DE60219952T2

DE60219952T2 - Proteinarrays für allelische Varianten und deren Verwendungen

Info

Publication number: DE60219952T2
Application number: DE60219952T
Authority: DE
Inventors: Jonathan Mark Boutell; Benjamin Leslie J. Sense Proteomic L GODBER; Darren James Hart; Jonathan David Blackburn
Original assignee: Sense Proteomic Ltd
Current assignee: Sense Proteomic Ltd
Priority date: 2001-12-05
Filing date: 2002-12-05
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2022-12-06
Also published as: AU2002352355A1; JP4781628B2; WO2003048768A2; JP2005512055A; AU2002352355B2; ATE361471T1; WO2003048768A3; US20180305840A1; US20040002078A1; EP1742062A3; CA2469403C; EP1456668A2; DE60219952D1; GB2384239A; US10870925B2; EP1742062A2; ES2289169T3; DK1456668T3; JP2009192547A; EP1456668B1

Description

Einzelnukleotid Polymorphismen (engl.: single nucleotide polymorphisms (SNPs)) sind Einzelbasenunterschiede zwischen der DNA von Organismen. Sie liegen sehr dem genetischen Bestandteil phänotypischer Variation zwischen Personen mit der Ausnahme von identischen Geschwistern und Klonen zugrunde. Da diese Variation Eigenschaften einschließt, wie eine Prädisposition für eine Erkrankung, das Alter des Beginns, die Schwere einer Erkrankung und die Antwort auf eine Behandlung, wird die Identifizierung und Katalogisierung von SNPs zu einem "genetischen Arzneimittel" führen [Chakravarti, A. Nature 409 822–823 (2001)]. Disziplinen, wie Pharmacogenomics, zielen darauf ab, Korrelationen zwischen SNPs und einer Antwort auf eine Arzneimittel Behandlung aufzustellen, um therapeutische Programme auf die einzelne Person zuzuschneiden. Allgemeiner ist die Rolle von besonderen SNPs in Leiden, wie einer Sichelzellanämie und Alzheimer'schen Erkrankung, und Fragen, wie einer HIV Resistenz und Transplantationsabstoßung, gut bekannt. Jedoch sind Korrelationen zwischen SNPs und ihren Phänotypen gewöhnlich von statistischen Analysen von Bevölkerungsdaten abgeleitet, und wenige Versuche werden unternommen, um die molekularen Mechanismen der beobachteten phänotypischen Variationen aufzuklären. Bis zum Aufkommen von Hochdurchsatz Sequenzierungsprojekten, die darauf abzielen, die vollständige Sequenz des humanen Genoms zu bestimmen [The International Human Genome Mapping Consortium Nature 409 860–921 (2001); Venter, J.C. Science 291 1304–1351 (2001)], waren nur wenige tausend SNPs identifiziert worden. Kürzlich wurden 1,42 Millionen SNPs durch eine Arbeitsgemeinschaft von Forschern in einer Arbeit katalogisiert worden, welche die menschliche Sequenz begleitet [The International SNP Map Working Group Nature 409 928–933 (2001)], von denen 60.000 innerhalb von Genen anwesend sind ("kodierende" SNPs). Kodierende SNPs können ferner dementsprechend klassifiziert werden, ob sie die Aminosäuresequenz des Proteins ändern oder nicht ändern, und wo Änderungen auftreten, kann die Proteinfunktion beeinflusst werden, was zu einer phänotypischen Variation führt. Somit existiert ein unerfüllter Bedarf nach Geräten und Methodik, die fähig sind die Phänotypen dieses großen Umfangs varianter Sequenzen schnell zu bestimmen.
Wolf, C.R. et al.: "Kapitel 18, Cytochrome P450 CYP2D6" Metabolic Polymorphisms and Susceptibilty to Cancer, Nr. 148, 1999, Seiten 209–229, offenbart die Verwendung von Sonden Arzneimitteln in CYP2D6 phänotypischen Studien unter Verwendung von HPLC basierten Verfahren, welche die relativen Konzentrationen von Vorläufer Arzneimitteln und Metaboliten im Urin analysieren.
Emili, A.Q. et al.: "Nature Biotechnology", Band 18, Nr. 4, S. 393–397, Apr. 2000, offenbart eine funktionelle Analyse im großen Maßstab unter Verwendung von Peptid oder Protein Arrays.
Die WO 02/053775 A2 und die WO 02/099099 A2 offenbaren jeweils polymorphe CYP3A5 bzw. CYP2C8 Polynukleotide sowie Gene oder Vektoren, die solche Polynukleotide umfassen, Wirtszellen, die genetisch mit solchen Polynukleotiden oder Genen verändert sind, Polypeptide und Fragmente davon, die durch solche Polynukleotide kodiert sind, und Antikörper, die an solche Peptide binden. Gemäß der WO 02/053775 A2 und der WO 02/099099 A2 kann ein oder eine Vielzahl des Polynukleotids, Gens, Vektors, Polypeptids, Antikörpers oder der Wirtszelle der entsprechenden Offenbarung auf einem festen Träger immobilisiert sein.
Die WO 00/04382 A1 offenbart Proteinarrays für das parallele in vitro Screenen biomolekularer Aktivität. Auf den Arrays ist eine Vielzahl verschiedener Proteine, wie verschiedene Mitglieder einer einzigen Proteinfamilie, auf einem oder mehreren organischen dünnen Filmen auf der Substratoberfläche immobilisiert. Gemäß der WO 00/04382 A1 kann die parallele Analyse einer Vielzahl von Mitgliedern einer Proteinfamilie oder Formen eines polymorphen Proteins (Screenen mit vielfachen Zielen) eine schnelle Identifikation von hochspezifischen Hauptverbindungen früh im Arzneimittel Entwicklungsverfahren ermöglichen.
Die Erfinder beschreiben hier Proteinarrays und deren Verwendung, um in einer parallelen Weise die Proteinprodukte hoch homologer oder verwandter DNA kodierender Sequenzen zu testen.
Mit hoch homolog oder verwandt sind jene DNA kodierenden Sequenzen gemeint, die eine gemeinsame Sequenz teilen und die sich nur durch eine oder mehrere natürlich vorkommende Mutationen unterscheiden, wie Einzelnukleotid Polymorphismen, Deletionen oder Insertionen, oder jene Sequenzen, die als Haplotypen erachtet werden (ein Haplotyp ist eine Kombination aus Variationen oder Mutationen auf einem Chromosom gewöhnlich im Zusammenhang mit einem besonderen Gen). Solche hoch homologen oder verwandten DNA kodierenden Sequenzen sind im Allgemeinen natürlich vorkommende Varianten desselben Gens.
Erfindunsgemäße Arrays weisen mehrere, zum Beispiel zwei oder mehr, einzelne Proteine auf, die in einem räumlich definierten Muster auf einer Oberfläche in einer Form abgelegt sind, wobei die Eigenschaften, zum Beispiel die Aktivität oder Funktion der Proteine, parallel durch Auswertung des Arrays untersucht oder getestet werden können.
Erfindungsgemäße Proteinarrays und deren Verwendung, um die phänotypischen Veränderungen in einer Proteinfunktion zu testen, die sich aus Mutationen ergeben (zum Beispiel kodierende SNPs – d.h. jene SNP Mutationen, die zu einem exprimierten Protein führen), unterscheiden sich vollständig von und weisen Vorteile gegenüber bestehender DNA basierender Technologien für SNP und andere Mutationsanalysen auf [im Überblick in Shi, M. M. Clin. Chem. 47 164–72 (2001) dargestellt]. Diese letzteren Technologien schließen Hochdurchsatz Sequenzieren und elektrophoretische Verfahren zum Identifizieren neuer SNPs oder diagnostische Technologien, wie Oligonukleotid Arrays mit hoher Dichte [z.B. Lindblad-Toh, K. Nat Genet 24 381–6 (2000)] oder Hochdurchsatz, Kurzlese Sequenziertechniken ein, die das Erstellen eines Profils eines einzelnen interessierenden Gens gegen bekannte SNPs ermöglichen [z.B. Buetow, K.H. Proc Natl Acad Sci USA 98 581–4 (2001)]. Bedeutend und im Gegensatz zu der hier beschriebenen Erfindung bleiben die phänotypischen Wirkungen eines Polymorphismus unbekannt, wenn sie nur auf dem DNA Niveau analysiert werden.
In der Tat sind die Wirkungen kodierender SNPs auf die Proteine, die sie kodieren, mit relativ wenigen Ausnahmen nicht charakterisiert. Beispiele von Proteinen mit vielen katalogisierten SNPs, aber wenig funktionellen Daten über die Wirkung dieser SNPs schließen p53, p10 (beide krebsbedingt) und die P450 Cytochrome (Arzneimittel Metabolismus) ein. Es gibt derzeit wenige, wenn überhaupt irgendwelche Verfahren, die zum Untersuchen der Funktionalitäten von SNP kodierten Proteinen mit ausreichend hohem Durchsatz fähig sind, der benötigt wird, um den großen Umfang von SNP Daten zu bewältigen, der erzeugt wird. Bioinformatik oder Computermodellierung ist möglich, insbesondere wenn eine Kristallstruktur verfügbar ist, aber die erzeugten Hypothesen müssen weiterhin experimentell verifiziert werden (d.h. durch einen biochemischen Test). Häufig bleibt jedoch die Rolle der Mutation nach bio-informatischer oder Computer basierter Analyse unklar. Deshalb bieten erfindungsgemäße Proteinarrays den leistungsfähigsten Weg zur funktionellen Analyse von SNPs.
Es wäre möglich, Proteine, die von verwandten DNA Molekülen abgeleitet sind, die sich zum Beispiel durch einen oder mehrere Einzelnukleotid Polymorphismen unterscheiden, in einem Teströhrchen Format einzeln zu testen, jedoch machen die serienmäßige Art dieser Arbeit und die eingeschlossenen großen Probenvolumina diesen Ansatz mühsam und unattraktiv. Durch Anordnen der verwandten Proteine in einer Mikrotiterplatte oder auf einem Mikroskop Objektträger können viele verschiedene Proteine (hunderte oder tausende) unter Verwendung nur kleiner Probenvolumina (im Falle von Mikroarrays nur wenige Mikroliter) gleichzeitig getestet werden, wodurch eine funktionelle Analyse von zum Beispiel SNPs ökonomisch durchführbar wird. Alle Proteine können zusammen im selben Experiment getestet werden, was Fehlerquellen aufgrund von unterschiedlicher Behandlung von Materialien verringert. Zusätzlich erleichtert ein Anbinden der Proteine direkt an einen festen Träger Bindungstests, die es notwendig machen, dass ungebundene Liganden vor einem Messen von gebundenen Konzentrationen weg gewaschen werden, eine Eigenschaft, die in lösungsbasierten oder Einzelphasen Flüssigkeitstests nicht verfügbar ist.
Spezifische Vorteile gegenüber Geräten und Verfahren, die derzeit im Stand der Technik bekannt sind, die durch die erfindungsgemäßen Arrays bereitgestellt werden, sind:

– enorm parallele Analyse stark verwandter Proteine, zum Beispiel jene, die von kodierenden SNPs abgeleitet sind, für eine kodierte Funktion
– Empfindlichkeit einer Analyse, die mit vorhandenen Verfahren mindestens vergleichbar, wenn nicht besser ist
– ermöglicht eine quantitative, vergleichend funktionelle Analyse in einer Weise, die zuvor nicht möglich war
– kompatibel mit Protein: Protein, Protein: Nukleinsäure, Protein: Ligand oder Protein: kleine Molekül Interaktionen und posttranslationale Modifikationen in situ "on-chip"
– erfindungsgemäße parallele Proteinarrays sind von der Spot Dichte unabhängig
– ein Mikroarray Format ermöglicht, dass eine Analyse unter Verwendung kleiner Volumina potenziell teurer Liganden durchgeführt wird

Informationen, die durch erfindungemäße parallele Proteinarrays bereitgestellt werden, werden für die Arzneimittel Entwicklung, Pharmakogenomik und diagnostische Bereiche extrem wertvoll, andere nützliche parallele Proteinarrays können Proteine einschließen, die von nicht natürlichen (synthetischen) Mutationen einer interessierenden DNA Sequenz abgeleitet sind. Solche Arrays können verwendet werden, um Interaktionen zwischen dem so hergestellten varianten Protein und anderen Proteinen, Nukleinsäuremolekülen und anderen Molekülen zu untersuchen, zum Beispiel Liganden oder kleinen Kandidaten-/Testmolekülen.
Geeignete Verfahren zum Durchführen einer solchen Mutagenese werden in Current Protocols in Molecular Biology, Band, 1, Kapitel 8, herausgegeben von Ausubel, FM, Brent, R, Kingston, RE, Moore, DD, Siedman, JG, Smith, JA und Struhl, K beschrieben.
Somit stellt die Erfindung in einem Aspekt ein Proteinarray bereit, das eine Oberfläche umfasst, auf der mindestens zwei Proteinanteile in einem räumlich definierten Muster abgelegt sind; dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinanteile die Expressionsprodukte natürlich vorkommender Varianten oder alternativ gespleißter natürlich vorkommender Transkripte einer interessierenden DNA Sequenz sind.
Ein Proteinarray, wie hier definiert, ist eine räumlich definierte Anordnung von Proteinanteilen in einem Muster auf einer Oberfläche. Vorzugsweise sind die Proteinanteile entweder direkt oder indirekt an der Oberfläche angeheftet. Die Anheftung kann unspezifisch sein (z.B. durch physikalische Absorption auf der Oberfläche oder durch Bildung einer unspezifischen kovalenten Interaktion). In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Proteinanteile durch einen allgemeinen bzw. gemeinsamen Markierungsanteil, der an jedem Proteinanteil angehängt ist, an der Oberfläche angeheftet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können die Proteinanteile in ein Bläschen oder Liposom eingebaut werden, das an der Oberfläche angebunden ist.
Eine Oberfläche, wie hier definiert, ist ein ebener oder umrissener Bereich, der durch chemische Behandlung beschichtet/abgeleitet sein kann oder nicht. Zum Beispiel kann der Bereich sein:
ein Glasobjektträger,
ein oder mehrere Kügelchen, zum Beispiel ein magnetisiertes, abgeleitetes und/oder markiertes Kügelchen, wie es im Stand der Technik bekannt ist,
ein Polypropylen oder Polystyrol Objektträger,
eine Polypropylen oder Polystyrol Platte mit mehreren Vertiefungen,
ein Gold, Silizium oder Metallobjekt,
eine Membran, die aus Nitrozellulose, PVDF, Nylon oder Phosphozellulose hergestellt ist.
Wo ein Kügelchen verwendet wird, können einzelne Proteine, Paare von Proteinen oder ein Pool varianter Proteine (z.B. für "Shotgun Screenen" – um anfänglich Gruppen von Proteinen zu identifizieren, in denen ein interessierendes Protein vorhanden sein kann; solche Gruppen werden dann getrennt und weiter untersucht (analog zu zusammenfassenden Verfahren, die im Stand der Technik der kombinatorischen Chemie bekannt sind)) an einzelne Kügelchen angeheftet werden, um die räumliche Definition oder Trennung auf dem Array bereitzustellen. Die Kügelchen können dann getrennt, aber parallel in einer aufgeteilten Weise getestet werden, zum Beispiel in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte oder in getrennten Teströhrchen.
So kann ein Proteinarray, der eine erfindungsgemäße Oberfläche umfasst, als Reihen getrennter Festphasenoberflächen existieren, wie Kügelchen, die verschiedene Proteine tragen, wobei das Array durch das räumlich definierte Muster oder die räumlich definierte Anordnung der getrennten Oberflächen im Experiment gebildet wird.
Vorzugsweise ist die Oberflächenbeschichtung zum Abwehren unspezifischer Proteinabsorption in der Lage. Die Oberflächenbeschichtung kann poröser oder nicht poröser Art sein. Zusätzlich stellt die Oberflächenbeschichtung in einer bevorzugten Ausführungsform eine spezifische Interaktion mit dem Markierungsanteil auf jedem Proteinanteil entweder direkt oder indirekt bereit (z.B. durch ein Protein oder Peptid oder eine Nukleinsäure, die an die Oberfläche gebunden ist). Eine erfindungsgemäße Ausführungsform, die in den Beispielen unten beschrieben ist, verwendet eine SAM2^TM Membran (Promega, Madison, Wisconsin, USA) als die Einfangoberfläche, obwohl eine Vielfalt anderer Oberflächen sowie Oberflächen in Mikroarray oder Mikrovertiefungsformaten verwendet werden können, wie sie im Stand der Technik bekannt sind.
Ein Proteinanteil ist ein Protein oder ein Polypeptid, das durch eine DNA Sequenz kodiert ist, die im Allgemeinen ein Gen oder eine natürlich vorkommende Variante des Gens ist. Der Proteinanteil kann die Form des kodierten Proteins annehmen oder kann zusätzliche Aminosäuren umfassen (ursprünglich nicht durch die DNA Sequenz codiert, von dem er abgeleitet ist), um eine Anheftung an das Array oder eine Analyse in einem Test zu erleichtern. In dem Fall, in dem das Protein nur die Aminosäuresequenz aufweist, die durch das natürlich vorkommende Gen ohne eine zusätzliche Sequenz kodiert ist, können solche Proteine durch eine gemeinsame Eigenschaft zwischen den Varianten an das Array angeheftet werden. Zum Beispiel kann ein Satz von Proteinvarianten über ein bindendes Protein oder einen Antikörper an das Array angeheftet werden, das zum Binden eines invarianten oder gemeinsamen Teils des einzelnen Proteins in der Reihe fähig ist. Vorzugsweise sind erfindungsgemäße Proteinanteile Proteine, die entweder am N- oder C-Terminus mit einem Markierungsanteil markiert sind (über die Kombination der Protein kodierenden DNA Sequenz mit einer markierungskodierenden DNA Sequenz), um eine Anheftung an das Array zu erleichtern.
Jede Position im Muster eines Arrays kann zum Beispiel entweder enthalten:

– eine Probe eines Einzelprotein Typs (in der Form eines Monomers, Dimers, Trimers, Tetramers oder höheren Multimers) oder
– eine Probe eines Einzelprotein Typs, das an ein interagierendes Molekül gebunden ist (zum Beispiel ein Nukleinsäuremolekül, Antikörper oder Protein oder kleines Molekül. Das interagierende Molekül kann selbst mit weiteren Molekülen interagieren. Zum Beispiel kann eine Untereinheit eines heteromeren Proteins an das Array angeheftet sein, und eine zweite Untereinheit oder ein Komplex von Untereinheiten kann an das Array über Interaktion mit der angehefteten Proteinuntereinheit angebunden sein. Umgekehrt kann die zweite Untereinheit oder der Komplex der Untereinheiten dann mit einem weiteren Molekül interagieren, z.B. einem Arzneimittel Kandidaten oder einem Antikörper) oder
– eine Probe eines Einzelprotein Typs, das an ein synthetisches Molekül gebunden ist (z.B. ein Peptid, eine chemische Verbindung) oder
– eine Probe aus zwei verschiedenen varianten Proteinen oder "Haplotyp Proteinen", wobei zum Beispiel jedes eine verschiedene Ergänzung von Mutationen oder Polymorphismen besitzt, z.B. "Protein 1" wird von einer DNA Sequenz abgeleitet, die SNP "A" und eine 3 Basenpaare Deletion "X" trägt, während "Protein 2" von einer DNA Sequenz abgeleitet ist, die SNP "A", SNP "B" und eine 3 Basenpaare Insertion "Y" trägt. Eine solche Anordnung ist zum Imitieren der heterozygoten Anwesenheit von zwei verschiedenen Proteinvarianten in einer Person in der Lage.

Vorzugsweise ist der Proteinanteil an jeder Position im Wesentlichen rein, aber bei bestimmten Verhältnissen können Mischungen von zwischen 2 und 100 verschiedenen Proteinanteilen an jeder Position im Muster eines Arrays anwesend sein, von denen mindestens eines markiert ist. Somit können die Proteine, die von der Expression von mehr als einer varianten DNA Sequenz abgeleitet sind, an einer einzelnen Position zum Beispiel für die Zwecke eines einleitenden Massenscreenens einer Reihe von Varianten angeheftet werden, um jene Reihen zu bestimmen, die interessierende Varianten enthalten.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform, die in den Beispielen unten beschrieben ist, verwendet ein Biotin Tag, um die Proteine auf der Oberfläche aufzureinigen bzw. zu reinigen, jedoch ist die Funktionalität des Arrays vom verwendeten Tag unabhängig.
"Natürlich vorkommende Varianten einer interessierenden DNA Sequenz" sind hier als Protein kodierende DNA Sequenzen definiert, die eine gemeinsame Se quenz teilen oder die sich nur durch einen oder mehrere natürlich vorkommende (d.h. in einer Population anwesende und nicht künstlich eingeführte) Einzelnukleotid Polymorphismen, Deletionen oder Insertionen oder jene Sequenzen unterscheiden, die als Haplotypen erachtet werden (ein Haplotyp ist eine Kombination von varianten Eigenschaften auf einem Chromosom gewöhnlich im Zusammenhang eines besonderen Gens). Im Allgemeinen sind solche DNA Sequenzen von demselben Gen abgeleitet, insofern sie auf einem gemeinsamen chromosomalen Ort liegen und ähnliche Proteine kodieren, die verschiedene Phänotypen besitzen können. Mit anderen Worten sind solche Varianten im Allgemeinen natürlich vorkommende Versionen desselben Gens, das eine oder mehrere Mutationen umfasst, oder deren synthetische Äquivalente, die, während sie verschiedene Kodons aufweisen, denselben "Wildtyp" oder dieselben variante Proteine kodieren, wie jene, von denen bekannt ist, dass sie in einer Population vorkommen.
Nützlicherweise werden DNA Moleküle mit allen bekannten Mutationen in einer Population verwendet, um eine Reihe von Proteinanteilen herzustellen, die an die erfindungsgemäßen Arrays angeheftet werden. Wahlweise umfasst das Array einen Teilsatz von varianten Proteinen, die von DNA Molekülen abgeleitet sind, die einen Teilsatz von Mutationen besitzen, zum Beispiel alle bekannten Keimlinien oder erblichen Mutationen oder einen Teilsatz klinisch relevanter oder klinisch wichtiger Mutationen. Verwandte DNA Moleküle, wie hier definiert, sind durch mehr als gerade eine gemeinsame Tag Sequenz verwandt, die zum Zweck des Markierens der sich ergebenden exprimierten Proteine eingeführt ist. Es ist die Sequenz, die zusätzlich zu solchen Tags vorhanden ist, die relevant ist für die Verwandtschaft der DNA Moleküle. Die verwandten Sequenzen sind im Allgemeinen die natürlich kodierende Sequenz eines Gens und varianter Formen, die durch Mutation verursacht sind. In der Praxis tragen die erfindungsgemäßen Arrays Proteinanteile, die von DNA Molekülen abgeleitet sind, die sich unterscheiden, d.h. an 1 bis 10, 1 bis 7, 1 bis 5, 1 bis 4, 1 bis 3, 1 bis 2 oder 1 diskreten Orten in der Sequenz von einem DNA Molekül relativ zu einem anderen oder häufiger relativ zu der Wildtyp kodierenden Sequenz (oder einer am häufigsten vorkommenden Variante in einer Population) mutiert sind. Der Unterschied oder die Mutation an jedem diskreten Sequenzort (zum Beispiel einem diskreten Ort, wie "Basenpaar 342" (der Ort kann eine Einzelbase sein) oder "Basenpaar 502 bis Basenpaar 525" (der Ort kann ein Bereich von Basen sein)) kann eine Punktmutation sein, wie eine Basenänderung, zum Beispiel die Substitution von "A" für "G". Dies kann zu einer "mis-Sense" Mutation führen, wobei eine Aminosäure in der Wildtyp Sequenz durch eine verschiedene Aminosäure ersetzt wird. Ein "Einzelnukleotid Polymorphismus" ist eine Mutation eines Einzelnukleotids. Alternativ kann die Mutation eine Deletion oder Insertion von 1 bis 200, 1 bis 100, 1 bis 50, 1 bis 20 oder 1 bis 10 Basen sein. Um ein Beispiel zu geben, werden Insertionsmutationen in "Triplet Wiederholungs"-Erkrankungen, wie einer Huntington Erkrankung gefunden – Proteinvarianten, die solchen Insertionsmutationen entsprechen, können von verschiedenen Mutationsformen des Gens abgeleitet werden und werden an das Array angeheftet, um eine Untersuchung ihrer Phänotypen zu ermöglichen.
So ist vorgesehen, dass Proteine, die von verwandten DNA Molekülen abgeleitet sind, in der Struktur ganz unterschiedlich sind. Zum Beispiel führt ein verwandtes DNA Molekül, das eine Mutation durchlaufen hat, die es verkürzt, eine Rasterverschiebung ein oder führt ein Stoppkodon auf halbem Weg durch die Wildtyp kodierende Sequenz ein, das ein kleineres oder kürzeres Proteinprodukt erzeugen kann. Eine ähnliche Mutation kann bewirken, dass das variante Protein eine zusätzliche Struktur aufweist, zum Beispiel eine wiederholte Domäne oder eine Anzahl zusätzlicher Aminosäuren entweder an den Termini des Proteins oder innerhalb der Sequenz des Proteins. Solche Proteine, die von verwandten DNA Sequenzen abgeleitet sind, sind in den Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen.
Wie oben dargelegt, sind Arrays, die Proteinanteile tragen, die durch synthetische Äquivalente eines Wildtyp Gens (oder einer natürlich vorkommenden Variante davon) einer interessierenden DNA Sequenz kodiert werden, auch in den Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen.
Auch in den Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen sind Arrays, die Proteinanteile tragen, die von verwandten DNA Molekülen abgeleitet sind, die mit varianten, d.h. mutierten Sequenzen zu Produkten führen, die unterschiedliche prätranslationale Verarbeitung (z.B. alternativ gespleißte Transkripte) oder unterschiedliche posttranslationale Verarbeitung durchlaufen (z.B. tritt Glykosylierung an einer besonderen Aminosäure in einem exprimierten Protein auf, tritt sie aber in einem anderen exprimierten Protein aufgrund einer Kodonänderung in der zugrundliegenden DNA Sequenz nicht auf, die bewirkt, dass die glykosylierte Aminosäure abwesend ist).
Im Allgemeinen sind erfindungsgemäße verwandte DNA Moleküle von Genen abgeleitet, die auf demselben chromosomalen Ort liegen, d.h. die verwandten DNA Moleküle sind unterschiedliche Versionen derselben Protein kodierenden Sequenz, die von einer einzigen Kopie eines Gens abgeleitet sind, die sich als ein Ergebnis einer natürlichen Mutation unterscheiden.
Der Wildtyp (oder das Protein, das durch die häufigste variante DNA Sequenz in einer Population kodiert ist) des Proteins ist vorzugsweise als einer der Proteinanteile auf dem Array eingeschlossen, um als eine Referenz zu wirken, durch welche die relativen Aktivitäten der Proteine, die von verwandten DNA Molekülen abgeleitet sind, verglichen werden können. Die Ausgabe des Tests gibt an, ob das verwandte DNA Molekül, welches ein mutiertes Gen umfasst, kodiert:

(1) ein Protein mit vergleichbarer Funktion zum Wildtyp Protein
(2) ein Protein mit geringerem oder höherem Funktionsniveaus als der Wildtyp
(3) ein Protein mit keiner nachweisbaren Funktion
(4) ein Protein mit veränderten posttranslationalen Modifikationsmustern
(5) ein Protein mit einer Aktivität, die durch Zugabe eines zusätzlichen Bestandteils modifiziert werden kann (z.B. ein Peptid, Antikörper oder kleines Molekül als Arzneimittelkandidat)
(6) ein Protein mit einer Aktivität, das durch posttranslationale Modifikation zum Beispiel in situ auf dem Chip modifiziert werden kann, zum Beispiel Phosphorylierung.
(7) ein Protein mit einer veränderten Funktion unter unterschiedlichen Umweltbedingungen im Test, zum Beispiel Ionenstärke, Temperatur oder pH-Wert.

Die Proteinanteile der erfindungsgemäßen Arrays können Proteine umfassen, die mit einem Erkrankungszustand, Arzneimittel Metabolismus assoziiert sind oder nicht gekennzeichnet sein können. In einer bevorzugten Ausführungsform kodieren die Proteinanteile Wildtyp p53 und allelische Varianten davon. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Arrays Proteinanteile, die ein Arzneimittel metabolisierendes Enzym, vorzugsweise Wildtyp p450 und allelische Varianten davon kodieren.
Die Anzahl von Proteinvarianten, die an die erfindungsgemäßen Arrays angeheftet sind, werden durch die Anzahl varianter kodierender Sequenzen bestimmt, die natürlich vorkommen oder die von ausreichendem experimentellen, kommerziellen oder klinischen Interesse sind, um künstlich erzeugt zu werden. Ein Array, das ein Wildtyp Protein und eine einzige Variante trägt, würde für den Untersuchenden von Nutzen sein. In der Praxis jedoch und um die Vorteile der Geeignetheit solcher Arrays für Hochdurchsatz Tests zu nutzen, ist es vorgesehen, dass 1 bis 10000, 1 bis 1000, 1 bis 500, 1 bis 400, 1 bis 300, 1 bis 200, 1 bis 100, 1 bis 75, 1 bis 50, 1 bis 25, 1 bis 10 oder 1 bis 5 verwandte DNA Moleküle durch ihre kodierten Proteine auf einem Array repräsentiert sind. Zum Beispiel gibt es im Fall des Gens für p53 (der Gegenstand von einem der hier beschriebenen Beispiele) derzeit ungefähr 50 bekannte Keimbahn oder erbliche Mutationen und mehr als 1000 bekannte somatische Mutationen. Eine Person kann natürlich zwei verschiedene Keimbahn Mutationen erben. So kann ein p53 variantes Proteinarray Proteine tragen, die von den 50 Keimbahn Mutationen abgeleitet sind, wobei jede von einem unterschiedlichen Ort isoliert wurde, Proteine von einem klinisch relevanten Teilsatz von 800 somatischen kodierenden Mutationen, (wobei ein Protein exprimiert werden kann), wobei jede von einem unterschiedlichen Ort isoliert wurde (oder in Gruppen von 10 von jedem Ort) und alle möglichen paarweisen Kombinationen der 50 Keimbahn Mutationen, wobei jede an einem unterschiedlichen Ort lokalisiert ist. Es kann deshalb gesehen werden, dass ein erfindungsgemäßer Array nützlicherweise einzelne DNA Moleküle repräsentieren kann, die mehr als 1000 unterschiedliche natürlich vorkommende Mutationen enthalten, und kann dementsprechend viel mehr, zum Beispiel 10000 oder mehr, getrennte diskrete Proben oder "Spots" der Proteinvarianten tragen, die davon abgeleitet sind, die entweder allein oder in Kombination mit anderen Varianten lokalisiert sind.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Proteinarrays bereit, umfassend die Schritte a) Bereitstellen DNA kodierender Sequenzen, die von zwei oder mehreren natürlich vorkommenden Varianten einer interessierenden DNA Sequenz abgeleitet sind, b) Exprimieren der kodierenden Sequenzen, um ein oder mehrere einzelne Proteinanteile bereitzustellen und c) Ablegen der Proteinanteile in einem räumlich definierten Muster auf einer Oberfläche, um ein Array zu ergeben.
In einigen Ausführungsformen können die Proteinanteile gereinigt werden. Vorzugsweise können die Proteinanteile gleichzeitig in einem einzigen Schritt auf dem Array gereinigt und isoliert werden. Dies kann mittels "Oberflächeneinfangen" durchgeführt werden, womit die gleichzeitige Reinigung und Isolation des Proteinanteils auf dem Array durch das eingebaute Tag gemeint ist, wie es in den Beispielen unten beschrieben ist, und in anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung wird ein erfindungsgemäßes Proteinarray bereitgestellt, das durch dieses Verfahren erhältlich ist. Jedoch ist eine solche Reinigung wahlweise, da es für die Proteinherstellung nicht notwendig ist am Ort des isolierten, markierten Proteins rein zu sein – das markierte Protein muss nur vom rohen Lysat der Wirts Herstellungszelle getrennt sein, wenn eine Reinheit nicht durch den Test erforderlich ist, in dem das Array teil nimmt.
Die DNA Moleküle, die exprimiert werden, um die Proteinanteile des Arrays herzustellen, können unter Verwendung von Techniken erzeugt werden, die im Stand der Technik bekannt sind (als Beispiel siehe Current Protocols in Molecular Biologe, Band 1, Kapitel 8, herausgegeben durch Ausubel, FM, Brent, R, Kingston, RE, Moore, DD, Siedman, JG, Smith JA und Struhl, K). Die Einfachheit von in vitro Manipulation klonierter DNA ermöglicht Mutationen, zum Beispiel SNPs, um durch molekularbiologische Standardtechniken erzeugt zu werden, wie PCR Mutagenese unter Verwendung des Wildtyp Gens als Matrize. Deshalb wird nur eine Kenntnis der Identität der Mutation, zum Beispiel SNP (häufig in elektronischen Datenbanken verfügbar), und nicht des eigentlichen Mutation enthaltenden DNA Moleküls zur Proteinarray Herstellung benötigt. Das Wildtyp Gen, welches das interessierende Protein kodiert, wird zuerst in einen DNA Vektor zur Expression in einem geeigneten Wirt kloniert. Es wird vom Fachmann verstanden werden, dass der Expressionswirt nicht auf E. coli beschränkt sein muss – Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen können verwendet werden. Die Verwendung eines eukaryotischen Wirts kann erwünscht sein, falls das Protein, das untersucht wird, dafür bekannt ist, eine posttranslationale Modifikation zu unterlaufen, wie eine Glykosylierung. Nach einer Bestätigung von Expression und Proteinaktivität wird das Wildtyp Gen mutiert, um die erwünschten SNPs einzuführen. Die Anwesenheit des SNP wird durch Sequenzieren nach Reklonieren bestätigt.
Um das Array herzustellen, können Klone in einem Mikrotiterplatten Format angezogen werden (aber nicht ausschließlich), wodurch ein paralleles Verarbeiten von Proben in einem Format ermöglicht wird, das zum Anordnen auf Objektträgern oder Plättchenformaten geeignet ist und das ein Hochdurchsatz Format bereitstellt. Eine Proteinexpression wird induziert, und Klone werden anschließend zum Anordnen verarbeitet. Dies kann ein Reinigen der Proteine durch Affinitätschromatographie oder ein Herstellen von Lysaten einschließen, die zum Anordnen auf einer Oberfläche bereit sind, die selektiv für das rekombinante Protein ist ("Oberflächen Einfangen"). Somit können die DNA Moleküle als Fusionsproteine exprimiert werden, um Proteinanteile zu ergeben, die entweder am N- oder C-Terminus mit einem Markierungsanteil markiert sind. Wie hier beschrieben, können solche Tags verwendet werden, um die Proteine zu reinigen oder an die Oberfläche oder das Array anzuheften. In geeigneter und bevorzugter Weise werden die Proteinan teile gleichzeitig von dem Expressionswirt Lysat gereinigt und mittels des Markierungsanteils an das Array angeheftet. Das sich ergebende Array von Proteinen kann dann verwendet werden, um die Funktionen aller Proteine parallel und deshalb in Hochdurchsatz Weise zu testen.
Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum gleichzeitigen Bestimmen der relativen Eigenschaften von Mitgliedern einer Reihe von Proteinanteilen bereit, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines Arrays, wie hier beschriebenen, In Kontaktbringen des Arrays mit einer Testsubstanz und Beobachten der Interaktion der Testsubstanz mit jedem Mitglied der Reihe auf dem Array.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screenen einer Reihe von Proteinanteilen bereit, die von verwandten DNA Molekülen für Verbindungen (zum Beispiel ein kleines organisches Molekül) abgeleitet sind, die eine Funktion eines Proteins wiederherstellen oder stören, die Verbindungen mit therapeutischen Vorteilen oder Nachteilen für einen Teilsatz der Population zeigen können, die einen besonderen SNP oder eine andere Mutation tragen. In anderen Ausführungsformen kann die Testsubstanz sein:

– ein Protein zum Bestimmen relativer Protein:Protein Interaktionen innerhalb einer Reihe von Proteinanteilen, die von verwandten DNA Molekülen abgeleitet sind
– ein Nukleinsäuremolekül zum Bestimmen relativer Protein:DNA oder Protein:RNA Interaktionen
– ein Ligand zum Bestimmen relativer Protein:Ligand Interaktionen.

Ergebnisse, die aus der Abfrage erfindungsgemäßer Arrays erhalten werden, können quantitativ (z.B. Messen von bindenden bzw. Bindungs- oder katalytischen Konstanten K_D & K_M), semiquantitativ (z.B. eine normalisierte gebundene Menge gegen eine Proteinquantität) oder qualitativ sein (z.B. funktionell vs. nicht funktio nell). Durch Quantifizieren des Signals für Replikationsarrays, bei denen der Ligand mit mehreren (zum Beispiel zwei oder mehr) Konzentrationen zugegeben wird, können sowohl die Bindungsaffinitäten als auch die aktiven Konzentrationen von Protein im Spot bestimmt werden. Dies ermöglicht einen Vergleich von SNPs miteinander und dem Wildtyp. Dieses Informationsniveau ist zuvor aus Arrays nicht erhalten worden. Genau dieselbe Methodik könnte verwendet werden, um eine Bindung von Arzneimittel an angeordnete Proteine zu messen.
Zum Beispiel können quantitative Ergebnisse, K_D und B_max, welche die Affinität der Interaktion zwischen Ligand und Protein und die Anzahl von Bindungsstellen jeweils für diesen Liganden beschreiben, von Proteinarraydaten abgeleitet werden. Kurz gesagt können sowohl quantifizierte als auch relative Mengen eines Liganden, der an jeden einzelnen Proteinspot gebunden ist, bei unterschiedlichen Konzentrationen eines Liganden in der Testlösung gemessen werden. Unter der Annahme eines linearen Verhältnisses zwischen der Menge eines Proteins und eines gebundenen Liganden kann die (relative) Menge eines Liganden, der an jedem Spot gebunden ist, über einen Bereich von Ligandenkonzentrationen, die in dem Test verwendet werden, an Gleichung 1, Umstellungen oder Ableitungen angepasst werden. Gebundener Ligand = Bmax/((KD/[L]) + 1) (Gleichung 1)

[L]: = Konzentration eines Liganden, der im Test verwendet wird

Bevorzugte Merkmale jedes erfindungsgemäßen Aspekts sind wie für jeden anderen Aspekt mutatis mutandis definiert.
Weitere erfindungsgemäße Eigenschaften und Details werden aus der folgenden Beschreibung besonderer Ausführungsformen eines Proteinarrays, eines p53 Protein SNP Arrays und eines p450 Arrays, und seiner erfindungsgemäßen Verwendung ersichtlich, die exemplarisch unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen angegeben sind, in denen:
1 eine p53 Mutationsfeldexpression zeigt. E. coli Zellen, die Plasmide enthalten, die humanes p53 vom Wildtyp oder die angegebenen Mutanten kodieren, wurden für 4 h bei 30°C induziert. Die Zellen wurden durch die Zugabe von Lysozym und Triton X100 lysiert, und die geklärten Lysate wurden durch einen Western Blot analysiert. Eine Spur, die dem His markierten, biotinylierten p53 in voller Länge entspricht, läuft bei ungefähr 70 kDa.
2 einen Gel Verschiebungstest zeigt, um eine DNA Bindungsfunktion von E. coli exprimiertem p53 zu zeigen. 1 μl des geklärten E. coli Lysats, das Wildtyp p53 (wt) oder die angegebene Mutante enthält, wurde mit 250 nm DIG markierter DNA und 0,05 mg/ml polydl/dC Konkurrenz DNA kombiniert. Die -ve Kontrolle enthielt nur DNA. Gebundene und freie DNA wurde durch ein 6 % Gel (NOVEX) getrennt, auf eine positiv geladene Membran (Roche) übertragen, und DIG markierte DNA wurde unter Verwendung eines anti-DIG HRP konjugierten Antikörpers (Roche) nachgewiesen. Der DNA:p53 Komplex ist durch einen Pfeil angegeben.
3 Mikroarray Daten für den p53 DNA Bindungstest zeigt. Lysate wurden in einem 4×4 Muster auf einer Streptavidin Einfangmembran angeordnet, wie in A) detailliert dargestellt und mit B) Cy3 markiertem anti-Histidin Antikörper oder C) Cy3 markierter GADD45 DNA als Sonde vor dem Scannen in einem Affymetrx 428 Arrayscanner versehen.
4 eine CKII Phosphorylierung von p53 zeigt. 2 μl eines E. coli Lysats, das p53 Wildtyp (wt) oder das angegebene Mutantenprotein enthält, wurden mit oder ohne Kaseinkinase II in einem Puffer, der ATP enthält, für 30 min bei 30°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Western Blot untersucht, und die Phosphorylierung am Serin 392 wurde unter Verwendung eines phosphorylierungsspezifischen Antikörpers nachgewiesen.
5 Mikroarraydaten für den CKII Phosphorylierungstest zeigt. Das p53 Array wurde mit CKII und ATP für 1 h bei 30°C inkubiert und auf Phosphorylierung am Serin 392 analysiert. Die Phosphorylierung wurde für alle Proteine auf dem Array mit Ausnahme der Verkürzungsmutanten Q136X, R196X, R209X, R213X, R306X, und für die Aminosäuremutanten L344P und S392A nachgewiesen.
6 einen Lösungsphasen MDM2 Interaktionstest zeigt. 10 μl von p53 enthaltendem Lysat wurden mit 10 μl MDM2 enthaltendem Lysat und 20 μl anti-FLAG Agarose in einem Gesamtvolumen von 500 μl inkubiert. Nach einer Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur wurde die anti-FLAG Agarose durch Zentrifugation gesammelt, ausgiebig gewaschen, und gebundene Proteine wurden durch Western Blot analysiert. p53 Proteine wurden durch Strep/HRP Konjugat nachgewiesen.
7 Mikroarraydaten für eine MDM2 Interaktion zeigt. Das p53 Array wurde mit gereinigtem Cy3 markiertem MDM2 Protein für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und gebundenes MDM2 Protein wurde unter Verwendung eines DNA Arrayscanners (Affymetrix) nachgewiesen. MDM2 Protein band an alle Mitglieder des Arrays, abgesehen von den W23A und W23G Mutanten.
8A Replikations p53 Mikroarrays zeigt, die in der Anwesenheit von 33P markierter Duplex DNA, die der Sequenz des GADD45 Promotorelements entspricht, bei variierenden Konzentrationen inkubiert wurden und unter Verwendung eines Phosphorimagers Bild gebend dargestellt wurden, so dass einzelne Spots quantifiziert werden konnten.
8B eine DNA Bindung an Wildtyp p53 (hohe Affinität), R273H (geringe Affinität) und L334P (keine Bindung) zeigt, was eine Wildtyp Affinität von 7 nM voraussagt.
9A eine Plasmidkarte von pBJW102.2 zur Expression von C-terminalen BCCP Hexahistidin Konstrukten zeigt.
9B die DNA Sequenz von pBJW102.2 zeigt.
9C die Klonierungsstelle von pBJW102.2 vom Startkodon zeigt. Humane P450, NADPH Cytochrom P450 Reduktase und Cytochrom b5 ORFs und Verkürzungen davon wurden an einen DraIII/SmaI gespaltenen Vektor von pBJW 102.2 ligiert.
10A eine Vektorkarte von pJW 45 zeigt.
10B die Sequenz des Vektors pJW45 zeigt.
11A die DNA Sequenz des offenen Leserasters von humanem P450 3A4 zeigt.
11B die Aminosäuresequenz von humanem P450 3A4 in voller Länge zeigt.
12A die DNA Sequenz des offenen Leserasters von humanem P450 2C9 zeigt.
12B die Aminosäuresequenz von humanem P450 2C9 in voller Länge zeigt.
13A die DNA Sequenz des offenen Leserasters von humanem P450 2D6 zeigt.
13B die Aminosäuresequenz von humanem P450 2D6 in voller Länge zeigt.
14 einen Western Blot und ein Coomassie gefärbtes Gel der Reinigung von Cytochrom P450 3A4 aus E. coli zeigt. Proben aus der Reinigung von Cytochrom P450 3A4 wurden auf einem SDS-PAGE laufen gelassen, das bezüglich eines Proteins unter Verwendung von Coomassie gefärbt wurde oder durch Western Blot auf eine Nitrozellulosemembran übertragen wurde, mit einer Streptavidin HRP Konjugat Sonde versehen und unter Verwendung von DAB Färbung visualisiert wurde:
Spuren 1: Ganze Zellen
Spuren 2: Lysat
Spuren 3: Lysierte E. coli Zellen
Spuren 4: Überstand vom E. coli Zellwaschschritt
Spuren 5: Pellet vom E. coli Zellwaschschritt
Spuren 6: Überstand nach Membranauflösung
Spuren 7: Pellet nach Membranauflösung
Spuren 8: Molekulargewichts Markierungen: 175, 83, 62, 48, 32, 25, 16,5, 6,5 kDa
15 das Coomassie gefärbte Gel einer Ni-NTA Säulenreinigung von Cytochrom P450 3A4 zeigt. Proben aller Stufen der Säulenreinigung wurden auf einem SDS-PAGE laufengelassen:
Spur 1: Markierungen 175, 83, 62, 48, 32, 25, 16,5, 6,5 kDa
Spur 2: Überstand der Membranauflösung
Spur 3: Säulendurchfluss
Spur 4: Waschschritt in Puffer C
Spur 5: Waschschritt in Puffer D
Spuren 6 & 7: Waschschritte in Puffer D + 50 mM Imidazol
Spuren 8–12: Elution in Puffer D + 200 mM Imidazol
16 die Testaktivität für Cytochrom P450 2D6 in einem Rekonstitutionstest unter Verwendung des Substrats AMMC zeigt. Rekombinantes, markiertes CYP2D6 wurde mit einem kommerziell verfügbaren CYP2D6 bezüglich der Fähigkeit verglichen, AMMC nach einer Rekonstitution in Liposomen mit NADPH Cytochrom P450 Reduktase umzusetzen.
17 die Raten einer Resorufin Bildung aus BzRes durch Cumol Wasserstoffperoxid aktiviertes Cytochrom P450 3A4 zeigt. Cytochrom P450 3A4 wurde in Lösung mit Cumol Wasserstoffperoxid Aktivierung in der Anwesenheit steigender Konzentrationen von BzRes bis zu 160 μM getestet.
18 die Gleichgewichtsbindung von [³H]Ketoconazol an immobilisiertes CYP3A4 und CYP2C9 zeigt. Im Fall von CYP3A4 sind die Datenpunkte die Mittel werte ± Standardabweichung von vier Experimenten. Eine unspezifische Bindung wurde in der Anwesenheit von 100 μM Ketoconazol bestimmt (Daten nicht gezeigt).
19 die chemische Aktivierung von markiertem, immobilisiertem P450 zeigt, wobei die Umsetzung von DBF in Fluoreszein durch CHP aktiviertes P450 3A4 eingeschlossen ist, das auf einer Streptavidin Oberfläche immobilisiert ist.
20 die Stabilität von Agarose verkapselten Mikrosomen zeigt. Mikrosomen, die Cytochrom P450 2D6 plus NADPH Cytochrom P450 Reduktase und Cytochrom b5 enthalten, wurden in Agarose verdünnt und verfestigten sich in Platten mit 96 Vertiefungen. Ein AMMC Umsatz wurde unmittelbar und nach zwei und sieben Tagen bei 4°C gemessen.
21 den Umsatz von BzRes durch Cytochrom P450 3A4 Isoformen zeigt. Cytochrom P450 3A4 Isoformen WT, *1, *2, *3, *4, *5 & *15 (ungefähr 1 μg) wurden in der Anwesenheit von BzRes (0–160 μM) und Cumol Wasserstoffperoxid (200 μM) bei Raumtemperatur in 200 mM KPO₄ Puffer, pH 7,4, inkubiert. Die Bildung von Resorufin wurde im Zeitverlauf gemessen, und die Raten wurden aus dem Verlauf der Kurven berechnet. Die Kurven, die herkömmliche Michaelis-Menton Kinetiken beschreiben, wurden an die Daten angepasst.
22 die Hemmung von Cytochrom p450 3A4 Isoformen durch Ketoconazol zeigt. Cytochrom P450 3A4 Isoformen WT, *1, *2, *3, *4, *5 & *15 (ungefähr 1 μg) wurden in der Anwesenheit von BzRes (50 μM) und Cumol Wasserstoffperoxid (200 μM) und Ketoconazol (0, 0,008, 0,04, 0,2, 1) bei Raumtemperatur in 200 mM KPO₄ Puffer, pH 7,4, inkubiert. Die Bildung von Resorufin wurde im Zeitverlauf gemessen, und die Raten wurden aus dem Verlauf der Kurven berechnet. IC₅₀ Hemmungskurven wurden an die Daten angepasst.
BEISPIELE
Beispiel 1: Verwendung eines Proteinarrays zur funktionellen Analyse von Proteinen, die durch SNP enthaltende Gene kodiert werden – das p53 Protein SNP Array
Mutationen im Tumorsuppressor Protein p53 sind mit ungefähr 50 % der Krebsfälle assoziiert, und mehr als tausend SNPs dieses Gens sind beobachtet worden. Mutationen des p53 Gens in Tumorzellen (somatische Mutation) oder im Genom von Familien mit einer Prädisposition für Krebs (Keimbahn Mutation) stellen eine Assoziation zwischen einem Leiden und einem Genotyp, aber keinen molekularen Mechanismus bereit. Um den Nutzen von Proteinarrays zur funktionellen Charakterisierung von kodierenden SNPs darzustellen, haben die Erfinder Wildtyp humanes p53 zusammen mit 46 Keimbahn Mutationen (SNPs) angeordnet. Die biochemische Aktivität dieser Proteine kann dann schnell und parallel unter Verwendung kleiner Probenvolumina eines Reagens oder Liganden verglichen werden. Für die angeordneten Proteine wird gezeigt, dass sie für eine DNA Bindung funktionell sind, posttranslational "on chip" durch eine bekannte p53 Kinase phosphoryliert sind und mit einem bekannten p53 interagierenden Protein MDM2, interagieren können. Für viele dieser SNPs ist dies die erste funktionelle Charakterisierung der Wirkung der Mutation auf eine p53 Funktion und stellt den Nutzen von Protein Mikroarrays im Analysieren biochemischer Aktivitäten in einer enorm parallelen Weise dar.
Material und Methoden zur Herstellung eines p53 SNP Arrays.
Wildtyp p53 cDNA wurde durch PCR aus einer HeLa Zell cDNA Bibliothek unter Verwendung der Primer P53F (5' atg gag gag ccg cag tca gat cct ag 3') und P53R (5' gat cgc ggc cgc tca gtc agg ccc ttc tg 3') amplifiziert und in einen E. coli Expressionsvektor der Sequenz nachgeschaltet ligiert, die ein poly-Histidin Tag und die BCCP Domäne des E. coli Accb Gens kodiert. Die Ligierungsmischung wurde in chemisch kompetente XL1Blue Zellen (Stratagene) gemäß der Anleitungen des Herstellers transformiert. Die p53 cDNA Sequenz wurde durch Sequenzieren überprüft, und es wurde festgestellt, dass sie der Wildtyp p53 Proteinsequenz entspricht, wie sie in der SWISS PROT. Eintragung für p53 enthalten ist [Zugangsnr. P04637].
Herstellung eines p53 Mutantenfeldes
Mutanten von p53 wurden unter Verwendung des Plasmids, das die Wildtyp p53 Sequenz als eine Matrize enthält, in einer inversen PCR Reaktion hergestellt. Die Primer waren so gestaltet, dass der Vorwärtsprimer 5' phosphoryliert war und mit dem Einzelnukleotid Polymorphismus (SNP) am 5' Ende begann, gefolgt durch 20– 24 Nukleotide der p53 Sequenz. Der Rückwärtsprimer war so gestaltet, dass er zu den 20–24 Nukleotiden vor dem SNP komplementär ist. Eine PCR wurde unter Verwendung einer Pwo Polymerase durchgeführt, die Produkte mit stumpfen Enden erzeugt, die dem gesamten p53 enthaltenden Vektor entsprechen. Die PCR Produkte wurden Gel gereinigt, ligiert, um zirkuläre Plasmide zu bilden, und Matrizen DNA wurde mit Restriktionsendonuklease DpnI (New England Biolabs) gespalten, um die Klonierungswirksamkeit zu erhöhen. Die ligierten Produkte wurden in XL1Blue Zellen transformiert, und mutierte p53 Gene wurden durch Sequenzieren bezüglich der Anwesenheit der erwünschten Mutation und der Abwesenheit irgendeiner sekundären Mutation verifiziert, die durch PCR eingeführt wurde.
Expression von p53 in E. coli
Kolonien von XLIBlue Zellen, die p53 Plasmide enthielten, wurden in 2 ml LB Medium, das Ampicillin enthielt (70 Mikrogramm/ml) in Blöcke mit 48 Vertiefungen (QIAGEN) überimpft und über Nacht bei 37°C in einem Schüttelinkubator angezogen. 40 μl der Übernachtkultur wurden verwendet, um weitere 2 ml LB/Ampicillin in Blöcke mit 48 Vertiefungen zu überimpfen und wurden bei 37°C angezogen, bis eine optische Dichte (600 nm) von –0,4 erreicht war. IPTG wurde anschließend mit 50 μM zugegeben, und die Induktion setzte sich bei 30°C für 4 Stunden fort.
Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt, und die Zellpellets wurden bei –80°C aufbewahrt. Zur Herstellung von Protein wurden die Zellpellets bei Raumtemperatur aufgetaut, und 40 μl des p53 Puffers (25 mM HEPES, pH 7,6, 50 mM KCl, 10 % Glycerol, 1 mM DTT, 1 mg/ml Rinderserum Albumin, 0,1 % Triton X100) und 10 μl 4 mg/ml Lysozym wurden zugegeben und gevortext, um das Zellpellet zu resuspendieren. Die Lysis wurde durch Inkubation auf einem Kippapparat bei Raumtemperatur für 30 min gefördert, bevor der Zelldebris durch Zentrifugation bei 13000 rpm für 10 min bei 4°C gesammelt wurde. Der geklärte Überstand an löslichem Protein wurde entfernt und unmittelbar verwendet oder bei –20°C gelagert.
Untersuchung durch Western Blot
Lösliche Proteinproben wurden in SDS enthaltendem Puffer für 5 min vor einem Beladen auf 4–20 % Tris-Glycin Gele (NOVEX) gekocht und bei 200 V für 45 min laufen gelassen. Das Protein wurde auf eine PVDF Membran (Hybond-P, Amersham) übertragen und auf die Anwesenheit verschiedener Epitope unter Verwendung von Standardtechniken mittels einer Sonde untersucht. Zum Nachweis des Histidin Tags wurden die Membranen in 5 % Marvel/PBST blockiert, und anti-RGS His Antikörper (QIAGEN) wurde als der primärer Antikörper bei einer 1/1000 Verdünnung verwendet. Zum Nachweis des Biotin Tags wurden die Membranen in Superblock/TBS (Pierce) blockiert und mit Streptavidin-HRP Konjugat (Amersham) als Sonde bei einer 1/2000 Verdünnung in Superblock/TBS/0,1 % Tween 20 untersucht. Der sekundäre Antikörper für den RGS His Antikörper war anti-Maus IgG (Fc spezifisches) HRP Konjugat (Sigma), das bei einer 1/2000 Verdünnung in Marvel/PBST verwendet wurde. Nach ausgiebigem Waschen wurden gebundene HRP Konjugate unter Verwendung entweder von ECL Plus (Amersham) und Hyperfilm ECL (Amersham) oder durch DAB Färben (Pierce) nachgewiesen.
DNA Gel Verschiebungstest
Die DNA Bindungsfunktion von exprimiertem p53 wurde unter Verwendung eines herkömmlichen Gel Verschiebungstests getestet. Die Oligonukleotide DIGGADD45A (5' DIG-gta cag aac atg tct aag cat gct ggg gac-3') und GADD45B (gtc ccc agc atg ctt aga cat gtt ctg tac 3') wurden zusammen reassoziiert, um eine Endkonzentration von 25 μM dsDNA zu ergeben. Es wurden Bindungsreaktionen zusammengestellt, die 1 μl geklärtes Lysat, 0,2 μl reassoziierte DIG markierte GADD45 Oligonukleotide und 1 μl polydl/dC Konkurrenz DNA (Sigma) in 20 μl p53 Puffer enthielten. Die Reaktionen wurden bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert, auf Eis gekühlt, und 5 μl wurden auf ein 6 % Vorlauf Polyacrylamid/TBE Gel (NOVEX) geladen. Die Gele wurden bei 100 V bei 4°C für 90 min laufen gelassen, bevor sie auf eine positiv geladene Nitrozellulose (Roche) übertragen wurden. Die Membranen wurden in 0,4 % Blockierungsreagens (Roche) in Puffer I (100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,0) für 30 min blockiert und auf Anwesenheit von DIG markierter DNA mit anti-DIG Fab Fragmenten als Sonde untersucht, die an HRP (Roche) konjugiert waren. Gebundene HRP Konjugate wurden unter Verwendung von ECL Plus und Hyperfilm ELC (Amersham) nachgewiesen.
p53 Phosphorylierungstest
Die Phosphorylierung von p53 wurde unter Verwendung gereinigter Kaseinkinase II (CKII, Sigma) durchgeführt. Für diese Kinase ist zuvor gezeigt worden, dass sie Wildtyp p53 am Serin 392 phosphoryliert. Die Phosphorylierungsreaktionen enthielten 2 μl p53 Lysat, 10 mM MgCl₂, 100 μM ATP und 0,1 Einh. CKII in 20 μl p53 Puffer. Die Reaktionen wurden bei 30°C für 30 min inkubiert, die Reaktionsprodukte wurden durch 4–20 % NOVEX Gele getrennt und auf eine PVDF Membran übertragen. Eine Phosphorylierung von p53 wurde unter Verwendung eines Antikörpers nachgewiesen, der für eine Phosphorylierung von p53 am Serin 392 spezifisch ist (Cell Signalling Technology), der bei einer 1/1000 Verdünnung in Marvel/TBST verwendet wurde. Ein sekundärer Antikörper war ein anti-Kaninchen HRP Konjugat (Cell Signalling Technology), das bei einer 1/2000 Verdünnung verwendet wurde.
MDM2 Interaktionstest
Die cDNA für den N-terminalen Teil von MDM2 (Aminosäuren 17-127) wurden aus einer cDNA Bibliothek amplifiziert und den Sequenzen, die ein His Tag und ein FLAG Tag kodieren, nachgeschaltet in einen E. coli Expressionsvektor kloniert. Die Plasmide wurden durch Sequenzieren auf eine korrekte MDM2 Sequenz überprüft, und eine Induktion von E. coli Kulturen zeigte eine Expression eines His und FLAG markierten löslichen Proteins der erwarteten Größe. Um auf Interaktionen zwischen MDM2 und dem p53 Mutantenfeld zu testen, wurden Bindungsreaktionen zusammengestellt, die 10 μl p53 enthaltendes Lysat, 10 μl MDM2 enthaltendes Lysat, 20 μl anti-FLAG Agarose in 500 μl Phosphat gepufferter Salzlösung enthielten, die 300 mM NaCl, 0,1 % Tween 20 und 1 % (w/v) Rinderserum Albumin enthielten. Die Reaktionen wurden auf einem Kippapparat bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert, und FLAG gebundene Komplexe wurden durch Zentrifugation bei 5000 rpm für 2 min gesammelt. Nach ausgiebigem Waschen in PEST wurden FLAG gebundene Komplexe in SDS Probenpuffer denaturiert und durch Western Blot untersucht. Die Anwesenheit von biotinyliertem p53 wurde durch ein Streptavidin/HRP Konjugat nachgewiesen.
p53 Mikroarrayherstellung und Tests
Geklärte Lysate des p53 Mutantenfeldes wurden auf eine Platte mit 384 Vertiefungen geladen und auf eine SAM2^TM Membran (Promega, Madison, Wisconsin, USA) unter Verwendung eines maßgefertigten Automaten (K-Biosystems, UK) mit einem mikroanordnenden Kopf mit 16 Nadeln gedruckt. Jedes Lysat wurde 4-malig auf jedes Array gespottet, und jeder Spot wurde 3-malig aufgedruckt. Nach dem Drucken wurden die Arrays in p53 Puffer angefeuchtet und in 5 % Marvel/p53 Puffer für 30 min geblockt. Nach einem Waschen 3 × 5 min in p53 Puffer waren die Arrays für einen Test bereit.
Für einen DNA Bindungstest wurden 5 μl reassoziierte Cy3 markierte GADD45 Oligonukleotide zu 500 μl p53 Puffer zugegeben. Die Sondenlösung wurde bei Raumtemperatur für 30 min über das Array gewaschen, und es wurde für 3 × 5 min in p53 Puffer gewaschen. Die Arrays wurden anschließend getrocknet und auf Glasobjektträgern zum Scannen in einem Affymetrix 428 Arrayscanner befestigt. Eine Quantifizierung von Cy3 gescannten Bildern wurde unter Verwendung einer ImaGene Software durchgeführt.
Für den Phosphorylierungstest wurden 10 μl CKII mit den Arrays in 320 μl p53 Puffer und 80 μl Mg/ATP Mischung bei 30°C für 30 min inkubiert. Die Arrays wurden dann für 3 × 5 min in TEST gewaschen, und anti-Phosphoserin 392 Antikörper wurde bei einer 1/1000 Verdünnung in Marvel/TBST für 1 Stunde zugegeben. Nach einem Waschen für 3 × 5 min in TEST wurde anti-Kaninchen sekundärer Antikörper bei einer 1/2000 Verdünnung für 1 Stunde zugegeben. Gebundener Antikörper wurde durch ECL Plus und Hyperfilm nachgewiesen.
Für den MDM2 Interaktionstest wurden 1 μl gereinigtes Cy3 markiertes MDM2 Protein mit den Arrays in 500 μl PBS/300 mM NaCl/0,1 % Tween 20/1 % BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem Waschen für 3 × 5 min im selben Puffer wurden die Arrays getrocknet, auf Glasobjektträgern befestigt und auf Cy3 Fluoreszenz wie für den DNA Bindungstest analysiert.
Ergebnisse
Expression von p53 in E. coli und Herstellung eines Mutantenfeldes
Der p53 offene Leseraster in voller Länge wurde aus einer Hela Zell cDNA Bibliothek durch PCR amplifiziert und dem Tac Promotor nachgeschaltet in einen Vektor pQE80L kloniert, in den die BCCP Domäne aus dem E. coli Gen ACCB bereits kloniert worden ist. Das sich ergebende p53 wäre dann an seinem N-Terminus His und Biotin markiert, und 1 zeigt eine Western Blot Analyse von löslichem Protein aus induzierten E. coli Kulturen. Es ist ein klares Signal für His markiertes, biotinyliertes Protein bei ungefähr 66 kDa vorhanden, und eine Bande derselben Größe wird durch den p53 spezifischen Antikörper pAb1801 nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Das Plasmid, das dieses Protein kodiert, wurde vollständig sequenziert, und es ist gezeigt worden, dass es Wildtyp p53 cDNA Sequenz ist. Dieses Plasmid wurde als die Matrize verwendet, um das Mutantenfeld zu bilden, und 1 zeigt auch eine Analyse der Expression einer Auswahl jener Mutanten, die ein Protein in voller Länge, wie es für die Einzelnukleotid Polymorphismen erwartet wird, und gekürzte Proteine zeigen, bei denen die Mutation für ein Stoppkodon kodiert. Die Mutanten wurden auch sequenziert, um die Anwesenheit der erwünschten Mutation und die Abwesenheit irgendwelcher sekundärer Mutationen zu bestätigen.
Obwohl die Erfinder His und Biotin Tags in diesem Beispiel eines SNP Arrays verwendet haben, können andere Affinitäts Tags (z.B. FLAG, myc, VSV) verwendet werden, um eine Reinigung der klonierten Proteine zu ermöglichen. Es kann auch ein anderer Expressionswirt als E. coli verwendet werden (z.B. Hefe, Insektenzellen, Säugtierzellen), falls benötigt.
Obwohl dieses Array auf die natürlich vorkommenden Keimbahn SNPs von p53 ausrichtet ist, sind auch andere Ausführungsformen nicht notwendigerweise auf natürlich vorkommende SNPs ("synthetische" Mutanten) oder Versionen des Wildtyp Proteins beschränkt, die mehr als einen SNP enthalten. Andere Ausführungsformen können Versionen des Proteins enthalten, die von einem von beiden oder beiden Enden deletiert werden (eine verschachtelte Reihe). Solche Arrays wären im Kartieren von Protein:Ligand Interaktionen und Beschreiben funktioneller Domänen unbekannter Proteine nützlich.
E. coli exprimiertes p53 ist für eine DNA Bindung funktionell
Um eine Funktionalität unseres p53 zu zeigen, führten die Erfinder elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests unter Verwendung eines DNA Oligonukleotids durch, für das zuvor gezeigt wurde, dass es durch p53 gebunden wird. 2 zeigt ein Beispielergebnis von diesen Gel Verschiebungstests, die eine DNA Bindung sowohl durch Wildtyp p53 als auch die Mutanten R72P, P82L und R181C zeigen. Von den ersten 2 Mutanten würde noch erwartet werden, dass sie DNA binden, da diese Mutationen außerhalb der DNA Bindungsdomäne von p53 liegen. Während eine DNA Bindung unter Verwendung eines herkömmlichen Gel basierten Tests gezeigt worden ist, wollten die Erfinder anschließend dieselbe Funktion für p53 zeigen, das auf einer Oberfläche angeordnet war. 3C zeigt das Ergebnis einer Bindung von Cy3 markierter DNA an das p53 Mutantenfeld, das auf einer SAM2^TM Membran (Promega, Madison, Wisconsin, USA) angeordnet war. Obwohl die Erfinder in diesem Beispiel eines SNP Arrays eine SAM2^TM Membran verwendet haben, schließen andere Oberflächen, die zum Anordnen von Proteinen darauf verwendet werden können, Glas, Polypropylen, Polystyrol, Gold oder Silikon Objektträger, Polypropylen oder Polystyrol Platten mit mehreren Vertiefungen oder andere poröse Oberflächen, wie Nitrozellulose, PVDF und Nylon Membranen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die SAM2^TM Membran fängt spezifisch biotinylierte Moleküle ein und reinigt so die biotinylierten p53 Proteine von den Mutantenfeld Zelllysaten. Nach einem Waschen ungebundener DNA von dem Array wurde gebundene DNA unter Verwendung eines Affymetrix DNA Arrayscanners visualisiert. Wie aus 3 ersehen werden kann, binden dieselben Mutanten, die DNA im Gel Verschiebungstest banden, auch die meiste DNA, wenn sie auf einer Oberfläche angeordnet sind. In der Tat scheint der Mikroarraytest für einen DNA Bindungstest empfindlicher zu sein als der herkömmliche Gel Verschiebungstest. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass in einem Gel Verschiebungstest der DNA:Protein Komplex während einer Gel Elektrophorese gebunden bleiben muss, und schwache Komplexe können während dieses Schritts dissoziieren. Auch kann die 3-dimensionale Matrix der verwendeten SAM2^TM Membran eine Käfigwirkung aufweisen. Die Menge an p53 Protein ist auf jedem Spot gleichwertig, wie es durch einen identischen Mikroarray gezeigt ist, der auf His markiertes Protein mittels einer Sonde untersucht wurde (3B).
Verwendung des p53 Arrays für Phosphorylierungsuntersuchungen
Um die Untersuchung der Wirkung von SNPs auf eine posttranslationale Modifikationen exemplarisch darzustellen, wählten die Erfinder, eine Phosphorylierung des p53 Array durch Kaseinkinase II zu betrachten. Für dieses Enzym ist zuvor gezeigt worden, dass es p53 am Serin 392 phosphoryliert, und die Erfinder nutzten einen kommerziell verfügbaren anti-p53 Phosphoserin 392 spezifischen Antikörper, um diesen Vorgang zu untersuchen. 4 zeigt eine Western Blot Analyse von Kinasereaktionen auf lösliche Proteinpräparationen aus p53 Wildtyp und S392A Klonen. Die Spur 1 zeigt eine Phosphorylierung von Wildtyp p53 durch CKII mit einem Hintergrundsignal, wenn CKII von der Reaktion ausgeschlossen wird (Spur 2). Die Spuren 3 und 4 zeigen die entsprechenden Ergebnisse für S392A, die wie erwartet nur ein Hintergrundsignal für eine Phosphorylierung durch CKII zeigen. Dieser Test wurde anschließend in einem Mikroarray Format angewendet, das, wie aus 5 ersehen werden kann, eine Phosphorylierung für alle die Mutantenfelder mit Ausnahme der S392A Mutante und jener Mutanten zeigt, die vor dem Rest 392 verkürzt wurden.
Verwendung des p53 Arrays zur Untersuchung einer Protein:Protein Interaktion
Um die Untersuchung einer Protein:Protein Interaktion auf einem SNP Proteinarray exemplarisch darzustellen, wurde die Interaktion von MDM2 mit dem p53 Proteinarray untersucht. 6 zeigt, dass FLAG markiertes MDM2 Wildtyp p53 herunter zieht, wenn es an anti-FLAG Agarose gebunden ist. Jedoch wird die W23A Mutante durch FLAG Agarose gebundenes MDM2 nicht herunter gezogen, was erwartet werden würde, da für diesen Rest zuvor gezeigt worden ist, dass er für die p53/MDM2 Interaktion entscheidend ist (Bottger, A., Bottger, V., Garcia-Echeverria, C., et al., J. Mol. Biol. (1997) 269: 744–756). Dieser Test wurde anschließend in einem Mikroarray Format durchgeführt, und 7 zeigt das Ergebnis dieses Tests mit Cy3 markiertem Protein, das an allen Spots abgesehen von den W23A und W23G Mutantenspots nachgewiesen wurde.
Die Erfinder haben eine neue Proteinchip Technologie verwendet, um die Wirkung von 46 Keimbahn Mutationen auf eine humane p53 Proteinfunktion zu charakterisieren. Die angeordneten Proteine können sowohl durch einen His markierten Antikörper als auch einen p53 spezifischen Antikörper nachgewiesen werden. Dieses Array kann verwendet werden, um nach mutationsspezifischen Antikörpern zu screenen, die Implikationen für eine p53 Zustandsdiagnose aufweisen können.
Die Erfinder waren fähig, eine Funktionalität des Wildtyp Proteins durch herkömmliche Gel basierte Tests zu zeigen und haben ähnliche Ergebnisse beim Durchführen der Tests in einem Mikroarray Format erzielt. In der Tat scheint der Mikroarraytest für einen DNA Bindungstest empfindlicher zu sein als die herkömmlichen Gel Verschiebungstests. Diese Arrays können bei –20°C in 50 % Glycerol aufbewahrt werden, und es ist für sie gezeigt worden, dass sie für eine DNA Bindung nach einem Monat noch funktionell sind (Daten nicht gezeigt).
Die CKII Phosphorylierungstest Ergebnisse sind mit einer Phosphorylierung, die für alle Proteine nachgewiesen wird, die das Serin am Rest 392 enthielten, wie erwartet. Diese Analyse kann offensichtlich auf einen Screen nach Kinasen, die p53 phosphorylieren oder zum Beispiel auf Kinasen ausgeweitet werden, die einige Mutanten unterschiedlich phosphorylieren und andere nicht, die selbst potenzielle Ziele bei Krebs darstellen können.
Der MDM2 Interaktionstest zeigt wieder die Gültigkeit des Proteinarray Formats, mit Ergebnissen für einen Wildtyp und die p53 Mutanten, die jene widerspiegeln, die unter Verwendung eines herkömmlicheren Abzugtests (engl.: pull down assay) erhalten wurden. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass unsere Proteinarrays verwendet werden können, um Protein:Protein Interaktionen nachzuweisen. Potenziell können diese Arrays verwendet werden, um quantitative Bindungsdaten zu erhalten (d.h. K_D Werte) für Protein:Protein Interaktionen in einer Hochdurchsatz Weise, was unter Verwendung derzeitiger Methodik nicht möglich ist. Die Tatsache, dass das MDM2 Protein aus einem rohen E. coli Lysat auf das Array heraus gezogen wurde, verspricht Gutes für vorgesehene Proteinprofil erstellende Expe rimente, wobei zum Beispiel Zellextrakte aus unterschiedlichen Patienten präpariert, mit verschiedenen Fluorophoren markiert und beide bzw. jeweils mit demselben Array hybridisiert werden, um Unterschiede in den Mengen Protein interagierender Arten zu suchen.
In der Tat hat der Anmelder in Beispiel 2 unten weiter gezeigt, dass diese Arrays verwendet werden können, um quantitative Daten zu erhalten.
Beispiel 2 Quantitative DNA Bindung am p53 Protein Mikroarray
Methoden
DNA Bindungstests.
Oligonukleotide mit einer GADD45 Promotorelement Sequenz (5'-gta cag aac atg tct aag cat gct ggg gac-3' und 5'-gtc ccc agc atg ctt aga cat gtt ctg tac-3') wurden mit Gamma ³³P-ATP (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) und T4 Kinase (Invitrogen, Carlsbad, CA) radioaktiv markiert, in p53 Puffer reassoziiert und dann unter Verwendung einer Nukleotid Extraktionssäule (Qiagen, Valencia, CA) gereinigt. Die Duplex Oligonukleotide wurden durch UV Spektrophotometrie quantifiziert, und eine 2,5-fache Verdünnungsreihe wurde in p53 Puffer durchgeführt. 500 μl jeder Verdünnung wurden mit Mikroarrays bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert, anschließend dreimal für 5 min in p53 Puffer gewaschen, um ungebundene DNA zu entfernen. Die Mikroarrays wurden dann gegenüber einer Phosphorimager Platte (Fuji, Japan) über Nacht vor dem Scannen exponiert. Eine ImaGene Software (BioDiscovery, Marina del Rey, CA) wurde verwendet, um die gescannten Bilder zu quantifizieren. Replikationswerte für alle Mutanten wurden bei jeder DNA Konzentration an einfache hyperbole Konzentrationsantwortkurven R = B_max/((K_d/L)+1) angepasst, wobei R die Antwort in relativen Zahlen ist und L die DNA Konzentration in nM ist.
Ergebnisse
Bindung von p53 an GADD45 Promotorelement DNA.

Replikations p53 Mikroarrays wurden in der Anwesenheit von ³³P markierter Duplex DNA inkubiert, die der Sequenz des GADD45 Promotorelements bei variierenden Konzentrationen entspricht (8A). Die Mikroarrays wurden unter Verwendung eines Phosphorimagers Bild gebend dargestellt, und einzelne Spots wurden quantifiziert. Die Daten wurden gegen eine Kalibrierungskurve normalisiert, um die Nichtlinearität dieses Nachweisverfahrens zu kompensieren, und Hintergründe wurden abgezogen. Die Replikationswerte für alle Mutanten wurden graphisch aufgetragen und durch nicht lineare Regressionsanalyse analysiert, wodurch eine Berechnung sowohl der K_d als auch der B_max Werte ermöglicht wurde (Tabelle 1). Tabelle 1

Mutation	DNA Bindung B_max	(% Wildtyp)	K_d (nM)		MDM2	CKII
Wildtyp	100	(90-100)	7	(5–10)	+	+
W23A	131	(119–144)	7	(5–10)	–	+
W23G	84	(74–94)	5	(3–9)	–	+
R72P	121	(110–132)	9	(7–13)	+	+
P82L	70	(63–77)	7	(5–10)	+	+
M133T	KN				+	+
Q136X	keine Bindung				+	–
C141Y	KN				+	+
P151S	KN				+	+
P152L	31	(23–38)	18	(9–37)	+	+
G154V	KN				+	+
R175H	KN				+	+
E180K	31	(21–41)	12	(4–35)	+	+
R181C	88	(81–95)	11	(8–13)	+	+
R181H	48	(40–57)	11	(6–21)	+	+
H193R	21	(16–26)	22	(11–42)	+	+
R196X	keine Bindung				+	–
R209X	keine Bindung				+	–
R213X	keine Bindung				+	–
P219S	21	(14–30)	10	(3–33)	+	+
Y220C	KN				+	+
S227T	101	(94–110)	7	(5–9)	+	+
H233N	60	(52–68)	5	(3–8)	+	+
H233D	70	(58–84)	7	(3–14)	+	+
N235D	32	(25–40)	27	(15–49)	+	+
N235S	46	(36–56)	9	(4–20)	+	+
S241F	38	(30–47)	19	(10–37)	+	+
G245C	KN				+	+
G245S	44	(38–51)	11	(7–18)	+	+
G245D	KN				+	+
R248W	107	(95–120)	12	(8–17)	+	+
R248Q	85	(77–95)	17	(12–23)	+	+
I251M	KN				+	+
L252P	22	(12–32)	16	(4–63)	+	+
T256I	32	(22–41)	14	(6–34)	+	+
L257Q	26	(19–35)	17	(7–44)	+	+
E258K	KN				+	+
L265P	KN				+	+
V272L	KN				+	+
R273C	70	(56–85)	20	(11–37)	+	+
R273H	59	(40–79)	54	(27–106)	+	+
P278L	KN				+	+
R280K	54	(40–70)	21	(9–46)	+	+
E286A	32	(23–41)	22	(10–46)	+	+
R306X	keine Bindung				+	–
R306P	90	(81–100)	7	(5–11)	+	+
G325V	73	(67–79)	7	(5–10)	+	+
R337C	88	(80–95)	6	(4–8)	+	+
L344P	keine Bindung				+	–
S392A	121	(107–136)	10	(6–14)	+	–

8B zeigt eine DNA Bindung an Wildtyp p53 (hohe Affinität), R273H (geringe Affinität) und L344P (keine Bindung), was eine Wildtyp Affinität von 7 nM voraussagt.
Diskussion
DNA Bindung.
Eine quantitative Analyse der DNA Bindungsdaten, die aus den Mikroarrays erhalten wurden, ergeben sowohl Affinitäten (K_d) und relative maximale Bindungswerte (B_max) für Wildtyp und mutiertes p53. Proteinfunktionsmikroarrays sind zuvor in dieser Weise nicht verwendet worden, und deshalb zeigen diese Daten deren Nutzen im Erhalten dieser Qualität und Menge von Daten in einer parallelen Weise. Der Ansatz des Normalisierens von Bindungsdaten für die Menge von affinitätsmarkiertem Protein im Spot stellt ein schnelles Mittel zum Analysieren großer Datenreihen bereit [Zhu, H. et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science 293, 2101–2105 (2001).], jedoch berücksichtigt es weder die variierende spezifische Aktivität des mikroangeordneten Proteins, noch ob das Signal unter gesättigten oder untergesättigten Bedingungen aufgezeichnet wird. Die quantitative Analyse, die hier durchgeführt wurde, ermöglicht die funktionelle Klassifizierung von Mutanten in Gruppen gemäß GADD45 DNA Bindung: jene, die nahezu Wildtyp Affinität zeigen; jene, die verringerte Stabilität zeigen (geringer B_max); jene, die verringerte Affinität zeigen (hoher K_d); und jene, die einen vollständigen Verlust an Aktivität zeigen (Tabelle 1).
Proteine mit nahezu Wildtyp Affinität für DNA weisen im Allgemeinen Mutationen auf, die außerhalb der DNA Bindungsdomäne lokalisiert sind und R72P, P82L, R306P und G325V einschließen. R337C ist dafür bekannt, dass es den Oligomerisationszustand von p53 beeinflusst, aber bei der Testtemperatur, die hier verwendet wurde, wird angenommen, dass es größtenteils tetramer vorliegt [Davison, T.S., Yin, P., Nie, E., Kay, C. & Arrowsmith, C.H. Characterisation of the oligomerisation defects of two p53 mutants found in families with Li-Fraumeni und Li-Fraumeni like syndrome. Oncogene 17, 651–656 (1998).], was mit der hier gemessenen Affinität übereinstimmt. Im Gegensatz dazu wurde, wie erwartet, ein gesam ter Verlust der Bindung für Mutationen, die vorzeitige Stoppkodons einführten (Q136X, R196X, R209X und R213X), und Mutationen beobachtet, die das Protein monomerisieren (L344P [Lomax, M.E., Barnes, D.M., Hupp, T.R., Picksley, S.M. & Camplejohn, R.S. Characterisation of p53 oligomerisation domain mutations isolated from Li-Fraumeni and Li-Fraumeni like family members. Oncogene 17, 643–649 (1998).] und das R306X mit fehlerhafter Tetramerisierungsdomäne).
Innerhalb der DNA-Bindungsdomäne hat der Anmelder festgestellt, dass Mutationen im Allgemeinen DNA Bindung mit den bemerkenswerten Ausnahmen R181C/H, S227T und H233N/D verringerten oder aufhoben; dies sind alles Lösungsmittel exponierte Positionen, die von der Protein-DNA Grenzfläche entfernt sind und eine Wildtyp Bindung zeigen. Die Mutationen R248Q/W, R273C/H und R280K, die an der Protein-DNA Grenzfläche anwesend sind, zeigen eine geringe Affinitäten mit Kd Werten, die 2- – 7-mal höher sind als vom Wildtyp (Tabelle 1), was entweder mit dem Verlust spezifischer Protein-DNA Interaktionen oder einer sterischen Behinderung durch ein suboptimales Packen der mutierten Reste übereinstimmt.
Viele der restlichen Mutanten fallen in eine Gruppe, die beträchtlich reduzierte spezifische Aktivitäten zeigt, was aus den sehr geringen B_max Werten ersichtlich ist, selbst wenn sie gemäß der Menge an Protein normalisiert werden, die im relevanten Spot anwesend ist. Für einige Mutanten war die DNA Bindung bis zu solchen Niveaus beeinflusst, dass obwohl eine Bindung beobachtet wurde, sie aufgrund des geringen Signal-zu-Hintergrund Verhältnisses nicht genau zu quantifizieren war, z.B. P151S und G245C. Für andere, wie L252P, ergaben geringe Signalintensitäten messbare K_d Werte, aber mit breiten Konfidenzgrenzen.
Um die Anwendbarkeit der Erfindung auf Proteinarrays weiterhin zu zeigen, die mindestens zwei Proteinanteile umfassen, die von natürlich vorkommenden Varianten einer interessierenden DNA Sequenz abgeleitet sind, wie zum Beispiel jene, die Proteine von Phase 1 oder Phase 2 Arzneimittel metabolisierenden Enzymen (engl.: drug metabolising enzymes (DMEs)) kodieren, ist die Erfindung weiterhin unter Bezugnahme auf ein p450 Array exemplarisch dargestellt. Phase 1 DMEs schließen die Cytochrom p450 und die Flavin Monooxygenasen (FMOs), und die Phase 2 DMEs schließen UDP-Glycosyltransferase(n) (UGTs), Glutathion S Transferasen (GSTs), Sulfotransferasen (SULTs), N-Acetyltransferasen (NATs), Arzneimittel bindende Kernrezeptoren und Arzneimittel Transportproteine ein.
Vorzugsweise ist die volle Anzahl oder ein signifikanter Anteil humaner DMEs auf den Arrays der Erfindung anwesend. Ein solches Array kann einschließen (die Zahlen in Klammern sind derzeit in der Swiss Prot. Datenbank beschrieben): alle humanen P450 (119), FMOs (5), UDP-Glycosyltransferase(n) (UGTs) (18), GSTs (20), Sulfotransferasen (SULTs) (6), N-Acetyltransferasen (NATs) (2), Arzneimittel bindende Kernrezeptoren (33) und Arzneimittel Transportproteine (6). Diese Proteinliste schließt jene Proteine nicht ein, die vom humanen Genom Sequenzierungsprojekt noch charakterisiert werden müssen, Spleißvarianten, für die bekannt ist, dass sie für jene P450 vorkommen, die eine Substratspezifität einschalten können, oder Polymorphismen, die dafür bekannt sind, dass sie die Funktion und Substratspezifität sowohl der P450 als auch der Phase 2 DMEs beeinflussen.

Zum Beispiel ist es bekannt, dass es große Unterschiede in der Frequenz des Auftretens verschiedener Allele in P450 2C9, 2D6 und 3A4 zwischen verschiedenen ethnischen Gruppen gibt (siehe Tabellen 2, 3 und 4). Diese Allele haben das Potenzial Enzymkinetiken, Substratspezifität, Regioselektivität und, falls mehrere Produkte hergestellt werden, Produktprofile zu beeinflussen. Die Arrays von Proteinen, die in dieser Offenbarung beschrieben sind, ermöglichen eine detailliertere Untersuchung dieser Unterschiede für ein besonderes Arzneimittel und werden im Voraussagen potenzieller Aufgaben und auch im wirksamen Planen der Population nützlich sein, die für klinische Versuche verwendet wird. Tabelle 2: P450 2D6 Allelhäufigkeit

P450	Allel	Mutation	Allelhäufigkeit	Ethnische Gruppe	Untersuchungsgruppe	Referenz
2D6	*1	WT	26,9 % 36,4 % 36 % 33 %	Chinese Deutscher Kaukasier Europäer	113 589 195 1344	(1) (2) (3) (4)
2D6	*2	R296C; S486T	13,4 % 32,4 % 29 % 27,1 %	Chinese Deutscher Kaukasier Europäer	113 589 195 1344	(1) (2) (3) (4)
2D6	*3	Leserasterverschiebung	2 % 1 % 1,9 %	Deutscher Kaukasier Europäer	589 195 1344	(2) (3) (4)
2D6	*4	Spleißfehler	20,7 % 20 % 16,6 % 1,2 %	Deutscher Kaukasier Europäer Äthiopier	589 195 1344 115	(2) (3) (4) (5)
2D6	*5	Deletion	4% 6,9 %	Kaukasier Europäer	195 1344	(3) (4)
2D6	*6	Spleißfehler	0,93 % 1,3 %	Deutscher Kaukasier	589 195	(2) (3)
2D6	*7	H324P	0,08 % 0,3 % 0,1 %	Deutscher Kaukasier Europäer	589 195 1344	(2) (3) (4)
2D6	*9	K281del	2 % 2,7 %	Kaukasier Europäer	195 1344	(3) (4)
2D6	*10	P34S; S486T	50,7 % 1,53 % 2 % 1,5 % 8,6 %	Chinese Deutscher Kaukasier Europäer Äthiopier	113 589 195 1344 115	(1) (2) (3) (4) (5)
2D6	*12	G42R; R296C; S486T	0 % 0,1 %	Deutscher Europäer	589 1344	(2) (4)
2D6	*14	P34S; G169R; R296C; S486T	0,1 %	Europäer	1344	(4)
2D6	*17	T1071; R296C; S486T	0 % 0,1 % 9% 34 %	Kaukasier Europäer Äthiopier Afrikaner	195 1344 115 388	(3) (4) (5) (6)

Alle anderen alleischen P450 Varianten treten mit einer Frequenz von 0,1 % oder weniger auf (4). Tabelle 3: P450 2C9 Allelhäufigkeit

P450	Allel	Mutation	Allelhäufigkeit	Ethnische Gruppe	Untersuchungsgruppe	Referenz
2C9	*1	WT	62 %	Kaukasier	52	(7)
2C9	*2	R144C	17 %	Kaukasier	52	(7)
2C9	*3	1359L	19 %	Kaukasier	52	(7)
2C9	*4	1359T	x %	Japaner	X	(8)
	*5	D360E	0 % 3 %	Kaukasier Afro-Amerikaner	140 120	(9) (9)
2C9	*7	Y358C	x %		X	Swiss Prot.

Tabelle 4: P450 3A4 Allelhäufigkeit


P450	Allel	Mutation	Allelhäufigkeit	Ethnische Gruppe	Untersuchungsgruppe	Referenz
3A4	*1	WT	>80%		X
3A4	*2	S222P	2,7 % 0% 0%	Kaukasier Afrikaner Chinese	X X X	(10) (10) (10)
3A4	*3	M445T	1 % 0,47 % 4 %	Chinese Europäer Kaukasier	X 213 72	(10) (11) (12)
3A4	*4	I118V	2,9 %	Chinese	102	(13)
3A4	*5	P218R	2 %	Chinese	102	(13)
3A4	*7	G56D	1,4 %	Europäer	213	(11)
3A4	*8	R130Q	0,33 %	Europäer	213	(11)
3A4	*9	V1701	0,24 %	Europäer	213	(11)
3A4	*10	D174H	0,24 %	Europäer	213	(11)
3A4	*11	T363M	0,34 %	Europäer	213	(11)
3A4	*12	L373F	0,34 %	Europäer	213	(11)
3A4	*13	P416L	0,34 %	Europäer	213	(11)
3A4	*15	R162Q	4 %	Afrikaner	72	(12)
3A4	*17	F189S	2 %	Kaukasier	72	(12)
3A4	*18	L293P	2 %	Asiat	72	(12)
3A4	*19	P467S	2 %	Asiat	72	(12)

Referenzen

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Beispiel 3: Klonieren von Wildtyp H. sapiens Cytochrom P450 Enzymen CYP2C9, CYP2D6 und CYP3A4

Die humanen Cytochrom p450 haben einen konservierten Bereich am N-Terminus, dieser schließt einen hydrophoben Bereich, der eine Lipidassoziation erleichtert, einen Säure- oder "Stoppübertragungs"-Bereich, der das Protein davon abhält, weiter in die Membran befördert zu werden, und eine teilweise konservierte Prolin Wiederholung ein. Drei Versionen der p450 wurden mit Deletionen bis zu diesen Domänen erzeugt, die N-terminalen Deletionen sind unten gezeigt.

Konstrukt	Version	N-terminale Deletion
T009-02 3A4	Prolin	-34 AA
T009-01 3A4	Stoppübertragung	-25 AA
T009-03 3A4	Hydrophobes Peptid	-13 AA
T015-02 2C9	Prolin	-28 AA
T015-C1 2C9	Stoppübertragung	-20 AA
T015-03 2C9	Hydrophobes Peptid	-0 AA
T017-C1 2D6	Prolin	-29 AA
T017-02 2D6	Stoppübertragung	-18 AA
T017-C3 2D6	Hydrophobes Peptid	-0 AA

Das humane CYP2D6 wurde durch PCR aus einem Pool von Gehirn, Herz und Leber cDNA Bibliotheken (Clontech) unter Verwendung spezifischer Vorwärts- und Rückwärtsprimer (T017F und T017R) amplifiziert. Die PCR Produkte wurden in den pMD004 Expressionsvektor innerhalb des Leserasters mit dem N-terminalen His-BCCP Tag und unter Verwendung der Not1 Restriktionsstelle kloniert, die im Rückwärtsprimer anwesend ist. Um das CYP2D6 zur Expression im C-terminalen Tag Vektor pBJW102.2 (9A & B) umzuwandeln, wurden Primer verwendet, die eine Sfi1 Klonierungsstelle am 5' Ende einbauten und das Stoppkodon am 3' Ende entfernten, um eine Fusion innerhalb des Leserasters mit dem C-terminalen Tag zu ermöglichen. Die Primer T017CR zusammen mit entweder T017CF1, T017CF2 oder T017CF3 ermöglichten jeweils die Deletion von 29, 18 bzw. 0 Aminosäuren vom N-Terminus von CYP2D6.
Die Primersequenzen sind wie folgt:
Eine PCR wurde in einem 50 μl Volumen durchgeführt, das 0,5 μM jedes Primers, 125–250 μM dNTPs, 5 ng Matrizen DNA, 1 × Reaktionspuffer, 1–5 Einheiten Polymerase (Pfu, Pwo oder "Expand Jong template" Polymerasemischung) enthält, wobei ein PCR Zyklus = 95°C 5 Minuten, 95°C 30 Sekunden, 50–70°C 30 Sekunden, 72°C 4 Minuten X 35 Zyklen, 72°C 10 Minuten oder im Fall von Expand 68°C für den Verlängerungsschritt verwendet wurde. Die PCR Produkte wurden durch eine Agarosegel Elektrophorese aufgelöst, jene Produkte der richtigen Größe wurden aus dem Gel ausgeschnitten und anschließend unter Verwendung eines Gel Extraktionskits gereinigt. Die gereinigte PCR Produkte wurden dann entweder mit Sfi1 oder Not1 gespalten und in das präparierte Vektorrückgrat ligiert (9C). Richtige rekombinante Klone wurden durch PCR Screenen von bakteriellen Kulturen, Western Blot und durch DNA Sequenzanalyse bestimmt.
CYP3A4 und CYP2C9 wurden aus cDNA Bibliotheken durch eine Methodik kloniert, die der des CYP2D6 ähnelt. Primersequenzen zum Amplifizieren von CYP3A4 und CYP2C9 zum Klonieren in die N-terminalen Vektoren sind wie folgt:
Primer zum Umwandeln der N-terminalen Klone zur Expression in den C-terminalen Markierungsvektoren sind wie folgt:
Die Gesamtlängen oder hydrophobe Peptid (C3) Version von 2C9 wurde durch eine inverse PCR unter Verwendung des 209-Stoppübertragungsklons (C1) als Matrize und der folgenden Primer hergestellt:
Beispiel 4: Klonieren von NADPH Cytochrom P450 Reduktase
NADPH Cytochrom P450 Reduktase wurde aus fötaler Leber cDNA (Clontech), den PCR Primern [NADPH Reduktase F1 5'-GGATCGACATATGGGAGACTCCCACGTGGACA-3'; NADPH Reduktase R1 5'-CCGATAAGCTTATCAGCTCCACACGTCCAGGGAG-3'], die eine Nde I Stelle am 5' und eine Hind III Stelle am 3' des Gens einbauten, um ein Klonieren zu ermöglichen. Das PCR Produkt wurde in den pJW45 Expressionsvektor (10A & B) kloniert, zwei Stoppkodons wurden in den umgekehrten Primer eingeschlossen, um sicherzustellen, dass das His Tag nicht translatiert wurde. Die richtigen rekombinanten Klone wurden durch PCR Screenen bakterieller Kulturen und durch Sequenzieren bestimmt.
Beispiel 5: Klonieren polymorpher Varianten von H. sapiens Cytochrom P450 CYP2C9, CYP2D6 und CYP3A4

Sobald die richtigen Wildtyp CYP450 (11, 12 & 13) kloniert und durch Sequenzanalyse verifiziert waren, wurden die natürlich vorkommenden Polymorphismen von 2C9, 2D6 und 3A4, die in Tabelle 5 gezeigt sind, durch einen inversen PCR Ansatz erzeugt (mit Ausnahme von CYP2D6*10, das als ein lineares PCR Produkt in derselben Weise wie das anfängliche Klonieren von CYP2D6 amplifiziert und kloniert wurde, das in Beispiel 3 beschrieben ist). In jedem Fall enthielt der vorwärts inverse PCR Primer eine 1 bp Fehlpaarung an der 5' Position, um das Wildtyp Nukleotid durch das polymorphe Nukleotid zu substituieren, wie es in den verschiedenen ethnischen Populationen beobachtet wird.

Cytochrom P450 Polymorphismus	Kodierte Aminosäuresubstitutionen
CYP2C9*1	Wildtyp
CYP2C9*2	R144C
CYP2C9*3	1359L
CYP2C9*4	1359T
CYP2C9*5	D360E
CYP2C9*7	Y358C

CYP2D6*1	Wildtyp
CYP2D6*2	R296C, S486T
CYP2D6*9	K281del
CYP2D6*10	P34S, S486T
CYP2D6*17	T107I, R296C, S486T

CYP3A4*1	Wildtyp
CYP3A4*2	S222P
CYP3A4*3	M445T
CYP3A4*4	I118V
CYP3A4*5	P218R
CYP3A4*15	R162Q

Tabelle 5: Klonierte polymorphe Formen von P450 2C9, 2D6 und 3A4

Die folgenden PCR Primer wurden verwendet:
Beispiel 6: Expression und Reinigung von P450 3A4
E. coli XL-10 Gold (Stratagene) wurde als ein Wirt für Expressionskulturen von P450 3A4 verwendet. Startkulturen wurden über Nacht in LB Medium angezogen, das mit 100 mg pro Liter Ampicillin ergänzt war. 0,5 Liter Terrific Broth Medium plus 100 mg pro Liter Ampicillin und 1 mM Thiamin und Spurenelemente wurden mit einer 1/1000 Verdünnung der Übernacht Starterkulturen beimpft. Die Flaschen wurden bei 37°C geschüttelt bis die Zelldichte OD₆₀₀ 0,4 betrug, anschließend wurde δ-Aminolevullinsäure (ALA) bei 0,5 mM für 20 min bei 30°C zu den Zellen zugegeben. Die Zellen wurden mit 50 μM Biotin ergänzt, anschließend mit einer optimalen Konzentration von IPTG (30–100 μM) induziert, anschließend über Nacht bei 30°C geschüttelt.
Die E. coli Zellen aus den 0,5 Liter Kulturen wurden in 50 ml Aliquote aufgeteilt, die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert, und die Zellpellets wurden bei –20°C gelagert. Die Zellen von jedem Pellet wurden durch Resuspendieren in 5 ml Puffer A (100 mM Tris Puffer, pH 8,0, der 100 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10 × Stammlösung eines Protease Inhibitorcocktails-Roche 1836170, 0,2 mg/ml Lysozym enthielt) lysiert. Nach 15 Minuten Inkubation auf Eis wurden 40 ml eiskaltes, deionisiertes Wasser zu jedem resuspendierten Zellpellet zugegeben und gemischt. 20 mM Magnesiumchlorid und 5 μg/ml DNasel wurden zugegeben. Die Zellen wurden für 30 min auf Eis mit leichtem Schütteln inkubiert, danach wurden die lysierten E. coli Zellen durch Zentrifugation für 30 min bei 4000 rpm pelletiert. Die Zellpellets wurden durch Resuspendieren in 10 ml Puffer B (100 mM Tris Puffer, pH 8,0, der 10 mM β-Mercaptoethanol und eine 10 × Stocklösung eines Protease Inhibitorcocktails-Roche 1836170 enthielt) gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 4000 rpm. Membran assoziiertes Protein wurde dann durch die Zugabe von 2 ml Puffer C (50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 10 × Stammlösung eines Protease Inhibitorcocktails-Roche 1836170, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,5 M NaCl und 0,3 % (v/v) Igepal CA-630) gelöst und auf Eis mit einer leichten Bewegung für 30 Minuten vor einer Zentrifugation bei 10.000 g für 15 min bei 4°C inkubiert, und der Überstand (14) wurde dann auf Talon Harz (Clontech) aufgetragen.
Eine 0,5 ml Säule aus Ni-NTA Agarose (Qiagen) wurde in Einweg Schwerkraftsäulen gegossen und mit 5 Säulenvolumina Puffer C äquilibriert. Der Überstand wurde auf die Säule aufgetragen, danach wurde die Säule nacheinander mit 4 Säulenvolumina Puffer C, 4 Säulenvolumina Puffer D (50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 10 × Stocklösung eines Protease Inhibitorcocktails-Roche 1836170, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,5 M NaCl und 20 % (v/v) Glycerol) und 4 Säulenvolumina Puffer D + 50 mM Imidazol vor einer Elution in 4 Säulenvolumina des Puffers D + 200 mM Imidazol gewaschen (15). 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt, und Protein enthaltende Fraktionen wurden zusammengefasst, aliquotiert und bei –80°C gelagert.
Beispiel 7: Bestimmung des Häm Einbaus in P450
Gereinigte P450 wurden auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml in 20 mM Kaliumphosphat (pH 7,4) in der Anwesenheit und Abwesenheit von 10 mM KCN verdünnt, und eine Absorptionsabtastung wurde für 600–260 nm gemessen. Der Prozentsatz von gebundenem Häm wurde basierend auf einem Extinktionskoeffizienten ε₄₂₀ von 100 mM^–1 cm^–1 gemessen.
Beispiel 8: Rekonstitution und Test von Cytochrom P450 Enyzmen in Liposomen mit NADPH Cytochrom P450 Reduktase
Liposomen werden durch Auflösen einer 1:1:1 Mischung aus 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholin, 1,2-Dileoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoserin in Chloroform, Verdampfen bis zur Trockenheit und anschließend Resuspendieren in 20 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, bei 10 mg/ml präpariert. 4 μg Liposomen wurden zu einer Mischung aus gereinigtem P450 2D6 (20 pmol), NADPH P450 Reduktase (40 pmol), Cytochrom b5 (20 pmol) in ein Gesamtvolumen von 10 μl zugegeben und für 10 Minuten bei 37°C vorinkubiert.
Nach einer Rekonstitution von Cytochrom P450 Enzymen in Liposomen werden die Liposomen auf 100 μl in einem Testpuffer, der HEPES/KOH (pH 7,4, 50 mM), NADP+ (2,6 mM), Glucose-6-Phosphat (6,6 mM), MgCl₂ (6,6 mM) und Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase (0,4 Einheiten/ml) enthält, in einer schwarzen Platte mit 96 Vertiefungen verdünnt. Der Testpuffer enthält auch ein geeignetes fluorogenes Substrat für die Cytochrom P450 Isoform, die getestet werden soll: Für P450 2D6 kann AMMC, für P450 3A4 können Dibenzylfluoreszein (DBF) oder Resorufinbenzylether (BzRes) und für 2C9 kann Dibenzylfluoreszein (DBF) verwendet werden. Diese Reaktionen werden durch die Zugabe von "Stopplösung" (80 % Acetonitril, das mit Tris gepuffert ist) angehalten, und die Produkte werden unter Verwendung geeigneter Wellenlängen Filterreihen in einem Fluoreszenzplatten Lesegerät gelesen (16).
Die P450 können auch durch zum Beispiel die Zugabe von 200 μM Cumol Wasserstoffperoxid anstelle sowohl der Coenyzme als auch der Regenerationslösung chemisch aktiviert werden (17).
Zusätzlich können fluoreszent gemessene Umsetzungsraten in der Anwesenheit von Inhibitoren gemessen werden.
Beispiel 9: Nachweis von Arzneimittelbindung an immobilisierte P450 CYP3A4
Gereinigtes CYP3A4 (10 μg/ml in 50 mM HEPES/0,01 % CHAPS, pH 7,4) wurde in Streptavidin immobilisierte Platten (Exiqon) (100 μg pro Vertiefung) eingebracht und auf Eis für 1 Stunde geschüttelt. Die Vertiefungen wurden aspiriert und zweimal mit 50 mM HEPES/0,01 % CHAPS gewaschen. Die [³H]-Ketoconazol Bindung an immobilisiertes Protein wurde direkt durch Szintillationszählen bestimmt. Sättigungsexperimente wurden unter Verwendung von [³H]-Ketoconazol (5 Ci/mmol, American Radiochemicals Inc., St. Louis) in 50 mM HEPES, pH 7,4, 0,01 % CHAPS und 10 % Superblock (Pierce) durchgeführt (18). Sechs Konzentrationen eines Liganden wurden im Bindungstest (25–1000 nM) in einem Endtestvolumen von 100 μl verwendet. Eine spezifische Bindung wurde als jene definiert, die durch 100 μM Ketoconazol ersetzt wurde. Jede Messung wurde zweifach durchgeführt. Nach einer Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Inhalte der Vertiefungen aspiriert, und die Vertiefungen wurden dreimal mit 150 μl eiskaltem Testpuffer gewaschen. 100 μl MicroScint 20 (Packard) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden in einem Packard TopCount Mikroplatten Szintillationszähler gezählt (18).
Beispiel 10: Chemische Aktivierung von markiertem, immobilisiertem CYP3A4
CYP3A4 wurde in Streptavidin Immobilisierungsplatten, wie in Beispiel 9 beschrieben, immobilisiert und wurden dann mit Dibenzylfluoreszein und variierenden Konzentrationen (0–300 μM) Cumol Wasserstoffperoxid inkubiert. Die Endpunkt tests zeigten, dass das markierte, immobilisierte CYP3A4 in einem Umsetzungstest mit chemischer Aktivierung funktionell war (19).
Beispiel 11: Immobilisierung von P450 durch Gel Verkapselung von Liposomen oder Mikrosomen
Nach Rekonstitution von Cytochrom P450 Enzymen zusammen mit NADPH Cytochrom P450 Reduktase in Liposomen oder Mikrosomen können diese anschließend auf einer Oberfläche durch Verkapselung innerhalb einer Gelmatrix, wie Agarose, Polyurethan oder Polyacrylamid, immobilisiert werden.
Zum Beispiel wurde Agarose mit einer geringen Schmelztemperatur (engl.: low melting temperature (LMT)) (1 % w/v) in 200 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, gelöst. Diese wurde dann auf 37°C auf einem Heizblock gekühlt. Mikrosomen, die Cytochrom P450 3A4, Cytochrom b5 und NADPH Cytochrom P450 Reduktase enthielten, wurden dann in der LMT Agarose verdünnt, so dass 50 μl Agarose 20, 40 bzw. 20 pmol jeweils P450 3A4, NADPH Cytochrom P450 Reduktase bzw. Cytochrom b5 enthielten. 50 μl Agarosemikrosomen wurden dann zu jeder Vertiefung einer schwarzen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben und verfestigte sich bei Raumtemperatur.
Zu jeder Vertiefung wurden 100 μl Testpuffer zugegeben, und der Test wurde, wie zuvor (zum Beispiel für Beispiel 8) für einen herkömmlichen Rekonstitutionstest beschrieben, durchgeführt. Aus den erzeugten Daten wurde ein Vergleich der grundlegenden Kinetiken einer BzRes Oxidation und Ketoconazol Hemmung durchgeführt (Tabelle 6), der zeigte, dass die Aktivität des CYP3A4 nach einer Gelverkapselung erhalten blieb.

Verkapseltes Gel Löslicher Stoff

BzRes Oxidation K_M (μM) V_max (% des löslichen Stoffs) 49 (18) 50 (6) 20 (5) 100 (6)

Ketoconazol Hemmung IC₅₀ (nM) 86 (12) 207 (54)

Tabelle 6: Vergleich kinetischer Parameter für eine BezRes Oxidation und Hemmung durch Ketoconazol für Cytochrom P450 3A4 Mikrosomen in Lösung und in Agarose verkapselt.
Für eine Beurteilung von K_M und V_max für BzRes wurden Tests in der Anwesenheit variierender Konzentrationen von BzRes bis zu 320 μM durchgeführt. Eine Ketoconazol Hemmung wurde bei 50 μM BzRes mit 7 dreifachen Verdünnungen von Ketoconazol aus 5 μM durchgeführt. Die Werte in Klammern geben die Standardfehler an, die vom Kurvenanpassen abgeleitet sind.
Die Aktivität von immobilisierten P450 wurde über einen Zeitraum von 7 Tagen beurteilt (20). Aliquote derselben Proteinpräparation, die unter denselben Bedingungen aufbewahrt wurden, mit der Ausnahme, dass sie nicht Gel verkapselt waren, wurden auch über denselben Zeitraum getestet, was zeigte, dass die Gel Verkapselung der P450 Aktivität eine signifikante Stabilität verleiht.
Beispiel 12: Quantitative Bestimmung des Einflusses von 3A4 Polymorphismen auf die Aktivität
Gereinigte Cytochrom P450 3A4 Isoformen *1, *2, *3, *4, *5 & *15 (ungef. 1 μg) wurden in der Anwesenheit von BzRes und Cumol Wasserstoffperoxid (200 μM) in der Abwesenheit und Anwesenheit von Ketoconazol bei Raumtemperatur in 200 mM KPO₄ Puffer, pH 7,4, in einem Gesamtvolumen von 100 μl in einer schwarzen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen inkubiert. Ein Minimum von Duplikaten wurde für jede Konzentration von BzRes oder Ketoconazol durchgeführt.
Eine Resorufin Bildung wurde über die Zeit durch die Zunahme an Fluoreszenz gemessen (520 nm und 580 nm Anregungs- bzw. Emissionsfilter), und anfängliche Raten wurden aus dem Verlauf der Kurven berechnet (21).
Zum Beurteilen von K_M ^app und V_max ^app für BzRes wurden Hintergrundraten zuerst von den anfänglichen Raten subtrahiert und anschließend gegen eine BzRes Konzentration graphisch aufgetragen, und Kurven wurden angepasst, die herkömmliche Michaelis-Menton Kinetiken beschreiben: V = Vmax/(1 + (KM/S))wobei V und S die anfängliche Rate bzw. Substratkonzentration sind. V_max Werte wurden anschließend für eine Cytochrom P450 Konzentration normalisiert und auf das Wildtyp Enzym skaliert (Tabelle 7).

Zum Beurteilen der IC₅₀ für Ketoconazol wurden Hintergrundraten zuerst von den anfänglichen Raten subtrahiert, die dann in % der ungehemmten Rate umgewandelt und gegen eine Ketoconazol Konzentration graphisch aufgetragen wurden (22). IC₅₀ Hemmkurven wurden unter Verwendung der Gleichung: V = 100/(1 + (I/IC50))angepasst, wobei V und I die anfängliche Rate bzw. Inhibitorkonzentration sind. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 7 gezeigt:

	V_max BzRes	K_M BzRes (μM)	IC₅₀ Ketoconazol (μM)
3A4*WT	100 (34)	104 (25)	0,91 (0,45)
3A4*2	65 (9)	62 (4)	0,44 (0,11)
3A4*3	93 (24)	54 (13)	1,13 (0,16)
3A4*4	69 (22)	111 (18)	0,88 (0,22)
3A4*5	59 (16)	101 (11)	1,96 (0,96)
3A4*15	111 (23)	89 (11)	0,59 (0,20)

Tabelle 7: Kinetische Parameter für eine BzRes Umsetzung und seine Hemmung durch Ketoconazol für Cytochrom P450 3A4 Isoformen.

Die Parameter wurden aus den Anpassungen von Michaelis-Menton und den IC₅₀ Inhibitionskurven zu den Daten in den 21 & 22 erhalten. Die Werte in Klammern sind die Standardfehler, die aus den Kurvenanpassungen erhalten wurden.
Beispiel 13: Array basierter Test immobilisierter CYP3A4 Polymorphismen
Cytochrom P450 Polymorphismen können parallel unter Verwendung eines Array Formats getestet werden, um feine Unterschiede in der Aktivität mit spezifischen kleinen Molekülen zu identifizieren. Zum Beispiel können gereinigte Cytochrom P450 3A4 Isoformen *1, *2, *3, *4, *5 & *15 einzeln in Liposomen mit NADPH Cytochrom P450 Reduktase, wie in Beispiel 11 beschrieben, wieder hergestellt werden. Die sich ergebene Liposomenpräparation kann in LMP Agarose verdünnt werden und in einzelnen Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, wie in Beispiel 11 beschrieben, immobilisiert werden. Die immobilisierten Proteine können dann, wie in Beispiel 11 beschrieben, durch Zugeben von 100 μl Testpuffer, der BzRes +/– Ketoconazol enthält, zu jeder Vertiefung getestet werden.
Eine chemische Aktivierung (wie in Beispiel 12 beschrieben) kann auch in einem Array Format verwendet werden. Zum Beispiel können gereinigte Cytochrom P450 3A4 Isoformen *1, *2, *3, *4, *5 & *15 einzeln in Liposomen ohne NADPH Cytoch rom P450 Reduktase wieder hergestellt werden, und die sich ergebenden Liposomen können über eine Verkapselung in Agarose immobilisiert werden, wie in Beispiel 11 beschrieben. Die Cytochrom P450 Aktivität in jeder Vertiefung kann anschließend, wie in Beispiel 12 beschrieben, durch 100 μl 200 mM KPO₄ Puffer, pH 7,4, gemessen werden, der BzRes und Cumol Wasserstoffperoxid (200 μM), +/– Ketoconazol in jeder Vertiefung enthält.
Zusammenfassend haben die Erfinder eine neue Proteinarray Technologie für enorm paralleles, Hochdurchsatz Screenen von SNPs nach der biochemischen Aktivität der kodierten Proteine entwickelt. Seine Anwendbarkeit wurde sowohl durch die Analyse verschiedener Funktionen von Wildtyp p53 und 46 SNP Versionen von p53 als auch mit allelischen Varianten von P450 gezeigt. Dieselbe Oberfläche und dieselben Testnachweismethodiken können nun auf andere verschiedenartigere Arrays angewendet werden, die derzeit entwickelt werden. Aufgrund der geringen Größe der Auswahl an Proteinen, die hier untersucht wurden, war die Spotdichte unseres Arrays relativ gering, und jedes Protein wurde vierfach gespottet. Unter Verwendung derzeitiger automatischer Spot Fertigkeiten ist es möglich, die Spotdichte zu erhöhen, um über 10.000 Proteine pro Array einzuschließen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Proteinarray umfassend eine Oberfläche, auf der mindestens zwei Proteinanteile in einem räumlich definierten Muster abgelegt sind; dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinanteile die Expressionsprodukte natürlich vorkommender Varianten oder alternativ gespleißter natürlich vorkommender Transkripte einer interessierenden DNA Sequenz sind.
Proteinarray wie beansprucht in Anspruch 1, wobei die Varianten auf demselben chromosomalen Ort liegen.
Proteinarray wie beansprucht in Anspruch 1 oder 2, wobei die mindestens zwei Proteinanteile die Expressionsprodukte synthetischer Äquivalente natürlich vorkommender Varianten oder alternativ gespleißter Transkripte einer interessierenden DNA Sequenz sind.
Proteinarray wie beansprucht in Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die mindestens zwei Proteinanteile einen Proteinanteil umfassen, der durch ein interessierendes Wildtyp Gen exprimiert wird, mit mindestens einem Proteinanteil, der durch ein oder mehrere Gene exprimiert wird, die ein oder mehrere natürlich vorkommende Mutationen davon enthalten.
Proteinarray wie beansprucht in Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Proteinanteile einen Proteinanteil umfassen, der durch ein interessierendes Wildtyp Gen exprimiert wird, mit einer Vielzahl von Proteinanteilen, die durch eine Vielzahl von Genen exprimiert werden, die ein oder mehrere natürlich vorkommende Mutationen davon enthalten.
Proteinarray wie beansprucht in Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei die Mutationen aus einer mis-Sense Mutation, einem Einzelnukleotid Poly morphismus, einer Deletonsmutation und einer Insertionsmutation ausgewählt sind.
Proteinarray wie beansprucht in einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Proteinanteile, die von der Expression von mehr als einer Varianten DNA Sequenz abgeleitet sind, an einer einzelnen Position des Musters angeheftet sind.
Proteinarray wie beansprucht in Anspruch 7, wobei Mischungen von zwischen 2 und 100 verschiedenen Proteinanteilen an jeder Position des Musters anwesend sind.
Proteinarray wie beansprucht in Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei jede Position des Musters eine Probe von zwei verschiedenen Varianten oder Haplotyp Proteinen enthält.
Proteinarray wie beansprucht in einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Array Proteinanteile trägt, welche die Expressionsprodukte von zugehörigen DNA Molekülen sind, die zu Produkten führen, die verschiedene prätranslationale oder posttranslationale Verarbeitung durchlaufen.
Proteinarray wie beansprucht in Anspruch 10, wobei die Proteinanteile von einem eukaryotischen Wirt exprimiert werden.
Proteinarray wie beansprucht in einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Proteinanteile Proteine umfassen, die mit einem Krankheitszustand, Arzneimittel Metabolismus assoziiert sind oder solche, die nicht gekennzeichnet sind.
Proteinarray wie beansprucht in einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Proteinanteile Wildtyp p53 und allelische Varianten oder alternativ gespleißte Transkripte davon kodieren.
Proteinarray wie beansprucht in einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Proteinanteile ein Arzneimittel metabolisierendes Enzym kodieren.
Proteinarray wie beansprucht in Anspruch 14, wobei das Arzneimittel metabolisierende Enzym Wildtyp p450 und allelische Varianten oder alternativ gespleißte Transkripte ist.
Proteinarray wie beansprucht in einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die mindestens zwei Proteinanteile entweder am N- oder C-Terminus mit einem Markierungsanteil markiert sind, um Anheftung an den Array zu fördern.
Proteinarray wie beansprucht in einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Array eine Oberflächenbeschichtung umfasst, die fähig ist, nicht spezifische Proteinabsorption abzuwehren.
Verfahren zum Herstellen eines Proteinarrays, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen DNA kodierender Sequenzen, die jene von zwei oder mehreren natürlich vorkommenden Varianten oder alternativ gespleißten Transkripten einer interessierenden DNA Sequenz sind; (b) Exprimieren der kodierenden Sequenzen, um ein oder mehrere einzelne Proteinanteile bereitzustellen; und (c) Ablegen der Proteinanteile in einem räumlich definierten Muster auf einer Oberfläche, um ein Array zu ergeben.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 18, wobei die Proteinanteile gleichzeitig aufgereinigt werden und auf dem Array in einem einzigen Schritt über eine eingebaute Markierung isoliert werden.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 18, wobei die interessierende DNA Sequenz ein Protein kodiert, das mit einem Krankheitszustand, Arzneimittel Metabolismus assoziiert ist oder nicht gekennzeichnet ist.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 20, wobei die interessierende DNA Sequenz p53 kodiert.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 20, wobei die interessierende DNA Sequenz ein Arzneimittel metabolisierendes Enzym kodiert.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 22, wobei das Arzneimittel metabolisierende Enzym Wildtyp p450 und allelische Varianten oder alternativ gespleißte Transkripte davon ist.
Proteinarray wie beansprucht in einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der Proteinarray gemäß des Verfahrens von einem der Ansprüche 18 bis 23 erhältlich ist.
Verwendung eines Arrays wie beansprucht in einem der Ansprüche 1 bis 17 oder Anspruch 24 in der Bestimmung des Phänotyps einer natürlich vorkommenden Variante oder eines alternativ gespleißten Transkripts einer interessierenden DNA Sequenz, wobei die DNA Sequenz durch mindestens einen Proteinanteil, der davon abgeleitet ist, repräsentiert wird und auf dem Array anwesend ist.
Verfahren zum Screenen einer Reihe von Proteinanteilen nach Molekülen, die mit einem oder mehreren Proteinen interagieren, umfassend die Schritte: (a) In Kontaktbringen eines oder mehrerer Testmoleküle mit einem Array wie beansprucht in einem der Ansprüche 1 bis 17 oder Anspruch 24; wobei der Array die Reihe von Proteinanteile trägt; und (b) Nachweisen einer Interaktion zwischen einem oder mehreren Testmolekülen und einem oder mehreren Proteinen auf dem Array.
Verfahren zum gleichzeitigen Bestimmen der relativen Eigenschaften von Mitgliedern einer Reihe von Proteinanteilen, umfassend die Schritte: (a) In Kontaktbringen eines Arrays wie beansprucht in einem der Ansprüche 1 bis 17 oder Anspruch 24, wobei der Array die Reihe von Proteinanteile trägt, mit einem oder mehreren Testsubstanzen, und (b) Beobachten der Interaktion der Testsubstanzen mit der Reihe von Mitgliedern auf dem Array.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei ein oder mehrere der Proteinanteile Arzneimittel metabolisierende Enzyme sind und wobei die Enzyme durch Kontakt mit einem akzessorischen Protein oder durch chemische Behandlung aktiviert werden.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 27, wobei das Verfahren quantitative Ergebnisse bereitstellt.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 29, wobei die eine oder mehreren Testsubstanzen einen Liganden umfassen und wobei das Verfahren Messen von bindenden oder katalytischen Konstanten umfasst.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 27, wobei die eine oder mehreren Testsubstanzen einen Liganden umfassen, und die Bindungsaffinitäten und aktiven Konzentrationen der Proteinanteile an den Positionen des Musters auf dem Array durch Quantifizieren der Signale für wiederholte Arrays, wo der Ligand in zwei oder mehreren Konzentrationen zugegeben wird, bestimmt wird.