DE60315343T2

DE60315343T2 - Neuartige verwendungen von durch ble-gene kodierten proteinen und antibiotika aus der bleomycin-familie

Info

Publication number: DE60315343T2
Application number: DE60315343T
Authority: DE
Inventors: Darren Sense Therap Maidenhead Hart; Ben Sense Therap Maidenhead Godber; Jonathan M. Sense Therap Maidenhead Blackburn; Mike Sense Therap Maidenhead McAndrews
Original assignee: Sense Proteomic Ltd
Current assignee: Sense Proteomic Ltd
Priority date: 2002-10-25
Filing date: 2003-10-27
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2023-10-28
Also published as: DK1565754T3; AU2003302133A1; DE60315343D1; AU2003302133A8; ATE368861T1; WO2004046730A2; JP2010156715A; EP1565754A2; WO2004046730A3; EP1565754B1; ES2290556T3; US20060194715A1; JP2006506447A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Verwendungen für die Familie der "Ble" Gene, zum Beispiel Sh Ble, Tn5 Ble, und Sa Ble und die Familie der Proteine, welche von diesen Genen exprimiert werden, die in der Lage sind, reversibel an Antibiotika der Bleomycin Familie zu binden. Die Antibiotika der Bleomycin Familie stellen DNA spaltende Glykopeptide dar und schließen Bleomycin, Phleomycin, Tallysomycin, Pepleomycin und Phleomycin D1 ein. Die Erfindung betrifft auch neuartige Verwendungen dieser Antibiotika. Insbesondere betrifft sie Fusionsproteine, welche ein Ble Protein umfassen und Hilfsmittel, Verfahren und Produkte, welche auf der Spezifität zwischen dem Ble Protein und den Antibiotika der Bleomycin Familie beruhen.
Wenn diese Ble Gene zusammen mit anderen Proteinen als Fusionsproteine exprimiert werden oder die Ble Genprodukte in einer anderen Weise mit anderen Molekülen, insbesondere Proteinen, fusioniert oder verknüpft werden, können sie zum Beispiel verwendet werden, um das Fusionsprotein schwach oder stark an eine Oberfläche, wie einen Array, insbesondere einen Mikroarray, einen Objektträger oder eine Mikrotiterplatte (wo im Allgemeinen eine starke Bindung gewünscht wird), sowie zum Beispiel an Kügelchen oder andere ähnliche Formen, welche bei einer Affinitätsaufreinigung bzw. Affinitätsreinigung (wo im Allgemeinen eine schwache Bindung gewünscht wird) verwendet werden, zu binden.
Die Erfindung betrifft aber nicht nur die Verwendung dieser Paarung zum Binden von Molekülen an Oberflächen, insbesondere an dabei nicht im Wesentlichen für einen Array geeignete Oberflächen, sondern auch die Verwendung eines Ble Fusionsproteins zusätzlich als ein Faltungs- und Löslichkeitsmarker. Sie betrifft auch die Verwendung von "markierten" Antibiotika aus der Bleomycin Familie, welche aufgrund ihrer Spezifität für die Ble Proteine als Marker für eine zelluläre Lokalisation geeignet sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine Expression von Humanproteinen in heterologen Systemen, wie Bakterien, Hefe, Insektenzellen oder Säugetierzellen kann zur Herstellung von fehlerhaft gefalteten Proteinen führen, was zur Bildung von unlöslichen Aggregaten und/oder einer niedrigen Ausbeute der exprimierten Proteine führt. Für die gesamte funktionelle Proteomarbeit ist die Herstellung von richtig gefalteten oder nativen Proteinen wesentlich, und ein Großteil der Arbeit wird häufig durchgeführt, um die Expression von einzelnen Proteinen zu optimieren.
Zwei Gebiete in denen eine fehlerhafte Faltung und schlechte Löslichkeit signifikant sein können, werden unten dargestellt:
Problematische Unlöslichkeit von gentechnisch hergestellten Proteinen
Die Manipulation der Proteinfunktion durch Gentechnik stellt ein Hauptstudiengebiet mit starken kommerziellen und akademischen Interessensvertretern dar. Die gewünschten Eigenschaften, welche bei solchen gentechnisch hergestellten Proteinen gesucht werden, schließen eine veränderte Substratspezifität, eine neue katalytische Funktion, eine verbesserte Bindungsspezifität und eine verbesserte thermische oder pH-Wert-Toleranz ein. Die anfänglich in das Protein eingeführten Mutationen führen jedoch häufig zu einem Verlust einer löslichen Expression, und kompensierende Mutationen, um die Löslichkeit wiederherzustellen, sind gewöhnlich unmöglich vorherzusagen.
Problematische Unlöslichkeit von Proteinen, die rekombinant in heterologen Wirten exprimiert werden
Ein Exprimieren rekombinanter Proteine in Escherichia coli wird häufig, insbesondere für eine Massenherstellung von Protein (z.B. industrielle Enzyme, für die Röntgenkristallographie), aufgrund der Einfachheit der Fermentation, der Abwesenheit einer heterogenen posttranslationalen Modifikation, der Einfachheit der nachfolgenden Verarbeitungsschritte und der hohen Materialausbeuten bevorzugt. Ein häufig auftretendes Problem, insbesondere bei eukaryotischen Proteinen, ist jedoch, dass das rekombinan te Material unlöslich exprimiert wird und daher inaktiv ist. Solche problematischen Proteine können löslich in komplizierteren Systemen (z.B. Pichia pastoris, Baculovirus) exprimiert werden, aber die geringeren Ausbeuten und das teurere Verfahren können zu einem kommerziell weniger attraktiven Produkt führen.
In beiden dieser Fälle weist ein Verfahren zum Erzeugen löslicher Formen eines unlöslichen Proteins einen großen Nutzen auf. Eine Zufallsmutagenese des Proteins, um eine Bibliothek von Varianten zu erzeugen, gefolgt von einer Selektion oder einem Screening auf eine lösliche Expression stellt einen Ansatz dar. Dies wird häufig als "gerichtete Evolution" bezeichnet. Die Anforderungen eines solchen Screenings liegen darin, dass viele variierende Klone parallel untersucht werden können, da die beteiligten Bibliotheken groß sind (häufig > 10⁶ Mitglieder). In einigen Fällen kann die Aktivität des Zielproteins direkt überprüft werden. Dies tritt jedoch relativ selten auf und erfordert häufig, dass jeder Klon in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte lysiert werden muss, und häufig weisen die Proteine keine nachweisbare Aktivität auf.
Ein effizienteres Verfahren liegt darin, das Protein mit einem zweiten "Reporter"-Protein mit einem visuell nachweisbaren Phänotyp zu fusionieren. Da die zwei Proteine physikalisch verknüpft sind, ist die Löslichkeit des Reporters (und daher die Anwesenheit des beobachtbaren Phänotyps) abhängig von der Löslichkeit des anderen. Von verschiedenen solcher Reportersysteme wurde berichtet. Vorzugsweise kann der Phänotyp ohne Verfahrensschritte beobachtet werden (d.h. während die Klone noch als Kolonien auf Agarplatten wachsen), was eine Analyse mit hohem Durchsatz erlaubt.
Eine Expression rekombinanter Proteine in großem Maßstab für die Herstellung von Proteinarrays stellt ein Gebiet der Proteomik dar, welches die funktionelle Beschreibung von Proteinen in einer parallelen Weise umfasst. Für viele Tausende von Proteinen ist es erforderlich, dass sie in einer löslichen und gefalteten Weise exprimiert werden. Gewöhnlich werden Expressionsbibliotheken verwendet, wobei Gene unter die Kontrolle eines Promotors gebracht werden, und anschließend eine Expression des Gens induziert wird. Der nächste Schritt liegt darin, zu untersuchen, welche Klone gefaltetes rekombinantes Protein exprimieren. Auf einer individuellen Grundlage wird dies gewöhnlich durch Fraktionieren von Zelllysaten in lösliche und unlösliche Bestandteile durch Zentrifugieren und eine nachfolgende Analyse der Fraktionen durch Gelelektrophorese erreicht. Dieser Ansatz ist für einen sehr kleinen Durchsatz, und ein Ausweiten auf die Menge, die zum Screenen von Bibliotheken benötigt wird, ist logistisch nicht machbar. Daher gibt es einen Bedarf für ein Verfahren, um Expressionsbibliotheken auf Klone zu screenen, welche lösliche, gefaltete Proteine herstellen, die anschließend für funktionelle Untersuchungen verwendet werden können. Eine Fusion der rekombinanten Proteine an ein Reporterprotein erlaubt eine einfache Bestimmung ihrer Löslichkeit.
Bevor betrachtet wird, was bislang getan wurde, ist es nötig, die wichtige Unterscheidung zwischen einem "Screening", in welchem alle Mitglieder einer Sammlung mit einer Teilmenge untersucht werden, welche mit den gewünschten, zu isolierenden Eigenschaften übereinstimmt, und einer "Selektion", in welcher nur die Mitglieder von Interesse beobachtbar sind, zu machen.
Selektionen sind leistungsfähiger als Screenings, wenn sehr große Anzahlen bearbeitet werden, da es praktische Beschränkungen gibt, die mit der Handhabung und dem Analysieren großer Anzahlen von Klonen verbunden sind. Gängige Beispiele für Screenings, welche in der Molekularbiologie verwendet werden, stellen Blau/Weiß-Selektion und GFP-Fluoreszenz dar.
Beschriebene Löslichkeits-/Faltungsreporter, welche zu einem farbbasierten (visuellen) Screening führen, verwenden β-Galactosidase (Wigley, W.C., Stidham, R.D., Smith, N.M., Hunt, J.F. & Thomas, P.J. Protein solubility and folding monitored in vivo by structural complementation of a genetic marker protein. Nat. Biotechnol. 19, 131–135 (2001)) und grün fluoreszierendes Protein (GFP) (Waldo, G.S., Standish, B.M., Berendzen, J. & Terwilliger, T.C. Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 17, 691–695 (1999)).
Eine Optimierung der Proteinlöslichkeit durch gerichtete Evolution zur Verwendung in strukturellen Untersuchungen wurde ebenfalls unter Verwendung von GFP durchgeführt. (Pédelacq, J.D. et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nat. Biotechnol. 20, 927-932 (2002)).
In der Literatur gibt es verschiedene Beispiele für das Ausnützen von Fusionsmarkern als Indikatoren für Proteinfaltung und -löslichkeit. Das Prinzip, welches diesen Systemen zugrunde liegt, ist die Beobachtung, dass Proteinfaltung und -löslichkeit eng miteinander korreliert sind, da fehlgefaltetes Protein gewöhnlich unlösliche Aggregate bildet oder durch die Wirtszelle stark proteolysiert wird. Es wird daher angenommen, dass ein Protein, wenn es löslich in einer nicht proteolysierten Form exprimiert wird, in seiner richtig gefalteten Form vorliegt. Wenn eine Fusion zwischen einem Protein und einem anderen vorgenommen wird, ist die Faltung und Löslichkeit der einen Domäne mit der des anderen verknüpft. Dies ist in 1 gezeigt, welche das Prinzip eines Faltungsmarkers zum Untersuchen der Löslichkeit des Gen X Expressionsprodukts darstellt. Nur wenn das Proteinprodukt von Gen X löslich ist, wird der Phänotyp der Fusion offensichtlich. In diesem Fall führt die Fusion zu grün fluoreszierenden Kolonien, welche eindeutig identifiziert werden können.
Eine Leben-oder-Tod Selektion auf Löslichkeit und Faltung unter Verwendung von Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) wurde beschrieben (Maxwell, K.L., Mittermaier, A.K., Forman-Kay, J.D. & Davidson, A.R. A simple in vivo assay for increased protein solubility. Protein Sci. 8, 1908–1911 (1999)).
Von Screening-Verfahren, welche die Erzeugung eines chimären Proteins einbeziehen, welches eine Region eines instabilen Proteins umfasst, die mit einer Region eines Markergenprodukts verknüpft ist, wurde in der US Patentanmeldung US 2003/0022151 berichtet.
DEFINITIONEN
So wie hier definiert, stellen "Ble" Gene eine Familie von Genen dar, welche Proteine exprimieren, die reversibel die Glykopeptid-Antibiotika der Bleomycin Familie binden, und schließen Sh Ble, Tn5 Ble und Sa Ble ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Im Allgemeinen verleihen diese Gene (oder genauer, die Genprodukte, welche von diesen Genen kodiert werden) ihrem Wirt eine Resistenz gegen die Glykopeptid-Antibiotika der Bleomycin Familie.
Die "Antibiotika der Bleomycin Familie" stellen DNA spaltende Glykopeptide dar und schließen Bleomycin, Phleomycin, Tallysomycin, Pepleomycin und Phleomycin D1 ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
So wie hier verwendet, schließt der Begriff "Proteine" sowohl vollständige Proteine, Polypeptide, als auch Untereinheiten oder Domänen davon ein.
So wie hier verwendet, bezeichnet ein "Fusionsprotein" ein Protein, welches einen "Marker" bzw. "Tag" am N- und/oder C-Terminus umfasst, welcher an Mitglieder der Antibiotika der Bleomycin Familie bindet. Das Fusionsprotein kann als ein Fusionsprotein aus einem Ble Gen enthaltenden genetischen Konstrukt exprimiert werden oder kann entweder durch ein Intein vermitteltes Spleißing von zum Beispiel zwei getrennten Polypeptiden oder durch die chemische Ligation von zwei solchen Peptiden gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren gebildet werden.
Der "Tag" wird anschließend als ein signalgebender Bestandteil und/oder als Hilfsmittel verwendet, um das Fusionsprotein weiter zu manipulieren. Er kann daher verwendet werden, um das Fusionsprotein an eine Oberfläche oder an ein anderes Molekül zu binden, so wie zum Beispiel ein visuelles Indikatormolekül, wie ein fluoreszierendes Molekül, oder um eine Eigenschaft des Fusionsproteins anzuzeigen, z.B. dass es so gefaltet ist, dass es wahrscheinlich funktionsfähig ist.
Die relativen Begriffe "starker Binder" und "schwacher Binder" und "hohe Dichte" und "niedrige Dichte" werden hier verwendet, um funktionell zwischen Beispielen zu unter scheiden, in denen es wünschenswert ist, eine im Wesentlichen irreversible Bindung zu erreichen, und der Situation, in welcher beabsichtigt wird, dass die Bindung rückgängig gemacht werden wird, wie bei einer Affinitätsaufreinigung. Daher, weil zum Beispiel das Sh Ble Protein ein Dimer ist, welches zwei Moleküle Bleomycin kooperativ binden kann (die erste Affinität beträgt ~600 nM, während die zweite Affinität ~100 nM beträgt), ist es möglich, die Bindungseigenschaften der Ble Proteine in einer selektiven Weise zu verwenden. Wenn man zum Beispiel eine Oberfläche (z.B. ein Kügelchen) hat, welche mit Bleomycin in niedriger Dichte beschichtet ist, dann würde man erwarten, dass durchschnittlich ein Sh Ble Dimer von einem Bleomycin Molekül gebunden werden würde. Wenn man eine Oberfläche (z.B. ein Kügelchen) hat, welche mit Bleomycin in einer hohen Dichte beschichtet ist, dann würde man im Gegensatz dazu erwarten, dass durchschnittlich ein Sh Ble Dimer von zwei Bleomycin Molekülen gebunden werden würde (jedes bindet eine der zwei Dimer-Untereinheiten), insbesondere wenn die Bleomycin Moleküle selber mit flexiblen Linkern (z.B. Polyethylenglykol (PEG)-Polymeren) verbunden sind. Da in diesem letzten Fall die zwei Bleomycin Moleküle effektiv über die Oberfläche miteinander verknüpft sind, wird die zweite Bindungsaffinität nun mehrere Größenordnungen größer sein, als wenn die zwei Moleküle nicht miteinander verknüpft sind. Mit anderen Worten, die Bindungsaffinität wird signifikant durch einen Chelateffekt verstärkt. Dieser Effekt kann zum Vorteil verwendet werden, da man bei zum Beispiel einem Array (wo man eine im Wesentlichen irreversible Bindung wünscht) und einem reversiblen Fängersystem, wie einem Kügelchen, verschiedene Bindungsaffinitäten wünschen würde.
Durch Kontrollieren der Oberflächendichte des Antibiotikums, wie Bleomycin, sollte es so möglich sein, einfach zu kontrollieren, ob die Sh Ble Fusionen schwach oder stark an die Oberfläche binden. Ein schwaches Binden würde für Affinitätsaufreinigungen angemessen sein, während starkes Binden für ein Immobilisieren in Arrays angemessen sein würde.
Als eine Alternative zum Immobilisieren der Bleomycin Moleküle auf einer Oberfläche, kann man sie kovalent mit zum Beispiel Amin-reaktiven fluoreszierenden Farbstoffen, wie NHS-aktiviertem Fluorescein, Cy3, Cy5 und Rhodamin, koppeln. Es sollte anschließend möglich sein, die fluoreszierenden Bleomycin Derivate in vollständige Zellen (sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen) einzudiffundieren, wobei die Derivate selektiv an Sh Ble Fusionsproteine binden würden. Auf diese Weise kann der Sh Ble Tag als ein Marker der zellulären Lokalisation verwendet werden (in derselben Weise, wie GFP zur Zeit verwendet wird). Dies wird auch ermöglichen, dass der Sh Ble Tag sowohl als selektierbarer Marker (d.h. Leben-oder-Tod) als auch als screenbarer Marker (d.h. Fluoreszenz basiert) verwendet werden kann.
In einem Aspekt der Erfindung nimmt der Träger die Form einer Sonde an, welche in der Lage ist, als ein Ziel in einer Analyse mit einer Laser-Desorptions/Ionisierungsmassenspektrometrie zu wirken, zum Beispiel einer Matrix unterstützten Laser-Desorption/Ionisierung (MALDI für engl.: matrix assisted laser desorption/ionisation). Die Sonde trägt die Analyten, zum Beispiel Proteine, während solcher Verfahren und interagiert mit der Repeller-Linse der ionenoptischen Anordnung, welche in Laser-Desorptions-Ionisierungs-Time-Of-Flight (TOF) Massenspektrometern des Standes der Technik gefunden wird, sodass die Analyten in gasförmige Ionen konvertiert werden, um eine Analyse zu erlauben. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen Sonden von Trägern für eine MALDI-Analyse, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, abgeleitet werden, welche so behandelt werden, dass ein Protein Bindungsrest mit hoher Affinität, z.B. Phleomycin D1, auf der Sondenoberfläche anwesend ist, welcher die Sh Ble Fusionsproteine für eine nachfolgende Analyse bindet. Zum Beispiel können gängige Glas oder Gold MALDI-Träger verwendet werden.
So wie hier definiert, ist ein "Mikroarray" ein Array, in dem die Größe der einzelnen Zielbereiche, d.h. die einzelnen Bereiche, welche durch einen Laser untersucht werden, in der Größenordnung von Mikrometern oder weniger liegt. Während sie am oberen Ende der Skala, bei ungefähr 1000 Mikrometern Durchmesser, mit dem bloßen Auge sichtbar sein können, werden die einzelnen Zielbereiche am unteren Ende der Skala nicht eindeutig mit bloßem Auge unterscheidbar sein.
Die "Arrays" werden typischerweise in Matrizes angeordnet, welche mehrere Zeilen und Spalten umfassen. Die Anzahl der einzelnen Zielbereiche wird davon abhängen, was gescreent werden soll, obwohl es im Allgemeinen wünschenswert ist, eine hohe Dichte dieser einzelnen Bereiche auf der Sondenoberfläche zu haben, da dies ein Screening mit hohem Durchsatz erleichtern wird. Typischerweise wird eine Sonde mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 100, weiter bevorzugt mindestens 1000 und so viele wie 10.000 oder mehr darauf hergestellte Zielbereiche umfassen. (Typischerweise wird eine Sondenoberfläche eine Fläche von ungefähr 10.000 mm² aufweisen – eine Bruker-Sonde weist eine Fläche von 10.292 mm² auf, obwohl es kein Erfordernis gibt, die Gesamtheit der Sonde zu verwenden, und der Mikroarray kann auf eine oder mehrere Matrix/Matrizes darauf angewendet werden). Die tatsächliche Dichte in einer gegebenen Matrix wird von der Größe der einzelnen Zielbereiche (welche typischerweise als Punkt gestempelt werden) und dem Abstand zwischen den benachbarten Punkten abhängen. Daher werden die einzelnen Zielbereiche typischerweise mit einer Dichte von mehr als 1 einzelnen Zielbereich pro mm² innerhalb irgendwelcher Matrizes anwesend sein.
"Linkermoleküle" stellen Moleküle dar, welche so funktionieren, wie ihr Name andeutet. Sie stellen Moleküle dar, welche funktionelle Gruppen umfassen, die es erlauben, dass Brücken zwischen verschiedenen Molekülen gebildet werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das Proteinprodukt von zum Beispiel dem She Ble Gen kodiert ein Protein, welches, wenn es von einer Zelle exprimiert wird, durch Binden an das Antibiotikum und Absondern desselben eine Resistenz gegen Antibiotika der Bleomycin Familie, einschließlich Phleomycin D1, verleiht. (Gatignol, A., Durand, H. & Tiraby, G. Bleomycin resistance conferred by a drug-binding protein. FEBS Lett 230, 171–175. (1988)).
Diese Antibiotika induzieren andernfalls einen DNA-Strangbruch. Wenn zum Beispiel das Sh Ble Gen in einer Tandemanordnung mit einem zweiten Gen von Interesse fusio niert wird, wobei ein Fusionsprotein kodiert wird, verleiht die Expression des Fusionsproteins auch eine Resistenz gegen Phleomycin D1. Wenn das Gen von Interesse ein unlösliches Protein oder Proteinfragment kodiert, wird der Phleomycin D1-Resistenz verleihende Phänotyp nicht beobachtet, da das Fusionsprotein unlöslich ist und nicht in der Lage ist, das Antibiotikum zu binden. Dies bildet die Grundlage einer neuartigen Leben-oder-Tod Selektion für gefaltete, lösliche Proteine.
Da zum Beispiel das Sh Ble Protein Phleomycin D1 fest und kooperativ bindet, haben die Erfinder zusätzlich gezeigt, dass es als ein Affinitäts-Tag verwendet werden kann, wenn eine Oberfläche bereitgestellt wird, welche mit zum Beispiel Phleomycin D1 oder einem Analogen derivatisiert ist.
Weiterhin sollte es zum Beispiel möglich sein, durch Verknüpfen eines visuellen Indikators mit dem Antibiotikum und durch Binden des markierten Antibiotikums an das Fusionsprotein über den Tag, das Ble Fusionsprotein als zum Beispiel einen Marker für eine zelluläre Lokalisation zu verwenden.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Immobilisieren eines Proteins an einer Oberfläche bereitgestellt, wobei das Protein an die Oberfläche als ein Ble Fusionsprotein bereitgestellt wird, und die Oberfläche eine Oberfläche ist, die mit einem Antibiotikum aus der Bleomycin Familie derivatisiert wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ble Fusionsprotein als ein Expressions- und Faltungsmarker und als ein Affinitäts-Tag verwendet.
Antibiotika aus der Bleomycin Familie schließen Bleomycin, Phleomycin, Tallysomycin, Pepleomycin und Phleomycin D1 ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugte Mitglieder schließen Bleomycin A2, Bleomycin A5, Bleomycin A6, Bleomycin B2 und Phleomycin D1 ein.
Ein Vorteil von Bleomycin A5 und A6 liegt darin, dass sie eine terminale primäre Amingruppe umfassen, welche verwendet werden kann, um das Protein zum Beispiel an eine Amin-reaktive Oberfläche zu koppeln. Typische Gruppen, die verwendet werden, um eine Amin-reaktive Oberfläche herzustellen, schließen: Aldehyde, Epoxide, N-Hydroxysuccinamide und Isothionate ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Natürlich können andere funktionelle Gruppen, welche auf den Antibiotika anwesend sind, verwendet werden, um die Antibiotika an eine Oberfläche zu koppeln, und dies wird dem Fachmann offensichtlich sein.
In einem bevorzugten Beispiel kann ein Koppeln durch Umsetzen der Amingruppe mit einer Amin-reaktiven Oberfläche, wie zum Beispiel einer NHS-aktivierten, Polyethylenglykol (PEG) derivatisierten Oberfläche, erreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche die Oberfläche eines Arrays, insbesondere eines Mikroarrays und weiterhin insbesondere eines MALDI-Arrays, obwohl es eine Mikrotiterplatte, ein Objektträger (wobei die Oberfläche die Oberfläche einer Sonde darstellt) oder ein Kügelchen (wobei die Oberfläche die eines Reinigungsmediums darstellt) sein könnte.
Daher wird gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Sonde bereitgestellt, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Zieloberfläche aufweist, die einen Array mit einer Vielzahl von einzelnen Zielbereichen umfasst, die einen oder mehrere Analyt-Fängerrest/e präsentieren, der/die ein Antibiotikum aus der Bleomycin Familie umfasst/umfassen.
Eine solche Zieloberfläche weist typischerweise eine Beschichtung in hoher Dichte mit dem Antibiotikum auf, sodass der Zielanalyt mit einer hohen Affinität gefangen wird, vorzugsweise weniger als 400 nM, weiter bevorzugt weniger als 200 nM, weiterhin insbesondere noch weniger als 150 nM. In dem erwähnten besonderen Beispiel weist das Sh Ble eine Affinität in der Größenordnung von 100 nM oder weniger auf, wenn zwei Moleküle Bleomycin gebunden werden.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Reinigungsmedium bereitgestellt, welches eine Zieloberfläche umfasst, die einen oder mehrere Analyt-Fängerrest/e präsentiert, der/die ein Antibiotikum aus der Bleomycin Familie umfasst/umfassen.
Eine solche Zieloberfläche weist typischerweise eine Beschichtung in niedriger Dichte mit dem Antibiotikum auf, sodass der Zielanalyt mit einer niedrigen Affinität gefangen wird, typischerweise in der Größenordnung von größer als 400 nM, und weiter bevorzugt größer als 500 nM. In dem erwähnten besonderen Beispiel weist das Sh Ble eine Affinität in der Größenordnung von 600 nM auf, wenn ein einzelnes Molekül Bleomycin gebunden wird. Idealerweise würde die Affinität im μM Bereich liegen, aber ausreichend, dass die Proteine gebunden werden.
In jedem Fall kann das Antibiotikum über einen flexiblen Linker, wie einem aktivierten Polyethylenglykol (PEG) mit der Oberfläche verknüpft werden.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Antibiotikum aus der Bleomycin Familie bereitgestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es mit einem Marker markiert ist.
Vorzugsweise ist der Marker ein visueller Marker, wie zum Beispiel ein Fluoreszenzmarker. Alternativ könnte er mit einem radioaktiven Isotop markiert werden. Bevorzugte Fluoreszenzmarker schließen NHS-aktiviertes Fluorescein, Cy3, Cy5 und Rhodamin ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein Werkzeug für die Herstellung des Fusionsproteins ist ein Vektor, bestehend im Wesentlichen aus einem Ble Gen strangabwärts einer Linker-DNA, welche bei Verwendung ausgeschnitten wird und durch eine DNA ersetzt wird, welche ein zu exprimierendes Protein, wie ein Ble Fusionsprotein, kodiert.
In einer Ausführungsform wird der Ble Vektor als einer der Bestandteile eines Kits zur Herstellung eines Arrays zusammen mit einer Oberfläche bereitgestellt, die mit einem Antibiotikum aus der Bleomycin Familie oder den Bestandteilen zur Herstellung einer solchen derivatisierten Oberfläche derivatisiert wurde.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen löslicher Formen eines unlöslichen Proteins bereitgestellt, umfassend:

i) Herstellen einer Bibliothek von Proteinvarianten und
ii) Auswählen von Kolonien hinsichtlich der Anwesenheit eines löslichen Proteins durch Exprimieren des Proteins als ein Ble Fusionsprotein und Auswählen eines Antibiotikums aus der Bleomycin Familie,
iii) Anziehen der ausgewählten Kolonien in Flüssigkultur, Lysieren und Stempeln eines Rohlysats auf eine Oberfläche, die mit einem Antibiotikum aus der Bleomycin Familie derivatisiert ist.

Vorzugsweise umfasst das Verfahren weiterhin Waschen der markierten Oberfläche, um nicht gebundene Materialien zu entfernen.
Eine frühere Leben-oder-Tod Selektion, welche Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) verwendet, ist bekannt, aber aufgrund ihres engen Toxizitätsfensters, d.h. die Konzentration des Antibiotikums, welche Zellen ohne CAT tötet, liegt nahe bei jener, welche ein Überleben der Zellen mit CAT erlaubt, nicht sehr effektiv (Maxwell, K.L., Mittermaier, A.K., Forman-Kay, J.D. & Davidson, A.R. A simple in vivo assay for increased protein solubility. Protein Sci. 8, 1908–1911 (1999)). Auch ermöglicht es nachfolgend keine direkt nachgeschaltete Reinigung oder Immobilisierung des exprimierten Proteins, da CAT das Antibiotikum enzymatisch zerstört und das Produkt nicht mit signifikanter Affinität bindet.
Gemäß einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Reinigen eines Sh Ble Fusionsproteins aus einem Rohextrakt bereitgestellt, welches den Schritt seines Immobilisierens an einer Oberfläche über ein Antibiotikum aus der Bleomycin Familie und gegebenenfalls das Freisetzen von dort umfasst.
Gemäß einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren der zellulären Lokalisation eines Proteins bereitgestellt, umfassend

i) Exprimieren des Proteins als ein Ble Fusionsprotein in einer Zelle,
ii) Einführen eines markierten Antibiotikums aus der Bleomycin Familie in die Zelle und Nachweisen des markierten Antibiotikums.

Das Verfahren kann qualitativ oder quantitativ sein, wobei das Verfahren einen weiteren Schritt des Quantifizierens des markierten Antibiotikums umfasst. Dies kann durch Messen der Intensität der Fluoreszenz durchgeführt werden, wenn das markierte Antibiotikum Fluoreszenz markiert ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung werden weiterhin exemplarisch nur durch Bezugnahme auf die folgenden Fig. und Beispiele beschrieben, in welchen:
1 ein Schema darstellt, welches das Prinzip der Verwendung eines Faltungsmarkers zum Untersuchen der Löslichkeit eines "Gen X"-Expressionsprodukts zeigt. Nur wenn das Proteinprodukt von Gen X löslich ist, wird der Phänotyp der Fusion offensichtlich. In diesem Fall führt die Fusion zu grün fluoreszierenden Kolonien, welche eindeutig identifiziert werden können,
2 ein Vektor gemäß einem Aspekt der Erfindung ist, welcher ein Sh Ble Gen umfasst,
3a und b die Reinigung eines Sh Ble Fusionsproteins auf Bleomycin-Sepharose darstellen,

A) ist ein Coomassie gefärbtes Gel, und
B) ist ein Streptavidin-HRP sondierter Western Blot.

Die Spuren 1–6 wurden wie folgt beladen:

1) Lysat,
2) Bleomycin-Sepharose nach Inkubation mit Lysat,
3) ungebundenes Lysat nach Inkubation mit Bleomycin-Sepharose,
4) Bleomycin Elution,
5) Bleomycin-Sepharose nach Bleomycin Elution, und
6) ungebundenes Lysat nach Inkubation mit Bleomycin-Sepharose.

4 die Immobilisierung von Sh Ble Fusionsproteinen auf einer Bleomycin derivatisierten Mikrotiterplatte darstellt. Lysate von zwei verschiedenen Sh Ble Fusionsprotein Klonen wurden zu Vertiefungen einer Bleomycin derivatisierten und einer Kontroll-Mikrotiterplatte in Anwesenheit und Abwesenheit von konkurrierendem Bleomycin hinzugefügt,
5 die Reinigung von immobilisierten Sh Ble Fusionsproteinen auf Bleomycin beschichteten Mikrovertiefungen darstellt (Sh Ble Fusionsprotein, welches auf Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefungen aus Lysaten gefangen wurde, wurde auf einer SDS PAGE laufen gelassen. Ausgangs-Lysate wurden zum Vergleich ebenfalls laufen gelassen. Ausgangs-Lysate stellten eine 2-fache Verdünnungsreihe dar, wobei Spur 1 unverdünntes Lysat darstellt und Spur 7 eine 1 zu 64 Verdünnung darstellt.),
6 die Geschwindigkeit der Immobilisierung des Sh Ble Fusionsproteins auf Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefungen zeigt (Geklärte Lysate des Sh Ble Fusionsprotein Klons 1 wurden für verschiedene Zeiträume in einer Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefung inkubiert. A) Silber gefärbte SDS PAGE, welche die Menge des immobilisierten Fusionsproteins zeigt. B) Die Banden wurden quantifiziert und gegen die Zeit aufgetragen.),
7 die Retention des Sh Ble Fusionsproteins auf Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefungen darstellt (Sh Ble Fusionsprotein Klon 1 wurde an Bleomycin derivatisierte Mikrovertiefungen gebunden. Nach einem Waschen wurden die Vertiefungen für verschiedene Zeiträume in Puffer inkubiert.

A) Coomassie gefärbte SDS PAGE, welche die Menge des Fusionsproteins zeigt, welche immobilisiert blieb.
B) Die Banden wurden quantifiziert und gegen die Zeit aufgetragen.),

8 die Retention des Sh Ble Fusionsproteins auf Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefungen darstellt. (Sh Ble Fusionsprotein Klon 1 wurde an Bleomycin derivatisierte Mikrovertiefungen gebunden. Nach einem Waschen wurden die Vertiefungen für verschiedene Zeiträume in Puffer, welcher überschüssiges Bleomycin enthielt, inkubiert. A) Coomassie gefärbte SDS PAGE, welche die Menge des Fusionsproteins zeigt, welche immobilisiert blieb. B) Die Banden wurden quantifiziert und gegen die Zeit aufgetragen.), und
9 die Immobilisierung von Sh Ble Fusionsprotein auf einem Bleomycin derivatisierten Mikroarray-Objektträger darstellt. (1 μl der geklärten Lysate des Sh Ble Fusionsprotein Klons 2 wurden auf einen Bleomycin derivatisierten Mikroarray-Objektträger in Anwesenheit und Abwesenheit von überschüssigem freien Bleomycin aufgebracht. A) Nach Sondieren auf das Fusionsprotein unter Verwendung eines Anti-Flag-Antikörpers und eines sekundären Cy3 markierten Anti-Maus-Antikörpers, wurde der Cy3 Fluorophor visualisiert. B) Die Gesamtintensität der Fluoreszenz der Probenpunkte wurde in einem Histogramm für Probenpunkt in Anwesenheit und Abwesenheit von überschüssigem Bleomycin aufgetragen.).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
1.0 Verwendung von Sh Ble als Affinitäts-Tag
Eine cDNA-Bibliothek wurde in einen modifizierten E. coli Expressionsvektor ligiert (vergleiche mit 2), sodass das Gen sowohl an den N-, als auch an den C-Termini mit einem FLAG-Tag am N-Terminus und einem Sh Ble, BCCP (biotinylierte Domäne von E. coli ACCB) und einem Myc-Tag am C-Terminus markiert werden konnte.
Nach einer Transformation in XL10 Gold wurden die Klone durch Anziehen auf LB-Agar, welcher 50 μg/ml Phleomycin D1 enthielt, selektiert.
Zwei Phleomycin D1 resistente Klone wurden selektiert, in LB-Amp auf eine OD₆₀₀ von ungefähr 0,4 angezogen, wonach die Klone mit 100 μg/ml IPTG für 4 h bei 30°C induziert wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, 4000 g für 15 min bei 4°C, und in Aliquots bei –20°C gelagert, um für zukünftige Arbeiten verwendet zu werden. Diese werden als "Klon 1" und "Klon 2" bezeichnet.
Frische E. coli Lysate wurden vor jedem Experiment hergestellt.
Zu jedem Aliquot der Zellen (aus 40 ml Induktionskultur) wurden 300 μl Lysepuffer (200 mM Tris pH-Wert 8, 100 mM EDTA, 1 × Protease Inhibitorcocktail (Roche), 10 mM Mercaptoethanol, 200 μg/ml Lysozym) hinzugefügt, und die Zellen wurden resuspendiert. Nach 15 min Inkubation bei 4°C wurden die Zellen mit 1,7 ml Puffer (1 × Protease Inhibitoren, 20 mM MgCl₂, 50 μg/ml DNAse) verdünnt und bei 4°C für weitere 30 Minuten inkubiert. Geklärte Lysate wurden nach Zentrifugieren bei 20.000 g für 10 min bei 4°C erhalten.
1.1 Derivatisieren von Sepharose mit Bleomycin und seine Verwendung in einer Affinitätsaufreinigung
Bleomycin A6 (2 mg/ml) wurde an eine Pharmacia 1 ml HiTrap NHS-aktivierte Sepharose Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers gekoppelt.
Nach dem Koppeln wurde die Sepharose aus der Säule entfernt und für eine Aufreinigung der Sh Ble Fusionsproteine in Chargen verwendet.
Zu 6 μl Bleomycin-Sepharose Aufschlämmung (ungefähr 50% gequollene Kügelchen) in PBS-Tween wurden 4 μl Klon 1-Lysat (wie oben hergestellt) hinzugefügt und bei 4°C für 30 min unter Schütteln inkubiert. Nach kurzem Zentrifugieren wurde der Überstand entfernt, und die Kügelchen wurden dreimal in 10 μl PBS-Tween gewaschen. In einer ähnlich behandelten Charge Bleomycin-Sepharose wurde gebundenes Protein durch Inkubieren der Kügelchen in 10 μl PBS-Tween, welches 300 μg/ml Bleomycin A6 enthielt, bei 4°C für 10 min unter Schütteln eluiert.
Die Proben wurden anschließend in SDS-Probenpuffer gekocht und auf zwei identische 10–20% Tris Glycin SDS PAGE Platten geladen. Nach der Elektrophorese wurde ein Gel mit Coomassie gefärbt und das andere auf eine Nitrozellulosemembran gebracht und mit Streptavidin-HRP sondiert, bevor die Banden unter Verwendung von DAB visualisiert wurden (3).
Bezug nehmend auf 3 kann eindeutig erkannt werden, dass das Sh Ble Fusionsprotein sowohl auf dem Coomassie gefärbten Gel, als auch auf dem Western Blot an die Bleomycin-Sepharose gebunden hat (3A und B, Spuren 2). Es kann auch erkannt werden, dass die Sh Ble Fusionsprotein Bindung sehr schwach ist und nur eine Bande auf dem Coomassie gefärbten Gel erzeugt. Das Protein hat nicht nur gezeigt, dass es spezifisch gebunden wird und signifikant aus dem Lysat des Fusionsproteins entfernt wird, sondern auch, dass es spezifisch mit freiem Bleomycin eluiert werden kann (3A und B, Spuren 4), was sowohl einen Beleg für die Spezifität der Interaktion, als auch als ein Hilfsmittel für eine Elution bereitstellt. Unter diesen Bedingungen wurde jedoch nur ein Teil des Sh Ble Fusionsproteins aus der Bleomycin-Sepharose eluiert.
1.2 Derivatisieren von Mikrotiterplatten mit Bleomycin
Mikrotiterstreifen mit 8 Vertiefungen, die mit PEG mit einem Amin-reaktiven Terminus beschichtet waren ("protein immobilizer"-Platten) wurden von Exiqon bezogen. Die Platten wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers wirksam mit Bleomycin A6 beschichtet. In Kürze, Bleomycin A6 wurde in 100 mM KPO₄-Puffer, pH-Wert 8, bei einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. 100 μl Bleomycin Lösung wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt, die Vertiefungen wurden verschlossen und bei 4°C für 18 h inkubiert. Danach wurde die Bleomycin Lösung aus den Vertiefungen entfernt, und die Vertiefungen wurden mit PBS-Tween für 5 Minuten dreimal gewaschen. Kontrollvertiefungen wurden wie oben mit dem Weglassen von Bleomycin A6 hergestellt.
1.3 Verwendung von Bleomycin Oberflächen in einer Affinitätsimmobilisierung
Zu Bleomycin beschichteten und Kontrollvertiefungen wurden 50 μl zwei verschiedener Sh Ble Fusionsprotein Klonlysate (Klon 1- und Klon 2-Lysate, die wie oben hergestellt wurden) in der Anwesenheit und Abwesenheit von 5 mg/ml Bleomycin hinzugefügt. Die Lysate wurden in den Vertiefungen für 30 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken inkubiert, wonach das Lysat aus den Vertiefungen abgesaugt wurde, und die Vertiefungen dreimal für jeweils 5 Minuten mit PBS-Tween gewaschen wurden.
Die Proteine wurden durch das Hinzufügen von 50 μl SDS Proben-Beladungspuffer von der Oberfläche eluiert, und die Vertiefungen wurden auf einem Heizblock bei 100°C für 10 min erhitzt. 20 μl jeder Probe wurden auf einer 10–20% Tris Glycin SDS PAGE laufen gelassen. Das Gel wurde auf eine Nitrozelluosemembran transferiert und unter Verwendung eines Streptavidin-HRP-Konjugats sondiert. Der Blot wurde unter Verwendung von ECL (Amersham) visualisiert, und die fotografische Aufnahme ist in 4 gezeigt.
Aus 4 wird deutlich, dass beide Sh Ble Fusionsproteine nur auf Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefungen immobilisiert werden, und zusätzlich, dass dieser Interaktion durch eine Präinkubation der Lysate mit überschüssigem freien Bleomycin entgegengetreten werden kann.
1.4 Analyse von auf Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefungen gereinigtem und immobilsiertem Sh Ble Fusionsprotein
50 μl geklärte Lysate des Sh Ble Fusionsklons 1, welche wie oben hergestellt wurden, in verschiedenen Verdünnungen, wurden zu Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefungen hinzugefügt. Nach einer Inkubation für 40 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Das Protein wurde aus den Vertiefungen durch Erhitzen auf einem Heizblock bei 100°C für 10 min in SDS Probenpuffer eluiert, und 15 μl wurden auf einer SDS PAGE mit entsprechenden Mengen des Ausgangs-Lysats elektrophoresiert. Nach der Elektrophorese wurden die Gele unter Verwendung eines Standardprotokolls für Silberfärbungen visualisiert.
Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt, welche die Reinigung von immobilisierten Sh Ble Fusionsproteinen auf Bleomycin beschichteten Mikrovertiefungen zeigt. Aus Lysaten auf Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefungen gefangenes Sh Ble Fusionsprotein wurde auf einer SDS PAGE laufen gelassen. Ausgangs-Lysate wurden auch zum Vergleich laufen gelassen. Die Ausgangs-Lysate stellten eine 2-fache Verdünnungsreihe dar, wobei Spur 1 unverdünntes Lysat darstellt und Spur 7 eine 64-fache Verdünnung darstellt.
5 zeigt, dass es überwiegend eine Hauptbande von gereinigtem vollständigen Sh Ble Fusionsprotein gibt, welches auf Mikrovertiefungen gefangen wurde. Es ist möglich, dass andere sichtbare kleinere Banden Proteolyseprodukte der Sh Ble Fusion darstellen, wie durch einen Vergleich mit einem ähnlichen Experiment mit einem Western Blot, der in 4 gezeigt ist, gezeigt wurde.
1.5 Geschwindigkeit des Bindens von Sh Ble Fusionsprotein an Bleomycin derivatisierte Mikrovertiefungen
50 μl geklärtes Lysat des Sh Ble Fusionsklons 1 wurden zu Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefungen hinzugefügt. Nach 5, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Das Protein wurde aus den Vertiefungen durch Erhitzen auf einem Heizblock bei 100°C für 10 min in SDS-Probenpuffer eluiert, und 15 μl wurden auf einer SDS PAGE elektrophoresiert. Nach der Elektrophorese wurden die Gele unter Verwendung eines Standardprotokolls für Silberfärbungen visualisiert (6A). Die Sh Ble Banden auf dem Gelbild wurden quantifiziert, und die durchschnittliche Dichte wurde aufgetragen (6B). Diese Daten zeigen, dass das meiste Protein nach ungefähr 40 Minuten Inkubation immobilisiert ist.
1.6 Stabilität der Sh Ble Fusionsprotein-Interaktion mit Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefungen
50 μl geklärtes Lysat des Sh Ble Fusionsklons 1 wurden zu Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefungen hinzugefügt. Nach einer Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Vertiefungen mit PBS-Tween aufgefüllt und für die gewünschte Zeit inkubiert, um einen Zeitverlauf zu erzeugen. Dies wurde auch mit einem zweiten Satz an Vertiefungen, welche nach dem Waschen der Vertiefungen in 0,5 mM Bleomycin in PBS-Tween inkubiert wurden, wiederholt. Nach diesen Zeitverläufen wurde das Protein aus den Vertiefungen durch Erhitzen auf einem Heizblock bei 100°C für 10 min in SDS-Probenpuffer eluiert, und 15 μl wurden auf einer SDS PAGE mit entsprechenden Mengen des Ausgangs-Lysats elektrophoresiert. Nach der Elektrophorese wurden die Gele unter Verwendung einer Coomassie Färbung visualisiert (7A & 8A).
Die Sh Ble Fusionsproteinbanden auf dem Gelbild wurden quantifiziert, und die durchschnittliche Dichte wurde aufgetragen (7B & 8B).
Immobilisiertes Sh Ble Fusionsprotein blieb in sehr großem Umfang an der Bleomycin derivatisierten Mikrovertiefung nach einer Inkubation für bis zu 24 h in PBS-Tween gebunden (7). Für den Einschluss von überschüssigem freien Bleomycin in den Puffer wurde erwartet, dass es die Geschwindigkeit der Dissoziation des Fusionsproteins von der Mikrovertiefung erhöht, aber selbst in der Anwesenheit von überschüssigem freien Bleomycin (8) wurde ein geringer Verlust von immobilisiertem Sh Ble Fusionsprotein beobachtet.
1.7 Verwendung von Sh Ble Fusion zur Immobilisierung von Proteinen auf Mikroarrays
In dieser Untersuchung wurden Exiqon Euray Objektträger verwendet und wiesen eine Oberflächenbeschichtung auf, welche im Wesentlichen jene darstellt, die bei den vorher verwendeten Mikrotiterplatten Vertiefungen gefunden wurde, wo ein PEG-Molekül mit einem Amin-reaktiven Terminus verwendet wurde, um die Objektträger zu beschichten. Das Derivatisieren dieser Objektträger wurde wie bei den Mikrotiterplatten Vertiefungen mit 400 μl 3 mg/ml Bleomycin A6 durchgeführt, welches in einer Mikroskop Hybridisierungskammer für Objektträger auf die Oberfläche aufgebracht wurde.
Geklärte Lysate des Sh Ble Fusionsprotein Klons 1 wurden 1 zu 2, 1 zu 4 und 1 zu 8 mit 100 mM KPO₄-Puffer verdünnt. Die Lysate wurden auf eine 384-Vertiefungsmikrotiterplatte für einen Mikroarray überführt. Mit einem sechs mal sechs Muster der Lysate wurde ein Mikroarray auf einem Objektträger, der mit Bleomycin derivatisiert wurde, und auf einem, welcher ähnlich mit Ethanolamin beschichtet wurde, durchgeführt. Der Mikroarray wurde unter Verwendung eines Genetix Qarray Roboters, der mit 300 Mikrometer festen Stiften ausgestattet war, durchgeführt. Die Mikroarrays wurden in einer feuchten Kammer für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen in PBS-Tween wurden die Objektträger mit einem Maus Anti-FLAG-Antikörper, gefolgt von einem Cy3 markierten Anti-Maus IgG-Antikörper sondiert. Nach dem Trocknen in einem Luftstrom aus Stickstoff wurden die Objektträger unter Verwendung eines Affymetrix 428 Arrayscanners visualisiert, welcher mit geeignetem Laser und Filter für den Nachweis des Cy3 Fluorophors ausgestattet war (9A). Die Gesamtfluoreszenz der Probenpunkte wurde quantifiziert, und Mittelwerte der identischen Probenpunkte wurden ausgewählt und aufgetragen (9B).
Die Daten in 9 zeigen, dass ein Sh Ble Fusionsprotein besonders auf einem Bleomycin derivatisierten Mikroskop Objektträger immobilisiert wird. Dies weist darauf hin, dass Sh Ble für eine Verwendung als Affinitäts-Tag für die Immobilisierung von Proteinen in einem Mikroarrayformat geeignet ist.

Claims

Verfahren zum Immobilisieren eines Proteins an einer Oberfläche, wobei das Protein an die Oberfläche als ein Ble Fusionsprotein bereitgestellt wird und die Oberfläche eine Oberfläche ist, die mit einem Antibiotikum aus der Bleomycin Familie derivatisiert wurde.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Ble innerhalb eines Ble Fusionsproteins auch als ein Expressions- und Faltungsmarker verwendet wird.
Verfahren wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, wobei das Ble Fusionsprotein ein Expressionsprodukt eines Sh ble, Tn5 ble oder Sa ble Gens ist.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Antibiotikum aus der Bleomycin Familie ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Bleomycin, Phleomycin, Tallysomycin, Pepleomycin und Phleomycin D1 besteht.
Verfahren wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei das Antibiotikum aus der Bleomycin Familie ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Bleomycin A2, Bleomycin A5, Bleomycin A6, Bleomycin B2 oder Phleomycin D1 besteht.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 1–5 beansprucht, wobei eine funktionelle Gruppe an dem Antibiotikum verwendet wird, um es mit der Oberfläche zu verknüpfen.
Verfahren wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei eine Amingruppe, die an dem Antibiotikum anwesend ist, verwendet wird, um das Antibiotikum an die Oberfläche zu koppeln.
Verfahren wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei das Antibiotikum an einer Polyethylenglykol (PEG) derivatisierten Oberfläche über eine Amingruppe gekoppelt ist.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 1–8 beansprucht, wobei die Oberfläche die Oberfläche eines Arrays, einer Mikrotiterplatte, eines Objektträgers oder eines Kügelchens ist.
Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei der Array ein Mikroarray ist.
Verfahren wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei der Array ein MALDI Array ist.
Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, das weiterhin das Entfernen des Ble Fusionsproteins von der Oberfläche umfasst.
Sonde, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Zieloberfläche aufweist, die einen Array mit einer Vielzahl von einzelnen Zielbereichen umfasst, die einen oder mehrere Analyt-Fängerrest/e darstellen, der/die ein Antibiotikum aus der Bleomycin Familie umfasst/umfassen.
Sonde wie in Anspruch 13 beansprucht, wobei das Antibiotikum an der Zieloberfläche mit einer hohen Oberflächendichte bereitgestellt wird, so dass man erwarten würde, dass durchschnittlich ein Sh ble Dimer von zwei Bleomycin Molekülen gebunden wird.
Sonde wie in Anspruch 14 beansprucht, wobei die Fängerreste eine Affinität für den Rest, den sie zu fangen beabsichtigen, von weniger als 400 nM, und vorzugsweise weniger als 200 nM aufweisen.
Sonde wie in einem der Ansprüche 13–15 beansprucht, wobei das Antibiotikum aus der Bleomycin Familie ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Bleomycin, Phleomycin, Tallysomycin, Pepleomycin und Phleomycin D1 besteht.
Sonde wie in Anspruch 16 beansprucht, wobei das Antibiotikum aus der Bleomycin Familie ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Bleomycin A2, Bleomycin A5, Bleomycin A6, Bleomycin B2 oder Phleomycin D1 besteht.
Reinigungsmedium umfassend eine Zieloberfläche, die einen oder mehrere Analyt-Fängerrest/e präsentiert, der/die ein Antibiotikum aus der Bleomycin Familie umfasst/umfassen.
Reinigungsmedium wie in Anspruch 18 beansprucht, das ein Kügelchen ist.
Reinigungsmedium wie in Anspruch 18 oder 19 beansprucht, wobei das Antibiotikum an der Zieloberfläche in einer geringen Oberflächendichte bereitgestellt wird, so dass man erwarten würde, dass durchschnittlich ein Sh ble Dimer von einem Bleomycin Molekül gebunden wird.
Reinigungsmedium wie in Anspruch 20 beansprucht, wobei die Fängereinheiten eine Affinität für den Rest, den sie zu fangen beabsichtigen, von größer als 400 nM und vorzugsweise größer als 500 nM aufweisen.
Reinigungsmedium wie in einem der Ansprüche 18–21 beansprucht, wobei das Antibiotikum aus der Bleomycin Familie ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Bleomycin, Phleomycin, Tallysomycin, Pepleomycin und Phleomycin D1 besteht.
Reinigungsmedium wie in einem der Ansprüche 18–22 beansprucht, wobei das Antibiotikum aus der Bleomycin Familie ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Bleomycin A2, Bleomycin A5, Bleomycin A6, Bleomycin B2 oder Phleomycin D1 besteht.
Reinigungsmedium wie in einem der Ansprüche 18–23 beansprucht, wobei das Antibiotikum an die Oberfläche über ein flexibles Linkermolekül gebunden ist.
Reinigungsmedium wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei das flexible Linkermolekül ein Polyethylenglykol (PEG) ist.
Verfahren zum Herstellen löslicher Formen eines unlöslichen Proteins umfassend: i) Herstellen einer Bibliothek von Proteinvarianten; und ii) Auswählen von Kolonien hinsichtlich der Anwesenheit eines löslichen Proteins durch Exprimieren des Proteins als ein Ble Fusionsprotein und Auswählen eines Antibiotikums aus der Bleomycin Familie; und iii) Anziehen der ausgewählten Kolonien, ihr Lysieren und Binden des Fusionsproteins an eine Oberfläche, die mit einem Antibiotikum aus der Bleomycin Familie derivatisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 26, weiterhin umfassend Waschen der markierten Oberfläche, um nichtgebundene Materialien zu entfernen.
Verfahren zum Reinigen eines Ble Fusionsproteins aus einem Rohextrakt umfassend den Schritt seines Immobilisierens auf einer Oberfläche über ein Antibiotikum aus der Bleomycin Familie und wahlweise sein Freisetzen davon.
Verfahren zum Identifizieren der zellulären Lokalisation eines Proteins umfassend i) Exprimieren des Proteins als ein Ble Fusionsprotein in einer Zelle, ii) Einführen eines markierten Antibiotikums aus der Bleomycin Familie in die Zelle, und iii) Nachweisen des markierten Antibiotikums.
Verfahren wie in Anspruch 29 beansprucht, wobei das Antibiotikum ein Antibiotikum aus der Bleomycin Familie ist, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es mit einem Marker markiert ist.
Verfahren wie in Anspruch 30 beansprucht, wobei der Marker ein visueller Marker ist.
Verfahren wie in Anspruch 31 beansprucht, wobei der visuelle Marker ein Fluoreszenzmarker ist.
Verfahren wie in Anspruch 32 beansprucht, wobei der Fluoreszenzmarker ausgewählt ist unter NHS-aktiviertem Fluorescein, Cy3, Cy5 oder Rhodamin.
Kit für die Herstellung eines Arrays umfassend einen ble Vektor und eine Oberfläche, die mit einem Antibiotikum aus der Bleomycin Familie oder den Bestandteilen zur Herstellung der derivatisierten Oberfläche derivatisiert ist.