DE60320304T2

DE60320304T2 - Kristallstruktur von menschlichem il-18

Info

Publication number: DE60320304T2
Application number: DE60320304T
Authority: DE
Inventors: Cheryl A. King of Prussia JANSON; Nestor O. King of Prussia CONCHA
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2003-04-17
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2023-04-18
Also published as: AU2003222627A1; ES2303899T3; WO2003089653A2; EP1573032A2; EP1573032A4; WO2003089653A3; US7253260B2; JP2006508029A; ATE391725T1; EP1573032B1; US20030232032A1; DE60320304D1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Identifizierung einer kristallinen Struktur des menschlichen IL-18 (hIL-18)-Cytokins, seinen Bindungsmodus an dessen Rezeptor und Verfahren, die ein weiteres Design und eine Selektion von Molekülen mit hIL-18-ähnliche Aktivität ermöglichen.
Hintergrund der Erfindung
IL-18 ist eine Art von Cytokin oder Substanz, die eine Signaltransduktion des Immunsystems vermittelt. Wie im japanischen Patent Kokai Nrn. 27,189/96 und 193,098/96 und Okamura et al., Nature, Bd. 378, Nr. 6,552, S. 88–91 (1995) gezeigt, wurde IL-18 direkt nach seiner Entdeckung vorläufig als "Interferon-gamma-induzierender Faktor" bezeichnet. Diese Bezeichnung wurde später in "IL-18" gemäß dem Vorschlag von Ushio et al., Journal of Immunology, Bd. 156, S. 4,274–4,279, (1996) geändert. IL-18 in reiner Form besteht aus 157 Aminosäuren. Es induziert immunkompetente Zellen bei der Produktion von Interferon-gamma (hier abgekürzt als "IFN-gamma"), wobei es sich um ein nützliches biologisch aktives Protein handelt, das die Erzeugung und Cytotoxizität von Killerzellen induzieren und verstärken kann. Intensive Forschungen werden gegenwärtig durchgeführt um die verschiedenen Nützlichkeiten von IL-18-Pharmazeutika zu entwickeln und zu untersuchen. Diese mit hohen Erwartungen verbundenen Anwendungen beinhalten die Verwendung von IL-18 als antivirales, antimikrobielles, Antikrebs- und anti-immunopathisches Mittel.
In der Natur werden Cytokine einschließlich IL-18 als Substanzen produziert und sezerniert, die für die Signaltransduktion im Immunsystem verantwortlich sind. Wenn daher Cytokine an den Körper von Säugern verabreicht werden, stören sie das natürlich existierende Gleichgewicht im Immunsystem des Säugers. Die Oberflächen von Säugerzellen tragen Stellen oder "Rezeptoren", die für die Erkennung von Cytokinen veranwortlich sind und sezernierte Cytokine transduzieren kein Signal an Zellen, bis sie an die Rezeptoren gebunden sind. Im normalen Immunsystem existiert ein definitives Gleichgewicht zwischen den jeweiligen Cytokinen und ihren Rezeptoren. Es gibt gegenwärtig noch nicht erfüllte Bedürfnisse bei der Auffindung und den Kenntnissen über die biologischen und strukturellen Eigenschaften von IL-18 und seinen Rezeptoren und die Verwendung solcher Kenntnisse bei dem Entwurf von Arzneimitteln für die Behandlung und Verbesserung von Krankheiten und Störungen wie viralen und mikrobiellen Infektionen, Krebs, Entzüundungen, usw.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 01/58956 offenbart die Struktur von menschlichem IL-18 in Hinblick auf seine Sequenz und offenbart auch ein Verfahren zur Identifikation von Antikörpern, die eine hohe Affinität für menschliches IL-18 aufweisen und die seine Aktivität neutralisieren könnten.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein menschliches IL-18 Proteinmolekül mit den Koordinaten von Tabelle I in im wesentlichen reiner nativer Form.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine neue kristalline Form des menschlichen IL-18-Moleküls bereit.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung direkte Informationen hinsichtlich der spezifischen Rolle bereit, die die für die Bindung von menschlichem IL-18 an seinen Rezeptor verantwortlichen Reste spielen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine menschlich IL-18-kristalline Struktur des nativen Proteins bereit, wobei das Protein eine Cystein-zu-Serin-Substitution an Position 38 von SEQ ID NO:1 aufweist. Basierend auf dieser Struktur und molekularen Modellen, die unter Verwendung verwandter Proteine gebaut wurden, stellt sie Wege zur Bestimmung der besonders wahrscheinlichen Plätze für eine Modifikation des hIL-18-Moleküls bereit, ohne seine biologische Aktivität zu kompromitieren wie auch Verfahren, diese kristalline Form für die Identifikation, Verbesserung oder einen Antagonismus zur biologischen Aktivität von hIL-18 zu verwenden.
Die dreidimensionale Struktur von menschlichem kristallinen IL-18 Die Kristallstruktur von menschlichem IL-18 in seiner nativen Form wurde durch molekularen Ersatz bestimmt und auf eine 2,06 Å-Auflösung verfeinert. Das neue menschliche IL-18, wie IL1β ist in einem zentralem, geschlossenen β-barrel gefaltet, mit einer Gesamt-β-trefoil-(Blatt)faltung. Die folgenden Reste bilden die drei Teile des Kleeblatts: (i) 10–47 und 150–156, (ii) 103–149 und (iii) 47–102 und 1–9. Es wird erwartet, daß die Struktur von menschlichem IL-18 ähnlich zu der von murinem IL-18 ist, da die Sequenzen dieser IL-18 hoch homolog sind (65% Identität). Die von der Struktur von menschlichem IL-18 abstammende Information wirft ein Licht darauf, wie Komplexe mit pharmakologischen Mitteln gebildet werden könnten, die die Eigenschaften von menschlichem IL-18 verändern, beispielsweise Halbwertszeit und Immunogenität, während die biologische Aktivität erhalten bleibt. In Abwesenheit struktureller Informationen zum hIL-18-Rezeptorkomplex werden die hIL-18-Struktur und diejenige des ILIβ-IL1β-Rezeptorkomplxes als Modelle für Interaktionen zwischen hIL-18 und seinem Rezeptor verwendet und stellen ein rationales Führungsmodell bereit, wo potentielle Mittel im hIL-18-Molekül plaziert werden könnten. ILlβ und hIL-18 haben ähnliche Gesamtfaltungen und Strukturen, jedoch ergeben sich deutliche Unterschiede bei den beiden Strukturen nahe und an den Positionen der Loops. Im IL1β-Rezeptorkomplex etablieren die Reste in IL1β-Loop wichtige Interaktionen mit dem Rezeptor, im wesentlichen durch die beiden Oberflächen. Um die Reste von IL-18 zu identifizieren, die mit dem IL-18-Rezeptor in Wechselwirkung treten können, wurden Reste von IL-18 auf die IL1β-Struktur kartiert, indem die 153 Cα-Atome von IL1β mit IL-18 überlagert wurden, um ein Root Mean Square, r. m. s. und eine Abweichung von 9 Å zu erreichen. Basierend auf dieser Überlagerung wird vorhergesagt, daß hIL-18 mit seinem Rezeptor über etliche Oberflächen interagiert. Auf einer der vorgeschlagenen Interaktionsoberflächen ist die Rezeptor-IL-18-Grenzfläche durch die IL-18-Reste: 4–18, 30–37, 107–112, 128–135 und 145–148 ausgekleidet. Auf einer anderen vorgeschlagenen Oberfläche, die auf der anderen Seite des Moleküls lokalisiert ist, ist die Grenzfläche durch die folgenden Reste ausgekleidet: 1–8, 50–55, 89–93, 103–105 und 155–156. Dies läßt die Reste 103–149 in hIL-18 frei von irgendeiner Interaktion mit dem Rezeptor und diese Reste sind im wesentlichen Lösungsmittel-ausgesetzt. Es wird nun vorgeschlagen, daß dies der beste Platz zum Anhaften eines Derivatisierungsmittels ist (beispielsweise eines Polyethylenglykol-Moleküls) das die hIL-18-Rezeptorbindungsaktivität nicht kompromitieren würde. Dieser Vorschlag wird von den Beobachtungen von Kim et al. unterstützt, wo festgestellt wurde, daß Glu42 und Lys89 für die Interaktion von menschlichem IL-18 mit dem Rezeptor kritisch sind. J. Biol. Chem. 277(13): 10998–1003 (2002). Glu42 und Lys89 sind ähnlich für eine Interaktion mit dem IL-18-Rezeptor in unserem Modell positioniert, was die Verwendung der Kristallographiemodelierung für die Vorhersage der interagierenden Oberflächen und Interaktionen zwischen Cytokin und Rezeptor weiter validiert.
Tabelle I stellt die Atomkoordinaten von nativem menschlichen IL-18 (C38S) bereit. Die Koordinaten wurden unter Verwendung eines Modells erhalten, das die Reste 1 bis 156 in der kristallographischen asymmetrischen Einheit umfaßte. Die Aminosäuresequenz des nativen menschlichen IL-18 wird in SEQ ID NO:1 bereitgestellt. Für die hier beschriebenen Studien wurde jedoch die C38S-Mutante verwendet.
Es wird erwartet, daß die in Tabelle 1 dargestellten Atom-Koordinaten sich bei Verfeinerung der Kristallstruktur verändern, jedoch sollte die Abweichung, die sich als Ergebnis im Hinblick auf die Cα-Atome ergibt, nicht substantiell eine r. m. s. von 1,0–1,5 Å überschreiben. Änlich werden die Bindungswinkel und Bindungslängen in nicht signifikanter Weise variieren, wie routinemäßig bei anderen Proteinen beobachtet. Engh et al. (1991), Acta Crystallogr. A47, 392–400. Die Interatomwechselwirkungen werden unverändert bleiben, im experimentellen Fehler. Die relative Konformation und Orientierung oder die Positionierung der Reste in der Rezeptorbindungsstelle werden ebenfalls nicht beeinflußt sein.
Beschreibung der Figuren
1 stellt ein "Ribbon-Diagramm" von nativem menschlichen IL-18 (C38S) dieser Erfindung bereit, wobei die Ansicht entlang der Achse der β-Barrel genommen wurde und die helikalen Segmente als Bänder und die β-Blätter als Pfeile repräsentiert sind. Die Polypeptid-Kette ist regenbogenfarbig, wobei die Farbe Blau am N- und Farbe Rot am C-Terminus ist.
2 stellt ein "Ribbon-Diagramm" der sekundären Strukturelemente von menschlichen IL-18 bereit. Diese sekundären Strukturelemente von hIL-18 sind: β1 2–14, β2 19–22, β3 28–31, αl 38–41, 3₁₀ Helix 42–44, β4 47–54, β5 60–67, β6 71–75, 3₁₀ Helix 77–79, β7 82–84, β8 91–92, β9 101–106, β10 109–117, β11 123–130, β12 133–140, 3₁₀ Helix 147–149, β13 151–154.
3 stellt Diagramme von murinen IL-18, menschlichen IL-1β und menschlichen IL-18-Strukturen bereit. Ein Seite-an-Seite-Vergleich dieser Strukturen zeigt die Konformationsähnlichkeiten zwischen diesen strukturell verwandten Cytokinen.
4 stellt ein Diagramm bereit, worin das hIL-18-Modell auf den IL1β-IL1-Rezeptor-Komplex überlagert ist. Menschliches IL-18 ist in einer dünnen gelben Linie gezeichnet und ILβ-IL1 in einer dünnen grünen Linie als Cytokin und einer roten Linie als Rezeptor. Das Diagramm beleuchtet die Art und Weise, in der hIL-18 an seinen Rezeptor bindet, wie auch die Beteiligung der Aminosäurereste an Rezeptorwechselwirkungen und biologischer Aktivität.
Mutanten und Derivate
Die Erfindung beschreibt weiter Homologe, Co-Komplexe, Mutanten und Derivate der menschlichen IL-18-Kristallstruktur der Erfindung.
Die Bezeichnung "Cytokin" wie hier verwendet bedeutet ein Protein, das das Wachstum und die funktionellen Aktivitäten von Immunzellen moduliert.
Die Bezeichnung "Homolog" wie hier verwendet, bedeutet ein Protein mit einer mindestens 30%igen Aminosäuresequenzidentität mit einer funktionalen Domäne von menschlichem IL-18. Vorzugsweise wird die prozentuale Identität 40 oder 50%, noch bevorzugter 60 oder 70% und besonders bevorzugt 80 oder 90% betragen. Eine 95%ige Identität wird besonders bevorzugt.
Die Bezeichnung "Co-Komplex" wie hier verwendet bedeutet das menschliche IL-18 oder eine Mutante oder ein Homolog von menschlichem IL-18 in kovalenter oder nicht-kovalenter Assoziation mit einer chemischen Einheit oder Verbindung.
Die Bezeichnung "Mutante" wie hier verwendet, bedeutet das menschliche IL-18-Polypeptid, d. h. ein Polypeptid, das die biologische Aktivität von Wildtyp menschlicher IL-18-Aktivität zeigt, gekennzeichnet durch den Ersatz von mindestens einer Aminosäure von der Wildtyp IL-18-Sequenz. Eine solche Mutante kann beispielsweise durch Expression von menschlicher IL-18-cDNA, vorher in ihrer codierenden Sequenz durch eine Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese hergestellt, werden.
Die Bezeichnung "r. m. s." wie hier verwendet, bedeutet Root Mean Square. Sie repräsentiert die Standardabweichung der Datensammlung.
Die Bezeichnung "pro-IL-18" wie hier verwendet, bedeutet die inaktive Vorläuferform von reifem IL-18. Reifes IL-18 enthält nicht das "Pro-Fragment" und ist biologisch aktiv.
Die Bezeichnung "Molekularersatz" wie hier verwendet bedeutet ein Verfahren um eine Kristallstruktur unter Verwendung der Atomkoordinaten eines strukturell verwandten Moleküls aufzulösen.
Menschliche IL-18-Mutanten können auch durch ortsspezifischen Einbau unnatürlicher Aminosäuren in das menschliche IL-18-Protein unter Verwendung des allgemeinen Biosyntheseverfahrens von Noren et al., Science, 244: 182–188 (1989) erzeugt werden. Bei diesem Verfahren werden die Nukleotide, die die Aminosäure von Interesse in Wildtyp menschlicher IL-18 codieren, durch ein "Blank"-Unsinn-Codon ersetzt, nämlich TAG, wobei eine Oligonukleotidgerichtete Mutagenese verwendet wird. Ein gegen dieses Codon gerichteter Suppressor wird dann in vitro chemisch aminoacyliert, mit der gewünschten unnatürlichen Aminosäure. Der aminoacylierte Rest wird dann zu einem Invitro-Translationssystem hinzugefügt, um ein mutiertes menschliches IL-18-Enzym mit der ortsspezifisch eingebauten nicht-natürlichen Aminosäure zu ergeben.
Selenocystein oder Selenomethionin können in ein Wildtyp oder mutiertes Cytokin durch Expression menschlicher IL-18 codierender cDNAs in auxotrophen E. coli-Stämmen eingebaut werden. Hendrickson et al., EMBO J., 9(5): 1665–1672 (1990). Die Wildtyp oder mutierte Cytokin-cDNA kann in einem Wirtsorganismus auf einem Wachstumsmedium exprimiert werden, dem entweder natürliches Cystein oder Methionin oder beide fehlen, das jedoch mit Selenocystein oder Selenomethionin oder beiden angereichert ist.
Die Bezeichnung "schweres Atomderivat" bezieht sich auf Derivate von menschlichem IL-18, die durch chemische Modifikation eines Kristalls von menschlichem IL-18 erzeugt wurden. In der Praxis wird ein Kristall in einer Lösung eingetaucht, die das gewünschte Metallsalz oder eine organometallische Verbindung, zum Beispiel Bleichlorid, Goldthiomalat, Thimerosal oder Uranylacetat enthält, die bei Diffusion in das Proteinkristall an das Protein binden kann. Die Stellung der gebundenen Schwermetallatomstelle(n) kann durch Röntgenbeugungsanalyse des eingetauchten Kristalls bestimmt werden. Diese Information wird dann wiederum verwendet, um die zur Konstruktion einer dreidimensionalen Elektronendichtekarte benötige Phasenwinkelinformation zu erzeugen, wovon ein Modell der Atomstruktur des Enzyms abgeleitet wird, Blundell et al., PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY, Academic Press (1976).
Verfahren zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten der neuen menschlichen IL-18-kristallinen Struktur
Ein anderer Aspekt dieser Erfindung involviert ein Verfahren zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten eines menschlichen IL-18 durch die hier beschriebene Kristallstruktur. Die menschliche IL-18-Kristallstruktur der Erfindung ermöglicht die Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten der Cytokinaktivität. Solche Agonisten/Antagonisten können kompetitiv sein, an die Gesamtheit oder einen Teil des Rezeptors für menschliches IL-18 binden oder nicht kompetitiv sein und die IL-18-Aktivität inhibieren und daran binden, unabhängig davon ob dies an den Rezeptor gebunden ist.
Eine Ausführungsform untersucht menschliches IL-18-Kristall der Erfindung mit einer Varietät unterschiedlicher chemischer Molekülsonden um optimale Stellen entweder für Interaktionen zwischen solchen Kandidaten Agonisten/Antagonisten-Molekülen und hIL-18 zu bestimmen oder alternativ für zelluläre Aktivitäten. Beispielsweise ermöglichen hochauflösende Röntgenbeugungsdaten, die von Kristallen, die mit Lösungsmittel gesättigt sind, gesammelt wurden die Bestimmung der Bindungspositionen für Lösungsmittelmoleküle. Kleine Moleküle, die fest an diese Stellen binden würden, können entworfen, synthetisiert und im Hinblick auf ihre menschlichen IL-18-agonistischen/antagonistischen Aktivitäten getestet werden.
Eine andere Ausführungsform untersucht in einem Screening kleine Moleküldatenbanken im Hinblick auf chemische Einheiten oder Verbindungen, die an die Gesamtheit oder einen Teil von menschlichem IL-18 oder menschlichen IL-18-Rezeptor oder beide binden können. Dieses Screeningverfahren und seine Verwendbarkeit ist auf dem Gebiet wohlbekannt. Beispielsweise wurden solche Computermodelltechniken in einer PCT-Anmeldung WO 97/16177 , veröffentlicht am 9. Mai 1997, beschrieben.
Sobald der Agonist/Antagonist durch das Modellieren identifiziert wurde, kann er im Hinblick auf seine biologische Aktivität getestet werden. Beispielsweise können die identifizierten Moleküle über Standardscreeningformate in enzymatische Aktivitätsassays eingeführt werden. um die inhibitorische Aktivität der Verbindungen zu bestimmen oder alternativ in Bindungsassays, um die Bindung zu bestimmen. Ein besonders bevorzugtes Assayformat ist der Enzym-gebundene Immunosorbend-Assay (ELISA). Dieser und andere Assayformate sind auf dem Gebiet wohlbekannt und so gibt es keine Begrenzungen für die vorliegende Erfindung.
Die folgenden Beispiele illustrieren verschiedene Aspekte dieser Erfindung.
Beispiele/biologische Verfahren
Beispiel 1 – Die Reinigung der menschlichen IL-18 C38S-Mutante in Escherichia coli
Menschliches proIL-18 wurde in E. coli als lösliches Protein mit einem N-terminalen Hexa-His-Tag exprimiert. ProIL-18 wurde mit einer Ni-NTA-Agarosesäule gereinigt und reifes IL-18 wurde durch Spaltung der Prodomäne mit Caspase 5 erhalten. Die C38S-Mutante von IL-18 wurde so manipuliert, um das übliche Auftreten einer Intra-Disulfid-Bindung zwischen C38 und C68 bei Wildtyp IL-18 bei neutralem pH zu verhindern.
Die E. coli-Zellen wurden mit 10 ml/g in 50 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl, 5% Glycerin, 10 mM 2-Mercaptoethanol (Puffer A) enthaltend 1 μg/ml Pepstatin A und 0,4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid suspendiert. Die Zellen wurden homogenisiert und dann durch zwei Passagen durch einen Mikrofluidisierer (M110-Y, Microfluidics) bei 12 000 psi lysiert. Zellabfall wurde durch Zentrifugation bei 30 000 g für 30 min entfernt. Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA-Agarosesäule gegeben und mit 3 Säulenvolumina Puffer A gewaschen. Die Säule wurde dann mit 3 Säulenvolumina eines 30 mM Imidazolpuffers in Puffer A gewaschen und proIL-18 wurde mit 300 mM Imidazol in Puffer A eluiert, was dann in 25 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol dialysiert wurde. Die mit einem Hexa-His-Tag versehene "Pro"-Domäne wurde durch Spaltung mit Hexa-His-Tag versehener Caspase 5 in einem proIL-18:Caspase 5-Verhältnis von 50:1 pro Gewicht für 2 Stunden bei Raumtemperatur entfernt. Die Salzkonzentration der Proteinmischung wurde auf 0,5 M NaCl eingestellt und die Mischung wurde dann auf eine Ni-NTA-Agarosesäule aufgebracht. Reifes IL-18 floß durch die Säule, während Spurenmengen von intaktem proIL-18, der "Pro"-Domäne, Caspase 5 und andere geringfügigere Kontaminationen an die Ni-NTA-Säule gebunden wurden. Reifes hIL-18 in der Ni-NTA-Durchflußfraktion wurde 1:10 mit 25 mM Tris (pH 7,5), 5 mM 2-Mercaptoethanol (Puffer B) verdünnt. Die Proteinlösung wurde dann auf eine MonoQ-Säule aufgebracht und die Flution wurde mit einem linearen Gradienten von 0–0,3 M NaCl in Puffer B, vorzugsweise in 20 Säulenvolumina durchgeführt. Fraktionen, die nach der Säule gesammelt wurden, enthaltend IL-18, wurden basierend auf einer Absorption bei 280 nm Wellenlänge und den Ergebnissen der SDS-PAGE gesammelt. Der Pool wurde dann auf eine HiLoad 26/60 Superdex 75 prep grade-Säule aufgebracht, die mit 25 mM Tris (pH 8), 50 mM NaCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA prääquilibriert war und die Flution des gewünschten Proteins wurde mit einer Flußrate von 2,5 ml/min durchgeführt. IL-18 wurde als einzelner symmetrischer Peak eluiert. Fraktionen, die zu diesem Peak korrespondierten, wurden gesammelt und das Protein im Pool wurde dann auf 10,2 mg/ml für die Kristallisierung konzentriert. Dieses resultierende Produkt war mehr als 95% rein in SDS-PAGE und hatte die gewünschte Aktivität. Eine N-terminale Aminosäureanalyse wurde verwendet um seine Identität zu bestätigen.
Die hier beschriebene Erfindung stellt ein Verfahren zur Definition von Ligandenwechselwirkungen mit IL-18 und seinem Rezeptor bereit:
1. A. Wirkungen der Ligandenbindung auf die intrinsische Enzym-Fluoreszenz, erzeugt von Tryptophan-Resten.
Die Bindung von entweder einem natürlichen Liganden oder einem derivatisierten Molekül kann zu Konformationsänderungen führen, die die intrinsische Proteinfluoreszenz ändern. Unter Verwendung einer Stopp-Fluß-Fluoreszenz-Technologie kann man diese Veränderungen der intrinsischen Fluoreszenz verwenden, um die mikroskopischen Ratenkonstanten zu definieren, die mit der Ligandenbindung assoziiert sind. Alternativ kann man Steady-State-Fluoreszenz-Titrationsverfahren verwenden, um die Gesamt-Dissoziationskonstante für die Bindung zu erzeugen. Standardverfahren werden für die Bewertung der erworbenen Parameter angewandt.
Beispiel 2 – Kristallisierung, Strukturbestimmung und Verfeinerung der Kristallstruktur von menschlichem IL-18
2. A. Kristallisierung
Die menschlichen IL-18 C38S-Kristalle wachsen als hexagonale Stäbe von abgesetzten Tropfen, äquilibriert durch die Dampfphase bei Raumtemperatur gegen ein Reservoir von 500 μl Lösung, enthaltend 20% Polyethylenglykol (PEG), 0,07 mM Natriumcitrat mit einem pH von 5,6 und 0,133 M Ammoniumacetat für 2 bis 3 Wochen in Cryschem-Platten. Die Tropfen enthielten 2 μl des Proteins bei 10 mg/ml in 50 mM NaCl, 25 mM Tris bei einem pH von 8, 0,1 mM EDTA und 5 mM β-Mercaptoethanol. Die Kristalle gehören zur Raumgruppe P6(1) mit Einheitszelldimensionen a = 71,4 Å, b = 71,4 Å, c = 88,7 Å, α = β = 90°, γ = 120° und einer Kopie des menschlichen IL-18 in der asymmetrischen Einheit.
2. B. Röntgenbeugungsdatensammlung
Wir sammelten die Röntgenbeugungsdaten durch einen einzelnen menschlichen IL-18 (C38S)-Kristall, suspendiert durch eine Nylonschlaufe und blitzgefroren unter einem kalten Stickstoffgasstrom. Die Beugungsparameter wurden durch eine ADSC-Quantum 210-ladungsgekoppelte Vorrichtung bei der 17ID-Strahllinie an der Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, Illinois, erzeugt. Die Wellenlänge des monochromatischen Röntgenstrahls wurde auf 1,000 Å eingestellt. Der reziproke Raum wurde mit 1,0° Oszillationsschritten um die ϕ-Goniostaten-Achse als Probe genommen. Die Daten wurden mit HKL2000 Otwinowski, Z. in Proceedings of the CCP4 Study Weekend: "Data Collection and Processing", 29.–30. Januar, SERC Daresbury Laboratory, England (1993) verarbeitet.
2. C. Strukturbestimmungen
Die Kristallstruktur von menschlichem IL-18 wurde durch molekularen Ersatz mit der Programmpackung AMoRe [Navaza, J., Acta Cryst. A50, 157–163 (1994)] unter Verwendung der Kristallstruktur von murinem IL-18, befreit von Lösungsmittelmolekülen als Suchmodell bestimmt, da sich die murinen und menschlichen IL-18-Proteine eine 65%ige Aminosäuresequenzidentität teilen. Das Suchmolekül wurde in einer orthogonalen Zelle mit Dimensionen von 100 Å × 100 Å × 100 Å plaziert. Die Kreuzrotations- und Translationsuchen wurde unter Verwendung von Daten von 20 Å- bis 4 Å-Auslösungen und einem Integrationsradius von 25 Å durchgeführt. Die Spitzenauflösung der Kreuzmutationsfunktion korrespondierte zum IL-18-Molekül in der asymmetrischen Einheit und war unzweifelhaft von den Hintergrundpeaks diskriminierbar. Die Suche nach einer korrekten Translation ergab eine Lösung mit einem R-Faktor von 0,45 und einem Korrelationskoeffizienten von 0,47 nach einer Verfeinerung nach dem Prinzip des starren Körpers in AmoRe.
2. D. Modellaufbau und Verfeinerung
Die native hIL-18 Struktur wurde aus den Rotations- und Translationsoperationen aufgebaut, aufgefunden durch molekularen Ersatz unter Verwendung der murinen IL-18-Struktur. Die menschliche IL-18-Struktur wurde folgend auf die 2Fo-Fc und Fo-Fc-Elektronendichtekarten aufgebaut. Gemäß diesen Karten kann man das menschliche IL-18-Grobmodell etablieren, indem die Aminosäuren, die in der murinen Struktur vorliegen, durch diejenigen des menschlichen Proteins selbst ersetzt werden, wie auch durch Zugabe oder Deletion von Resten. Wir verwendeten das interaktive Computergraphikprogramm XTALVIEW um diese Manipulationen durchzuführen. McRee J. Structural Biology 125, 156–165 (1999). Dieses Grobmodell wurde dann etlichen Runden eines simulierten Annealings, Positions- und B-Faktor-Verfeinerungen unter Verwendung von CNX [Brunger et al., Science, 235, 458–460 (1987)] und REFMAC [Murshudov et al., Acta Crystallographica D5, 240–255 (1997)] unterworfen, gefolgt von einem manuellen Eingriff. Die Verfeinerung und der manuelle Aufbau wurden durch die Qualität der 2Fo-Fc- und Fo-Fc-Elektronendichtekarten überwacht wie auch den Wert von kristallographischem R und R_free. Während der Verfeinerung wurden Reflexionsdaten von Unendlich bis 2,06 λ verwendet, falls nötig, um das Masselösungsmittel innerhalb des Kristalls auszugleichen, das zur Beugungsintensität beitragen kann. Das Endmodell des menschlichen IL-18 (C38S) umfaßt die Reste 1 bis 156 [SEQ ID NO:1] und 208 Wassermoleküle. Der R-Faktor des Modells ist 0,16 und R_free ist 0,19 für 15 011 Reflexionen. Die r. m. s.-Abweichungen von der Standardgeometrie [Engh et al., Acta Cryst. A 47, 392–400 (1991)] sind 0,013 Å für Bindungslängen und 1,5° für Bindungswinkel. Tabelle 1 Atomkoordinaten der nativen menschlichen IL-18-Struktur (C38S-Mutante)

Sequenzprotokoll

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein menschliches IL-18 in kristalliner Form, wobei das Protein eine Cystein- zu Serin-Substitution an Rest 38 von SEQ ID Nr. 1 aufweist und wobei das Proteinkristall ein primitiver hexagonaler (P6,) Kristall mit Einheitszelldimensionen a = 71,4 Å, b = 71,4 Å, c = 88,7 Å, α = β = 90 und γ = 120 ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das menschliche IL-18 durch eine Kleeblatt-(β-Trefoil)-Faltung gekennzeichnet ist.
Verfahren zur Identifizierung eines Agonisten oder eines Antagonisten von menschlichem IL-18, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Peptid, einem Nicht-Peptid und einem kleinen Molekül, wobei der Agonist oder Antagonist dazu in der Lage ist, die Interaktion zwischen menschlichem IL-18 und seinem Rezeptor zu verstärken, auszulösen oder zu blockieren, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: a) Kristallisieren der Zusammensetzungen gemäß Anspruch 1 und Bestimmung der dreidimensionalen Strukturkoordinaten wie definiert in Tabelle 1; b) Einführen der dreidimensionalen Strukturkoordinaten in ein geeignetes Computerprogramm und Veranlassen, daß das Programm die Koordinaten anzeigt; c) Erzeugen eines dreidimensionalen Modells einer Testverbindung in dem Computerprogramm; d) Anzeigen und Überlagern des Modells der Testverbindung auf die dreidimensionalen Strukturkoordinaten des IL-18-Proteins; e) Bewerten, ob das Testverbindungsmodell dazu in der Lage ist, die Interaktion zwischen IL-18 und seinem Rezeptor zu beeinflussen; und f) Inkorporieren der Testverbindung in einen IL-18 Aktivitätsassay und Bestimmen, ob die Testverbindung die biologische Aktivität von menschlichem IL-18 inhibiert oder verstärkt, wobei die Verbindungen als Agonisten oder Antagonisten identifiziert werden.