DE69424663T2

DE69424663T2 - Reporterenzym-freisetzungstechnologie: verfahren zum nachweis der gegenwart von aspartat-proteasen und anderen aktivitaeten von hydrolytischen enzymen

Info

Publication number: DE69424663T2
Application number: DE69424663T
Authority: DE
Inventors: J Andreasen; Aulena Chauhuri; J Lawrence
Original assignee: Litmus Concepts Inc
Current assignee: Litmus Concepts Inc
Priority date: 1993-04-14
Filing date: 1994-04-13
Publication date: 2000-09-28
Anticipated expiration: 2014-04-14
Also published as: US5585273A; EP0694077B1; CN1096501C; US6251621B1; EP0694077A1; US5416003A; ATE193330T1; CN1138877A; RU2159818C2; DE69424663D1

Description

Diese Erfindung betrifft allgemein Verfahren zum Assayen hinsichtlich der Gegenwart von Hydrolase-Aktivität (d. h. hydrolytischen Enzymen) in einer Probe oder einer Ausgangsprobe. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Candidiasis durch Assayen auf die Gegenwart von enzymatisch aktiver Aspartat-Protease in einer Probe.
Candida albicans und andere Candida-Arten verursachen eine Anzahl von häufigen, medizinisch bedeutsamen Infektionen. Orale Candidiasis zum Beispiel ist bei Patienten mit Immunschwäche sehr häufig. Darüber hinaus ist vulvovaginale Candidiasis eine der häufigsten Krankheiten in der Geburtshilfe und Gynäkologie. Es ist geschätzt worden, das ungefähr drei Viertel aller erwachsenen Frauen unter mindestens einer Attacke dieser Krankheit leiden (De Bernardis, et al., 3. Clin. Microbiol. 27(11): 2598-2603 (1989)). Als ein Ergebnis ihres weitverbreiteten Auftretens sind umfassende Ausmaße an Forschung in das Verständnis der Ätiologie von Candidiasis geflossen.
Die Forschung hat gezeigt, daß Candida albicans und andere Candida-Arten ein ätiologische Beteiligung bei humaner Candidiasis aufweisen, und es wird jetzt allgemein angenommen, daß Candidiasis hauptsächlich von der Gegenwart von Candida albicans verursacht wird. Ferner gibt es nun eine beträchtliche Beweismasse für die Rolle einer Aspartat-Protease oder (austauschbar) Säure-Proteinase als Virulenzfaktor von Candida albicans. Es ist bekannt, das reine Kulturen von Candida albicans eine Aspartat-Protease sezernieren, wenn sie unter genau definierten Bedingungen herangezogen werden. In ähnlicher Weise ist es bekannt, daß reine Stämme von aus Frauen mit symptomatischer Vulgovaginitis isoliertem Candida albicans dieses Enzym freisetzen, wenn sie anschließend in spezifisch definierten Kulturmedium gezüchtet werden.
Das Candida albicans-Säure-Proteinase-Antigen, d. h. Aspartat-Protease-Antigen, ist immunologisch in dem Vaginalfluid von allen Frauen nachgewiesen worden, aus denen vulvovaginaler Candida albicans isoliert wurde (De Bernardis et al., Übersichtsartikel Nr. F- 91 in: Abstracts of Annual Meeting of the American Society for Microbiology, (Anaheim, CA 1990)). Die Konzentration von Säure-Proteinase-Antigen aus Candida albicans war jedoch in Patienten mit symptomatischer vulvovaginaler Candidiasis signifikant höher als bei asymptomatischen Trägern. Die Vaginalfluid-Konzentration dieses Antigens in Frauen mit Candidiasis beträgt ungefähr 176 ± 15,2 ng/ml, wohingegen die Vaginalfluid-Konzentration dieses Antigens bei Frauen ohne Isolation von Candida albicans, d. h. ohne klinische Candidiasis, weniger als 2 ng/ml betrug. Asymptomatische Candida albicans-Träger wiesen intermediäre Antigen-Spiegel auf (94 ± 18,5 ng/ml). Diese Feststellungen sind ein starker Hinweis dafür, daß Säure-Proteinase (d. h. Aspartat-Protease) bei der Pathogenese von vulvovaginaler Candidiasis beteiligt ist. Aspartat-Protease aus Candida albicans ist allerdings bekanntermaßen bei Körpertemperaturen instabil. Darüber hinaus zeigte der Nachweis des Aspartat-Proteinase-Antigens immunologisch nicht auf, ob das Enzym in einer enzymatisch aktiven Form vorhanden war.
Säure-Proteinase von Candida albicans ist eine extrazelluläre Aspartat-Protease. Aspartat- Proteasen sind eine der Hauptklassen von Proteasen. Sie enthalten einen oder mehrere Asparaginsäure-Schlüsselreste, welche für die Aktivität erforderlich sind. Aspartat-Protease von Candida albicans besitzt eine breite Protein-Substratspezifität, welche zum Beispiel Albumin, Hämoglobin, Casein, Immunoglobulin A und viele andere Proteine einschließt. Dieses Enzym funktioniert optimal unter sauren Bedingungen (d. h. pH 2,5-5,5) und es wird bei einem hohen pH-Wert (d. h. bei pH 7,5) rasch inaktiviert. Aspartat-Protease aus Candida albicans wird durch Pepstatin stark inhibiert, aber sie wird nicht durch Thiol-Reagenzien, Chelatbildner oder Serin-Protease-Inhibitoren inhibiert.
Viele pharmazeutische Firmen und führende Akademiker untersuchen Aspartat-Protease- Inhibitoren für eine potentielle therapeutische Anwendung. Ihre Bemühungen werden jedoch aufgrund des Fehlens eines geeigneten Enzym-Assays für Aspartat-Proteasen erschwert. Obgleich einfache kolorimetrische Assays für manche Serin-, Thiol-, Metallo-, saure und alkalische Proteasen und Peptidasen verfügbar sind, sind sie nicht für Aspartat-Proteasen verfügbar. Die Substrat-Spezifität dieser besonderen Klasse von Enzymen erfordert die Gegenwart von mehreren hydrophoben Aminosäuren. Diese Eigenschaft hat die Suche nach einfachen synthetischen chromogenen Substraten in großem Maße behindert, weil die hydrophoben Aminosäuren, welche als das Substrat für Aspartat-Proteasen dienen, notorisch schwierig in Wasser zu lösen sind. Als ein Ergebnis sind chromogene Substrate für Aspartat- Protease nicht im Handel erhältlich, sind schwierig zu synthetisieren und zu charakterisieren, und sind schlecht wasserlöslich. Der Nettoeffekt dieser Einschränkungen besteht darin, das die Enzym-Aktivität, wie von diesen chromogenen Substraten definiert, extrem niedrig ist, und somit colorimetrische Assays für Aspartat-Protease ziemlich unempfindlich sind. In ähnlicher Weise sind fluorogene Substrate für Aspartat-Proteasen beschrieben worden, aber sie sind ebenfalls von beschränkter Nützlichkeit. Zuerst, wie früher erwähnt, erfordert die Substrat-Spezifität dieser besonderen Klasse von Enzymen die Gegenwart von mehreren hydrophoben Aminosäuren, was die Substrate relativ unlöslich macht. Zweitens, bei den niedrigen erzielbaren Konzentrationen dieser Substrate, werden die fluorogenen Substrate sehr langsam hydrolysiert, und somit sind fluorogene Assays zeitaufwendig. Darüber hinaus enthalten viele biologische Proben fluoreszente Materialien, welche die fluorogenen Assays für Aspartat-Proteasen stören können.
Aufgrund des Fehlens von geeigneten kolorimetrischen oder fluorogenen Assays für den Nachweis von Aspartat-Proteasen werden im allgemeinen Ultraviolett(UV)-Spektrophotometrie-Assays verwendet, um auf die Gegenwart dieser besonderen Klasse von Enzymen zu assayen. In typischen UV-Spektrophotometrie-Assays wird Aspartat-Protease zu einer Lösung von Protein gegeben (wie zum Beispiel Hämoglobin oder Albumin), und die Mischung wird 0,5-4 Stunden lang bei 30-37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wird kalte konzentrierte Trichloressigsäure (TCA) zu der gekühlten Inkubationsmischung zugesetzt, um das unverdaute Protein zu fällen, wobei Utraviolettlicht-absorbierende Peptide in Lösung verbleiben. Schließlich wird das präzipitierte unverdaute Protein durch Zentrifugation während ungefähr einer Stunde bei gekühlten Temperaturen pelletiert, der Überstand abgesaugt, und seine optische Dichte bei 280 nm ermittelt, um das Ausmaß der Protein-Hydrolyse zu bestimmen. Obwohl dieser Assay für den Nachweis von Aspartat- Proteasen verwendet werden kann, ist er sowohl zeitaufwendig als auch mühsam.
Die EP-A-0244932 offenbart einen Assay für enzymatische Endoglykosidase-Aktivität und ein markiertes Substrat zur Verwendung in einem solchen Assay. Der Assay ist für den Nachweis von krebsartigen Malignitäten nützlich.
Die EP-A-0571939, relevant gemäß Artikel 54 (3) EPC offenbart ein Verfahren zum Nachweis einer Substanz mit hydrolytischer enzymatischer Aktivität.
Bis heute ist deshalb kein zweckdienlicher einfacher, "On-Site"-Assay für den Nachweis des Vorhandenseins von enzymatisch aktiven Aspartat-Proteasen entwickelt worden. Folglich richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Assay hinsichtlich der Gegenwart von enzymatisch aktiven Aspartat-Proteasen, welches die Probleme und Nachteile des Stands der Technik überwindet. Ferner sind die Verfahren der vorliegenden Erfindung ebenfalls nützlich für den Assay hinsichtlich des Vorhandenseins von anderen bekannten hydrolytischen Enzymen, d. h. Hydrolasen.
Es ist nun festgestellt worden, das enzymatisch aktive Aspartat-Protease aus Candida albicans in der Vaginalflüssigkeit von Frauen mit vulvovaginaler Candidiasis vorhanden ist. Es ist ferner festgestellt worden, daß das Vorhandensein von enzymatisch aktiver Aspartat- Protease in einer Probe oder Ursprungsprobe als ein Marker für den Nachweis und die Diagnose von Candidiasis dienen kann. Folglich ist nun ein Verfahren zum Nachweis von Candidiasis durch Assay hinsichtlich des Vorhandenseins von enzymatisch aktiver Aspartat- Protease in einer Probe entwickelt worden.
In diesem Verfahren wird eine Probe, z. B. Vaginalflüssigkeit, mit einem festen Träger kontaktiert. Der feste Träger, mit dem die Probe kontaktiert wird, weist ein darauf immobilisiertes Reporterenzym auf (d. h. ein signalerzeugendes Enzym). Das Reporterenzym ist auf dem festen Träger in einer solchen Weise immobilisiert, daß es von dem festen Träger bei Wirkung der enzymatisch aktiven Aspartat-Protease freigesetzt wird, wenn die enzymatisch aktive Aspartat-Protease, tatsächlich, in der Probe vorhanden ist. Nachdem sie mit dem festen Träger kontaktiert worden ist, wird die Probe mit einem Indikator kombiniert. Der Indikator ist jegliche chemische Spezies, welche für eine sichtbare oder nachweisbare Veränderung (wie zum Beispiel einer Farbveränderung) bei Wirkung des Reporterenzyms empfänglich ist. Wenn der Indikator nach Kontakt mit der Probe eine nachweisbare Veränderung durchläuft, ist enzymatisch aktive Aspartat-Protease in der Probe vorhanden, und somit kann behauptet werden, daß Candidiasis vorhanden ist.
Vor der vorliegenden Erfindung gab es keinen raschen und direkten Weg zum Assayen hinsichtlich der Gegenwart von enzymatisch aktiven Aspartat-Proteasen oder, noch bedeutender, von Candidiasis. Spektrophotometrische, fluorogene und immunologische Assays sind angewandt worden, um auf die Gegenwart von Aspartat-Protease-Aktivität zu assayen, aber diese Assays sind zeitaufwendig, arbeitsintensiv und nicht zur Anwendung durch ungeschultes klinisches "On-Site"-Personal geeignet. In ähnlicher Weise kann Candida albicans durch Kultivieren einer Probe in einem definierten Medium oder durch Naßeinbettungs-Mikroskopie nachgewiesen werden. Das Kultivierungsverfahren ist sehr zeitaufwendig (d. h. es dauert ungefähr 48 Stunden), und beide Verfahren erfordern kostspielige Ausrüstung und umfangreiches Training. Im Gegensatz zu früher angewandten Assays ist das vorliegend beanspruchte Verfahren zum Assayen hinsichtlich der Gegenwart von enzymatisch aktiver Aspartat-Protease und, dadurch, Candidiasis rasch, genau, kostengünstig und einfach anzuwenden.
Die Reporterenzym-Freisetzungstechnologie, auf welcher der Aspartat-Protease-Assay beruht, kann ebenfalls verwendet werden, um auf die Gegenwart von jedwedem aktiven hydrolytischen Enzym zu assayen, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, der folgenden: Proteasen oder (austauschbar) Proteinasen, Peptidasen, Lipasen, Nucleasen, Homo-Oligosaccharidasen, Hetero-Oligosaccharidasen, Homo-Polysaccharidasen, Hetero- Polysaccharidasen, Phosphatasen, Sulfatasen, Neuraminidasen und Esterasen. Folglich sind nun Verfahren zum Assayen hinsichtlich der Gegenwart einer enzymatisch aktiven Hydrolase in einer Probe entwickelt worden.
In diesen Verfahren wird eine Probe oder Ausgangsprobe mit einem festen Träger kontaktiert. Der feste Träger, mit dem die Probe kontaktiert wird, weist ein darauf immobilisiertes Reporterenzym (d. h. ein signalerzeugendes Enzym) auf. Das Reporterenzym ist auf dem festen Träger in einer Weise immobilisiert, so daß es von dem festen Träger bei Wirkung der Hydrolase freigesetzt wird, wenn die enzymatisch aktive Hydrolase tatsächlich in der Probe vorhanden ist. Die Probe wird, nachdem sie mit dem festen Träger kontaktiert worden ist, mit einem Indikator kombiniert. Der Indikator ist jedwede chemische Spezies, welche für eine nachweisbare Veränderung, gewöhnlich eine Farbveränderung, bei Wirkung des Reporterenzyms anfällig ist. Eine nachweisbare Veränderung in dem Indikator ist eine Anzeige, daß die enzymatisch aktive Hydrolase in der Probe vorhanden ist. Umgekehrt ist das Fehlen einer nachweisbaren Veränderung im Indikator eine Anzeige, daß die enzymatisch aktive Hydrolase von der Probe abwesend ist. Wie bei dem Assay für enzymatisch aktive Aspartat- Protease und, dadurch, Candidiasis, sind die vorliegend beanspruchten Verfahren zum Assayen hinsichtlich der Gegenwart einer enzymatisch aktiven Hydrolase in einer Probe rasch, genau, kostengünstig und einfach anzuwenden.
Darüber hinaus kann die Reporterenzym-Freisetzungstechnologie, auf welcher die obenstehenden Verfahren basieren, auch verwendet werden, um hinsichtlich der Gegenwart eines Inhibitors von jedwedem bekannten hydrolytischen Enzym zu assayen, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die folgenden: Inhibitoren der Proteasen oder (austauschbar) Proteinasen, Peptidasen, Lipasen, Nucleasen, Homo-Oligosaccharidasen, Hetero-Oligosaccharidasen, Homo-Polysaccharidasen, Hetero-Polysaccharidasen, Phosphatasen, Sulfatasen, Neuraminidasen und Esterasen.
Zusätzlich zu den Verfahren des Assayens hinsichtlich der Gegenwart von enzymatisch aktiver Aspartat-Protease und den Aktivitäten von anderen hydrolytischen Enzymen ist nun eine trockene, selbst-enthaltende Testvorrichtung zum Testen einer Probe hinsichtlich der Gegenwart von Candidiasis durch Assayen hinsichtlich der Gegenwart von enzymatisch aktiver Aspartat-Protease entwickelt worden. Darüber hinaus ist auch eine selbst-enthaltende Trocken-Testvorrichtung zum Assayen hinsichtlich der Gegenwart einer enzymatisch aktiven Hydrolase in einer Probe entwickelt worden. Diese Testvorrichtungen kombinieren ein auf einem festen Träger immobilisiertes Reporterenzym, einen Indikator, und eine oder mehrere andere Reagenzien in trockener Form in einer laminierten Tafel mit einer internen Kammer, wobei die Kammer ein Leerraum ist, bis die Probe in das Innere eingebracht wird. Zur Bequemlichkeit werden die Teile der Tafel und die Lokalisierungen der funktionellen Chemikalien in der Tafel von einem Referenzrahmen aus beschrieben, in welchem die Tafel in einer horizontalen Position ist, da dies die wahrscheinlichste Position ist, welche die Tafel während der Verwendung einnehmen wird. Mit der Tafel in dieser Position, insbesondere für die bevorzugten Tafeln dieser Erfindung, welche dünne flache Strukturen sind, wird die Probe in die Kammer durch eine Öffnung an der Oberseite der Tafel eingebracht werden. Von den Schichtlagen bzw. Laminae, welche die Tafel bilden, wird die alleroberste Lamina in dieser Position, wobei diese Lamina diejenige ist, durch welche die Probe eingeführt wird, als die Oberseitenlamina der Tafel bezeichnet werden, wobei die untere Oberfläche dieses Blattes die obere Oberfläche der Kammer bildet. Dergleichen wird die allerunterste Lamina der Tafel als die Bodenlamina der Tafel bezeichnet werden, wobei die obere Oberfläche dieser Bodenlamina die untere Oberfläche der Kammer bildet. Die dünnen Ränder entlang des Umfangs dieser Oberseiten- und Boden-Laminae werden als die Seitenkanten der Tafel bezeichnet werden, und die dünnen lateralen Extremitäten der Kammer entlang der Kanten ihrer oberen und unteren Oberflächen werden als die Seitenwände der Kammer bezeichnet werden. Regionen von jeder gegebenen Oberfläche, welche in der gleichen horizontalen Ebene aneinandergrenzend sind, werden als horizontal aneinandergrenzend bezeichnet werden, wohingegen eine direkt über andere Laminae aufgebrachte Lamina, um parallele horizontale Ebenen zu bilden, als vertikal aneinandergrenzend bezeichnet wird.
Die Oberseiten-, Boden- oder beide Laminae der Tafel sind aus einem lichtdurchlässigen, vorzugsweise transparenten bzw. durchsichtigen Material gefertigt. Das auf einem festen Träger immobilisierte Reporterenzym, Indikator und andere für den Test benötigte Komponenten und Reagenzien sind in einer oder mehreren Laminae innerhalb der Kammer angeordnet, entweder als Überzüge auf der oberen Oberfläche der Kammer, als Überzüge auf der unteren Oberfläche der Kammer, oder auf beiden. Der Indikator ist jedwede chemische Spezies, welche einer nachweisbaren Veränderung, gewöhnlich einer Farbveränderung, bei Wirkung des Reporterenzyms zugänglich ist, wenn es von dem festen Träger durch die enzymatisch aktive Hydrolase freigesetzt wird, deren Gegenwart nachgewiesen wird. Die Lamina mit dem Indikator kann auf der oberen oder unteren Oberfläche der Kammer sein. Eines oder mehrere der für den Test benötigten Reagenzien kann/können in der gleichen Lamina wie der Indikator eingeschlossen sein, oder in separaten Laminae auf der gleichen Oberfläche oder auf der entgegengesetzten Oberfläche. In bestimmten bevorzugten Aus führungsformen der Erfindung ist der Indikator in der Lamina enthalten, welche direkt unterhalb einer lichtdurchlässigen Wand aufgebracht ist, und das auf dem festen Träger immobilisierte Reporterenzym ist in der Lamina enthalten, welche auf der entgegenliegenden Wand aufgebracht ist.
Die die Laminae besetzenden Reagenzien können so gewählt werden, daß alles, was benötigt wird, um den Test zu vervollständigen, die Zugabe der Probe plus eine minimale Anzahl von weiteren Reagenzien ist, wie zum Beispiel ein Entwickler. In besonders bevorzugten Ausführungsformen jedoch enthalten die Laminae alle von der Probe verschiedenen benötigten Reagenzien, so daß die Durchführung des Tests nichts weiter als die Zugabe der Probe erfordert.
Alle Laminae sind feste Schichten vor dem Kontakt mit der Probe, und die Lamina, welche den Indikator enthält, ist vorzugsweise von einer Zusammensetzung, welche in der flüssigen Probe, für die der Test entworfen ist, unlöslich ist, so daß der Indikator während der gesamten Dauer des Tests in der Lamina verbleibt. Für Proben in entweder wäßrigen oder wasserlöslichen Medien handelt es sich deswegen bei der bevorzugten Indikator-Lamina entweder um einen Indikator, der in Wasser unlöslich ist, oder einen Indikator, der in einer Matrix gehalten wird, welche in Wasser unlöslich ist. Bei dem so in einer dünnen konzentrierten Lamina direkt unterhalb einer lichtdurchlässigen Wand zurückgehaltenen Indikator, erscheint eine Veränderung im Indikator, welche durch die lichtdurchlässige Wand nachweisbar ist, in einer kurzen Zeitdauer, was sowohl zu einer hohen Empfindlichkeit als auch einem schnellen Ergebnis führt.
Diese Erfindung kann für Tests für eine breite Vielzahl von Hydrolasen in Testproben aus einer breiten Vielzahl von Quellen angepaßt und verwendet werden. Darüber hinaus kann diese Erfindung für Tests für eine breite Vielzahl von Hydrolase-Inhibitoren angepaßt und verwendet werden. Ein Test kann entweder eine einzelne Reaktion oder eine Abfolge von Reaktionen, welche in einer nachweisbaren Veränderung im Indikator kulminieren, beinhalten, und die Anzahl und die Typen von Reagenzien und Reaktionen werden dementsprechend von einem Test zum nächsten variieren, abhängig davon, welche Hydrolase nachgewiesen wird. In manchen Fällen werden beste Ergebnisse erhalten, wenn im vornhinein aufgetragene reagierende Spezies zwischen den oberen und unteren Oberflächen der Kammer so verteilt sind, daß sie durch einen Spalt getrennt sind, bis der Spalt mit der Testprobe gefüllt wird. In anderen Fällen können die reagierenden Spezies in einer gemeinsamen Lamina oder in zwei oder mehreren distinkten, aber vertikal aneinandergrenzenden Laminae auf der oberen oder unteren Oberfläche der Kammer ohne einen Verlust in der Zuverlässigkeit des Tests angeordnet sein. In allen Fällen jedoch sind die Laminae so konstituiert und angeordnet, daß die Reaktionen, welche in der nachweisbaren Indikatorveränderung kulminieren, nur stattfinden, wenn die Kammer mit der Testprobe gefüllt ist, und so, daß, wenn die Indikatorveränderung stattfindet, sie in der unmittelbar an eine lichtdurchlässige Wand angrenzenden Lamina wenigstens konzentriert und vorzugsweise darauf begrenzt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung schließt die Testvorrichtung eine eingebaute Positivkontrolle, eine eingebaute Negativkontrolle oder beides ein, von denen alle durch die Zugabe einer einzelnen Ausgangsprobe aktiviert werden. Die Aktivierung dieser Kontrollen findet gleichzeitig mit der Durchführung des Tests statt, und nachweisbare Anzeigen (wie zum Beispiel Farbveränderungen oder deren Fehlen), welche die beiden Kontrollen und den Test repräsentieren, werden mit einer einzelnen Aufbringung der Probe in die Vorrichtung erzielt und sind durch eine lichtdurchlässige Wand nachweisbar. Die Kontrollen besetzen Positionen auf der Vorrichtung, welche horizontal angrenzend zu der Testfläche sind, mit angemessenen Kennzeichnungen auf der oberen oder unteren Oberfläche der Vorrichtung, vorzugsweise der oberen, um die Kontrollen zu identifizieren und sie von dem Test zu unterscheiden. Die Kontrollen selbst bestehen im allgemeinen aus weiteren Laminae, enthaltend Reagenzien oder andere angemessene Spezies, welche entweder die nachweisbare Veränderung im Indikator von sich selbst aus induzieren oder das Stattfinden der Veränderung verhindern, und nur so wirken werden, wenn die Testprobe vorhanden ist und zwar dennoch unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit der fraglichen Hydrolase in der Testprobe. Wiederum wird die Auswahl dieser Kontrollen und der chemischen Mechanismen, durch welche sie funktionieren, als auch die Auswahl zwischen der Plazierung dieser Laminae auf der gleichen Oberfläche der Kammer, wie der Indikator, oder auf der entgegenliegenden Oberfläche von einem Test zum nächsten variieren.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung enthalten zusätzliche Merkmale, um die Leistung des Tests zu verbessern. Für Proben auf Wasserbasis wird die Einbindung eines oberflächenaktiven Mittels in die unmittelbar an den Spalt angrenzenden Laminae, der mit der Probe gefüllt werden soll, die Benetzung der Laminae mit der Probe und das rasche und gleichmäßige Füllen der Kammer beschleunigen. Das oberflächenaktive Mittel kann der einzige funktionelle Bestandteil in der Lamina sein oder in der Lamina mit Test-Reagenzien kombiniert sein. Vorzugsweise sind beide Seiten des Spalts mit Laminae, welche das oberflächenaktive Mittel tragen, ausgekleidet. Eine Proben-Einführungsöffnung ist in der Vorrichtung eingeschlossen, um die direkte Einführung der Probe in die Kammer zu gestatten, und bevorzugte Ausführungsformen schließen eine oder mehrere Entlüftungslöcher in der Kammer ein, welche von der Probeneinführungsöffnung räumlich getrennt angeordnet sind, um das Füllen der Kammer weiter zu erleichtern.
Andere Merkmale, Ziele und Vorteile der Erfindung und ihrer bevorzugten Ausführungsformen werden aus der Beschreibung, welche folgt, offensichtlich werden.
Die Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht einer veranschaulichenden Testvorrichtung gemäß der Erfindung.
Die Fig. 2 ist eine Seitenansicht unter Abschneiden eines Bereichs der in Fig. 1 gezeigten Testvorrichtung.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Assayen hinsichtlich der Gegenwart einer enzymatisch aktiven Hydrolase in einer Probe vorgesehen, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
(a) Einbringen der Probe in eine Testvorrichtung, welche erste und zweite feste Träger enthält, wobei der erste feste Träger ein darauf auf eine solche Weise kovalent angeheftetes Reporter-Enzym aufweist, daß das Reporter-Enzym bei Wirkung der Hydrolase freigesetzt wird; wobei der zweite feste Träger, der nicht im Kontakt mit dem ersten festen Träger ist, einen darauf immobilisierten Indikator aufweist, wobei der Indikator ein solcher ist, der für eine nachweisbare Veränderung bei Wirkung des Reporter-Enzyms empfänglich ist, wobei die Probe auf eine solche Weise in die Vorrichtung eingebracht wird, daß die Probe den ersten und zweiten festen Träger so kontaktiert, daß jeglichem durch irgendeine in der Probe vorhandene Hydrolase- Aktivität freigesetzten Reporter-Enzym gestattet wird, durch die Probe zu dem zweiten festen Träger zu diffundieren; und
(c) Beobachten, ob der Indikator eine nachweisbare Veränderung durchläuft, wobei die nachweisbare Veränderung eine Anzeige der Gegenwart der enzymatisch aktiven Hydrolase in der Probe ist.
Der Begriff "Hydrolase" wird hierin verwendet, um ein Enzym zu bezeichnen, das hydrolytische Reaktionen katalysiert. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann angewandt werden, um hinsichtlich der Gegenwart eines beliebigen bekannten hydrolytischen Enzyms zu assayen. Solche hydrolytischen Enzyme, d. h. Hydrolasen, schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die folgenden ein: Proteasen oder (austauschbar) Proteinasen, Peptidasen, Lipasen, Nucleasen, Homo- oder Hetero-Oligosaccharidasen, Homo- oder Hetero- Polysaccharidasen, Phosphatasen, Sulfatasen, Neuraminidasen und Esterasen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewandt werden, um hinsichtlich der Gegenwart von Proteasen zu assayen, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, den folgenden: Aspartat-Proteasen, Serinproteasen, Thiolproteasen, Metalloproteasen, sauren Proteasen und alkalischen Proteasen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewandt werden, um einen Assay hinsichtlich der Gegenwart von Homo- oder Hetero-Oligosaccharidasen oder Homo- oder Hetero-Polysaccharidasen durchzuführen, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Chitinase, Amylasen, Cellulase und Lysozym.
Der Begriff "Reporter-Enzym" oder (wechselweise) "Marker-Enzym" wird hierin verwendet, um ein signalerzeugendes Enzym zu bezeichnen, d. h. ein Enzym, dessen Aktivität eine sichtbare oder anderweitig nachweisbare Veränderung entstehen läßt. Solche Reporterenzyme schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die folgenden ein: Peroxidasen, Phosphatasen, Oxidoreductasen, Dehydrogenasen, Transferasen, Isomerasen, Kinasen, Reductasen, Deaminasen, Katalasen, Urease und Glucoronidase. Beim Auswählen eines in dem vorliegend beanspruchten Verfahren zu verwendenden Reporterenzyms ist es unbedingt erforderlich, daß das Reporterenzym nicht einer Inaktivierung durch irgendein Mittel in der Probe unterliegt, einschließlich inaktivierender Hydrolyse durch irgendeine in der Probe vorhandene Hydrolaseaktivität. Die Auswahl eines passenden Reporter- oder Markerenzyms wird dem Fachmann ohne weiteres offensichtlich sein. Vorliegend bevorzugte Reporterenzyme sind die Peroxidasen, wie zum Beispiel Meerrettichperoxidase.
Das Reporterenzym wird auf einem festen Träger, d. h. einem unlöslichen polymeren Material, einer anorganischen oder organischen Matrix, einem Gel, Aggregat, Präzipitat oder Harz, auf eine solche Weise immobilisiert, daß das Reporterenzym bei Wirkung der Hydrolase, auf deren Gegenwart geassayt wird, freigesetzt wird (insbesondere Aspartat- Protease und Thiolprotease in den nachstehend erörterten Aspekten der Erfindung). Bevorzugte feste Träger gemäß der vorliegenden Erfindung schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die folgenden ein: Cellulose, Agarose, Dextran, Polyacrylat, Polyacrylamid oder ihre Derivate, Chitin, Sepharose (Warenzeichen), Oxiran-Acryl-Perlen und polymeres Dialdehyd, Stärke, Collagen, Keratin, Elastin, Rinderhautpulver, Bakterienzellwand-Peptidoglykan und Fragmente davon, Nylon, Polyethylenterephthalate, Polycarbonate und Glas kontrollierter Porengröße. Die Immobilisierung des Reporterenzyms auf dem festen Träger wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren und Vorgehensweisen durchgeführt, welche dem Fachmann bekannt und von ihm verstanden sind.
Das Reporterenzym kann direkt an den festen Träger angeheftet werden. In diesem Fall dient der unlösliche Träger direkt als ein Substrat für die Hydrolase. Wenn zum Beispiel Chitinase die geassayte Hydrolase ist, kann das Reporter- oder Markerenzym (wie zum Beispiel Meerrettichperoxidase) direkt an das unlösliche Chitin angeheftet werden. Bei Gegenwart von Chitinase wird die Meerrettichperoxidase von dem festen Träger freigesetzt werden. In ähnlicher Weise kann, wenn Cellulase die nachzuweisende Hydrolase ist, das Reporterenzym, z. B. Meerrettichperoxidase, direkt an Cellulose angeheftet werden, und bei Gegenwart der Hydrolase Cellulase wird die Meerrettichperoxidase von dem festen Träger freigesetzt werden. Schließlich kann, wenn die nachzuweisende Hydrolase Lysozym ist, das Reporterenzym, z. B. Meerrettichperoxidase, direkt an Bakterienzellwand-Peptidoglykan angeheftet werden, und bei Gegenwart der Hydrolase Lysozym wird die Meerrettichperoxidase von dem festen Träger freigesetzt werden.
Alternativ dazu kann das Reporterenzym auf dem festen Träger durch die Verwendung eines Linkermoleküls immobilisiert werden, welches ein hydrolysierbares Substrat für die nachzuweisende Hydrolase ist. Solche Linkermoleküle schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die folgenden ein: Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Peptide, Ester und Nukleinsäuren. Das zur Anheftung des Reporterenzyms an den festen Träger verwendete jeweilige Linkermolekül wird davon abhängen, welche Hydrolase nachgewiesen wird, und die Auswahl in jedem gegebenen Fall wird dem Fachmann ohne weiteres offensichtlich sein.
Der Begriff "Indikator" wird hierin verwendet, um jedwede chemische Spezies zu bezeichnen, welche eine nachweisbare Veränderung als ein Ergebnis der Reaktion oder als ein Ergebnis der Kulmination von Reaktionen durchläuft, welche auftreten, wenn die enzymatisch aktive Hydrolase in der Probe oder Ausgangsprobe vorhanden ist. Die resultierende nachweisbare Veränderung ist eine Anzeige, daß die enzymatisch aktive Hydrolase in der Probe oder Ausgangsprobe vorhanden ist.
Bevorzugte Indikatoren sind sichtbare Indikatoren und, insbesondere, chromogene Indikatoren, d. h. diejenigen, bei denen die sichtbare Veränderung eine Farbveränderung ist, einschließlich der Bildung von Farbe in einem ansonsten farblosen Material bei Wirkung des Reporter- oder Markerenzyms, wenn es von dem festen Träger durch die enzymatisch aktive Hydrolase freigesetzt wird, deren Gegenwart nachgewiesen wird. Alternativ dazu kann das Reporterenzym in der Lage zur Katalysierung der Bildung eines fluoreszenten Signals, eines phosphoreszenten, eines biolumineszenten Signals, eines chemolumineszenten Signals, oder eines elektrochemischen Signals bei seiner Freisetzung von dem festen Träger durch die Wirkung der Hydrolase sein. Darüber hinaus kann das Reporterenzym fähig zur Erzeugung an derer sichtbarer oder nachweisbarer Signale sein, wie zum Beispiel eines Gerinnsels, einer Agglutination, einer Präzipitation oder einer Aufklärungszone. In diesen Fällen wäre der Indikator die chemische Spezies oder das Substrat, welche(s) von dem Reporter- oder Markerenzym benötigt wird, um die gewünschte nachweisbare Veränderung entstehen zu lassen.
Eine breite Vielzahl von chromogenen Indikatoren (d. h. Chromogenen) und anderen Spezies mit einem ähnlichen Effekt kann als visuelle Indikatoren mit Peroxidasen, wie Meerrettichperoxidase, als dem Reporterenzym verwendet werden. Bevorzugte chromogene Indikatoren gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen ein Hydroperoxid und ein Chromogen, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, eines der folgenden: Guajak, 2-2'-Azino-bis(3- ethyl-benthiazolin-6-sulfonsäure), Tetramethylbenzidin, Phenol, 4-Aminoantipyrin und 4,5- Dihydroxynaphthalin-2,7-disulfonsäure. Ein besonders bevorzugter chromogener Indikator ist aufgebaut aus einem Hydroperoxid und Guajak, einem Chromogen, das in seinem reduzierten Zustand farblos ist und in seinem oxidierten Zustand tief blau ist. Gegebenenfalls kann Guajak vor der Verwendung, z. B. durch Lösungsmittel-Extraktion, gereinigt werden. Der angemessenste chromogene Indikator für irgendein gegebenes Reporterenzym wird von der Reaktion oder den Reaktionen abhängen, welche das Reporterenzym zu katalysieren oder initiieren in der Lage ist, und die Auswahl in jedwedem gegebenen Falle wird dem Fachmann ohne weiteres offensichtlich sein.
Wenn der visuelle Indikator ein chromogener Indikator ist, ist es möglich, entweder ein flüssiges Chromogensystem oder ein festes Chromogensystem zu verwenden. Wenn ein flüssiges Chromogensystem zum Nachweis von Peroxidasen verwendet wird, würde ein solches System ein Lösungsmittel, ein Hydroperoxid und ein Chromogen umfassen, das in der Lage ist, von Hydroperoxiden in Gegenwart einer Peroxidase, wie zum Beispiel Meerrettichperoxidase; oxidiert zu werden. Alternativ dazu würde, wenn ein festes Chromogensystem, zum Beispiel für Peroxidasen oder Pseudoperoxidasen, verwendet wird, ein solches System ein Hydroperoxid, ein Chromogen, das in der Lage ist, von Hydroperoxiden in Gegenwart einer Peroxidase oxidiert zu werden, und einen festen Träger, auf welchem das Chromogen imprägniert oder immobilisiert und getrocknet worden ist, umfassen. In diesem System kann das Chromogen auf ein saugfähiges Papier oder Träger imprägniert werden, wie der Fall bei Hemoccult®-Objektträgern, oder, alternativ dazu, kann das Chromogen auf eine Kunststoff oder andere Tafel in der Form einer dünnen Schicht aufgelagert werden. In diesem letztgenannten Format könnte das Chromogen als eine Lösung aufgeschichtet werden, welche ein polymeres Material enthält (wie zum Beispiel Hydroxypropylcellulose, Ethylcellulose etc.). Wenn das Chromogen selbst ein wasserlösliches Chromogen ist, kann es in einer Matrix von Material eingefangen werden, welches in Wasser unlöslich ist. Alternativ dazu, wenn das Chromogen selbst in Wasser unlöslich ist, kann es als eine Lösung in einem organischen Lösungsmittel entweder allein oder in Kombination mit einem wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Polymer aufbeschichtet werden.
In dem festen Chromogensystem zum Nachweis von Peroxidasen, kann das Hydroperoxid entweder in einer festen Form (wie zum Beispiel Titaniumhydroperoxid) vorgesehen werden oder es kann in situ erzeugt werden, zum Beispiel in einer Testvorrichtung. Wasserstoffperoxid kann zum Beispiel in situ mit Glucose, Umgebungs-Sauerstoff und Glucoseoxidase erzeugt werden. Alternativ dazu kann Wasserstoffperoxid in situ durch die Verwendung einer getrockneten Schicht erzeugt werden, die nach Ablagern einer Suspension von Natriumperborat in Alkohol gebildet wurde. Bei niedrigem pH setzt das Natriumperborat spontan Wasserstoffperoxid frei. In Gegenwart des Wasserstoffperoxids und der Peroxidase bei ihrer Freisetzung von dem festen Träger durch die Hydrolase wird das Chromogen oxidiert werden, und eine visuell nachweisbare Veränderung der Farbe wird resultieren. Diese resultierende Farbveränderung ist eine Anzeige, daß die enzymatisch aktive Hydrolase in der Probe oder Ausgangsprobe vorhanden ist.
Dieses Verfahren, sowie die anderen Verfahren der vorliegend beanspruchten Erfindung, können verwendet werden, um gleichzeitig hinsichtlich der Gegenwart von zwei oder mehreren aktiven Hydrolasen in einer Probe oder Ausgangsprobe zu assayen. Ein solches Verfahren würde eine Mischung von zwei oder mehreren Reporterenzymen, immobilisiert auf (einem) festen Träger(n) durch Substrat-Bindungen, welche gegenüber spezifischen Hydrolasen anfällig sind, und zwei oder mehrere Indikator- und Reagenzien-Systeme zur Erzeugung einer nachweisbaren Antwort auf jedes der Reporterenzyme anwenden. Zum Beispiel wäre es möglich, unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung gleichzeitig eine Mischung von Proteasen, Lipasen und Polysaccharidasen nachzuweisen, wodurch ein hydrolytisches Profil eines gegebenen Pathogens oder Krankheitsprozesses erhalten wird.
Weiterhin wird es dem Fachmann ohne weiteres offensichtlich sein, daß die Reaktionsbedingungen (wie zum Beispiel die Auswahl des Linkermoleküls oder der Brücke, des festen Trägers, pH, Pufferkapazität, Pufferidentität, Salze etc.) der vorliegend beanspruchten Verfahren modifiziert und reguliert werden können, um die Hydrolase-Spezifität zu erhöhen und zwischen den verschiedenen in einer Probe vorhandenen Hydrolasen zu unterscheiden. Zum Beispiel ist es bekannt, daß bestimmte Hydrolasen bei einem niedrigen pH-Wert funktionieren und bei einem hohen pH inhibiert werden. Im Gegensatz dazu funktionieren andere Hydrolasen bei einem hohen pH und werden von einem niedrigen pH inhibiert. Durch Regulieren des pH-Wertes des Assays wird man in der Lage sein, die Gegenwart einer besonderen Hydrolase selektiv nachzuweisen. Darüber hinaus wird es dem geschulten Fachmann ohne weiteres offensichtlich sein, daß spezifische Enzyminhibitoren ebenfalls in den vorliegend beanspruchten Verfahren eingesetzt werden können, um die Hydrolaseaktivität und -spezifität zu erhöhen und zwischen den verschiedenen Hydrolasen zu unterscheiden.
Bevorzugte erste und zweite feste Träger gemäß der vorliegenden Erfindung schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die folgenden ein: Cellulose, Agarose, Dextran, Polyacrylat, Polyacrylamid, oder ihre Derivate, Chitin, Sepharose, Oxiran-Acrylperlen, polymeres Dialdehyd, Stärke, Collagen, Keratin, Elastin, Rinderhautpulver, Bakterienzellwand-Peptidoglykan oder Fragmente davon, Nylon, Polyethylenterephthalate, Polycarbonate und Glas mit regulierter Porengröße. Die Immobilisierung des visuellen Indikators auf dem zweiten festen Träger wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren und Vorgehensweisen, welche dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt.
In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist enzymatisch aktive Aspartat-Protease die nachgewiesene Hydrolase, wobei das Verfahren umfaßt: Einbringen der Probe in eine Vorrichtung, welche erste und zweite feste Träger enthält, wobei der erste feste Träger Polyacrylat ist und darauf durch ein Myoglobin-Molekül immobilisierte Meerrettichperoxidase aufweist, welches ein Substrat für Aspartat-Protease ist, wobei der zweite feste Träger, der nicht im Kontakt mit dem ersten festen Träger ist, ein Cellulose-Derivat ist und darauf immobilisiert ein Hydroperoxid und Guajak aufweist, ein chromogenes Substrat, welches bei Wirkung von Meerrettichperoxidase in Gegenwart eines Hydroperoxids eine Farbveränderung durchläuft, wobei die Probe auf eine solche Weise in die Vorrichtung eingebracht wird, daß die Probe die ersten und zweiten festen Träger so kontaktiert, daß jeglicher durch irgendeine in der Probe vorhandene enzymatisch aktive Aspartat-Protease freigesetzten Meerrettichperoxidase gestattet wird, durch die Probe zu dem zweiten festen Träger zu diffundieren; und das Beobachten, ob Guajak eine Farbveränderung durchläuft, wobei die Farbveränderung eine Anzeige der Gegenwart von enzymatisch aktiver Aspartat-Protease in der Probe ist.
Wie früher erwähnt, wird es dem Fachmann ohne weiteres offensichtlich sein, daß besondere Reaktionsbedingungen (wie zum Beispiel die Auswahl von Linker-Molekül, festem Träger, pH, Pufferkapazität, Puffer-Identität, Salzen etc.) und spezifische Inhibitoren verwendet werden können, um Aspartat-Protease-Spezifität zu erhöhen. Zum Beispiel kann man durch Assayen hinsichtlich Aspartat-Protease bei einem pH-Wert von etwa 2,5 bis etwa 5,0 Aspartat-Proteasen gegenüber vielen Thiolproteasen, Serinproteasen, Metalloproteasen und alkalischen Proteasen selektiv nachweisen. Ferner kann man durch Hinzusetzen von Inhibitoren der Metallo-Proteasen, der Thiolproteasen, der Serinproteasen und der sauren oder alkalischen Proteasen selektiv Aspartat-Proteasen nachweisen.
Somit wird gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Candidiasis durch Assayen hinsichtlich der Gegenwart von enzymatisch aktiver Aspartat-Protease in einer Probe vorgesehen, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Kontaktieren der Probe mit einem festen Träger, wobei der feste Träger ein darauf auf eine solche Weise immobilisiertes Reporter-Enzym aufweist, daß das Reporter-Enzym bei Wirkung der Aspartat-Protease freigesetzt wird; (b) Kombinieren der Probe, nachdem sie mit dem festen Träger kontaktiert worden ist, mit einem Indikator, wobei der Indikator ein solcher ist, der für eine nachweisbare Veränderung bei Wirkung des Reporter-Enzyms empfänglich ist; und (c) Beobachten, ob der Indikator eine nachweisbare Veränderung durchmacht, wobei die nachweisbare Veränderung eine Anzeige der Gegenwart der enzymatisch aktiven Aspartat-Protease in der Probe und somit von Candidiasis ist.
Das in diesem Verfahren verwendete Reporterenzym oder Markerenzym kann ein beliebiges der obenstehend erörterten sein, und Meerrettichperoxidase wird vorliegend bevorzugt, weil sie nicht leicht durch Aspartat-Protease oder viele andere gut bekannte Proteasen, welche in der Probe vorhanden sein können, hydrolysiert wird.
Das Reporterenzym wird auf einem festen Träger immobilisiert, wie obenstehend erörtert, gegebenenfalls durch die Verwendung eines Linker-Moleküls, welches ein hydrolysierbares Substrat für die enzymatisch aktive Aspartat-Protease ist (oder, in dem nachstehend zu erörternden Aspekt der Erfindung, ein hydrolysierbares Substrat für Thiolprotease ist). In diesem Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen derartige Linker-Moleküle Proteine und Peptide ein, wobei Proteine die bevorzugten Linker-Moleküle sind. Wenn das Linker- Molekül ein Protein ist, schließen bevorzugte Proteine, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die folgenden ein: Azocasein, Casein, K-Casein, Immunoglobuline, Hämoglobin, Myoglobin, Albumin, Elastin, Keratin und Collagen. In bevorzugten Ausführungsformen dieses Verfahrens der beanspruchten Erfindung ist das Linker-Molekül K-Casein, Casein, Hämoglobin oder Myoglobin.
Der Indikator kann jedwede chemische Spezies sein, welche eine nachweisbare Veränderung als ein Ergebnis der Reaktion oder als ein Ergebnis der Kulmination von Reaktionen durchläuft, welche stattfinden, wenn enzymatisch aktive Aspartat-Protease oder Thiolprotease - siehe nachstehend - in der Probe oder Ausgangsprobe vorhanden ist. Die resultierende nachweisbare Veränderung ist eine Anzeige der Gegenwart von enzymatisch aktiver Aspartat-Protease in der Probe, und die Gegenwart von enzymatisch aktiver Aspartat- Protease in der Probe zeigt, ihrerseits, das Vorhandensein von Candidiasis oder von Trichomonas vaginalis - siehe nachstehend - an.
Bevorzugte Indikatoren und ihre Wirkung im Zusammenhang mit dem Reporter- oder Marker-Enzym wurden obenstehend erörtert.
Wie obenstehend erörtert, kann eine breite Vielfalt von chromogenen Indikatoren (d. h. Chromogenen) und anderen Spezies mit einem ähnlichen Effekt als visuelle Indikatoren verwendet werden, wenn Peroxidasen als die Reporter- oder Marker-Enzyme eingesetzt werden.
In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Trichomonas vaginalis durch Assayen hinsichtlich der Gegenwart von enzymatisch aktiver Thiolprotease in einer Probe vorgesehen, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Kontaktieren der Probe mit einem festen Träger, wobei der feste Träger ein darauf auf eine solche Weise immobilisiertes Reporter-Enzym aufweist, daß das Reporter-Enzym bei Wirkung der Thiol-Protease freigesetzt wird; (b) Kombinieren der Probe, nachdem sie mit dem festen Träger kontaktiert worden ist, mit einem Indikator, wobei der Indikator ein solcher ist, der für eine nachweisbare Änderung bei Wirkung des Reporter-Enzyms empfänglich ist; und (c) Beobachten, ob der Indikator eine nachweisbare Veränderung durchmacht, wobei die nachweisbare Veränderung eine Anzeige der Gegenwart der enzymatisch aktiven Thiol-Protease in der Probe und somit von Trichomonas vaginalis ist.
Wie bei den zuvor beschriebenen Verfahren kann das in diesem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Reporterenzym oder Markerenzym jedwedes signalerzeugende Enzym sein, d. h. ein Enzym, dessen Aktivität eine sichtbare oder nachweisbare Veränderung entstehen läßt, welches nicht einer Inaktivierung durch irgendein Mittel in der Probe unterworfen ist, einschließlich inaktivierender Hydrolyse durch irgendeine in der Probe vorhandene Hydrolase-Aktivität. Solche Reporterenzyme wurden obenstehend erörtert, und in diesem Verfahren der vorliegenden Erfindung sind die bevorzugten Reporterenzyme die Peroxidasen und insbesondere Meerrettichperoxidase.
Das Reporterenzym wird auf einem festen Träger immobilisiert, wie obenstehend erörtert, und bevorzugte feste Träger in diesem Verfahren der beanspruchten Erfindung schließen Chitin, Polyacrylat, Cellulose und ihre Derivate, und Sepharose ein.
Wie bei den Aspartat-Protease-Assays können bestimmte Reaktionsbedingungen und spezifische Inhibitoren verwendet werden, um Thiolprotease-Aktivität und -Spezifität zu erhöhen. Zum Beispiel könnte man Inhibitoren (wie zum Beispiel Pepstatin zur Inhibierung von Aspartat-Proteasen, Sojabohnen-Trypsininhibitor zur Inhibierung von Trypsin, EDTA oder andere Chelatoren zur Inhibierung von Metallo-Proteasen, oder irgendeinen der vielen bekannten natürlich vorkommenden Inhibitoren von Nicht-Thiol-Protein-Proteasen) zu dem Testsystem zusetzen, so daß nur Thiolproteasen funktionieren und somit nachgewiesen werden würden. Weiterhin werden, durch Assayen bei einem pH von etwa 7,4, viele Thiolproteasen aktiv sein, aber Aspartat-Proteasen werden inaktiviert.
Es ist wichtig, anzumerken, daß die Reporterenzym-Freisetzungs-Technologie der vorliegenden Erfindung auch angewandt werden kann, um die Gegenwart oder Abwesenheit eines Hydrolaseinhibitors in einer Probe nachzuweisen. Viele biologische Prozesse, einschließlich der Regulierung von Blutdruck, Blutgerinnung, Bakterien-Replikation etc., beinhalten die Verwendung von sehr spezifischen, sorgfältig modulierten Hydrolasen. Darüber hinaus ist es von zahlreichen Arzneimitteln, Pestiziden und Herbiziden etc. bekannt, daß sie Dank der Inhibierung von spezifischen Hydrolasen wirken. Unter bestimmten Umständen ist es in hohem Maße wünschenswert, die Blutkonzentration eines therapeutischen Hydrolaseinhibierenden Arzneimittels zu bestimmen oder die Gegenwart einer potenziellen Pestizid- Hydrolaseinhibitor-Kontamination bei der Produktion etc. zu bestimmen. In diesen Fällen ist es deshalb notwendig, eher den Inhibitor einer Hydrolase als die Hydrolase selbst nachzuweisen.
Die Gegenwart eines Hydrolaseinhibitors in einer Probe kann wie folgend nachgewiesen werden. Eine definierte Menge der Ziel-Hydrolase wird in das Testsystem eingebracht, und die Test-Durchführung beinhaltet das Nachweisen des Vermögens der Probe, die Ziel- Hydrolase zu inhibieren. In dem Fall, daß der Ziel-Hydrolase-Inhibitor nicht in der Probe vorhanden ist, wird die Ziel-Hydrolase das Reporterenzym von dem festen Träger freisetzen, wodurch eine nachweisbare Veränderung im Indikator erzeugt wird. Wenn, umgekehrt, der Ziel-Hydrolase-Inhibitor in der Probe vorhanden ist, wird die Ziel-Hydrolase inhibiert werden, das Reporterenzym wird nicht von dem festen Träger freigesetzt werden, und eine nachweisbare Veränderung oder Antwort im Indikator wird nicht erzeugt werden. Es ist nicht wesentlich, daß der Inhibitor in der Probe die dem Testsystem zugesetzte Ziel-Hydrolase vollständig inhibiert. Es ist lediglich erforderlich, daß eine ausreichende Menge von Ziel- Hydrolase-Inhibition stattfindet, um einen bemerkbaren Unterschied in der antizipierten nachweisbaren Antwort zu erzeugen.
Dieses Verfahren kann angewandt werden, um hinsichtlich der Gegenwart oder Abwesenheit von jedwedem bekannten Inhibitor eines hydrolytischen Enzyms zu assayen, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, den folgenden: Inhibitoren der Proteasen oder (austauschbar) Proteinasen, Peptidasen, Lipasen, Nukleasen, Homo- oder Hetero-Oligosaccharidasen, Homo- oder Hetero-Polysaccharidasen, Phosphatasen, Sulfatasen, Neuraminidasen und Esterasen. Dieses Verfahren kann angewandt werden, um hinsichtlich der Gegenwart von Proteaseinhibitoren zu assayen, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, der folgenden: Aspartat-Protease-Inhibitoren, Serinproteaseinhibitoren, Thiolproteaseinhibitoren, Metalloproteaseinhibitoren, Inhibitoren von saurer Protease und Alkalische-Protease- Inhibitoren. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform wird dieses Verfahren angewandt, um hinsichtlich der Gegenwart von Aspartat-Proteaseinhibitoren zu assayen, wie zum Beispiel Pepstatin, Ovomakroglobulin, Haloperidol, Übergangszustands-Mimetica bzw. -Nachahmungsmittel, U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 und A-7003. U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 und A-7003 sind experimentelle Arzneimittel, welche in der Literatur früher beschrieben worden sind.
Ein besonders bevorzugter chromogener Indikator ist aus einem Hydroperoxid und Guajak aufgebaut, einem Chromogen, welches in seinem reduzierten Zustand farblos ist und in seinem oxidierten Zustand tief blau ist. Wie früher beschrieben ist es, wenn der visuelle Indikator ein chromogener Indikator ist, möglich, entweder ein flüssiges Chromogen-System oder ein festes Chromogen-System zu verwenden.
In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Testvorrichtung für das Testen einer Probe hinsichtlich der Gegenwart von Candidiasis durch Assayen auf die Gegenwart einer enzymatisch aktiven Aspartat-Protease vorgesehen, wobei die Testvorrichtung umfaßt: ein Aufnahmebehältnis, mindestens teilweise begrenzt durch entgegengesetzte erste und zweite Wände, welche nach innen gerichtete Oberflächen mit einem Spalt dazwischen aufweisen, wobei die erste Wand, die zweite Wand oder beide aus einem licht-durchlässigen Material bestehen; ein Reporter-Enzym, das auf einem festen Träger auf der nach innen gerichteten Oberfläche von einer von den ersten und zweiten Wänden in einer solchen Weise immobilisiert ist, daß das Reporter-Enzym bei Wirkung der Aspartat-Protease freigesetzt wird; einen Indikator, der auf der nach innen gerichteten Oberfläche von einer von besagten ersten und zweiten Wänden immobilisiert ist, wobei der Indikator ein solcher ist, der eine nachweisbare Veränderung bei Wirkung des Reporter- Enzyms durchläuft; und eine Öffnung in dem Aufnahmebehältnis zur Einführung der Probe.
Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Aufnahmebehältnis vorzugsweise flach und dünn und von einer Größe, welche einfach mit der Hand gehalten werden kann. Folglich ist die Kammer vorzugsweise flach und auch untief, mit einer Breite und Länge, die viel größer als ihre Tiefe sind, wobei die Tiefe im wesentlichen konstant ist. Die Kammer ist vorzugsweise untief bzw. seicht genug, um die spontane Benetzung der Kammerwände mit der Ausgangsprobe zu fördern, um den maximalen Kontakt zwischen der Ausgangsprobe und den trockenen Reagenz-Überzügen auf den oberen und unteren Oberflächen zu erzielen. Dies ist von besonderem Interesse, wenn Reagenz-Überzüge sowohl auf den oberen als auch auf den unteren Oberflächen der Kammer vorhanden sind. In solchen Fällen, wird ein kleiner konstanter Abstand zwischen diesen Oberflächen auch die Distanz minimieren, über welche die Reagenzien auf der Oberfläche, welche entgegengesetzt zu derjenigen liegt, auf welche der visuelle Indikator aufgebracht worden ist, diffundieren müssen, um den Indikator zu erreichen.
Innerhalb dieser Erwägungen ist die Kammertiefe für die Erfindung nicht kritisch und kann variieren. In den meisten Fällen wird eine Kammer im Bereich von etwa 3 mil bis etwa 50 mil (0,003-0,050 Inch; 0,0076-0,127 cm) Tiefe, vorzugsweise etwa 5 mil bis etwa 15 mil (0,005- 0,015 Inch; 0,0127-0,0381 cm) die besten Ergebnisse ergeben. Für jedwede gegebene Tiefe werden die lateralen Abmessungen der Kammer (d. h. der Abstand zwischen ihren Seitenwänden) die Größe der Probe definieren, welche die Vorrichtung aufnehmen wird, und sind ansonsten unbedeutend, außer zur Definierung der Größe und Form der sichtbaren Testfläche auf der Außenoberfläche der Vorrichtung. Die lateralen Abmessungen sollten somit eine Testfläche vorsehen, welche groß genug ist, um gesehen zu werden, und dennoch klein genug, daß die Kammer von einer Probe von vernünftiger Größe vollständig gefüllt sein wird. Die Ausgangsproben-Größe wird mit dem Typ von Ausgangsprobe und seiner Quelle und dem Verfahren der Probenentnahme variieren. In typischen Strukturen wird es in Erwägung gezogen, daß die laterale Fläche der Kammer im Bereich von etwa 0,1 cm² bis etwa 10 cm², oder vorzugsweise von etwa 0,3 cm² bis etwa 3 cm², liegen wird. Das Innenvolumen der Kammer in typischen Strukturen wird in ähnlicher Weise variieren, und für die meisten Typen von Proben werden Volumina im Bereich von etwa 3 ul bis etwa 300 ul am passendsten und zweckdienlichsten sein.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine analoge Testvorrichtung bereitgestellt, welche jedoch für den Assay hinsichtlich der Gegenwart von Thiolproteasen zum Nachweis von Trichomonas vaginalis verwendet werden soll.
Das in der Testvorrichtung verwendete Reporterenzym oder Markerenzym kann jedwedes signalerzeugende Enzym sein, d. h. ein Enzym, dessen Aktivität eine nachweisbare Veränderung entstehen läßt, welche(s) nicht der Inaktivierung durch irgendein Mittel in der Probe unterworfen ist, einschließlich inaktivierender Hydrolyse durch irgendeine Aspartat-Protease, Thiolprotease oder andere Hydrolase-Aktivität, welche in der Probe vorhanden ist. Solche Reporterenzyme sind obenstehend aufgelistet.
Das Reporterenzym ist auf einen ersten festen Träger wie obenstehend beschrieben immobilisiert.
Das Reporterenzym kann direkt an den ersten festen Träger angeheftet werden, oder alternativ dazu kann das Reporterenzym auf dem ersten festen Träger über die Verwendung eines Linker-Moleküls, wie obenstehend beschrieben, immobilisiert werden.
In der Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung wird der Indikator auf einem zweiten festen Träger immobilisiert, welcher nicht in Kontakt mit dem ersten festen Träger steht. Bevorzugte feste Träger gemäß der vorliegenden Erfindung schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die folgenden ein: Cellulose, Agarose, Dextran, Polyacrylat, oder ihre Derivate, Chitin, Sepharose, Oxiran-Acryl-Perlen, polymeres Dialdehyd, Stärke, Collagen, Keratin, Elastin, Rinderhautpulver, Bakterienzellwandpeptidoglykan oder Fragmente davon, Polyacrylamid, Nylon, Polyethylenterephthalate, Polycarbonate und Glas von regulierter Porengröße. Die Immobilisierung des Indikators auf dem zweiten festen Träger wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren und Vorgehensweisen, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt.
Der in der Testvorrichtung verwendete Indikator kann wie obenstehend beschrieben beschaffen sein.
Wie obenstehend erörtert, kann eine breite Vielfalt von chromogenen Indikatoren (d. h. Chromogenen) und anderen Spezies mit einem ähnlichen Effekt als visuelle Indikatoren verwendet werden.
Wenn der visuelle Indikator ein chromogener Indikator ist, wird ein festes Chromogen- System, wie obenstehend erörtert, angewandt.
In diesem besonderen Chromogensystem kann das Hydroperoxid entweder in einer festen Form (wie zum Beispiel Titaniumhydroperoxid) vorgesehen werden, oder es kann in der Vorrichtung in situ erzeugt werden. Wasserstoffperoxid kann zum Beispiel in situ durch Aufschichten von getrockneter Glucose und Glucoseoxidase auf den nach innen gerichteten Oberflächen der Testvorrichtung erzeugt werden. Alternativ dazu kann Wasserstoffperoxid in situ durch Aufbeschichten einer Suspension von Natriumperborat in Alkohol auf den nach innen gerichteten Oberflächen der Testvorrichtung erzeugt werden. Der Effekt bei niedrigem pH-Wert wurde obenstehend erörtert.
Die Reaktionsbedingungen der vorliegend beanspruchten Testvorrichtung können modifiziert werden, wie obenstehend erörtert.
Die Testvorrichtung ist mit einer Probeneinführungs-Öffnung ausgestattet, durch welche die Ausgangsprobe in die Kammer eingebracht wird. Die Öffnung befindet sich vorzugsweise in der gleichen Wand, durch die Veränderungen im visuellen Indikator beobachtet werden, d. h. der lichtdurchlässigen Wand. Die Öffnung wird geformt sein, um die Transfer-Vorrichtung aufzunehmen, welche verwendet wird, um die Probe von ihrer Quelle zu befördern, und die Öffnung kann daher variiert werden, um zu einem beliebigen der verschiedenen Typen von Transfervorrichtungen zu passen, welche verwendet werden könnten. Beispiele von Transfer- Vorrichtungen sind Spritzen, Pipetten, Tupfer und Spekula bzw. Spiegel. Andere werden dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sein. Eine kreisförmige Öffnung ist im allgemeinen angemessen, obwohl für Transfer-Vorrichtungen, wie Tupfer, die Öffnung eine gerade Kante enthalten kann, entlang welcher die Transfer-Vorrichtung abgestreift werden kann, um die Ausgangsprobe einfacher freizusetzen.
Bevorzugte Ausführungsformen der Testvorrichtung beinhalten weitere Merkmale, welche die zur Füllung der Kammer und dadurch Plazierung aller Reagenzien in Kontakt mit der Ausgangsprobe benötigte Fluid-Migration weiter fördern. Ein solches Merkmal ist der Einschluß von einem oder mehreren Entlüftungslöchern in der Kammer, um das Austreten von Luft zu gestatten. Die Entlüftungslöcher werden in angemessener Weise einen Abstand von der Probeneinführungsöffnung aufweisen, um den von der Ausgangsprobe benetzten Oberflächen- Bereich zu maximieren. In Vorrichtungen, bei welchen Ausgangsprobenaktivierte Positiv- und Negativ-Kontrollen innerhalb der Kammer in horizontal zur Testfläche angrenzenden Positionen eingeschlossen sind, werden die Entlüftungslöcher angeordnet, um zu gewährleisten, daß die Ausgangsprobe beide Kontrollen erreicht und sie füllt, um jedwede falschen oder zweideutigen Ablesungen zu vermeiden. Wie nachstehend erörtert, ist eine bevorzugte Anordnung der Vorrichtung die Plazierung der Testfläche zwischen den Kontrollflächen, so daß die Positiv- und Negativ-Kontrollflächen keine gemeinsame Grenze teilen, obwohl jede eine gemeinsame Grenze mit der Testfläche gemein hat. In dieser Anordnung wird die Probeneinführungsöffnung am zweckmäßigsten an einer Stelle in der Wand plaziert, direkt überhalb der Testfläche, und ein Entlüftungsloch wird oberhalb jeder der zwei Kontrollflächen an oder nahe den äußeren Extremitäten dieser Flächen plaziert, wodurch die Ausgangsprobe veranlaßt wird, zuerst die Testfläche und dann beide Kontrollflächen zu füllen.
Ein anderes die Fluid-Migration förderndes Merkmal in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Plazierung eines oberflächenaktiven Mittels entlang der inneren Oberfläche der Kammer. Das Mittel kann entlang einer oder der anderen der oberen und unteren Oberflächen der Kammer, vorzugsweise beiden, vorliegen und kann als ein trockener gelöster Stoff in einer Trägermatrix eingeschlossen sein, umfassend die innerste Lamina oder Beschichtung auf der Oberfläche. In manchen Fällen wird die Lamina auch ein oder mehrere Reagenzien enthalten, welche an den Testreaktionen teilnehmen. In anderen Fällen wird das oberflächenaktive Mittel die einzige funktionelle Komponente der Lamina sein.
Oberflächenaktive Mittel werden für Ausgangsproben nützlich sein, welche auf Wasser-Basis beschaffen sind, wie es bei den meisten biologischen Proben der Fall ist. Geeignete oberflächenaktive Mittel werden diejenigen sein, welche in eine feste Form gebracht werden können, und eine breite Vielfalt von Substanzen, welche einen oberflächenaktiven Effekt aufweisen, kann verwendet werden. Die Substanzen werden im allgemeinen Detergenzien, Benetzungsmittel oder Emulgatoren sein, und werden in der chemischen Struktur und dem Elektronen-Charakter in breitem Maße variieren, einschließlich anionischer, kationischer, zwitterionischer und nichtionischer Substanzen. Beispiele sind Alkyl-Alkoxysulfate, Alkylarylsulfonate, Glycerinfettsäureester, Lanolin-basierende Derivate, Polyoxyethylenalkylphenole, Polyoxyethylenamine, Polyoxyethylenfettsäuren und -ester, Polyoxyethylenfettalkohole und -ether, Poly(ethylenglykol)fettsäuren und -ester, Polyoxyethylenfettester und Öle, Polyoxypropylen/Polyoxyethylen-Kondensate und -Blockpolymere, Sorbitanfettsäureester, Sulfo-Derivate von Succinaten, Alkylglucoside und Cholsäurederivate. Handelsnamen von Produkten, die in einige dieser Klassen fallen, sind Lubrol, Brij, Tween, Tergitol, Igepal, Triton, Teepol und viele andere.
Die Bildung der festen Laminae, sowohl Indikator- als auch Reagenzien-Laminae, kann durch Auftragen des Lamina-Materials in flüssiger Form, gefolgt von Trocknen oder einer anderen Verfestigung, bewerkstelligt werden. Die flüssige Form der Substanz kann zum Beispiel eine Lösung, eine Suspension oder ein ungehärteter flüssiger Zustand der Substanz sein, und der Verfestigungsschritt kann somit eine Verdampfung des Lösungsmittels oder ein Härten der Substanz sein. Die Substanz von Interesse kann mit zusätzlichen Materialien für einen beliebigen einer Vielzahl von Zwecken kombiniert werden, wie zum Beispiel:
(1) um das Aufbringen der Flüssigkeit auf die Oberfläche durch Modifizieren der Viskosität der Flüssigkeit zu erleichtern,
(2) um bei der Bildung einer kontinuierlichen glatten festen Schicht zu helfen, welche gleichmäßig bleibt und über die Zeit oder bei der Aufbringung weiterer Schichten darüber nicht disintegriert oder granuliert,
(3) um die Solubilität der Schicht mit in den darüber aufzubringenden Schichten verwendeten Lösungsmitteln zu modifizieren oder die Schicht in Lösungsmitteln löslich zu machen, welche darunter aufgetragene Schichten nicht lösen,
oder alle von diesen gleichzeitig. Lösliche polymere Materialien sind bevorzugte Additive, um einem oder allen dieser Zwecke zu dienen. Beispiele sind Cellulose und verschiedene Cellulosederivate, wobei die Substitutionen passend gewählt werden, um die gewünschten Solubilitäts-Merkmale zu erreichen. Für diejenigen Testvorrichtungen, welche für wäßrige oder andere Wasser-basierende Proben entworfen sind, enthält die Indikator-Lamina vorzugsweise den Indikator, der zurückgehalten wird in einer Matrix von festem Material, das in Wasser unlöslich ist. Dies verhindert, daß der Indikator aus der Lamina heraus und von der lichtdurchlässigen Oberfläche wegwandert. Alternativ dazu ist allerdings der Indikator selbst in Wasser unlöslich und wird von sich aus eine kohärente Lamina bilden, welche unversehrt bleiben wird.
Für diejenigen Ausführungsformen der Erfindung, in welchen ein Positiv-Kontrolle-Indikator, ein Negativ-Kontrolle-Indikator oder beide in der Vorrichtung eingeschlossen sind, werden ein oder mehrere zusätzliche Reagenzien für jede Kontrolle eingeschlossen werden. Diese zusätzlichen Reagenzien werden entweder innerhalb einer der existierenden Laminae in einer horizontal definierten Portion dieser Lamina eingebunden werden oder als eine separate, vertikal angrenzende Lamina über einer horizontal definierten Portion der existierenden Lamina aufgebracht. Dank ihrer Position in der Kammer definieren diese zusätzlichen Reagenzien deshalb Kontrollflächen, welche horizontal voneinander und von der Testfläche getrennt sind.
Die Auswahl eines passenden Reagenzes für eine Positiv- oder Negativkontrolle wird von der Hydrolase abhängen, gegen die der Gesamttest gerichtet ist, dem Typ von visuellen Indikator, der verwendet wird, um die Gegenwart der Hydrolase nachzuweisen, und davon, ob das Reagenz beabsichtigtermaßen als eine Positivkontrolle oder eine Negativkontrolle dient. Durch Anwenden bekannter Chemie wird die Auswahl eines passenden Reagenzes in den meisten Fällen dem Fachmann offensichtlich sein. Das Reagenz für eine Positivkontrolle kann zum Beispiel eine Probe der Hydrolase selbst, ein Analog der Hydrolase oder irgendeine andere Spezies mit einer parallelen Wirkungsweise sein, welche(s) die Reaktion oder Reaktionsabfolge, welche in einer nachweisbaren Veränderung im Indikator kulminiert, initiiert oder induziert. Die dieses Reagenz enthaltende Lamina wird auf einer von der oberen oder unteren Oberfläche der Kammer sein, vorausgesetzt daß das Reagenz die nachweisbare Veränderung nicht initiieren oder induzieren wird, bis die Ausgangsprobe vorhanden ist, aber dieses unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit der enzymatisch aktiven Hydrolase in der Ausgangsprobe tun wird. Das Reagenz für eine Negativkontrolle kann in gleicher Weise eine inhibierende Spezies sein, wie ein denaturierendes, inhibierendes oder anderweitig inaktivierendes Mittel, welches die Reaktion oder Reaktionsabfolge verhindert oder blockiert, und dadurch das Auftreten der nachweisbaren Veränderung verhindert, ungeachtet dessen, ob die enzymatisch aktive Hydrolase in der Probe oder Ausgangsprobe vorhanden ist oder nicht.
Beide Kontrollen werden aktiviert, wenn die Ausgangsprobe auf die Testvorrichtung aufgebracht wird. In manchen Fällen wird dies am effektivsten durch Plazieren der Kontrollreagenzien in Laminae auf der gleichen Oberfläche, wie die Lamina(e) mit den anderen Reagenz(ien), erreicht. In anderen Fällen werden beste Ergebnisse erreicht, wenn die Kontrollreagenzien in Laminae auf der Kammeroberfläche plaziert werden, entgegengesetzt zu jener, welche die anderen Reagenz(ien) trägt, so daß das Kontrollreagenz und die restlichen Reagenz(ien) durch den Luftspalt getrennt sind. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Kontrollflächen der Vorrichtung alle in der Testfläche verwendeten Komponenten und Reagenzien mit dem Zusatz der Kontrollreagenzien enthalten, entweder eingebunden in horizontal entworfenen bzw. abgegrenzten Abschnitten von einer oder mehreren der gleichen Laminae, die in der Testfläche verwendet werden, oder aufgebracht als separate Laminae über solchen horizontal abgegrenzten Abschnitten. Um scharfe Grenzen für die Kontrollflächen zu erzielen und die Kontrollreagenzien von der Aktivierung oder Deaktivierung der Testfläche zu hindern, ist es oft nützlich, Unterbrechungen in die Laminae an den Grenzen zu plazieren, welche die Kontrollflächen von der Testfläche trennen, um die Möglichkeit von lateraler Diffusion der Kontrollreagenzien aus ihren jeweiligen Kontrollflächen heraus zu minimieren oder zu eliminieren. Diese Unterbrechungen können in Laminae entlang der oberen Oberfläche, der unteren Oberfläche oder beiden vorliegen.
Wie obenstehend angezeigt, werden die Kontrollen vorzugsweise durch dieselbe Probe aktiviert, wie sie für den Test verwendet wird. Dies wird zweckmäßigerweise durch Anordnen der Kontrollflächen als Ausläufer bzw. Verlängerungen der Testfläche, alle enthalten in derselben Kammer in der Testvorrichtung, mit unbehinderter Fluid- Kommunikation zwischen den verschiedenen Flächen bewerkstelligt. In bevorzugten Ausführungsformen, wo sowohl Positiv- als auch Negativ-Kontrollflächen eingeschlossen sind, sind die Kontrollflächen voneinander durch die Testfläche isoliert, welche zwischen den zweien positioniert ist. Das Füllen von allen Flächen mit einer einzelnen Aufbringung kann mit der Anordnung der Probeneinführungsöffnung und der Entlüftungslöcher, die obenstehend beschrieben wurde, bewerkstelligt werden. Da die nachweisbaren Veränderungen, oder deren Abwesenheit, durch die lichtdurchlässige Wand der Vorrichtung nachweisbar sind, wird die Identifikation von Flächen als Positiv- und Negativkontrollen zweckmäßigerweise durch Aufbringen von passenden Zeichen auf der Außenoberfläche der Vorrichtung erreicht.
Die lichtdurchlässige Wand kann jedwedes Material sein, welches inert und ausreichend starr ist, um die Indikator-Lamina zu tragen, und dennoch ausreichend durchlässig für Licht ist, um die Veränderung im Indikator zu zeigen, sobald sie stattfindet. Transluzente oder transparente Materialien, vorzugsweise nicht-absorbierende Materialien, können verwendet werden; transparente Materialien werden bevorzugt. Beispiele von transparenten polymeren Materialien, die für diese Verwendung geeignet sind, sind Polyethylenterephthalate (wie zum Beispiel Mylar®) und Polycarbonate (wie zum Beispiel Lexan®). Die entgegengesetzte (d. h. Boden-) Wand der Vorrichtung kann gleicherweise aus transparentem oder transluzentem Material hergestellt sein, obwohl sie auch aus opakem Material sein kann, da die Visualisierung der Testergebnisse als auch der Positiv- und Negativkontrollen nur von einer Seite der Vorrichtung erfordert wird. Wenn die Bodenwand transparent ist, kann der Nachweis der Veränderung in der Testfläche, den Kontrollflächen oder beiden durch die Oberseitenwand durch Aufbringung einer Bedruckung oder eines Überzugs auf eine Seite der Bodenwand mit einem gefärbten oder reflektierenden Material zur Erhöhung des Farbkontrastes verbessert werden.
Die Testvorrichtung kann auf einer Vielzahl von Wegen gebildet werden. Blatt-Lagen bzw. Tafeln von polymerem Material können zusammenlaminiert werden mit passenden Aus schnitten, um die Gestalt der Kammer und Löcher für die Probeneinführungsöffnung und die Entlüftungslöcher zu definieren. Die Tiefe der Kammer als auch ihre Gestalt und lateralen Abmessungen werden dann durch die Dicke der zentralen Tafel definiert werden, während die Anordnung der Löcher durch die obere Tafel geregelt werden wird. Die Indikator- und Reagenz-Überzüge können dann auf die obere Tafel, BodenTafel oder beide, wie benötigt, aufgebracht werden, bevor die Tafeln zu dem Laminat zusammengebaut werden. Die Tafeln können dann auf einem beliebigen herkömmlichen Wege, wie zum Beispiel Hitze- Versiegelung oder durch die Verwendung von Klebstoffen, zusammen-gesichert werden.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Bildung der Vorrichtung erfolgt durch die Verwendung einer einzelnen Tafel von transparentem oder anderweitig lichtdurchlässigem polymeren Material, wobei ein Abschnitt der Tafel ausgeprägt oder anderweitig, mechanisch oder chemisch, verarbeitet ist, um eine Vertiefung oder Einschneidung von konstanter Tiefe in der inneren Oberfläche der Kammer zu enthalten. Die Vertiefung ist auf einer Hälfte der Tafel lokalisiert, wobei die Löcher für Probeneinführung und Entlüftung auf der anderen Hälfte sind. Die Indikator- und Reagenzien-Überzüge werden an passenden Stellen auf der Tafel angebracht, und die Hälfte mit den Löchern wird dann über die andere Hälfte gefaltet, um die geschlossene Kammer zu formen und die korrekte Ausrichtung der Flächen, welche die unteren und oberen Oberflächen der Kammer repräsentieren, zu erzielen. Die zueinander blickenden Oberflächen der Tafel werden aneinandergebunden, wie in dem Laminat des vorausgehenden Abschnitts.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Aneinanderbinden der zwei Hälften erfolgt durch die Verwendung eines wärmeempfindlichen, druckempfindlichen Klebstoffs auf Wasserbasis oder Lösungsmittelbasis. Der Klebstoff kann auf die zu der Kammer peripheren Flächen beschränkt sein, um Kontakt mit den Testreagenzien zu vermeiden, oder er kann die gesamte Oberfläche der Tafel bedecken, wobei er vor der Aufbringung der Indikator- und Reagenzien- Überzüge aufgebracht worden ist. Im letztgenannten Falle werden passende Klebstoffe diejenigen sein, welche transparent, inert, benetzbar durch und ansonsten kompatibel mit den darüber aufzubringenden Schichten sind. Viele Typen von für diese Anwendung geeigneten Klebstoffen existieren, und die passendste Wahl wird von einem System zum nächsten in Abhängigkeit von den darüber aufzubringenden Schichten variieren.
Die Gegenwart eines Hydrolaseinhibitors in einer Probe kann unter Verwendung einer Testvorrichtung auf eine ähnliche Weise nachgewiesen werden, wie derjenigen, welche obenstehend im Zusammenhang mit dem Testsystem erörtert wurde. Eine definierte Menge der Ziel-Hydrolase wird in die Vorrichtung entweder unmittelbar vor der Durchführung des Tests oder, vorzugsweise, während der Herstellung der Testvorrichtung eingebunden. Die Positiv- und Negativkontroll-Elemente der obenstehend erörterten Testvorrichtung liefern Vergleichsantworten, um die Erscheinungen von vollständig inhibierter Ziel-Hydrolase und einer von Inhibition freien Ziel-Hydrolase zu veranschaulichen.
Die Empfindlichkeit dieser Enzymfreisetzungs-Technologie kann wie benötigt eingestellt werden durch Einbinden von definierten Mengen der Ziel-Hydrolase in die Testvorrichtung. In ähnlicher Weise kann, falls gewünscht, die Expositionszeit der Ziel-Hydrolase an irgendeinen Inhibitor in der Probe durch physikalisches oder chemisches Trennen der Ziel- Hydrolase von dem immobilisierten Reporterenzym reguliert werden. Zum Beispiel kann, durch Aufbeschichten des immobilisierten Reporterenzyms in einer Matrix mit Zeitverzögerung, einer pH-zersetzbaren Beschichtung oder anderem Material mit gesteuerter Freisetzung, das sich vergleichsweise langsam auflöst, der zeitliche Zugang der Ziel- Hydrolase zu dem immobilisierten Reporterenzym gesteuert werden. Alternativ dazu kann die Ziel-Hydrolase an einer Stelle oder in einer chemischen Form vorhanden sein, welche für jedweden Inhibitor, der in der Probe vorhanden sein kann, unmittelbar zugänglich ist. Somit kann die Ziel-Hydrolase, bevor sie Zugang zu dem immobilisierten Reporterenzym gewinnt, zuerst eine ausreichende Zeit lang an den Inhibitor ausgesetzt sein, damit eine Inhibition stattfindet. Da der Zugang zu dem immobilisierten Reporterenzym zeitlich reguliert sein kann, können die Testergebnisse sogar die Gegenwart von langsam wirkenden Inhibitoren nachweisen.
Diese Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um eine Probe hinsichtlich der Gegenwart oder Abwesenheit von Aspartat-Protease-Inhibitoren oder Thiolprotease-Inhibitoren zu testen. Insbesondere wird die Testvorrichtung verwendet, um hinsichtlich der Gegenwart von Aspartat-Protease-Inhibitoren zu assayen, wie zum Beispiel Pepstatin, Ovomakroglobulin, Haloperidol, Übergangszustand-Mimetica, U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 und A-7003. U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 und A-7003 sind experimentelle Arzneimittel, welche in der Literatur zuvor beschrieben worden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Pepstatin der Aspartat-Protease- Inhibitor, dessen Vorhandensein nachgewiesen wird.
Es versteht sich, daß die Struktur einer Testvorrichtung zum Assayen hinsichtlich der Gegenwart einer Hydrolase vollständig auf eine Testvorrichtung zum Testen einer Probe auf die Gegenwart von Candidiasis durch Assayen hinsichtlich der Gegenwart von enzymatisch aktiver Aspartat-Protease und eine Testvorrichtung zum Testen einer Probe hinsichtlich der Gegenwart eines Inhibitors einer Ziel-Hydrolase anwendbar ist.
Wenngleich es nicht beabsichtigt ist, daß die Erfindung auf irgendeine besondere Konstruktion einer Testvorrichtung eingeschränkt ist, veranschaulichen die beigefügten Figuren, welche nicht maßstabsgetreu gezeichnet sind, wie eine solche Vorrichtung konstruiert werden kann.
Die Fig. 1 zeigt die Trägerstruktur der Vorrichtung in einer perspektivischen Ansicht, bevor der Indikator und die Reagenzien appliziert wurden und die Kammer geschlossen wurde. Die Trägerstruktur besteht aus einer einzelnen Tafel 11 aus relativ steifem, transparenten, chemisch inerten Kunststoffmaterial, mit einer eingekerbten Linie 12, welche eine Faltung definiert, die die Tafel in zwei Hälften 13, 14, jeweils mit der gleichen Länge und Breite, unterteilt. Die untere Hälfte 13 enthält eine Ausschneidung einer zusammengesetzten Gestalt, bestehend aus einem Kreis 15 in der Mitte mit zwei rechteckigen Verlängerungen 16, 17, welche sich zu entgegengesetzten Seiten erstrecken. Die obere Hälfte 14 enthält drei Löcher, einschließlich eines zentralen Loches 18, welches als die Probeneinführungsöffnung dient, und zweier Seitenlöcher 19, 20 welche als Entlüftungslöcher dienen. Die zwei Entlüftungslöcher 19, 20 sind kreisförmig, während die Probeneinführungsöffnung 18 kreisförmig mit einer geraden Kante ist, um das Abkratzen der Ausgangsprobe von dem Tupfer, welcher als ein Transfergerät verwendet wird, zu erleichtern. Die Löcher sind so positioniert, das wenn der Kunststoff an der Kerb-Linie 12 gefaltet wird, und die obere Hälfte 14 im Kontakt mit der Boden-Hälfte 13 in Kontakt gebracht wird, die Probeneinführungsöffnung 18 überhalb der Mitte des kreisförmigen Teils 15 der Ausschneidung ist, und die Entlüftungslöcher 19, 20 überhalb der zwei rechteckigen Verlängerungen 16, 17 an der äußersten Kante von jedem sind. Die zwei rechteckigen Ausläufer 16, 17 repräsentieren die Positiv- und Negativ- Kontroll-Flächen der Vorrichtung.
Es können viele Variationen der Vorrichtung von Fig. 1 angefertigt werden. Die zwei Hälften 13, 14 können aus verschiedenen Gründen unterschiedliche Längen, Breiten oder beides aufweisen. Der einzige kritische Gesichtspunkt besteht darin, das die Ausschneidungen in der unteren Hälfte und die Löcher in der oberen Hälfte so relativ zu der Kerblinie positioniert werden, das die Löcher und Ausschneidungen in richtiger Überlagerung sind, wenn die zwei Hälften an der Kerblinie gefaltet werden. Als ein anderes Beispiel können die rechteckigen Ausläufer 16, 17 in der unteren Hälfte der Struktur in kreisförmigen (oder halbkreisförmigen) Flächen endigen, um den Entlüftungslöchern 19, 20 in der oberen Hälfte zu entsprechen. Die Entlüftungslöcher selbst können von einer beliebigen Form sein. In der Tat haben Entlüftungslöcher, welche unterschiedlich von dem Probeneinführungsloch 18 geformt sind, den Vorteil eine Verwirrung des Anwenders, wo die Probe einzuführen ist, zu verhindern.
Die Fig. 2 ist eine Seiten-Schnittansicht der Vorrichtung von Fig. 1, welche die Kammer 31 im Schnitt zeigt, nachdem die Überzüge aufgebracht und die zwei Hälften übereinandergefaltet und aneinander versiegelt worden sind. Die inneren Oberflächen von jeder der zwei Hälften 13, 14 des transparenten Polymers sind jeweils mit einem Klebstoff 32 bzw. 33 beschichtet. Direkt unterhalb der oberen Klebstoffschicht 33 befindet sich die Schicht mit dem visuellen Indikator 34, und unterhalb der letztgenannten befindet sich eine Schicht von Reagenz 35. Es wird bemerkt werden, das sowohl die visuelle Indikator-Schicht 34 als auch die Reagenzschicht 35 sich über die volle Länge und Breite der Kammer erstrecken können, umgebend die Probeneinführungsöffnung 18 und sich ausstreckend in alle Bereiche der Kammer.
Die Test- und Kontrollflächen der Kammer werden durch die horizontalen Lokalisierungen der Überzüge auf der unteren Wand 13 der Kammer definiert. Ein Reagenz für die Negativ- Kontrolle ist in einem Überzug 36 enthalten, welcher die untere Oberfläche von einem der zwei rechteckigen Ausläufer 16 der Kammer besetzt (siehe Fig. I) und ein Reagenz für die Positiv-Kontrolle ist einem zweitem Überzug 37 enthalten, der ähnlich in dem anderen rechteckigen Ausläufer 17 gelegen ist. Alternativ dazu können Reagenzien für die Kontrollen auf der oberen Oberfläche der Kammer anstatt der unteren plaziert sein. Dies wird für bestimmte Assays in der Tat bevorzugt. Der Bereich der unteren Oberfläche unter dem zentralen kreisförmigen Abschnitt 15 der Kammer (siehe Fig. 1) ist mit einer Schicht 38 überzogen, welche entweder ein in der Testreaktion verwendetes zusätzliches Reagenz oder überhaupt kein Reagenz enthalten kann. Wie von der Oberseite der geschlossenen Vorrichtung betrachtet, wird daher die kreisförmige Testfläche 41 von einer rechteckigen Negativ-Kontrollfläche 42 und einer rechteckigen Positiv-Kontrollfläche 43 flankiert. Die drei Segmente 36, 37, 38, können durch Lücken oder Unterbrechungen 44, 45 getrennt sein, um die Diffusion zwischen, oder den Kontakt von, den Inhalten dieser Segmente zu retardieren oder minimieren. Ähnliche Unterbrechungen können auch in jeder oder beiden der visuellen Indikator- und Reagenzien- Schichten 34, 35 direkt über den Unterbrechungen 44, 45 in der unteren Schicht plaziert sein. Die Unterbrechungen in den visuellen Indikator- und Reagenzienschichten werden die Diffusion von Kontroll-Komponenten oder anderen Reagenzien aus den Kontroll-Flächen in die Testfläche hinein weiter verhindern. Die am meisten nach innen gerichteten der Schichten 35, 36, 37, 38 können alle, zusätzlich zu irgendwelchen vorhandenen Reagenzien, ein Benetzungsmittel oder Detergenz enthalten, um die rasche und vollständige Ausbreitung der Ursprungsprobe entlang der oberen und unteren Oberflächen zu fördern, um die Kammer zu füllen. In manchen Fällen wird derselbe Effekt durch eine Proteinschicht erzielt.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung neigen die Reagenzien dazu, sich bei verlängerter Exposition an Luft oder in der Luft befindlicher Feuchtigkeit zu verschlechtern. In der in Fig. 2 gezeigten Vorrichtung wird dies durch eine dünne Lage von Material 46 verhindert, welches sowohl feuchtigkeitsundurchlässig als auch luftundurchlässig ist. Die Lage bedeckt die Probeninjektionsöffnung und beide Entlüftungslöcher, wobei das Kammerinnere von der Umgebung abgeschlossen ist, bis die Vorrichtung zum Einsatz bereit ist, wobei die Lage ohne weiteres abgezogen werden kann. Für Materialien, welche besonders wasserempfindlich oder luftempfindlich sind, kann es auch wünschenswert sein, ein feuchtigkeits- und luftundurchlässiges Blatt auf dem Boden der Vorrichtung zu plazieren, wobei des Blatt entweder permanent angeheftet ist oder in der Lage dazu ist, abgezogen zu werden. Weiterer Schutz gegen Feuchtigkeit und Luft kann durch Einbringen der Vorrichtung in einen Beutel, der die Vorrichtung vollständig umgibt, erreicht werden.
Wie obenstehend angegeben, kann jede der Abmessungen der in der Fig. 1 und 2 gezeigten Vorrichtung variieren, wie auch ihre Anordnungen und Gestalten. Ein typisches Beispiel ist jedoch eines, in welchem das Trägerblatt Mylar (Warenzeichen) von 5 mil Dicke (0,005 Inch, 0,0127 cm) ist, und die Klebstoffschicht niedrig-dichtes Polyethylen von 2 mil Dicke (0,002 Inch, 0,0051 cm) ist, die Spaltbreite 47 sich auf 7,5 mil (0,0075 Inch, 0,019 cm) beläuft, die Testfläche ein Kreis von 5/16 Inch Durchmesser ist (Fläche: 0,0766 Inch², 0,494 cm²), und die Negativ- und Positivkontrollflächen jeweils 1/8 Inch · 1116 Inch messen (Fläche: 0,0078 Inch², 0,0504 cm²). Die Luftlöcher in diesem Beispiel sind jeweils kreisförmig, und sie und die Probeneinführungsöffnung sind jeweils von einem Durchmesser von 1/8 Inch (0,32 cm). Das Kammervolumen beträgt ungefähr 12 ul.
Die Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung ist verwendbar zum Testen von Proben hinsichtlich der Gegenwart einer Hydrolase aus einem breiten Bereich von Quellen, einschließlich biologischen Quellen und anderen. Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Harnröhren-Ausscheidung, Tränen, Vaginalflüssigkeit, Gebärmutterhals-Exudat, Rückenmarkflüssigkeit und Speichel, sowie Nicht-Körperflüssigkeiten, wie Nahrungsmittel, Teich- oder Swimmingpool-Wasser und flüssige Abfälle sind Beispiele.

Beispiele

1. HERSTELLUNGEN

A. Herstellung von Cyanogenbromid-aktivierten festen Trägern

1. MATERIALIEN

a. Feste unlösliche Träger (Sepharose 4 B, Chitin und Sigmacell® 20 [bezogen von Sigma Chemical Co.])
b. Destilliertes Wasser und mit destillierten Wasser hergestelltes Eis
c. 4,0 M NaOH
d. Festes CNBr
e. Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO&sub3;, enthaltend 0,5 M NaCl)
f. Magnetischer Rührer-Motor und Rührstab; pH-Meter; Chemikalien-Abzugshaube

2. VORGEHENSWEISE

Zehn Milliliter (10 ml) von kaltem destillierten Wasser wurden zu 5 Gramm feuchtem, gewaschenen festen Träger zugesetzt, und die Mischung wurde auf 10ºC-15ºC abgekühlt. Der pH der Suspension wurde mit 4,0 M NaOH auf 10,8 eingestellt, und 100 mg festes, zerkleinertes CNBr wurden pro Gramm feuchtem festen Träger zugegeben. Der pH-Wert wurde durch Zusetzen von 4,0 M NaOH, falls notwendig, bei 10,8 aufrechterhalten, und die Temperatur der Suspension wurde während des Aktivierungsverfahrens auf 18ºC-20ºC steigen gelassen. Die Aktivierung wurde als vollständig betrachtet, wenn keine weiteren Zugaben von 4,0 M NaOH benötigt wurden, um den pH auf 10,8 zu halten. Zu diesem Zeitpunkt wurde Bruch-Eis zugegeben, um das Reaktionsgemisch zu kühlen, und die Suspension wurde auf einem vorgekühlten gesinterten Trichter filtriert. Das Filtrat wurde in einem Absaugkolben aufgefangen, enthaltend festes Eisen(II)-sulfat, das restliches CNBr und Cyanid inaktivierte, welches in der Reaktionsmischung zurückblieben. Der feste Träger wurde mit einem Liter kaltem destillierten Wasser und einem Liter Kopplungspuffer unter Absaugen gewaschen und als eine feuchte Paste bei 4ºC aufbewahrt.

B. Herstellung von [Kappa-Casein-HRPO]- Konjugaten (Hydrazid-Verfahren)

1. MATERIALIEN

a. Kappa-Casein und Meerettich-Peroxidase (HRPO)-Hydrazid [erworben von Sigma Chemical Co.]
b. Destilliertes Wasser
c. Puffer:
i. 50 mM 2-[Morpholino]ethansulfonsäure](MES)-Puffer, pH 6,0
ii. 100 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0 enthaltend 0,5 M NaCl
iii. 100 mM Natriumborat, pH 9,0, enthaltend 0,5 M NaCl
d. Festes Natriumperiodat
e. 100 mM Formaldehyd

2. VORGEHENSWEISE

a. Periodat-Aktivierung von Kappa-Casein

Zwanzig mg Kappa-Casein wurden in 2 ml MES-Puffer gelöst und 8,6 mg festes Natriumperiodat wurden zu der Lösung zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang auf einem Rotor im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde dann gegen ungefähr 300 ml 50 mM MES, pH 6,0, ungefähr 45 Minuten lang bei Raumtemperatur dialysiert, wonach die Dialyseflüssigkeit ersetzt und die Dialyse weitere 45 Minuten lang fortgesetzt wurde.

b. Kovalente Verknüpfung von HRPO an Kappa-Casein

Fünf mg HRPO-Hydrazid (ungefähr 175 Unit/mg Protein) wurden zu aktiviertem dialysierten Kappa-Casein zugegeben und die Mischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Bewegung inkubiert. 200 Mikroliter von 100 mM Formaldehyd wurden zu dem Gemisch gegeben, und die Inkubation weitere 30 Minuten lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. 2 ml kalter 1 M Acetatpuffer, pH 4,0, wurden zugegeben, und das Konjugat wurde 30 Minuten lang bei 4ºC präzipitieren gelassen. Das Pellet wurde durch Zentrifugation entfernt, in 2 ml 100 mM Boratpuffer, pH 9,0, gelöst und bis zur Verwendung bei 4ºC aufbewahrt.

C. Anheftung von [Kappa-Casein-HRPO]-Konjugaten (Hydrazid-Verfahren) an Cyanogenbromid-aktivierte Träger

1. MATERIALIEN

a. [Kappa-Casein-HRPO]-Konjugate (HERSTELLUNG B)
b. Destilliertes Wasser
c. Puffer:
i. Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO&sub3; enthaltend 0,5 M NaCl)
ii. 1,0 M Tris-Puffer, pH 8,0
iii. 100 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iv. 100 mM Natriumborat-Puffer, pH 9,0, enthaltend 0,5 M NaCl
d. Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4 B und Sigmacell® 20 (HERSTELLUNG A)
e. Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 6 MB (von Sigma Chemical Co.)

2. VORGEHENSWEISE

a. Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4 B und Sigmacell® 20

Zwei Milliliter [Kappa-Casein-HRPO]-Kojugat, hergestellt aus dem Hydrazid von HRPO, wie beschrieben in HERSTELLUNG B, wurden mit 3 ml Kopplungspuffer verdünnt und zu einem Gramm feuchter Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose 4B oder Sigmacell® zugesetzt. Die Suspension wurde Ende-über-Ende zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gemischt. Der feste Träger wurde mit Kopplungspuffer und Wasser gewaschen, und 3 ml 1,0 M Tris-Puffer, pH 8, wurden zugegeben. Die Suspension wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, um verbleibende aktive Stellen auf dem festen Träger zu inaktivieren. Drei Waschzyklen, jeder bestehend aus pH 4,0-Acetatpuffer, gefolgt von Kopplungspuffer, wurden angewandt, um ungebundene Materialien von dem Träger zu entfernen. Eine letztendliche Waschung mit destillierten Wasser wurde angewandt, und die feuchte Suspension wurde bis zur Verwendung bei 4ºC aufbewahrt.

b. Im Handel erhältliche aktivierte Sepharose 6 MB (Sigma Chemical Co.)

Das feuchte Gel (1 Gramm Feuchtgewicht) wurde mit 200 ml 1 mM HCl vor der Anwendung gewaschen, wie obenstehend beschrieben.

c. Aktiviertes Chitin

Das obenstehend in A beschriebene Verfahren wurde angewandt, außer das 500 mg feuchtes aktiviertes Chitin anstelle von 1 Gramm verwendet wurden.

D. Herstellung von Meerrettichperoxidase (HRPO)-Aldehyd

1. MATERIALIEN

a. HRPO, Typ II, 200 Units/mg (von Sigma Chemical Co.)
b. 20 mM 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES)-Puffer, pH 5,0
c. Festes Natriumperiodat
d. Sphärisches Biogel® P-30-Polyacrylamidgel, erworben von Bio-Rad (Warenzeichen)

2. VORGEHENSWEISE

25,7 mg festes Natriumperiodat (40 Millimol) wurden zu 30 mg HRPO in 3 ml MES-Puffer zugegebenen. Die Lösung wurde im Dunkeln 30 Minuten lang bei Raumtemperatur bei kontinuierlicher Rotation inkubiert. Die Lösung wurde durch eine P-30-Säule in MES-Puffer hindurchgeleitet, um überschüssiges Natriumperiodat zu entfernen, und das gefärbte HRPO wurde in einem Gesamtvolumen von 3 ml aufgefangen. Das HRPO-Aldehyd wurde unmittelbar an das gewünschte Protein (Hämoglobin, Myoglobin oder Casein) gekoppelt.

E. Anheftung von Hämoglobin und Myoglobin an Cyanogenbromid-aktivierte feste Träger

1. MATERIALIEN

a. Feste unlösliche Träger
i. Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 6 MB (von Sigma Chemical Co.)
ii. Sigmacell ® 20 (wie beschrieben in HERSTELLUNG A)
b. Destilliertes Wasser
c. Puffer:
i. Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO&sub3;, enthaltend 0,5 M NaCl)
ii. 1,0 M Tris-Puffer, pH 8,0
iii. 100 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0 enthaltend 0,5 M NaCl
iv. 100 mM Natriumborat- Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl
v. 0,1 Prozent (v/v) Glutaraldehyd-Lösung in Wasser

2. VORGEHENSWEISEN

Einhundert Milligramm entweder von Hämoglobin oder Myoglobin, gelöst in 5 ml Kopplungspuffer, wurden zu 1 Gramm feuchtem festem Träger gegeben. Die Suspension wurde zwei Stunden lang Ende-über-Ende bei Raumtemperatur gemischt. Der feste Träger wurde mit Kopplungspuffer und Wasser gewaschen, und 3 ml 1,0 M Tris-Puffer, pH 8, wurden zugegeben und die Suspension wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, um verbleibende aktive Stellen auf dem festen Träger zu inaktivieren. Drei Waschzyklen, jeweils bestehend aus pH 4,0-Acetatpuffer, gefolgt von Borat-Puffer, beide enthaltend Natriumchlorid, wurden angewandt, um ungebundene Materialien von dem Träger zu entfernen. Für Myoglobin-derivatisierte Träger wurde eine End-Waschung mit destillierten Wasser verwendet und die feuchte Suspension bei 4ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Für Hämoglobin-derivatisierte Träger wurden 5 ml 0,1%ige Glutaraldehyd-Lösung zu der feuchten Suspension gegeben, welche aus dem oben bestehenden Vorgehen resultiert, und die Suspension wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert. Drei Waschzyklen, jeweils bestehend aus pH 4,0-Acetatpuffer, gefolgt von Borat-Puffer bei pH 8,0, wurden angewandt, um ungebundene Materialien von dem Träger zu entfernen. Eine letzte Waschung wurde mit destillierten Wasser durchgeführt, und die feuchte Suspension bei 4ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.

F. Anheftung von Meerrettichperoxidase (HRPO)-Aldehyd an Hämoglobin- oder Myoglobin-derivatisierte Träger

1. MATERIALIEN

a. HRPO-Aldehyd, hergestellt wie beschrieben in HERSTELLUNG D
b. Hämoglobin- oder Myoglobin-derivatisierte feste Träger, hergestellt wie beschrieben in HERSTELLUNG E.
c. 100 mM Natrium-Cyanoborhydrid
d. 1,0 M NaCl
e. Destilliertes Wasser

2. VORGEHENSWEISE

Die aus der P-30-Säule in HERSTELLUNG D gewonnenen drei ml HRPO-Aldehyd (30 mg) wurden zu 1 Gramm der Hämoglobin- oder Myoglobin-derivatisierten festen Träger, beschrieben in HERSTELLUNG E, zugesetzt. Die Suspension wurde 16 Stunden lang bei 4ºC inkubiert, gefolgt von 4 Stunden bei Raumtemperatur. Drei Waschzyklen, jeweils bestehend aus destilliertem Wasser und 1,0 M NaCl, wurden angewandt, um ungebundene Materialien von dem Träger zu entfernen. Der feste Träger wurde dann mit 5 ml 100 mM Cyanoborhydrid über Nacht bei 4ºC inkubiert. Eine letzte Waschung wurde mit destillierten Wasser durchgeführt, und die feuchte Suspension bei 4ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.

G. Herstellung von Aldehyd-aktiviertem Sigmacell® 20

1. MATERIALIEN

a. Sigmacell® 20 (von Sigma Chemical Co.)
b. Destilliertes Wasser
c. Festes Natriumperiodat
d. 20 mM Natriumbicarbonat, pH 9,5

2. VORGEHENSWEISE

Festes Natriumperiodat (428 mg) wurde zu einen Gramm Sigmacell®, suspendiert in 10 ml destillierten Wasser, zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang fortwährend rotiert. Das Pellet wurde durch Zentrifugation entfernt, fünfmal mit 10 ml destillierten Wasser und einmal mit 10 ml 20 mM Natriumbicarbonat, pH 9,5, gewaschen. Das Harz wurde unmittelbar nach der Herstellung verwendet.

H. Kovalente Anheftung von Hämoglobin und Myoglobin an Aldehyd-aktiviertes Sigmacell®20

1. MATERIALIEN

a. Aldehyd-aktiviertes Sigmacell®20 (HERSTELLUNG G)
b. Destilliertes Wasser
c. 100 mM Natrium-Cyanoborhydrid
d. Humanes Hämoglobin und Pferdeherz-Myoglobin (beide von Sigma Chemical Co.)
e. Puffer
i. 20 mM Natriumbicarbonat, pH 9,5
ii. 50 mM Etanolamin, pH 9,5
iii. 100 mM M Tris-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iv. 100 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, enthaltend 0,5 M NaCl
v. 20 mM MES-Puffer, pH 5,0

2. VORGEHENSWEISE

50 mg entweder von Myoglobin oder Hämoglobin, gelöst in 9 ml Natriumbicarbonat, pH 9,5, wurden zu 1 ml Aldehyd-aktiviertem Sigmacell®20 (HERSTELLUNG G) gegeben. Die Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur rotiert und das Pellet durch Zentrifugation entfernt. Das Pellet wurde mit 10 ml Wasser gewaschen. 9 ml 50 mM Ethanolamin, pH 9,5, wurden zugegeben, und die Mischung kontinuierlich bei Raumtemperatur eine Stunde lang rotiert. Das Pellet wurde durch Zentrifugation isoliert und sequenziell mit jeweils 10 ml Acetat-Puffer, Tris-Puffer und MES-Puffer gewaschen. Zwanzig ml einer wässrigen Lösung von 100 mM Natrium-Cyanoborhydrid wurden zugegeben, und die Mischung wurde eine Stunde lang bei kontinuierlicher Rotation bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von Inkubation über Nacht bei 4ºC. Nach der Übernacht-Inkubation wurde der derivatisierte Träger fünfmal mit 10-ml-Aliquots destilliertem Wasser und zweimal mit 10-ml-Aliquots MES-Puffer gewaschen.

I. Kovalente Anheftung von HRPO-Aldehyd an Hämoglobin oder Myoglobin, das auf Aldehyd-aktiviertem Sigmacell®20 immobilisiert ist

1. MATERIALIEN

a. Hämoglobin- oder Myoglobin-derivatisiertes Sigmacell® 20 (HERSTELLUNG H)
b. Destilliertes Wasser
c. 100 mM Natrium-Cyanoborhydrid
d. Puffer
i. 100 mM M Tris-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl
ii. 100 mM Natrium-Acetat-Puffer, pH 4,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iii. 20 mM MES-Puffer, pH 5,0
e. Aldehyd-aktivierte HRPO (HERSTELLUNG D)

2. VORGEHENSWEISE

Zwanzig Milligramm entsalztes HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG D), gelöst in 2 ml MES- Puffer, pH 5,0, wurden zu 1 Gramm Hämoglobin- oder Myoglobin-derivatisiertem Sigmacell®20 (HERSTELLUNG H) zugesetzt, und die Suspension wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur rotieren gelassen, gefolgt von Inkubation über Nacht bei 4ºC. Der Träger wurde durch Zentrifugation isoliert und zweimal mit 10 ml großen Aliquots destilliertem Wasser gewaschen. 20 ml 100 mM Natrium-Cyanoborhydrid wurden zugegeben, und die Suspension 60 Stunden lang bei 4ºC inkubiert. Das Pellet wurde sequenziell zweimal mit jedem der folgenden gewaschen: Destilliertem Wasser, Acetat-Puffer, Tris-Puffer und MES- Puffer.

J. Kovalente Anheftung von Hämoglobin an Handelsübliche Eupergit®C-Acrylperlen

1. MATERIALIEN

a. Oxiran-Acrylperlen (Eupergit®C, von Sigma Chemical Co.)
b. Humanes Hämoglobin (Typ IV von Sigma Chemical Co.)
c. Puffer und Lösungen
i. 1,0 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,1% Natriumazid (w/v)
ii. 1,0 M NaCl
iii. 5% (v/v) Mercaptoethanol, eingestellt auf pH 8,0 mit 0,5 M NaOH
iv. 100 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4
v. 500 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4
vi. 3,5 M Natriumthiocyanat
vii. Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,2, enthaltend 0,15 M NaCl)
d. Destilliertes Wasser

2. VORGEHENSWEISE

Hämoglobin (125 mg) wurde in 5 ml 1,0 M Phosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend Natriumazid, gelöst und zu 1 Gramm Eupergit® C zugesetzt. Die Mischung wurde ohne Bewegen 72 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Der Träger wurde dreimal mit 1,0 M NaCl und fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen. Der Träger wurde mit 2,5 ml Mercaptoethanol vermischt, das zuvor auf pH 8,0 eingestellt worden war, und die Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Perlen wurden zehnmal mit destilliertem Wasser gewaschen, auf einem kleinen Sinterglas-Trichter plaziert und sequenziell mit 50 ml von jedem der folgenden gewaschen: 0,5 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5; 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer pH 7,5; 3,5 M Natriumthiocyanat; und schließlich mit großen Volumina von Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,2, enthaltend 0,15 M NaCl). Die derivatisierten Perlen wurden mit 0,1% (v/v) Glutaraldehyd bei Rotation während zwei Stunden bei Raumtemperatur, über Nacht bei 4ºC, behandelt und dann mit destilliertem Wasser gewaschen.

K. Kovalente Anheftung von HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG D) an Hämoglobinderivatisiertes Eupergit®C (HERSTELLUNG J)

1. MATERIALIEN

a. HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG D)
b. Hämoglobinderivatisiertes Eupergit s C (HERSTELLUNG J)
c. 100 mM Natrium-Cyanoborhydrid
d. 1,0 M NaCl
e. Destilliertes Wasser

2. VORGEHENSWEISE

Dreißig Milligramm von HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG D) in drei ml MES-Puffer wurden zu 1 Gramm Hämoglobin-derivatisiertem Eupergit®C (HERSTELLUNG J) zugegeben. Die Suspension wurde 16 Stunden lang bei 4ºC, gefolgt von 4 Stunden bei Raumtemperatur, inkubiert. Drei Waschzyklen, jeder bestehend aus destilliertem Wasser und 1,0 M NaCl, wurden angewandt, um ungebundene Materialien von dem Träger zu entfernen. Der feste Träger wurde dann mit 5 ml 100 mM Cyanoborhydrid 60 Stunden lang bei 4ºC inkubiert. Eine letztliche Waschung wurde mit destilliertem Wasser durchgeführt, und die feuchte Suspension bei 4ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.

L. Kovalente Anheftung von Casein-HRPO an polymeres Dialdehyd

1. MATERIALIEN

a. 25 mg Kappa-Casein-HRPO-Konjugat, hergestellt durch das Hydrazid-Verfahren (HERSTELLUNG B), gelöst in 2 ml 100 mM Borat-Puffer, pH 9,0
b. Polymeres Dialdehyd (von Sigma Chemical Co.)
c. Puffer:
i. 100 mM Ethanolamin, pH 9,5
ii. 100 mM Natriumborat-Puffer, pH 9,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iii. 100 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iv. 50 mM MES-Puffer, pH 6,0
d. 100 mM Formaldehyd
e. 100 mM Natrium-Cyanoborhydrid

2. VORGEHENSWEISE

Zwei ml Kappa-Casein-HRPO-Konjugat wurden wie in HERSTELLUNG B beschrieben mit einer Modifikation hergestellt: Die Formaldehyd-Behandlung wurde weggelassen. Diese Lösung wurde mit 3 ml MES-Puffer gemischt, und die Lösung wurde zu 1 Gramm polymeren Dialdehyd zugesetzt. Die Suspension wurde 6 Stunden lang bei Raumtemperatur rotiert und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Zweihundert Mikroliter von 100 mM Formaldehyd wurden zu der Suspension gegeben und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Harz wurde durch Zentrifugation entfernt, mit Wasser gewaschen, und in 3 ml 100 mM Ethanolamin, pH 8,5, resuspendiert. Nach einer zweistündigen Inkubation mit Rotation bei Raumtemperatur wurde das Harz sequentiell gewaschen mit Acetat-Puffer, Borat-Puffer und Wasser. Der feste Träger wurde dann über Nacht bei 4ºC mit 5 ml 100 mM Cyanoborhydrid inkubiert. Eine letzte Waschung wurde mit destilliertem Wasser durchgeführt, und die feuchte Suspension wurde bei 4ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.

M. Anheftung von HRPO-markiertem (Aldehyd-Verfahren) Gesamt-Casein oder Kappa-Casein an Eupergit® C-Acrylperlen

1. MATERIALIEN

a. Oxiran-Acrylperlen (Eupergit® C, von Sigma Chemical Co.)
b. Rinder-Gesamt-Casein oder Kappa-Casein (von Sigma Chemical Co.) c. Puffer und Lösungen
i. 100 mM Natriumbicarbonat, pH 8,5, enthaltend 0,5 M NaCl
ii. 100 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iii. 100 mM Tris-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iv. 20 mM MES-Puffer, pH 5,0
v. 5% (v/v) Mercaptoethanol in Wasser
vi. 200 mM Natriumborhydrid in Wasser
d. Destilliertes Wasser

2. VORGEHENSWEISEN

a. Kovalente Anheftung von Casein oder Kappa-Casein an Eupergit®C-Perlen

2 ml einer Lösung, enthaltend entweder Gesamt-Casein oder Kappa-Casein (10 mg/ml) in 100 mM Natrium-Bicarbonat-Puffer, pH 8,5, und enthaltend 0,5 M NaCl, wurden zu 1 ml in Wasser suspendierten Eupergit®C-Perlen zugesetzt. Die Mischung wurde unter Rotation 48 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Pellet wurde durch Zentrifugation isoliert und sequentiell mit 9-ml-Aliquots von Acetat- und Tris-Puffern gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen mit 9-ml-Aliquots von MES-Puffer. 10 ml 5% Mercaptoethanol wurden zugesetzt und die Mischung bei Rotationsmischen über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Der Casein-derivatisierte Träger wurde durch Zentrifugation isoliert und viermal mit 9 ml MES-Puffer gewaschen.

b. Markierung von auf Eupergit® C immobilisierten Casein mit HRPO

Drei ml Aldehyd-aktiviertes HRPO (HERSTELLUNG D) wurden zu dem Casein- derivatisierten Eupergit®C vom obenstehenden Abschnitt A zugesetzt, und die Mischung wurde bei Rotation 1 Stunde lang bei Raumtemperatur und 60 Stunden lang bei 4ºC inkubiert. Das Pellet wurde durch Zentrifugation isoliert und mit zwei 10 ml-Aliquots Wasser gewaschen. Eine wässrige Lösung von Natriumborhydrid (5 ml) wurde zu dem Pellet zugesetzt, und die Suspension wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Pellet wurde durch Zentrifugation isoliert und sequentiell mit 9-ml-Aliquots von Acetat-, Tris-, Acetat-, Tris- und MES-Puffer gewaschen.

N. Kovalente Anheftung von Myoglobin-HRPO an polymeres Dialdehyd

1. MATERIALIEN

a. 30 mg Pferdeherz-Myoglobin, gelöst in 2 ml 20 mM Natrium-Bicarbonat-Puffer, pH 9,5
b. Polymeres Dialdehyd (Zellulose-Dialdehyd, erworben von Sigma Chemical Co.)
c. Puffer:
i. 50 mM Ethanolamin, pH 9,5
ii. 100 mM Natriumborat, pH 9,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iii. 100 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iv. 50 mM MES-Puffer, pH 6,0
v. 100 mM Tris-Puffer, ph 8,0, enthaltend 0,5 NaCl
d. 100 mM Formaldehyd
e. 100 mM Natrium-Cyanoborhydrid in Wasser

2. VORGEHENSWEISE

a. Kovalente Bindung von Myoglobin an polymeres Dialdehyd

Zwei ml der Myoglobin-Lösung wurden mit 1 ml einer Suspension von polymeren Dialdehyd gemischt, und die Suspension wurde bei Raumtemperatur über Nacht rotieren gelassen. Das Harz wurde durch Zentrifugation abgetrennt und zweimal mit 10 ml-Aliquots Wasser gewaschen. Neun ml Ethanolamin-Lösung wurden zugesetzt und die Suspension unter Rotation 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Harz wurde durch Zentrifugation isoliert und sequentiell mit 10 ml-Aliquots von Acetat-, Tris-, und MES-Puffer gewaschen. Zwanzig ml Natrium-Cyanoborhydrid wurden zugegeben. Die Suspension wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert. Das Myoglobin-derivatisierte polymere Dialdehyd wurde fünfmal mit 10 ml-Aliquots Wasser und zweimal mit MES-Puffer gewaschen.

b. Markierung von Myoglobin-derivatisierten Perlen mit HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG D)

Zwei ml entsalztes HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG D) wurden zu dem Harz gegeben, und die Suspension bei Rotation bei Raumtemperatur 1 Stunde lang und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Das Harz wurde dann durch Zentrifugation isoliert, zweimal mit 10 ml-Aliquots Wasser gewaschen, in 20 ml Natrium-Cyanoborhydrid suspendiert und bei 4ºC 60 Stunden lang inkubiert. Das Harz wurde durch Zentrifugation isoliert, zweimal mit 10 ml-Aliquots Wasser gewaschen, dann zweimal sequentiell mit vier 10-ml-Aliquots von Acetat/NaCl- und Tris/NaCl-Puffern gewaschen. Schließlich wurde das Harz mit 10 ml MES-Puffer gewaschen und bei 4ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.

O. Herstellung von HRPO-markierten Chitin und dessen Verwendung, um einen Assay auf Chitinase durchzuführen

1. MATERIALIEN

a. Cyanogenbromid-aktiviertes Chitin (HERSTELLUNG A)
b. HRPO (Typ II von Sigma Chemical Co., 78 Units/mg)
c. Chitinase (EC 3.2.1.14, isoliert von aus Streptomyces grisius und bezogen von Sigma Chemical Co.)
d. Puffer:
i. 500 mM Tris/MES-Puffer, pH 5,4
ii. Kopplungspuffer, 100 mM Natrium-Bicarbonat enthaltend 0,5 M NaCl
iii. 100 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iv. 100 mM Natriumborat-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl
v. 1,0 M Tris-Puffer, pH 8,0
e. ABTS-Assay-Gemisch: 40 Mikroliter 25 mg/ml ABTS (2,2'-Azino-di[3-ethylbenzthiazolin-sulfonsäure, Diammoniumsalz]; 10 Mikroliter 1%(v/v) Wasserstoffperoxid; 950 Mikroliter Wasser

2. VORGEHENSWEISE

a. Herstellung von HRPO-derivatisiertem Chitin

Fünfhundert mg Cyanogenbromid-aktiviertes Chitin (HERSTELLUNG A) wurden in 5 ml Kopplungspuffer suspendiert, 5 mg HRPO wurden zugesetzt, und die Suspension wurde Ende-über-Ende 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gemischt. Das feste Material wurde mit destilliertem Wasser und Kopplungspuffer gewaschen. Drei ml 1,0 M Tris-Puffer, pH 8,0, wurden dem Träger zugegeben, und die Suspension wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor sie dreimal sequentiell mit Acetat- und Borat-Puffern und schließlich mit Wasser gewaschen wurde.

b. Chitinase-Assay

Fünfzig mg HRPO-markiertes Chitin wurden in 200 Mikrolitern MES/Tris-Puffer suspendiert. Fünfzig Mikroliter einer Lösung von Chitinase (50 Units/ml) wurden zugegeben, und die Mischung wurde 4 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde zentifugiert, um das Chitin zu sedimentieren und ein 10 Mikroliter-Aliquot des Überstands wurde mit 100 Mikrolitern des ABTS-Assay-Gemisches gemischt. Die Chitinase-katalysierte Freisetzung von Chitin-gebundenem HRPO wurde durch die Erzeugung einer grünen Farbe in der Lösung nachgewiesen.

P. Herstellung von Cyanogenbromid-aktiviertem Sepharose-Casein oder Kappa- Casein-HRPO-Aldehyd

1. MATERIALIEN

a. Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose (HERSTELLUNG A)
b. Casein oder Kappa-Casein bei 10 mg/ml in Kopplungspuffer (0,1 M Natrium-Bicarbonat, enthaltend 0,5 M NaCl)
c. Puffer und Lösungen:
i. 50 mM Ethanolamin, pH 9,5
ii. 100 mM Natriumborat, pH 9,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iii. 100 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, enthaltend 0,5 M NaCl
iv. 20 mM MES-Puffer, pH 5,0
v. 100 mM Tris-Puffer, pH 8,5, enthaltend 0,5 M NaCl
vi. 100 mM Natriumborhydrid in Wasser
d. HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG D)

2. VORGEHENSWEISE

Zwei ml Casein oder Kappa-Casein-Lösung wurden zu einem ml Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose zugegeben und die Suspension 2 Stunden lang mit Rotation bei Raumtemperatur inkubiert. Sieben ml Ethanolamin-Lösung wurden zugegeben, und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Harz wurde durch Zentrifugation isoliert und sequentiell mit 9 ml-Aliquots von Acetat- und Tris-Puffern, enthaltend Natriumchlorid, gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen mit 9 ml MES-Puffer.
3 ml entsalztes HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG D) wurden zugegeben und das Gemisch 1 Stunde lang bei Raumtemperatur rotiert, gefolgt von Inkubation bei 4ºC über Nacht. Das Harz wurde durch Zentrifugation isoliert und zweimal mit 10 ml Wasser gewaschen. Das Harz wurde in 10 ml Natriumborhydrid suspendiert und die Mischung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde das Harz durch Zentrifugation isoliert und sequentiell mit 9 ml von jedem der folgenden Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, gewaschen: Acetat; Tris; Acetat; und Tris. Das Harz wurde schließlich mit 9 ml MES-Puffer gewaschen und in MES-Puffer bei 4ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.

Q. Kovalente Anheftung von Myoglobin und Rinderserum-Albumin an fein pulverisierte Eupergit®C-Acrylperlen (Eupergit®C) und anschließende kovalente Markierung mit Meerrettichperoxidase (Aldehyd-Verfahren)

Schritt 1: Kovalente Anheftung von Myoglobin und Rinderserum-Albumin an Eupergit®C-Acrylperlen (Eupergit®C)

1. MATERIALIEN

a. Oxiran-Acrylperlen (Eupergite®C, 150 Mikrometer große Perlen von Sigma Chemical Co.)
b. Pferdeherz-Myoglobin (Typ IV) oder Rinderserum-Albumin (von Sigma Chemical Co.)
c. Puffer und Lösungen
i. 1,0 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,1% Natriumazid (w/v)
ii. 1,0 M NaCl
iii. 5% (v/v) Mercaptoethanol, eingestellt auf pH 8,0 mit 0,5 N NaOH
iv. 100 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5
v. 500 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5
vi. 3,5 M Natriumthiocyanat
vii. Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,2, enthaltend 0,15 M NaCl)
d. Destilliertes Wasser

2. VORGEHENSWEISE

Ein Gramm von Oxiran-Acrylperlen wurden von Hand mit einem Mörser und einem Pistill zu einem feinen Pulver zermahlen. Myoglobin oder Rinderserum-Albumin (125 mg) wurden in 5 ml 1,0 M Phosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend Natriumazid, gelöst und zu 1 Gramm fein gemahlenem Eupergit® C zugesetzt. Die Mischung wurde ohne Bewegen 72 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Unter Verwendung von Zentrifugation wurde der Träger dreimal mit 1,0 M NaCl und fünfmal mit 20 ml destillierten Wasser gewaschen. Der Träger wurde mit 2,5 ml zuvor auf pH 8,0 eingestelltem Mercaptoethanol gemischt, und die Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Perlen wurden zehnmal, unter Verwendung von Zentrifugation, mit destillierten Wasser gewaschen und sequentiell mit 50 ml von jedem der folgenden gewaschen: 0,5 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5; 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5; 3,5 M Natriumthiocyanat; und schließlich mit großen Volumina von Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,2, enthaltend 0,15 M NaCl).

Schritt 2: Kovalente Markierung mit Meerrettichperoxidase (Aldehyd-Verfahren)

Meerrettichperoxidase-Aldehyd (HERSTELLUNG D) wurde verwendet, um die obenstehenden Myoglobin- oder Albumin-derivatisierten Acrylperlen aus dem obenstehenden Schritt 1 unter Anwendung der Vorgehensweise F zu markieren.

R. Kopplung von Sigmacell®-20-Myoglobin an HRPO mit Glutaraldehyd

1. MATERIALIEN

a. Myoglobin, kovalent angeknüpft an Cyanogenbromid-aktivierte Sigmacell® 20 (HERSTELLUNG E)
b. 0,5 M MES-Puffer, pH 5,0
c. 1% (v/v) Glutaraldehyd in Wasser
d. HRPO-Hydrazid (von Sigma Chemical Co., 200 Units/mg)
e. 100 mM Formaldehyd
f. 100 mM Natrium-Cyanoborhydrid
g. 0,5 M NaCl

2. VORGEHENSWEISEN

Ein ml von Glutaraldehydlösung wurde zu 1 Gramm Myoglobin-konjugiertem Sigmacell®20 zugegeben, und die Suspension 30 Minuten lang bei Raumtemperatur rotiert und mit Wasser gewaschen. Fünf mg HRPO-Hydrazid in 2 ml 100 mM MES-Puffer wurden dem gewaschenen Harz zugegeben, und die Suspension 4 Stunden lang bei Raumtemperatur rotiert. Zweihundert Mikroliter 100 mM Formaldehyd-Lösung wurden zugesetzt, und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen, in 5 ml 100 mM Natrium-Cyanoborhydrid suspendiert und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Das Harz wurde dann mit destillierten Wasser und 0,5 M NaCl gewaschen und als feuchte Paste bis zur Verwendung aufbewahrt.

S. Herstellung von Guajak-Lösung und Guajak-Blättern

1. Guajak, Hydroxypropyl-Zellulose-Lösung (d. h. Guajak-Tinte)

150 Gramm pulverisiertes Guajak werden in 660 ml warmen, gerührten Ethanol gelöst. Zu der resultierenden Lösung werden 1330 ml destilliertes Wasser zugesetzt und die resultierende Suspension wird auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Nach 2 Stunden wird der Überstand dekantiert und die restliche Suspension zurückbehalten.
250 ml einer 10% (w/w) Lösung von Hydroxypropyl-Zellulose in Ethanol werden mit weiteren 250 ml Ethanol gemischt, und die resultierende Lösung wird zu der Guajak- Aufschlämmung zugesetzt. Die Mischung wird gerührt, bis sich der Guajak-Rückstand vollständig aufgelöst hat.

2. Guajak-Blätter

Ein ml der obenstehenden Guajak-Lösung wird auf die Polyethylen-Seite eines 10 Inch · 10 Inch großen Blattes eines Mylar/Polyethylen-Laminates (7 mil Mylar/3 ml Polyethylen) aufpipettiert. Die Guajak-Lösung wird mittels eines Standard-Flechtdraht-Teststabes über die Oberfläche der Blätter ausgebreitet und bei Raumtemperatur trocknen gelassen.

T. Herstellung von Natriumperborat-Suspension (d. h. Natriumperborat-Tinte)

Zwanzig Gramm fein gemahlenes festes Natriumperborat werden gemischt mit einem ausreichenden Volumen von 10% (w/w) Lösung von Hydroxypropyl-Zellulose-Lösung in wasserfreiem Alkohol, um einen Liter Suspension herzustellen.

II. EXPERIMENTE

Experiment I

Dieses Experiment beinhaltet die Freisetzung von HRPO aus [Sepharose-Casein-HRPO] und [Sepharose-Kappa-Casein-HRPO] durch Aspartat-Protease, freigesetzt in Candida albicans- Kultur.

A. MATERIALIEN: (Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose) (HRPO-Aldehyd-Kopplungsverfahren)

1. Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B (HERSTELLUNG A), zuerst derivatisiert mit kovalent gebundenem Casein oder Kappa-Casein (HERSTELLUNG P) und anschließend markiert mit HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG D)
2. Aspartat-Protease-produzierende Candida albicans (ATCC 28366)-Kultur, herangezogen und gezüchtet in Flüssigkultur, wie beschrieben in Journal of General Microbiology, (1983) 129: 431-438.
3. Guajak-Schichtblätter (HERSTELLUNG S)
4. Puffer und Lösungen
a. 20 mM Wasserstoffperoxid
b. 500 mM MES-Puffer, pH 6,0

B. VORGEHENSWEISEN

10 mg (Naßgewicht) [Sepharose-Casein-HRPO]-Konjugat (oder das Kappa-Casein- Äquivalent) wurden in 300 ul entweder von Candida albicans-Kultur, enthaltend aktive sezernierte Aspartat-Protease, oder 300 ul derselben Candida albicans-Kultur, welche 20 Minuten lang gekocht worden war, um die Aspartat-Protease zu inaktivieren, suspendiert. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur rotiert und die Suspension zentrifugiert, um das feste Konjugat und Candida albicans-Zellen zu sedimentieren.
Achtzig ul des klaren Überstands wurden mit 10 ul Wasserstoffperoxid-Lösung und 10 ul MES-Puffer gemischt. Zwanzig ul jeder Lösung wurden auf die Oberfläche eines Guajak- Schichtblattes zugesetzt und das Blatt wurde hinsichtlich der Bildung einer blauen Farbe untersucht.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
1,5 blaue Farbe zwischen Intensität 1,0 und 2,0
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-Schichtblatt in dem Bereich, auf dem Candida albicans-behandelter Sepharose-Protein-HRPO-Überstand zugegeben worden war. Keine Farbe war in der Fläche ersichtlich, auf welche mit gekochter Kultur behandelter Sepharose-Protein-HRPO-Überstand zugegeben worden war.
Enzym-Quelle Farb-Bewertung
Candida albicans-Kultur 1,5
gekochte Kultur 0

D. INTERPRETATION

In das Wachstumsmedium von Candida albicans-Zellen sezernierte aktive Aspartat-Protease hydrolysierte Sepharose-gebundenes Casein oder Kappa-Casein, wobei lösliches aktives HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte Sepharose-gebundenes HRPO, wobei nur Aspartat-Protease-solubilisiertes HRPO in Lösung gelassen wurde. Das lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Guajak-Schichtblättern ein zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von Aspartat-Protease vor.
Das Kochen der Kultur inaktivierte Aspartat-Protease, welche von Candida albicans-Zellen in das Wachstumsmedium sezerniert worden war. Somit wurde Sepharose-gebundenes Casein oder Kappa-Casein nicht hydrolysiert, und lösliche, aktive HRPO wurde nicht von dem Träger freigesetzt. Eine Zentrifugation sedimentierte Sepharose-gebundene HRPO, wobei keine Aspartat-Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid wurde nicht katalysiert, und eine kaum nachweisbare blaue Farbe wurde gebildet. Die Freisetzung von HRPO von dem Träger war nicht einfach das Ergebnis von nicht-spezifischer Freisetzung von HRPO durch Salze oder andere im Wachstumsmedium vorhandene Komponenten.

Experiment II

Dieses Experiment beinhaltet die Freisetzung von HRPO aus [Eupergit®C-Acrylperlen- Casein-HRPO]-Konjugaten und [Eupergit®C-Acrylperlen-Kappa-Casein-HRPO]-Konjugaten durch Aspartat-Protease, welche in Candida albicans-Kultur freigesetzt wird:

A. MATERIALIEN: (Eupergit®C-aktivierte Acrylperlen) (HRPO-Aldehyd-Kopplungsverfahren)

1. Oxiran-Acrylperlen (Eupergit®C) wurden mit Casein oder Kappa-Casein (HERSTELLUNG M) behandelt und anschließend mit HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG D) markiert.
2. Aspartat-Protease-produzierende Candida albicans (ATCC 28366)-Kultur, herangezogen und gezüchtet in Flüssigkultur, wie beschrieben in Journal of General Microbiology, (1983) 129 : 431-438.
3. Guajak-Schichtblätter (HERSTELLUNG S)
4. Puffer und Lösungen
a. 20 mM Wasserstoffperoxid
b. 500 mM MES-Puffer, pH 6,0

B. VORGEHENSWEISEN

10 mg (Naßgewicht) [Eupergit®C-Casein-HRPO]-Konjugat (oder das Kappa-Casein-Äquivalent) wurden in 300 ul entweder von Candida albicans-Kultur, enthaltend aktive sezernierte Aspartat-Protease, oder 300 ul derselben Candida albicans-Kultur, welche 20 Minuten lang gekocht worden war, um die Aspartat-Protease zu inaktivieren, suspendiert. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur rotiert und die Suspension zentrifugiert, um das feste Konjugat und Candida albicans-Zellen zu sedimentieren.
Achtzig ul des klaren Überstands wurden mit 10 ul Wasserstoffperoxid-Lösung und 10 ul MES-Puffer gemischt. Zwanzig ul jeder Lösung wurden auf die Oberfläche eines Guajak- Schichtblattes zugesetzt und das Blatt wurde hinsichtlich der Bildung einer blauen Farbe untersucht.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
1,5 blaue Farbe zwischen Intensität 1,0 und 2,0
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-Schichtblatt in dem Bereich, auf dem Candida albicans-behandelter [Eupergit®C-Protein-HRPO]-Überstand zugegeben worden war. Keine Farbe war in der Fläche ersichtlich, auf welche mit gekochter Kultur behandelter [Eupergit®C-Protein-HRPO]-Überstand zugegeben worden war.
Enzym-Quelle Farb-Bewertung
Candida albicans-Kultur 1,5
gekochte Kultur 0

D. INTERPRETATION

In das Wachstumsmedium von Candida albicans-Zellen sezernierte aktive Aspartat-Protease hydrolysierte Eupergit®C-gebundenes Casein oder Kappa-Casein, wobei lösliches aktives HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte Eupergit®C-gebundenes HRPO, wobei nur Aspartat-Protease-solubilisiertes HRPO in Lösung gelassen wurde. Das lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Guajak-SchichtblätteRN ein zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von Aspartat-Protease vor.
Das Kochen der Kultur inaktivierte Aspartat-Protease, welche von Candida albicans-Zellen in das Wachstumsmedium sezerniert wurde. Somit wurde Eupergit®C-gebundenes Casein oder Kappa-Casein nicht hydrolysiert, und lösliche aktive HRPO wurde nicht von dem Träger freigesetzt. Eine Zentrifugation sedimentierte Eupergit®C-gebundene HRPO, wobei keine Aspartat-Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid wurde nicht katalysiert, und eine kaum nachweisbare blaue Farbe wurde gebildet. Die Freisetzung von HRPO von dem Träger war nicht einfach das Ergebnis von nicht-spezifischer Freisetzung von HRPO durch Salze oder andere im Wachstumsmedium vorhandene Komponenten.

Experiment III

Dieses Experiment beinhaltet die Freisetzung von HRPO aus [Sepharose-Hämoglobin- HRPO] oder [Sepharose-Myoglobin-HRPO] durch Pepsin und Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi.

1. Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B (HERSTELLUNG A), zuerst derivatisiert mit kovalent gebundenem Hämoglobin oder Myoglobin (HERSTELLUNG E) und anschließend markiert mit HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNGEN D und F). Das Konjugat wurde über Nacht mit 100 mM Natriumcyanoborhydrid bei Raumtemperatur behandelt und mit 0,5 M NaCl vor der Verwendung gewaschen.
2. Testlösungen: a. Im Handel erhältliche Aspartat-Protease (Typ XIII) aus Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 Units/mg); b. Pepsin (1 mg/ml, 2900 Units/mg); und c. Rinderserumalbumin (BSA) (2 mg/ ml in Wasser) (alle bezogen von Sigma Chemical Co.)
3. Guajak-imprägniertes Papier in der Form von im Handel erhältlichen Hemoccult®- Objektträgern (von SmithKline Diagnostios)
4. Puffer und Lösungen
a. 0,02% (v/v) Wasserstoffperoxid in 200 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0
b. 100 mM Acetat-Puffer, pH 4,0

B. VORGEHENSWEISEN

40 mg (Naßgewicht) [Sepharose-Hämoglobin-HRPO]-Konjugat (oder das Myoglobin- Äquivalent) wurden in 75 ul Acetat-Puffer, pH 4,0, suspendiert und 25 ul Testlösung wurden zugesetzt. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert, um das Festphasen-Konjugat zu entfernen. Fünf ul des Überstands wurden zu einem Guajak-Objektträger zugesetzt, gefolgt von fünf ul Wasserstoffperoxid-Lösung. Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche blaße blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-imprägnierten Blatt in dem Bereich, auf dem Überstandsproben mit Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi oder Pepsin zugegeben worden waren. Eine nur sehr blaße Farbe war in der Fläche ersichtlich, auf welche Überstands-Aliquots, die nur BSA allein (2 mg/ml) oder Puffer enthielten, zugegeben worden waren.
Enzym-Quelle Farb-Bewertung
Aspartat-Protease 2,0
Pepsin 2,0
BSA +/-
Puffer +/-

D. INTERPRETATION

Aktive Aspergillus saitoi-Aspartat-Protease und Pepsin, eine Aspartat-Protease aus Schweinemagen, hydrolysierten Sepharose-gebundenes Hämoglobin oder Myoglobin, wobei lösliche aktive HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte Sepharose- gebundene HRPO, wobei nur Enzym-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Guajak-Schichtblättern ein zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von aktiver Aspergillus-Aspartat-Protease oder Schweine-Pepsin vor.
Weder BSA noch Puffer besitzen Aspartat-Protease-Aktivität. Daher wurden Sepharose- gebundenes Hämoglobin oder Myoglobin nicht hydrolysiert, und lösliche aktive HRPO wurde nicht von dem Träger freigesetzt. Eine Zentrifugation sedimentierte Sepharose-gebundene HRPO, wobei keine Aspartat-Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid wurde nicht katalysiert, und eine kaum nachweisbare blaue Farbe wurde gebildet.

Experiment IV

Dieses Experiment beinhaltet die Freisetzung von HRPO aus [Sepharose-Casein-HRPO] oder [Sepharose-Kappa-Casein-HRPO] durch Pepsin und Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi.

A. MATERIALIEN: (Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose) (HRPO-Hydrazid-Kopplungsverfahren)

1. Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B (HERSTELLUNG A), der gestattet wurde, mit Kappa-Casein-HRPO oder Casein-HRPO (Hydrazid-Verfahren) zu reagieren (HERSTELLUNGEN B und C)
2. Testlösungen: a. Im Handel erhältliche Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 Units/mg); b. Pepsin (1 mg/ml, 2900 Units/mg); und c. Rinderserumalbumin (BSA) (2 mg/ml in Wasser) (alle bezogen von Sigma Chemical Co.)
3. Guajak-imprägniertes Papier in der Form von im Handel erhältlichen Hemoccult®- Objektträgern
4. Puffer und Lösungen
a. 0,02% (v/v) Wasserstoffperoxid in 200 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0
b. 100 mM Acetat-Puffer, pH 4,0

B. VORGEHENSWEISEN

40 mg (Naßgewicht) [Sepharose-Casein-HRPO]-Konjugat (oder das Kappa-Casein-Äquivalent) wurden in 75 ul Acetat-Puffer, pH 4,0, suspendiert und 25 ul Testlösung wurden zugesetzt. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert, um das Festphasen-Konjugat zu entfernen. Fünf ul des Überstands wurden zu einem Guajak-Objektträger zugesetzt, gefolgt von fünf ul Wasserstoffperoxid-Lösung.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche schwache blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-imprägnierten Blatt in dem Bereich, auf dem Überstandsproben mit Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi oder Pepsin zugegeben worden waren. Nur die schwächste nachweisbare Farbe war in der Fläche ersichtlich, auf welche Überstands-Aliquots, die nur BSA allein (2,0 mg/ml) oder Puffer enthielten, zugegeben worden waren.
Enzym-Quelle Farb-Bewertung
Aspartat-Protease 2,0
Pepsin 2,0
BSA +/-
Puffer +/-

D. INTERPRETATION

Aktive Aspergillus saitoi-Aspartat-Protease und Schweine-Pepsin hydrolysierten Sepharose- gebundenes Casein oder Kappa-Casein, wobei lösliche aktive HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte Sepharose-gebundene HRPO, wobei nur Enzym-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Guajak-Schichtblättern ein zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von Aspartat- Protease oder Pepsin vor.
Weder BSA noch Puffer besitzen Aspartat-Protease-Aktivität. Daher wurden Sepharose- gebundenes Casein oder Kappa-Casein nicht hydrolysiert, und lösliche aktive HRPO wurde nicht von dem Träger freigesetzt. Eine Zentrifugation sedimentierte Sepharose-gebundene HRPO, wobei keine Aspartat-Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid wurde nicht katalysiert, und eine kaum nachweisbare blaue Farbe wurde gebildet.

Experiment V

Dieses Experiment beinhaltet die Freisetzung von HRPO aus [Chitin-Kappa-Casein-HRPO] durch Pepsin und Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi.

A. MATERIALIEN: (Cyanogenbromid-aktiviertes Chitin) (HRPO-Hydrazid-Kopplungsverfahren)

1. Cyanogenbromid-aktiviertem Chitin (HERSTELLUNG A) wurde gestattet, mit Kappa- Casein-HRPO (Hydrazid-Verfahren) zu reagieren (HERSTELLUNG B und C)
2. Testlösungen: a. Im Handel erhältliche Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 Units/mg); b. Pepsin (1 mg/ml, 2900 Units/mg); und c. Rinderserumalbumin (BSA) (2 mg/ml in Wasser) (alle bezogen von Sigma Chemical Co.)
3. Guajak-imprägniertes Papier in der Form von im Handel erhältlichen Hemoccult®- Objektträgern (von SmithKline Diagnostics)
4. Puffer und Lösungen
a. 0,02% (v/v) Wasserstoffperoxid in 200 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0
b. 100 mM Acetat-Puffer, pH 4,0

B. VORGEHENSWEISEN

40 mg (Naßgewicht) [Chitin-Kappa-Casein-HRPO]-Konjugat wurden in 75 ul Acetat-Puffer, pH 4,0, suspendiert und 25 ul Testlösung wurden zugesetzt. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert, um das Festphasen-Konjugat zu entfernen. Fünf ul des Überstands wurden zu einem Guajak-Objektträger zugesetzt, gefolgt von fünf ul Wasserstoffperoxid-Lösung.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche schwache blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-imprägnierten Blatt in dem Bereich, auf dem Überstandsproben mit Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi oder Pepsin zugegeben worden waren. Nur eine kaum nachweisbare Farbe war in der Fläche ersichtlich, auf welche Überstands-Aliquots nach BSA (2,0 mg/ml) oder Puffer zugegeben worden waren.
Enzym-Quelle Farb-Bewertung
Aspartat-Protease 2,0
Pepsin 2,0
BSA +/-
Puffer +/-

D. INTERPRETATION

Aktive Aspergillus saitoi-Aspartat-Protease und Schweine-Pepsin hydrolysierten Sigmacell®20-gebundenes Hämoglobin oder Myoglobin, wobei lösliche aktive HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte Sigmacell®20-gebundene HRPO, wobei nur Enzym-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Guajak-Schichtblättern ein zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von Aspartat-Protease oder Pepsin vor.
Weder BSA noch Puffer besitzen Aspartat-Protease-Aktivität. Daher wurden Sigmacell®20- gebundenes Hämoglobin oder Myoglobin nicht hydrolysiert, und lösliche aktive HRPO wurde nicht von dem Träger freigesetzt. Eine Zentrifugation sedimentierte Sigmacell®20- gebundene HRPO, wobei keine Aspartat-Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid wurde nicht katalysiert, und eine kaum nachweisbare blaue Farbe wurde gebildet.

Experiment VI

Dieses Experiment beinhaltet die Freisetzung von HRPO aus [Sigmacell®20-Hämoglobin- HRPO] oder [Sigmacell®20-Myoglobin-HRPO] durch Pepsin und Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi.

A. MATERIALIEN: (Cyanogenbromid-aktiviertes Sigmacell®20) (HRPO-Aldehyd-Kopplungsverfahren)

1. Cyanogenbromid-aktiviertes Sigmacell®20 (HERSTELLUNG A), zuerst derivatisiert mit kovalent gebundenem Hämoglobin oder Myoglobin (HERSTELLUNG E) und anschließend markiert mit HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNGEN D-F). Das Konjugat wurde über Nacht mit 100 mM Natriumcyanoborhydrid bei Raumtemperatur behandelt und mit 0,5 M NaCl vor der Verwendung gewaschen.
2. Testlösungen: a. Im Handel erhältliche Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 Units/mg); b. Pepsin (1 mg/ml, 2900 Units/mg); und c. Rinderserumalbumin (BSA) (2 mg/ ml in Wasser) (alle bezogen von Sigma Chemical Co.)
3. Guajak-imprägniertes Papier in der Form von im Handel erhältlichen Hemoccult®- Objektträgern
4. Puffer und Lösungen
a. 0,02% (v/v) Wasserstoffperoxid in 200 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0
b. 100 mM Acetat-Puffer, pH 4,0

B. VORGEHENSWEISEN

40 mg (Naßgewicht) [Sigmacell®20-Hämoglobin-HRPO]-Konjugat (oder das Myoglobin- Äquivalent) wurden in 75 ul Acetat-Puffer, pH 4,0, suspendiert und 25 ul Testlösung wurden zugesetzt. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert, um das Festphasen-Konjugat zu entfernen. Fünf ul des Überstands wurden zu · einem Guajak-Objektträger zugesetzt, gefolgt von fünf ul Wasserstoffperoxid-Lösung. Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche Maße blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-imprägnierten Blatt in dem Bereich, auf dem Überstandsproben, enthaltend Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi oder Pepsin, zugegeben worden waren. Eine nur sehr blaße Farbe war in der Fläche ersichtlich, auf welche Überstands-Aliquots nach BSA (2,0 mg/ml) oder Puffer zugegeben worden waren.
Enzym-Quelle Farb-Bewertung
Aspartat-Protease 2,0
Pepsin 2,0
BSA +/-
Puffer +/-

D. INTERPRETATION

Aktive Aspergillus saitoi-Aspartat-Protease und Schweine-Pepsin hydrolysierten Sigmacell®20-gebundenes Hämoglobin oder Myoglobin, wobei lösliche aktive HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte Sigmacell®20-gebundene HRPO, wobei nur Enzym-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Guajak-beschichteten Blattlagen ein zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von Aspartat-Protease oder Pepsin vor.
Weder BSA noch Puffer besitzen Aspartat-Protease-Aktivität. Daher wurden Sigmacell®20- gebundenes Hämoglobin oder Myoglobin nicht hydrolysiert, und lösliche aktive HRPO wurde nicht von dem Träger freigesetzt. Eine Zentrifugation sedimentierte Sigmacell®20- gebundene HRPO, wobei keine Aspartat-Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid wurde nicht katalysiert, und eine kaum nachweisbare blaue Farbe wurde gebildet.

Experiment VII

Dieses Experiment ist ein. Beispiel der Freisetzung von HRPO aus [Sigmacell®20-Kappa- Casein-HRPO] durch Pepsin und Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi.

A. MATERIALIEN: (Cyanogenbromid-aktiviertes Sigmacell®20) (HRPO-Hydrazid- Kopplungsverfahren)

1. Cyanogenbromid-aktiviertes Sigmacell®20 (HERSTELLUNG A), dem gestattet wurde, mit Kappa-Casein-HRPO (Hydrazid-Verfahren) zu reagieren (HERSTELLUNGEN B und C)
2. Testlösungen: a. Im Handel erhältliche Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 Units/mg); b. Pepsin (1 mg/ml, 2900 Units/mg); und c. Rinderserumalbumin (BSA) (2 mg/ml in Wasser) (alle bezogen von Sigma Chemical Co.)
3. Guajak-imprägniertes Papier in der Form von im Handel erhältlichen Hemoccult®- Objektträgern
4. Puffer und Lösungen
a. 0,02% (v/v) Wasserstoffperoxid in 200 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0
b. 100 mM Acetat-Puffer, pH 4,0

B. VORGEHENSWEISEN

40 mg (Naßgewicht) [Sigmacell®20-Kappa-Casein-HRPO]-Konjugat wurden in 75 ul Acetat-Puffer, pH 4,0, suspendiert und 25 ul Testlösung wurden zugesetzt. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert, um das Festphasen- Konjugat zu entfernen. Fünf ul des Überstands wurden zu einem Guajak-Objektträger zugesetzt, gefolgt von fünf ul Wasserstoffperoxid-Lösung.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche schwache blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-imprägnierten Blatt in dem Bereich, auf dem Überstandsproben mit Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi oder Pepsin zugegeben worden waren. Nur eine sehr blaße Farbe war in der Fläche ersichtlich, auf welche Überstands-Aliquots nach BSA (2,0 mg/ml) oder Puffer zugegeben worden waren.
Enzym-Quelle Farb-Bewertung
Aspartat-Protease 2,0
Pepsin 2,0
BSA +/-
Puffer +/-

D. INTERPRETATION

Aktive Aspergillus saitoi-Aspartat-Protease und Schweine-Pepsin hydrolysierten Sigmacell®20-gebundenes Kappa-Casein, wobei lösliche aktive HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte Sigmacel®20-gebundene HRPO, wobei nur Enzymsolubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Guajak-Schichtblättern ein zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von Aspartat-Protease oder Pepsin vor.
Weder BSA noch Puffer besitzen Aspartat-Protease-Aktivität. Daher wurde Sigmacell®20- gebundenes Kappa-Casein nicht hydrolysiert, und lösliche aktive HRPO wurde nicht von dem Träger freigesetzt. Eine Zentrifugation sedimentierte Sigmacell®20-gebundene HRPO, wobei keine Aspartat-Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid wurde nicht katalysiert, und eine kaum nachweisbare blaue Farbe wurde gebildet.

Experiment VIII

Dieses Experiment ist ein Beispiel der Freisetzung von HRPO aus [Sigmacell®20-Kappa- Casein-HRPO] (Hydrazid-Verfahren) oder [Sigmacell®20-Myoglobin/Hämoglobin-HRPO] (Aldehyd-Verfahren) durch Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi oder Pepsin.

A. MATERIALIEN: (Cyanogenbromid-aktiviertes Sigmacell®20)

1. Cyanogenbromid-aktiviertes Sigmacell®20 (HERSTELLUNG A) wurde derivatisiert mit mit Kappa-Casein und HRPO (Hydrazid-Verfahren) (HERSTELLUNG B). Alternativ dazu wurde Cyanogenbromid-aktiviertes Sigmacell®20 mit Hämoglobin oder Myoglobin (HERSTELLUNG E) derivatisiert und dann an HRPO-Aldehyd gekoppelt (HERSTELLUNG D).
2. Testlösungen: a. Im Handel erhältliche Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 Units/mg); b. Pepsin (1 mg/ml, 2900 Units/mg); und c. Rinderserumalbumin (BSA) (2 mg/ml in Wasser) (alle bezogen von Sigma Chemical Co.)
3. Guajak-imprägniertes Papier in der Form von im Handel erhältlichen Hemoccult®- Objektträgern
4. Puffer und Lösungen
a. 0,02% (v/v) Wasserstoffperoxid in 244 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0
b. 100 mM Acetat-Puffer, pH 4,0

B. VORGEHENSWEISEN

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-imprägnierten Blatt in dem Bereich, auf dem Überstandsproben mit Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi oder Pepsin zugegeben worden waren. Nur eine sehr blaße Farbe war in der Fläche ersichtlich, auf welche Überstands-Aliquots, die BSA (2,0 mg/ml.) oder Puffer enthielten, zugegeben worden waren.
Enzym-Quelle Farb-Bewertung
Aspartat-Protease 2,0
Pepsin 2,0
BSA +/-
Puffer +/-

D. INTERPRETATION

Aktive Aspergillus saitoi-Aspartat-Protease und Schweine-Pepsin hydrolysierten Sigmacell®20-gebundenes Kappa-Casein, wobei lösliche aktive HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte Sigmacell®20-gebundene HRPO, wobei nur Enzymsolubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Guajak-Schichtblättern ein zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von Aspartat-Protease oder Pepsin vor.
Weder BSA noch Puffer besitzen Aspartat-Protease-Aktivität. Daher wurde Sigmacell®20- gebundenes Kappa-Casein nicht hydrolysiert, und lösliche aktive HRPO wurde nicht von dem Träger freigesetzt. Eine Zentrifugation sedimentierte Sigmacell®20-gebundene HRPO, wobei keine durch Aspartat-Protease solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid wurde nicht katalysiert, und eine kaum nachweisbare blaue Farbe wurde gebildet.

Experiment IX

Dieses Experiment ist ein Beispiel der Freisetzung von HRPO aus [Sigmacell®20- Hämoglobin-HRPO] oder [Sigmacell®20-Myoglobin-HRPO] durch in Candida albicans- Kultur freigesetzte Aspartat-Protease.

A. MATERIALIEN: (Aldehyd-aktiviertes Sigmacell®20) (HRPO-Aldehyd-Kopplungsverfahren)

1. Aldehyd-aktiviertes Sigmacell®20 (HERSTELLUNG G) wurde zuerst mit kovalent gebundenem Hämoglobin oder Myoglobin (HERSTELLUNG H) derivatisiert und anschließend markiert mit HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNGEN D und F).
2. Aspartat-Protease-produzierende Candida albicans (ATCC 28366)-Kultur, herangezogen und gezüchtet in Flüssigkultur, wie beschrieben in Journal of General Microbiology, (1983) 129 : 431-438.
3. Guajak-Schichtblätter (HERSTELLUNG S)
4. Puffer und Lösungen
a. 20 mM Wasserstoffperoxid
b. 500 mM MES-Puffer, pH 6,0

B. VORGEHENSWEISEN

10 mg (Naßgewicht) [Sigmacell®20-Protein-HRPO]-Konjugat wurden in 300 ul entweder von Candida albicans-Kultur, enthaltend sezernierte Aspartat-Protease, oder 300 ul derselben Candida albicans-Kultur, welche 20 Minuten lang gekocht worden war, um die Aspartat- Protease zu inaktivieren, suspendiert. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur rotiert und die Suspension zentrifugiert, um das feste Konjugat und Candida albicans-Zellen zu sedimentieren.
Achtzig ul des klaren Überstands wurden mit 10 ul Wasserstoffperoxid-Lösung und 10 ul MES-Puffer gemischt. Zwanzig ul jeder Lösung wurden auf die Oberfläche eines Guajak- Schichtblattes zugesetzt, und das Blatt wurde hinsichtlich der Bildung einer blauen Farbe untersucht.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche blaße blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
1,5 blaue Farbe zwischen Intensität 1,0 und 2,0
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-Schichtblatt in dem Bereich, auf dem Candida albicans-behandeltes Sepharose-Protein-HRPO zugegeben worden war. Keine Farbe war in der Fläche ersichtlich, auf welche mit gekochter Kultur behandeltes Sepharose- Protein-HRPO zugegeben worden war.
Enzym-Quelle Farb-Bewertung
Candida albicans-Kultur 1,5
gekochte Kultur 0

D. INTERPRETATION

In das Wachstumsmedium von Candida albicans-Zellen sezernierte aktive Aspartat-Protease hydrolysierte Sigmacell®20-gebundenes Protein, wobei lösliche aktive HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte Sepharose-gebundene HRPO, wobei nur Aspartat- Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Guajak-Schichtblättern ein zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von Aspartat-Protease vor.
Das Kochen der Kultur inaktivierte Aspartat-Protease, welche von Candida albicans-Zellen in das Wachstumsmedium sezerniert worden war. Somit wurde Sigmacell®20-gebundenes Protein nicht hydrolysiert, und lösliche aktive HRPO wurde nicht von dem Träger freigesetzt.
Eine Zentrifugation sedimentierte Sigmacell®20-gebundene HRPO, wobei keine Aspartat- Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid wurde nicht katalysiert, und eine kaum nachweisbare blaue Farbe gebildet. Die Freisetzung von HRPO von dem Träger war nicht einfach das Ergebnis von nicht-spezifischer Freisetzung von HRPO durch Salze oder andere im Wachstumsmedium vorhandene Komponenten.

Experiment X

Dieses Experiment ist ein Beispiel der Freisetzung von HRPO aus [Polymerem Dialdehyd- Kappa-Casein-HRPO] durch Pepsin und Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi.

A. MATERIALIEN: (Polymeres Dialdehyd) (HRPO-Hydrazid-Kopplungsverfahren)

1. Handelsübliches polymeres Dialdehyd von Sigma Chemical Co., dem gestattet wurde, mit Kappa-Casein-HRPO (Hydrazid-Verfahren) zu reagieren (HERSTELLUNGEN B und L)
2. Testlösungen: a. Im Handel erhältliche Aspartat-Protease aus Aspergillus saitoi (30 mg/ml, 0,6 Units/mg); b. Pepsin (1 mg/ml, 2900 Units/mg); und c. Rinderserumalbumin (BSA) (2 mg/ml in Wasser) (alle bezogen von Sigma Chemical Co.)
3. Guajak-imprägniertes Papier in der Form von im Handel erhältlichen Hemoccult®- Objektträgern
4. Puffer und Lösungen
a. 0,02% (v/v) Wasserstoffperoxid in 200 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0
b. 100 mM Acetat-Puffer, pH 4,0

B. VORGEHENSWEISEN

40 mg (Naßgewicht) [Polymeres Dialdehyd-Kappa-Casein-HRPO]-Konjugat wurden in 75 ul Acetat-Puffer, pH 4,0, suspendiert und 25 ul Testlösung wurden zugesetzt. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert, um das Festphasen- Konjugat zu entfernen. Fünf ul des Überstands wurden zu einem Guajak-Objektträger zugesetzt, gefolgt von fünf ul Wasserstoffperoxid-Lösung.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche schwache blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
1,5 blaue Farbe zwischen Intensität 1,0 und 2,0
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

D. INTERPRETATION

Aktive Aspergillus saitoi-Aspartat-Protease und Schweine-Pepsin hydrolysierten an polymeres Dialdehyd gebundenes Kappa-Casein, wobei lösliche aktive HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte an polymeres Dialdehyd gebundene HRPO, wobei nur Enzym-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Guajak-Schichtblättern ein zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von Aspartat-Protease oder Pepsin vor.
Weder BSA noch Puffer besitzen Aspartat-Protease-Aktivität. Daher wurde an polymeres Dialdehyd gebundenes Kappa-Casein nicht hydrolysiert, und lösliche aktive HRPO wurde nicht von dem Träger freigesetzt. Eine Zentrifugation sedimentierte an polymeres Dialdehyd gebundene HRPO, wobei keine Aspartat-Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid wurde nicht katalysiert, und eine kaum nachweisbare blaue Farbe wurde gebildet.

Experiment XI

Dieses Experiment beinhaltet die Freisetzung von HRPO aus [Polymerem Dialdehyd- Myoglobin-HRPO] durch Aspartat-Protease aus Candida albicans.

A. MATERIALIEN: (Polymeres Dialdehyd) (HRPO-Aldehyd-Kopplungsverfahren)

1. Handelsübliches polymeres Dialdehyd von Sigma Chemical Co., dem gestattet wurde, mit Myoglobin (HERSTELLUNG N) und anschließend mit HRPO-Aldehyd zu reagieren (HERSTELLUNG N)
2. Aspartat-Protease-produzierende Candida albicans (ATCC 28366)-Kultur, herangezogen und gezüchtet in Flüssigkultur, wie beschrieben in Journal of General Microbiology, (1983) 129 : 431-438.
3. Guajak-Schichtblätter (HERSTELLUNG S)
4. Puffer und Lösungen
a. 20 mM Wasserstoffperoxid
b. 500 mM MES-Puffer, pH 6,0

B. VORGEHENSWEISEN

10 mg (Naßgewicht) [polymeres Dialdehyd-Myoglobin-HRPO]-Konjugat wurden in 300 ul entweder von Candida albicans-Kultur, enthaltend sezernierte Aspartat-Protease, oder 300 ul derselben Candida albicans-Kultur, welche 20 Minuten lang gekocht worden war, um die Aspartat-Protease zu inaktivieren, suspendiert. Die Mischung wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur rotiert und die Suspension zentrifugiert, um das feste Konjugat und Candida albicans-Zellen zu sedimentieren.
Achtzig ul des klaren Überstands wurden mit 10 ul Wasserstoffperoxid-Lösung und 10 ul MES-Puffer gemischt. Zwanzig ul jeder Lösung wurden auf die Oberfläche eines Guajak- Schichtblattes zugesetzt, und das Blatt wurde hinsichtlich der Bildung einer blauen Farbe untersucht.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche blaße blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
1,5 blaue Farbe zwischen Intensität 1,0 und 2,0
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-Schichtblatt in dem Bereich, auf dem Candida albicans-behandeltes Polymeres-Dialdehyd-Myoglobin-HRPO zugegeben worden war. Keine Farbe war in der Fläche ersichtlich, auf welche mit gekochter Kultur behandeltes Polymeres-Dialdehyd-Myoglobin-HRPO zugegeben worden war.
Enzym-Quelle Farb-Bewertung
Candida albicans-Kultur 1,5
gekochte Kultur 0

D. INTERPRETATION

In das Wachstumsmedium von Candida albicans-Zellen sezernierte aktive Aspartat-Protease hydrolysierte Polymeres-Dialdehyd-Myoglobin, wobei lösliches aktives HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte an polymeres Dialdehyd gebundenes HRPO, wobei nur Aspartat-Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Guajak-Schichtblättern ein zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von Aspartat-Protease vor.
Das Kochen der Kultur inaktivierte Aspartat-Protease, welche von Candida albicans-Zellen in das Wachstumsmedium sezerniert worden war. Somit wurde an polymeres Dialdehyd gebundenes Myoglobin nicht hydrolysiert, und lösliche aktive HRPO wurde nicht von dem Träger freigesetzt. Eine Zentrifugation sedimentierte an polymeres Dialdehyd gebundene HRPO, wobei keine Aspartat-Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid wurde nicht katalysiert, und eine kaum nachweisbare blaue Farbe wurde gebildet. Die Freisetzung von HRPO von dem Träger war nicht einfach das Ergebnis von nicht-spezifischer Freisetzung von HRPO durch Salze oder andere im Wachstumsmedium vorhandene Komponenten.

Experiment XII

Dieses Experiment beinhaltet die Freisetzung von HRPO aus [Sepharose 6 MB-Kappa- Casein-HRPO] durch Vaginalflüssigkeit-Proben:
1. Normale Vaginalflüssigkeit
2. Normale Vaginalflüssigkeit, zu der Candida albicans-Kultur zugegeben worden war
3. Vaginalflüssigkeit aus Frauen mit klinisch diagnostizierter vulvovaginaler Candidiasis

A. MATERIALIEN: (Handelsübliche Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 6 MB) (HRPO- Hydrazid-Kopplungsverfahren)

1. Sepharose 6 MB-Kappa-Casein-HRPO-Konjugat (HERSTELLUNG C)
2. Vaginalflüssigkeit-Proben, erhalten auf Standard-Dacron(Warenzeichen)-Tupfern. Die Proben waren bis unmittelbar vor der Verwendung gefroren. Die Proben wurden aufgetaut und in speziell angepaßten Röhrchen zentrifugiert, um die Extraktion von unverdünnter Vaginalflüssigkeit aus dem Tupfer zu gestatten. Die gesamte Probe aus jedem Tupfer wurde getestet. Wo notwendig, wurde destilliertes Wasser zu der Probe zugegeben, um ein Endvolumen von 75 ul zu erzeugen.
Wo angegeben, wurden 25 ul einer Candida albicans-Kultur (siehe z. B. Experiment I) zu Vaginalflüssigkeit-Proben zugegeben, welche aus Frauen ohne klinische vulvovaginale Candidiasis erhalten worden waren.
3. Guajak-imprägniertes Filterpapier (handelsübliche Hemoccult®-Testobjektträger)
4. Puffer und Lösungen
a. 6 mM Wasserstoffperoxid
b. 250 mM Glycylglycin-Puffer, pH 3,0

B. VORGEHENSWEISEN

30 mg (Naßgewicht) [Sepharose-Kappa-Casein-HRPO]-Konjugat wurden in 75 ul behandelter oder unbehandelter Vaginalflüssigkeit suspendiert. Die Suspensionen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, und die Suspension wurde zentrifugiert, um das feste Konjugat und andere Zelltrümmer zu sedimentieren.
Fünf ul der klaren Überstande wurden zu dem Guajak-imprägnierten Papier zugesetzt, gefolgt von fünf ul Wasserstoffperoxid-Lösung, und die Blätter wurden hinsichtlich der Bildung einer blauen Farbe untersucht.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche schwache blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-imprägnierten Papier in dem Bereich, auf dem Vaginalflüssigkeit-Überstand aus mit vulvovaginaler Candidiasis infizierten Frauen zugegeben worden war. Keine Farbe wurde in den Flächen des Guajak-imprägnierten Papiers gebildet, auf die Vaginalflüssigkeit-Überstand aus Kontrollfrauen zugesetzt worden war. Eine starke blaue Farbe bildete sich auch auf dem Guajak-imprägnierten Papier in der Fläche, auf welche Vaginalflüssigkeit-Überstand aus normalen Frauen, welcher mit Medium aus einer wachsenden Candida albicans-Kultur supplementiert worden war, zugesetzt wurde.

D. INTERPRETATION

Vaginalflüssigkeit aus Frauen mit nachgewiesener klinischer vulvovaginaler Candidiasis enthielt Aspartat-Protease, welche Sepharose 6 MB-gebundenes Kappa-Casein bei pH 3,0 in 15 Minuten bei Raumtemperatur hydrolysierte, wobei lösliche aktive HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte Sepharose 6 MB-gebundene HRPO, wobei nur freigesetzte, solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation der handelsüblichen Hemoccult®-Objektträger, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf den Hemoccult®-Objektträgern ein rasches und zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von aus Candida abgeleiteter Aspartat-Protease in Vaginalflüssigkeit, und somit von vulvovaginaler Candidiasis, vor.
Vaginalflüssigkeit aus normalen Frauen ohne vulvovaginale Candidiasis enthielt keine Aspartat-Protease und versagte darin, an Sepharose 6 MB gebundenes Kappa-Casein bei pH 3,0 in 15 Minuten bei Raumtemperatur zu hydrolysieren, und versagte darin, lösliche aktive HRPO freizusetzen. Eine Zentrifugation sedimentierte an Sepharose 6 MB-gebundenes HRPO, wobei keine freigesetzte solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. In Ermangelung des HRPO-Katalysators fand keine Oxidation der handelsüblichen Hemoccult®-Objektträger statt und es wurde keine blaue Farbe erzeugt. Somit liefert das Fehlen einer blauen Farbbildung auf den Hemoccult®-Objektträgern ein rasches und zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von normalen Frauen, denen Candida-abgeleitete Aspartat-Protease in der Vaginalflüssigkeit fehlt, und somit von Frauen, welche keine vulvovaginale Candidiasis aufweisen.
Schließlich fand, wenn Medium aus einer Candida albicans-Kultur zu Vaginalflüssigkeit von normalen Frauen ohne vulvovaginale Candidiasis zugegeben wurde, eine Hydrolyse von Sepharose 6 MB-gebundenem Kappa-Casein bei pH 3,0 in 15 Minuten bei Raumtemperatur statt, und lösliche aktive HRPO wurde freigesetzt. Eine Zentrifugation sedimentierte Sepharose-6MB-gebundene HRPO, wobei freigesetzte, solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von handelsüblichen Hemoccult®- Objektträgern durch Wasserstoffperoxid und erzeugte eine blaue Farbe. Somit zeigt die blaue Farbbildung auf den Hemoccult®-Objektträgern, daß von Candida albicans-Zellen in das Wachstumsmedium freigesetzte Aspartat-Protease ohne weiteres rasch und zweckmäßig nachgewiesen werden kann, sogar bei Hinzusetzen zu Vaginalflüssigkeit von normalen Frauen.

Experiment XIII

Dieses Experiment beinhaltet die Freisetzung von HRPO aus [Eupergit®C-Myoglobin- HRPO] und [Sigmacell®20-Myoglobin-HRPO] durch Vaginalflüssigkeit-Proben:
1. Normale Vaginalflüssigkeit
2. Vaginalflüssigkeit aus Frauen mit klinisch diagnostizierter vulvovaginaler Candidiasis

A. MATERIALIEN: (Cyanogenbromid-aktivierte Sigmacell®20-Myoglobin-HRPO - HERSTELLUNGEN A und I) und (Eupergit®C-Myoglobin-HRPO - HERSTELLUNG Q) (HRPO-Aldehyd-Kopplungs-Verfahren)

1. Feingemahlene Oxiran-Acrylperlen, gekoppelt an Myoglobin-HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG Q)
2. Sigmacell®20 (Cyanogenbromid-aktiviert, HERSTELLUNG A), gekoppelt an Myoglobin-HRPO-Aldehyd (HERSTELLUNG I)
3. Auf Standard-Dacron-Tupfern erhaltene Vaginalflüssigkeit-Proben. Die Proben waren bis unmittelbar vor der Verwendung gefroren. Die Proben wurden aufgetaut und in speziell angepaßten Röhrchen zentrifugiert, um die Extraktion von unverdünnter Vaginalflüssigkeit aus dem Tupfer zu gestatten. Die gesamte Probe aus jedem Tupfer wurde getestet.
4. Guajak-imprägniertes Filterpapier (handelsübliche Hemoccult®-Testobjektträger)
5. Puffer und Lösungen
a. 6 mM Wasserstoffperoxid
b. 250 mM Glycylglycin-Puffer, pH 3,0
c. 1,0 M Acetatpuffer, pH 4,0

B. VORGEHENSWEISEN

20 mg (Naßgewicht) Eupergit®-gebundenes Myoglobin-HRPO-Konjugat wurden in der unverdünnten Vaginalflüssigkeit und 10 ul 1 M Acetatpuffer suspendiert. Die Suspensionen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, und die Suspension wurde zentrifugiert, um das feste Konjugat und andere Zelltrümmer zu sedimentieren.
Fünf ul des klaren Überstandes wurden zu dem Guajak-imprägnierten Papier zugesetzt, gefolgt von fünf ul Wasserstoffperoxid-Lösung, und die Blätter wurden hinsichtlich der Bildung einer blauen Farbe untersucht.
20 mg (Naßgewicht) Sigmacell®20-gebundenes Myoglobin-HRPO-Konjugat wurden in unverdünnter Vaginalflüssigkeit und 10 ul 250 mM Acetatpuffer suspendiert. Die Suspensionen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, und die Suspension wurde zentrifugiert, um das feste Konjugat und andere Zelltrümmer zu sedimentieren.
Fünf ul des klaren Überstandes wurden zu dem Guajak-imprägnierten Papier zugesetzt, gefolgt von fünf ul Wasserstoffperoxid-Lösung, und die Blätter wurden hinsichtlich der Bildung einer blauen Farbe untersucht.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche schwache blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Eine dunkelblaue Farbe bildete sich auf dem Guajak-imprägnierten Papier in dem Bereich, auf dem Vaginalflüssigkeit aus mit vulvovaginaler Candidiasis infizierten Frauen zugegeben worden war. Keine Farbe wurde in den Flächen des Guajak-imprägnierten Papiers gebildet, auf die Vaginalflüssigkeit aus Kontrolle zugesetzt worden war.

D. INTERPRETATION

In die Vaginalflüssigkeit von Frauen mit klinischer Candidiasis von Candida albicans-Zellen sezernierte aktive Aspartat-Protease hydrolysierte sowohl Sigmacell®20-gebundenes Protein als auch Eupergit®-gebundenes Protein, wobei lösliches aktives HRPO freigesetzt wurde. Eine Zentrifugation sedimentierte Polymer-gebundenes HRPO, wobei nur Aspartat-Proteasesolubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. Die lösliche HRPO katalysierte die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid, was eine blaue Farbe erzeugte. Somit sieht die blaue Farbbildung auf dem Guajak-imprägnierten Papier ein zweckmäßiges und effektives Verfahren zum Nachweis von aktiver Aspartat-Protease in Vaginalflüssigkeit, und dadurch von vulvovaginaler Candidiasis, vor.
Aktive Aspartat-Protease wird nicht in der Vaginalflüssigkeit von Kontroll-Frauen, d. h. denjenigen ohne klinische Candidiasis, gefunden. Somit versagten Vaginalflüssigkeit-Proben aus Kontroll-Frauen darin, Polymer-gebundenes Protein zu hydrolysieren, und versagten darin, lösliche aktive HRPO von einem der beiden Träger freizusetzen. Eine Zentrifugation sedimentierte Polymer-gebundenes HRPO, wobei keine Aspartat-Protease-solubilisierte HRPO in Lösung gelassen wurde. In Ermangelung von HRPO versagte der Überstand von Kontrollproben darin, die Oxidation von Guajak durch Wasserstoffperoxid zu katalysieren, und versagte darin, eine blaue Farbe zu erzeugen. Somit liefert das Versagen, eine blaue Farbe auf dem Guajak-imprägnierten Papier zu bilden, ein zweckmäßiges Verfahren zur Identifizierung von Frauen, die nicht mit vulvovaginalem Candida albicans infiziert waren.

Experiment XIV

Dieses Experiment beinhaltet die differenzielle hydrolytische Aktivität von mehreren mikrobiellen Proteasen auf [Sigmacell®-Myoglobin-HRPO].

A. MATERIALIEN

1. [Sigmacell®-Myoglobin-HRPO] (HERSTELLUNGEN E und F).
2. Aspartat-Protease produzierende Candida albicans (ATCC 28366)-Kultur.
3. Trichomonas vaginalis (ATCC 3001)-Kultur.
4. Mobiluncus curtisii-Zellsuspension (ATCC 35241) in Kochsalzlösung.
5. Puffer und Lösungen.
a. 0,02% Wasserstoffperoxid-Lösung
b. Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5, 300 mM
c. Natriumacetatpuffer, pH 4,0, 100 mM.
6. Guajak-imprägniertes Papier (handelsübliche Hemoccult®-Objektträger)

B. VORGEHENSWEISE

Zwanzig mg Substrat [Sigmacell®-Myoglobin-HRPO] wurden in 75 ul des passenden Puffers (siehe nachstehende Tabelle) suspendiert, gefolgt von der Zugabe von 25 ul Zellkultur/- suspension. Die Reaktion wurde zwischen 10-30 Minuten lang inkubiert, wonach die Probe zentrifugiert wurde, um Festphasen-konjugiertes Substrat und Zelltrümmer zu entfernen. Fünf ul des Reaktionsüberstands wurden zu dem Guajak-Objektträger zugegeben und mit 5 ul Wasserstoffperoxid-Lösung entwickelt. Über die Reaktionsbedingungen und die Farbentwicklung wird in der Tabelle, welche folgt, berichtet.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche schwache blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

Es wurde keine Farbe gebildet, wenn der Reaktionsüberstand aus Röhrchen, welche 30 Minuten lang mit Puffer bei pH 4,0 oder pH 7,5 inkubiert worden waren, zu Guajak-Objektträgern zugegeben und mit Wasserstoffperoxid entwickelt wurde. Ein ähnliches Ergebnis (d. h. keine Farbbildung) wurde mit gekochten Kulturen von Candida albicans (pH 4,0 und 7,5), Trichomonas vaginalis (pH 4,0 und 7,5) oder Mobiluncus curtisii (pH 4,0 und 7,5) beobachtet. Candida albicans-Kultur erzeugte eine kräftige blaue Farbe nach einer 10 Minuten langen Inkubation bei pH 4,0, aber nicht bei pH 7,5, selbst nach einer 30 Minuten langen Inkubation. Trichomonas vaginalis erzeugte eine kräftige blaue Farbe nach einer 30 Minuten langen Inkubation bei pH 7,5, aber lediglich eine kaum nachweisbare Farbe nach einer 30 Minuten langen Inkubation bei pH 4,0. Mobiluncus curtisii-Kultur erzeugte keine blaue Farbe in 30 Minuten bei entweder H 4,0 oder 7,5.

D. INTERPRETATION

HRPO wird von dem festen Träger nicht durch 300 mM Phosphatpuffer bei ph 7,5 oder durch 100 mM Acetatpuffer bei ph 4,0 über ein 30 Minuten langes Inkubationsintervall bei Raumtemperatur freigesetzt. In ähnlicher Weise setzten gekochte Suspensionen von Candida albicans, Trichomonas vaginalis oder Mobiluncus curtisii HRPO bei ph 7,5 oder 4,0 über eine 30 Minuten lange Inkubation bei Raumtemperatur nicht frei. Eine Candida albicans- Kultur setzt jedoch HRPO von dem festen Träger bei pH 4,0 in 10 Minuten frei, versagt aber darin, HRPO bei ph 7,5 freizusetzen, selbst über eine 30 Minuten lange Inkubationsdauer. Dies ist konsistent mit dem etablierten ph-Profil der Candida albicans-Aspartat-Protease, welche bei niedrigem ph aktiv ist, aber bei hohem ph kaum aktiv oder inaktiv ist. Umgekehrt, stetzt eine T. vaginalis-Kultur ohne weiteres HRPO von dem festen Träger bei ph 7,4 über ein 30 Minuten langes Inkubationsintervall frei, aber setzt kaum nachweisbare Mengen von HRPO bei ph 4,0 frei. Dieses Verhalten ist auch mit dem bekannten ph-Profil der T. vaginalis-Thiolproteasen konsistent (d. h. aktiv bei hohem ph, aber viel weniger aktiv oder inaktiv bei niedrigem ph). Schließlich versagt Mobiluncus curtisii, von dem nicht bekannt ist, Proteasen auszuscheiden, darin, HRPO bei entweder ph 4,0 oder pH 7,5 selbst über ein 30 Minuten langes Inkubationsintervall freizusetzen.
Somit ist es durch Ausführen der Tests unter verschiedenen ph-Bedingungen möglich, zwischen den drei Mikroben zu differenzieren: nur Candida albicans wird eine Farbbildung in 10 Minuten bei Raumtemperatur bei ph 4,0 verursachen; nur Trichomonas vaginalis wird eine Farbbildung bei ph 7,5 in 30 Minuten verursachen, und Mobiluncus curtisii wird keine Farbbildung in 30 Minuten bei entweder ph 7,5 oder 4,0 verursachen.

Experiment XV

Dieses Experiment beinhaltet die Aktivität von verschiedenen Proteasen und ihrer Inhibitoren auf das Substrat [Eupergit®C-Myoglobin-HRPO].

A. MATERIALIEN

1. Pulverisiertes [Eupergit®C-Myoglobin-HRPO] (HERSTELLUNG Q).
2. Im Handel erhältliche Aspartat-Protease von Sigma Chemical Co. (Typ XIII, aus Aspergillus saitoi, 0,6 Units/mg Aktivität) 40 mg/ml.
3. Trypsin (Serinprotease) aus Rinderpankreas (2900 Units/mg Aktivität), erhalten von U. S. Biochemicals, 2 mg/ml.
4. Papain (Thiolprotease) aus Papaya-Latex (12 Units/mg Aktivität) von Sigma Chemical Co., 2 mg/ml.
5. Aspartat-Protease-produzierende Candida albicans-Kultur (ATCC 28366)
6. Tosyl-Lysinchlormethylketon(TLCK)-hydrochlorid, 50 mM in Ethanol von Sigma Chemical Co.
7. Pepstatin A aus einer mikrobiellen Quelle, erhalten von Sigma Chemical Co., 2 mg/ml in Ethanol.
8. Puffer und Lösungen.
a. Kaliumphosphat-Puffer pH 7,0, 200 mM.
b. Kaliumphosphat-Puffer pH 7,4, 100 mM.
c. Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, 100 mM.
d. 0,02% Wasserstoffperoxid-Lösung.
e. absoluter Ethanol.
9. Guajak-imprägniertes Papier (handelsübliche Hemoccult®-Objektträger)

B. VORGEHENSWEISE

Dieser Assay wird in zwei Teilen angesetzt. Der erste besteht darin, die Aktivität der verschiedenen Proteasen auf das Substrat [Eupergit®C-Myoglobin-HRPO] zu bestimmen. Die Enzyme und Kontrollen (15 min lang gekochte Enzyme) werden mit 20 mg Substrat und Puffern (siehe Mengen in der nachstehenden Tabelle) 15 Minuten lang vor dem Assay inkubiert.
Im zweiten Teil werden die Enzyme mit ihren jeweiligen Inhibitoren und passenden Puffern 15 Minuten lang vorinkubiert. Diese werden dann zu dem Substrat gegeben und weitere 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
In beiden Fällen wird das Reaktionsgemisch zentrifugiert, um Festphasen-Konjugat zu entfernen. Der Überstand (5 ul) wird zu Hemoccult®-Objektträgern zugesetzt und mit 5 ul Wasserstoffperoxid entwickelt.
Farb-Bewertung: Interpretation
0 keine sichtbare blaue Farbbildung
+/- mögliche schwache blaue Farbe
0,25 schwächste visuell nachweisbare blaue Farbe
0,5 distinkte blaue Farbe
1,0 dunkelblaue Farbe
2,0 dunkelste mögliche blaue Farbe im Testsystem

C. ERGEBNISSE

1. TEIL I: Die Reaktionsüberstande aus Röhrchen mit Puffer allein bei entweder pH 4,0 oder pH 7,5 erzeugten die lediglich schwächste nachweisbare Farbe bei Zusetzen zu Guajak- Objektträgern und Entwicklung mit Wasserstoffperoxid-Entwickler. Das gleiche Ergebnis war mit Reaktionsüberstanden aus Röhrchen, enthaltend gekochtes Trypsin bei pH 7,4, gekochte Candida-Kultur bei pH 4,0, und gekochtes Papain bei pH 7,4, ersichtlich. Eine starke blaue Farbe wurde mit ungekochtem Trypsin bei pH 7,4, ungekochter Candida-Kultur bei pH 4,0, und ungekochtem Papain bei pH 7,0 gebildet.
2. TEIL II: TLCK, ein Protease-Inhibitor, der in der Lage ist, sowohl Proteasen vom Serin- als auch vom Thiol-Typ zu inhibieren, inhibiert die Farbbildung sowohl durch Trypsin (eine Serinprotease) als auch Papain (eine Thiolprotease). Pepstatin, ein bekannter Inhibitor von Asparginsäure-Proteasen, inhibiert die Farbbildung durch die Candida albicans- Asparginsäure-Protease. Tabelle - Teil 1 Tabelle - Teil 2

D. INTERPRETATION

Trypsin, eine Serinprotease, hydrolysierte das Festphasen-Substrat bei pH 7,4, wobei lösliche HRPO freigesetzt wurde, welche die blaue Farbbildung auf entwickelten Guajak-Objektträgern katalysierte. Dasselbe galt für die Candida albicans-Aspartat-Protease bei pH 4,0, und Papain, eine Thiol-Protease, bei pH 7,0. Das Kochen verhinderte die HRPO-Freisetzung durch jedes Enzym. Somit war jeder der drei verschiedenen Enzymtypen unter den passenden Reaktionsbedingungen in der Lage zur hydrolytischen Freisetzung von löslicher HRPO von dem Träger. Weder Puffer noch hitzeinaktivierte Enzyme setzten lösliche HRPO frei, was anzeigt, daß die HRPO-Freisetzung nicht nur eine durch Salze etc. im Wachstumsmedium oder Inkubationsgemisch verursachte, nicht-spezifische Freisetzung war.
TLCK, ein zur Inhibierung von Proteasen sowohl vom Serin- als auch Thioltyp fähiger Proteaseinhibitor, inhibiert die Farbbildung sowohl durch Trypsin (eine Serinprotease) als auch Papain (eine Thiolprotease). Pepstatin, ein bekannter Inhibitor von Asparginsäure- Proteasen, inhibiert die Farbbildung durch die Candida albicans-Asparginsäure-Protease. Somit kann, durch Ausführung von Inkubationen in Gegenwart von bekannten spezifischen Enzyminhibitoren oder Inhibitoren spezifischer Klassen von Enzymen, eine Spezifität des Hydrolase-Nachweises erreicht werden.

Claims

1. Verfahren zum Assayen hinsichtlich der Gegenwart einer enzymatisch aktiven Hydrolase in einer Probe, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) Einbringen der Probe in eine Testvorrichtung, welche einen ersten und einen zweiten festen Träger enthält, wobei der erste feste Träger ein daran auf eine solche Weise kovalent angeheftetes Reporter-Enzym aufweist, daß das Reporter-Enzym bei Wirkung der Hydrolase freigesetzt wird; wobei der zweite feste Träger, der nicht in Kontakt mit dem ersten festen Träger steht, einen darauf immobilisierten Indikator aufweist, wobei der Indikator ein solcher ist, der für eine nachweisbare Veränderung bei Wirkung des Reporter-Enzyms empfänglich ist, wobei die Probe auf eine solche Weise in die Vorrichtung eingebracht wird, daß die Probe den ersten und zweiten festen Träger so kontaktiert, daß jeglichem durch irgendeine in der Probe vorhandene Hydrolase-Aktivität freigesetzten Reporter-Enzym gestattet wird, durch die Probe zu dem zweiten festen Träger zu diffundieren; und

(c) Beobachten, ob der Indikator eine nachweisbare Veränderung durchläuft, wobei die nachweisbare Veränderung eine Anzeige der Gegenwart der enzymatisch aktiven Hydrolase in der Probe ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Hydrolase eine Protease ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Asparaginsäure-Proteasen, Serin-Proteasen, Thiol-Proteasen, Metallo-Proteasen, sauren Proteasen und alkalischen Proteasen.

3. Verfahren zum Nachweis von Candidiasis durch Assayen hinsichtlich der Gegenwart von enzymatisch aktiver Asparaginsäure-Protease in einer Probe, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) Kontaktieren der Probe mit einem festen Träger, wobei der feste Träger ein darauf auf eine solche Weise immobilisiertes Reporter-Enzym aufweist, daß das Reporter-Enzym bei Wirkung der Asparaginsäure-Protease freigesetzt wird;

(b) Kombinieren der Probe, nachdem sie mit dem festen Träger kontaktiert worden ist, mit einem Indikator, wobei der Indikator ein solcher ist, der für eine nachweisbare Veränderung bei Wirkung des Reporter-Enzyms empfänglich ist; und (c) Beobachten, ob der Indikator eine nachweisbare Veränderung durchmacht, wobei die nachweisbare Veränderung eine Anzeige der Gegenwart der enzymatisch aktiven Asparaginsäure-Protease in der Probe und somit von Candidiasis ist.

4. Verfahren zum Nachweis von Trichomonas vaginalis durch Assayen hinsichtlich der Gegenwart einer enzymatisch aktiven Thiol-Protease in einer Probe, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) Kontaktieren der Probe mit einem festen Träger, wobei der feste Träger ein darauf auf eine solche Weise immobilisiertes Reporter-Enzym aufweist, daß das Reporter-Enzym bei Wirkung der Thiol-Protease freigesetzt wird;

(b) Kombinieren der Probe, nachdem sie mit dem festen Träger kontaktiert worden ist, mit einem Indikator, wobei der Indikator ein solcher ist, der für eine nachweisbare Änderung bei Wirkung des Reporter-Enzyms empfänglich ist; und

(c) Beobachten, ob der Indikator eine nachweisbare Veränderung durchmacht, wobei die nachweisbare Veränderung eine Anzeige der Gegenwart der enzymatisch aktiven Thiol-Protease in der Probe und somit von Trichomonas vaginalis ist.

5. Verfahren gemäß mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, in welchem das Reporter-Enzym eine Peroxidase, Phosphatase, Oxidoreduktase, Dehydrogenase, Transferase, Isomerase, Kinase, Reduktase, Deaminase, Katalase, Urease oder Glucuronidase umfaßt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Reporter-Enzym Meerrettichperoxidase umfaßt.

7. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei der feste Träger ein(e) unlösliche(s) Matrix, Gel oder Harz ist.

8. Verfahren gemäß mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei der feste Träger Cellulose, Agarose, Dextran, Polyacrylat, Polyacrylamid oder ihre Derivate, Chitin, Oxiranacryl-Perlen, polymeres Dialdehyd, Stärke, Collagen, Keratin, Elastin, Rinderhautpulver, Bakterienzellwand-Peptidoglycan oder Fragmente davon, Nylon, Polyethylenterephthalat, Polycarbonat oder Glas mit regulierter Porengröße umfaßt.

9. Verfahren gemäß mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei das Reporter- Enzym auf dem festen Träger durch Verwendung eines Linkermoleküls immobilisiert ist, welches ein hydrolysierbares Substrat für die enzymatisch aktive Hydrolase oder Protease ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Linkermolekül ein Protein oder Peptid ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Protein Azocasein, Casein, kappa-Casein, Immunoglobulin, Hämoglobin, Myoglobin, Albumin, Elastin, Keratin oder Collagen ist.

12. Verfahren gemäß mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die nachweisbare Veränderung eine Veränderung der Farbe bei Wirkung des Reporter-Enzyms ist, wenn es von dem festen Träger durch die enzymatisch aktive Hydrolase oder Protease freigesetzt wird.

13. Verfahren gemäß mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, in welchem das Reporter-Enzym in der Lage zum Katalysieren der Bildung eines fluoreszenten Signals, eines phosphoreszenten Signals, eines biolumineszenten Signals, eines chemolumineszenten Signals oder eines elektrochemischen Signals nach seiner Freisetzung von dem festen Träger durch die enzymatisch aktive Hydrolase oder Protease ist.

14. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-12, wobei das Reporter-Enzym in der Lage zur Erzeugung eines Gerinnsels, einer Agglutination, einer Präzipitation oder einer Klärzone ist.

15. Verfahren gemäß mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, in welchem das Reporter-Enzym eine Peroxidase ist, und der Indikator ein visueller chromogener Indikator ist.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der chromogene Indikator ein Hydroperoxid und Guajak, 2-2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure), Tetramethylbenzidin, Phenol, 4-Aminoantipyrin oder 4,5-Dihydroxynaphthalin-2,7-disulfonsäure umfaßt.

17. Testvorrichtung (11) zum Testen einer Probe hinsichtlich der Gegenwart von Candidiasis durch Assayen auf die Gegenwart einer enzymatisch aktiven Asparaginsäure-Protease, wobei die Testvorrichtung (11) folgendes umfaßt:

(a) Aufnahmebehältnis (31), mindestens teilweise begrenzt durch entgegengesetzte erste (13) und zweite (14) Wände, welche nach innen gerichtete Oberflächen (35, 36, 37, 38) mit einem Spalt (47) dazwischen aufweisen, wobei die erste Wand (13), die zweite Wand (14) oder beide aus einem licht-durchlässigen Material bestehen;

(b) Reporter-Enzym, das auf einem festen Träger auf der nach innen gerichteten Oberfläche von einer von den ersten und zweiten Wänden in einer solchen Weise immobilisiert ist, daß das Reporter-Enzym bei Wirkung der Asparaginsäure-Protease freigesetzt wird;

(c) Indikator (34), der auf der nach innen gerichteten Oberfläche von einer von besagten ersten und zweiten Wänden immobilisiert ist, wobei der Indikator ein solcher ist, der eine nachweisbare Veränderung bei Wirkung des Reporter-Enzyms durchläuft; und

(d) Öffnung (18) in dem Aufnahmebehältnis (31) zur Einführung der Probe.

18. Testvorrichtung (11) zum Testen einer Probe hinsichtlich der Gegenwart von Trichomonas vaginalis durch Assayen auf die Gegenwart einer enzymatisch aktiven Thiol-Protease, wobei die Testvorrichtung folgendes umfaßt:

(b) Reporter-Enzym, das auf einem festen Träger auf der nach innen gerichteten Oberfläche von einer von den ersten und zweiten Wänden in einer solchen Weise immobilisiert ist, daß das Reporter-Enzym bei Wirkung der Thiol-Protease freigesetzt wird;

(c) Indikator (34), der auf der nach innen gerichteten Oberfläche von einer von besagten ersten und zweiten Wänden immobilisiert ist, wobei der Indikator ein solcher ist, der eine nachweisbare Änderung bei Wirkung des Reporter-Enzyms durchläuft; und

(d) Öffnung (18) in dem Aufnahmebehältnis (31) zur Einführung der Probe.

19. Testvorrichtung gemäß Anspruch 17 oder 18, die geeignet zur Durchführung eines Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 3-16 ist.