DE68910682T2

DE68910682T2 - Aktivierung der nf-kappa b-vorstufe.

Info

Publication number: DE68910682T2
Application number: DE68910682T
Authority: DE
Inventors: Patrick Baeuerle; David Baltimore
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 1988-03-01
Filing date: 1989-03-01
Publication date: 1994-06-01
Anticipated expiration: 2009-03-02
Also published as: WO1989008147A1; CA1340174C; DE68910682D1; CA1341606C; EP0407411A1; EP0407411B1

Description

Stand der Technik

Verstärker- und Promotor-Elemente sind die wichtigsten Regulations-DNA-Sequenzen, die zum Steuern eucaryotischer Gen-Expression bekannt sind. McKnight, S.L. und R. Tjian, Cell, 46:795-805 (1986).
Promotor-Elemente sind auf einen lokalen Bereich oberhalb des Gens beschränkt. Verstärker-Elemente sind cis-wirkende Sequenzen, die eine große Positionsflexibilität anzeigen. Banerji, J. et al., Cell, 27:299-308 (1981), Fromm, M. und P. Beig, Molecular Cellular Biology, 3:991-999 (1983).
Verstärker-Elemente sind verantwortlich für viele Regulationseigenschaften der Gene, die sie steuern, wie Zelltyp und gewebespezifische Expression und Ansprechbarkeit auf Steroidhormone und Wachstumsfaktoren. Alle bisher analysierten Verstärker-Elemente bestehen aus mehrfachen DNA-Sequenzmotiven, die als Bindungsstellen für spezifische Proteinfaktoren dienen. Es gibt immer mehr Anzeichen dafür, daß sequenzspezifische DNA-Bindungsproteine Transkriptionsaktivität und spezialisierte Regulationseigenschaften den Verstärker-Elementen verleihen. Schoeler, H. und P. Gruss, EMBO Journal, 4:3005-3013 (1985); Ephrussi, A. et al., Science, 227:134-140 (1985); Lee, W. et al., Cell, 49:741- 752 (1987). Wie die Verstärker-Elemente die Transkriptionsrate von einem besonderen Gen steuern, ist jedoch noch nicht verstanden.
Ein typisches Verstärker-Element ist in dem J-C-Intron des kappa*)leichte Kette-Gens lokalisiert. Queen, C. und D. Baltimore, Cell, 33:741-748 (1983); Falkner, F.G. und H.G. Zachau, Nature, 310:71-74 (1984); Picard, D. und K.R. Yamamoto, EMBO Journal, 6:3333-3340 (1987). Dieser Verstärker enthält wenigstens drei Stellen, die mit spezifischen DNA-Bindungsproteinen wechselwirken. Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 46:705-716 (1986); Lenardo M. et al., Science, 236:1573-1577 (1987); eine dieser Stellen, die Kappa B-Stelle bindet, einen B-zellenspezifischen Faktor, genannt Nuklearfaktor Kappa B (NF-kB). Sen, R und D. Baltimore, Cell, 47:921-928 (1986). Die DNA-Bindungsaktivität dieses Proteins ist nicht nachweisbar in Nuklearextrakten der Prä-B-Zellinie 70Z/3, kann aber durch einen Post-Translationsmechanismus nach Behandlung von Zellen mit bakteriellem Lipopolysaccharid oder Phorbolestern aktiviert werden. Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 47:921- 928 (1986). Die Induktion von NF-kB Aktivität in Prä-B- Zellen durch diese Behandlungen korreliert stark mit der Transkriptionsaktivität des Kappa-Gens. Nelson, K.J. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82:5305-5309 (1985); Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 47: 921-928 (1986). Mutationsanalyse von dem Kappa-Verstärker (Lenardo, M. et al., Science, 236:1573-1577 (1987)) und die Konstruktion von funktionellen Verstärkern unter Verwendung von Oligonukleotiden, die NF-kB-Bindungsstellen repräsentieren, haben weiteren Beweis geliefert, daß die Bindung von NF-kB an das kB-Motiv in dem Kappa-Verstärker wesentlich für die Transkriptionsaktivität, Induzierbarkeit und Entwicklungsstufen-Spezifität des Kappa-Verstärkers ist. NF-kB scheint auch eine Schlüsselrolle bei der Transkriptionsaktivierung des Human-Immundefizienzvirus (HIV) in latent infizierten T-Zellen zu spielen, weil Induktion von NF-kB-Aktivität in T-Zellen die Aktivität *) kappa ( = κ ) hier "k" abgekürzt
der Transkriptionssteuer-Elemente des Virus drastisch erhöht und Mutation der kB-Stellen die Stimulation vernichtet. Nabel, G. und D. Baltimore, Nature, 326:711-713 (1987)

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Aktivierung von NF-kB, eines Transkriptionsfaktors, der Expression des leichte- Immunglobulin-Kappa-Kette-Gens und von Human, Immundefizienzvirus (HIV) steuert, sowie Verfahren zum Bewirken und Verhindern von Aktivierung des Faktors, zum Steuern von Expression des leichte-Immunglobulin-Kappa-Kette-Gens und zum Steuern von Expression von HIV. Sie bezieht sich auf einen Vorläufer von NF-kB, von dem gezeigt wurde, daß er in einer Vielzahl von Zellen vorhanden ist; Steuerung von Induktion von Aktivität des Vorläufers; einen Protein- Inhibitor (T Kappa B oder TkB), der NF-kB in eine inaktive Form umwandeln kann; Verfahren, durch die der NF-kB-Vorläufer in aktiven NF-kB umgewandelt werden kann; und Verfahren, durch die Anfangs-Expression von ruhender HIV-DNA durch latent infizierte T-Lymphozyten gesteuert werden können.
Spezieller liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verändern der Expression in einer Zelle von einem Gen, dessen Transkriptionsaktivität durch Binden vom Nuklearfaktor Kappa B (NF-kB) an den Verstärker dieses Gens verändert wird, das das Einführen eines Mittels umfaßt, das die Dissoziation des Nuklearfaktors Kappa B-Inhibitors vom Nuklearfaktor Kappa B (NF-kB-IkB) Komplex, der in dem Zytoplasma dieser Zelle vorhanden ist, steuert.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Reduzieren der Expression in einer Zelle von einem Gen, dessen Transkriptionsaktivität durch Binden von NF-kB an den Verstärker dieses Gens aktiviert wird, das das Einführen eines Mittels umf aßt, das Dissoziation von NF-kB-IkB Komplex verhindert, der in dem Zytoplasma dieser Zelle vorhanden ist.
Weiterhin liefert die Erfindung ein Verfahren zum Aktivieren in einer Wirtszelle eines NF-kB Vorläufers, der in dem Zytoplasma dieser Wirtszelle vorhanden ist, wobei der Vorläufer einen NF-kB-IkB Komplex umfaßt, das das Kontaktieren der Wirtszelle mit einem Mittel umfaßt, das in der Lage ist, Dissoziation des Komplexes in einen Inhibitor vom Kernfaktor kB (IkB) und NF-kB und Translokation dieses NF-kB in den Kern dieser Zelle zu bewirken.
Außerdem liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steuern der Expression von humaner Immundefizienzvirus- DNA in einer Wirtszelle, die latent mit Human-Immundifizienzvirus-DNA infiziert ist, das das Verhindern des Bindens von NF-kB an Human-Immundefizienzvirus-Transkriptions- Steuerelemente umfaßt.
Die Erfindung liefert auch NF-kB-IkB, der Gegenstand der Ansprüche 8 bis 12 ist, TkB, der Gegenstand der Ansprüche 13 und 14 ist, und die inaktive zytosolische NF-kB-Vorstufe, die Gegenstand von Anspruch 15 ist.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind brauchbar zum Bestimmen/Steuern der Expression des leichten-Immunglobulin- Kappa-Ketten-Gens,der Expression von HIV-DNA durch latentinfizierte T-Zellen und Expression von zusätzlichen Genen, für die NF-kB eine Rolle als ein Verstärker bindendes Protein snielt, das bei Transkriptionsaktivierung des Gens teilnimmt. Als Folge ist es möglich, zum Beispiel die Expression des leichten Immunglobulin-Kappa-Ketten-Gens zu verstärken oder Expression von HIV-DNA in latent infizierten Zellen zu hemmen. Dies wird durch Aktivierung einer NF-kB Vorstufe bewirkt, von der sich gezeigt hat, daß sie in der zytosolischen Zellenfraktion vorhanden ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine Darstellung von Bindungsstellen für den NF-kB Transkriptionsfaktor in dem leichten Immunglobulin- Kappa-Ketten-Verstärker und dem HIV-Verstärker. Kästchen zeigen die Bindungsstellen für NF-kB (B) an; andere Regulationsstellen sind als E1, E2 und E3 und Sp1 bezeichnet. Punkte zeigen Guanosin-Reste in dem Kappa-Verstärker an, deren Methylierung Bindung von NF-kB beeinträchtigt.
Figur 2 ist eine Charakterisierung des NF-kB Proteins. Figur 2A repräsentiert die Bestimmung des Molekulargewichts von NF-kB. Ein Kernextrakt (300 ug Protein) von TPA-stimulierten 70Z/3 Prä-B-Zellen wurde denaturiert und reduzierender SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) unterworfen. Protein in den Molekulargewichtsfraktionen, angezeigt durch gestrichelte Linien, wurde eluiert und renaturiert vor Mobilitätsverschiebungstests, wie es beschrieben wird. Ein Fluorogramm eines nativen Gels ist gezeigt. Der ausgefüllte Pfeil zeigt die Stelle eines spezifischen Protein-DNA-Komplexes an, der nur in der 62-55 kDa-Fraktion mit einem wilden TyP (wt), aber nicht mit einem mutanten (mu) Kappa-Verstärker-Fragment entdeckt wurde. Der offene Pfeil zeigt die Stelle von ungebundenen DNA-Fragmenten an. Figur 2B ist eine Darstellung von Glycerolgradienten-Zentrifugierung von NF-kB. Kernextrakt (400 ug Protein) von TPA- stimulierten 70Z/3 Zellen wurde Ultrazentrifugierung auf einem kontinuierlichen 10-30% Glycerolgradienten über 20 Stunden bei lsooooxg im Puffer D(+) unterworfen. Gleichzeitig sedimentierte Molekulargewichtsstandards (Ovalbumin, 45 kDa; Pinderserumalbumin, 67 kDa; Immunglobulin G, 158 kDa; Thyroglobulinmonomer, 330 kDa und Dimer 660 kDa) wurden in den Fraktionen durch SDS-PAGE nachgewiesen, woraufhin Coomassie-Blau-Färbung folgte. Die Verteilung von NF-kB-Aktivität wurde durch elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests bestimmt, wobei ein endmarkiertes Kappa-Verstärkerfragment verwendet wurde. Fluorogramme von nativen Gelen sind gezeigt. Die Spezifität der Bindung wurde getestet, wobei ein Kappa-Verstärker-Fragment mit einer Mutation in der NF-kB Bindungsstelle verwendet wurde.
Figur 3 repräsentiert den Nachweis einer zytosolischen Vorstufe von NF-kB. Figur 3A repräsentiert die Analyse von subzellularen Fraktionen für NF-kB DNA-Bindungsaktivität. Kernextrakte (N), zytosolische (C) und postnukleare Membran- Fraktionen (P) von einer Kontrolle und TPA-stimulierten 70Z/3 Prä-B-Zellen wurden durch Gelverschiebungstests analysiert. Der gefüllte Pfeil zeigt die Stellung des spezifischen Protein-DNA-Komplexes, gesehen nur mit einem wilden Typ, aber nicht init einem mutanten Kappa-Verstärkerfragment. Figur 3B repräsentiert Aktivierung einer zytosolischen NF-kB Vorstufe nach Behandlung mit dissoziierenden Mitteln. Subzellulare Fraktionen wurden mit 25% Formamid behandelt, woraufhin Verdünnung und Zugabe von 0,2% Natriumdesoxycholat folgte, wie es beschrieben wird . Figur 3C repräsentiert den Nachweis einer zytosolischen NF-kB Vorstufe nach Denaturierung, SDS-PAGE und Renaturierung von Protein. Kernextrakt (N) und zytosolische Fraktion (C) von unstimulierten (Kontrolle) 70Z/3 Zellen wurden der Behandlung unterworfen, die in Figur 2A umrissen ist. Bezüglich Einzelheiten der Darstellung vgl. Figur 3A.
Figur 4 repräsentiert die Analyse von subzellularen Fraktionen für DNA-Bindungsaktivität des TPA-induzierbaren Transkriptionsfaktors AP-1. Gleiche Zell-Äquivalente von Kernextrakten (N) und zytosolischen Fraktionen (C) von 70Z/3 und HeLa-Zellen wurden bei den Mobilitätsverschiebungstests verwendet. AP-1 spezifische DNA-Bindungsaktivität wurde nachgewiesen, indem ein endmarkiertes EcoRI- HindIII Fragment von dem Hefe HTS 4 Promotor verwendet wurde, der drei Bindungsstellen für GCN4, erkannt durch Säugetier AP-1, enthielt. Die drei Protein-DNA-Komplexe, die man beim kürzeren Exponieren des Fluorogramms sieht, sind durch gefüllte Pfeile angegeben, und die Stelle des ungebundenen DNA-Fragments ist durch einen offenen Pfeil angezeigt.
Figur 5 repräsentiert Ergebnisse von elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsanalysen von subzellularer Fraktion von 70Z/3 Zellen.
Figur 6 zeigt die Wirkung der Denaturierung und Renaturierung von kB-spezifischer DNA-Bindungsaktivität in Kernextrakten und zytosolischen Fraktionen von 70Z/3 Zellen.
Figur 7 zeigt die Einflüsse von dissoziierenden Mitteln auf die Aktivität von NF-kB in subzellularen Fraktionen von 70Z/3 Zellen. Figur 7A: Zellenfreie Aktivierung einer NF-kB Vorstufe in der zytosolischen Fraktion durch Desoxycholat. Figur 7B: Zellenfreie Aktivierung einer NF-kB Vorstufe in der zytosolischen Fraktion durch Formamid und durch eine kombinierte Behandlung mit Formamid und Desoxycholat.
Figur 8 zeigt den Einfluß von TPA Stimulierung auf die subzellulare Verteilung von NF-kB in 70Z/3 Zellen.
Figur 9 zeigt den Einf luß von TPA Stimulation auf die subzellulare Verteilung von NF-kB in HeLa Zellen.
Figur 10 zeigt Ergebnisse von DNA-Zellulose-Chromatographie von DOC-behandeltem Zytosol. Zytosol wurde von unstimulierten 70Z/3 Prä-B Zellen hergestellt, und die Protein-Konzentrationen wurden bestimmt. In den gezeigten Fluorogrammen von nativen Gelen zeigen die gefüllten Pfeile die Stelle von dem NF-kB-k Verstärker-Fragmentkomplex und die offenen Pfeile die Stelle der ungebundenen DNA-Probe an. Figur 10A: Freigabe von DOC-unabhängiger NF-kB Aktivität. Gleiche Anteile von Ladung, Durchf luß (FT), Waschungen und Eluaten wurden durch EMSA analysiert, mit (+) oder ohne (-) Uberschuß an DOC. Die ³²P-Radioaktivität in den NF-kB-DNA-KomPlexen wurde durch Flüssigkeits-Szintillation gezählt, und der Prozentsatz an NF-kB Aktivität, der in den verschiedenen Fraktionen zurückgewonnen wurde, wurde berechnet. Figur 10B: Freigabe einer Inhibitionsaktivität. NF-kB, enthalten in der 0,2M NaCl-Fraktion (31 ng Protein), oder NF-kB in einem Kernextrakt von TPA-behandelten 70Z/3 Zellen (1,1 ug Protein) wurde inkubiert unter nicht-dissoziierenden Bedingungen mit den angegebenen Mengen (in Mikrolitern) von jeweils Zytosol, das mit DOC behandelt war, aber nicht über DNA-Zellulose geleitet war (Spuren 4 bis 6 und 13 bis 15), oder der Durchflußfraktion (bezeichnet als NF-kB-befreites Zytosol; Spuren 7 bis 9 und 16 bis 18).
Figur 11 zeigt Charakterisierung von IkB und seinem Komplex mit NF-kB. in den gezeigten Fluorogrammen zeigen die gefüllten Pfeile die Stellung von dem NF-kB-DNA Komplex an, und die offenen Pfeile zeigen die Stelle von freier DNA Probe an.
Figur 11A: Zur Größenbestimmung von IkB wurde der Durchfluß von der DNA-Zellulosesäule über eine G-200 Sephadex-Säule geleitet. Portionen der Fraktionen wurden inkubiert mit NF-kB, das in den Kernextrakten von TPA-stimulierten 70Z/3 Zellen (N TPA) enthalten war, und durch EMSA analysiert. v, leeres Volumen; P, Fraktion, wo die verbleibende NF-kB Vorstufe (Figur 10A, SPur 4) Maxima erreichte nach Gel- Filtrierung bei Prüfung mit überschüssigem DOC in Abwesenheit von zugegebenem NF-kB; I, Fraktion, wo die Inhibitionsaktivität Maxima erreichte.
Figur 11B: Die Wirkung von Trypsin-Behandlung auf die Inhibitionsaktßiität von IkB. NF-kB in einem Kernextrakt (Spur 1) wurde inkubiert mit einer Fraktion, die Inhibitor enthielt (Spur 2) ohne irgendeine Zugabe (-; Spur 3), oder mit Rinder -Pankreas-Trypsin-Inhibitor (TI; Spur 4), Trypsin, das mit BPTI inkubiert war (T+TI; Spur 5), oder mit Trypsin allein (T; Spur 6). Es wurden dann Prob en in dem Inhibitor-Test verwendet.
Figur 11C: Glycerolgradient-Sedimentierung von NF-kB und seinem Komplex mit IkB. Kernextrakt von TPA-stirnulierten 70Z/3 Zellen (N TPA) und Zytosol von unstimulierten Zellen (C Co) wurden der Sedimentierung durch einen Glycerolgradienten unterworfen. Gleichzeitig sedimentierte Größenmarkierungen waren Ovalbumin (45 kD), BSA (67 kD), Immunglobulin G (158 kD) und Thyroglobulin (330 und 660 kD). NF-kB Aktivität wurde in den Fraktionen durch EMSA mit einem k-Verstärkerfragment vom wilden Typ nachgewiesen (kB wt, linke Felder). Die Spezifität wurde mit einem mutanten Fragment getestet (kB mu, rechte Felder). Die inaktive zytosolische NF-kB Vorstufe (unteres Feld) wurde durch Formamid-Behandlung aktiviert (Fa; mittleres Feld).
Figur 12 zeigt die Umkehrbarkeit und das kinetische Verhalten der Inaktivierung von NF-kB. Figur 12A: Der Einfluß der DOC Behandlung auf in vitro inaktiviertem NF-kB. In Kernextrakten von TPA-stimulierten 70Z/3 Zellen (N TPA; 1,1 ug Protein) enthaltenes NF-kB wurde inaktiviert durch Zugabe einer Gel-Filtrierungsfraktion, die IkB (2,5 ug Protein) enthielt. Eine Duplikatprobe wurde nach der Inhibitionsreaktion mit 0,8% DOC behandelt, woraufhin Zugabe von DNA-Bindungsreaktionsgemisch folgte, das 0,7% NP-40 enthielt. Die Proben wurden analysiert durch EMSA. In den gezeigten Fluorogrammen gibt der gefüllte Pfeil die Stellung von dem NF-kB-DNA-Komplex an, und der offene Pfeil gibt die Stellung der ungebundenen DNA-Probe an.
Figur 12B: Eine Titrations- und Kinetik-Analyse von der in vitro Inaktivierung von NF-kB. In Kernextrakten von TPA-behandelten 70Z/3 Zellen (2,2 ug Protein) enthaltenes NF-kB wurde mit ansteigenden Mengen (0,25 bis 2,25 ug Protein) einer Gel-Filtrierungsfraktion, die IkB enthielt, inkubiert. Nach der DNA-Bindungsreaktion wurden Proben durch EMSA analysiert. Die ³²P-Radioaktivität in den NF-kB-DNA-Komplexen, die durch Fluorographie sichtbar gemacht wurde, wurde durch Flüssigkeits-Szintillationszählung bestimmt. Alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt. Die Balken repräsentieren Standard-Abweichungen.
Figur 13 zeigt die Spezifität von IkB. Kernextrakte von unstimulierten (Co) oder TPA-behandelten Zellen wurden mit 5 ul Puffer G (-) oder mit 5 ul einer Gel-Filtrierungsfraktion, die IkB (+) enthielt,behandelt (A, in Anwesenheit von 150 mM NaCl). Nach den DNA-Bindungsreaktionen wurden Proben durch EMSA analysiert.
Figur 13A: Der Einfluß von IkB auf die DNA-Bindungsaktivität von verschiedenen Kernfaktoren. Die Proben waren: NF-kB; H2TF1, ein Oligonukleotid, subkloniert in pUC, das die H2TF1 Bindungsstelle von dem H-2 Promotor enthielt; OCTA, ein Oligonukleotid, subkloniert in PUC, das die gemeinsame Bindungsstelle für die ubiquitären (oberer gefüllter Pfeil) und Lymphoid-spezifischen (unterer gefüllter Pfeil) Octamer-Bindungsproteine enthielt; NF-uE1; NF-kE2; und AP-1, EcoRI-HindIII Fragment des Hefe HIS4 Promotors, der drei Bindungsstellen, erkannt durch Säugetier AP-1/jun, enthielt. In den gezeigten Fluorogrammen geben gefüllte Pfeile die Stellen von spezifischen Proterin-DNA Komplexen an. Offene Pfeile geben die Stellen von nicht-komplexartigen DNA-Fragmenten an. Figur 13B: Wechselwirkung von IkB mit NF-kB von unterschiedlichen Zellinien. Die gefüllten Pfeile geben die Stellen der NF-kB-DNA Komplexe von den verschiedenen Zellinien an, und die offenen Pfeile geben die Stelle von nicht-komplexartiger DNA-Probe an.
Figur 14 zeigt die Anwesenheit von NF-kB in entkernten Zellen. Figur 14A: Phasenkontrast- und Fluoreszenz-Mikroskopie von entkernten HeLa Zellen. Von 612 Zellen, die auf photographischen Abzügen gezählt wurden, zeigten 63 Kernfärbung. Eine repräsentative Mikrographie ist gezeigt. Figur 14B: Analyse von vollständigen und entkernten Zellen für NF-kB Aktivität. Die gesamten Zellextrakte (1,2 ug Protein) von Kontroll-(Co) und TPA-behandelten vollständigen und entkernten Zellen wurden durch EMSA mit einem markierten k- Verstärkerfragment (kB) oder HIS4 Promotor-Fragment (AP-1), 3 ug Poly(dI-dC), 1 ug BSA, 1,2% NP-40 und dem Bindungspuffer in einem Endvolumen von 20 ul analysiert. In den Spuren 5 bis 8 wurden Extrakte mit DOC behandelt, woraufhin Zugabe von dem DNA-Bindungsgemisch folgte, um Endkonzentrationen von 0,8% DOC und 1,2% NP-40 zu liefern. Proben wurden durch EMSA analysiert. In den gezeigten Fluorogrammen geben die gefüllten Pfeile die Stellen von sPezifischen Protein-DNA-Komplexen an, und die offenen Pfeile geben die Stellungen von nicht-komplexartiger DNA-Probe an.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß Mengen von zytosolischem NF-kB in Fraktionen von unstimulierten Prä-B-Zellen und von Kern-NF-kB von Phorbolesteraktivierten Zellen ähnlich sind; daß das in zytosolischen Fraktionen vorhandene NF-kB in seiner DNA Bindungsaktivität gehemmt (inhibiert) wird; und daß die Hemmung (Inhibierung) von zytosolischem NF-kB durch geeignete Stimulierung entfernt werden kann, was auch Translokation von NF-kB zu dem Kern bewirkt. Sie basiert auch auf Identifikation und Lokalisierung der Vorstufe von NF-kB in der zytosolischen Fraktion von unstimulierten Zellen und auf Identifikation und Charakterisierung eines Protein-Inhibitors, genannt IkB, der in dem Zytosol vorhanden ist und NF-kB in eine inaktive Form in einer reversiblen, sättigbaren und spezifischen Reaktion umwandeln kann. Die NF-kB Vorstufe ist in einer Form vorhanden, in der DNA-Bindungsaktivität in vitro durch denaturierende Mittel aktiviert werden kann. Die Inhibitions-Aktivität von IkB ist offensichtlich nach selektivem Entfernen des endogenen zytosolischen NF-kB unter Dissoziationsbedingungen, was nahelegt, daß NF-kB und IkB in einem stöchiometrischen Komplex vorhanden sind. Die hier beschriebenen Ergebnisse sind konsistent mit einem molekularen Mechanismus von induzierbarer Gen-Expression, durch die ein zytoplasmischer Transkriptionsfaktor-Inhibitor-Komplex durch die Wirkung von TPA dissoziiert wird, wahrscheinlich durch Aktivierung von Proteinkinase C. Es wurde gezeigt, daß das Dissoziationsereignis zu zwei Ereignissen führt: Aktivierung (Auftreten der NF-kB-Bindungsaktivität) und Translokation des Faktors zu dem Kern.
Weil NF-kB Aktivität (und Kappa Gen-Transkription) induziert werden kann, wurde der Zustand von NF-kB in unstimulierten Zellen anfänglich eingeschätzt. Niedrige NF-kB-Aktivität war demonstrierbar in entweder dem Kern oder dem Zytoplasma von unstimulierten 70Z/3 Zellen. Durch ein Denaturierungs-Renaturierungs-Protokoll wurde gezeigt, daß NF-kB in zytosolischen Fraktionen vorhanden ist, was nahelegt, daß das zytosolische NF-kB an einen Inhibitor gebunden ist. Schonende Dissoziation des Inhibitor-NF-kB-Komplexes wurde durchgeführt, wobei dissoziierende Mittel verwendet wurden; insbesondere zeigte die Verwendung entweder von Natriumdesoxycholat (DOC) oder von Formamid NF-kB in zytosolischen Fraktionen. Unter Verwendung gleicher Zell-Äquivalente von Protein und einem optimalisierten Protokoll wurde gezeigt, daß die Menge von zytosolischem NF-kB in unstimulierten 70Z/3 Zellen so hoch wie die Menge von Kern-NF-kB in Phorbolester-stimulierten Zellen war. Es wurde auch gezeigt, daß HeLa-Zellen inaktiven, zytosolischen NF-kB enthielten. Nachfolgende Abschätzung der DOC-Abhängigkeit von zytosolischem NF-kB zeigte, wie unten beschrieben ist, das Vorhandensein einer Aktivität in zytosolischen Fraktionen, die sPezifisch DNA-Bindung an NF-kB verhindert. Der Protein-Inhibitor, IkB, ist in zytosolischen Fraktionen von unstimulierten Prä-B-Zellen vorhanden, kann NF-kB in eine inaktive DOC-abhängige Form umwandeln durch eine reversible, sättigbare und spezifische Reaktion und erscheint in einem stöchiometrischen Komplex mit NF-kB vorhanden zu sein.
Das Folgende ist eine Beschreibung des Auftretens und der Aktivierung von NF-kB in Zellen, die nicht leichte k-Immunglobulin-Ketten-Gene expremieren (kund in denen NF-kB nicht in einer zytoplasmischen oder nuklearen Fraktion evident ist). Insbesondere ist das Folgende eine Beschreibung der Lokalisierung von NF-kB in der zytosolischen Fraktion; von Aktivierung von NF-kB in zytosolischen Fraktionen durch dissoziierende Mittel; oder Rückverteilung von NF-kB in die Kernfraktion bei TPA-Stimulierung; von Demonstration des Auftretens von NF-kB Bindungsfähigkeit; und von dem Auftreten und der Charakterisierung eines NF-kB-Inhibitors.

NF-kB Auftreten und Aktivierung in 70Z/3 Zellen

NF-kB ist im wesentlichen unnachweisbar in unstimulierten 70Z/3 Zellen

Um zu bestimmen, wo in der Zelle NF-kB oder seine inaktive Vorstufe gelegen sind, wurden subzellulare Fraktionen von Kontroll- und TPA-stimulierten 70Z/3 Zellen auf kB-spezifische DNA-Bindungsaktivität analysiert. Kernextrakte, zytosolische und postnukleare Membran-Fraktionen wurden bei gleichen Mengen Protein in einem elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstest analysiert, der in Beispiel 1 beschrieben ist, woraufhin Fluorographie folgte. (Sen, R. und D. Baltimore, Cell 46:705-716 (1986)). Die Spezifität von Protein-Bindung an ein Fragment des Kappa-leichte Ketten-Verstärkers wurde gesteuert unter Verwendung eines Fragments mit einer Mutation in dem Bindungsmotiv für NF-kB. Es zeigte sich, daß diese Mutation Bindung von NF-kB verhindert. Lenardo, M. et al., Science, 236:1573- 1577 (1987). Auf diese Weise wurden alle Komplexe, die auf dem wilden Typ, jedoch nicht auf dem mutanten Fragment gebildet wurden, als spezifisch für die NF-kB Stelle angesehen.
Kernextrakte von Kontrollzellen enthielten sehr geringe kB-spezifische Bindungsaktivität (Figur 5, vergl. Spuren 1 und 7). Dies- steht im Einklang mit Ergebnissen, die früher von Sen und Baltimore berichtet wurden. Sen, R. und D.Baltimore, Cell, 46:705-716 (1986); Sen, R. und D. Baltimore, Cell 47:921-928 (1986). In ähnlicher Weise erzeugte die zytosolische Fraktion nur ein schwaches, aber spezifisches und reproduzierbares Signal, das mit dem Signal vom dem Kernextrakt zusammen wanderte (Figur 5, vgl. Spuren 2 und 8). Die postnukleare Membranen enthaltende Fraktion zeigte keinerlei nachweisbare DNA-Bindungsaktivität (Figur 5, Spur 3).
Bei Behandlung von Zellen mit TPA über 30 Minuten wurde die Kern-NF-kB Aktivität drastisch erhöht (Figur 8, vgl. Spuren 4 und 10). Es wurde fast kein Anstieg des spezifischen Signals in der zytosolischen Fraktion beobachtet (Figur 5, vgl. Spuren 5 und 11). Die postnukleare Membranfraktion gab Anlaß zum Entstehen für einen offensichtlichen kB-spezifischen Komplex mit einer Beweglichkeit, die höher als diejenige war, die durch Kern-NF-kB gebildet wurde (Figur 5, vgl. Spuren 6 und 12). Keine der Fraktionen hatte Inhibitoren für Bindung, weil zugegebenes authentisches NF-kB in allen Fraktionen vollständig rückgewonnen wurde, was anzeigte, daß die Ergebnisse eine wahre Aktivierung der Bindungs-Spezifität widerspiegeln.

NF-kB ist nachweisbar in der zytosolischen Fraktion nach Denaturierung und Renaturierung.

Um zu prüfen, ob aktives NF-kB vorhanden sein könnte, jedoch in Fraktionen von unstimulierten 70Z/3 Zellen maskiert war, wurden Proteine von Kernextrakten und zytosolischen Fraktionen von Kontroll- und TPA-stimulierten Zellen ausgefällt, denaturiert durch Sieden in SDS plus 2-Mercaptoäthanol und fraktioniert durch Elektrophorese durch SDS-Polyacrylamid-Gele. 300 ug Protein von Kernextrakten (N) und zytosolischen Fraktionen (C) von Kontroll- (Co) und TPA-stimulierten Zellen (TPA) wurden reduzierender SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen. Von unterschiedlichen Molekulargewichts-Fraktionen des Gels eluierte Proteine (d.h. entsprechend etwa 70-62 kDa (Gelscheibe No. 6), 62-55 kDa (Gelscheibe No. 7) und 55-48 kDa (Gelscheibe No.8)) wurden einem Renaturierungsprotokoll nach Entfernung von SDS unterworfen. Hager, D.A. und R.R.Burgess, Anal. Biochem., 109:76-86 (1980) und Beispiel 2. Renaturierte Fraktionen wurden auf kB-spezifische DNA- bindungsaktivität in Mobilitätsverschiebungstests untersucht, wobei Wild-Typ und mutante Kappa leichte-Ketten- Verstärkerfragmente untersucht wurden. DNA-Bindungsreaktionen wurden mit 11 ul der renaturierten Fraktionen in Anwesenheit von 80 ng Poly(d[I-c] ) in einem Endvolumen von 15 ul durchgeführt. Anordnungen mit Wild-Typ (WT) und mutanten (mu) k Verstärkerfragmenten wurden in benachbarte Spuren eingebracht.
In Kernextrakten von TPA-stimulierten Zellen wurde NF-kB Aktivität ausschließlich in einer Molekulargewichtsregion von 62-55 kDa gefunden. Der Wirkungsgrad der Renaturierung von der Kern-NF-kB-Aktivität war etwa ein Prozent. In Figur 6 sind die aktive und zwei benachbarte Fraktionen für den Kernextrakt von TPA-stimulierten Zellen gezeigt (Spuren 13 bis 18). In Kernextrakten von Kontrollzellen wurde viel weniger NF-kB Aktivität in der gleichen Molekulargewichtsfraktion nach Renaturierung gefunden (Figur 6, Spuren 3 und 4). Die zytosolischen Fraktionen sowohl von Kontrollzellen als auch von TPA-stimulierten Zellen gaben jedoch Anlaß zum Anstieg eines starken NF-kB-spezifischen Signals (Figur 6, Spuren 9, 10 und 21, 22). Die Spezifität des Signals wurde durch verschiedene Kriterien gezeigt. Erstens, es war nur vorhanden, wenn der Wild-Typ, aber nicht das mutante DNA-Fragment in den Mobilitätsverschiebungstests verwendet wurde (Figur 6, Spuren 9, 10 und 21, 22). Zweitens, es wurde erzeugt mit Protein, das von der gleichen Molekulargewichtsfraktion eluiert worden war, die authentisches nukleares NF-kB enthielt. Drittens, beim Mischen wanderte der Komplex, der durch das vermeintliche zytoplasmische NF-kB gebildet worden war, exakt zusammen in nativen Polyacrylamid-Gelen mit dem Komplex, der durch Wechselwirkung der nuklearen Form von NF-kB mit seiner verwandten DNA gebildet worden war.
Nimmt man an, daß NF-kB von den verschiedenen Fraktionen eine ähnliche Rückgewinnung und Wirkungsgrad der Renaturierung besaß, legen die Daten nahe, daß sie signifikante Mengen von NF-kB in unstimulierten 70Z/3 Zellen durch Denaturierung, gefolgt von Fraktionierung und Renaturierung, aktiviert werden können. Weiterhin war in unstimulierten Zellen die in vitro aktivierte NF-kB-Aktivität fast ausschließlich in der zytosolischen Fraktion zurückgewonnen worden.
Die subzellulare Verteilung von zwei nicht-induzierbaren DNA-Bindungsproteinen, NF-uE3 und das Octamer-Bindungsprotein wurden auch in Mobilitätsverschiebungstests geprüft, um zu bestimmen, ob andere DNA-Bindungsfaktoren auch in zytoplasmische Fraktionen auftrennen. Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 46:705-716 (1986); Singh, H. et al., Nature, 319:154-158 (1986); und Staudt,L.M. et al., Nature, 323:640-643 (1986). Die große Mehrheit von beiden DNA-Bindungsaktivitäten wurde in Kernextrakten gefunden; zytosolische und postnukleare Membran-Fraktionen enthielten nur sehr geringe Aktivitäten (Figur 5, Spuren 13 bis 24). Es wurde keine signifikante Änderung in der Komplexbildung durch die zwei Faktoren beobachtet, wenn Fraktionen von Kontroll- und TPA-stimulierten Zellen verglichen wurden. Obgleich also subzellulare Fraktionierung künstliche Umverteilung von Proteinen erzeugen kann, spiegeln die Fraktionen, die bei dieser Untersuchung verwendet wurden, gut Kernlokalisierung einer Anzahl von DNA-Bindungsproteinen wider.

NF-kB in der zytosolischen Fraktion kann durch dissoziierende Mittel aktiviert werden.

Die Fähigkeit, zytosolisches NF-kF einfach durch Denaturierung und Renaturierung zu enthüllen, legte nahe, daß NF-kB an einen Inhibitor gebunden sein könnte, und deshalb wurden etliche Verbindungen, die Proteinkomplexe dissoziieren könnten, au ihre Fähigkeit, kB-spezifische DNA-Bindungsaktivität in Fraktionen von 70Z/3 Zellen direkt zu aktivieren, getestet. Die zvtosolische Fraktion von unstimulierten Zellen und, als eine Kontrolle, der Kernextrakt von TPA-behandelten Zellen wurden rnit den Verbindungen inkubiert vor elektrophoretischer Trennung der Protein-DNA- Komplexe. Inkubieren der zvtosolischen Fraktion mit 0,2% Natriumdesoxycholat (DOC) (in Anwesenheit von 0,2% NP-40 ) führte zu der Aktivierung von DNA-Bindungsaktivität (Figur 7A, Scur 2). Der induzierte Komplex hatte die gleiche Mobilität in nativen Gelen wie derjenige, der durch Kern-NF-kB gebildet worden war. Er schien spezifisch zu sein dür die kB-Stelle des Kapta-leichter-Kettenverstarker, weil er nicht gebildet wurde, wenn das mutante Fragment in dem Mobilitätsverschiebungstest verwendet wurde (Figur 7A, Spur 21) . Höhere Konzentrationen von DOC führten zu der Inaktivierung der neu aktivierten kB-Bindungsaktivität (Figur 7A, Spuren 3 bis 5) und auch des authentischen Kernfaktors (Figur 7A, Spuren 13 bis 15).
DOC kann von einer Lösung heraus sequentiert werden durch die Zugabe von überschüssigem nicht-ionischem Detergensmittel, vermutlich durch Einschluß des DOC in Mizellen, die durch das nicht-ionische Detergensmittel gebildet wurden. Wenn auf Behandlung der zytosolischen Fraktion mit bis zu 0,8% DOC Zugabe von 1% des nicht-ionischen Detergensmittels NP-40 folgte, wurde eine recht effiziente Aktivierung der zytosolischen kB-Bindungsaktivität erzielt (Figur 7A, Spuren 7 bis 9). Die DNA-Bindungsaktivität von in vivo aktiviertem NF-kB von Kernextrakten wurde nicht signifikant erhöht bei niedrigen Konzentrationen von DOC (Figur 7A, Spuren 11, 12 und 16, 17). Erhöhte Konzentrationen von DOC zeigten Inhibitions-Wirkungen auf die DNA-Bindungsaktivität von TPA-aktiviertem NF-kB, die parallel zu denjenigen waren, die für die in vitro aktivierte kB-Bindungsaktivität beobachtet worden war (Figur 7A, vgl. Spuren 3, 4, 5 mit Spuren 13, 14, 15 und Spuren 9, 10 mit Spuren 19, 20)
Eine partielle Aktivierung der zytosolischen kB-Bindungsaktivität wurde beobachtet nach Behandlung der zytosolischen Fraktion mit 27% Formamid, gefolgt von Verdünnung (Figur 7B, Spur 7). Mit der weiteren Zugabe von 0,2% DOC - eine Bedingung, die allein auch nur zu partieller Aktivierung führt (Figur 7B, Spur 3) - wurde eine sehr kräftige Aktivierung beobachtet (Figur 7B, Spur 11). Eine Titration zeigte, daß Formamid und DOC auf eine synergistische Weise aktivierten (Figur 7B, Spuren 2 bis 11). Die DNA- Bindungsaktivität von in vivo aktiviertem NF-kB von Kernextrakten wurde nicht durch irgendeine der Behandlungen erhöht (Figur 7B, Spuren 13 bis 22). Andererseits wurde Teil-Inhibition von DNA-Bindung von NF-kB unter einigen Bedingungen beobachtet.
Es wurde keine in vitro Aktivierung von NF-kB erzielt durch Behandlung mit Guanidiniumhydrochlorid (zwischen 0,3 und 3M), Harnstoff (zwischen 0,5 und 5M) und SDS (zwischen 0,1 und 1%) in Anwesenheit von 0,2% NP-40 . Erschöpfende Dialyse der zytosolischen Fraktion unter Verwendung von Dialyse-Membranen mit einer Abbruchkante von 25 kDa führte nicht zu einer Aktivierung von DNA-Bindungsaktivität. In der dialysierten Fraktion konnte NF-kB-Aktivität noch wirksam durch Formamid/DOC-Behandlung induziert werden, was nahelegt, daß keine frei diffundierbaren Co-Faktoren kleiner als 25 kDa für die in vitro Aktivierung erforderlich waren.

TPA Stimulierung bewirkt Umverteilung von NF-kB in die Kernfraktion.

Um zu prüfen, ob die Form von NF-kB, die nach in vitro Aktivierung in der zytosolischen Fraktion nachgewiesen wurde, quantitativ für das in Kernextrakten nach TPA Stimulierung von Zellen gefundene NF-kB zählen könnte, wurden subzellulare Fraktionen von 70Z/3 Zellen nochmals in Mobilitätsverschiebungstests nach Behandlung mit Formamid und DOC untersucht, wobei gleiche Zell-Äquivalente von subzellularen Fraktionen verwendet wurden. Gleiche Zell-Äquivalente von Kernextrakten (N) und zytosolischen (C) und postnuklearen Membranfraktionen (P) von Kontroll-(Co) und TPA-stimulierten Zellen (TPA) wurden unbehandelt gelassen (Spuren 1-6 und 13-18) oder einer Formamid/Desoxycholat-Behandlung unterworfen (Fa + DOC; Spuren 7-12 und 19-24; bezüglich der Bedingungen siehe Figur 7B, Spur 11). Diese Behandlung wurde gegenüber der DOC/NP-40 Versuchsbehandlung bevorzugt, weil sie höhere Auflösung von Banden in den Mobilitätsverschiebungstests lieferte. DNA-Bindungsreaktionen wurden in Anwesenheit von 3,2 ug Poly(d[I-C] ) unter Verwendung von 4,4 ug Protein von Kernextrakten, 8,8 ug Protein von zytosolischen Fraktionen oder 2,2 ug Protein von postnuklearen Membranfraktionen durchgeführt (alle in 4 ul Puffer D(+)). Fluorogramme von nativen Gelen sind gezeigt. Die Spezifität von Protein-DNA-Komplexen wurde kontrolliert, indem wilder Typ (kB wt) und mutante kaPpa Verstärkerfragmente (kB mutant; siehe Erklärung zu Figur 5) verwendet wurden. Der gefüllte Pfeil zeigt die Stellung von kB-spezifischen Protein-DNA-Komplexen an und der offene Pfeil zeigt die Stellungen von ungebundenen DNA-Fragmenten an.
Densitometrische Abtastung von Fluorogrammen zeigte, daß in Kontrollzellen mehr als 92% der gesamten zellularen kB- spezifischen DNA-Bindungsaktivität in der zytosolischen Fraktion rückgewonnen wurde, woraufhin Behandlung mit Formamid und DOC folgte (Figur 8, Spuren 7 bis 9). In TPA- stimulierten Zellen wurde 80% der kB-spezifischen DNA- Bindungsaktivität in Kernextrakten gefunden (Figur 8, Spuren 10 bis 12). Die verbliebene Aktivität wurde weitgehend zurückgewonnen in der zytosolischen Fraktion (Figur 8, Spur 11). Alle beschriebenen DNA-Bindungsaktivitäten waren spezifisch für die kB -Stelle, was durch ihr Fehlen angezeigt wurde, wenn das mutante Kappa Verstärkerfragment in den Mobilitätsverschiebungstests verwendet wurde (Figur 8, Spuren 13 bis 24)
Wenn die gesamte zellulare NF-kB-Aktivität, die in vitro in Kontrollzellen aktiviert worden war, mit der gesamten zellularen Aktivität, die in TPA-stimulierten Zellen nach der gleichen Behandlung gefunden wurde, verglichen wurde, wurden im wesentlichen identische Beträge der Aktivität beobachtet. Die gleichen Beträge von NF-kB-Aktivität, die in Kontroll- und TPA-behandelten Zellen gefunden wurden, legen nahe, daß die Behandlung mit Formamid und DOC zu der vollständigen Umwandlung einer inaktiven Vorstufe von NF-kB in eine Form von NF-kB mit hoher DNA-Bindungsaffinität führte. Außerdem lieferten diese Ergebnisse den Beweis für eine TPA-induzierbare Translokation von NF-kB von dem Zytosol in den Kern (Nucleus)

NF-kB Auftreten und Aktivierung in HeLa Zellen

NF-kB Aktivität kann auch in HeLa Zellen nach TPA-Behandlung induziert werden, wie dies durch das Erscheinen einer kB-spezifischen DNA-Bindungsaktivität in Kernextrakten zeigt. Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 47:921-928 (1986) Deshalb wurde das Induzieren von NF-kB in der zytosolischen Fraktion von HeLa Zellen durch Behandlung mit Formamid und DOC getestet. Zu gleichen Zell-Äquivalenten von Fraktionen wurde 17% Formamid hinzugegeben und auf 10% durch die Zugabe der DNA-Bindungsreaktionsmischung, die 4 ug Poly(d[I-C]) enthielt, verdünnt. DOC wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 0,6% hinzugegeben, um ein Reaktionsvolumen von 20 ul zu liefern. Testanordnungen enthielten entweder 1,35 ug Protein von Kernextrakten, 9 ug Protein von den zytosolischen Fraktionen oder 0,9 ug Protein von den postnuklearen Membranfraktionen (alle in 10 ul Puffer D(+)).
Es wurde auch Umverteilung von NF-kB Aktivität in den subzellularen Fraktionen nach TPA-Stimulation von Zellen abgeschätzt, wobei das Verfahren angewendet wurde, das für 70Z/3 Zellen beschrieben ist. Es wurden Mobilitätsverschiebungstests mit gleichen Zell-Äquivalenten der subzellularen Fraktionen durchgeführt. Weil HeLa Zellen etwa zehn Mal soviel zytosolisches Protein wie nukleares Protein hatten - im Gegensatz zu dem 2:1-Verhältnis in 70Z/3 Zellen - lieferte die Verwendung von gleichen Zell-Äquivalenten von Fraktionen sehr unterschiedliche quantitative Ergebnisse von denen, die mit gleichen Mengen Protein erhalten wurden. Ohne irgendeine Behandlung wurden nur Spuren von einer kB- spezifischen DNA-Bindungsaktivität in den Kern- und zytosolischen Fraktionen von HeLa Zellen nachgewiesen, und es wurde keine Aktivität in der postnuklearen Membranfraktion beobachtet (Figur 9, Spuren 1 bis 3). Nach TPA-Stimulierung von Zellen unter den gleichen Bedingungen wie für 70Z/3 Zellen war NF-kB Aktivität stark erhöht in dem Kernextrakt (Figur 9, Spur 4). Auch in der zytosolischen Fraktion wurde ein signifikanter Anstieg von NF-kB Aktivität gefunden (Figur 9, Spur 5). Dies war nicht ein Artifakt von Fraktionierung, weil die Aktivität von AP-1, einem anderen Kernfaktor (Lee, W. et al., Cell, 49:741-752, 1987), in Kernextrakten hoch angereichert war und fast nicht in der zytosolischen Fraktion von HeLa Zellen vor und nach TPA-Stimulierung nachweisbar war.
Die Behandlung von Kontrollfraktionen von HeLa Zellen mit Formamid und DOC zeigte große Beträge von kB-spezifischer DNA-Bindungsaktivität in der zytosolischen Fraktion (Figur 9, vgl. Spuren 8 und 20). Die Konzentrationen von Formamid und DOC, die für eine optimale in vitro Aktivierung von NF-kB in HeLa Zellen erforderlich waren, waren unterschiedlich von denen, die für 70Z/3 Zellen erforderlich waren; es wurde weniger Formamid und mehr DOC benötigt. Alle beschriebenen DNA-Bindungsaktivitäten waren spezifisch für die kB-Bindungsstelle in dem Kappa Verstärkerfragment (Figur 9, Spuren 13 bis 24).
Es wurde fast keine Aktivität in dem HeLa Kernextrakt und der postnuklearen Membranfraktion nach in vitro Aktivierung nachgewiesen (Figur 9, Spuren 7 und 9). Große Beträge an NF-kB-Aktivität konnten noch in der zytosolischen Fraktion von TPA-stimulierten HeLa Zellen aktiviert werden (Figur 9, Spur 11). Dies legt nahe, daß in vivo in HeLa Zellen - im Gegensatz zu 70Z/3 Zellen - nur ein kleiner Anteil des gesamten zellularen NF-kB nach einer TPA-Stimulierung aktiviert wird. Die NF-kB-Aktivität in Formamid/DOC-behandelten Kernextrakten von TPA-stimulierten Zellen war kleiner im Vergleich zu unbehandelten Kernextrakten (Figur 9, vergleiche Spuren 4 und 10), was eine partielle Inhibition der DNA-Bindungsaktivität von in vivo aktiviertem NF-kB widerspiegelt. Wie in 70Z/3 Zellen blieb die gesamte zellulare NF-kB-Aktivität in HeLa Zellen, wie sich nach in vitro Aktivierung zeigte, vor und nach TPA-Behandlung von Zellen konstant. Diese Daten implizieren, daß NF-kB durch den gleichen Mechanismus in HeLa Zellen wie in der Prä-B-Zellinie 70Z/3 aktiviert wird. Jedoch ist in HeLa Zellen TPA viel weniger vollständig in seiner Aktivierung, als dies in 70Z/3 Zellen der Fall ist.

NF-kB Auftreten und Aktivierung in anderen Zell-Typen

Es wurden auch NF-kB Auftreten und Aktivierung in verschiedenen zusätzlichen Zell-Typen, einschließlich zwei T-Zelllinien (H9, Jurkat) und Fibroblasten, und in Geweben, einschließlich menschlicher Placenta und Mäuseniere, Leber, Milz, Lunge, Muskel und Gehirn wie oben beschrieben abgeschätzt. In jedem Falle wurde gezeigt, daß NF-kB in einer DOC-aktivierbaren Form in der zytosolischen Fraktion vorhanden ist.

Auftreten von Bindungsaktivität

Die obenbeschriebenen Ergebnisse legen nahe, daß das Auftreten von Bindungsaktivität der Trennung von NF-kB von einem Inhibitor zuzuschreiben sein kann. Es wurde gezeigt, daß sowohl Größenfraktionierungs- und Denaturierungsmittel in der Lage sind, NF-kB von solch einem Inhibitor zu trennen, der offensichtlich ein niedriges Molekulargewicht hatte. Dies liefert eine vernünftige Erklärung dafür, wie NF-kB in Prä-B-Zellen, HeLa Zellen und anderen induzierbaren Zellen wie T-Zellen induziert wird.
Ob die DOC-Abhängigkeit von zytosolischem NF-kB von seiner Assoziierung mit einem Inhibitor herrührt, wurde untersucht durch Testen auf Aktivität in zytosolischen Fraktionen, die spezifisch DNA-Bindung an NF-kB in elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstests (EMSA) verhindern würden. Diese Arbeit demonstrierte das Vorhandensein eines Protein- Inhibitors, genannt IkB, in zytosolischen Fraktionen von unstimulierten Prä-B-Zellen, der NF-kB in eine inaktive DOC-abhängige Form durch eine reversible, sättigbare und spezifische Reaktion umwandeln kann. Die Inhibitions-Aktivität wird offensichtlich nach selektiver Entfernung des endogenen zytosolischen NF-kB unter dissoziierenden Bedingungen, was nahelegt, daß NF-kB und IkB in einem stöchiometrischen Komplex vorhanden waren. Entkernungs-Experimente zeigten, daß der Komplex von NF-kB und IkB wirklich zytoplasmisch ist. Die Daten sind konsistent mit einem molekularen Mechanismus von induzierbarer Gen-Expression, durch die ein zytoplasmischer Transkriptionsfaktor-Inhibitor- Komplex durch die Wirkung von TPA, wahrscheinlich durch Aktivierung von Proteinkinase C, dissoziiert wird. Der Dissoziationsvorgang führt zur Aktivierung und offensichtlichen Kerntranslokation des Transkriptionsfaktors. Es hätte den Anschein, daß IkB die Zielscheibe (das Target) für die TPA-induzierte Dissoziationsreaktion ist. Das Folgende ist eine Beschreibung dieser Untersuchung, die in näheren Einzelheiten in Beispiel 4 beschrieben ist.

Trennung von einem Inhibitor von NF-kB

Zytosolische Fraktionen von unstimulierten 70Z/3 Prä-B-Zellen wurden auf eine Aktivität, die dIe DNA-Bindungsaktivität von zugegebenem NF-kB verschlechtern könnte, in einem EMSA geprüft. Baeuerle, P.A. und D. Baltimore, Cell 53:211 (1988). Ansteigende Mengen von Zytosol von unstimulierten Zellen beeinflußten nicht signifikant die Bildung eines Protein-DNA-Komplexes zwischen NF-kB und einem k Verstärkerfragment (Figur 10, Spuren 13 bis 15). Dies zeigte das Fehlen von freiem Inhibitor an, wahrscheinlich weil alles von ihm mit endogenem NF-kB im Komplex ist. DNA-Zellulose wurde verwendet, um selektiv das endogene NF-kB von mit DOC behandeltem Zytosol in einem versuch zum Freisetzen des Inhibitors zu entfernen. Fast das gesamte NF-kB war in einer DOC-abhängigen Form vor der DOC-Aktivierung und Chromatographie vorhanden (Figur 10A, Spuren 1 und 2). Bei Anwesenheit von überschüssigem DOC wurde etwa 80% der NF-kB Aktivität durch DNA-Zellulose beibehalten (Figur 10A, vgl. Spuren 2 und 4) , wovon das meiste von der DNA-Zellulose zwischen 0,15 und 0,35 M NaCl eluierte (Figur 10A, Spuren 8 bis 10 und 16 bis 18). Die NF-kB-Aktivität, die bei hohem Salzgehalt eluierte, war nachweisbar in Mobilitätsverschiebungstests bei Abwesenheit von überschüssigem DOC (Figur 10A, Spuren 8 bis 11), was anzeigte, daß NF-kB von einer Aktivität getrennt worden war, die seine DOC- abhängige DNA-Bindungsaktivität verursachte. Im Gegensatz dazu war der kleine Prozentsatz von NF-kB Aktivität, der in den Waschflüssigkeiten verblieben war, noch abhängig von DOC (Figur 10A, vgl. Spuren 5 bis 7 und 13 bis 15). Diese Ergebnisse zeigen, daß Affinitäts-Chromatographie ausreichend ist, um die DOC-abhängige NF-kB Vorstufe in DOC-unabhängigen aktiven NF-kB umzuwandeln, was ähnlich dem ist, was in Kernextrakten von TPA-stimulierten Zellen gefunden worden war.
Die Durchflußfraktion von der DNA-Zellulose wurde auf eine Aktivität getestet, die nach Neutralisation von DOC durch ein nicht-ionisches Detergensmittel, zugegebenes NF-kB von der 0,2M NaCl-Fraktion von Kernextrakten von TPA-stimulierten Zellen inaktiv machen würde. Ansteigende Mengen Zytosol, von denen das endogene NF-kB entfernt war, hemmte die Bildung eines NF-kB-DNA-Komplexes, wie sich durch EMSA ergab (Figur 10B, Spuren 7 bis 9 und 16 bis 18). DOC-behandeltes Zytosol, das nicht über DNA-Zellulose geleitet worden war, hatte keine Wirkung (Figur 10B, Spuren 4 bis 6 und 13 bis 15), selbst wenn Zellen mit TPA behandelt worden waren. Die Tatsache, daß nach DNA-Zellulose-Chromatographie von DOC-behandeltem Zytosol sowohl das DOC-unabhängige NF-kB als auch eine Inhibitionsaktivität beobachtet wurden, machte es vernünftig zu glauben, daß NF-kB von einem Inhibitor abgetrennt worden war. Der Inhibitor wird als IkB bezeichnet.

IkB Charakterisierung

IkB fraktioniert als ein 60 bis 70 kD Protein. Die Durchflußfraktion von der DNA-Zellulose-Säule wurde Gel-Filtrierung durch G-200 Sephadex unterworfen, und die Fraktionen wurden auf Aktivität getestet, die die DNA-Bindungsaktivität von zugegebenem NF-kB, das in einem Kernextrakt von TPA-stimulierten 70Z/3 Zellen enthalten war, beeinträchtigen würde (Figur 11A). Die 67 kD-Fraktion hatte die höchste Aktivität: sie verhinderte tatsächlich vollständig Wechselwirkung von NF-kB und DNA (Figur 11A, Spuren 6). In Fraktionen von einer G-75 Sephadex -Säule war kein zusätzlicher Inhibitor mit niedriger molekularer Größe nachweisbar, was anzeigte, daß NF-kB durch ein Makromolekül von definierter Größe inaktiviert worden war Keine signifikante Inhibitions-Aktivität konnte nach Gel-Filtrierung eines DNA-Zellulose-Durchflusses von DOC-behandeltem Zytosol von TPA-stimulierten 70Z/3 Zellen gezeigt werden, was beinhaltet, daß TPA-Behandlung von Zellen IkB inaktivierte. Baeuerle, P.A. und D. Baltimore, unveröffentlichte Beobachtung).
Die Inhibitorfraktion wurde mit Trypsin behandelt, um zu testen, ob IkB ein Protein ist (Figur 11B). Tryptische Verdauung wurde abgestoppt durch die Zugabe von Rinderpankreas-Trypsin-Inhibitor (BPTI), und Proben wurden auf NF-kB Inhibition analysiert. Tryps-in-Behandlung störte die Aktivität von IkB, wie durch die vollständige Unfähigkeit der behandelten Probe, NF-kB Aktivität zu hemmen, gezeigt wurde (Figur 11B, vgl. Spuren 1 und 6). Trypsin, das mit BPTI behandelt worden war, hatte keine Wirkung (Figur 11B, Spur 5), was- zeigte, daß die Inaktivierung von IkB spezifisch durch die proteolytische Aktivität von Trypsin verursacht war. Es schien, daß IkB eine intakte Polypeptid-Struktur für seine Aktivität erfordert.
Der zytosolische Komplex von IkB und NF-kB zeigte eine offensichtliche Größe von etwa 120 bis 130 kD, beides nach Gel-Filtrierung (Figur 11A, Spur 3) und nach Sedimentation durch einen Glycerolgradienten (Figur 11C, Spuren 6 und 7). Für beide Methoden wurde Zytosol von unstimulierten Zellen unter nicht dissoziierenden Bedingungen analysiert. NF-kB war in Fraktionen aktiviert entweder durch DOC (Figur 11A) oder Formamid (Figur 11C, mittleres Feld) vor der Analyse durch EMSA. Baeuerle, P.A. und D. Baltimore, Cell, 53:211 (1988). Die Spezifität von Komplexen wurde getestet mit einer mutanten DNA-Probe (Figur 11C, rechte Felder). Lenardo, M. et al., Science, 236:1573 (1987). Das offensichtliche Freigeben eines 60 bis 70 kD Inhibitionsproteins von der zytosolischen NF-kB-Vorstufe, sei-ne Sedimentierungsgeschwindigkeit in Glycerolgradienten und seine Größe, gesehen durch Gel-Filtrierung, legen nahe, daß die inaktive NF-kB Vorstufe ein Heterodimer ist, das aus einem 55 bis 62 kD NF-kB Molekül und einem 60 bis 70 kD IkB Molekül zusammengesetzt ist. Es wurde gefunden, daß Kern-NF-kB zusammen mit dem zytosolischen Komplex von IkB und NF-kB sedimentiert (Figur 11C, oberes Feld). Native Gel-Elektrophorese, ein Verfahren, das Auflösung von Größendifferenzen von Protein-DNA-Komplexen gestattet, lieferte Beweis, daß die 120 kD Form von Kern-NF-kB, gesehen in Glycerolgradienten, von der Bildung eines Homodimeren kommt. Hope, I.A. und K. Struhl, EMBO J., 6:2781 (1987) und Baeuerle, P.A. et al., unveröffentliche Beobachtung. Durch diese Interpretationen würde Aktivierung von NF-kB einen zusätzlichen Schritt einschließen (d.h. Bildung eines NF-kB-Homodimeren). Dies ist konsistent mit der Beobachtung, daß die Protein-DNA-Komplexe, die mit in vitro aktiviertem NF-kB gebildet werden, die gleiche Mobilität in nativen Gelen haben wie diejenigen, die mit Kern-NF-kB gebildet werden. Baeuerle, P.A. und D. Baltimore, Cell, 53: 211 (1988).
Die Inaktivierung von NF-kB durch IkB ist reversibel, sättigbar und sPezifisch. Inkubation mit der Inhibitor-Fraktion kann die DNA Bindungsaktivität von NF-kB um mehr als 90% hemmen (Figur 12A, Spuren 1 und 3). Die Behandlung einer doppelten Probe mit DOC nach der Inhibitionsreaktion reaktivierte 66% der zugegebenen NF-kB Aktivität (Figur 12A; vgl. Spuren 3, 4 und 6). Dies zeigte, daß eine DOC- abhängige Form von NF-kB in vitro rekonstruiert werden kann durch die Zugabe einer IkB enthaltenden Fraktion zu Kern-NF-kB. Die unvollständige Aktivierung von NF-kB durch DOC könnte auf die DOC-neutralisierende Wirkung von nichtionischem Detergensmittel zurückzuführen sein, das noch in der Probe von der vorhergehenden Inhibitionsreaktion anwesend war.
Eine Titration und kinetische Analyse zeigten, daß IkB stöchiometrisch mit NF-kB wechselwirkt (Figur 12B). Ansteigende Mengen der Inhibitorfraktion wurden zu einer Uberschußmenge NF-kB hinzugegeben und 20 oder 60 Minuten inkubiert. Nach der DNA-Bindungsreaktion wurden NF-kB-DNA- Komplexe auf nativen Gelen separiert und durch Flüssigkeits-Szintillationszählung quantitativ bestimmt. Die Beziehung zwischen der Menge der zugegebenen IkB-Fraktion und dem Ausmaß der Inhibition war linear. Die Menge an NF-kB, das nach 20 Minuten Inkubation inaktiviert war, wurde nicht nach 60 Minuten erhöht (Figur 12B). Diese kinetischen Ergebnisse waren wahrscheinlich nicht die Folge eines schnellen Abfalls eines katalytisch aktiven Inhibitors, weil die Fraktionen vor der Reaktion inkubiert waren. Die Daten sind konsistent mit schneller Bildung eines inaktiven Komplexes durch Zugabe von IkB zu NF-kB. Die IkB-enthaltende Fraktion schien nicht NF-kB katalytisch oder kovalent zu inaktivieren: weder die Reversibilität noch die kinetischen Ergebnisse tragen solch ein Modell.
IkB wurde auf seinen Einfluß auf die DNA-Bindungsaktivität von anderen definierten Kernfaktoren getestet (Figur 13A) Diese Faktoren waren in Kernextrakten enthalten, die im wesentlichen keinen aktiven NF-kB enthielten, was sonst IkB durch Komplexbildung inaktiviert haben könnte. Die DNA-Bindungsaktivität von H2TF1, eines Transkriptionsfaktors, von dem man dachte, daß er mit NF-kB verwandt ist, wurde nicht durch die Inhibitor-Fraktion angegriffen. Baeuerle, P.A. et al., unveröffentlichte Beobachtung. Ubiquitäre und Lymphoid-spezifische Octamer-Bindungsproteine (OCTA) (Sive, H.L. und R.G. Roeder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6382 (1986) und Staudt, L.M. et al., Nature, 323:640 (1986)) blieben unbeeinflußt in ihren DNA-Bindungsaktivitäten, wie auch zwei E-Box-Bindungsfaktoren, NF-uE1 (Weinberger, J. et al., Nature, 322:846 (1986)) und NF-kE2 (Lenardo, M. et al. Science, 236:1573 (1987)), die mit u-schwere-Kette- und k-leichte-Kette-Verstärkern entsprechend wechselwirkten. AP-1, ein anderer TPA-induzierbarer Transkriptionsfaktor (Lee, W. et al., Cell, 49:741 (1987); Angel, P. et al., Cell, 49:729 (1987)), zeigte auch gleiche Komplexbildung nach Inkubation in Anwesenheit und bei Fehlen der Inhibitor-Fraktion. Weiterhin zeigte keine der undefinierten DNA-Bindungsaktivitäten, gesehen in EMSA, irgendeine Inaktivierung durch IkB. Diese Ergebnisse zeigen, daß IkB ein sPezifischer Inhibitor der DNA- Bindungsaktivität von NF-kB ist.
In vivo aktiviertes NF-kB spricht auf IkB an. IkB, das von der Mäuse-Prä-B-Zellinie 70Z/3 präpariert worden war, wurde auf Inaktivierung von NF-kB getestet, das in Kernextrakten von anderen Zellinien enthalten war. Menschlicher NF-kB, der in Kernextrakten von TPA-stimulierten HeLa Zellen und H-9 T-Lymphoma-Zellen enthalten war, wurde wirksam inaktiviert (Figur 13B). Wenn überschüssige Mengen der verschiedenen NF-kB-Aktivitäten in dem Inhibitionstest verwendet wurden, war das Ausmaß der Reduzierung von NF-kB-Aktivitäten durch eine feste Menge IkB sehr ähnlich, wenn sie durch Flüssigkeits-Szintillationszählung quantitativ bestimmt wurden. Baeuerle, P.A. und D. Baltimore, unveröffentlichte Beobachtung. NF-kB von Kernextrakten von TPA- stimulierten Madin-Darby Rindernieren- (MDBK) Zellen wurde auch inaktiviert, was nahelegte, daß die Kontrolle von NF-kB-Aktivität durch IkB unter unterschiedlichen Säugetierarten konserviert ist. Baeuerle, P.A. und D. Baltimore, unveröffentlichte Beobachtung.
NF-kB ist grundlegend aktiv in Zellinien, die von reifen B-Zellen abgeleitet sind. Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 46:705 (1986). Kernextrakte von der Mäuse B-Zellinie WEHI 231 wurden in dem Inhibitortest getestet um zu prüfen, ob NF-kB eine Modifikation in jenen Zellinien erfahren hatte, die ihre Inaktivierung durch IkB verhinderte. Sowohl NF-kB von B-Zellen als auch NF-kB von Prä-B-Zellen wurde wirksam inaktiviert (Figur 13B), was nahelegt, daß NF-kB nicht stabil in B-Zellen (oder in anderen Zellen nach TPA-Stimulierung) auf solch eine Weise modifiziert wird, daß es nicht auf Inaktivierung durch IkB ansprechen kann.
Der NF-kB--IkB Komplex ist in entkernten Zellen vorhanden. Der NF-kB--IkB Komplex zeigt eine zytosolische Lokalisierung auf subzellularer Fraktionierung (Figur 14A). Dieses Verfahren kann jedoch Artifakte verursachen. Hypotonische Lyse von Zellen kann zu Trennung von Kernproteinen in Zytosol führen, insbesondere wenn sie nicht fest mit Kernkomponenten verbunden sind. Li, J.J. und T. J. Kelly, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6973 (1984). Der Nachweis von dem KomPlex von IkB und NF-kB in entkernten Zellen wurde versucht. Entkernung wurde durchgeführt mit lebenden Zellen bei 37ºC und sollte deshalb nicht aktiven Kernimport von Proteinen beeinträchtigen, was ATP-abhängig ist und bei niedrigen Temperaturen blockiert wird. Prescott, D.M. und J.B. Kirkpatrick, in: Methods Cell Biol., D.M. Brescott, ed. (Academic Press, New York, 1973), Seite 189; Newmeyer, D.D. und D.J. Forbes, Cell, 52:641 (1987); Richardson, W.D. et al., Cell, 52:655 (1988).
Unter Verwendung von Zytochalasin-B-behandelten HeLa Zellen wurde ein Entkernungswirkungsgrad von etwa 90% erhalten (Figur 1 4A) . Entkernte und Zytochalasin-B-behandelte vollständige Zellen wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von TPA inkubiert, solubilisiert durch Detergensmittel und Proteine wurden mit hohem Salz extrahiert. Wegen der kleinen Anzahl von analysierten Zellen ist dieses Verfahren unterschiedlich zu den standardmäßigen. Gesamte Zellextrakte wurden auf NF-kB-spezifische DNA-Bindungsaktivität durch EMSA analysiert (Figur 14B). Sowohl in entkernten als auch in kompletten Zellen wurden ähnliche Beträge NF-kB-Aktivität nach TPA-Stimulierung gefunden (Figur 14B, SPuren 1 bis 4). Die Aktivität war spezifisch für NF-kB, weil sie nicht mit einem mutanten k Verstärkerfragment beobachtet wurde. Lenardo, M. et al., Science, 236:1573 (1987); Baeuerle, P.A. und D. Baltimore, unveröffentlichte Beobachtung. Diese Ergebnisse legen nahe, daß TPA- induzierbares NF-kB in HeLa Zellen vorwiegend zytoplasmisch ist, weil es noch in entkernten Zellen vorhanden ist. Die NF-kB Aktivität, gesehen unter Kontrollbedingungen (Figur 14B, Spuren 1 und 3), wurde am wahrscheinlichsten durch die angewendeten Lyse-Bedingungen aktiviert, weil sie auch in Extrakten von HeLa Zellen beobachtet wurde, die nicht mit Zytochalasin B behandelt worden waren (Baeuerle, P.A. und D. Baltimore, unveröffentlichte Beobachtung), aber nicht in Fraktionen, die nach hypotonischer Lyse erhalten wurden. Baeuerle, P.A. und D. Baltimore, Cell, 53:211 (1988). Es war jedoch noch offensichtlich, daß TPA NF-kB in entkernten Zellen aktivieren konnte (Figur 14B, Spuren 3 und 4).
Nach Behandlung mit DOC zeigten die gesamten Extrakte von vollständigen und entkernten Kontrollzellen etwa einen 2-fachen Anstieg in dem Betrag der NF-kB-Aktivität (Figur 14B, vgl. Spuren 1 und 3 mit 5 und 7). Die Demonstration von DOC-aktivierbarem NF-kB in entkernten Zellen sowie das Vorhandensein von ähnlichen Mengen an gesamter NF-kB in entkernten und vollständigen Zellen (Figur 14B, vgl. Spuren 5 bis 8) zeigte, daß eine wesentliche Menge von dem gesamten zellularen NF-kB--IkB Komplex zytoplasmisch war. Im Gegensatz zu NF-kB war der größte Teil der DNA- Bindungsaktivität von AP-1, einem bona fide Nuklearprotein, offensichtlich durch Entkernung von Zellen verloren gegangen (Figur 14B, Spuren 9 bis 12). Lee, W. et al., Cell, 49:741 (1987); Angel, P. et al., Cell, 49:729 (1987)

Mechanismus von NF-kB Aktivierung

Somit ist gezeigt worden, daß der NF-kB Kern-Transkriptionsfaktor in unstimulierten Prä-B-Zellen in einem zytoplasmischen Komplex mit einem sPezifischen Inhibitions-Protein, TkB, existiert. In diesem Komplex zeigt NF-kB nicht DNA- Bindungsaktivität in EMSA und Trennungen bei subzellularer Fraktionierung in das Zytosol. Der Komplex ist anscheinend ein Heterodimer, das aus etwa einem 60 kD NF-kB Molekül und einem 60 bis 70 kD IkB Molekül besteht. Bei TPA-Stimulation von Zellen oder nach Behandlung mit dissoziierenden Mitteln in vitro dissoziiert der NF-kB--IkB Komplex. Dies setzt NF-kB frei, welches nun ein Homodimer zu bilden scheint und in den Kern translozieren kann. Ob Dimerisation für Aktivierung von NF-kB erforderlich ist, ist nicht bekannt.
Die Inhibitionswirkung von IkB auf die DNA-Bindungsaktivität und die Kern-Lokalisierungseigenschaften von NF-kB scheint von einer einfachen physikalischen Affinität der zwei Proteine herzurühren. Der Komplex dissoziiert frei und die Komponenten verbinden sich leicht unter in vitro Bedingungen. Selbst in vivo ist Dissoziation durch kurzzeitige TPA-Behandlung und Reassoziation nach langzeitiger TPA-Behandlung offensichtlich. Baeuerle, P.A. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 53, im Druck. Das letztere rührt vermutlich von dem Abbau von Protein-Kinase C nach TPA-Aktivierung her und impliziert, daß NF-kB sich zu dem Zytoplasma zurückbewegen kann, nachdem es in dem Kern aktiv ist.
Die Wirkung von TPA scheint eine Änderung von IkB, aber nicht von NF-kB zu beinhalten. Nach TPA-Stimulierung wurde kein aktives IkB gefunden - was seine Änderung impliziert - während das nukleare NF-kB empfindlich für unmodifiziertes IkB blieb, wenn es in vitro getestet wurde. Ob inaktives IkB regeneriert werden kann, ist unklar; in Experimenten, bei denen Cycloheximid verwendet wird (Baeuerle, P.A. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 53, im Druck), war irreversibler Verlust von IkB Aktivität die einzige demonstrierbare Wirkung nach 8 stündiger TPA-Behandlung. Nimmt die Fähigkeit von TPA an, Protein-Kinase C zu aktivieren, so ist es eine vernünftige Hypothese, daß direkte oder indirekte Phosphorylierung von IkB zu seiner Dissoziation von NF-kB führt.
Es ist früher gefunden worden, daß der NF-kB--IkB Komplex in dem Zytosol rückgewonnen wird. Es wurde nun direkt gezeigt, daß der Komplex nicht von der Zelle durch Entkernung entfernt wird und deshalb wirklich zytoplasmisch ist. Welshons, W.V. et al., Nature, 307:747 (1984). Weil aktive Protein-Kinase C an die Plasma-Membran gebunden ist (Kraft, A.S. et al., J. Biol. Chem., 257:13193 (1983); Wolf, M. et al., Nature, 317:546 (1985); Kikkawa, U. und Y. Nishizuka, Ann. Rev. Cell. Biol., 2:149 (1986)), wird es in steigendem Maße attraktiv anzunehmen, daß der zytoplasmische Komplex in dem Zytoplasma (eventuell nahe der Plasma-Membran) mit Protein-Kinase C wechselwirkt und das befreite NF-kB das Signal von Zytoplasma zum Kern trägt. Unter einer Anzahl von Bedingungen wird aktives NF-kB in dem Zytoplasma gefunden. Diese Tatsache und die Reversibilität von NF-kB-Aktivierung in vivo legt nahe, daß das Protein sich frei in und aus dem Kern bewegen kann, wobei es Information, die den zytoplasmischen Aktivierungszustand von Protein-Kinase C und möglicherweise anderen signalgebenden Systemen widerspiegelt, zu dem Kern bringt.
Das Ansprechen von NF-kB auf aktivierte Protein-Kinase C tritt anscheinend indirekt durch Modifikation und nachfolgendes Freisetzen von zugeordneter IkB auf. Die Induzierbarkeit von NF-kB durch TPA ist somit abhängig von dem Vorhandensein und dem Zustand der Aktivität von IkB. Änderungen in der Menge oder der Aktivität von IkB sollte deshalb die TPA-Induzierbarkeit von NF-kB beeinflussen. NF-kB kann in der Tat nicht nur in TPA-induzierbarer sondern auch in grundlegend aktiver Form existieren (z.B. in reifen B-Zellen; Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 46: 705 (1986). Weil grundlegendes NF-kB von B-Zellen noch auf IkB in vitro anspricht, denkt man, daß IkB und nicht NF-kB während der Differenzierung von Prä-B in B-Zellen geändert wird.
IkB ist anscheinend unstabil, wenn es nicht mit NF-kB im Komplex verbunden ist. Dies wird nahegelegt durch das Fehlen von überschüssigem aktivem Inhibitor in dem Zytosol von unstimulierten Zellen. In einer Situation, bei der die Erzeugung von neuem Inhibitor verschlechtert wird, könnte der Zerfall von gelegentlich freigesetztein Inhibitor NF-kB aktivieren. Dies würde die partielle Aktivierung von NF-kB erklären, die man nach Behandlung mit den Protein-Synthese-Inhibitoren Cycloheximid und Anisomycin beobachtet. Sen R. und D. Baltimore, Cell,47:921 (1987) Die Demonstration eines spezifischen Inhibitions-Proteins von NF-kB und die Interpretation, daß Cycloheximid-Behandlung NF-kB aktivieren kann, vermutlich weil Zellen vom Inhibitor befreit werden, legt nahe, daß IkB der mutmatlich labile Repressor von k Gen-Expression (Wall, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:295 (1986)) und von NF-kB-Aktivität ist. Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 47:921 (1987).

Rolle von NF-kB in HIV-Expression

Behandlung von latent HIV-infizierten T-Zellen mit Phorbolester (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat; TPA) und mit Phytohaemaglutinin (PHA) führt zum Einsetzen von Virusproduktion. Harada, S. et al., virology, 154:249-258 (1986); Zagury, D.J. et al., Science, 232:755-759 (1986). Die gleichen Behandlungen induzieren NF-kB-Aktivität in der menschlichen T-Lymphoma-Zellinie Jurkat. Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 47:921-928 (1986). Diese Korrelation und das Auffinden, daß zwei NF-kB-Bindungsstellen stromaufwärts von der Transkriptions-Startstelle in dem HIV Verstärker vorhanden sind (Figur 1), läßt eine direkte Rolle von NF-kB bei der Aktivierung des viralen Verstärkers vermuten, einem Ereignis,das schließlich zu der Erzeugung von Virus führt. Nabel, G. und D. Baltimore, Nature, 326: 711-713 (1987). Dies wurde möglicherweise durch vorübergehende Transfektion eines Plasmids, das ein HIV LTR- gesteuertes CAT-Gen enthielt, in eine menschliche T-Lymphoina-Zellinie getestet. Nabel G. und D. Baltimore, Nature, 326:711-713 (1987). Die viralen cis-wirkenden Elemente machten die Transkriptions-Aktivität des CAT-Gens ansprechbar auf TPA/PHA Behandlung von Zellen. Diese induzierbare Transkriptions--Stimulierung des CAT-Gens war vollständig abhängig von intakten Bindungsstellen für NF-kB in dem HIV-Verstärker, weil Mutation der zwei Bindungsstellen Induzierbarkeit vernichtete. Ein Protein-DNA Komplex mit einem Fragment des HIV-Verstärkers, der die zwei NF-kB- bindungsstellen enthielt, wurde in Mobilitätsverschiebungstests nur mit Kernextrakten von TPA/PHA-stimulierten T-Zellen und nicht bei Kontrollextrakten beobachtet. Diese Beobachtungen lieferten starken Anschein, daß HIV Expression in latent infizierten T-Zellen durch den gleichen Transkriptionsfaktor induziert wird, der Kappa Gen-Expression, NF-kB, reguliert. Eine Vorstufe von NF-kB ist grundlegend vorhanden in T-Zellen. Ihre Aktivität kann durch eine Behandlung induziert werden, die antigenische T-Zellen- Aktivierung nachahmt, und nach Induzierung ist NF-kB in der Lage, an dieHIV Transkriptions-Steuerelemente zu binden und nachfolgend deren Aktivität zu vergrößern. Auf diese Weise ist der Schluß sinnvoll, daß NF-kB der physiologische Trans-Aktivator ist, der für anfängliche Expression von ruhender HIV-DNA ist, woraufhin Stimulation von T-Lymphozyten folgt.
Andere Faktoren sind auch an der Steuerung von HIV-Expression beteiligt gewesen, einschließlich das HIV-codierte tat-III Protein, der zellulare Transkriptionsfaktor Sp1 und virale Proteine, die durch das EIA Gen von Adenovirus und dem ICPO-Gen des Herpes Simplex Virus codiert werden. Muesing, M.A. et al., Cell, 48:691-701 (1987); Jones, K.A. et al., Science, 232:755-759 (1986); Gendelman, H.E. et al., Proceedings of the National Academy of Siences, USA, 83:9759-9763 (1986); Nabel, G.J. et al.,Science (1988); Rando, R.F. et al., Oncogene, 1:13-19 (1987); Mosca, J.D. et al., Nature, 325:67-70 (1987). Es ist zweifelhaft, ob tat-III und Sp1 Proteine für eine Anfangsinduzierung von HIV-Expression verantwortlich sind. Obgleich das tat-III Protein als ein starker positiver Feedback-Regulator für HIV-Expression wirkt, scheint vollständige Expression des tat-III Proteins von NF-kB abzuhängen. Muesing, M.A. et al., Cell, 48:691-701 (1987); Nabel, G. und D. Baltimore, Nature, 326:711-713 (1987). Es ist unwahrscheinlich, daß Sp1 HIV-Expression initiiert, weil es dem Wesen nach aktiv ist. Dynan, W.S. und R. Tjian, Cell, 32:669-680 (1983). Die viralen EiA und ICPO Gen-Produkte können zu Induzierung von HTV-Expression führen. Dies ist jedoch unabhängig von T-Zellen-Aktivierung durch antigenische Stimulierung und von NF-kB, wie dies durch Co-Transfektions- Experimente in menschliche T-Lymphoma-Zellen von Plasmiden mit einem HIV-Verstärker-gesteuerten CAT-Gen und Plasmiden, die die viralen Gene codieren, gezeigt wird. Der Anstieg in der CAT-Aktivität, induziert durch die viralen Gen-Produkte, war unverändert, wenn die NF-kB- Bindungsstellen in dem HIV-Verstärker durch Mutation inaktiviert waren.

Charakterisierung des NF-kB-Proteins

Mäuse-NF-kB ist ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht um 60 kDa. Dies ist durch ein DNA-Bindungs--Renaturierungsexperiment bestimmt worden, bei dem Eluate von unterschiedlichen Molekulargewichtsfraktionen eines reduzierenden SDS-Gels verwendet wurden (Figur 2A). Die Größe des nativen NF-kB-Proteins wurde auf die folgende Weise bestimmt: Kernextrakt von TPA-stimulierten Zellen wurde einer Ultrazentrifugierung auf einem kontinuierlichen Glycerolgradienten unterworfen. Die Fraktionen wurden auf DNA-Bindungsaktivität von NF-kB durch elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests getestet (Figur 2B). NF-kB-Aktivität wurde am höchsten zwischen den co-sedimentierten Rinderserumalbumin (67 kDa) und IgG (158 kDa) Standards gefunden (Figur 2B, Spuren 6 bis 8). Die Spezifität von Bindung zeigte sich durch das Fehlen eines Komplexes, wenn eine DNA-Probe mit einer Mutation in der NF-kB-Bindungssequenz verwendet wurde, um die Fraktionen zu testen (Figur 2B, rechte Spuren 4 bis 10). Lenardo, M. et al., Science, 236: 1573-1577 (1987). Es war kleine NF-kB-Aktivität in den Fraktionen enthalten, wenn erwartet werden konnte, daß ein 60 kDa Protein sedimentieren würde (Figur 2B, Spuren 4 und 5). Wenn die Sedimentation von NF-kB nicht in hohem Maße anormal ist, legen die Ergebnisse von der Glycerolgradient-Zentrifugierung nahe, daß NF-kB mit anderem Protein von näherungsweise der gleichen Größe assoziiert ist. Vermutlich bildet NF-kB ein Homodimer, weil der Protein- DNA-Komplex, der in nativen Gelen gebildet wird, bei denen der ganze Kernextrakt verwendet wird, von der gleichen Mobilität ist wie der Komplex, der mit renaturiertem NF-kB Protein von einem einzelnen Punkt eines zweidimensionalen Gels gebildet wird.
Die vorliegende Erfindung ist brauchbar als ein Mittel zum Steuern von Aktivierung in einer Wirtszelle einer NF-kB-Vorstufe, was zur Bildung von aktiviertem NF-kB führt, welches seinerseits eine Schlüsselrolle bei der Transkriptions-Aktivierung von anderen Sequenzen spielt, wie der kleichte-Kettenverstärker, der HIV-Verstärker und das Interleukin-2-Rezeptor-α-Kettengen. Es hat sich gezeigt, daß NF-kB ein ubiquitärer induzierbarer Transkriptionsfaktor ist; es hat sich gezeigt, wie es hier beschrieben wurde, daß es in vielen Typen von Zellen vorhanden ist (d.h. in allen Zelltypen, die bisher bewertet worden sind). Es dient dazu, sofortiges frühes Ansprechen zu liefern, das es bewirken kann, weil es post-translationsaktiviert ist. Als eine Folge davon können das Verfahren und die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Transkriptionsaktivierung von Genen zu steuern, die ein selektiertes zellulares Protein codieren. Änderungen in der Expression von Genen, die durch RNA Polymerase II durch Ansprechen auf Mittel transkribiert sind, wie Steroid-Hormone, Wachstumsfaktoren, Interferon, Tumorpromotoren, Schwermetallionen und Wärmeschock, werden vermittelt durch cis-wirkende DNA-Sequenzelemente wie Verstärker. Es wurde gezeigt, daß Bindung von NF-kB-Transkriptionsfaktor Transkriptionsaktivität auf verschiedene Gene überträgt. Expression von diesen Genen und anderen ähnlich beeinflußten können durch das vorliegende Verfahren gesteuert werden. Es ist zum Beispiel gezeigt worden, daß Expression von einem der zwei Elemente des Zellenoberflächen-Rezeptors, der für IL-2 spezifisch ist, durch NF-kB gesteuert wird. Somit kann in T-Zellen, die IL-2 erzeugen, die Produktion durch Steuerung der Aktivierung von NF-kB gesteuert (erhöht, reduziert) werden. Auf eine ähnliche Weise kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, um Expression von Human-Immundefizienz-Virus in infizierten Wirtszellen zu steuern.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert, die jedoch nicht auf irgendeine Weise als einschränkend angesehen werden sollen. Beispiel 1 : Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsanalyse von subzellularen Fraktionen von 70Z/3-Zellen
70Z/3 Zellkulturen wurden inkubiert in Abwesenheit (Co) und Anwesenheit von Phorbolester (TPA), woraufhin subzellulare Fraktionierung von Zellen folgte. In den DNA-Bindungsreaktionen wurden 8,8 ug Protein von Kernextrakten (N), zytosolische Fraktionen (C) und post-nukleare Membranfraktionen (P) in 4 ul Puffer D(+) verwendet. Die endmarkierten DNA-Fragmente wurden inkubiert in Anwesenheit von 3,2 ug Poly(d[I-C]) mit den subzellularen Fraktionen in einem Endvolumen von 20 ul über 15 bis 30 Minuten, woraufhin Trennung von Protein-DNA-Komplexen und ungebundener DNA auf nativen 4% Polyacrylamidgelen folgte. Fluorogramme von nativen Gelen sind gezeigt. Um kB-spezifische DNA- Bindungsaktivität nachzuweisen, wurde ein DdeI-HaeIII wild-Typ Fragment von dem Kappa leichte-Ketten-Verstärker (kB wt; Spuren 1-6) verwendet. Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 46:705-716 (1986). kB-unspezifische Aktivitäten, die an das Kappa verstärkerfragment binden, wurden nachgewiesen, indem ein Fragment verwendet wurde, das in NF-kB Bindungsstelle mutiert war, das sonst identisch zu dem wild-Typ Fragment war (Spuren 7-12). Lenardo, M. et al., Science, 236:1573-1577 (1987). NF-uE3-Bindungsaktivität und Octamer-Bindungsprotein-Aktivität wurden mit einem HaeIII-DdeI Kappa Verstärkerfragment (uE3; Spuren 13-18) und einem PvuII-EcoRI Kappa schwere-Ketten-Promotorfragment (OCTA; Spuren 19-24) entsprechend getestet. Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 46:705-716 (1986); Singh, H. et al., Nature, 319:154-158 (1986). Spezifische Protein-DNA- Komplexe sind durch gefüllte Pfeile und die Stellen von ungebundenen DNA-Fragmenten durch offene Pfeile angezeigt.

Beispiel 2 : Renaturierung von NF-kB

70Z/3 Zellen wurden in Spinnerkulturen mit RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% Serum vom neugeborenen Kalb und 50 uM 2-Mercaptoäthanol gezüchtet. HeLa Zellen wurden ebenfalls in Spinnerkulturen mit MEM-Medium,ergänzt mit 10% Pferdeserum, gezüchtet. Die Zellkulturen wurden mit 25 ng/ml 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA; Sigma) 30 Minuten lang bei Zelldichten zwischen 7x10&sup5; und 2x10&sup6; pro ml behandelt.

Subzellulare Fraktionierung

Es wurden Zellen durch Zentrifugieren über 10 Minuten bei 150xg aufgesammelt. Zellen-Pellets wurden umsuspendiert in eiskalter Phosphat-gepufferter Salzlösung und wieder durch Zentrifugieren aufgesammelt. Alle folgenden Schritte wurden bei 4ºC durchgeführt. Gewaschene Zellen wurden in vier gepackten Zellvolumen von einem hypotonischen Lyse-Puf fer umsuspendiert (Puffer A; Dignam, J.P. et al., Nucleic Acid Research, 11:1475-1489 (1983)). Nach 20 Minuten wurden Zellen durch 15 (HeLa) oder 20 Strichen (70Z/3 Zellen) mit einem lose passenden Dounce-Homogenisierer homogenisiert. Kerne wurden durch Zentrifugieren über 6 Minuten bei 4300xg aufgesammelt, in fünf Volumen Puffer A umsuspendiert und einmal durch Zentrifugieren gewaschen. Proteine wurden von gewaschenen Kernen durch hohes Salz extrahiert, woraufhin Zentrifugieren der Kernextrakte und Dialyse gegen Puffer D folgte, wie es beschrieben ist. Dignam, J.P. et al., Nucleic Acids Research, 11:1475-1489 (1983). Ein Prozent NP-40 (v/v) wurde zu den dialysierten Kernextrakten hinzugegeben. Die post-nukleare überstehende Flüssigkeit wurde 6 Minuten bei 4300xg zentrifugiert und die entstandene überstehende Flüssigkeit 1 Stunde bei 150000xg ultra-zentrifugiert. Das Pellet nach der Ultra-Zentrifugierung, das post-nukleare Membranen enthielt, wurde in Puffer D gelöst, der 1% (v/v) NP-40 enthielt (als Puffer D(+) bezeichnet). Unlösliches Material wurde durch Zentrifugieren über 10 Minuten in einer Mikrozentrifuge (Microfuge) entfernt. Die überstehende Flüssigkeit nach Ultra-Zentrifugierung (als zytosolische Fraktion bezeichnet) wurde auf Puffer D(+)-Bedingungen durch die Zugabe von Vorratslösungen einjustiert. Die Fraktionen wurden bei -70ºC gelagert.
Proteinkonzentrationen wurden durch einen Test bestimmt, bei dem Bicinchoninsäure verwendet wurde. Smith, P.K. et al., Anals of Biochemistry, 150:76-85 (1985). Das Verhältnis von dem gesamten während eines Fraktionierungsexperiments zurückgewonnenen Proteins in Kernextrakten, zytosolischen Fraktionen und post-nuklearen Membranfraktionen war 2:4:1 für 70Z/3 Zellen und 1:10:1,5 für HeLa Zellen. Diese Verhältnisse wurden verwendet, um die Fraktionen auf Protein-Konzentrationen einzustellen, die gleiche Zell-Äquivalente von subzellularen Fraktionen widerspiegelten.

Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests und Behandlungen mit dissoziierenden Mitteln.

DNA-Bindungsreaktionen wurden durchgeführt, wie es oben beschrieben ist. Die DNA-Bindungsreaktionsmischung enthielt Poly(d[I-C]) (Pharmacia), 3000 bis 6000 cpm von [³²P]endmarkierte DNA-Fragmente und einen Puffer, der aus 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM EDTA und 5% Glycerol bestand. Bindungsreaktionen und die nachfolgende Analyse auf nativen 4% Polyacrylamidgelen wurde bei Raumtemperatur durchgeführt, wie es beschrieben ist. Sen, R. und D. Baltimore, Cell, 46: 705-716 (1986). Subzellulare Fraktionen wurden mit Formamid (DNA Qualität; American Bioanalytical) vor der Zugabe von dem DNA-Bindungsreaktionsgemisch behandelt. Natriumdexoxycholat (Fisher Scientific Company) wurde nach der DNA- Bindungsreaktion hinzugegeben.

Renaturierung von NF-kB

Protein in den subzellularen Fraktionen wurde bei -20ºC durch die Zugabe von vier Volumina Aceton ausgefällt. Pellets wurden in SDS-Proben-Puffer, der 3,3% 2-Mercaptoäthanol enthielt, gelöst und 5 Minuten gekocht. Laemmli, U.K., Nature, 227:680-685 (1970). Nach SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurden Gel-Stücke von unterschiedlichen Molekulargewichts-Regionen herausgeschnitten, gemahlen, und Proteine wurden über Nacht bei 4ºC in 500 ul eines Puffers eluiert, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,9, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, 1 mM DTT, 0,2 mM EDTA, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 2,5% Glycerol enthielt. Nach Zentrifugieren über 2 Minuten in einer Microfuge wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und 10 Minuten umzentrifugiert, um Gel-Stückchen zu entfernen.
Zu 200 ul der überstehenden Flüssigkeit wurden vier Volumina Aceton hinzugegeben und Proteine wurden 2 Stunden lang bei -20ºC ausfällen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren über 10 Minuten in einer Microfuge aufgesammelt, einmal mit 1 ml Methanol bei -20ºC gewaschen und 30 Minuten in dem invertierten Rohr getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde in 2,5 ul gesättigter Lösung aus Harnstoff (ultrarein; American Bioanalytical) gelöst und mit 125 ul eines Puffers verdünnt, der 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM KCl, 2 mM DTT und 10 uM PMSF enthielt. Renaturierung wurde über ein Minimum von 18 Stunden bei 4ºC gestattet. kB-spezifische DNA-Bindungsaktivität war in Mobilitätsverschiebungstests für wenigstens 48 Stunden nach Lagerung von renaturierten Fraktionen bei 4ºC ohne merklichen Verlust von Aktivität nachweisbar.

Beispiel 3 : Subzellulare Lokalisierung der NF-kB-Vorstufe

Weil NF-kB ein DNA-Bindungsprotein ist, wird erwartet, daß es in dem Kern ansässig ist. Dies ist bestimmt wahr für NF-kB von Phorbolester-behandelten Zellen und reifen B- Zellen, wo die Aktivität in Kernextrakten nachweisbar ist. Es ist jedoch nicht notwendigerweise so für eine Vorstufe von NF-kB speziell im Hinblick auf die Tatsache, daß die Vorstufe durch Protein-Kinase C, ein zytosolisches Protein, aktiviert wird, welches in seinem aktiven Zustand mit der Plasma-Membran assoziiert ist.
Die Vorstufe von NF-kB wurde durch eine Untersuchung von subzellularen Fraktionen von unstimulierten Prä-B-Zellen auf Anwesenheit von NF-kB-Aktivität analysiert, wobei elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests verwendet wurden (Figur 3A). Geringe DNA-Bindungsaktivität wurde in den subzellularen Fraktionen nachgewiesen, was anzeigte, daß die Vorstufe in einer Form niedriger Affinität zu ihrer verwandten DNA existieren mußte (Figur 3A, Spuren 1 bis 3). In Fraktionen von TPA-stimulierten Zellen war das neu aktivierte NF-kB fast ausschließlich in dem Kernextrakt enthalten (Figur 3A, Spuren 4-6).
In einem Versuch, die DNA-Bindungsaktivität der NF-kB-Vorstufe zu aktivieren, wurden die verschiedenen subzellularen Fraktionen mit Mitteln-behandelt, die dafür bekannt sind, daß sie Protein-Protein-Wechselwirkungen schonend dissoziieren. Niedrige Konzentrationen von Desoxycholat, Formamid oder einer Kombination von beiden, die in dem Mobilitätsverschiebungstest gemischt enthalten waren, führten zu der Aktivierung einer NF-kB-spezifischen DNA-Bindungsaktivität (Figur 3B). Die Fraktion, die die Masse von der in vitro aktivierbaren NF-kB-Vorstufe enthielt, war das Zytosol (Figur 3B, Spuren 1 bis 3). Wenn Fraktionen von TPA-stimulierten Zellen der gleichen Behandlung unterworfen wurden, wurde gefunden, daß die Menge der Vorstufe in der zytosolischen Fraktion stark reduziert war, anscheinend wegen Umverteilung von aktiviertem NF-kB in die Kernextrakt-Fraktion (Figur 3B, Spuren 4 und 5). Sowohl in Kontroll- als auch in TPA-stimulierten Zellen war der Betrag der gesamten zellularen NF-kB-Aktivität, die sich nach Behandlung mit dissoziierenden Mitteln zeigte, gleich, was eine vollständige Umwandlung der NF-kB-Vorstufe in aktives NF-kB nahelegte. Zytosolische Fraktionen von HeLa Zellen und von Kalbsmilz enthielten auch NF-kB-Vorstufe, was nach Aktivierung mit dissoziierenden Mitteln gezeigt werden konnte. Diese Beobachtungen lassen stark den Schluß zu, daß NF-kB als eine inaktive Vorstufe in dem Zytosol lokalisiert ist. Aktivierung von Protein-Kinase C durch Phorbolester würde dann zu zwei Ereignissen führen: Induzieren von DNA-Bindungsaktivität und Kern-Translozierung von NF-kB.
Unter Verwendung subzellularer Fraktionen von HeLa Zellen wurde ein anderer TPA-induzierbarer Transkriptionsfaktor, AP-1, getestet um zu bestimmen, ob er auch Aktivierung und subzellulare Umverteilung bei TPA-Stimulierung zeigte. Wie durch Mobilitätsverschiebungstests nachgewiesen wurde, zeigte AP-1 von Kernextrakten keinen Anstieg in DNA-Bindungsaktivität nach TPA-Stimulierung und es gab auch keine signifikanten Mengen an AP-1 Aktivität, die in den zytosolischen Fraktionen von Kontroll- und stimulierten Zellen vorhanden gewesen wäre (Figur 4). Dies zeigte, daß der Mechanismus, durch den die Transkriptionsfaktor-Aktivität von NF-kB induziert wird, grundsätzlich verschieden von dem von AP-1 ist, obgleich das Anfangssignal - Aktivierung von Protein-Kinase C durch Phorbolester - das gleiche ist.

Beispiel 4: Untersuchung der DOC-Abhängigkeit von zytosolischem NF-kB

Zytosol von unstimulierten 70Z/3 Prä-B-Zellen in Puffer A (Dignam, J.P. et al., Nucl. Acids. Res., 11:1475 (1983); Baeuerle, P.A. und D. Baltimore, Cell 53:211 (1988)) wurde auf eine Endkonzentration von 50 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,9), 1,5 mM EDTA, 5% Glycerol und 0,2% NP-40 eingestellt. Zytosolisches Protein (45 mg) wurde zu einem Endvolumen von 4 ml mit 0,6% DOC, 0,75 g Kalbsthymus (Naßgewicht) DNA-Zellulose (Sigma; äquilibriert in Puffer G: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 5% Glycerol, 0,2% DOC, 0,2% NP-40 und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) und 1,2% NP-40 gemischt. Die Suspension wurde in einer Mini-Säule 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Dreh-Schüttler inkubiert. Die Durchflußfraktion wurde für Gel-Filtrierung verwendet. DNA-Zellulose wurde mit Puffer G gewaschen und mit einem NaCl-Stufengradienten in Puffer G eluiert. Gleiche Anteile von Fraktionen wurden durch EMSA (Sen, R. und D.Baltimore, Cell, 46:705 (1986); Baeuerle, P.A. und D. Baltimore, Cell, 53:211 (1988)) bei einer Endkonzentration von 1,2% NP-40 in Anwesenheit von entweder 0,03% DOC (nicht dissoziierende Bedingung) oder 0,6% DOC (dissoziierende Bedingung) und mit 10 ug Rinderserumalbumin (BSA) als Träger getestet. Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Figur 10 dargestellt und oben beschrieben.

Beispiel 5: Charakterisierung von IkB und seinem Komplex mit NF-kB

Die Durchflußfraktion von der DNA-Zellulose-Säule (1,55 mg Protein in 250 ul beschrieben in Beispiel 4) wurde einer G-200 Sephadex -Säule (280 mal 7 mm) mit einer Fließrate von 0,15 ml/min in Puffer G bei Raumtemperatur unterworfen. Eine Mischung von Größenmarkierern (Dextran-blau; Immunglobulin G, 158 kDa, BSA, 67 kDa, Ovalbumin, 45 kDa, Myoglobin, 17 kDa; Biorad) wurde getrennt auf der Säule vor den Probenläufen durchlaufen gelassen. Die Markierer wurden in Fraktionen durch ihre Farbe und unter Verwendung von SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) erfaßt, woraufhin Coomassie-Blau-Einfärbung folgte.
Um die Inhibitions-Aktivität zu erfassen, wurden Anteile von Fraktionen (5 ul; in Puffer G) mit 1 ul Kernextrakten (in Puffer D(+)) und 0,5 ul 10% NP-40 gemischt. Dignam, J.P. et al., Nucl. Acids, Res. 11:1475 (1983). Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsvolumen auf 20 ul gebracht durch die Zugabe einer DNA-Bindungsreaktionsmischung, die 3,2 ug Poly(dI-dC) (Pharmacia), 5 bis 20 fMole ³²Pendmarkiertes k Verstärkerfragment, 75 mM NaCl, 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 mM EDTA, 1,5 mM DTT, 7,5% Glycerol, 0,3% NP-40 und 20 ug BSA enthielt. Nach einer 20-minütigen DNA-Bindungsreaktion wurden Proben durch EMSA analysiert.
Gel-Filtrierungsfraktionen, die IkB (25 ug Protein) enthielten, wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur in Puffer G ohne jegliche Zugabe oder mit 2 ug TPCK-behandeltem Trypsin (Sigma), 8 ug BPTI (Sigma) oder mit 2 um Trypsin, das mit 8 ug BPTI inkubiert worden war, inkubiert. Tryptische Verdauung wurde durch eine 10-minütige Inkubation mit 8 ug BPTI abgestoppt, und Proben wurden analysiert, wie oben beschrieben wurde.
Kernextrakt von TPA-stimulierten 70Z/3 Zellen und Zytosol von unbehandelten Zellen (beides 220 ug Protein) wurde durch 5 ml eines kontinuierlichen 10 bis 30% Glycerolgradienten in Puffer D(+) und 150000g (SW 50,1 Rotor; Beckmann) über 20 Stunden bei 4ºC sedimentiert. Co-sedimentierte Größenmarkierer wurden in Fraktionen durch SDS-PAGE und Coomassie-Blau Einfärbung nachgewiesen. Anteile von Glycerolgradient-Fraktionen (4 ul) wurden durch EMSA mit 10 ug BSA als Träger und 0,5 ug Poly(dI-dC) analysiert. Eine NF-kB-Vorstufe wurde aktiviert, indem 4 ul der Fraktionen mit 1,5 ul Formamid behandelt wurden, bevor die DNA-Bindungsreaktionsmischung hinzugegeben wurde.

Beispiel 6: Demonstration des Vorhandenseins des NF-kB- IkB-Komplexes in entkernten Zellen

HeLa Zellen wurden in Eagle's Minimum Essential Medium, das mit 10% Pferdeserum, Penicillin (SO I.U./ml) und Streptomycin (50 ug/ml) (bezeichnet als MEM-Medium) ergänzt worden war, auf Scheiben (1,8 cm Durchmesser) gezüchtet, die von Zellkultur-Kunststoffware ausgeschnitten waren. Zum Entkernen wurden die Scheiben mit der Oberseite nach unten in Zentrifugenrohre gelegt, die mit 10 ml MEM- Medium mit 37ºC, das Cytochalasin B (10 ug/ml) enthielt, gefüllt waren, und wurden die gleiche Zeit in dem Inkubator belassen. Um den Entkernungswirkungsgrad abzuschätzen, wurden entkernte Zellen auf einer Scheibe mit Formaldehyd (3,7%) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) über 20 Minuten fixiert, 4 Minuten mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1 ug/ml; Sigma) in PBS gefärbt und in PBS gewaschen. Fluoreszenz-Mikroskopie unter UV-Licht und Phasenkontrast-Mikroskopie wurden mit einem Zeiss-Photomikroskop III durchgeführt. Kontroll- und entkernte Zellen wurden in Cytochalasin 8-freiem MEM-Medium 30 Minuten sich erholen gelassen vor einer 2-stündigen Inkubation unter Fehlen oder in Anwesenheit von TPA (50 ng/ml). Die Zellen wurden dann in eiskaltem PBS gewaschen und von den Scheiben abgeschabt in 100 ul eines Puffers, der 20 mM HEPES (pH 7,9), 0,35 M NaCl, 20% Glycerol, 1% NP-40 , 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1% Aprotinin (Sigma) und 1 mM PMSF enthielt. Nach Lyse und Extraktion über 10 Minuten auf Eis wurde teilchenförmiges Material durch Zentrifugieren (Microfuge) über 15 Minuten bei 4ºC entfernt, und die überstehenden Flüssigkeiten wurden durch EMSA analysiert.

Äquivalente

Der Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen oder feststellen können, daß unter Verwendung von nicht mehr als Routine- Experimentation viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der Erfindung, wie sie hier speziell beschrieben ist, möglich sind. Solche Äquivalente sollen in den Umfang der folgenden Ansprüche eingeschlossen sein.

Claims

1. Ein Verfahren zum Verändern der Expression in einer Zelle von einem Gen, dessen Transkriptionsaktivität durch Binden vom Nuklearfaktor kappa B (NF-κB) an den Verstärker dieses Gens verändert ist, das das Einführen eines Mittels umfaßt, das die Dissoziation des Nuklearfaktor kappa B-Inhibitors vom Nuklearfaktor kappa B (NF-κB--IκB) Komplex steuert, der in dem Cytoplasma dieser Zelle vorhanden ist.

2. Ein Verfahren zum Reduzieren der Expression in einer Zelle von einem Gen, dessen Transkriptionsaktivität durch Binden von NF-κB an den Verstärker dieses Gens aktiviert wird, das das Einführen eines Mittels umfaßt, das Dissoziation vom NF-κB--IκB Komplex verhindert, der in dem Cytoplasma dieser Zelle vorhanden ist.

3. Ein Verfahren zum Aktivieren in einer Wirtszelle einer NF-κB Vorstufe, die in dem Cytoplasma dieser Wirtszelle vorhanden ist, wobei die Vorstufe einen NF-κB--IκB Komplex umfaßt, das das Kontaktieren der Wirtszelle mit einem Mittel umfaßt, das in der Lage ist, Dissoziation des Komplexes in einen Inhibitor vom Kernfaktor kappa B (IκB) und NF-κB und Translokation dieses NF-κB in den Kern dieser Zelle zu bewirken.

4. Ein Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Mittel Natriumdesoxycholat oder 12-O-Tetradecanoylphorbol-13- acetat ist.

5. Ein Verfahren zum Steuern der Expression von humaner Immundefizienzvirus-DNA in einer Wirtszelle, die latent mit Human-Immundefizienzvirus-DNA infiziert ist, das das Verhindern des Bindens von NF-κB an Human-Immundefizienzvirus-Transkriptionssteuerelemente umfaßt.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Binden von NF-κB an Immundefizienzvirus-Transkriptionssteuerelemente verhindert wird, indem Dissoziation eines in dem Cytoplasma von der besagten Wirtszelle vorhandenen NF-κB--IκB Komplexes in IκB und NF-κB verhindert wird.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Gen eine leichte Immunglobulin-kappa-Kette codiert.

8. Ein Komplex von NF-κB und IκB mit den Charakteristiken vom NF-κB-IκB Komplex, der von cytosolischen Fraktionen von unstimulierten Prä-B Zellen erhältlich ist.

9. Der Komplex nach Anspruch 8, bei dem das Molekulargewicht annäherungsweise 120 bis 130 KD ist.

10. Der Komplex nach Anspruch 9, bei dem der NF-κB-IκB Komplex von unstimulierten Prä-B Zellen durch Gel- Filtrieren oder -Sedimentieren erhältlich ist.

11. Der Komplex nach Anspruch 10, bei dem die unstimulierten Prä-B Zellen unstimulierte 70Z/3 Prä-B Zelllen sind.

12. NF-κB-IκB Komplex, der von cytosolischen Fraktionen von unstimulierten Prä-B Zellen erhältlich ist.

13. IκB mit angenähertem Molekulargewicht von 60 bis 70 KD, das von der Durchfluß-Fraktion von cytosolischen Fraktionen von unstimulierten Prä-B Zellen erhältlich ist.

14. IκB nach Anspruch 13, das durch weiteres Fraktionieren von der besagten Durchflußfraktion von cytosolischen Fraktionen erhältlich ist und ein Molekulargewicht von annäherungsweise 67 KD aufweist.

15. Inaktive cytosolische NF-κB Vorstufe, die ein Heterodimer von einem NF-κB Molekül mit einem angenäherten Molekulargewicht von 55 bis 62 KD und einem IκB Molekül mit einem angenäherten Molekulargewicht von 60 bis 70 KD ist, die durch Fraktionierung von unstimulierten Prä-B Zellen erhältlich ist.