HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbesserung der
Löslichkeit von Taxol in Wasser. Insbesondere betrifft sie die
Verbesserung der Löslichkeit von Taxol in einer wäßrigen Phase
durch Umwandlung in ein Cyclodextrin-Einschlußprodukt (im
folgenden als CD bezeichnet).
2. Stand der Technik
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Taxol ist eine Verbindung, die aus den Rinden von Taxus
brevifolia isoliert wird, eine Eibenbaumsorte, die in
Nordamerika wächst. Die Verbindung besitzt die Wirkung, daß sie die
Teilung von Krebszellen unterdrückt. Es wurde beobachtet, daß
die Verbindung besonders wirksam ist, wenn sie Patienten
verabreicht wird, die an Eierstockkrebs leiden. Die Substanz erregte
daher großes Aufsehen als neues wirksames Antikrebsmittel.
Taxol wird jedoch bei der Verabreichung an Patienten, infolge
seiner Unlöslichkeit in Wasser, kaum absorbiert.
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Taxol wurde erst in jüngster Zeit entdeckt, und es ist
wenig über seine Löslichkeit berichtet worden, mit Ausnahme der
Offenbarung in der Beschreibung der japanischen Patentanmeldung
Nr. Hei4-339 495 (339 495/1992), worin die Löslichkeit von
Taxol verbessert wird, indem man die Verbindung in einer Mischung
eines organischen Lösungsmittels und Wasser mit α-CD, β-CD, γ-
CD oder einem substituierten α-, β- oder γ-CD, bei dem
mindestens eine der Hydroxylgruppen über eine Etherbindung mit
mindestens einer Glukosylgruppe, einer Maltosylgruppe oder einem
Maltooligosaccharid substituiert ist, reagieren läßt.
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Bei dem obigen Verfahren werden organische Lösungsmittel
für die Herstellung der CD-Einschlußprodukte verwendet. Die
Verwendung von organischen Lösungsmitteln ist jedoch unter dem
Kostengesichtspunkten nachteilig, führt zur Komplizierung und
es besteht die Möglichkeit, daß eine Kontamination mit
organischen Lösungsmitteln auftritt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der
Bereitstellung eines neuen Einschlußproduktes von Taxol mit
verbesserter Löslichkeit im Wasser.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in
der Bereitstellung eines Verfahrens für die Herstellung eines
CD-Einschlußproduktes von Taxol auf bequeme, ökonomisch
vorteilhafte Weise, ohne die Verwendung organischer Lösungsmittel.
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Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der
folgenden Beschreibung deutlich.
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Die Erfindung stellt somit bereit:
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(1) Ein Einschlußprodukt von Taxol, das eingeschlossen ist in
einem substituierten α-, β- oder γ-Cyclodextrin, in dem ein
oder mehrere Hydroxylgruppen über eine Etherbindung mit
mindestens einem Bestandteil, ausgewählt aus der Gruppe, die aus
Methyl-, Hydroxyethyl- und Hydroxypropyl-Gruppen besteht,
substituiert sind, mit der Maßgabe, daß das substituierte
β-Cyclodextrin nicht Heptakis-2,6-O-dimethyl-β-cyclodextrin,
statistisch methyliertes β-Cyclodextrin oder 2-Hydroxypropyl-β-
cyclodextrin ist,
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(2) ein Verfahren zur Herstellung eines Einschlußproduktes von
Taxol, das in Cyclodextrin eingeschlossen ist, das umfaßt:
Umsetzen von Taxol mit α-Cyclodextrin oder einem substituierten
α-, β- oder γ-Cyclodextrin, in dem ein oder mehrere
Hydroxylgruppen des genannten substituierten Cyclodextrins über eine
Etherbindung mit mindestens einem Bestandteil substituiert
sind, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer
Glucosylgruppe, einer Maltosylgruppe, einem Maltooligosaccharidrest,
einer Methylgruppe, einer Hydroxyethylgruppe und einer
Hydroxypropylgruppe besteht, und worin die genannte Reaktion in einem
wäßrigen System unter Rühren oder Schütteln durchgeführt wird,
mit der Maßgabe, daß das substituierte β-Cyclodextrin nicht
Heptakis-2,6-O-dimethyl-β-cyclodextrin, statistisch
methyliertes β-Cyclodextrin oder 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin ist,
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(3) ein Verfahren zur Herstellung eines Einschlußproduktes von
Taxol, das in Cyclodextrin eingeschlossen ist, das umfaßt:
Umsetzen von Taxol mit einem substituierten α-, β- oder
γ-Cyclodextrin, worin ein oder mehrere Hydroxylgruppen des genannten
substituierten Cyclodextrins über eine Etherbindung mit
mindestens einem Bestandteil substituiert sind, der ausgewählt wird
aus der Gruppe, die aus Methyl-, Hydroxyethyl- und
Hydroxypropylgruppen besteht, und worin die genannte Reaktion in einem
organischen Lösungsmittel-Wasser-System unter Rühren oder
Schütteln durchgeführt wird, mit der Maßgabe, daß das
substituierte β-Cyclodextrin nicht
Heptakis-2,6-O-dimethyl-β-cyclodextrin, statistisch methyliertes β-Cyclodextrin oder
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin ist,
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(4) ein Verfahren zur Verbesserung der Löslichkeit von Taxol
in Wasser, das umfaßt: Umsetzen von Taxol mit α-Cyclodextrin
oder einem substituierten α-, β- oder γ-Cyclodextrin, in dem
ein oder mehrere Hydroxylgruppen des genannten substituierten
Cyclodextrins über eine Etherbindung mit mindestens einem
Bestandteil substituiert sind, der aus der Gruppe ausgewählt wird
die aus einer Glukosylgruppe, einer Maltosylgruppe, einem
Maltooligosaccharidrest, einer Methylgruppe, einer
Hydroxyethylgruppe und einer Hydroxypropylgruppe besteht, und worin die
genannte Reaktion in einem wäßrigen System unter Rühren oder
Schütteln durchgeführt wird, mit der Maßgabe, daß das
substituierte β-Cyclodextrin nicht
Heptakis-2,6-O-dimethyl-β-cyclodextrin, statistisch methyliertes β-Cyclodextrin oder
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin ist, und
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(5) Ein Verfahren zur Verbesserung der Löslichkeit von Taxol in
Wasser, das umfaßt: Umsetzen von Taxol mit einem substituierten
α-, β- oder γ-Cyclodextrin, worin ein oder mehrere
Hydroxylgruppen des genannten substituierten Cyclodextrins über eine
Etherbindung mit mindestens einem Bestandteil substituiert
sind, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Methyl-
, einer Hydroxyethyl- und einer Hydroxypropylgruppe besteht,
wobei die genannte Reaktion in einem organischen Lösungsmittel-
Wasser-System unter Rühren oder Schütteln durchgeführt wird,
mit der Maßgabe, daß das substituierte β-Cyclodextrin nicht
Heptakis-2,6-O-dimethyl-β-cyclodextrin, statistisch
methyliertes β-Cyclodextrin oder 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
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Fig. 1 ist eine Darstellung, die die Veränderungen der
Menge des gelösten Taxols in einer wäßrigen 0,1 M-Lösung von
2,6-Di-O-methyl-β-CD (CD-β-CD) mit dem Verstreichen der Zeit
zeigt.
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Fig. 2 stellt das ¹H-NMR-Spektrum eines Taxol-DM-β-CD-
Komplex-Pulvers, gelöst in D&sub2;O dar.
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Fig. 3 ist das ¹H-NMR-Spektrum von Taxol, gelöst in D&sub2;O.
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Fig. 4 stellt das ¹H-NMR-Spektrum von Taxol-DM-β-CD-
Komplex-Pulver, gelöst in d&sub6;-DMSO dar.
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Fig. 5 stellt das ¹H-NMR-Spektrum von Taxol, gelöst in d&sub6;-
DMSO dar.
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Fig. 6 stellt das ¹H-NMR-Spektrum von DM-β-CD, gelöst in
d&sub6;-DMSO dar.
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Fig. 7 stellt das ¹³C-NMR-Spektrum von Taxol-DM-CD-
Komplex-Pulver, gelöst in d&sub6;-DMSO dar.
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Fig. 8 stellt das ¹³C-NMR-Spektrum für DM-β-CD, gelöst in
d&sub6;-DMSO dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Der Ausdruck CD meint eine Verbindung, die besteht aus
einem Ring von 6 bis 8 D-Glukosen, verbunden durch
α-1,4-Bindungen; eine, bestehend aus 6 D-Glukosen, wird als α-CD
bezeichnet, eine, bestehend aus 7-D-Glukosen, wird als β-CD
bezeichnet und eine weitere, bestehend aus 8-D-Glukosen, wird als
γ-CD bezeichnet.
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In der Erfindung wird α-CD als solches oder ein
substituiertes α-, β- oder γ-CD, bei dem mindestens eine der
Hydroxylgruppen mit mindestens einer funktionelle Gruppe über eine
Etherbindung substituiert ist, verwendet. Beispiele anwendbarer
substituierter CDs schließen diejenigen ein, die mit solchen
funktionellen Gruppen substituiert sind, wie Saccharid-Gruppen
(z. B. Glukosyl, Maltosyl, Maltooligosaccharid), Alkylgruppen
(z. B. Methyl, Ethyl), Hydroxyalkylgruppen (z. B. Hydroxyethyl,
Hydroxypropyl) mit der Maßgabe, daß das substituierte
β-Cyclodextrin nicht Heptakis-2,6-O-dimethyl-β-cyclodextrin,
statistisch methyliertes β-Cyclodextrin oder 2-Hydroxypropyl-β-
cyclodextrin ist, und ähnliche.
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Diese CDs können entweder allein oder in Kombination von
zwei oder mehr davon verwendet werden.
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Um ein CD-Einschlußprodukt von Taxol durch Reaktion in
einem wäßrigen System zu erhalten, wird das CD in Wasser gelöst
und das Taxol dann hinzugegeben, gefolgt durch starkes Rühren
oder Schütteln. Die Konzentration des CD kann von 0,0001 bis
200 Gew.-%, bevorzugt 1 bis 50 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht
des Wassers, betragen.
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Das CD wird dann in einer Menge vom 1- bis 100.000.000-
fachen der molaren Menge des Taxols vermischt, bevorzugt der
100- bis 100.000-fachen molaren Menge des Taxols. Das Rühren
oder Schütteln wird so stark wie möglich für einen Zeitraum von
einigen Minuten bis mehrere 10 Minuten durchgeführt. Die
Reak
tion wird bei einer Temperatur von 0 bis 60ºC, bevorzugt bei 15
bis 40ºC durchgeführt.
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Durch die obige Reaktion wird das Taxol in das CD
eingeschlossen. Wenn das Taxol in einem hohen Verhältnis vermischt
wird, kann ein Teil der Verbindung ungelöst zurückbleiben. In
diesem Fall kann die ungelöste Verbindung aus der
Reaktionsmischung mit Hilfe der Filtration entfernt werden.
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Die so erhaltene wäßrige Lösung des CD-Einschlußproduktes
von Taxol kann bei Bedarf getrocknet werden, um ein Pulver des
Einschlußproduktes zu erhalten. Das resultierende
CD-Einschlußprodukt von Taxol besitzt eine deutlich verbesserte Löslichkeit
in Wasser.
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Um ein CD-Einschlußprodukt von Taxol durch die Reaktion
eines organischen Lösungsmittel-Wasser-Systems (nämlich eine
Mischung eines organischen Lösungsmittels und Wasser) zu
erhalten, wird das Taxol zunächst in einem organischen Lösungsmittel
gelöst. Beispiele der organischen Lösungsmittel, die für die
Auflösung anwendbar sind, schließen ein Ethylacetat, Methanol,
Ethanol, Aceton, Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid
und ähnliche. Acetonitril und Methanol sind besonders
bevorzugt. Es gibt keine besondere Einschränkung hinsichtlich der
Menge der zu verwendenden organischen Lösungsmittel,
vorausgesetzt, daß das Taxol darin gelöst werden kann.
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Auf der anderen Seite wird das CD in Wasser gelöst, um
eine wäßrige Lösung herzustellen, die das CD in einer Menge des
1- bis 100.000.000-fachen, bevorzugt 100- bis 100.000-fachen
der molaren Menge des Taxols enthält, und die Lösung wird zur
oben erhaltenen Taxollösung gegeben. Alternativ kann das CD
direkt zur Taxollösung gegeben werden. Nach der Zugabe wird die
Taxollösung gerührt, bevorzugt in heftiger Weise unter
Verwendung eines Rührers oder ähnlichem. Es gibt keine besondere
Einschränkung hinsichtlich der Temperatur bei der die
Einschlußreaktion durchgeführt wird, und die Reaktion verläuft bei
Raumtemperatur in ausreichendem Maße. Die Reaktionszeit kann im
Bereich von einigen Minuten bis mehreren Stunden liegen.
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Durch die obige Reaktion wird das Taxol in dem CD
eingeschlossen.
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Die resultierende Lösung kann bei Bedarf getrocknet
werden, um stabile CD-Einschlußprodukte von Taxol zu erhalten. Das
so erhaltene Produkt besitzt eine hohe Löslichkeit in Wasser.
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Das erhaltene CD-Einschlußprodukt von Taxol kann bei der
Verabreichung an einen Patienten z. B. mit Hilfe einer
intravenösen Injektion oder durch orale Verabreichung effizient in die
erkrankten Teile des Patienten bei einer geringeren Dosierung
transportiert werden. Daher können die physiologischen
Aktivitäten des Taxols effizient ausgenutzt werden.
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Das CD-Einschlußprodukt von Taxol, das durch die Erfindung
erhältlich ist, kann in verschiedenen Formen verwendet werden.
Z. B. kann es als Injektionsarzneimittel verwendet werden, oder
es kann wie es ist, in der Form eines Pulvers verwendet werden.
Aus Gründen der Bequemlichkeit kann das Pulver in ein Granulat
oder Tabletten geformt werden oder es kann in eine Kapsel
gefüllt werden. Das Einschlußprodukt kann natürlich auch in Form
der Lösung verwendet werden.
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Einschlußprodukte des Taxols gemäß dieser Erfindung
besitzen eine deutlich verbesserte Löslichkeit im wäßrigen System
und können folglich auf effiziente Weise erkrankten
Körperteilen von Patienten, die an Krebs leiden, verabreicht werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter
erläutert. Es wird darauf hingewiesen, daß die Erfindung durch
diese Beispiele auf keinen Fall beschränkt wird.
Beispiel 1
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In Wasser wurden 0,058 g α-CD, 0,078 g γ-CD, 0,078 g 6-
Mono-O-maltosyl-α-CD (im folgenden als G&sub2;-α-CD bezeichnet),
0,088 g 6-Mono-O-maltosyl-β-CD (im folgenden als G&sub2;-β-CD
bezeichnet), 0,097 g 6-Mono-O-maltosyl-γ-CD (im folgenden als G&sub2;-
γ-CD bezeichnet), 0,069 g 2,6-Di-O-methyl-α-CD (im folgenden
als DM-α-CD bezeichnet), 0,080 g 2,6-Di-O-methyl-β-CD (im
fol
genden als DM-β-CD bezeichnet), und 0,098 g Hydroxyethyl-β-CD,
worin von 21 Hydroxylgruppen, die in einem β-CD-Molekül
enthalten waren, durchschnittlich 1,6 Gruppen über eine Etherbindung
mit einer Hydroxyethylgruppe substituiert waren (im folgenden
als HE-β-CD bezeichnet) oder 0,090 g Hydroxypropyl-β-CD, worin
von 21 Hydroxylgruppen, die in einem β-CD-Molekül enthalten
waren, durchschnittlich 0,9 Gruppen über eine Etherbindung mit
einer Hydroxypropylgruppe substituiert waren (im folgenden als
HP-β-CD bezeichnet) gelöst, und das Volumen jeder Lösung wurde
auf 10 ml eingestellt, um wäßrige CD-Lösungen mit einer
Konzentration von 6 mM herzustellen.
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Diesen Lösungen wurde jeweils 2 mg Taxol zugesetzt, und
die resultierenden Mischungen wurden bei Raumtemperatur (20 bis
25ºC) bei 5000 U. p. m. gerührt. Nach 70 Minuten Rühren wurden
die Lösungen über einen Filter mit einem Porendurchmesser von
0,45 um gegeben, und die Konzentration des Taxols, das in den
Filtraten enthalten war, wurde durch
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
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Löslichkeit des Taxols (ug/ml)
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CD nicht hinzugegeben (Kontrolle) 0
-
α-CD 0,3
-
γ-CD 0,3
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G&sub2;-α-CD 0,3
-
G&sub2;-β-CD 0,5
-
G&sub2;-γ-CD 0,4
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DM-α-CD 2,8
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DM-β-CD 47,1
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HE-β-CD 0,5
-
HP-β-CD 1,1
Beispiel 2
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In Wasser wurden 1,296 g G&sub2;-α-CD, 1,458 g G&sub2;-β-CD, 1,620 g
G&sub2;-γ-CD, 1,331 g DM-β-CD, 1,429 g 2,3,6-Tri-O-methyl-β-CD (im
folgenden als TM-β-CD bezeichnet), und 1,629 g HE-β-CD oder
1,501 g HP-β-CD gelöst, und die Volumen jeder Lösung wurden auf
10 ml eingestellt, um wäßrige CD-Lösungen mit einer
Konzentration von 100 mM herzustellen. Anschließend wurden 20 mg Taxol
zu der wäßrigen DM-β-CD-Lösung gegeben, 2 mg Taxol zu der
wäßrigen HP-β-CD-Lösung und 1 mg Taxol jeweils zu den anderen
wäßrigen CD-Lösungen, und die resultierenden Mischungen wurden bei
Raumtemperatur (20 bis 25ºC) bei 5000 U. p. m. gerührt. Als
Kontrolle wurde 1 mg Taxol zu 10 ml Wasser gegeben, und die
resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur (20 bis 25ºC) bei
5000 U. p. m.. gerührt. Nach 70 Minuten Rühren wurden die Lösungen
über einen Filter mit einem Porendurchmesser von 0,45 um
gegeben, und die Konzentrationen des Taxols, die in den Filtraten
enthalten waren, wurden bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse
sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
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Löslichkeit des Taxols (ug/ml)
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CD nicht zugegeben (Kontrolle) 0,4
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G&sub2;-α-CD 1,6
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G&sub2;-β-CD 23,0
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G&sub2;-3-CD 23,0
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DM-β-CD 1236
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TM-β-CD 28,0
-
HE-β-CD 22,2
-
HP-β-CD 68,9
Beispiel 3
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In Wasser wurde 1,331 g DM-β-CD gelöst, und das Volumen
der Lösung wurde auf 10 ml eingestellt, um eine wäßrige CD-
Lösung mit einer Konzentration von 100 mM herzustellen. Dazu
wurden 20 mg Taxol gegeben, und die resultierende Mischung
wurde bei Raumtemperatur (20 bis 25ºC) bei 5000 U. p. m. für einen
Zeitraum von 11 Stunden gerührt. Während des Rührens wurden der
Mischung Proben entnommen in geeigneten Intervallen und über
einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 um gegeben, und die
Konzentration des in den Filtraten enthaltenen Taxols wurde
bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.
Beispiel 4
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Zu 70 ml einer Mischung von Methanol und Wasser
(Volumenverhältnis 1 : 1), das gleiche Volumen einer Mischung von
Acetonitril und Wasser (Volumenverhältnis 1. 1), das gleiche
Volumen einer Mischung von Aceton und Wasser (Volumenverhältnis 1
1) und das gleiche Volumen einer Mischung von Tetrahydrofuran
und Wasser (Volumenverhältnis 1. 1) wurden jeweils 5 mg Taxol
gegeben. Zu den resultierenden Taxollösungen wurden jeweils 500
mg DM-β-CD gegeben, und die resultierenden Mischungen wurden
mit einem Rührer heftig bei einer Temperatur von 25ºC gerührt.
Nach 2 Stunden Rühren wurden jeweils 100 ml Wasser
hinzugegeben, und die resultierenden Lösungen wurden gefriergetrocknet,
so daß Pulver erhalten wurden durch vollständiges Entfernen des
Wassers und der organischen Lösungsmittel. Anschließend wurden
jeweils 8 mg der so erhaltenen Pulver in 1 ml Wasser unter
Rühren gelöst, und die resultierenden Lösungen wurden über einen
Filter mit einer Porengröße von 0,45 um gegeben, und die
Konzentration des DM-β-CD und des Taxols, die in den Filtraten
enthalten waren, wurden durch HPLC bestimmt. Tabelle 3 zeigt
die Löslichkeit des Taxols bei einer DM-β-CD-Konzentration von
6 mM.
Tabelle 3
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Verwendetes organisches Lösungsmittel Löslichkeit des Taxols (ug/ml)
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Methanol 63,2
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Acetonitril 78,6
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Aceton 43,9
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Tetrahydrofuran 10,3
Beispiel 5
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Zwei Taxollösungen wurden durch Lösen von jeweils 5 mg
Taxol in jeweils 100 ml von Mischungen aus Methanol und Wasser
(Volumenverhältnis 1. 1) gegeben. Zu diesen Lösungen wurden 50
mg HE-β-CD oder HP-β-CD gegeben, und die resultierenden
Mischungen wurden unter Verwendung eines Rührers bei 25ºC heftig
gerührt. Nach 2 Stunden Rühren wurden 300 ml Wasser
hinzugegeben, und die resultierenden Lösungen wurden der
Gefriertrocknung unterworfen, so daß Pulver durch vollständige
Entfernung des Wassers und des organischen Lösungsmittels erhalten
wurden.
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Teile der so erhaltenen Pulver (9,8 mg HE-β-CD und 9,0 mg
HP-β-CD) wurden in jeweils 1 ml Wasser gelöst. Nach dem Rühren
wurden die resultierenden Mischungen über einen Filter mit
einer Porengröße von 0,45 um gegeben, und die Konzentration des
in den Filtraten enthaltenen Taxols wurde bestimmt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
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Verwendetes CD Löslichkeit des Taxols (ug/ml)
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HE-β-CD 1,3
-
HP-β-CD 6,1
Beispiel 6
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13,31 g DM-β-CD wurden in Wasser gelöst, und das Volumen
der Lösung wurde auf 100 ml eingestellt, um eine wäßrige CD-
Lösung mit einer Konzentration von 0,1 M herzustellen.
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Zu der Lösung wurden 1,2 g Taxol gegeben, und die
resultierenden Mischungen wurden mit einem Rührer bei 25ºC für eine
Stunde gerührt. Anschließend wurden die Mischungen mit einem
Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 um filtriert, um
das ungelöste Taxol zu entfernen, wobei eine transparente
Lösung erhalten wurde. Die resultierende Lösung wurde
gefriergetrocknet, um den Taxol-DM-β-CD-Komplex in Pulverform zu
erhalten.
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0,05 g des Taxol-DM-β-CD-Komplexpulvers wurden in Wasser
gelöst, um 10 ml einer Lösung herzustellen. Anschließend wurden
20 ul der Lösung der HPLC-Analyse unter den folgenden
Bedingungen unterworfen: Säule: Crest Pak C18S (JASCO CO., Japan),
Säulemtemperatur: Raumtemperatur, Elutionsmittel: Methanol/Wasser
= 65/35 (bezogen auf das Volumen), Fließgeschwindigkeit: 1,0
ml/min., Detektor: UV-Detektor und gemessene Wellenlänge: UV
230 nm. Als Standardlösungen des Taxols wurden jeweils 50
ug/ml-, 100 ug/ml-, 150 ug/ml- und 200 ug/ml-Taxollösungen
gelöst in Methanol/Wasser (65/35 bezogen auf Volumen) hergestellt
und jeweils 20 ul dieser Lösungen wurden unter den gleichen
analytischen Bedingungen wie oben analysiert, um eine
Kalibrierungskurve zu erhalten. Durch das absolute Kalibrierungskurven-
Verfahren wurde der Taxolgehalt in dem
Taxol-DM-β-CD-Komplexpulver auf 10,7 mg/g-Pulver bestimmt.
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Taxol-DM-β-Komplexpulver, Taxol und DM-β-CD wurden in D&sub2;O
oder d&sub6;-DMSO gelöst. Die resultierende Lösung wurde der ¹H-NMR
(400 MHz) oder ¹³C-NMR (100 MHz)-Analyse unter Verwendung eines
JNM-GSX 400 Spektrometers (hergestellt durch JEOL, Ltd.)
unterworfen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 bis 8 gezeigt.
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Fig. 2 und 3 sind die ¹H-NMR-Spektren für Taxol-DM-β-CD-
Komplexpulver bzw. Taxol gelöst in D&sub2;O. Ein Spektrum des Taxols
ist zu sehen in Fig. 2, aber nicht in Fig. 3.
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Fig. 4, 5 und 6 sind die ¹H-NMR-Spektren für Taxol-DM-β-
CD-Komplexpulver, Taxol und DM-β-CD jeweils in d&sub6;-DMSO gelöst.
Durch Vergleich der chemischen Verschiebung von Taxol in dem
Taxol-DM-β-CD-Komplex und freiem Taxol wurde gefunden, daß das
NH-Proton unter den Signalen des Taxols in dem Taxol-DM-β-CD-
Komplex hochfeldverschoben war und in dem Spektrum des Taxols
in dem Taxol-DM-β-CD-Komplex Signale vorlagen, die von
denjenigen des Spektrums des freien Taxols verschieden waren. Fig. 7
und 8 sind die ¹³C-NMR-Spektren für Taxol-DM-β-CD-Komplexpulver
bzw. für DM-β-CD gelöst in d&sub6;-DMSO. Durch Vergleich der
jeweiligen chemischen Verschiebungen von DM-β-CD in Taxol-DM-β-CD-
Komplex und freiem DM-β-CD wurde gefunden, daß C-2, C-6 und
C-6' (Kohlenstoff der Methoxylgruppe) in der Glukoseeinheit des
CD in dem Taxol-DM-β-CD-Komplex tieffeldverschoben war.
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Durch die obigen Ergebnisse wurde gefunden, daß die
Löslichkeit des Taxols gegenüber Wasser durch das Vorliegen von CD
verbessert wurde, und somit die Wechselwirkung zwischen Taxol
und DM-β-CD nahelegte.