DE69412593T2

DE69412593T2 - Anthrax-toxin-fusionsproteine und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69412593T2
Application number: DE69412593T
Authority: DE
Inventors: Naveen Delhi 110052 Arora; Kurt Gaithersburg Md 20882 Klimpel; Stephen H. Bethesda Md 20817 Leppla; Yogendra Scir Center For Biochemicals Delhi 110007 Singh
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1993-02-12
Filing date: 1994-02-14
Publication date: 1999-02-18
Anticipated expiration: 2014-02-15
Also published as: AU6392294A; ATE169959T1; EP0684997A1; DE69412593D1; WO1994018332A2; WO1994018332A3; EP0684997B1; US5677274A; CA2155514A1; AU682500B2; ES2122257T3

Description

ANTHRAX-TOXIN-FUSIONSPROTEINE UND DEREN VERWENDUNGEN

Eine Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein codiert Hintergrund der Erfindung:
Die Zielrichtung von zellgiftigen oder anderen Stoffen zu spezifischen Zelltypen wurde als eine Methode vorgeschlagen, um Krankheiten, wie beispielsweise Krebs, zu behandeln. Verschiedene Toxine wie Diphtheria-Toxin und Pseudomonas-Toxin A, wurden als potentielle Kandidaten von Toxinen für solch eine Behandlungsmethode vorgeschlagen. Eine Schwierigkeit solcher Methoden war die Unfähigkeit, spezifische Zelltypen selektiv als Ziel bei Gabe von Toxinen oder anderen aktiven Stoffen zu erreichen.
Eine Methode, um zielgerichtet spezifische Zellen zu erreichen, war es, Fusionsproteine, bestehend aus einem Toxin und einem einzelsträngigen Antikörper herzustellen. Ein einzelsträngiger Antikörper (sFv) besteht aus der variablen Domäne der leichten Kette (VL) eines Antikörpers und der variablen Domäne der schweren Kette (VH), die durch eine kurzes Peptid verbunden sind und wodurch eine Struktur entsteht, die es erlaubt, eine Konformation anzunehmen, die eine Bindung eines Antigens ermöglicht. Unter diagnostischen oder therapeutischen Rahmenbedingungen könnte der Einsatz eines sFv attraktive Vorteile gegenüber der Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (MoAb) bieten. Solche Vorteile beinhalten ein schnelleres Eindringen in Tumore, begleitet von geringer Rückhaltung in Nicht-Zielorganen (Yokota et al., Cancer Res., 52: 3402, 1992), extrem schneller Reinigung aus dem Plasma und dem gesamten Körper (resultiert in einer Verteilung, die hoch im Tumor und normal im Gewebe ist), gezeigt im Verlauf durch bildgebenden Studien (Colcher et al., Natl. Cancer Inst., 82 : 1191,1990; Milenic et. al., Cancer Res., 51 : 6363, 1991), und relativ geringen Kosten der Herstellung sowie der Befreiung von Beeinflussung auf genetischer Ebene (Huston et al., Methods Enzymol., 203 : 46,1991; Johnson, S. und Bird, R. E., Methods Enzymol., 203 : 88, 1991). Zusammenfassend wurde gezeigt, daß sFv-Toxin-Fusionsproteine eine erhöhte anti-Tumor Aktivität zeigen, verglichen mit konventionell chemisch erzeugten Konjugaten (Chaudhary et al., Nature, 339 : 394, 1989; Batra et al., Cell Biol., 11 : 2200-2295, 1991). Unter den ersten sFv, die erzeugt wurden, waren Moleküle mit der Fähigkeit zur Bindung von Haptenen (Bird et al., Science, 242 : 423,1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 5879, 1988), Zell-Oberflächen-Rezeptoren (Chaudhary et. al., 1989), und Tumor-Antigene (Chaudhary et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 1066,1990; Colcher et al., 1990).
Das Gen, das einen sFv codiert, kann durch einen von zwei Wegen zusammengesetzt werden: (i) durch de novo-Konstruktion, ausgehend von chemisch synthetisierten, überlappenden Oligonucleotiden, oder (ii) durch auf Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierender Klonierung von VL- und VH-Genen aus Hybridoma cDNA. Hauptsächliche Nachteile des ersten Ansatzes sind der beträchtliche Aufwand, den die Oligonucleotid-Synthese mit sich bringt, und die Tatsache, daß die Sequenz von VL und VH bekannt sein muß, bevor eine Zusammenstellung der Gene möglich ist. Folglich wurde die Mehrheit von sFv, über die bisher berichtet wurde, durch Klonierung aus Hybridoma cDNA erzeugt; nichtsdestoweniger wohnen diesem Herangehen ebenfalls Nachteile inne, da verfügbare Kulturen der Hybridoma- oder Myeloma-Zelllinien benötigt werden und man häufig auf Probleme stößt, bei Versuchen die Gene mit der korrekten V-Region aus der heterologen cDNA zu gewinnen, zum Beispiel Hybridoma-Zellen, in denen der unsterblich gemachte Fusionspartner von MOPC-21 abgeleitet ist und möglicherweise ein VL-kappa-Transkript exprimiert, das an der VJ-Rekombinationsstelle falsch zusammengesetzt ist und welches deshalb für eine nicht-funktionale leichte Kette codiert (Cabilly & Riggs, 1985; Carroll et al., 1988). Die Menge dieses Transkriptes in der Zelle ist möglicher weise höher als der des vom korrekten VL-Gens produzierten, so daß ein großer Anteil der Ausbeute der PCR-Amplifikation von Hybridoma cDNA nicht die funktionale leichte Kette codieren wird. Ein zweiter Nachteil, dem die Autoren dieser Erfindung häufig gegenüberstanden, der auf PCR basierenden Methode ist wechselnder Erfolg, VH-Gene zu erhalten, wenn bis jetzt in der Literatur beschriebene Versuchsbedingungen gewählt wurden, wahrscheinlich weil die Anzahl der zueinander passenden Basenpaare zwischen der Primer- und der Zielsequenz eine Hybridbildung soweit destabilisierte, daß eine PCR-Amplifikation inhibiert wurde.
Deshalb erwiesen sich Methoden in der Praxis als schwierig, bei denen einzelsträngige Antikörper benutzt wurden, um Toxine zu spezifischen Zielzellen zu dirigieren, wegen der Schwierigkeiten, einzelsträngige Antikörper oder andere zur Zielrichtung verwendbare Einheiten zu erhalten. Auch war keine der vorgeschlagenen Behandlungsmethoden vollständig erfolgreich, weil durch die Notwendigkeit, das Toxin an die Einheit zur Zielrichtung zu fusionieren, entweder die Funktion des Toxins oder die Funktion der Zielrichtung zerstört wurde. Deshalb besteht ein Bedarf an einem Verfahren, mit dem Moleküle, die eine gewünschte Aktivität aufweisen, zielgerichtet zu einer spezifischen Zellpopulation zu dirigieren.
Bakterielle und pflanzliche Protein-Toxine haben neue und effiziente Strategien hervorgebracht, um in das Cytoplasma von Säugetierzellen einzudringen, und diese Fähigkeit wurde genützt, um anti-Tumor- und anti-HIV-Zellgifte zu entwickeln. Beispiele schließen Ricin sowie chimäre Pseudomonas-Exotoxin A-(PE)- Toxine und Immunotoxine ein.
Pseudomonas-Exotoxin A-(PE) ist ein Toxin, für das eine detaillierte Analyse der funktionalen Domänen existiert. Die Sequenz ist in GenBank hinterlegt. Durch Strukturanalyse mittels Röntgenbeugung, Expression von zerstörten Proteinen und ausgiebige Mutagenesestudien wurden drei funktionale Domänen in PE definiert: eine Rezeptor-Bindungsdomäne (Reste 1-252 und 365- 399), bezeichnet als Ia und Ib, eine zentrale Translokationsdomäne (Aminosäu ren 253-364, Domäne II) und eine enzymatische Domäne am Carboxy-Ende (Aminosäuren 400-613, Domäne III). Domäne III katalysiert die ADP-Ribosylierung des Elongationsfaktors 2 (EF-2), welches in einer Inhibierung der Proteinbiosynthese und Zelltod resultiert. Kürzlich wurde weiterhin herausgefunden, daß eine Sequenz am äußersten Carboxy-Ende wesentlich für die Toxizität ist (Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87 : 308-312, 1990; Seetharam et al., J. Biol. Chem., 266 : 17376-17381, 1991). Da diese Sequenz ähnlich der Sequenz ist, die die Rückhaltung von Proteinen im endoplasmatischen Retikulum (ER) spezifiziert (Munro, S. und Pelham, H.R.B Cell, 48 : 899-907, 1987), wurde vorgeschlagen, daß PE das ER passieren müsse, um in das Cytoplasma zu gelangen. Kenntnisse der strukturellen Einzelheiten von PE haben die Verwendung der Domänen II, Ib und III (zusammen bezeichnet als PE40) für Hybrid-Toxine und Immunotoxine erleichtert.
Bacillus anthracis produziert drei Proteine, welche passend kombiniert zwei starke Toxine bilden, gemeinsam bezeichnet als Anthrax-Toxin. Das Schutz- Antigen (PA, 82,684 Da (Dalton) (SEQ ID NOS: 3 und 4)) und der Edema-Faktor (EF, 89,840 Da) bilden in Kombination das Edema-Toxin (ET), während PA und der Letal-Faktor (LF, 90,237 Da (SEQ ID NOS: 1 und 2)) in Kombination das Letal-Toxin (LT) bilden (Leppla, S. H. Alouf, J.E. und Freer, J.H., eds., Academic Press, London, 277-302, 1991). Beide, ET und LT, stimmen mit dem AB Toxin-Modell überein, wobei PA die Bindungsfunktion (B) an die Zielzelle liefert und EF oder LF als Effektor- oder katalytische (A) Einheiten agieren. Ein besonderes Kennzeichen dieser Toxine ist, daß LF und EF keine Toxizität in der Abwesenheit von PA aufweisen, offensichtlich weil sie keinen Zugang zum Cytoplasma eukariontischer Zellen erlangen können.
Die Gene für jede der drei Komponenten des Anthrax Toxins sind kloniert und sequenziert worden (Leppla, 1991). Dies zeigte, daß LF und EF ausgedehnte Übereinstimmung in den Aminosäureresten von 1-300 haben. Da LF und EF um die Bindung an PA63 konkurrieren, ist es höchstwahrscheinlich, daß diese Regionen am Amino-Ende für die Bindung an PA63 verantwortlich sind. Ein direkter Nachweis hierfür wurde kürzlich durch eine Mutagenesestudie geliefert (Quinn et al., J. Biol. Chem., 266 : 20124-20130, 1991); alle Mutationen, die innerhalb der Aminosäurereste 1-210 von LF gemacht wurden, führten zu einer verminderten Bindung an PA63. Die gleiche Studie deutet auch darauf hin, daß die vermutliche katalytische Domäne von LF die Reste 491-776 mit einschließt (Quinn et al., 1991). Im Gegensatz dazu ist die Lokalisierung der funktionellen Domänen innerhalb des PA63 Polypeptids aus einer Überprüfung der abgeleiteten Aminosäuresequenz nicht offensichtlich erkennbar. Studien mit monoklonalen Antikörpern und Protease-Fragmenten (Leppla, 1991) sowie nachfolgende Mutagenesestudien (Singh et al., J. Biol. Chem., 266 : 15493-15497,1991) haben jedoch gezeigt, daß Reste am oder nahe des Carboxy-Endes von PA in die Bindung an den Rezeptor beteiligt sind.
PA hat die Fähigkeit, an die Oberfläche vieler Zelltypen zu binden. Nachdem PA an den spezifischen Rezeptor (Leppla, 1991) auf der Oberfläche entsprechender Zellen bindet, wird es an einer einzigen Stelle durch eine Protease der Zelloberfläche, wahrscheinlich Furin, gespalten, wodurch ein 19-kDa-Fragment des Amino-Endes entsteht, das von dem Rezeptor/PA-Komplex freigesetzt wird (Singh et al., J. Biol. Chem., 264 : 19103-10107,1989). Die Beseitigung dieses Fragments von PA legt eine hochaffine Bindungsstelle für LF und EF auf dem Rezeptor-gebundenen 63-kDa-Fragment des Carboxy-Endes (PA63) frei. Der Komplex von PA63 und LF oder EF wird in die Zellen aufgenommen und erreicht wahrscheinlich durch Passage mittels angesäuerter Endosomen das Cytoplasma.
Spaltung von PA findet nach nach den Resten 164-167, Arg-Lys-Lys-Arg statt. Diese Stelle ist auch empfänglich für eine Spaltung durch Trypsin, so daß von der Trypsin-Spaltungsstelle gesprochen werden kann. Nur nach Spaltung ist PA fähig, entweder EF oder LF zu binden und so entweder ET oder LT zu bilden. Frühere Arbeiten haben gezeigt, daß das PA-Fragment des Carboxy-Endes (PA63) Ionen-leitende Kanäle in künstlichen Lipid-Membranen formen kann (Blaustein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86 : 2209-2213, 1989; Koehler, T. M. und Collier, R.J., Mol. MicrobioL, 5 : 1501-1506,1991), und das LF gebun den an PA63 auf Zelloberflächen-Rezeptoren durch Ansäuerung des Kulturmediums künstlich über die Zellmembran in das Cytoplasma transportiert werden kann (Friedlander, A.M., J. Biol. Chem., 261 : 7123-7126, 1986). Darüber hinaus schützen Wirkstoffe, die eine Ansäuerung der Endosomen blockieren, Zellen vor LF (Gordon et al., J. Biol. Chem., 264 : 14792-14796,1989; Friedlander, 1986; Gordon et al., Infect Immun., 56 : 1066-1069, 1988). Der Mechanismus, durch den EF aufgenommen wird, wurde in kultivierten Zellen untersucht, indem der Anstieg der cAMP-Konzentration, verursacht durch PA und EF, gemessen wurde (Leppla, S. H., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79 : 3162-3166, 1982; Gordon et al., 1989). Da jedoch Bestimmungen von cAMP relativ teuer und nicht sehr präzise sind, stellt dies keine günstige Analysenmethode dar. Die Aufnahme von LF wurde ausschließlich in Maus- bzw. Ratten-Macrophagen analysiert, da dies die einzigen Zelltypen sind, die durch das Letal-Toxin lysiert werden.

Zusammenfassung der Erfindung:

Mit der vorliegenden Erfindung wird eine für ein Fusionsprotein codierende Nucleinsäure bereitgestellt, die eine für die Translokationsdomäne und LF-Bindungsdomäne des nativen PA-Proteins codierende Nucleotidsequenz und eine eine Ligandendomäne codierende Nucleotidsequenz umfaßt, wobei die Ligandendomäne spezifisch einen zellulären Empfänger bindet. Proteine, die durch die in der Erfindung beschriebene Nucleinsäure codiert werden und Vektoren, die diese Nucleinsäure enthalten, werden auch angegeben.

Kurze Beschreibung der Figuren:

In Fig. 1 ist eine grafische Darstellung des Prozentsatzes der Spaltung mutierter Proteine durch aufgereinigte HIV-1-Protease gezeigt. Die mutierten Proteine schließen das Schutz-Antigen (PA) ein, welches so verändert wurde, daß es die HIV-1-Protease-Spaltungsstelle anstelle der natürlichen Trypsin-Spaltungsstelle beinhaltet.

Nucleinsäuren:

Letal-Faktor (LF):

Nachfolgend wird eine isolierte, ein Fusionsprotein codierende Nucleinsäure beschrieben, das eine für die PA-Bindungsdomäne des nativen LF-Proteins codierende Nucleotidsequenz und eine eine aktivitätsinduzierende Domäne eines zweiten Proteins codierende Nucleotidsequenz umfaßt. Das LF-Gen und das native LF-Protein sind in SEQ ID NO: 1 beziehungsweise 2 gezeigt. Das PA-Gen und das native PA-Protein sind in SEQ ID NO: 3 beziehungsweise 4 gezeigt.
Das zweite Protein kann ein Toxin sein, zum Beispiel Pseudomonas-Exotoxin A- (PE), die A-Kette des Diphtheria-Toxins oder Shiga-Toxin. Die aktivitätsinduzierende Domäne vieler anderer bekannter Toxine kann in das durch die hier beanspruchte Nucleinsäure codierende Fusionsprotein mit eingeschlossen werden. Die aktivitätsinduzierende Domäne braucht kein Toxin zu sein, kann aber andere Aktivitäten haben, einschließlich aber nicht begrenzt auf ein Anregen oder Herabsetzen des Wachstums, die selektive Hemmung der DNA-Replikation, der Bereitstellung eines erwünschtes Gens, der Bereitstellung einer gewünschten enzymatischen Aktivität oder der Bereitstellung einer Strahlungsquelle. In jedem Fall müssen die Fusionsproteine, die durch die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung codiert werden, die Fähigkeit aufweisen, aufgenommen zu werden und eine spezifische Aktivität in einer Zelle zu exprimieren. Ein bestimmtes erfindungsgemäßes LF-Fusionsprotein kann auf seine Fähigkeit, aufgenommen zu werden und die gewünschte Aktivität zu exprimieren, getestet werden, indem hier, insbesondere in den Beispielen 1 und 2, beschriebene Methoden verwendet werden.
Ein Beispiel für eine geeignete Nucleinsäure umfaßt die Nucleotidsequenz, die in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 5 bezeichnet ist. Diese Nucleinsäure codiert eine Fusion der LF-Reste 1-254 mit den zwei Verbindungsresten "TR" und den PE-Resten 401-602 (SEQ ID NO: 6). Das Protein beinhaltet eine Met-Val- Pro-Sequenz am Beginn der LF-Sequenz. Verfahren zur Gewinnung dieses Fusionsproteins sind nachfolgend und weiter unten in Beispiel 1 beschrieben.
Ein weiteres Beispiel für eine geeignete Nucleinsäure umfaßt die Nucleotidsequenz, die in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 7 bezeichnet ist. Diese Nucleinsäure codiert eine Fusion der LF-Reste 1-254 mit den zwei Verbindungsresten "TR" und den PE-Resten 398-613 (SEQ ID NO: 8). Der Verbindungspunkt, der das "TR" enthält, ist die Sequenz LTRA, und das Met-Val-Pro- ist auch vorhanden. Dieses Fusionsprotein und Methoden zu dessen Gewinnung sind nachfolgend und weiter unten in Beispiel 2 beschrieben.
Ein weiteres Beispiel einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure umfaßt die Nucleotidsequenz, die in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 9 bezeichnet ist. Diese Nucleinsäure codiert eine Fusion der LF-Reste 1-254 mit den zwei Verbindungsresten und den PE-Resten 362-613 (SEQ ID NO: 10). Dieses Fusionsprotein ist weiter unten in Beispiel 1 beschrieben.
In einer anderen Möglichkeit kann die Nucleinsäure die vollständige codierende Sequenz des LF-Proteins beinhalten und mit einer non-LF-aktivitätsinduzierenden Domäne fusioniert sein. Andere LF-Fusionsproteine verschiedener Größen, die mit Hilfe verschiedener Methoden hergestellt und auf die gewünschte Aktivität getestet wurden, werden hier auch angegeben, insbesondere in den Beispielen 1 und 2.

Schutz-Antigen (PA):

Mit der Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, die für ein Fusionsprotein codiert, das eine für die Translokationsdomäne und LF-Bindungsdomäne des nativen PA-Proteins codierende Nucleotidsequenz und eine eine Ligandendomäne codierende Nucleotidsequenz umfaßt, wobei die Ligandendomäne spezifisch einen zellulären Empfänger bindet.
Ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure umfaßt die Nucleotidse quenz, die in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 11 bezeichnet ist. Diese Nucleinsäure codiert eine Fusion der PA-Reste 1-725 und von Resten 1-178 von CD4 von Menschen, des Teils, der an gp120 bindet, das von HIV-1 infizierten Zellen getragen wird (SEQ ID NO: 12). Dieses Fusionsprotein und Methoden, um Fusionsproteine zu gewnnen und zu testen, sind nachfolgend und in den Beispielen 3, 4 und 5 beschrieben.
Die bereitgestellte Nucleinsäure, welche für das PA Fusionsprotein codiert, kann jede Ligandendomäne, die spezifisch einen zellulären Empfänger bindet, z.B. einen Rezeptor der Zelloberfläche, ein auf der Zelloberfläche exprimiertes Antigen etc., codieren. Zum Beispiel kann die Nucleinsäure eine Ligandendomäne codieren, die spezifisch an ein HIV-Protein bindet, das auf der Oberfläche einer HIV-infizierten Zelle exprimiert wird. Solch eine Ligandendomäne kann ein einzelsträngiger Antikörper sein, der als ein Fusionsprotein exprimiert wird, wie oben und in den Beispielen 3, 4 und 5 dargestellt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß die Nucleinsäure für eine Ligandendomäne codiert, die ein Wachstumsfaktor darstellt, wie in Beispiel 3 wiedergegeben.
Obgleich die PA codierende Sequenz der das erfindungsgemäße PA-Fusionsprotein codierenden Nucleinsäure nur die für die Translokationsdomäne und die LF-Bindungsdomäne des nativen PA-Proteins codierende Nucleotidsequenz einzuschließen braucht, kann die Nucleinsäure außerdem auch die den Rest des nativen PA Proteins codierende Nucleotidsequenz umfassen. Wie in den Beispielen dargestellt, können alle zusätzlichen, nicht notwendigen Sequenzen, basierend auf Routineverfahren, untersucht werden, wie der Verminderung des Einflusses auf die Nucleinsäure, der Verminderung der Expression des Produktes in dem Wirt und jedem Effekt auf die Translokation/Aufnahme.

Proteine:

Proteine, die durch die erfindungsgemäße Nucleinsäure codiert werden, werden ebenfalls bereitgestellt.

LF-Fusionsproteine:

Nachfolgend werden durch Nucleinsäuren codierende LF-Fusionsproteine beschrieben, welche obig und in den Beispielen beschrieben wurden. Insbesondere Fusionen des LF-Gens mit Domänen II, Ib und III von PE können mit Hilfe von Rekombinationstechniken durchgeführt werden, um translationale Fusionen in korrektem Leseraster zu erzeugen. Rekombinierte Gene (z.B., SEQ ID NOs: 5, 7 und 9) wurden in Escherichia coli (E. coli) exprimiert, und die aufgereinigten Proteine wurden auf Aktivität an kultivierten Zellen getestet, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Bestimmte Fusionsproteine werden wirksam mit Hilfe des PA-Rezeptors in das Cytoplasma aufgenommen. Diese Beispiele zeigen, daß dieses System verwendet werden kann, um viele verschiedene Polypeptide zielgerichtet in bestimmte Empfängerzellen einzuschleusen.
Obwohl spezielle Beispiele für diese Proteine aufgezeigt wurden, kann durch die vorliegende Anleitung bezüglich der Herstellung von LF-Fusionsproteinen die Verwirklichung anderer Ausführungsformen, die andere aktivitätsinduzierende Domänen aufweisen, mit Hilfe von routinemäßigen Fertigkeiten erreicht werden.
Unter Einsatz von gängigen Methoden genetischer Manipulation kann eine Vielfalt von anderen aktivitätsinduzierenden Einheiten (z.B. Polypeptiden) als Fusionsprotein mit LF translatiert werden, welches nachfolgend von Zellen aufgenommen werden kann, wenn es zusammen mit PA- oder PA-Fusionsproteinen verabreicht wird. Fusionsproteine, die mit Hilfe dieser Technik erzeugt wurden, können durch die in den Beispielen erläuterten Methoden und verschiedene Routineverfahren auf die gewünschte Aktivität überprüft werden. Ausgehend von den hier vorliegenden Unterlagen liefert die vorliegende Erfindung ein hochwirksames System, um eine aktivitätsinduzierende Einheit in eine Empfängerzelle zu liefern.

PA-Fusionsproteine:

Die vorliegende Erfindung betrifft durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren codierende PA-Fusionsproteine. Spezifische Fusionen von PA mit einzelsträngigen Antikörpern und CD4 werden bereitgestellt.
Unter Einsatz von gängigen Methoden genetischer Manipulation kann eine Vielfalt von anderen Ligandendomänen (z.B. Polypeptiden) als Fusionsprotein mit PA translatiert werden, welches nachfolgend spezifische Zielzellen binden und die Aufnahme von LF oder LF-Fusionsproteinen erleichtern kann. Ausgehend von den hier vorliegenden Unterlagen liefert die vorliegende Erfindung ein hochwirksames System, um eine aktivitätsinduzierende Einheit in eine spezifische Art oder Klasse von Empfängerzellen zu liefern.
Obwohl spezielle Beispiele für diese Proteine aufgezeigt wurden, kann durch die vorliegende Anleitung bezüglich der Herstellung von PA-Fusionsproteinen die Verwirklichung anderer Ausführungsformen, die andere Ligandendomänen aufweisen, mit Hilfe von routinemäßigen Fertigkeiten erreicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine können unter Verwendung der in den Beispielen erläuterten Methoden und verschiedener Routineverfahren auf die gewünschte Spezifität und Aktivität überprüft werden. In jedem Fall müssen die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren codierenden PA-Fusionsproteine in der Lage sein, die ausgewählte Zielzelle spezifisch zu binden, LF oder LF-Fusionen oder -Konjugate zu binden und die LF-Fusion/Konjugation aufzunehmen.

Konjugate:

Eine Zusammensetzung wird bereitgestellt, welche die PA-Bindungsdomäne des nativen LF-Proteins, chemisch gebunden an eine aktivitätsinduzierende Einheit, umfaßt. Solch eine aktivitätsinduzierende Einheit ist eine Aktivität, die auf nativem LF nicht vorhanden ist. Die Zusammensetzung kann eine aktivitätsinduzierende Einheit enthalten, welche beispielsweise ein Polypeptid, ein radioaktives Isotop, eine antisense-Nucleinsäure oder eine ein erwünschtes Gen produkt codierende Nucleinsäure ist.
Unter Einsatz gängiger chemischer Manipulationsmethoden können viele andere Einheiten (z.B. Polypeptide, Nucleinsäuren, radioktive Isotope etc.) chemisch an LF angeheftet und in Zellen aufgenommen werden und ihre Aktivität exprimieren, wenn sie zusammen mit PA oder PA-Fusionsproteinen verabreicht werden. Die Verbindungen können auf die gewünschte Aktivität und Aufnahme, unter Verwendung der in den Beispielen erläuterten Methoden, getestet werden. Zum Beispiel liefert die vorliegende Erfindung ein LF-Protein-Fragment 1- 254 (LF1-254) mit einem Cysteinrest, der an das Ende von LF1-254 (LF1- 254Cys) angefügt wird. Da keine weiteren Cysteine in LF vorhanden sind, stellt dieses einzige Cystein einen passenden Anheftungspunkt dar, über den chemische Konjugation anderer Proteine oder nicht-Protein-Einheiten erfolgen kann.

Vektoren und Wirte:

Ein Vektor, der die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren enthält, wird ebenfalls bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen Vektoren können in einem Wirt vorhanden sein, der fähig ist, das von der Nucleinsäure codierte Protein zu exprimieren.
Um die erfindungsgemäßen Proteine und Konjugate zu exprimieren, können die Nucleinsäuren mit einem Signal, das die Genexpression steuert, operativ verbunden werden. Eine Nucleinsäure ist "operativ verbunden", wenn sie so plaziert ist, daß sie in einer funktionalen Wechselwirkung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz steht. Zum Beispiel sind ein Promotor oder eine Verstärkersequenz operativ verbunden mit einer codierenden Sequenz, wenn sie einen Effekt auf die Transkription der Sequenz haben. Im allgemeinen bedeutet operativ verbunden, daß die verbundenen Nucleinsäuresequenzen aneinander angrenzen und, wenn es notwendig ist, zwei für Proteine codierende Regionen zu verbinden, im gleichen Leseraster aneinander angrenzen.
Das Gen, welches ein erfindungsgemäßes Protein codiert, kann in einen "Expressionsvektor", "Klonierungsvektor" oder "Vektor" eingefügt werden, wobei diese Bezeichnungen in der Regel Plasmide oder andere Nucleinsäuremoleküle bezeichnen, die fähig sind, sich in der gewählten Wirtszelle zu replizieren. Expressionsvektoren können sich autonom replizieren, oder sie können sich replizieren, indem sie in das Genom der Wirtszelle eingefügt sind. Vektoren, die sich autonom replizieren, haben einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), die in der gewählten Wirtszelle funktional ist. Häufig ist es wünschenswert, daß ein Vektor in mehr als einer Wirtszelle verwendet werden kann, z.B. in E. coli zur Klonierung und Konstruktion und in einer Säugetierzelle zur Expression.
Der jeweilige Vektor, der für den Transport der genetischen Information in die Zelle verwendet wird, ist auch nicht von entscheidender Bedeutung. Jeder der üblichen Vektoren, die für die Expression von rekombinanten Proteinen in prokariontischen oder eukariontischen Zellen Anwendung finden, kann benutzt werden.
Expressionsvektoren besitzen typischerweise eine Transkriptionseinheit oder Expressionskassette, die alle Elemente enthält, die für die Expression der DNA, welche ein Protein aus der Erfindung codiert, in der Wirtszelle benötigt werden. Eine typische Expressionskassette enthält einen Promotor, der operativ mit der DNA-Sequenz, welche ein Protein codiert, verbunden ist und Signale, die für eine wirksame Polyadenylierung des Transkriptes benötigt werden. Der Promotor ist in seiner natürlichen Anordnung vorzugsweise in etwa der gleichen Entfernung von der heterologen Transkriptions-Startstelle gelegen wie von der Transkriptions-Startstelle. Die Erfahrung hat jedoch gezeigt, daß eine gewisse Variation in dieser Entfernung ohne einen Verlust der Funktion des Promotors möglich ist.
Die DNA-Sequenz, die ein Protein aus der Erfindung codiert, kann mit einer abtrennbaren Signalpeptid-Sequenz verknüpft werden, um die Sekretion des codierten Proteins aus der transformierten Zelle zu erreichen. Zusätzliche Ele mente des Vektors können zum Beispiel selektierbare Marker oder Verstärkersequenzen umfassen. Selektierbare Marker, z.B. Tetrazyklin-Resistenz oder Hygromycin-Resistenz, könen die Detektion und/oder Selektion der Zellen erlauben, die mit den gewürichten DNA-Sequenzen transformiert sind (siehe z.B. U.S. Patent 4,704,362).
Verstärker-Elemente können die Transkription von verbundenen homologen oder heterologen Promotoren bis zu 1.000-fach verstärken. Viele Verstärker- Elemente, die von Viren abgeleitet sind, haben ein breites Wirtsspektrum und sind in einer Vielzahl von Geweben aktiv. Zum Beispiel ist die Verstärkersequenz der frühen SV40-Gene für viele Zelltypen geeignet. Andere VerstärkersequenzlPromotor-Kombinationen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, beinhalten jene, die von Polyoma-Virus, Zytomegalovirus aus Mensch oder Maus, der endständigen Sequenzwiederholung von verschiedenen Retroviren, wie dem Maus-Leukämie-Virus, Maus- oder Rous-Sarkom-Virus und HIV, abgeleitet sind. Siehe, Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, N.Y. 1983, welches hierin als Verweis enthalten ist.
Zusätzlich zu einer Promotorsequenz sollte die Expressionskassette auch ein Transkriptions-Stop-Element nach dem Strukturgen enthalten, um einen wirksamen Abbruch zu gewährleisten. Das Stop-Element kann aus demselben Gen, aus dem die Promotor-Sequenz kommt, stammen oder kann aus einem unterschiedlichen Gen entnommen werden.
Um die Translation der durch das Strukturgen codierten mRNA in Säugetierzellen weiter zu verbessern, ist es üblich, auch noch Polyadenylierungssequenzen in das Vektor-Konstrukt einzufügen. Zwei bestimmte Sequenzelemente werden für eine genaue und wirksame Polyadenylierung benötigt: GU- oder Ureiche Sequenzen, die nach der Polyadenylierungsstelle angeordnet sind, und eine hoch konservierte Sequenz von sechs Nucleotiden, AAUAAA, 11-30 Nucleotide davor gelegen. Stop- und Polyadenylierungs-Signale, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, beinhalten jene, die von SV40 abgeleitet sind, oder eine teilweise genomische Kopie eines Gens, das bereits auf dem Expressionsvektor vorhanden ist.
Die Vektoren, die das Gen enthalten, welches das erfindungsgemäße Protein codiert, werden zur Expression in Wirtszellen transformiert. "Transformation" bezeichnet das Einschleusen des Vektors, der die gewünschten Nucleinsäuren enthält, direkt in Wirtszeilen mit Hüfe weithin bekannter Techniken. Die jeweilige Methode, die für das Einschleusen des genetischen Materials in die Wirtszelle zur Expression des Proteins verwendet wird, ist nicht von entscheidender Bedeutung. Jedes der weithin bekannten Verfahren zum Einschleusen fremder Nucleotidsequenzen in Wirtszellen kann benutzt werden. Es ist lediglich erforderlich, daß das jeweilig benutzte Verfahren dazu imstande ist, mindestens ein Gen, welches zur Expression des Gens fähig ist, erfolgreich in die Wirtszelle einzuschleusen.
Transformationsmethoden, die sich abhängig vom Typ der Wirtszelle unterscheiden, umfassen Elektroporation, Transfektion unter Verwendung von Calciumchlorid, Rubidiumchlorid, Calciumphosphat, DEAE-Dextran oder anderer Substanzen, Beschuß mit Mikroprojektilen, Lipofektion, Infektion (wobei der Vektor eine infektiöse Substanz darstellt) und andere Verfahren. Siehe, im allgemeinen, Sambrook et al., (1989), supra, und Current Prolocols in Molecular Biology, supra. Ein Verweis auf die Zellen, in die oben beschriebene Nucleinsäuren eingeschleust wurden, schließt auch die Nachkommen solcher Zellen ein.
Es gibt zahlreiche bekannte prokariontische Expressionssysteme, die für die Expression des Antigens verwendbar sind. Gewöhnlich wird E. coli eingesetzt sowie andere Mikroorganismen, die als Wirte geeignet sind, einschließlich bacilli, wie Bacillus subtilis, sowie andere Enterobakterien, etwa Salmonella, Serratia und verschiedene Pseudomonas Arten. Man kann Expressionsvektoren zur Verwendung in diesen prokariontischen Wirten herstellen; die Vektoren werden typischerweise Sequenzen zur Kontrolle der Expression enthalten, die mit der Wirtszelle vereinbar sind (z.B. einen Replikationsursprung, einen Pro motor). Jeder unter einer Vielzahl weithin bekannter Promotoren kann verwendet werden, wie das Lactose-Promotor-System, ein Tryptophan (Trp)-Promotor- System, ein beta-Lactamase-Promotor-System oder ein Promotor des Bakteriophagen Lambda. Die Promotoren werden typischerweise die Expression steuern, wahlweise mit einer Operator-Sequenz, und haben Sequenzen zur Bindung von Ribosomen, zum Beispiel zur Einleitung und Vollendung der Transkription und Translation. Falls notwendig, kann ein Methionin am Amino-Ende bereitgestellt werden durch Einbau eines Met Codons 5' und in korrektem Leseraster mit den Codonen für das Protein. Auch das Carboxy-Ende des Proteins kann durch Standard-Oligonucieotid-Mutagenesetechniken entfernt werden, falls dies gewünscht ist.
Es können bakterielle Wirtszellen gewählt werden, die so verändert wurden, daß sie verminderte Mengen von Proteasen enthalten oder gar frei von ihnen sind, so daß produzierte Proteine nicht abgebaut werden. Für Bacillus-Expressionssysteme, bei denen die Proteine in das Kulturmedium ausgeschieden werden, sind Stämme verfügbar, denen sekretierte Proteasen fehlen.
Säugetier-Zelllinien können auch als Wirtszellen für die Expression von erfindungsgemäßen Polypeptiden benutzt werden. Die Vermehrung von Säugetierzellen in Kulturen ist per se gut bekannt. Siehe Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, ed. (1973). Wirts-Zelllinien können unter anderen auch solche Organismen, wie Bakterien (z.B. E.coli oder B.subtilis), Hefe, filamentöse Pilze, Pflanzenzellen oder Insektenzellen, einschließen.

Reinigung von Protein:

Nachdem unter Einsatz von Standard-Transfektions- oder Transformationsmethoden prokariontische, Säugetier-, Hefe- oder Insekten-Zelllinien hergestellt worden sind, die große Mengen des erfindungsgemäßen Proteins exprimieren, wird das Protein mit Hilfe von Standardtechniken, die für dieses Arbeitsgebiet bekannt sind, gereinigt. Siehe, z.B., Colley et al. (1989), J. Biol. Chem., 64: 17619-17622; und Methods in Enzymology, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ed. Vol. 182 (1990).
Standardverfahren aus diesem Arbeitsgebiet, die zur Reinigung erfindungsgemäßer Proteine eingesetzt werden können, beinhalten die Fällung mit Ammoniumsulfat, Affinitäts- und fraktionierte Säulenchromatographie, Gel-Elektrophorese und dergleichen. Siehe, im allgemeinen, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, New York (1982), und U.S. Patent 4,512,922, welche allgemeine Verfahren zur Reinigung von Protein aus mit rekombinanten Techniken erzeugten Bakterien offenbaren.
Wenn die Expressionssysteme bewirken, daß ein erfindungsgemäßes Protein aus den Zellen ausgeschieden wird, werden die rekombinanten Zellen angezogen, das Protein wird exprimiert, und danach wird das Kulturmedium geerntet, um es zur Reinigung des sekretierten Proteins zu verwenden. Das Medium wird typischerweise durch Zentrifugieren oder Filtern von Zellen oder Zell-Bruchstücken befreit, und die Proteine können durch Adsorption an jedes geeignete Material, wie zum Beispiel CDP-Sepharose, Asialoprothrombin-Sepharose 4B oder Q Sepharose, oder durch den Einsatz von fraktionierten Fällungen mit Ammoniumsulfat, Fällungen mit Polyethylenglykol oder durch Ultrazentrifugation, konzentriert werden. Andere bekannte Methoden sind gleichermaßen geeignet. Die weitere Reinigung der Proteine kann durch Standardtechniken vollendet werden, zum Beispiel Affinitäts-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Chromatographie nach Größe oder durch andere Proteinreinigungs-Techniken, die verwendet werden können, um Homogenität zu erhalten. Die gereinigten Proteine werden dann verwendet, um pharmazeutische Zusammensetzungen zu erzeugen, wie nachfolgend beschrieben wird.
Eine andere Möglichkeit ist es, Vektoren einzusetzen, die das Protein in der Zelle exprimieren, statt das Protein aus den Zellen auszuscheiden. In diesem Fall werden die Zellen geerntet, aufgebrochen, und das Protein wird aus dem Zellextrakt gereinigt, z.B. mit Hilfe von Standardtechniken. Wenn die Zelllinien eine Zellwand besitzen, dann könnte eine anfängliche Extraktion in einem Puffer mit geringem Salzgehalt ermöglichen, das Protein zusammen mit der Zellwand-Fraktion im Bodensatz zu erhalten. Das Protein kann von der Zellwand durch hohe Salzkonzentrationen und Dialyse eluiert werden. Wenn das Protein in der Zelllinie glykosyliert wird, kann das Glykoprotein möglicherweise durch den Einsatz einer Con A-Säule besser gereinigt werden. Anionenaustausch-Säulen (MonoQ, Pharmacia) und Gelfiltrations-Säulen können zur weiteren Reinigung des Proteins eingesetzt werden. Eine hochreine Fraktion kann durch präparative Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen auf Kosten des Verlustes der Aktivität erzielt werden.
Protein-Analoga können in vielfachen Konformationen erzeugt werden, welche unter nicht-reduzierenden Chromatographie-Bedingungen nachweisbar sind. Die Beseitigung dieser Formen, die eine niedrige spezifische Aktivität aufweisen, ist wünschenswert und wird durch unterschiedliche Chromatographietechniken, die Anionenaustausch- oder Größenausschluß-Chromatographie einschließt, erzielt.
Rekombinante Analoga können durch Dialyse unter Druck und Pufferwechsel direkt zu flüchtigen Puffersubstanzen (z.B. N-Ethylmorpholin (NEM), Ammoniumbicarbonat, Ammoniumacetat und Pyridinacetat) konzentriert werden. Zusätzlich können Proben aus solchen flüchtigen Puffern direkt gefriergetrocknet werden, wobei ein stabiles Proteinpulver resultiert, das frei von Salzen und Reinigungs-Substanzen ist. Weiterhin können gefriergetrocknete Proben von rekombinanten Analoga vor Verwendung zur Infusion in entsprechend verträglichen Puffersubstanzen (z.B. mit Phosphat gepufferte Salzlösung) sehr gut wieder gelöst werden. Andere geeignete Puffersubstanzen können Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfatacetat, Benzoat, Malat, Citrat, Glycin, Glutamat und Aspartat beinhalten.

Spezifische Ausführungsformen:

Toxine, die so verändert wurden, daß sie Erkennungsstellen intrazellulärer Pathogen-Proteasen enthalten:
Nachfolgend wird die Tatsache beschrieben, daß PA und andere Toxine proteolytisch gespalten werden müssen, um ihre Aktivität zu erlangen, zusammen mit der Tatsache, daß einige Zellen, die mit einem intrazellulären Pathogen infiziert sind, eine aktive Protease besitzen, die eine vergleichsweise enge Substratspezifität aufweist (zum Beispiel HIV-infizierte Zellen). Die Erkennungsstelle der Protease, die im nativen Toxin gefunden wird, ist gegen eine Erkennungsstelle, die spezifisch für eine intrazelluläre Protease ist, ausgetauscht. Daher spaltet die Protease in Zellen, die durch ein intrazelluläres Pathogen infiziert sind, das veränderte Toxin, welches dadurch aktiv wird, und die Zelle abtötet.
Intrazelluläre Pathogene, die zielgerichtet durch die erfindungsgemäßen Produkte und Verfahren erreicht werden können, beinhalten alle Pathogene, die eine Protease mit einer spezifischen Erkennungsstelle produzieren. Solche Pathogene können Prokarionten (einschließlich Rickettsia, Mycobacterium tubercolosis etc.), Mycoplasmen, eukariontische Pathogene (z.B. pathogene Pilze etc.) und Viren umfassen. Ein Beispiel für ein intrazelluläres Pathogen, das eine spezifische Protease erzeugt, ist menschliches Immundefizienz-Virus (HIV). Die HIV-1-Protease spaltet virale Polyproteine, um einsatzfähige Strukturproteine sowie die reverse Transkriptase und die Protease selbst zu bilden. Die Replikation von HIV-1 und das Prinzip der viralen Infektion sind vollständig von der Wirkung der HIV-1-Protease abhängig.
Eine spezifische Erkennungsstelle intrazellulärer Pathogen-Proteasen kann in jedes natürliche oder rekombinante Toxin eingeführt werden, für das eine proteolytische Spaltung zur Toxizität benötigt wird. Zum Beispiel kann man die Anthrax-PA-Trypsin-Spaltungsstelle (R164-167) von PA mit der HIV-1- Protease-Erkennungsstelle ersetzen. Eine andere Möglichkeit ist der Ersatz der Diphtheria-Toxin-Disulfid-Schleifen-Sequenz (siehe O'Hare, et al. FEBS 273 (1, 2): 200-204 (Oct. 1990)) mit der HIV-1-Protease-Spaltungsstelle, um ein Toxin zu erhalten, das für HIV-1 infizierte Zellen spezifisch ist. In ähnlicher Weise kann die gewöhnliche Sequenz des Diphtheria-Toxins der Reste 191-194 (Williams et al., J. Biol. Chem., 265(33): 20673-20677 (1990)) durch die spezi fische Erkennungsstelle einer intrazellulären Pathogen-Protease, wie der HIV- 1-Protease-Spaltungsstelle, ersetzt werden. Das DAB486-IL-2 Fusions-Toxin von Williams und das verbesserte DAB389-IL-2-Toxin wirken auf HIV-1 infizierte Zellen, die hohe Mengen des IL-2-Rezeptors exprimieren (Williams, J. Biol. Chem., 265 : 20673). Das Hinzufügen der HIV-1-Protease-Spaltungsstelle würde einen weiter erhöhten Spezifitätsgrad liefern. In ähnlicher Weise benötigt das Botulinum-Toxin C2-Toxin wie das Anthrax-Toxin eine Spaltung innerhalb der nativen Protein-Untereinheit (siehe Ohishi und Yanagimoto, lnfection and Immunity, 60(11): 4648-4655 (Nov. 1992)); dadurch kann es ebenfalls spezifisch für Zellen gemacht werden, die mit einem intrazellulären Pathogen wie HIV-1 infiziert sind.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Protease-Erkennungsstelle von PA durch die Stelle, die von der HIV-1-Protease erkannt wird, ersetzt. Die Protease der Zelle, welche PA spaltet, benötigt unbedingt die Anwesenheit der Reste Arg 164 und Arg 167, da der Austausch eines dieser Reste ein PA-Molekül ergibt, welches nach Bindung an die Zelloberfläche nicht gespalten wird. Jedoch können alle PA-Austausch-Mutanten, die mindestens einen Arg- oder Lsy-Rest innerhalb der Reste 164-167 beibehalten, durch Behandlung mit Trypsin aktiviert werden. Da die PA63-Fragmente, die durch tryptischen Verdau entstehen, eine Vielzahl verschiedener Reste am Amino-Ende besitzen, ist es offensichtlich, daß eine bestimmte Identität der endständigen Reste nicht zwingend ist. Klimpel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89 : 10277-10281 (1992).
Der Austausch der Reste 164-167 von PA gegen Reste, welche die HIV-1- Protease-Erkennungsstelle abbilden, kann von außen zugefügtes PA an Zellen inaktivieren, die nicht die HIV-1-Protease besitzen. Die Zellen, die jedoch die HIV-1-Protease exprimieren (z.B. Zellen, die mit HIV-1 infiziert sind oder Zellen, die so verändert wurden, daß sie die Protease produzieren), würden spalten und dadurch das mutierte PA aktivieren. Die aktivierten PA-Proteine können dann von außen zugefügte, zellgiftige Fusionsproteine binden und aufnehmen, etwa solche wie LF-PE.
Auf der Grundlage ausgiebiger Untersuchungen über die Substratspezifität der Protease wurden mehrere PA-Varianten entworfen und hergestellt, die mit der Erfindung in Verbindung stehen. Diese sind untenstehend aufgeführt, wobei die Reste, zwischen denen die Spaltung stattfand, unterstrichen sind. PA-Proteine die so verändert wurden, daß 8164-167 durch eine von der HIV-1-Protease erkannte Aminosäuresequenz ersetzt wurde, sind als "PAHIV" bezeichnet.
PAHIV#1 QVSQNYPIVQNI
PAHIV#2 NTATIMMQRGNF
PAHIV#3 TVSFNFPQITLW
PAHIV#4 GGSAFNFPIVMGG
Die veränderten Proteine PAHIV#(1-4) wurden richtig von der HIV-1-Protease gespalten.
In Tabelle 1 sind die Aminosäuren und ihre entsprechenden Abkürzungen und Symbole wiedergegeben. Tabelle 1
Vorzugsweise werden die Mutationen an 8164-167 von PA als Kassetten-Mutagenesen ausgeführt, obgleich andere Methoden durchführbar sind, wie nachfol gend diskutiert wird. Insgesamt werden drei DNA-Stücke miteinander verbunden. Das erste Stück besitzt Vektorsequenzen und codiert die "vordere Hälfte" (5'-Ende des Gens) des PA-Proteins, das zweite ist ein kurzes DNA-Stück (eine Kassette) und codiert ein kleines Mittelstück des PA-Proteins, und das dritte codiert die "hintere Hälfte" (3'-Ende des Gens) von PA. Die Kassette enthält Codone für die Aminosäuren, die benötigt werden, um die Spaltungsstelle für die intrazelluiäre Pathogen-Protease zu vervollständigen. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Mutanten in dem Plasmid pYS5 herzustellen, obgleich auch andere Plasmide hätten eingesetzt werden können.
Als andere Möglichkeit können die Mutationen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und anderer Verfahren ausgeführt werden, wie nachfolgend diskutiert wird. PCR verdoppelt ein Teilstück der DNA viele Male, was eine Vervielfältigung dieses Teilstückes zum Ergebnis hat. Die Reaktion erzeugt genügend DNA des Teilstückes, so daß es mit Restriktionsenzymen modifiziert und kloniert werden kann. Während der Reaktion wird eine synthetische Oligonucleotidsequenz (Primer) benutzt, um die Verdopplung des anvisierten DNA Teilstückes zu starten. Ein beliebiger synthetischer Primer kann entworfen werden, um neue DNA-Sequenzen in das DNA-Molekül einzuführen oder um vorhandene DNA-Sequenzen zu verändern.
Veränderung der Toxine zur Erweiterung oder Veränderung der Spezifität gegenüber Zielzellen:
Hier werden Substanzen und Verfahren beschrieben, die zur Erweiterung oder zum Wechsel des Spektrums von Zelltypen, gegen die ein Toxin wirksam ist, führen. Zum Beispiel besitzt das Letal-Anthrax-Toxin, PA-LF, akute Toxizität gegenüber Maus-Makrophagen-Zellen, offensichtlich auf Grund der spezifischen Expression eines Zieles für die katalytische Aktivität von LF in diesen Zellen. Andere Zelltypen werden durch LF nicht angegriffen. In der vorliegenden Erfindung wird LF jedoch eingesetzt, um Zellgifte mit einer breiten Spezifität gegenüber Zellen herzustellen.
In einer eingehenden Untersuchung der Domänen von LF wurden die 254 Aminosäuren des Amino-Endes als die Region, die an PA63 bindet, identifiziert. Fusionsproteine, welche die Reste 1-254 von LF und die ADP-Ribosylierungsdomäne von Pseudomonas Exotoxin A (PE) enthalten, wurden in Übereinstimmung mit der Erfindung entworfen. Diese Fusionsproteine sind gegenüber kultivierten Zellen hochgiftig, aber nur wenn gleichzeitig PA verabreicht wird.
Synthese von Genen, die Proteine aus der Erfindung codieren:
Gene, die Toxine mit veränderten Protease-Erkennungsstellen codieren, oder Fusionsproteine, die eine Bindungsdomäne des einen Proteins und eine aktivitätsinduzierende Domäne von einem zweiten Protein besitzen, können mit bekannten Verfahren synthetisiert werden. Als ein Beispiel für anwendbare Techniken ist die Synthese von Genen, welche die veränderten Anthrax-Toxin-Untereinheiten LF und PA codieren, nachfolgend beschrieben.
Die DNA-Sequenzen für natives PA und LF sind bekannt. Die Kenntnis dieser DNA-Sequenzen erleichtert die Herstellung von Genen und kann als Anfangspunkt für die Konstruktion von DNA-Molekülen, die Mutanten von PA und/oder LF codieren, verwendet werden. Die Protein-Mutanten aus der Erfindung sind löslich und enthalten interne Aminosäuren, die ersetzt wurden. Weiterhin wurden diese Mutanten gereinigt von oder ausgeschieden aus Zellen, die mit Plasmiden transfiziert oder transformiert worden sind, welche die Gene, die diese Proteine codieren, enthalten. Die Verfahren zur Herstellung von Veränderungen, wie der Ersatz von Aminosäuren, die Wegnahme oder das Hinzufügen von Signalsequenzen an klonierte Gene, sind bekannt. Hier speziell angewendete Methoden sind nachfolgend beschrieben.
Die Gene für PA oder LF können durch mehrere Verfahren gewonnen werden. Genomische und cDNA-Bibliotheken sind käuflich erhältlich. Oligonucleotid-Sonden, die spezifisch für das gewünschte Gen sind, können mit Hilfe der bekannten Gen-Sequenz hergestellt werden. Verfahren zur Durchmusterung genomischer und von cDNA-Bibliotheken mit Oligonucleotid-Sonden sind be kannt. Ein genomischer oder cDNA-Klon kann das notwendige Ausgangsmaterial liefern, um ein Expressions-Plasmid für das gewünschte Protein mit Hilfe bekannter Techniken herzustellen.
Ein DNA-Fragment, das ein Protein codiert, kann mit Hilfe von Schnittstellen für Restriktionsendonucleasen, welche in benachbarten Bereichen oder innerhalb des Gens identifiziert wurden, kloniert werden. Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d. ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), nachfolgend mit "Sambrook" bezeichnet.
Das gewünschte Protein codierende Gene können, ausgehend von Wildtyp-Genen, konstruiert werden, indem das Gen, welches das Protein in voller Länge codiert, verwendet wird. In einem Verfahren zur Herstellung von Wildtyp-Genen für eine nachfolgende Mutation wird die Verwendung synthetischer Oligonucleotid-Sequenzen (Primer) mit einer Verlängerung durch eine Polymerase auf mRNA oder DNA als Vorlage kombiniert. Diese PCR-Technik vervielfältigt die gewünschte Nucleotid-Sequenz. In den U.S. Patenten 4,683,195 und 4,683,202 ist dieses Verfahren beschrieben. Schnittstellen für Restriktionsendonucleasen können in die Primer eingebaut werden. Die mit Hilfe von PCR vervielfältigten Gene können aus Agarose-Gelen gereinigt werden und in einen geeigneten Vektor kloniert werden. In die natürliche Gen-Sequenz können Änderungen mit Hilfe von Techniken eingeführt werden, wie in vitro-Mutagenese und PCR, wobei Primer, die zum Einbau geeigneter Mutationen entworfen wurden, verwendet werden.
Die hier beschriebenen Proteine können intrazellulär exprimiert und gereinigt werden oder können nach ihrer Expression in Zellkulturen ausgeschieden werden. Wenn es erwünscht ist, kann die Sekretion erreicht werden, indem die native Signalsequenz des Gens verwendet wird. Als andere Möglichkeit können Gene, die erfindungsgemäße Proteine codieren, in korrektem Leseraster mit einer Signalsequenz, die nicht der des nativen Gens entspricht, verknüpft werden. Obwohl die rekombinanten erfindungsgemäßen PA-Proteine typischerweise in B. anthracis exprimiert wurden, können sie in anderen Wirten, solchen wie E. coli, exprimiert werden.
Die erfindungsgemäßen Proteine sind durch ihre Aminosäure-Sequenz und durch ihre Nucleotid-Sequenz beschrieben; dies ist so zu verstehen, daß die Proteine auch ihre biologisch gleichwertigen Formen in der Weise enthalten, daß diese Erfindung geringe oder unbeabsichtigte Austausche und Verluste von Aminosäuren, die wesentliche biologische Eigenschaften der Analoga nur gering beeinflussen, einschließt. Unter manchen Umständen könnte es nützlich sein, seltene oder nicht natürlich vorkommende Aminosäuren gegen eine oder mehrere der zwanzig am häufigsten vorkommenden Aminosäuren, aufgelistet in Tabelle 1, auszutauschen. Beispiele schließen das Ornithin sowie acetylierte oder hydroxylierte Formen ein. Siehe, im allgemeinen Stryer, L., Biochemistry, 3d ed. (1988).
Andere Möglichkeiten von Nucleotid-Sequenzen können verwendet werden, um Analoga in verschiedenen Wirtszellen zu exprimieren. Weiterhin können aufgrund der Degeneration des genetischen Codes gleichwertige Codone, welche die gleiche Polypeptid-Sequenz codieren, ausgetauscht werden. Zusätzlich sind Sequenzen (Nucleotide und Aminosäuren), die in der Substanz zu denen der Erfindung identisch sind, ebenfalls eingeschlossen. Unter dem Begriff identisch in diesem Sinne ist die gleiche Identität (von Basenpaar oder Aminosäure) und Reihenfolge (von Basenpaaren oder Aminosäuren) zu verstehen. Wesentliche Identität schließt Dinge ein, die zu mehr als 80% identisch sind. Vorzugsweise bezieht sich wesentliche Identität auf mehr als 90% Identität. Inbesondere bezieht sich auf mehr als 95% Identität.

Mutagenese:

Mutagenese kann durchgeführt werden, um Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen zu erhalten, die spezifische Bereiche der oben beschriebenen Gene verändern. Punktmutationen können durch eine Vielzahl von Verfahren eingeführt werden, die chemische Mutagenese, Methoden zur mutagenisierten Wiedergabe und Stellen-spezifische Mutagenese-Techniken mit Hilfe von syntheti schen Oligonucleotiden beinhalten.
Kassetten-Mutagenese-Techniken werden üblicherweise angewendet, um Punktmutationen in die spezifischen Bereiche der PA- oder LF-Gene einzuführen. Ein doppelsträngiger Oligonucleotid-Bereich, der Änderungen in der spezifischen Sequenz des Gens enthält, wird hergestellt. Dieser Oligonucleotid-Bereich der Kassette kann hergestellt werden, indem ein Oligonucleotid mit der geänderten Sequenz der Reste des PA- oder LF-Gens synthetisiert wird, an einen Primer angelagert und durch das große Fragment der DNA-Polymerase verlängert und mit BstBI zurecht geschnitten wird. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird in das BamHi/BstBI-Fragment von pYS5 und das PpuMI-BamHI-Fragment von pYS6 eingefügt, um die vollständige rekombinante DNA zu schaffen. Zur Herstellung des doppelsträngigen Oligonucleotids und anderer rekombinanter DNA-Vektoren können andere Verfahren eingesetzt werden.
Chemische Mutagenese kann unter Einsatz des M13 Vektor-Systems durchgeführt werden. Ein Einzelstrang rekombinanter M13-DNA, der rekombinante PA- oder LF-DNA enthält, wird hergestellt. Ein anderer rekombinanter M13, der die gleiche rekombinante DNA, jedoch in doppelsträngiger Form, enthält, wird eingesetzt, um eine Deletion in der anvisierten Region des Gens zu erzeugen. Dieser doppelsträngige rekombinante M13 wird mit einer Endonuclease zu einem linearen Molekül geschnitten, denaturiert und an den einzelsträngigen rekombinanten M13 angelagert, was zu einer einzelsträngigen Lücke in der anvisierten Region der PA- oder LF-DNA führt.
Diese rekombinante M13-DNA mit einer Lücke wird dann mit einer Substanz wie Natriumbisulfit behandelt, um die Cytosin-Reste des einzelsträngigen Bereiches zu Uracil zu deaminieren. Dies ergibt begrenzte und spezifische Mutationen in der einzelsträngigen DNA-Region. Schließlich wird die Lücke in der DNA durch Behandlung mit DNA-Polymerase aufgefüllt, was den Ersatz eines G-C- Basenpaares in dem unveränderten Teil des Gens durch ein U-A-Basenpaar zum Ergebnis hat. Nach Replikation enthält das neue rekombinante Gen T-A- Basenpaare, die Punktmutationen zu der ursprünglichen Sequenz darstellen. Andere Formen der chemischen Mutagenese sind ebenfalls verfügbar. Mutagenisierte Wiedergabe der rekombinanten PA- oder LF-DNA kann unter Einsatz mehrerer Methoden durchgeführt werden. Zum Beispiel wird in einem DNA-Bereich eine einzelsträngige Lücke erzeugt, wie zuvor beschrieben wurde. Diese Region wird mit DNA-Polymerase I und einer oder mehrerer mutagener Analoga von normalen Ribonucleosid-Triphosphaten behandelt. Während des Kopierens der einzelsträngigen Region mit der DNA-Polymerase wird die einzelsträngige Lücke des Bereiches durch Ersatz mit den mutagenen Analoga aufgefüllt. Transfektion und Replikation der sich ergebenden DNA hat die Produktion von einigen veränderten rekombinanten DNAs für PA, LF oder EF zur Folge, die dann durch Klonierung selektiert werden können. Andere Methoden der mutagenisierten Wiedergabe können eingesetzt werden.
Punktmutationen können in spezifische Bereiche der PA- oder LF-Gene eingeführt werden, indem Verfahren zur Stellen-spezifischen Mutagenese unter Einsatz von synthetischen Oligonucleotiden eingesetzt werden. Das Kopieren der PA- oder LF-Gene durch PCR wird durchgeführt, indem spezifische Zielbereiche abdeckende Oligonucleotid-Primer verwendet werden, die Veränderungen in Bezug auf die Wildtyp-Sequenz in diesem Bereich enthalten. Das PA-Gen in einem pYS5-Vektor kann durch PCR mit Hilfe dieser Verfahren vervielfältigt werden, wobei die Mutationen an der Position 164-167 erzeugt werden. Vervielfältigung durch PCR kann ebenfalls verwendet werden, um Mutationen in den anvisierten Bereich des LF-Gens einzuführen.
Techniken mit synthetischen Oligonucleotiden zur Einführung von Punktmutationen können unter Einsatz von Heteroduplex-DNA durchgeführt werden. Ein M13-Vektor mit rekombinanter DNA, der das PA- oder LF-Gen enthält, wird hergestellt und ein einzelsträngiger rekombinanter M13 wird produziert. Ein einzelsträngiges Oligonucleotid, das eine Änderung in der spezifischen Zielsequenz für das PA- oder LF-Gen enthält, wird an den einzelsträngigen rekombinanten M13 angelagert, wobei eine nicht genau passende Sequenz entsteht. Behandlung mit DNA-Polymerase I ergibt einen doppelsträngigen rekombinan ten M13, der nicht passende Basenpaare in der anvisierten Region des Gens enthält. Dieser rekombinante M13 wird in einem Wirt wie B. anthracis oder E. coli repliziert, um beide, Wildtyp und mutierte, rekombinante M13 zu produzieren. Die mutierten rekombinanten M13 werden kloniert und isoliert. Andere Vektor-Systeme zur Mutagenese, die mit Beteiligung synthetische Nucleotide und Bildung einer Heteroduplex arbeiten, können zur Anwendung kommen.
Expression von Proteinen in prokariontischen Zellen:
Zusätzlich zur Verwendung von Klonierungstechniken in Bakterien wie Bacülus anthracis zur Vervielfältigung von klonierten Sequenzen, ist es möglicherweise wünschenswert, die Proteine in anderen Prokarionten zu exprimieren. Es ist möglich, ein funktionstüchtiges Protein aus E. coli zu gewinnen, das mit einem PA oder LF-Protein codierenden Expressionsplasmid transformiert ist. Am günstigsten ist es, wenn die mutierten erfindungsgemäßen PA-Proteine in B. anthracis und die LF-Fusionsproteine in E. coli exprimiert werden.
Verfahren zur Expression von klonierten Genen in Bakterien sind gut bekannt, siehe Sambrook. Um die Expression von einem klonierten Gen in einem prokariontischen System zu optimieren, können Expressionsvektoren konstruiert werden, die einen Promotor einschließen, der den Abbruch der mRNA-Transkription steuert. Die Einbeziehung von Selektions-Markern in DNA-Vektoren, die in Bakterien transformiert werden, ist nützlich. Beispiele solcher Marker beinhalten die Gene, welche Resistenzen gegen Ampicillin, Tetracyclin oder Chloramphenicol vermitteln.
Siehe Sambrook, bereits zitiert, für Details bezüglich Selektions-Markern und Promotoren zum Einsatz in Bakterien wie E. coli. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist pYS5 ein Vektor für die Subklonierung und Vervielfältigung von gewünschten Gen-Sequenzen, obwohl andere Vektoren verwendet werden könnten.
Bad//us anthracis-Stämme, die mutierte Proteine produzieren:
Zur Produktion des PA-Proteins werden B. anthracis-Stämme bevorzugt, die von pX01 und pX02 befreit wurden, da sie so nicht mehr virulent sind. Beispiele für solche Stämme sind UM23C1-1 und UM44-1C9, die von Curtis Thorne, Universität von Massachusetts, erhalten wurden. Ähnliche Stämme können durch Entfernung von Plasmiden erzeugt werden, wie von P. Mikesell et al., "Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bad/us anthracis", Infect. Immun., 39 : 371-376 (1983) beschrieben ist.
Siehe, im allgemeinen, die häufig verwiesene U.S. -Patentanmeldung mit der Anmelde-Nr. 08/042,745, welche am 5. April 1993 eingereicht wurde, hierin durch Verweis einbezogen.

Behandlungsmethoden:

Eine Methode, um eine gewünschte Aktivität zu einer Empfängerzelle zu bringen, wird nachfolgend beschrieben. Die Schritte dieser Methode beinhalten die Verabreichung (a) eines Proteins, das die Translokationsdomäne und die LF- Bindungsdomäne des nativen PA-Proteins und eine Ligandendomäne umfaßt, an die Zelle und (b) ein Produkt, umfassend die PA-Bindungsdomäne des nativen LF-Proteins und eine nicht-LF aktivitätsinduzierende Einheit, wobei das in Schritt (b) verabreichte Produkt in die Zelle aufgenommen wird und eine Aktivität innerhalb der Zelle entfaltet. Bei der Methode, einer Empfängerzelle Aktivität zuzuführen, kann von einer Ligandendomäne Gebrauch gemacht werden, welche die Rezeptor-Bindungs-Domäne des nativen PA-Proteins ist. Andere Ligandendomänen werden entsprechend ihrer Spezifität für einen bestimmten Zelltyp oder eine Klasse von Zellen ausgewählt. Die Spezifität der PA-Fusionsproteine für die anvisierte Zelle kann mit Hüfe von Standardtechniken bestimmt werden und auch wie in Beispielen 2 und 3 beschrieben ist.
Die Methode, einer Empfängerzelle Aktivität zuzuführen, kann von einer aktivitätsinduzierenden Einheit, welche ein Polypeptid ist, Gebrauch machen, zum Beispiel einem Wachstums-Faktor, einem Toxin, einer antisense-Nucleinsäure oder einer Nucleinsäure, die ein gewünschtes Genprodukt codiert. Die tatsächlich verwendete aktivitätsinduzierende Einheit wird auf Grund der jeweiligen Eigenschaften ihrer Funktion ausgewählt, z.B. ihrer Aktivität.
Eine Methode zum Abtöten einer Krebszelle in einem Patienten wird nachfolgend beschrieben. Die Schritte der Methode können beinhalten, daß dem Patienten ein erstes die Translokationsdomäne und LF-Bindungsdomäne des nativen PA-Proteins und eine für die Krebszelle spezifische Ligandendomäne umfassendes Fusionsprotein verabreicht wird, und zwar in einer Menge, die ausreichend ist, um an eine Tumorzelle zu binden. Ein zweites Fusionsprotein wird ebenfalls verabreicht, indem das Protein die PA-Bindungsdomäne des nativen LF-Proteins und eine zellgiftige Domäne von einem nicht-LF-Protein umfaßt und die Menge ausreicht, um an das erste Protein zu binden, wobei das zweite Protein in die Krebszelle aufgenommen wird und die Krebszelle abtötet. Die zellgiftige Domäne kann aus einem Toxin bestehen oder kann eine andere Einheit sein, die genaugenommen kein Toxin darstellt, aber welche eine Aktivität besitzt, die den Zelltod zur Folge hat. Diese zellgiftigen Einheiten können durch Einsatz von Standardtests zur giftigen Wirkung auf Zellen ausgewählt werden, solche wie der Lyse von Zellen und Messungen zur Hemmung der Proteinsynthese, welche in den Beispielen beschrieben sind.
Eine Methode zum Abtöten von HIV-infizierten Zellen in einem Patienten wird nachfolgend beschrieben. Die Methode umfaßt die Schritte Verabreichen eines ersten Fusionsproteins an einen Patienten, das die Translokationsdomäne und LF-Bindungsdomäne des nativen PA-Proteins und eine spezifisch an ein HIV- Protein bindende Ligandendomäne umfaßt, das an der Oberfläche einer HIV-infizierten Zelle exprimiert wird, und zwar in einer Menge, die ausreichend ist, an eine HIV-infizierte Zelle zu binden. Im nächsten Schritt wird dem Patient ein zweites Fusionsprotein verabreicht, das die PA-Bindungsdomäne des nativen LF-Proteins und eine zellgiftige Domäne von einem nicht-LF-Protein umfaßt, wobei die Menge ausreicht, um an das erste Protein zu binden und wobei das zweite Protein in die HIV-infizierte Zelle aufgenommen wird und die HIV-infizierte Zelle abtötet. Dadurch wird die weitere Verbreitung des HIV verhindert.
Obwohl bestimmte Methoden, wie der Einsatz von LF-Fusionproteinen, beschrieben wurden, ist zu betonen, daß andere LF-Zusammensetzungen, deren aktivitätsinduzierende Einheiten chemisch angefügt wurden, innerhalb des Verfahrens verwendet werden können.
Die Fusionsproteine und andere Zusammensetzungen können durch verschiedene Techniken verabreicht werden, z.B. parenteral, intramuskulär oder intrapertional.
Die benötigte Menge kann von anderen Rezeptor/Ligand- oder AntikörperlAntigen-Therapien abgeleitet werden. Die Menge kann mit Hilfe von Routineverfahren optimiert werden. Die genaue Menge, die von solchen LF- und PA- Zusammensetzungen benötigt wird, wird sich von Patient zu Patient ändern, in Abhängigkeit von Art, Alter, Gewicht und allgemeiner Verfassung des Patienten, der Schwere der Erkrankung, die behandelt wird, der Zusammensetzung des jeweilig verwendeten Fusionsproteins, seiner Art der Verabreichung und dergleichen. Im allgemeinen wird die Dosis ungefähr der Menge entsprechen, die bei der Verabreichung von Liganden von Zelloberflächen-Rezeptoren typisch ist, und wird vorzugsweise im Bereich von etwa 2 mg/kg/Tag bis zu 2 mg/kg/Tag liegen.
Abhängig von der vorgesehenen Art der Verabreichung können die Substanzen in unterschiedlichen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten sein. Die Zusammensetzungen werden, wie oben angeführt, in Kombination mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger eine wirksame Menge des ausgewählten Proteins beinhalten und können zusätzlich andere medizinische Substanzen, pharmazeutische Substanzen, Träger, Zusatzstoffe, Lösungsmittel etc. beinhalten. Mit "pharmazeutisch geeignet" ist ein Material gemeint, das nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht ist; z.B. kann das Material an eine Einzelperson verabreicht werden, zusammen mit dem Fusionsprotein oder in anderer Zusammensetzung, ohne eine unerwünschte biologische Wirkung oder Wechselwirkung in einer schädlichen Weise mit irgendeiner der anderen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung, in der es enthalten ist, zu verursachen.
Parenterale Verabreichung wird im allgemeinen durch Injektion angewendet. Substanzen zur Injektion können in üblicher Form vorbereitet werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, oder als Emulsionen. Ein erst kürzlich abgeändertes Verfahren zur parenteralen Verabreichung beinhaltet den Gebrauch eines Systems zur langsamen oder anhaltenden Abgabe, so daß eine konstante Höhe der Dosis beibehalten wird, siehe z.B. U.S. -Patent 3,710,795, das hierin durch Verweis einbezogen ist.

Formulierungen und Verabreichung:

Erfindungsgemäße Proteine, etwa PAHIV, werden typischerweise vor Verabreichung an ein Säugetier, wie etwa einen Menschen, mit einer physiologisch geeigneten Flüssigkeit gemischt. Beispiele für physiologisch geeignete Flüssigkeiten schließen Salzlösungen ein, wie etwa normale Kochsalzlösung, Ringer-Lösung und ganz allgemein Mischungen verschiedener Salze, einschließlich Kalium- und Phosphat-Salze mit oder ohne Zuckerzusatz, wie etwa Glucose. Die Proteine werden parenteral verabreicht, wobei intravensöse Verabreichung der am meisten benutzte Weg ist. Es kann entweder das ganze Protein in Lösung auf einmal oder als langsame Infusion intravenös verabreicht werden. Ob eine einmalige Gabe oder eine Infusion gewählt wird, hängt von der Kinetik, einschließlich der Halbwertszeit des Proteins in dem Patienten ab. Eine Bewertung der Zeit, die für die Gabe des Proteins angemessen ist, gehört zu den normalen Fertigkeiten des klinischen Personals.
Patienten, die für die Behandlung mit PAHIV ausgewählt wurden, sind mit HIV infiziert und können oder können nicht Symptome der Erkrankung zeigen. Optimal ist es, wenn das Protein an eine mit HIV-1 infizierte Person verabreicht würde, die noch keine Symptome der Erkrankung zeigt. Der Bereich der Dosierung eines Proteins aus der Erfindung, wie etwa PAHIV, liegt typischerweise zwischen etwa 5 und etwa 25 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten. Gewöhnlich beträgt die Dosis etwa 10 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten. Die Dosis wird in regelmäßigen Abständen wiederholt gegeben, wie etwa wöchentlich für ungefähr 4 bis 6 Wochen. Während dieser Zeit hat das klinische Personal die Option, den Immun-Status des Patienten, welcher die Immun-Toleranz gegenüber PAHIV beinhaltet, zu bewerten, um über die weitere Behandlung zu entscheiden.
Die vorangehende Beschreibung und die folgenden Beispiele werden in erster Linie zum Zweck der Erläuterung vorgebracht. Für den Fachmann wird es schnell offensichtlich werden, daß die Bedingungen der Ausführung, die Materialien, Verfahrensschritte und andere Parameter des hierin beschriebenen Systems weiter modifiziert oder in verschiedener Art und Weise ersetzt werden können, ohne den Geist und Bereich der Erfindung zu verlassen. Obwohl der Einsatz am Menschen diskutiert wurde, ist ein Einsatz der Erfindung beispielsweise ebenfalls in der Tiermedizin möglich. Zum Beispiel leiden Katzen an einem sogenannten Katzen-AIDS oder dem Katzen-Immun-Defizienz-Virus (FIV). Schutz-Antigen kann so verändert werden, das es eine Schnittstelle für eine Protease enthält, die spezifisch für FIV ist. Daher ist die Erfindung nicht durch die Beschreibung und Beispiele begrenzt, sondern vielmehr durch die anhängenden Ansprüche.

Beispiel 1:

Fusionen von Anthrax-Toxin-Letal-Faktor an die ADP-Ribosylierungs-Domäne von Pseudomonas-Exotoxin:
Reagentien und Allgemeine Verfahren:
Restriktionsendonucleasen und DNA-modifizierende Enzyme wurden von GIBCO/BRL, Boehringer Mannheim oder New England Biolabs gekauft. Agaro se mit niedrigem Schmelzpunkt (Sea Plaque) wurde von der FMC Corp. (Rockland, ME) erhalten. Oligonucleotide wurden auf einer PCR-Mate (Applied Biosystems) synthetisiert und mit Hilfe von vorgefertigten Säulen für Oligonucleotide (Applied Biosystems) gereinigt. Die PCR wurde mit Hilfe eines Reagens zur DNA-Vervielfältigung (GeneAmp) von Perkin-Elmer Cetus Instruments und einem PCR-Heizblock (Perkin-Elmer Cetus) durchgeführt. Die Vervielfältigung wurde in 30 Zyklen mit 1 min langer Denaturation bei 94ºC, 2,5 min langer Bindung bei 55ºC und 3 min langer Verlängerung bei 72ºC durchgeführt. Eine letzte Verlängerung fand 7 min lang bei 72ºC statt. Zur Vervielfältigung des PE- Fragments wurden 10% Formamid in die Reaktionsmischung zugegeben, um die Wirkung des hohen GC-Gehalts zu vermindern. DNA-Sequenzier-Reaktionen wurden unter Verwendung der Sequenase-Version 1.0 der U.S. Biochemical Corp. durchgeführt, und DNA-Sequenzier-Gele wurden aus dem Gel-Mix 6 von GIBCO/BRL gemacht. [³&sup5;S]Deoxyadenosin-5'-[α-thio]-triphosphat und L-[3,4,5-³H]-Leucin wurden von Dupont-New England Nuclear gekauft. J774A.1-Zellen wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Eizellen des chinesischen Hamsters (CHO) wurden von Michael Gottesman (National Cancer Institute, National Institutes of Health) (ATCC CCL 61) bezogen.

Plasmid-Konstruktion:

Die Konstruktion von Plasmiden, die LF-PE-Fusionen enthalten, wurde wie folgt durchgeführt: Unterschiedliche Teile des PE-Gens wurden durch PCR vervielfältigt, in korrektem Leseraster mit dem 3'-Ende des LF-Gens verbunden und in den pVEX115 f+T Expressionsvektor (geliefert durch V.K. Chaudhary, National Cancer Institute, National Institutes of Health) eingesetzt. Um Fusionsproteine zu konstruieren, wurde das 3'-Ende des nativen LF-Gens (welches das Codon 776, spezifisch für Ser, des vollständigen Proteins enthält) mit den 5'-Enden der Sequenzen verbunden, die spezifisch für unterschiedliche Teile der Domänen II, Ib und III von PE sind. Das LF-Gen wurde, ausgehend vom Plasmid pLF7 (Robertson, D.L. und Leppla, S.H., Gene, 44: 71-78, 1986), durch PCR vervielfältigt, wobei Oligonucleotid-Primer verwendet wurden, die KpnI- und MIuI Schnittstellen an dem 5'- beziehungsweise dem 3'-Ende des Gens hinzufügten. In ähnlicher Weise wurden Teile des PE-Gens (geliefert durch David FitzGerald, National Cancer Institute, National Institutes of Health) durch PCR so vervielfältigt, daß MIuI- und EcoRI-Schnittstellen am 5'- und 3'-Ende zugefügt wurden. Das PCR-Produkt des LF-Gens wurde mit KpnI verdaut, und die DNA wurde gefällt. Das LF-Gen wurde nachfolgend mit MIuI behandelt. In ähnlicher Weise wurden PCR-Produkte aus PE-Vervielfältigung mit MIuI und EcoRI verdaut. Der Expressionsvektor pVEX115 f+T wurde, jeweils getrennt, mit KpnI und EcoRI geschnitten und dephosphoryliert. Dieser Vektor besitzt einen T7- Promotor, OmpA-Signalsequenz, Multi-Klonierungsstelle und einen T7-Transkriptions-Terminator. Sämtliche der oben genannten DNA-Fragmente wurden aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt, eine Verbindung von drei Fragmenten wurde durchgeführt und das Produkt in E. coli DH5α (ATCC 53868) transformiert. In den vier Konstruktionen, die in diesem Bericht beschrieben wurden, ist das gesamte LF-Gen mit unterschiedlichen Teilen von PE fusioniert. Die Identität von jeder Konstruktion wurde durch Sequenzierung, unter Verwendung eines Sequenase Kit (U.S. Biochemical Corp.), der Verbindungsstelle bestätigt. Zur Expression wurden rekombinante Plasmide in den E. coli-Stamm SA2821 (geliefert durch Sankar Adhya, National Cancer Institute, National Institutes of Health), der eine Abart von BL21(IDE3) ist (Studier, F.W. und Moffatt, B.A., J. Mol. 8101., 189 : 113-150, 1986) transformiert. Dieser Stamm besitzt ein T7 RNA-Polymerase-Gen, das von einem induzierbaren lac- Promotor gesteuert wird, und enthält auch die degP-Mutation, wodurch eine wichtige periplasmatische Protease eliminiert wird (Strauch et al., J. Bacteriol., 171: 2689-2696, 1989).
In den sich ergebenden Plasmiden ist das LF-PE-Fusionsprotein unter der Kontrolle des T7-Promotors und enthält ein OmpA-Signalpeptid, um die Ausscheidung der Produkte in das Periplasma zu erreichen, so daß die Reinigung erleichtert wird. Die Verbindungsteile wurden mit Hilfe von PCR so entworfen, daß zwei nicht-native Aminosäuren, Thr-Arg, an der LF-PE-Verbindungsstelle eingeführt wurden. Die vier Fusionen, die in diesem Bericht untersucht wurden, enthalten die gesamten 776 Aminosäuren des vollständigen LF, die zwei zu gefügten Reste TR (Thr-Arg) und unterschiedliche Teile von PE. In Fusion FP33 wurde das Carboxy-Ende von PE von dem nativen REDLK (Arg-Glu-Asp-Leu-Lys) in LDER ausgewechselt, eine Sequenz, die als Ursache für eine Rückhaltung im ER (endoplasmatisches Retikulum), versagte.

Expression und Reinigung von Fusionsproteinen:

Von pNA2, pNA4, pNA23 und pNA33 produzierte Fusionsproteine wurden jeweils als FP2, FP4, FP23 und FP33 bezeichnet. E. coli-Stämme, welche die rekombinanten Plasmide beinhalten, wurden in Super Broth (32 g/l Trypton, 20 g/l, Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl, pH 7,5) mit 100 ug/ml Ampicillin unter Schütteln mit 225 U/min bei 37ºC in 2-1-Kulturen gewachsen. Sobald die Asoo den Wert von 0,8-1,0 erreichte, wurde Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid zu einer Endkonzentration von 1 mM zugefügt, und die Kulturen wurden weitere 2 h lang bebrütet. EDTA und 1,10-o-Phenanthrolin wurden zu einer Endkonzentration von 5 mM beziehungsweise 0,1 mM zugegeben, und die Bakterien wurden durch Zentrifugation 15 min lang mit 4000 x g bei 4ºC geerntet. Zur Gewinnung der periplasmatischen Inhalte wurden die Zellen in 75 ml 20% Saccharose, die 30 mM Tris und 1 mM EDTA enthielt, aufgenommen, 10 min lang bei 0ºC gehalten und 15 min lang mit 8000 x g bei 4ºC zentrifugiert. Die Zellen wurden behutsam in 50 ml kaltem destillierten Wasser wieder aufgenommen, 10 min lang auf Eis gehalten, und die Spheroplasten wurden sedimentiert. Der Überstand wurde mit Centriprep-100 Einheiten (Amicon) konzentriert und auf eine Sephacryl S-200 Säule (40 · 2 cm) aufgetragen, und 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt.
Fraktionen, die das Protein in voller Länge enthielten, was durch Immuno-Blots bestimmt wurde, wurden vereinigt und wie oben beschrieben konzentriert. Protein wurde dann auf einer Anionenaustausch-Säule (MonoQ HR5/5, Pharmacia-LKB) unter Verwendung eines NaCl-Gradienten gereinigt. Die Fusionsproteine wurden bei 280-300 mM NaCl eluiert. Die Proteine wurden abermals auf Centriprep-100 (Amicon Division) konzentriert, und die MonoQ-Chromatographie wurde wiederholt. Proteinkonzentrationen wurden durch die Bicin chonin-Säure-Methode (BCA Protein Assay Reagent, Pierce) bestimmt, wobei Serum-Albumin von Rind als Standard eingesetzt wurde. Proteine wurden durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese in Gegenwart von Natrium-dodecylsulfat (SDS) untersucht. Gele wurden entweder mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt, oder die Proteine wurden durch Elektro-Blot auf Nitrozellulosepapier übertragen, welches mit Sonden von polyklonalen Antiseren aus Kaninchen gegen LF oder PE (List Biological Laboratories, Campbell, CA) behandelt wurde. Um den Prozentsatz von Protein voller Länge zu ermitteln, wurden SDS- Gele, die mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt waren, mit einem Laser-Densitometer (Pharmacia-LKB Ultrascan XL) abgetastet.
Die Proteine wanderten bei der Gel-Elektrophorese mit molekularen Massen von mehr als 106 kDa, was sich mit den erwarteten Größen deckt, und lmmuno-Blots bestätigten, daß die Produkte mit beiden Antiseren gegen LF bzw. PE reagierten. Die Fusionsproteine unterschieden sich in ihrer Empfänglichkeit gegenüber Proteolyse, wie durch das Auftauchen von kleineren Fragmenten auf lmmuno-Blots erkennbar war, und dies führte zu unterschiedlichen Ausbeuten von Endprodukt. Daher waren die Ausbeuten aus 2-1-Kulturen für FP2, 27 ug; FP4, 87 ug; FP23, 18 ug; und FP33, 143 ug.

Zellkultur-Techniken und Bestimmung der Proteinsynthese-Hemmung:

CHO-Zellen wurden als einlagige Schichten in Eagle's Minimum-Essentiell- Medium (EMEM) unterhalten, das mit 10% fötalem Kälberserum, 10 mM 4-2-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure (HEPES) (pH 7,3), 2 mM Glutamin, Penicillin/Streptomycin und nicht-essentiellen Aminosäuren (GIBCO/BRL) ergänzt ist. Zellen wurden einen Tag vor dem Experiment in Platten mit 24 oder 48 Vertiefungen überführt. Nach dem Bebrüten über Nacht, wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt, welches, falls nicht anderweitig angezeigt, 1 ug/ml PA enthielt. Fusionsproteine wurden zu 0,1-1000 ng/ml hinzugefügt. Sämtliche Messpunkte wurden als Doppelwerte bestimmt. Zellen wurden für weitere 20 h bei 37ºC in einer Atmosphäre mit 5% CO&sub2; gehalten. Das Medium wurde dann entfernt, und die Zellen wurden 2 h lang bei 37ºC mit Leucin-freiem Medium behandelt, das 1 uCl/ml [³H]-Leucin enthielt. Zellen wurden zweimal mit Medium gewaschen, 30 min lang wurde kalte 10% Trichloressigsäure zugegeben, die Zellen wurden zweimal mit 5% Trichloressigsäure gewaschen und in 0,150 ml 0,1 M NaOH aufgenommen. Proben wurden im Pharmacia-LKB 1410 Flüssig-Szintillationszähler gemessen. In Untersuchungen, bei denen bestimmt werden sollte, ob das Toxin durch angesäuerte Endosomen aufgenommen ist, wurde 1 uM Monensin (Sigma) 90 min früher als das Toxin zugegeben und war während sämtlicher nachfolgender Schritte vorhanden. Um zu bestätigen, daß die Fusionsproteine durch den PA-Rezeptor aufgenommen wurden, wurde mit Konkurrenz durch natives LF gearbeitet. PA (0,1 pg/ml) und LF (0,1-10.000 ng/ml) wurden zu den CHO- Zellen zugegeben, um den PA-Rezeptor zu blockieren, und die Fusionsproteine wurden danach in Konzentrationen von 100 ng/ml für FP4 und FP23 und 5 ng/ml für FP33 zugegeben. Nach 20 h wurde die Hemmung der Proteinsynthese, wie oben beschrieben, gemessen.

Zellgiftige Aktivität der Fusionsproteine:

ANe vier Fusionsproteine, die hergestellt und gereinigt wurden, waren toxisch gegenüber CHO-Zellen. Die Konzentration der Proteine, welche 50% Lyse der kultivierten Zellen (EC50) verursachte, betrug 350, 8,10 und 0,2 ng/ml jeweils für FP2, FP4, FP23 und FP33 (Tabelle 2). Diese Bestimmungen wurden in Gegenwart von 1 ug/ml PA, der Km von 0,1 ug/ml (100 pM) wurde weit übertroffen, durchgeführt. Die Fusionsproteine wiesen keine Toxizität auf, sogar nicht bei 1 ug/ml, wenn PA weggelassen wurde, was beweist, daß die Aufnahme der Fusionsproteine mit Hilfe von PA und dem PA-Rezeptor stattfindet. Bereits früher wurde gezeigt, daß natives LF, wenn zusammen mit PA zugegeben, keine kurzfristigen toxischen Wirkungen auf CHO-Zellen hat; daher wurde es nicht innerhalb dieser Messungen untersucht. Das Fusionsprotein, das nur Domäne III und ein verändertes Carboxy-Ende (FP33) hat, war am stärksten aktiv, während jenes mit den vollständigen Domänen II und III und dem nativen REDLK- Ende (FP2) die schwächste Aktivität hatte. Die anderen zwei Fusionsproteine (FP4 und FP23) hatten dazwischenliegende Wirksamkeiten.
Unter den Proteinen, die ADP-Ribosylierungsaktivität haben, wurde früher Wirksamkeit in Konzentrationen von 1 pM oder mehr nur für native Diphtheria und Pseudomonas-Toxine gefunden, die an ausgewählten Zellen aktiv waren (Middlebrook, J. L. und Dorlan, R. B., Can. J. Microbiol., 23: 183-189, 1977) und für Fusionsproteine von PE und Diphtheria-Toxin, wenn diese an Zellen getestet wurden, die > 100.000 Rezeptoren für die Domäne zur Liganden-Erkennung der Fusion (EGF, Transferrin, etc.) besaßen (Pastan, I. und FitzGerald, D., Science, 254: 1173-1177, 1991; Middlebrook, et al. 1977). An CHO-Zellen ist die Wirksamkeit von FP33 (EC&sub5;&sub0; = 2 pM) höher als die von PE selbst (EC&sub5;&sub0; = 420 pM), und das, obwohl CHO-Zellen wahrscheinlich eine ähnliche Anzahl von Rezeptoren für beide, PA und PE (ca. 5.000-20.000), haben. Wenn der intrazelluläre Transport von nativem PE weniger als 5% der Moleküle an das Cytoplasma liefert, dann läßt die 200-fach höhere Wirksamkeit von FP33 darauf schließen, daß dem PA/LF-System ein hoher Wirkungsgrad der Lieferung an das Cytoplasma innewohnt.
Ein Vergleich der Wirksamkeiten von den vier Fusionsproteinen zeigt, daß die Einbeziehung der Domäne II die Wirksamkeit vermindert. Daher war die Fusion mit der geringsten Wirksamkeit, FP2, jene, welche die vollständigen Domänen II, Ib und III beinhaltete. Während des Entwurfs der Fusionsproteine wurden die gesamten oder ein Teil der PE-Domänen II und Ib in mehrere Konstruktionen einbezogen, weil nicht angenommen werden konnte, daß die Funktionen zur Translokation, die PA und LF besitzen, fähig sein könnten, die PE-Domäne III korrekt in das Cytoplasma zu befördern. Die Kombination der Domänen II, Ib und III, als PE40 bezeichnet, wurde in einer großen Zahl von toxischen Hybrid-Proteinen eingesetzt, bei der Fusion an Wachstumsfaktoren, monoklonale Antikörper und andere Proteine (Pastan et al. 1991; Oeltmann, T.N. und Frankel, A.E., Faseb J., 5 : 2334-2337, 1991), und einige von diesen Fusionen haben eine wesentliche Wirksamkeit gezeigt. Es wurde herausgefunden, daß Domäne II in diesen Hybrid-Proteinen wesentlich ist, um eine Funktion zur Translokation zu liefern, welche in der an sie fusionierten Domäne zur Rezeptorbindung nicht vorhanden ist. Die Wirksamkeit von vielen dieser PE40-Fu sionsproteine scheint zu benötigen, daß sie durch den Golgi und das ER geschleust werden und in der gleichen Weise wie das native PE durch Proteolyse aktiviert werden, um eine Lieferung der Domäne III in das Cytoplasma zu erzielen. Die Tatsache, daß die Einbeziehung der gesamten Domäne II in das LF- Fusionprotein FP2 statt dessen die Aktivität verminderte, legt nahe, daß die Aufnahme von LF-Fusionproteinen über einen unterschiedlichen Weg stattfindet, einen der nicht ohne weiteres mit allen Sequenzen in Domäne II zurechtkommt.
Ein Anhaltspunkt, daß Strukturen innerhalb der PE-Reste 251-278 die Translokation von den LF-Fusionen hemmen, kommt von der 35-fach geringeren Wirksamkeit von FP2, verglichen mit FP23. Eine Struktur, welche die Translokation von den Fusionen hemmen könnte, ist die Disulfid-Brücke, die durch Cys265 und Cys287 gebildet wird. In nativem PE scheint diese Disulfid-Brücke für maximale Aktivität notwendig zu sein. Deshalb sind native PE und TGF-α-PE40 Fusionen 10- bis 100-fach weniger toxisch, wenn eines dieser beiden Cysteine gegen Serin ausgewechselt wird. Die Disulfid-Brücke wirkt wahrscheinlich in der Weise, daß das Arg276 und das Arg279 des Polypeptids für die intrazelluläre Protease empfänglich sind, welche an der Spaltung beteiligt ist, die der Translokation vorangeht. Im Gegensatz dazu vermindert die Disulfid-Brücke die Wirksamkeit der LF-Fusionen, vielleicht durch Verhinderung der Entfaltung, welche für die Passage durch einen Protein-Kanal notwendig ist, was in dieser Situation wie eine Sequenz zum "Transfer-Stop" wirkt. FP23, dem Cys265 fehlt, würde nicht das Disulfid der Domäne II enthalten und würde daher nicht Gegenstand dieses Effektes sein. LF sowie PA und EF enthalten keine Cysteine und würden nicht durch Disulfid-Brücken an der vollständigen Entfaltung gehindert, die notwendig ist, um einen Protein-Kanal zu passieren. Die Annahme, daß Disulfid-Brücken als Signale zum Transfer-Stop fungieren, würde vorhersagen, daß das Disulfid Cys372-Cys379 in PE-Domäne Ib, welches in allen vier LF-Fusionen beibehalten ist, ebenfalls die Wirksamkeit vermindern würde. Es sollte erwähnt werden, daß weder die hier gemachten Fusionen noch die PE40-Fusionen chemisch untersucht worden sind, um zu ermitteln, ob die Disulfide in den Domänen II und III tatsächlich gebildet werden. Wenn die Di sulfide korrekt gebildet werden, würde vorhergesagt werden, daß die Wirksamkeiten von allen Fusionsproteinen, und insbesondere die von FP2, durch Behandlung mit reduzierenden Substanzen gesteigert würden. Diese Untersuchungen wurden bis jetzt noch nicht durchgeführt. Diese Untersuchung läßt ebenfalls vermuten, daß in der Zukunft durch Weglassen der Domäne Ib möglicherweise wirksamere LF-Fusionen gemacht werden können.
Das andere strukturelle Kennzeichen von PE, von dem bekannt ist, daß es in den intrazellulären Transport eingreift, ist die Sequenz des Carboxy-Endes, REDLK, die spezifisch für eine Rückhaltung im ER ist (Chaudhary et al. 1990; Muro et al. 1987). Um festzustellen, ob der Transport der LF-Fusionproteine ähnlich zu dem von PE ist, wurden zwei der Fusionsproteine so entworfen, daß sie sich lediglich in der Sequenz des Endes unterschieden. Austausch der normalen Sequenz durch LDER, eine die nicht als ein Signal zur Rückhaltung im ER wirkt, produzierte das am stärksten toxische der vier Fusionsproteine, FP33. Das mit Ausnahme der beibehaltenen funktionierenden REDLK-Sequenz identische FP4 war 30-fach schwächer wirksam. Diese Angaben lassen darauf schließen, daß Wegnahme des REDLK-Endes von den Fusionen ihren Zugang zu EF-2 des Cytoplasmas verringerte. Die Folge ist, daß PE möglicherweise das REDLK-Ende benötigt, um für einen zwingenden Schritt im weiteren Verlauf in das ER zu gelangen, aber dann in seiner endgültigen toxischen Wirksamkeit durch Beschlagnahme von seinem Ziel im Cytoplasma begrenzt ist. Schließlich liefert dieser Vergleich starke Argumente, das die Aufnahme der LF- Fusionen nicht dem gleichen Weg wie PE folgt.
Beim Entwurf der hier beschriebenen Fusionsproteine wurde erhofft, daß sie eine zellgiftige Aktivität gegenüber Zellen haben würden, die nicht durch das Anthrax-Letal-Toxin in Mitleidenschaft gezogen worden sind, und dies wurde erfolgreich verwirklicht, wie durch die mit den CHO-Zellen gewonnenen Daten gezeigt wird. Jedoch haben frühere Kenntnisse über LF keine Basis für eine Voraussage geliefert, ob die Konstruktionen Toxizität gegenüber Maus-Makrophagen beibehalten würden, welche die einzigen Zellen sind, von denen bekannt ist, daß sie schnell durch Anthrax-Letal-Toxin abgetötet werden. Makro phagen werden durch Letal-Toxin in 90-120 Minuten lysiert, lange bevor jegliche Hemmung der Proteinsynthese, die durch ADP-Ribosylierung von EF-2 hervorgerufen wird, zur Verminderung der Membran-Vollständigkeit oder -Lebensfähigkeit führt. Dieser Unterschied in der Kinetik macht es möglich, direkt die Wirkung von LF zu testen. Wie oben diskutiert, waren die Fusionsproteine, die gereinigt wurden, um die durch Proteolyse gebildete 89-kDa LF-Form zu entfernen, nicht toxisch gegenüber J774A.1-Makrophagen. Dies zeigt, daß Anfügen einer sperrigen Gruppe an das Carboxy-Ende von LF seine normale toxische Aktivität beseitigt. In Abwesenheit von jeglicher Bestimmungsmethode für die vermeintliche katalytische Aktivität von LF ist es nicht möglich, die Ursache für den Verlust der LF-Aktivität zu ermitteln. Die Unfähigkeit der Fusionen, J774A.1-Zellen zu lysieren, spricht auch gegen einen Abbau der Fusionen durch Proteolyse, entweder im Medium während der Inkubation mit Zellen oder nach Aufnahme.
Ein wichtiges Ergebnis der hier beschriebenen Erfindung ist der Beweis, daß die Anthrax-Toxin-Proteine einen leistungsfähigen Mechanismus zur Proteinaufnahme in tierische Zellen bilden. Die hohe Wirksamkeit der gegenwärtigen Fusionsproteine erweist, daß dieses System eine innewohnende Leistungsfähigkeit hat sowie für Verbesserungen zugänglich sind. Die hohe Leistungsfähigkeit ergibt sich teilweise aus der offensichtlich direkten Translokation von den Endosomen, ohne daß ein Transport durch andere intrazelluläre Teilräume notwendig ist. Zusätzlich zu seiner Leistungsfähigkeit scheint das System in der Lage zu sein, heterologe Polypeptide zu dulden.

Makrophagen-Lyse-Test von Fusionsproteinen:

Fusionsproteine werden auf funktionale LF-Aktivität an der J774A.1-Makrophagen-Zelllinie in Gegenwart von 1 pg/ml PA getestet. Einen Tag vor Gebrauch wurden die Zellen aus den Kolben geschabt und in Gewebekultur-Platten mit 48 Vertiefungen gegeben. Für Tests zur Zellgiftigkeit wurde das Medium abgesaugt und mit frischem Medium ersetzt, das 1 pg/ml PA und die LF-Fusionsproteine enthielt, und die Zellen wurden 3 h lang bebrütet. Alle Messpunkte wurden als Doppelbestimmungen durchgeführt. Um die Lebensfähigkeit der behandelten Zellen zu messen, wurde 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu den Zellen in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugegeben, und die Inkubation wurde für weitere 45 min fortgesetzt, um die Aufnahme und Oxidation von MTT durch lebende Zellen zu gestatten. Medium wurde abgesaugt und durch 200 ul von 0,5% SDS, 40 mM HCl, 90% Isopropanol ersetzt, und die Platten wurden stark geschüttelt, um den blauen Farbstoff aufzulösen. Die Absorption des MTT wurde bei 570 nm mit einem UVmax Kinetic Microplate Reader (Molecular Devices Corp.) bestimmt.
Die Rohextrakte des Periplasmas, aus denen die Fusionsproteine gereinigt wurden, verursachten Lyse der J774A.1-Makrophagen, wenn sie mit PA zugefügt wurden, was auf die Gegenwart von aktiven LF-Formen hinweist, die wahrscheinlich durch Proteolyse aus den Fusionsproteinen gebildet wurden. Reinigung entfernte diese Aktivität, so daß keines von den endgültigen Fusionsproteinen diese Aktivität hatte. Dieses Ergebnis zeigt beides, nämlich daß die gereinigten Proteine frei von LF voller Länge oder aktiven LF-Fragmenten waren und daß die Aktivität von LF zur Lyse von Makrophagen blockiert ist, wenn Reste von PE an sein Carboxy-Ende fusioniert sind.

ADP-Ribosylierungs-Test:

Um auf ADP-Ribosylierungsaktivität zu testen, wurde die Methode von Collier und Kandel (Collier, R.J. und Kandel, J., J. BioJ. Chem., 246 : 1496-1503, 1971) mit einigen Abwandlungen verwendet. Ein Extrakt aus Weizenkeimen, der mit EF-2 angereichert war, wurde für die Reaktion eingesetzt. Kurz gefaßt, wurden in einem 200-ul Reaktionsansatz 20 ul Puffer (500 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Dithiothreitol und 10 mg/ml Rinder-Serum-Albumin) mit 30 ul EF-2, 130 ul H&sub2;O oder der Probe und 20 ul [Adenylat-³²P]-NAD (0,4 uCl pro Test, ICN Biochemicals), das 5 uM von nicht-radioaktivem NAD enthielt, gemischt. Die Ansätze wurden 20 min lang bei 23ºC bebrütet, die Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 ml 10% Trichloressigsäure gestoppt, und die Niederschläge wur den gesammelt und auf GA-6-Filtern (Gelman Sciences) gewaschen. Die Filter wurden zweimal mit 70% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet, und die Radioaktivität wurde gemessen.
Tabelle 2 zeigt, daß sämtliche Fusionsproteine sich gleichende Fähigkeiten zur ADP-Ribosylierung von EF-2 haben. FP2, das eine geringfügig höhere Zellgiftigkeit gegenüber CHO-Zellen hatte, behielt noch vollständige ADP-Ribosylierungsaktivität. Es wurde ebenfalls gefunden, daß Behandlung mit Harnstoff und Dithiothreitol unter Bedingungen, welche die enzymatische Aktivität von nativem PE aktivieren, keinen Anstieg in der ADP-Ribosylierungsaktivität der Fusionsproteine zur Folge hatte, was nahelegt, daß die Proteine nicht so gefaltet sind, daß sie räumlich das katalytische Zentrum blockieren.

Auswirkung von mutiertem PA auf die LF-PE-Aktivität:

Um nachzuweisen, daß die Aufnahme der Fusionsproteine PA benötigt, wurde die Aktivität der Fusionsproteine in der Gegenwart eines mutierten PA, das offensichtlich nicht aufgenommen wird, gemessen. In dieser Mutante, PA-S395C, ist ein Serin durch Cystein bei Rest 395 des reifen Proteins ersetzt, und sie behält die Fähigkeit, an den Rezeptor zu binden, wird proteolytisch geschnitten und bindet LF, ist aber unfähig, Makrophagen zu lysieren. Wenn PA-S395C durch natives PA in Kombination mit FP33 ersetzt wird, wurde keine Behinderung der Hemmung der Proteinsynthese beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, als die anderen drei Fusionsproteine in Kombination mit PA-S395C getestet wurden.

Auswirkung von Monensin auf die Aktivität der Fusionsproteine:

Um nachzuweisen, daß sich die Aufnahme der Fusionsproteine mit Hilfe von Passage durch angesäuerte Endosomen in der gleichen Weise wie für natives LF ereignet, wurde die Fähigkeit von Monensin, Zellen zu schützen, untersucht. Zugabe von Monensin auf 1 uM verminderte die Wirksamkeit von FP33 > 100-fach. Der Schutz gegen die anderen drei Fusionsproteine übertraf 20-fach.

LF-Blockade von Aktivität der LF-PE-Fusion:

Um weiter zu bestätigen, daß die Fusionsproteine durch den PA-Rezeptor aufgenommen werden, wurden CHO-Zellen mit PA und verschiedenen Mengen von LF inkubiert, um den Rezeptor zu blockieren, und hiernach wurden die Fusionsproteine zugegeben. Bestimmungen der Hemmung der Proteinsynthese zeigten, daß natives LF in Abhängigkeit von der Konzentration LF-PE-Fusionsproteine kompetitiv blockieren kann.
Die vorliegenden Daten lassen darauf schließen, daß das Rezeptor-gebundene 63-kDa Proteolyse-Fragment von PA einen Membran-Kanal bildet und daß Bereiche an oder nahe der Amino-Enden von LF und EF zuerst in diesen Kanal eintreten und dabei die Membran des Endosoms überqueren, gefolgt von Entfaltung und Transport des gesamten Polypetids in das Cytoplasma. Dieses Modell unterscheidet sich von jenem für das Diphtheria-Toxin dadurch, daß die Orientierung des Polypeptid-Transports umgekehrt ist. Da beide, EF und LF, große katalytische Domänen haben, die sich bis nahe an ihre Carboxy-Enden ausdehnen, erscheint es wahrscheinlich, daß das gesamte Polypeptid die Membran überquert. In den LF-Fusionproteinen würden die angefügten PE- Sequenzen zusammen mit dem LF-Polypeptid durch den Kanal in das Cytoplasma geschleust. Daher muß der PA63-Protein-Kanal verschiedene Aminosäurereste und Sequenzen dulden. Die vorgelegten Angaben sind vereinbar mit einem Mechanismus der direkten Translokation von LF-Proteinen in das Cytoplasma, so wie hierin vorgeschlagen wurde. Tabelle 2 Zellgiftige und katalytische Aktivität von LF-PE- Fusionsproteinen
a REDLK am Carboxy-Ende ist gegen LDER ausgetauscht.
b Angaben sind aus diesem Beispiel mit Ausnahme für natives PE, welche aus nicht gezeigten Angaben kommen und gleich einem früher dargestellten Wert sind (Moehring, T.J. und Moehring, J.M. Cell 11 : 447-454,1977).
c ADP-Ribosylierung wurde unter Verwendung von 30 ng der Fusionsproteine in einem Endvolumen von 0,200 ml mit 5 uM NAD gemessen. Die Ergebnisse wurden entsprechend des Molekulargewichts der Proteine korrigiert und auf PE normiert.

Beispiel 2:

Reste 1-254 des Anthrax-Toxin-Letal-Faktors sind ausreichend, um die Aufnahme von fusionierten Polypeptiden in Zellen zu bewirken:

Reagentien und Allgemeine Verfahren:

Restriktionsendonucleasen und DNA-modifizierende Enzyme wurden von GIBOO/BRL, Boehringer Mannheim oder New England Biolabs gekauft. Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Sea Plaque) wurde von der FMC Corporation erhalten. Oligonucleotide wurden auf einer PCR-Mate (Applied Biosystems) synthetisiert und mit vorgefertigten Säulen für Oligonucleotide (Applied Biosystems) gereinigt. Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR) wurden mit Hilfe eines PCR-Heizblocks (Perkin-Elmer-Cetus) durchgeführt, wobei Reagentien der U.S. Biochemical Corp. oder Perkin-Elmer-Cetus verwendet wurden. DNA wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, vervielfältigt. Die DNA wurde sequenziert, um die Richtigkeit von allen Konstruktionen, die im Bericht beschrieben sind, zu bestätigen. Für die Sequenzier-Reaktionen wurde SEQUENASE Version 2.0 von U.S. Biochemical Corp. verwendet, und DNA-Sequenzier-Gele wurden mit Gel-Mix 8 von GIBCO/BRL gemacht. [³&sup5;S]-dATPaS und L-[3,4,5-³H]-Leucin wurden von Dupont-New England Nuclear gekauft. Eizellen des chinesischen Hamsters (CHO) wurden von Michael Gottesman (NCI, NIH) bezogen. J774A.1-Makrophagen-Zellen wurden von der American Type Culture Collection erhalten.

Plasmid-Konstruktion:

Drei Arten von LF-Protein-Konstrukten wurden hergestellt und in diesem Bericht untersucht. Sämtliche der Konstrukte wurden durch Vervielfältigung der gewünschten Sequenzen mit PCR hergestellt, wobei das native LF-Gen als Vorlage eingesetzt wurde. LF-Proteine, die am Amino- oder Carboxy-Ende verkürzt waren, wurden durch eine einzige PCR-Reaktion zur Vervielfältigung konstruiert, bei der Restriktionsschnittstellen an den Enden zum Einbau der Konstruktion in den Expressionsvektor hinzugefügt wurden. LF-Proteine, die um eine oder mehrere der Wiederholungen von 19 die Reste 308-383 umfassenden Aminosäuren verkürzt waren, wurden hergestellt, indem die Produkte von zwei getrennten PCR-Reaktionen verbunden wurden, welche die Bereiche vervielfältigten, die zu streichende Teile einklammern. Die dritte Gruppe von Konstruktionen waren Fusionen von verschiedenen Teilen des Amino-Endes von LF mit den PE-Domänen Ib und III. Wie die LF-Proteine mit innenliegenden Verkürzungen wurden diese LF-PE-Fusionen auch durch Verbindung von zwei getrennt hergestellten PCR-Produkten gemacht. In den beiden letzten Arten von Konstruktionen ergab das Zusammenfügen der PCR-Produkte, daß eine verbindung, ACGCGT, an der Nahtstelle zugefügt wurde. Dies führte zwei nicht-native Reste, Thr-Arg, zwischen die fusionierten Domänen ein. Die Beeinflussungen durch PCR haben auch drei nicht-native Aminosäuren, Met-Val-Pro, als eine Verlängerung an das native Amino-Ende von allen in diesem Bericht beschriebenen Konstruktionen angefügt. Das Hinzufügen dieser Sequenz macht es nicht wahrscheinlich, daß die Aktivität der Konstruktionen verändert wird (untenstehend diskutiert). Es sollte erwähnt werden, daß die LF-PE-Fusionen, die hier beschrieben werden, diese Verlängerung durch drei Reste enthalten.
Für PCR-Reaktionen, die zur Verkürzung von 40 und 78 Aminosäuren des Amino-Endes von LF gemacht wurden, sind zwei verschiedene mutagenisierte Oligonucleotid-Primer hergestellt worden, die an den beabsichtigten neuen Enden der Vorlage des LF-Gens vollständig identisch waren und welche an ihre 5'-Enden KpnI-Schnittstellen hinzufügten. Ein anderer (nicht mutagenisierter) Oligonucleotid-Primer zur Einführung einer BamHI-Schnittstelle am 3'-Ende von LF wurde hergestellt. Ähnlich dazu wurden, um Verkürzungen am Carboxy- Ende von LF zu machen, zwei verschiedene mutagenisierte Primer verwendet, die LF an Resten 729 und 693 stutzen und eine BamHI-Schnittstelle neben den neuen 3'-Enden des LF-Gens einführen. Ein zweiter (nicht mutagenisierter) Oligonucleotid-Primer, der für das Amino-Ende von LF spezifisch ist und der eine KpnI-Schnittstelle am 5'-Ende des Gens einführt, wurde gemacht. Sämtliche der oben erwähnten Primer wurden für PCR-Reaktionen mit pLF7 (Robertson und Leppla, 1986) als Vorlage verwendet, um DNA-Fragmente herzustellen, die jeweils KpnI- und BamHI-Schnittstellen an ihren 5'- und 3'-Enden haben. Die vervielfältigten LF-DNAs, welche die Verkürzungen der Amino- und Carboxy-Enden enthielten, wurden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten. Der Expressionsvektor pVEX115f+T (geliefert durch V.K. Chaudhary, NCI, NIH) wurde nacheinander mit KpnI und BamHI geschnitten und dephosphoryliert. Dieser Expressionsvektor enthält einen T7-Promotor, eine OmpA-Signalsequenz für den Transport von Proteinen in das Periplasma, eine Multi-Klonierungsstelle, die KpnI- und BamHI-Schnittstellen beinhaltet, und einen T7-Transkriptions-Terminator. Die LF- und pVEX115f+T-DNA-Fragmente wurden aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt, über Nacht zusammengefügt und in E. coli DHSa transformiert. Um die gewünschten rekombinanten Plasmide zu identifizieren, wurden Transformanten durch Verdau mit Restriktionsenzymen durchgemustert. Proteine, die von diesen Konstruktionen produziert werden, sind entsprechend der Aminosäurereste, die beibehalten wurden, bezeichnet; zum Beispiel wird das LF, welches an Rest 693 gestutzt ist, als LF1-693 bezeichnet. Alle der oben beschriebenen mutagenisierten LF- Proteine enthalten drei nicht-native Aminosäuren, Met-Val-Pro, die als ein Ergebnis der PCR-Veränderungen an das Amino-Ende angefügt wurden.
Um die Rolle des sich wiederholenden Bereichs von LF zu untersuchen, wurden vier verschiedene Konstruktionen gemacht: 1., Beseitigung des gesamten sich wiederholenden Bereichs (LF¹&supmin;³&sup0;&sup7;.TR.LF³&sup8;&sup4;&supmin;&sup7;&sup7;&sup6;), 2., Beseitigung der ersten Wiederholung (LF¹&supmin;³&sup0;&sup7;.TR.LF³²&sup7;&supmin;&sup7;&sup7;&sup6;), 3., Beseitigung der letzten Wiederholung (LF¹&supmin;³&sup6;&sup4;.TR.LF³&sup8;&sup4;&supmin;&sup7;&sup7;&sup5;), und 4., Beseitigung der Wiederholungen 2-4 (LF¹&supmin;³²&sup6;.TR.LF³&sup8;&sup4;&supmin;&sup7;&sup7;&sup6;). Um LF¹&supmin;³&sup0;&sup7;.TR.LF³&sup8;&sup4;&supmin;&sup7;&sup7;&sup8; zu konstruieren, wurden vier verschiedene Primer in zwei getrennten PCR-Reaktionen verwendet. Um LF¹&supmin;³&sup0;&sup7; zu vervielfältigen, wurde ein Oligonucleotid-Primer, der eine KpnI-Schnittstelle anfügt, für das 5'-Ende des LF-Gens hergestellt und ein zweiter Primer, der eine MIuI-Schnittstelle einführt, wurde für das Ende bei Rest 307 konstruiert. Um LF³&sup8;&sup4;&supmin;&sup7;&sup7;&sup6; zu vervielfältigen, wurde ein dritter Primer, der eine MluI-Schnittstelle hinzufügt, hergestellt und ein vierter Primer, der eine BamHI-Schnittstelle am Ende einführt, bei Rest 776 gemacht. Zwei Vervielfältigungen durch PCR wurden mit den Primern Eins/Zwei und DreiNier mit pLF7 (Robertson und Leppla, 1986) als Vorlage durchgeführt. Die erste Vervielfältigungsreaktion wurde nacheinander mit KpnI und MluI verdaut, und die zweite Vervielfältigungsreaktion wurde mit MluI und BamHI verdaut. Der Expressionsvektor pVEX115f+T wurde getrennt mit KpnI und BamHI verdaut und dephosphoryliert. Alle drei Fragmente wurden aus dem Gel gereinigt, über Nacht bei 16ºC zusammengefügt und in E. coli DH5α transformiert. Die anderen drei Konstruktionen wurden mit Hilfe ähnlicher Strategien hergestellt. Oligonucleotid-Primer Eins und Vier waren gleich für alle vier Konstruktionen, während Primer Zwei und Drei entsprechend verändert wurden. Alle vier Konstruktionen enuialten Met-Val-Pro am Amino-Ende von LF und Thr-Arg an der Stelle, wo die sich wiederholende Region beseitigt wurde.
Um LF-PE-Fusionsproteine zu konstruieren, wurden Fragmente des LF-Gens, die sich vom Amino-Ende, ausgehend über verschiedene Längen, erstreckten, mit dem Plasmid pLF7 (Robertson und Leppla, 1986) als Vorlage mit Hilfe von PCR vervielfältigt, indem ein üblicher, eine KpnI-Schnittstelle an das 5'-Ende anfügende Oligonucleotid-Primer und mutagenisierte, MluI-Schnittstellen an den beabsichtigten neuen 3'-Enden hinzufügende Primer verwendet wurden. Die PCR-Produkte des LF-Gens wurden mit KpnI verdaut, die DNAs wurden gefällt und hinterher mit MluI verdaut. Domänen Ib und III des PE-Gens (geliefert durch David FitzGerald, NCI, NIH) wurden durch PCR vervielfältigt, bei der Primer verwendet wurden, die jeweils MluI- und EcoRI-Schnittstellen an den 5'- und 3'-Enden anfügten. Das PCR-Produkt von PE wurde mit MluI und EcoRI verdaut. In ähnlicher Weise wurde der Expressionsvektor pVEX115f+T mit KpnI und EcoRI verdaut. Sämtliche DNA-Fragmente wurden aus Agarose-Gelen mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt, eine Verbindung von drei Fragmenten wurde durchgeführt, und die Produkte wurden in E. coli DH5a transformiert. Die drei in diesem Beispiel beschriebenen Konstruktionen haben 254, 198 und 79 Aminosäuren von LF, welche mit den PE-Domänen Ib und III verbunden sind. Diese Fusionsproteine sind jeweils als LF¹&supmin;²&sup5;&sup4;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³ (SEQ ID NO: 10), LF¹&supmin;¹&sup9;&sup8;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³, und LF¹&supmin;&sup7;&sup9;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³ bezeichnet. Die Proteine behalten die native Sequenz des Carboxy-Endes von PE, REDLK, bei. Es sollte erwähnt werden, daß diese Abkürzungen nicht den gesamten Aminosäuregehalt der Proteine genau angeben, da alle Konstruktionen auch Met-Val-Pro enthalten, das durch die PCR-Veränderungen an das Amino-Ende der LF-Domäne, angefügt wurde.

Expression und Reinigung von verkürztem LF und Fusionsproteinen:

Rekombinante Plasmide wurden in E. coli SA2821 (geliefert durch Sankar Adhya, NCI, NIH), einer Abart von BL21(λDE3) (Studier und Moffatt, 1986), transformiert, welchem es an den Proteasen, die durch die Ion-, OmpT- und degP- Gene codiert werden, mangelt und der das vom lac-Promotor gesteuerte T-7 RNA-Polymerase-Gen besitzt (Strauch et al., 1989). Transformanten wurden in Super Broth mit 100 pg/ml Ampicillin unter Schütteln mit 225 U/min. 37ºC in 2-1- Kulturen gewachsen. Sobald die A&sub6;&sub0;&sub0; den Wert von 0,8-1,0 erreichte, wurde Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid zu einer Endkonzentration von 1 mM zugefügt, und die Kulturen wurden weitere 2 h lang bebrütet. EDTA und 1,10-o-Phenanthrolin wurden zu einer Endkonzentration von 5 mM beziehungsweise 0,1 mM zugegeben, und periplasmatisches Protein wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen. Die Flüssigkeit der Überstände wurde mit Hilfe von Centriprep-30-Einheiten (Amicon) konzentriert, und Proteine wurden durch Gelfiltration (Sephacryl S-200, Pharmacia-LKB) und Anionenaustausch-Chromatographie (MonoQ, Pharmacia-LKB), wie in Beispiel 1 beschrieben, annähernd zur Homogenität gereinigt. Um den Prozentsatz von Protein voller Länge zu ermitteln, wurden SDS-Gele, die mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt waren, mit einem Laser-Densitometer (Pharmacia-LKB Ultrascan XL) abgetastet. Western-Blots wurden wie vorher beschrieben durchgeführt (Singh et al., 1991).
Die LF-Proteine mit verkürzten Enden und die LF-PE-Fusionsproteine wurden aus periplasmatischen Extrakten gewonnen und durch GelfiItration und Anionenaustausch-Chromatographie annähernd zur Homogenität gereinigt. Die Wanderung der Proteine stimmte mit ihren erwarteten Molekulargewichten überein. Immuno-Blots bestätigten, daß die LF-Proteine mit LF-Antiseren reagierten, und die LF-PE-Fusionsproteine zeigten eine Reaktion mit beiden, LF und PE, Antiseren. Fusionsproteine und am Ende verkürzte LF-Proteine unterschieden sich in ihrer Empfänglichkeit gegenüber Proteolyse, wie nach dem Erscheinungsbild von Peptid-Fragmenten auf den Immuno-Blots beurteilt, und dies spiegelte sich ebenfalls in den verschiedenen Mengen wieder, die von gereinigten Proteinen erhalten wurden. Daher waren die Ausbeuten von gereinigten Proteinen aus 2-1-Kulturen für LF&sup4;¹&supmin;&sup7;&sup7;&sup6;, 39 ug; LF&sup7;&sup9;&supmin;&sup7;&sup7;&sup6;, 32 pg; LF¹&supmin;&sup7;²&sup9;, 50 ug; LF¹&supmin;&sup6;&sup9;³, 46 ug; LF¹&supmin;²&sup5;&sup4;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³, 184 ug; LF¹&supmin;¹&sup9;&sup8;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³, 80 ug; LF¹&supmin;&sup7;&sup9;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³, 127 ug.
Es wurde gefunden, daß im sich wiederholenden Bereich verkürzte LF-Proteine instabil sind und keine Produkte voller Lälge gereinigt werden konnten. Deshalb wurden die Aktivitäten von diesen Proteinen durch Test des periplasmatischen Rohextrakts bestimmt, und Immuno-Blots wurden eingesetzt, um die Menge der vorhandenen Proteine voller Länge abzuschätzen.

Zellgiftigkeit von LF-Proteinen, die an den Enden oder innerhalb verkürzt sind, gegenüber Makrophagen:

Verkürzte LF-Proteine wurden auf funktionale LF-Aktivität an der J774A.1- Makrophagen-Zelllinie in Gegenwart von nativem PA, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. In Kürze, Zellen wurden auf Platten mit 24 oder 48 Vertiefungen in Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM), welches 10% fötales Kälberserum enthielt, überführt und 18 h lang gewachsen. PA (1 pg/ml) und die mutierten LF-Proteine wurden zugegeben, und die Zellen wurden 3 h lang bebrütet. Um die Lebensfähigkeit der behandelten Zellen zu messen, wurde 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu den Zellen zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugegeben. Nach 45 min langer Inkubation wurde das Medium abgesaugt, und Zellen wurden in 90% Isopropanol, 0,5% SDS, 40 mM HCl gelöst und bei 540 nm mit einem UVmax Kinetic Microplate Reader (Molecular Devices Corp.) bestimmt.
Um die Ausdehnung der wesentlichen Sequenzen am Amino-Ende von LF zu bestimmen, wurde die Toxizität von zwei am Amino-Ende verkürzten LF-Proteinen in Kombination mit PA in dem Makrophagen-Lyse-Test bestimmt. Gereinigte LF&sup4;¹&supmin;&sup7;&sup7;&sup6; und LF&sup7;&sup9;&supmin;&sup7;&sup7;&sup6; waren nicht fähig, die J774A.1-Makrophagen-Zellen zu lysieren. Dies deutet darauf hin, daß ein Teil der dem Rest 41 vorausgehenden Sequenz notwendig ist, um ein aktives LF-Protein aufrechtzuerhalten.
Um die Rolle des Carboxy-Endes von LF zu untersuchen, wurden zwei Proteine, die in diesem Bereich gestutzt sind, hergestellt und untersucht. Die Proteine LF¹&supmin;&sup6;&sup9;³ und LF¹&supmin;&sup7;²&sup9; wurden an J774A.1-Zellen getestet und als inaktiv befunden. Es ist anzunehmen, daß dies von einer Inaktivierung der vermeintlichen katalytischen Domäne herrührt.
Um Untersuchungen zur Rolle der sich wiederholenden Region von LF zu beginnen, wurden vier Konstruktionen, die Verkürzungen in diesem Bereich haben, gemacht. Die von diesen Mutanten exprimierten Proteine waren instabil. Von den vier verkürzten Proteinen lieferte nur LF¹&supmin;³&sup0;&sup7;.TR.LF³²&sup7;&supmin;&sup7;&sup7;&sup6; Material, das eine Immunreaktion an der Position zeigte, die für intaktes Fusionsprotein erwartet wurde. Die Menge von intaktem LF¹&supmin;³&sup0;&sup7;.TR.LF³²&sup7;&supmin;&sup7;&sup7;&sup6; war ähnlich zu der von nativem LF, das mit gleichem Vektor exprimiert wurde. Wurden die nicht-gereinigten periplasmatischen Extrakte an J774A.1-Makrophagen getestet, war nur die Konfirolle mit nativem LF toxisch. LF¹&supmin;³&sup0;&sup7;.TR.LF³²&sup7;&supmin;&sup7;&sup7;&sup6; lysierte die Makrophagen auch dann nicht, selbst wenn es in 50-fach höherer Konzentration als das LF-Protein aus dem periplasmatischen Rohextrakt vorhanden war. Schlußfolgerungen bezüglich der Toxizität der anderen drei Konstruktionen können nicht gezogen werden, weil die Fusionsproteine voller Länge nicht in den periplasmatischen Extrakten vorhanden waren.

Zellkultur-Techniken und Bestimmung der Proteinsynthese-Hemmung von Fusionsproteinen:

CHO-Zellen wurden als einlagige Schichten in α-modifiziertem Minimum-Essentiell-Medium (α-MEM), das mit 5% fötalem Kälberserum, 10 mM HEPES (pH 7,3) und Penicillin/Streptomycin ergänzt wurde, unterhalten. Bestimmungen der Proteinsynthese wurden in Platten mit 24 oder 48 Vertiefungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. CHO-Zellen wurden mit PA (0,1 pg/ml) und verschiedenen Konzentrationen von LF behandelt, von dem eine Blockade des Rezeptors erwartet wird. Fusionsproteine wurden in nachfolgend festgesetzten Konzentrationen zugegeben: FP4, 100 ng/ml, FP23, 100 ng/ml, und FP33, 5 ng/ml. Zellen wurden 20 h lang inkubiert und die Hemmung der Proteinsynthese wurde durch Einbau von [³H]-Leucin berechnet.

Zellgiftigkeit von den LF-PE-Fusionsproteinen gegenüber CHO-Zellen:

Die Verwendung von Fusionsproteinen liefert eine besser definierte Methode zur Messung der Translokation von LF, wie in Beispiel 1 dargestellt, wobei gezeigt wurde, daß Fusionen von LF mit Domänen Ib und III von PE hochtoxisch sind. Die Translokation von diesen Fusionen wird leicht gemessen, weil Domäne III die Proteinsynthese durch ADP-Ribosylierung des Elongationsfaktors 2 blockiert. Die neuen Fusionen, die verschiedene Teile von LF, fusioniert an PE- Domänen Ib und III, enthalten, wurden entworfen, um die geringste LF-Sequenz zu identifizieren, welche fähig ist, die Translokation zu fördern. Die EC&sub5;&sub0; von LF¹&supmin;²&sup5;&sup4;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³ (SEQ ID NO: 10) war 1,7 ng/ml, während LF¹&supmin;¹&sup9;&sup8;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³ und LF¹&supmin;&sup7;&sup9;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³ selbst bei einer 1200-fach höheren Konzentration noch keine 50% der Zellen abtöteten. Andere Konstruktionen, die größere Teile von LF fusioniert an PE-Domänen Ib und III enthielten, wurden ebenfalls hergestellt und untersucht, und bei diesen wurde eine Wirksamkeit gleich zu LF¹&supmin;²&sup5;&sup4;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³ gefunden. Diese Ergebnisse zeigen, daß Reste 1-254 sämtliche Sequenzen enthalten, die für Bindung an PA63 wesentlich sind. Die Fusionsproteine haben in der Abwesenheit von PA keine Toxizität, was beweist, daß ihre Aufnahme unbedingt Wechselwirkung mit PA benötigt.

Bindung von Fusionsproteinen und verkürzten LF-Proteinen an PA:

Bindung von LF-Proteinen an Zell-gebundenes PA wurde durch Konkurrenz mit radioaktiv markiertem ¹²&sup5;I-LF bestimmt. Natives LF wurde mit Hilfe des Bolton-Hunter-Reagens radioaktiv markiert (3,1 · 106 cpm/ug Protein). In Bindungsstudien wurde die L6-Ratten-Myoplast-Zelllinie, die ungefähr zweimal so viele Rezeptoren wie die J774A.1-Makrophagen-Linie hat, verwendet (Singh et al. 1989). Der Bequemlichkeit halber wurden Zellen durch ein schonendes Verfahren chemisch fixiert, das die Bindungsaktivität des Rezeptors genauso wie die Fähigkeit der Protease der Zelloberfläche erhält, PA zu spalten, um Rezeptor-gebundenes PA63 zu produzieren. Tests wurden in Platten mit 24 Vertiefungen durchgeführt, wobei Zellen verwendet wurden, die einen Tag vor dem Versuch in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum verbracht wurden. Einlagige Zellschichten wurden zweimal mit Hanks' eingestellter Salzlösung (HBSS), die 25 mM HEPES enthielt, gewaschen und 30 min lang bei 23ºC in 10 mM N-Hydroxysuccinimide und 30 mM 1-Ethyl-3-[3-dimethyl-[aminopropyl]-carbodi imid in Puffer chemisch fixiert, der mM 10 HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2; enthielt. Einlagige Schichten wurden mit HBSS, das 25 mM HEPES enthielt, gewaschen, und der Fixierer wurde durch 30 min lange Behandlung bei 23ºC in DMEM (ohne Serum), das 25 mM HEPES enthielt, inaktiviert. Natives PA wurde in Minimal-Essentiell-Medium zu 1 ug/ml zugegeben, das Hanks'-Salze, 25 mM HEPES, 1% Rinder-Serum-Albumin und eine Gesamtmenge von 4,5 mM NaHCO&sub3; enthielt. Zellen wurden über Nacht bei Raumtemperatur gehalten, um eine Bindung und Spaltung von PA zu ermöglichen. Zellen wurden zweimal in HBSS gewaschen, und mutierte LF-Proteine (0-5000 ng/ml) wurden gemeinsam mit 50 ng/ml ¹²&sup5;I-LF in jede Vertiefung zugegeben. Zellen wurden für weitere 5 h inkubiert, dreimal in HBSS gewaschen, in 0,5 ml 1 N NaOH gelöst und in einem Gammastrahlen-Zähler (Beckman Gamma 9000) gemessen.
Durch Verwendung dieses Tests wurde gefunden, daß mutierte LF-Proteine mit Verkürzungen des Amino-Endes unfähig sind, PA zu binden, was das Fehlen ihrer Toxizität erklärt. Am Carboxy-Ende verkürzte LF-Proteine banden abhängig von ihrer Dosis an PA, obgleich sie leicht geringere Affinität als LF hatten. Die in der sich wiederholenden Region verkürzten Proteine konnten nicht auf ihre Bindungs-Konkurrenz getestet werden, da ihre Instabilität eine Reinigung intakten Proteins verhinderte.
Die EC&sub5;&sub0; für die LF¹&supmin;²&sup5;&sup4;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³-Bindung wurde mit 220 ng/ml festgestellt, was ähnlich der von LF, 300 ng/ml, ist. Die Bindungswerte stehen deshalb gut mit der Toxizität dieser Konstruktion in Beziehung. Im Gegensatz dazu banden weder LF¹&supmin;¹&sup9;&sup8;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³ noch LF¹&supmin;&sup7;&sup9;.TR.PE³&sup6;²&supmin;&sup6;¹³ an PA63 von Zellen, was ein Fehlen ihrer Toxizität erklärt.

Beispiel 3:

Konstruktion von Genen, die PA-Fusionsproteine codieren:

Die Gene, die PA (oder am Carboxy-Ende gestutztes PA, um die Bindung an den PA-Rezeptor aufzuheben) und eine wechselnde Einheit zur Zielrichtung (ein einzelsträngiger Antikörper, Wachstumsfaktor oder andere Zelltyp-spezifische Domänen) codieren, werden unter Einsatz gebräuchlicher molekularbiologischer Techniken zusammengebracht. Das PA-Gen ist leicht verfügbar, und die Gene, welche die verschiedenen Domänen zur Zielrichtung codieren, werden wie unten beschrieben erhalten.
Einzelsträngige Antikörper (sFv):
Siehe Beispiel 4, nachfolgend.

Wachstumsfaktoren und andere Proteine zur Zielrichtung:

Die Nucleotidsequenz von Genen, welche für eine Reihe von Wachstumsfaktoren und anderen Proteinen, die zu spezifischen Zelltypen oder -klassen zielgenau gelenkt werden, sind in frei zugänglichen Datenbanken (z.B. GenBank) aufgeführt, und in vielen Fallen sind die Gene verfügbar. In Fällen, in denen dies nicht der Fall ist, können Gene aus genomischen oder cDNA-Bibliotheken unter Einsatz von Sonden kloniert werden, die auf der Nucleotidsequenz des den Wachstumsfaktor codierenden Gens beruhen oder von einem Teilstück der Aminosäuresequenz des Proteins abgeleitet sind (siehe z.B. Sambrook, wie oben). Eine andere Möglichkeit ist es, die Gene, welche den Wachstumsfaktor oder andere Einheiten zur Zielrichtung codieren, de novo aus chemisch synthetisierten überlappenden Oligonucleotiden unter Verwendung der bevorzugt benutzten Codone des Wirts für die Expression zu produzieren. Zum Beispiel wurde das Gen für den menschlichen Wachstumsfaktor der Haut, Urogastron, ausgehend von der bekannten Aminosäuresequenz von menschlichem Urogastron unter Verwendung der bevorzugten Hefe-Codone synthetisiert. Die klonierte DNA exprimiert mit Steuerung durch den Hefe-GADPH-Promotor und den Hefe-ADH-1-Terminator ein Produkt, das die gleichen Eigenschaften wie natürliches menschliches Urogastron hat. Das Produkt von diesem synthetisierten Gen ist mit dem des natürlichen Urogastron nahezu identisch; der einzige Unterschied besteht darin, daß das Produkt des synthetischen Gens ein Trypto phan als Aminosäure 13 hat, während das andere ein Tyrosin aufweist (Urdea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80 : 7461-7465, 1983).

Expression von PA-Fusionsproteinen:

Sobald konstruiert, wurden Gene, die PA-Fusionsproteine codieren, in Bacillus anthracis exprimiert und rekombinante Proteine durch eine der folgenden Methoden gereinigt: (i) chromatographische Trennung nach Größe; (ii) Afflnitäts- Chromatographie. Im Fall der PA-sFv-Fusionen könnte Affinitäts-Chromatographie an gebundenen Metall-Chelaten die Reinigungsmethode der Wahl sein, weil das Anfügen einer Kette von sechs Histidin-Resten an das Carboxy-Ende von sFv keine abträgliche Wirkung auf die Bindung des Antigens haben wird. Wie in Beispiel 4 demonstriert wird nutzen weitere Methoden zur Expression von PA-Fusionsproteinen ein in vitro auf Lysat basierendes gekoppeltes Transkriptions/Translations-System in Hasen-Reticulocyten aus, von dem nachgewiesen wurde, daß es zusammengesetzte Proteine richtig zurückfalten kann, die aus einem sFv, fusioniert an Diphtheria-Toxin oder Pseudomonas-Toxin, bestehen.

Funktionstest von PA-Fusionsproteinen:

Nach Expression und Reinigung wird die Funktionstüchtigkeit von PA-Fusionsproteinen durch Bestimmung ihrer Fähigkeit, die Proteinsynthese in einer geeigneten Zelllinie in Zusammenwirken mit einem LF-PE-Fusionsprotein zu hemmen, getestet. Bei Verwendung einer PA-anti Human-Transferrin-RezeptorsFv-Fusion als Modell werden die folgenden Eigenschaften untersucht: (i) Spezifität für Zelltypen (Proteinsynthese sollte in Zelllinien, die den menschlichen Transferrin-Rezeptor exprimieren, gehemmt sein, aber nicht in jenen, die das nicht tun); (ii) Unabhängigkeit der Toxizität von der PA-Rezeptor-Bindung (überschüssiges freies PA sollte keine Wirkung auf die Toxizität des PA-sFv/LF-PE- Komplexes haben); (iii) Kompetitive Hemmung durch überschüssigen freien Antikörper (Toxizität sollte in Gegenwart von überschüssigem sFv oder des monoklonalen Antikörpers, von dem er abgeleitet wurde, aufgehoben werden).
Zum Beispiel sind solche Tests in den Beispielen 4 und 5 beschrieben. Diese Untersuchungen und andere Studien werden eingesetzt, um zu bestätigen, daß PA erfolgreich zu einem anderen Rezeptor umgeleitet worden ist, was den Einsatz des vorliegenden auf dem Anthrax-Toxin beruhenden Zelltyp-spezifischen, zellgiftigen Stoffs zur Behandlung von Krankheiten erlaubt.

Beispiel 4:

Herstellung von Fusionsproteinen mit einzelsträngigen Antikörpern:

Reagentien:

Methionin-freie Reagentien für das auf Lysat basierende Hasen-Reticulocyten gekoppelte Transkriptions/Translations-System, rekombinanter Ribonuclease-Inhibitor (rmasin), und vorgefertigte Säulen zur Reinigung von Plasmid- DNA wurden von Promega (Madison, WI) gekauft. Materialien für die Gewebekultur waren von GIBCO (Grand Island, NY) und Biofluids (Rockville, MD). Monoklonaler Antikörper OKT9 wurde von Ortho Diagnostic Systems (Raritan, NJ) gekauft. PCR Reagentien wurden von Perkin-Elmer Cetus Instruments (Norwalk, CT) erhalten, und Restriktions- und Nucleinsäure mofizierende Enzyme (einschließlich M-MLV Reverse Transkriptase) waren von GIBCO-BRL (Gaithersburg, MD). Ein Geneclean Kit für die Zurückgewinnung von DNA aus Agarose-Gelen wurde von BIO 101 (La Jolla, CA) geliefert. Hybridoma mRNA wurde mit Hilfe eines Fast Trak mRNA Isolation Kit (Invitrogen, San Diego, CA) isoliert. Alle Isotope wurden von Du Pont-New England Nuclear (Boston, MA) gekauft, mit Ausnahme von [Adenylat-³²P]-NAD, das von ICN Biomedicals (Costa Mesa, CA) geliefert wurde. Pseudomonas Exotoxin A wurde von List Biologicals (Campbell, CA) erhalten. Oligonucleotide wurden auf einem Doppel- Säulen Milligen-Biosearch Cyclone Plus DNA Synthesizer (Burlington, MA) synthetisiert und mit Hilfe von OPC-Patronen (Applied Biosystems, Foster City, CA) gereinigt. DNA-Vorlagen wurden unter Verwendung eines Sequenase II- Kits (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) durchgeführt und SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) wurde mit 10-20% Gradien ten-Gelen (Daiichi, Tokyo, Japan) durchgeführt. Nach Elektrophorese wurden Gele in 10% Methanol/7% Essigsäure fixiert und in Autoradiographie-Verstärker (Amersham Arlington Heights, IL) durchweicht. Nach Trocknen wurde Autoradiographie unter Verwendung von X-OMAT AR2-Filmen (Eastman Kodak, Rochester, NY) über Nacht durchgeführt.

Plasmide:

Der Vektor pET-11d ist bei Novagen, Inc., Madison, WI, erhältlich. Plasmide wurde im E. coli-Stamm XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) aufrechterhalten und vermehrt.

Zelllinien:

K562, eine aus Erythroleukämie des Menschen abgeleitete Zelllinie [ATCC CCL 243], ist bekannt dafür, hohe Mengen des menschlichen Transferrin-Rezeptors an der Zelloberfläche zu exprimieren und wurde in RPMI-1640-Medium, das 24 mM NaHCO&sub3;, 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin, 1 mM Natrium-Pyruvate, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren und 10 pg/ml Gentamycin enthielt, kultiviert. Eine Linie aus Niere des African Green Monkey, Vero (ATCC CCL 81), wurde in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) gewachsen, das wie oben aufgezeigt ergänzt wurde. OKT9 Hybridoma (ATCC CRL 8021), die einen MoAb (IgG&sub1;) produziert, der mit dem menschlichen Transferrin-Rezeptor reagiert, wurde in Iscove's modifiziertem Dulbecco's Medium, das zusätzlich zu den oben beschriebenen Ergänzungen 20% fötales Kälberserum enthielt, aufrechterhalten. Sämtliche Zelllinien wurden bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; kultiviert.

Konstruktion von sFv ausgehend von Hybridomas:

VL- und VH-Gene von Antikörpern wurden mit Hilfe einer Abwandlung einer früher beschriebenen Technik kloniert (Larrick et al. Biotechniques 7 : 360, 1989; Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86 : 3833, 1989; Chaudhary et al., 1990). In Kürze, mRNA wurde aus Hybridoma Zellen, die 1 · 10&sup8; Antikörper produzierten, isoliert und ungefähr 3 ug wurden mit M-MLV-Reverse-Transkriptase revers transkribiert, wobei zufällige Hexanucleotide als Primer verwendet wurden. Die erhaltene cDNA wurde mit zwei Sätzen von PCR Primer-Paaren durchmustert, die entworfen wurden, um zu ermitteln, aus welcher Kabat- Genfamilie die schweren und leichten Ketten abgeleitet wurden (Kabat et al., Sequences of proteins of lmmunological interest., Fifth Edition. (Bethesda, Maryland: U.S. Public Health Service, 1991). Sobald das Primer-Paar mit der größten Wirkung identifiziert war, wurden cDNA's, die für VL und VH codieren, zusammengesetzt, getrennt durch einen Bereich, der 15 Aminosäuren als Peptid-Verbindung codiert, mit Hilfe einer früher beschriebenen PCR-Technik, die als Gen-Zusammensetzung durch Überlapp-Verlängerung (SOE) bekannt ist (Johnson & Bird, Methods Enzymol., 203: 88, 1991). Das sFv-Gen wurde dann in korrektem Leseraster und auf der 5'-Seite des PE40 Gens in pET-11d kloniert, so daß die Expression der Konstruktion ein sFv-PE40-Fusionsprotein von ungefähr 70 kDa Größe erzeugen sollte.

Entwurf von Primern für PCR-Vervielfältigung der Gene der V-Region:

Der erste und der dritte die Komplementarität bestimmende Bereich (CDRs) der Gene für die variable Region von endständig neu geordneten lmmunoglobulinen ist von konservierten Sequenzen flankiert (der erste Rahmenbereich FR1 auf der 5'-Seite von CDR1 und der vierte Rahmenbereich FR4 auf der 3'-Seite von CDR3).
Obwohl mit nur zwei Paaren von hoch degenerierten Primern (ein Paar für VL und ein anderes Paar für VH) Gene der variablen Region ohne Rücksicht auf ihre Familie erfolgreich aus Maus kloniert wurden (Gussow et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 54 : 265,1989; Orlandi et al., 1989; Chaudhary et al., 1990; Batra et al., 1991), ist die Methode möglicherweise unwirksam in Fällen, in denen die Anzahl von nicht passenden Basenpaaren zwischen Primern und der Zielsequenz hoch ist. Dieses im Sinn, liefert die vorliegende Erfindung unter Einsatz der Kabat-Datenbank von Sequenzen der V-Gene aus Maus ei nen Satz von zehn von FR1 abgeleiteten Primern (sechs für Vl und vier für VH), in der Weise, daß jede der zufällig ausgewählten Sequenzen der Datenbank höchstens drei nicht passende Basenpaare mit dem am stärksten homologen Primer haben würde. Dieser Satz von Primern kann wirksam eingesetzt werden, um die Gene der V-Region von einer Reihe der MoAb ausscheidenden Zeillinien zu klonieren.

Zusammenbau des OKT9 sFv-Gens:

mRNA, die aus dem OKT9 MoAb ausscheidenden Hybridoma isoliert wurde, wurde wie vorher beschrieben in cDNA umgewandelt (Larrick et al., 1989; Orlandi et al., 1989; Chaudhary et al., 1990). Trotz der Tatsache, daß CL-UNI in jedem Fall das Partner-Oligonucleotid ist, wird ein Produkt der benötigten Größe (ungefähr 400 bp) von den VL-Primern LV/VI, IIa oder IIb nicht produziert. Dies läßt darauf schließen, daß nicht passende Basenpaare zwischen diesen Primern und der Zielsequenz zu häufig sind, um eine wirksame Vervielfältigung zu erlauben. Ein ähnliches Argument kann benutzt werden, um den Fehlschlag zu erklären, mit den VH-Primern I und III das gewünschte Produkt herzustellen. Es ist klar, daß die Primer VL-I/IhI und VH-V am wirksamsten sind, die jeweiligen OKT9 VL- und VH-Gene zu vervielfältigen. Durch PCR vervielfältigte OKT9 VL- und VH-Gene wurden mit Hilfe der SOE-Technik zusammengebaut, wie zuvor beschrieben wurde (Johnson & Bird, 1991). Eine synthetische DNA-Sequenz, die eine Verbindung aus 15 Aminosäuren codiert, wurde zwischen die variablen Bereiche gesetzt; diese Verbindung wurde sehr wirkungsvoll in der Produktion von funktionstüchtigen sFv eingesetzt (Huston et al., 1991; Johnson & Bird, 1991) und scheint es den variablen Ketten zu erlauben, die optimale Ausrichtung zur Antigen-Bindung einzunehmen. Nach Zusammenbau der Gene des V- Bereichs durch das SOE-Verfahren, ließ man das DNA-Fragment, welches OKT9 sFv codiert, mit Elektrophorese durch ein 1,5% Agarose-Gel wandern, reinigte es durch die Geneclean-Technik, verdaute es mit dem geeigneten Paar von Restriktionsenzymen und klonierte es im korrektem Leseraster und auf der 5' Seite des PE40-Gens in den pET-11 d-Expressionsvektor.

In vitro-Expression von sFv-PE40-Fuionsproteinen:

Plasmidvorlagen wurden mit Hilfe des auf Lysat basierenden Hasen- Reticulocyten-Transkriptions/Translations-Systems, entsprechend den Anweisungen des Herstellers, transkribiert und translatiert, und in Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen wurden L-[³&sup5;S]-Methionin markierte Proteine (zur Analyse durch SDS-PAGE) und nicht-markierte Proteine (für enzymatische Untersuchungen und biologische Tests) unter ähnlichen Bedingungen produziert, mit der Ausnahme, daß im letzten Fall Isotop durch 20 ml nicht-markiertes L-Methionin ersetzt wurde. Kontroll-Lysat wurde durch Zugabe aller Reagentien, mit Ausnahme der Plasmids DNA, produziert. Nach Translation wurden nicht-markierte Proben über Nacht bei 4ºC gegen mit Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS), pH 7,4 in Spectra/Por 6 MWCO (molecular weight cutoff) 50.000 tubing (Spectrum, Houston, TX), dialysiert.
Konstruktionen, die das abweichende Kappa-Transkript tragen, werden ein Translations-Stop-Codon in der VL-Kette enthalten, wie zuvor beschrieben, und deshalb wäre zu erwarten, daß sie ein Translations-Produkt von ungefähr 12 kDa Größe erzeugen. Andererseits enthalten Konstruktionen, die das produktive VL-Gen tragen, nicht solch ein Stop-Codon, und ein Fusionsprotein voller Länge (ungefähr 70 kDa Größe) sollte erzeugt werden.
In vitro-Expressionsanalysen wurden eingesetzt, um die Größe des Proteins, das durch das OKT9 sFv-PE40-Gen codiert wird, zu bestimmen. Die in diesem Experiment analysierten Konstruktionen produzieren eindeutig ein Protein von etwa 70 kDa, was darauf hinweist, daß die Klone keine abweichenden VL-Gene enthalten und frei von Mutationen des Leserasters sind. Von den verschiedenen analysierten OKT9 sFv-Konstruktionen, trägt offenbar keines das nicht korrekte VL-Gen. Im Fall eines anderen sFv, der durch dieses Verfahren erzeugt wurde (1 B7 sFv, abgeleitet von einem MoAb, der ein Pertussis-Toxin bindet), produzierten jedoch die Mehrzahl der Klone ein 12 kDa-Protein, und durch DNA-Sequenzierung wurde gefunden, daß sie das abweichende Transkript enthalten. Es sollte erwähnt werden, daß das 12 kDa-Fragment in 10-20% Gradienten-Gelen häufig durch nicht eingebautes ³&sup5;S-Methionin, welches auf gleicher Höhe wie die Front des Farbstoffs wandert, verdeckt wird.

Bestimmung der Proteinkonzentration:

Die enzymatischen Aktivitäten von Fusionsproteinen wurden mit denen bekannter Konzentrationen von PE in einem ADP-Ribosyl-Transferase-Test verglichen, was es erlaubt, Molaritäten zu bestimmen (Johnson et al., J. Biol. Chem., 263: 1295-1399, 1988). Proben wurden so eingestellt, daß sie die gleichen Konzentrationen von Lysat enthalten; deshalb wurde eine identische Menge von Substrat (Elongations-Faktor 2) in allen Fällen aufrechterhalten.

Bestimmung der Proteinsynthese-Hemmung für funktionstüchtige sFv-PE40- Bindung:

Die Bindung des OKT9 sFv an den menschlichen Transferrin-Rezeptor wurde qualitativ bestimmt, indem die Fähigkeit des OKT9 sFv-PE40-Fusionsproteins, die Proteinsynthese in der K562-Zelllinie zu hemmen, beurteilt wurde. Pseudomonas Exotoxin A ist ein bakterielles Protein, daß fähig ist, de novo Proteinsynthese in einer Vielzahl von eukariontischen Zelltypen zu hemmen. Das Toxin bindet an die Zelloberfläche und wird letztlich in das Zytoplasma aufgenommen, wo es den Elongations-Faktor 2 enzymatisch inaktiviert. PE40 ist eine mutierte Form von Exotoxin A, der eine Bindungsdomäne fehlt, ist aber enzymatisch aktiv und zur Aufnahme fähig. Fusionsproteine, die PE40 und eine wechselnde Bindungsdomäne (zum Beispiel einen sFv gegen einen Rezeptor der Zelloberfläche) enthalten, werden die Proteinsynthese in einer geeigneten Zelllinie nur hemmen, wenn der sFv an das Antigen der Zelloberfläche bindet, welches nachfolgend in ein angesäuertes Endosom aufgenommen wird (Chaudhary et al., 1989). Der TfnR ist solch ein Antigen, daher könnte eine qualitative Beurteilung der Bindung durch Messung der Fähigkeit des OKT9 sFv-PE40-Fusionsproteins bestimmt werden, die Proteinsynthese in einer Zelllinie wie K562, die den TfnR exprimiert, zu hemmen. Bestimmungen der Proteinsynthese- Hemmung wurden wie vorher beschrieben durchgeführt (Johnson et al., 1988).
In Kürze, Proben wurden fortlaufend in eiskaltem PBS, 0,2% BSA verdünnt, und ein Volumen von 11 ul wurde zu der entsprechenden Vertiefung auf einer Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben (enthaltend 104 ZelIen/l OOpl/Vertiefung in Leucin-freiem RPMI 1640). Nach vorsichtigem Durchmischen des Inhalts von jeder Vertiefung wurde die Platte für die erforderliche Zeit bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; bebrütet. Jede Vertiefung wurde dann mit 20 ul von L-[¹&sup4;C(U)J-Leucin (0,1 uCi/20 ml) versetzt, eine Stunde bebrütet und auf Glasfiber-Filtern mit Hilfe eines PHD-Zell-Ernters (Cambridge Technology, Cambridge, MA) geerntet. Ergebnisse werden als Prozent des Isotop-Einbaus in Zellen, die mit geeigneten Konzentrationen von dialysierten Kontroll-Lysaten behandelt wurden, ausgedrückt.
Die Ergebnisse dieses Tests weisen eindeutig darauf hin, daß OKT9 sFv-PE40 fähig ist, die Proteinsynthese zu hemmen mit einer IC&sub5;&sub0; (die Konzentration eines Stoffs, welche die Proteinsynthese um 50% hemmt) von ungefähr 2 · 10&supmin;&sup9; M. Die Toxizität des Fusionsproteins, aber nicht von PE, war in der Gegenwart von überschüssigem OKT9 MoAb (12 ug/ml) aufgehoben, was darauf hinweist, daß die Bindung spezifisch für TfnR ist. Es wurde keine Toxizität beobachtet, wenn K562 durch Vero (eine African Green Monkey-Zelllinie, welche die Simian-Version des Transferrin-Rezeptors exprimiert) ersetzt wurde, was anzeigt, daß OKT9 sFv die für den menschlichen Rezeptor spezifischen Bindungseigenschaften für Antigene des elterlichen Antikörpers beibehält.
Da die Bindung von OKT9 sFv an TfnR bewiesen war, wurde seine Nucleotidsequenz mit Hilfe von Dideoxynucleotid-Ketten-Abbruch-Techniken bestimmt, was eine ausgedehnte Homologie mit den jeweiligen Regionen von lmmunoglobulinen mit bekannter Sequenz bestätigte.

Beispiel 5:

Charakterisierung von einzelsträngigen Antikörper (sFv)-Toxin-Fusionsproteinen, die in vitro in Lysat von Hasen-Reticulocyten produziert wurden:
Die vorliegende Erfindung liefert die in vitro-Produktion von Proteinen, die eine Toxin-Domäne (abgeleitet von Diphtheria-Toxin (DT) oder PE), fusioniert an eine Domäne, die einen gegen den menschlichen Transferrin-Rezeptor (TfnR) gerichteten einzelsträngigen Antikörper codiert, enthalten. Die Expression von diesem Antigen auf der Zelloberfläche ist gleichgeordnet mit dem Zellwachstum reguliert; TfnR zeigt ein begrenztes Expressionsmuster in normalen Geweben, ist aber in Karzinomen und Sarkomen weit verbreitet (Gatter, et al., J. Clin. Pathol., 36 : 539-545, 1983), und ist daher möglicherweise ein geeignetes Ziel für auf Immuno-Toxin beruhenden therapeutischen Strategien (Johnson, V.G. und Youle, R.J. "Intracellular Trafficking of Proteins" Cambridge Univ. Press, Cambridge England, Steer und Hover eds., pp. 183-225; Batra et al.; 1991; Johnson et al., 1988).
Proteine, die aus einer Fusion zwischen einem sFv, der gegen den TfnR gerichtet ist, und entweder den 40 kDa des Carboxy-Endes von PE, oder der DT- Mutante CRM 107 [S(525)F] bestehen, wurden in Lysaten von Hasen-Reticulocyten exprimiert, und es wurde gefunden, daß sie spezifisch gegenüber K562, einer Zelllinie, die bekannterweise TfnR exprimiert, zellgiftig sind. Im Vergleich zeigte ein zusammengesetztes Protein, das aus einer Fusion zwischen einer zweiten DT-Mutante, DTM1 [S(508)F, S(525)F], und dem E6 sFv besteht, bedeutend geringere Zellgiftigkeit. Auferlegte rechtliche Beschränkungen der Beeinflussung von Toxin-Genen in vivo verhinderten früher die Expression von möglichen interessanten Fusionsproteinen, die Toxine enthalten (Federal Register, 51(88) (III): 16961 und Anhang F: 16971); die vorliegende Erfindung liefert ein neues Verfahren für in vitro-Konstruktion von Genen und eine den vorschriftsmäßigen Erfordernissen genügende Expression, was die erste Analyse der Möglichkeiten von nicht-gestutzten DT-Mutanten in Fusionsproteinen lTs erleichterte. Die vorliegenden Daten beweisen auch, daß funktionstüchtige rekombinante Antikörper in vitro erzeugt werden können.

Reagentien:

DT und PE wurden von List Biologicals (Campbell, CA) gekauft. Nuclease-behandeltes, Methionin-freies Hasen-Reticulocyten-Lysat und rekombinanter Ribonuclease-Inhibitor (rmasin) wurden von Promega (Madison, WI) erhalten. Materialien für die Gewebekultur waren von GIBCO (Grand Island, NY) und Biofluids (Rockville, MD). Reagentien für PCR wurden von Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT) geliefert. Restriktions- und Nucleinsäure mofizierende Enzyme waren von Stratagene (La Jolla, CA), wie das mCAP Kit, das verwendet wurde, um mRNA in vitro zu produzieren. Geneclean und RNaid Kits (jeweils für die Reinigung von DNA und RNA) wurden von BIO 101 (La Jolla, CA) geliefert. L-[³&sup5;S]-Methionin, L-[¹&sup4;C(U)]-Leucin und 5'-(alpha-thio)-[³&sup5;S]-dATP waren von New England Nuclear (Boston, MA). [Adenylat-³²P]-NAD wurde von ICN Biomedicals (Costa Mesa, CA) geliefert.

Oligonucleotid-Synthese:

Oligonucleotide wurden unter Einsatz von durch Milligen-Biosearch (Burlington, MA) gelieferten Cyanoethylphosphoramiditen auf einem Doppel-Säulen Milligen-Biosearch Cyclone Plus DNA Synthesizer synthetisiert (0,2 uM-Maßstab). Reinigung nach Synthese wurde durch Verwendung von OPC Patronen (Applied Biosystems, Foster City, CA) erreicht.

Plasmide:

pET-11d war eine großzügige Gabe von Dr. F. William Studier, Brookhaven National Laboratory (Upton, NY). pHB21-PE40, ein Abkömmling von pET-11d, der das Gen für PE40 enthält, wurde freundlicherweise von Dr. David FitzGerald (NIH, Bethseda, MD) geliefert. Alle Plasmide wurden im E. coli-Stamm XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) aufrechterhalten und vermehrt.

Zellinien:

Corynebacterium diphtheriae-Stamm C7s(β)tox+ (ATCC 27012) wurde von dem ATCC (Rockville, MD) erhalten und der Stamm, der die DT-Mutante CRM 103, deren Bindung unzulänglich ist, produziert, war eine großzügige Gabe von Dr. Neil Groman, University of Washington (Seattle, WA). Beide Stämme wurden in LB Broth vermehrt. K562 (eine aus Erythroleukämie des Menschen abgeleitete Zelllinie, ATCC CCL 243) wurde in RPMI 1640 Medium kultiviert, das 24 mM NaHCO&sub3;, 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren und 10 pg/ml Gentamycin enthielt. Vero (eine Linie aus der Niere des African Green Monkey, ATCC CCL 81), wurde in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium gewachsen, das wie oben aufgezeigt ergänzt wurde. Sämtliche eukariontischen Zellen wurden bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; kultiviert.

Zusammensetzung von Genen mit Hilfe von PCR:

Mit Hilfe einer früher beschriebenen PCR-Technik, die als Gen-Zusammensetzung durch Überlapp-Verlängerung (SOE) bekannt ist (Horton et al., Gene, 77: 61-68, 1989; Horton et al., Biotechniques, 8: 528-535, 1990), wurden Gene, die VL und VH von Antikörpern codieren, getrennt durch einen Bereich, der 15 Aminosäuren als Peptid-Verbindung codiert, zusammengesetzt. Für Untersuchungen, die in vitro-Expression von PCR-Produkten benötigen, wurden von tox-Genen abgeleitete Fragmente durch Einsatz einer ähnlichen Methode ohne Verwendung von Restriktionsenzymen mit solchen, die sFv codieren, verbunden.

Konstruktion von Plasmiden, die Toxin-sFv-Fusionsproteine codieren:

Das für PE40 codierende Gen wurde als ein Teilstück in pET-11d erhalten und das sFv-Gen wurde auf die 5'-Seite von diesem Teilstück, wie aufgezeigt, kloniert. Um das Gen, welches für die DT-Mutante der Bindungsstelle, DTM1 [S(508)F, S(525)F], codiert, zu klonieren, wurde genomische DNA von dem C. diphtheriae-Stamm, der CMR 103 produziert, isoliert. DNA wurde durch ein abgewandeltes Cetyltrimethylammoniumbromid-Extraktions-Verfahren gewonnen (Wilson, K. "Current Protocols in Molecular Biology", AsubeJ et al. eds. John Wiley & Sons, New York, 2.4.1-2.4.5, 1988) und einer Vervielfältigung durch PCR mit 20 Zyklen unterworfen. Primer wurden entworfen um: (i) den 1605 bp-Bereich, der CRM 103 codiert, zu vervielfältigen, begleitend wird das Codon an Position 525 von TCT zu TTT mutiert, und (ii) Restriktionsschnittstellen, welche zur Klonierung geeignet sind, einzuführen. Dadurch wurden die Mutation, die in CRM 107 und CRM 103 vorhanden waren, in einem einzigen Gen kombiniert.

In vitro-Transkription von DNA-Vorlagen:

Zur Transkription benötigen DNA-Vorlagen direkt vor dem Gen von Interesse einen T7 RNA-Polymerase-Promotor (Oakley, J. L. und Coleman, J. E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74: 4266-4270, 1977). Angenehmerweise war solch ein Promotor in pET-11d vorhanden (Studier et al., Enzymol., 185: 60-89, 1990). Im Fall von PCR-Produkten wurde der Primer der 5'-Seite (ein 57-mer, T7-DT) eingesetzt, um alle der Elemente einzuführen, die für in vitro-Transkriptionl Translation notwendig sind. T7-DT beinhaltet einen consensus T7 RNA- Polymerase-Promotor zusammen mit den ersten sieben Codonen des fertigen DT (Greenfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80 : 6853-6857, 1983), dem direkt ein ATG-Translations-Start-Codon in der optimalen Kozak-Umgebung vorangeht (Kozak, M., J. BioJ. Chem., 266: 19867-19870, 1991). RNA mit m¹G(5')ppp(5')G-Cap wurde durch Transkription von linearisierten Plasmiden oder PCR-Produkten unter Verwendung eines mCAP-Kits, entsprechend dem Protokoll des Herstellers, produziert. Vor der Translation wurde RNA mit Hilfe eines RNaid-Kits gereinigt, in Nuclease-freiem Wasser wieder aufgenommen und durch Formaldehyd-Gel-Elektrophorese analysiert.

In Vitro-Expression von Fusionsproteinen:

Mit L-[³&sup5;S)-Methionin markierte Proteine (zur Analyse durch SDS-PAGE) wur den aus RNA mit Cap in Methionin-freiem, Nuclease-behandeltem Hasen- Reticulocyten-Lysat entsprechend den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Nicht-markierte Proteine (für biologische Tests) wurden unter ähnlichen Bedingungen mit der Ausnahme, daß 20 uM nicht-markiertes L-Methionin das lsotop ersetzten, produziert. Kontroll-Lysat wurde durch Zugabe aller Reagentien, mit Ausnahme der exogenen RNA, produziert. Nach Translation wurden Proben über Nacht bei 4ºC gegen PBS, pH 7,4 in Spectra/Por 6 MWCO 50.000 tubing (Spectrum, Houston, TX), dialysiert.
Vor Transkription wurden Plasmide an der BglII-Schnittstelle linearisiert und mit Proteinase K behandelt, um Ribonucleasen, die möglicherweise die Probe kontaminieren, zu zerstören. Nach Ausschütteln mit Phenol/Chloroform und Fällung durch Ethanol wurde die DNA in Nuclease-freiem Wasser gelöst, so daß eine Konzentration von ungefähr 0,2 ug/ul erreicht wurde. RNA mit m&sup7;G(5')ppp(5')G-Cap wurde durch T7 RNA-Polymerase unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen synthetisiert, und seine Vollständigkeit wurde durch Formaldehyd-Gel-Elektrophorese bestätigt. RNA mit Cap wurde mit käuf lich erhältlichem Hasen-Reticulocyten-Lysat entsprechend den Anweisungen des Herstellers translatiert. Auf dem Gel ist es eindeutig, daß die Hauptbande in jedem Fall ein Molekulargewicht hat, das dem des Proteins von Interesse entspricht, und daß relativ große Moleküle (ungefähr 120 kDa im Fall von DTM1-E6 sFv-PE40) in dem Lysat mit Hilfe der beschriebenen Bedingungen synthetisiert werden können.
Unmittelbar nach Translation wurden die Proben über Nacht bei 4ºC ausgiebig gegen PBS, pH 7,4 dialysiert. Der Dialyse-Schritt stellte sich als notwendig heraus, da nicht-dialysiertes Hasen-Reticulocyten-Lysat einen Einbau von bedeutend geringeren Mengen von ¹&sup4;C-Leucin, wie bestimmt durch Hemmung der Proteinsynthese in allen getesteten Zelllinen, zur Folge hat. Nachdem die Konzentration des neu synthetisierten Proteins mit Hilfe eines Standardtests zur Messung der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität (Johnson et al., 1988) bestimmt worden war, wurde sofort die zellgiftige Aktivität der Proben ermittelt.

ADP-Ribosyltransferase-Test:

Die enzymatische Aktivität (und deshalb Molarität) von Fusionsproteinen wurde durch Vergleich mit DT- oder PE-Standardkurven wie zuvor beschrieben ermittelt (Johnson et al., 1988). Geeignete Volumina von Kontroll-Lysat wurden zu jeder Probe der Standardkurve zugegeben, um das Vorhandensein von bedeutenden Mengen von EF-2 in Reticulocyten-Lysat zu kontrollieren.

Andere Methoden:

SDS-PAGE wurde wie früher beschrieben (Laemmli, U.K. Nature, 227: 680-685, 1970) mit Hilfe von 10-20% Gradienten-Gelen (Daiichi, Tokyo, Japan) durchgeführt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden Gele für 15 Minuten in 10% Methanol, 7% Essigsäure fixiert und dann in Autoradiographie-Verstärker (Amersham Arlington Heights, IL) 30 min lang durchweicht. Nach dem Trocknen wurde die Autoradiographie über Nacht unter Verwendung von X-OMAT AR2-Filmen (Eastman Kodak, Rochester, NY) in Abwesenheit von Verstärkerfolien durchgeführt. Sequenzierung mit Dideoxynucleotid-Ketten- Abbruch mit doppelsträngiger DNA als Vorlage wurde unter Einsatz eines Sequenase II-Kits (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH), entsprechend dem Protokoll des Herstellers, durchgeführt.

ZelIg iftigkeit von Toxin-sFv-Fusionsproteinen, die in Reticulocyten-Lysaten exprimiert sind:

Die zellgiftige Aktivität von Fusionsproteinen wurde durch ihre Fähigkeit, die Proteinsynthese in geeigneten Zelllinien (z.B. K562) zu hemmen, ermittelt. Bestimmungen wurden wie vorher beschrieben durchgeführt (Johnson et al., 1988). In Kürze, Proben wurden fortlaufend in eiskaltem PBS, 0,2% BSA verdünnt, und ein Volumen von 11 ul wurde zu der entsprechenden Vertiefung auf einer Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben (enthaltens 104 ZellenNertiefung in Leucin-freiem RPMI 1640). Nach vorsichtigem Durchmischen des Inhalts jeder Vertiefung wurde die Platte für die erforderliche Zeit bei 37ºC in einer befeuch- teten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; bebrütet. Jede Vertiefung wurde dann mit 20 ul L-[¹&sup4;C(U)]-Leucin (0,1 uCi/20 ul) versetzt, eine Stunde bebrütet und auf Glasfiber-Filtern mit Hilfe eines PHD Zell-Ernters (Cambridge Technology, Cambridge, MA) geerntet. Ergebnisse wurden als Prozentsatz des Isotop-Einbaus in Zellen, die mit geeigneten Konzentrationen von dialysierten Kontroll-Lysaten behandelt wurden, ausgedrückt.
Die Ergebnisse der Bestimmung der Hemmung der Proteinsynthese weisen eindeutig darauf hin, daß PE40-enthaftende Fusionsproteine, die in zellfreien Reticulocyten-Lysaten synthetisiert wurden, hoch toxisch gegenüber dieser Zelllinie sind (IC&sub5;&sub0; 1 · 10&supmin;¹&sup0; M). Im Gegensatz dazu war DTM1-E6 sFv wenigstens 10-fach weniger toxisch gegenüber K562 als das PE40-enthaltende Fusionsprotein trotz der Tatsache, daß es eine ADP-Ribosyltransferase-Aktivität aufwies, die von jener von wt DT, das von einer gleichen Menge von RNA in einer identischen Reticulocyten-Lysat-Mischung synthetisiert wurde, ununterscheidbar war. Da die verminderte Toxizität von DTM1-E6 sFv eindeutig nicht von einem Mangel der enzymatischen Aktivität herrührt, ist der Bindungs- und/oder Translokations-Prozess beteiligt. Mögliche Mechanismen, durch die eine sFv-Antigen-Wechselwirkung gehemmt werden könnte, beinhalten: (i) fehlerhafte Faltung der sFv-Domäne oder (ii) räumliche Wechselwirkungen mit anderen Bereichen des Fusionsproteins, die eine enge Verbindung von sFv mit dem TfnR verhindern. Es ist interessant, daß ein dreiteiliges Protein, DTM1-E6 sFv-PE40 eine bedeutsame Zellgiftigkeit gegenüber K562 hatte (IC&sub5;&sub0; bei etwa 1 · 10&supmin;¹&sup0; M, ähnlich zu der von PE40-E6 sFv) und die toxische Wirkung eindeutig durch den TfnR vermittelt wurde, da diese Aktivität durch die Zugabe von E6 Mab im Überschuß blockiert wurde. Obwohl es möglich ist, daß die Einbeziehung der PE40-Einheit am Carboxy-Ende von dem dreiteiligen Molekül eine bedeutende Konformationsänderung in den näher am Amino-Ende gelegenen Domänen zur Folge hat, scheint es unwahrscheinlich zu sein, daß die sFv-Bindungsdomäne fehlerhaft von DTM1-E6 gefaltet ist oder für eine Wechselwirkung mit dem TfnR nicht zugänglich ist. Wechselwirkungen von DTM1-E6 sFv mit der Zelloberfläche könnten in einem direkten Bindungstest (Greenfield et al., Science, 238 : 536-539, 1987) gemessen werden, aber diese Studien wur den im Rahmen dieser Untersuchung nicht durchgeführt. Trotzdem scheint es wahrscheinlich, daß die fehlende Toxizität des DTM1-E6 sFv-Fusionsproteins auf einem Mangel in seiner Translokations-Funktion beruht.
Das entwickelte Expressionssystem ist schnell und einfach und erleichtert die Handhabung einer Anzahl von Proben zur gleichen Zeit. Es werden keine komplizierten Verfahren der Protein-Reinigung oder -Rückfaltung benötigt, und die Methode kann zur Expression von Proteinen eingesetzt werden, die auf Grund der Einschränkungen, die der Handhabung von Toxin-codierenden Genen auf erlegt sind, nicht mit Hilfe von eher herkömmlichen Techniken produziert werden könnten. Die Technik ist ideal für die Feststellung, ob ein neuer sFv für IT- Entwicklung geeignet ist; es ist theoretisch möglich, das für sFv codierende Gen (und jenes, das den IT selbst codiert) durch Zusammensetzen von PCR- Produkten, die direkt aus dem Hybridoma stammen ohne die Notwendigkeit zur Klonierung zu erstellen. Dies würde die Auswahl von den vielversprechendsten Molekül-Kandidaten erleichtern, bevor beträchtliche Anstrengungen und Kosten in die Protein-Produktion und -Reinigung im großen Maßstab investiert werden. Toxine und Toxin-enthaltende Fusionsproteine beweisen sich als große Hilfe für unser Verständnis der Rezeptor-vermittelten Endocytose und des intrazellulären Transportes und liefern wertvolle Einsicht in die normalen Funktionen der Zelle (rezensiert in ref. 2). Die beschriebene Methode vereinfacht die Erzeugung von solchen Molekülen und erleichtert ihre Produktion und Verwendung in Laboratorien, in denen die Anwendung von eher gebräuchlichen Expressionsmethoden nicht durchführbar wäre.

Beispiel 6:

Kassetten-Mutagenese zur Produktion von PAHIV-Mutanten:

Drei DNA-Stücke werden miteinander verbunden. Teil A besitzt Vektorsequenzen und codiert die "vordere Hälfte" (5'-Ende des Gens) des PA-Proteins, B ist ein kurzes DNA-Stück (hier erwähnt als eine Kassette) und codiert ein kleines Mittelstück des PA-Proteins und Teil C, welches die "hintere Hälfte" (3'-Ende des Gens) von PA codiert.
PA mit wechselnden HIV-1-Schnittstellen wurde durch ein Kassetten-Mutagenese-Verfahren hervorgebracht. Acht Deoxyoligonucleotide wurden für die Konstruktion der Kassetten, die für die jeweils entworfene Aminosäuresequenz codierten, synthetisiert. Alle vier Kassetten wurden durch Anlagerung von zwei synthetischen Oligonucleotiden (Primern) erzeugt.
Der unterstrichene Bereich jeder Proteinsequenz wird von der HIV-1-Protease erkannt und geschnitten.
Primer-Paar 1 codiert eine Proteinsequenz, die einen Teil von der Spaltungsstelle, die zwischen dem mit der Membran verbundenen Protein und dem Capsid-Protein gefunden wird, verdoppelt.
Primer-Paar 2 codiert eine Proteinsequenz, die einen Teil von der Spaltungsstelle zwischen dem Capsid- und dem Nucleocapsid-Protein verdoppelt.
Primer-Paar 3 codiert eine Proteinsequenz, die einen Teil von der Spaltungs stelle zwischen der Protease und dem p6-Protein verdoppelt. Wie die Protease ist p6 ein Teil von dem großen Protein, welches durch das HIV produziert wird.
Primer-Paar 4 codiert eine Proteinsequenz, die durch die Protease gespalten werden sollte. Es wurde durch Untersuchung mehrerer Proteinsequenzen, die durch die HIV-Protease erkannt werden, geschaffen und verwendet die gemeinsamen Reste von jeder Sequenz. Glycinreste wurden an jedes Ende angefügt, um das Molekül biegsamer zu machen.
Die mutagenisierten Kassetten wurden mit dem BamHI/BstBI-Fragment von Plasmid pYS5 und dem PpuMI-BamI-II Fragment von Plasmid pYS6 verbunden. Plasmide, welche die richtigen Restriktions-Kartierungen zeigten, wurden in den E. coli dam- dcm- Stamm GM2163 (erhältlich von New England Bio-Labs, Beverly, MA) transformiert. Nicht-methylierte Plasmid-DNA von jeder Mutante wurde gereinigt und zur Transformation von B. anthracis eingesetzt. Zu den Methoden siehe Klimpel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89 : 10277-10281 (1992). die Konstruktion von pYS5 und pYS6 ist beschrieben in Singh et al., J. Blot. Chem., 264 : 19103-19107 (1989).
Die Nucleotid- und Aminosäure-Sequenzen des reifen PA-Proteins nach Veränderung mit Primer-Satz 2 sind unten gezeigt. Nucleotidreste 482 bis 523 wurden mit Kassette 2 ausgewechselt, was den Ersatz der Aminosäurereste 162-171 von PA mit Resten NTATIMMQRGNFLQ, PAHIV#2, ergab. Die veränderte DNA-Sequenz und die neuen Aminosäurereste sind unterstrichen. Sequenzreihe 1 bis 2220
Dem obigen Verfahren wurde für PAHIV#1, 3 und 4 gefolgt.

Beispiel 7:

Spaltung von mutierten PAHl V-Proteinen in vitro:

Die mutierten Proteine wurden mit gereinigter HIV-1-Protease behandelt und das Ausmaß ihrer Spaltung in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt. Die gereinigte Protease wurde von dem NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Division ofAlDS, NIAID, Bethesda, MD erhalten. Als andere Möglichkeit kann die Protease nach der Methode von Louis et al., Euro. J. Biochem., 199: 361 (1991) gereinigt werden.
Ausgedehnte Behandlung (12 Stunden) von PA oder den mutierten PA-Proteinen mit der gereinigten HIV-1-Protease führte zum Auftreten von zwei zusätzlichen Protein-Fragmenten, die nicht erwartet wurden. Diese zwei Fragmente haben eine Größe von ungefähr 56 Kilodalton und 30 Kilodalton. Dies könnte eine Spaltung von PA und mutierten PA-Proteinen an einer Stelle, die von der HIV-1-Protease erkannt wird, zwischen den PA-Resten Y²&sup5;&sup9; und P²&sup6;&sup0; bedeuten. Die Reste in der Umgebung dieser Spaltungsstelle, ²&sup5;&sup6;VAAYPIVHV²&sup6;&sup4;, wurden vorher nicht als eine mögliche Spaltungsstelle der HIV-1-Protease identifiziert.
Bebrüten von RAW 264.7-Zellen (ATCC No. TIB 71) mit Letal-Faktor (LF) und HIV-1-Protease-gespaltenem PAHIV#1 oder PAHIV#4 verursachte Zelltod, was beweist, das die mutierten PA-Proteine fähig sind, an LF und deshalb die toxischen LF/PE-Fusionsproteine zu binden. PAHIV, PAHIV#2 und PAHIV#3 sind noch nicht getestet worden.

Beispiel 8:

Bestimmung von zellgiftigen Substanzen in Zellkulturen:

Die Fähigkeit der die HIV-1-Spaltungsstelle enthaltenden PA-Konstruktionen, das Abtöten von HIV-1 infizierten Zellen zu fördern, ist in COS-1-Zellen (ATCC No. CRL 1650), die mit dem Vektor HIV-gpt transfiziert waren, bestimmt worden. Wenn COS-Zellen mit diesem Plasmid-Vektor transfiziert sind, exprimieren sie alle Gene für die Produktion des HIV-1-Virus-Partikels, mit der Ausnahme des Hyll-(envelope)-Proteins gp160 (Page, K. A. et al., 1990, J. Virol., 64: 5270-5276). Ohne das HYII-Protein sind die Partikel nicht ansteckend. Diese Zellen exprimieren die HIV-1-Proteasen und spalten das virale Protein gp55 richtig zu gp24 (Page, K.A. et al., 1990, J. Virol., 64: 5270-5276). Diese Eigenschaften machen die transfizierten Zellen zu einem hervorragenden Modell-System, um damit die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Protein-Konstruktionen zu bestimmen, HIV-1 infizierte Zellen aus Kulturen zu beseitigen.
Die COS-1-Zellen wurden mit dem Plasmid-Vektor transfiziert, und die erhaltenen Kulturen sind auf stabile Transfektionen selektiert worden. Die mutierten PA-Proteine (PAHIV#1, PAHIV#2, PAHIV#3 und PAHIV#4) wurden zu den Kulturmedien von wachsenden HIV-gpt transfizierten COS-1-Zellen in der Gegenwart des Letal-Faktor-Fusionsproteins FP53 (Arora, N. et al., J. Biol. Chem., 267: 15542 (1992)) zugegeben. Nur Zellen, welche die mutierten PA-Proteine richtig spalten, sind fähig, das Toxin LF-Fusionprotein zu binden. Die Kulturen wurden nach 36 Stunden auf Proteinexpression (ein indirektes Maß der Lebensfähigkeit) untersucht (Arora, N. und S.H. Leppla. 1992, J. Biol. Chem., 268: 3334).

Beispiel 9:

Behandlung von einem HIV-1 infizierten Patienten:

Ein menschlicher Patient, der mit HIV-1 infiziert ist, wurde zur Behandlung ausgewählt. Obwohl infiziert, hat dieser besondere Patient keine Symptome. Der Patient wiegt 70 Kilogramm. Eine Dosis von 10 Mikrogramm pro Kilogramm oder 700 Mikrogramm von einem PAHIV in normaler Salzlösung wird vorbereitet. Diese Dosis wird in den Patienten intravenös in einer Gabe injiziert. Die Dosis wird wöchentlich bis zu insgesamt 4 bis 6 Dosen wiederholt. Der Patient wird regelmäßig, wie etwa wöchentlich, untersucht, wobei seine Symptome, Zustand des Körpers und labormedizinische Analysen, entsprechend dem Urteil des klinischen Personals begutachtet werden. Tests von besonderem Interesse beinhalten sämtliche Blutwerte des Patienten und Untersuchung auf die Anwesenheit der HIV-Infektion. Das Behandlungsschema kann mit oder ohne Veränderungen nach Ermessen des klinischen Personals wiederholt werden.
Aufgenommen durch Verweis/Absatz vor Patentansprüchen Wenn nicht anderweitig definiert, haben sämtliche technischen oder wissenschaftlichen Fachausdrücke, die hierin verwendet wurden, die gleiche Bedeutung, mit der sie gewöhnlich von jemandem mit normalen Kenntnissen des Fachgebietes, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden. Obwohl alle Methoden und Materialien, die den beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind, in der Durchführung oder Test von der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind die vorzuziehenden Methoden und Materialien nun beschrieben. Alle Veröffentlichungen und Patentdokumente, auf die in dieser Anmeldung verwiesen wurde, sind hierin durch Verweis aufgenommen.

Sequenzliste:

(1) Allgemeine Information....
(2) Information für Seq. ID No. 1:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 3291 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Anti-sense: Nein
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: CD5
(B) Lage:580 .. 2907
(D) Andere Information: (Produkt = "Letal-Faktor"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 1:
(2) Information für Seq. ID No. 2:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 776 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No.2:
(2) Information für Seq. ID No. 3:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 4235 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Anti-sense: Nein
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: CDS
(B) Lage:1891 .. 4095
(D) Andere Information: (Produkt = "Schutz-Antigen"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 3:
(2) Information für Seq. ID No. 4:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 735 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topofogie:linear
(ii) Art des Molkeüls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 4:
(2) Information für Seq. ID No. 5:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 1368 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) anti-sense: Nein
(vi) Ursprungliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: CDS
(B) Lage: 1 .. 1368
(D) Andere Information: /Produkt = "LF(1-254)--TR--PE(401-602)"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 5:
(2) Information für Seq. ID No. 6:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 456 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 6:
2) Information für Seq. ID No. 7:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 1425 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Molkeüls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: CDS
(B) Lage:1 .. 1416
(D) Andere Information: (Produkt = "LF(1-254)-TR-PE(398-613)"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 7:
(2) Information für Seq. ID No. 8:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 472 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 8:
(2) Information für Seq. ID No. 9:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 1524 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: CDS
(B) Lage: 1 .. 1524
(D) Andere Information: (Produkt = "LF(1-254)-TR-PE(362-613)"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 9:
(2) Information für Seq.ID No. 10:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 508 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID. No. 10:
(2) Information für Seq. ID No. 11:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 2709 Basenpaare
(B) Typ: Nucieinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: CDS
(B) Lage: 1 .. 2709
(D) Andere Information: /Produkt = "PA(1-725) - - - - - CD4 von Mensch, Reste (1-178)"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 11:
(2) Information für Seq. ID No. 12:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 903 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 12:
(2) Information für Seq. No. 13:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(iii) Hypothetisch: Nein
(v) Fragmentierungstyp: intern
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: Peptid
(B) Lage: 1 .. 8
(D) Andere Information: (Kennzeichnung = PAHIV
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 13:
(2) Information für Seq. ID No. 14:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 12 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(iii) Hypothetisch: Nein
(v) Fragmentierungstyp: intern
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: Peptid
(B) Lage: 1 .. 12
(D) Andere Information: /Kennzeichnung = PAHIV-1
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 14:
(2) Information für Seq. ID No. 15:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 12 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(iii) Hypothetisch: Nein
(v) Fragmentierungstyp: intern
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) NameIKennziffer: Peptid
(B) Lage: 1 .. 12
(D) Andere Information: /Kennzeichnung = PAHIV-2
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 15:
(2) Information für Seq. ID No. 16
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 12 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(iii) Hypothetisch: Nein
(v) Fragmentierungstyp: intern
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: Peptid
(B) Lage: 1 .. 12
(D) Andere Information: /Kennzeichnung = PAHIV-3
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 16
(2) Information für Seq. ID No. 17:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 13 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(iii) Hypothetisch: Nein
(v) Fragmentierungstyp: intern
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: Peptid
(B) Lage: 1 .. 13
(D) andere Information: /Kennzeichnung= PAHIV-4
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 17:
(2) Information für Seq. ID No. 18:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 45 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: CDS
(B) Lage: 3 .. 44
(D) Andere Information: /Produkt = "Primer 1A"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 18:
(2) Information für Seq. ID No. 19:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 14 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 19:
(2) Information für Seq. ID No. 20:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 46 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Anti-sense: Ja
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: Misc-Kennzeichen
(B) Lage: 1 .. 46
(D) Andere Information: (Produkt = "Primer 1 B"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 20:
GTTCCTGCAG TATGTTTTGC ACGATCGGAT AATTTTGTGA TACTTG 46
(2) Information für Seq. ID No. 21:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 45 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: CDS
(B) Lage: 3 .. 44
(D) Andere Information: (Produkt = "Primer 2A"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 21:
(2) Information für Seq. ID No. 22:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 14 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 22:
(2) Information für Seq. ID No. 23:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 46 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Anti-sense: Ja
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Misc-Kennzeichen
(B) Lage: 1 .. 46
(D) Andere Information: (Produkt = "Primer 2B"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 23:
GTCCCTGCAG AAAATTACCA CGTTGCATCA TGATAGTGGC AGTGTT 44
(2) Information für Seq. ID No. 24:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 45 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: CDS
(B) Lage: 3 .. 44
(D) Andere Information: /Produkt = "Primer 3A"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID. No. 24:
(2) Information für Seq. ID No. 25:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 14 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 25:
(2) Information für Seq. ID No. 26:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 46 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Anti-sense: Ja
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: Misc-Kennzeichen
(B) Lage: 1 .. 46
(D) Andere Information: /Produkt "Primer 3B"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 26:
GTCCCTGCAG CCAAAGCGTG ATTTGCGGGA AGTTAAAAGA GACAGT 46
(2) Information für Seq. ID No. 27:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 48 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: CDS
(B) Lage: 3 .. 47
(D) Andere Information: (Produkt = "Primer 4A"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 27:
CG GGC GGT TCT GCC TTT AAC TTC CCG ATC GTC ATG GGA GGT CTG CAG 47
(2) Information für Seq. ID No. 28:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 15 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 28:
(2) Information für Seq. ID No. 29:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 49 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Anti-sense: Ja
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: Misc-Kennzeichen
(B) Lage: 1 .. 49
(D) Andere Information: (Produkt = "Primer 4B"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 29:
GTCCCTGCAG ACCTCCCATG ACGATCGGGA AGTTAAAGGC AGAACCGCC 49
(2) Information für Seq. ID No. 30:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 2160 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strang: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Bacillus anthracis
(ix) Kennzeichen:
(A) Name/Kennziffer: CDS
(B) Lage: 1 .. 2157
(D) Andere Information: /Produkt = "PAHIV#2"
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. tD No. 30:
(2) Information für Seq. ID No. 31:
(i) Sequenzeigenschaften
(A) Länge: 719 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID No. 31:

Claims

1. Eine ein Fusionsprotein codierende Nucleinsäure, wobei die Nucleinsäure eine den Translokationsbereich und den Anthrax-Letalfaktor (LF) - Bindungsbereich des natürlichen Anthrax-Schutzantigen (PA) - Proteins codierende Nucleotidsequenz und eine einen Ligandenbereich codierende Nucleotidsequenz umfaßt und der Ligandenbereich speziell einen zellulären Empfänger bindet.

2. Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei der Ligandenbereich speziell ein auf der Oberfläche einer HIV-infizierten Zelle sich darstellendes HIV-Protein bindet.

3. Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei der Ligandenbereich ein Wachstumsfaktor ist.

4. Nucleinsäure nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die den Translokationsbereich und den LF-Bindungsbereich des natürlichen PA-Proteins codierende Nucleotidsequenz außerdem die den Rest des natürlichen PA-Proteins codierende Nucleotidsequenz umfaßt.

6. Ein durch eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiertes Protein.

7. Vektor, umfassend Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4. Vektor nach Anspruch 6 in einem Wirt, der das durch die Nucleinsäure codierte Protein darstellen kann.