DE602006000517T2

DE602006000517T2 - Verfahren und Vorrichtung zum Züchten von anaeroben Ammonium-oxydierende Bakterien

Info

Publication number: DE602006000517T2
Application number: DE602006000517T
Authority: DE
Inventors: Kazuichi Chiyoda-Ku Isaka; Tatsuo Chiyoda-Ku Sumino; Satoshi Tsuneda
Original assignee: Hitachi Plant Technologies Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2005-03-14
Filing date: 2006-03-13
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2026-03-14
Also published as: EP1702891A1; KR101216525B1; DE602006000517D1; EP1702891B1; US20080280352A1; ATE386001T1; US7960171B2; US20060205055A1; KR20060100933A; US7442539B2

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien, die für ein effektives Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien vorgesehen sind, welche eingesetzt werden, um aus Stickstoff-enthaltenden Flüssigkeiten, wie Abwasser, Stickstoff zu entfernen, und welche die als Substrate verwendeten Stickstoffkomponenten Ammonium und Nitrit in den Stickstoff-enthaltenden Flüssigkeiten anaerob oxidieren.
Stand der Technik
Stickstoffkomponenten, die in Stickstoff-enthaltenden Flüssigkeiten, wie häuslichem und industriellem Abwasser, enthalten sind, bewirken die Eutrophierung von Wassersystemen, wie Seen und Sumpfland, und führen dazu, dass der gelöste Sauerstoff in den Wassersystemen abnimmt. Aus diesen Gründen müssen die Stickstoffkomponenten entfernt werden, bevor die Stickstoff-enthaltenden Flüssigkeiten aus den Systemen abgelassen werden. Die wichtigsten Stickstoffkomponenten, die in einer solchen Stickstoff-enthaltenden Flüssigkeit enthalten sind, sind Ammonium-Stickstoff, Nitrit-Stickstoff, Nitrat-Stickstoff und organischer Stickstoff.
Üblicherweise wurde bisher diese Art von Abwasser im Fall von Abwasser, das Stickstoff in niedrigen Konzentrationen enthielt, mittels Entfernung durch ein Ionenaustausch-Verfahren und eine Oxidation mit Chlor und Ozon behandelt, während im Fall von Abwasser, das Stickstoff in mittleren und hohen Konzentrationen enthielt, ein biologisches Behandlungsverfahren eingesetzt wurde.
Bei der biologischen Behandlung erfolgt eine Nitrifikations-/Denitrifikationsbehandlung durch aerobe Nitrifikation und anaerobe Denitrifikation. Bei der aeroben Nitrifikation werden Ammonium-Stickstoff und Nitrit-Stickstoff in einer Stickstoff-enthaltenden Flüssigkeit, die behandelt werden soll, durch Ammonium-oxidierende Bakterien (wie die Gattungen Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira und Nitrosolo bus) und Nitrit-oxidierende Bakterien (wie die Gattungen Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus und Nitrospina) in einem Nitrifikationstank aerob oxidiert. Andererseits wird bei der anaeroben Denitrifikation eine anaerobe Denitrifikation durch heterotrophe Bakterien, wie Pseudomonas denitrificans, in einem Denitrifikationstank durchgeführt.
Bei der aeroben Nitrifikation wird der Nitrifikationstank mit einer Befüllung im Bereich von 0,2 bis 0,3 kg-N/m³/Tag laufen gelassen. Andererseits wird der Denitrifikationstank bei der anaeroben Denitrifikation mit einer Befüllung im Bereich von 0,2 bis 0,4 kg-N/m³/Tag laufen gelassen. Wenn also die gesamte Stickstoffkonzentration in der Stickstoff-enthaltenden Flüssigkeit, die behandelt werden soll, im Bereich von 30 bis 40 mg/l liegt, ist demgemäß für den Nitrifikationstank eine Retentionszeit von sechs bis acht Stunden und für den Denitrifikationstank von fünf bis acht Stunden erforderlich, wodurch das Problem entsteht, dass jeder der Tanks für eine Behandlung im großen Maßstab bereitgestellt werden muss.
Außerdem ist für die Denitrifikation von Stickstoff-enthaltenden Flüssigkeiten, die anorganisches Material enthalten, wie industrielles Abwasser, noch organisches Material erforderlich, auch wenn die Befüllung der Nitrifikations- und Denitrifikationstanks jeweils im vorstehenden Bereich erfolgt. So muss Methanol bei einer Konzentration zugegeben werden, die drei- bis viermal höher ist als die Stickstoffkonzentration in der zu behandelnden Stickstoff-enthaltenden Flüssigkeit, wodurch noch ein weiteres Problem entsteht, nämlich dass zu den anfänglichen Kosten noch hohe laufende Kosten dazukommen.
Im Gegensatz dazu ist man kürzlich auf die Stickstoff-Entfernung durch ein anaerobes Ammonium-Oxidations-Verfahren aufmerksam geworden, wie es in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 2001-037467 offenbart ist. Dieses anaerobe Ammonium-Oxidations-Verfahren ist ein Verfahren, in welchem Ammonium und Nitrit in einer Stickstoff-enthaltenden Flüssigkeit, die behandelt werden soll, als Elektronendonor bzw. Elektronenakzeptor verwendet werden, wobei sie gleichzeitig durch eine Gruppe von anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien gemäß der nachstehend dargestellten chemischen Formel 1 denitrifiziert werden (vgl. Strous M. et al., (1998), The sequencing batch reactor as a powerful tool for the study of slowly growing anaerobic ammoniium-oxidizing microorganisms, Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 589-596). NH₄ ⁺ + 1,32NO₂ + 0,066HCO₃ + 0,13H⁺ → 1,02N₂ + 0,26NO₃ + 0,066CH₂O_0,5N_0,15 + 2,03H₂O Chemische Formel 1
Gemäß dem anaeroben Ammonium-Oxidations-Verfahren kann die in herkömmlichen Denitrifikations-Verfahren erforderliche Verwendung von Methanol usw. signifikant reduziert werden, da Ammonium in der zu behandelnden Stickstoff-enthaltenden Flüssigkeit als ein Wasserstoffdonor verwendet wird. Außerdem hat dieses Verfahren den Vorteil, dass die durch die Behandlung erzeugte Menge an Schlamm reduziert wird, und somit kann man davon ausgehen, dass es sich hierbei um ein wirksames Verfahren zur Entfernung von Stickstoff handelt, das sich in Zukunft bewähren wird.
Es wurde berichtet, dass Mikroorganismen der Gattung Planctomycetes diejenigen sind, die für diese anaerobe Ammonium-Oxidationsreaktion verantwortlich sind (Strous M. et al., (1999), Missing lithotroph identified as a new planctomycete, Nature 400: 446-449).
Im Allgemeinen sind die Wachstumsraten von Mikroorganismen, die für die vorstehend beschriebene Abwasserbehandlung zur Stickstoffentfernung verwendet werden, niedrig, und auch die Ausbeuten der entsprechenden Bakterienzellen sind gering. Somit ist für die Behandlung von Abwasser eine große Menge von Bakterienzellen dieser Mikroorganismen erforderlich, wodurch das Problem entsteht, dass für die Kultivierung und Akklimatisation der Mikroorganismen viel Zeit erforderlich ist.
Um dieses Problem in den Griff zu bekommen, hat die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 09-187272 ein Verfahren vorgeschlagen, in welchem ein Nitratbakterium mit einer niedrigen Wachstumsrate effizient gezüchtet wird, indem die Menge eines Ammonium-Substrats, das in der logarithmischen Wachstumsphase des Nitrat-bakteriums zugegeben wird, gesteuert wird.
Es ist schwierig, das anaerobe Ammonium-Oxidations-Verfahren in die Praxis umzusetzen, weshalb dieses Verfahren trotz der Tatsache, dass schon eine große Zahl von anaeroben Ammonium-Oxidations-Verfahren vorgeschlagen wurde, noch nicht häufig eingesetzt wird.
Ein Grund hierfür besteht darin, dass die Wachstumsraten von anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, die in dem anaeroben Ammonium-Oxidations-Verfahren verwendet werden, niedrig sind und dass die Ausbeuten der Bakterien gering sind. Insbesondere über Mikroorganismen der Gattung Planctomycetes wurde berichtet, dass sie eine Verdopplungszeit (die Zeit, in der aus einer Bakterienzelle zwei Bakterienzellen gewachsen sind) von elf Tagen benötigen. Dieses langsame Wachstum ist ein entscheidendes Problem bei der praktischen Anwendung des Verfahrens. Unter den vorliegenden Umständen wurde noch kein Verfahren zum Züchten dieser anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien konkret beschrieben.
Für den Betrieb von Anlagen, die Abwasser durch das anaerobe Ammonium-Oxidations-Verfahren behandeln, ist ein Impfschlamm erforderlich, der anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien enthält. Ein solcher Impfschlamm, der zugegeben wird, muss eine große Zahl von Bakterienzellen enthalten, damit eine Vorrichtung zur Abwasserbehandlung innerhalb kurzer Zeit stabil zum Laufen gebracht werden kann.
Jedoch stellt die effektive Züchtung der als Impfschlamm verwendeten Bakterien, für die eine so lange Verdopplungszeit wie elf Tage erforderlich ist, ein Hauptpro blem bei der praktischen Anwendung der Behandlung von Abwasser durch das anaerobe Ammonium-Oxidations-Verfahren dar. Damit das anaeroben Ammonium-Oxidations-Verfahrens praktisch angewendet werden kann, ist es unbedingt erforderlich, dass dieses Problem gelöst wird.
Außerdem macht es das anaerobe Ammonium-Oxidations-Verfahren möglich, eine Schnellbehandlung wie vorstehend beschrieben durchzuführen. Deshalb ist für das Verfahren eine Verbrauchsrate eines Substrats erforderlich, wie sie beim Züchten von nitrifizierenden Bakterien bisher noch nie gefunden wurde, wie in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 09-187272 offenbart. Weiterhin ist für das Verfahren aufgrund der niedrigen Wachstumsraten der Bakterien eine lange Kultivierungszeit erforderlich, weshalb während der Züchtung eine enorm große Substratmenge benötigt wird. Somit bereitet das Verfahren weitere Probleme, die mit den für die Zugabe des Substrats erforderlichen hohen Kosten und außerdem noch mit den hohen Kosten zusammenhängen, die für die Behandlung einer großen Menge von Abfallflüssigkeiten, welche durch die Züchtung erzeugt werden, anfallen.
Die vorliegende Erfindung wurde unter Berücksichtigung dieser Umstände zustande gebracht, und eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien bereitzustellen, wobei Substrate zugegeben werden können, ohne dass Abfall entsteht, wodurch ein Impfschlamm mit hohen Konzentrationen von Bakterienzellen hergestellt wird, mit welchem der Prozess innerhalb kurzer Zeit in Gang gesetzt werden kann, wobei das Verfahren durchgeführt wird, indem anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien mit Ammonium und Nitrit als Substrate gezüchtet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorstehend beschriebene Aufgabe wird gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung gelöst, indem ein Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien bereitgestellt wird, wobei in einem Kultivierungstank anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien gezüchtet werden, welche die als Substrat verwendeten Stoffe Nitrit und Ammonium anaerob denitrifizieren, wobei das Verfahren das Steuern einer Zugaberate Y des Substrats, das in den Kultivierungstank zugegeben wird, nachdem die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in eine logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind, umfasst, so dass die folgende Formel: Y = A × exp(K × T) erfüllt wird, wobei Y die Zugaberate des Substrats darstellt, K eine Zugabekonstante des Substrats bedeutet, T die Anzahl von Kultivierungstagen vom Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab angibt und A eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens darstellt.
Die Erfinder haben die früher beschriebene Verdopplungszeit von anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in Frage gestellt, wobei sie anaerobe Ammonium- oxidierende Bakterien auf Genebene hinsichtlich der Wachstumsrate untersucht haben. Als Folge haben die Erfinder gefunden, dass die Verdopplungszeit nicht elf Tage beträgt, wie früher berichtet wurde, sondern höchstens 1,8 Tage. Basierend auf diesen neuen Erkenntnissen stellt die vorliegende Erfindung bereit: das Zugeben eines Substrats, ohne dass Abfall entsteht, wodurch ein Impfschlamm mit hohen Konzentrationen von Bakterienzellen erzeugt wird, und das Inbetriebsetzen eines Kultivierungstanks, indem man anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien in dem Kultivierungstank wachsen lässt.
Wie vorstehend beschrieben ist der in der vorliegenden Erfindung verwendete Kultivierungstank nicht auf das Züchten von Impfschlamm von anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien beschränkt. Wenn der Kultivierungstank ein anaerober Ammonium-Oxidations-Tank einer vorliegenden Vorrichtung ist, kann die vorliegende Erfindung für das Inbetriebsetzen des anaeroben Ammonium-Oxidations-Tanks verwendet werden, und außerdem kann sie auch als ein Verfahren zur Akklimatisation von anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, die während des Prozesses inaktiviert wurden, verwendet werden.
Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Zugaberate Y des Substrats, das in den Kultivierungstank zugegeben wird, nachdem die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in eine logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind, so gesteuert, dass die Formel: Y = A × exp(K × T) erfüllt wird. Deshalb wird die effektive kontinuierliche Züchtung der anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien möglich gemacht, so dass die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien einfach mit hohen Konzentrationen hergestellt werden können. Außerdem ist es möglich, die ineffektive Zugabe des Substrats zu vermeiden und dadurch eine effiziente Züchtung durchzuführen, indem die Zugabekonstante K mit der Verdopplungszeit, die durch die neuen Erkenntnisse erhalten wurde, d.h. einer Verbrauchsrate des Substrats durch die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, in Übereinstimmung gebracht wird. Auf diese Weise kann Substrat zugegeben werden, ohne dass Abfall entsteht, wodurch ein Impfschlamm mit hohen Konzentrationen von Bakterienzellen erzeugt wird. Deshalb können die Kosten für die Zugabe des Substrats reduziert werden, und außerdem können die Kosten für die Behandlung von Abfallflüssigkeiten signifikant reduziert werden.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß dem ersten Aspekt bereitgestellt, wobei die Bakterien Bakterien sind, welche eine DNA-Sequenz eines 16S-rRNA-Gens aufweisen, wobei die spezielle Region hiervon mindestens eine der Sequenzen mit SEQ ID NO: 1 bis 9 enthält.
Die Gensequenzen der anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, wie im zweiten Aspekt beschrieben, sind in der DDBJ (DNA Data Bank of Japan) registriert, wobei die Registerierungsnummern wie folgt sind: AB164467 für die Sequenz (1), AB164468 für die Sequenz (2), AB164469 für die Sequenz (3), A6164470 für die Sequenz (4), AB164471 für die Sequenz (5), AB164472 für die Sequenz (6), AB164473 für die Sequenz (7), AB164474 für die Sequenz (8) und AB164475 für die Sequenz (9).
In dem zweiten Aspekt wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf Bakterien angewendet, die eine DNA-Sequenz eines 16S-rRNA-Gens aufweisen, wobei die spezielle Region hiervon mindestens eine der Sequenzen mit SEQ ID NO: 1 bis 9 enthält, und dadurch kann eine stärker bevorzugte Wirkung erhalten werden.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt bereitgestellt, wobei das Verhältnis von Ammonium-Stickstoff zu Nitrit-Stickstoff, zugegeben in den Kultivierungstank, so gesteuert wird, dass es innerhalb des Bereichs von 1:0,5 bis 1:2,0 liegt.
Der dritte Aspekt definiert den bevorzugten Bereich des Verhältnisses von Ammonium-Stickstoff zu Nitrit-Stickstoff, die als Substrate dienen. Das Verhältnis liegt innerhalb des Bereichs von vorzugsweise 1:0,5 bis 1:2,0, stärker bevorzugt von 1:1 bis 1:1,5, besonders bevorzugt von 1:1,3.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß einem der Aspekte eins bis drei bereitgestellt, wobei die Zugabekonstante K des Substrats im Bereich von 0,05 bis 0,28 eingestellt wird.
Der vierte Aspekt definiert den bevorzugten Bereich zum Einstellen der Zugabekonstante K in Übereinstimmung mit der Verdopplungszeit, die durch die neuen Erkenntnisse erhalten wurde. Die Zugabekonstante K liegt vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 0,28.
Wenn man versucht, die Zugabekonstante K mit der früher berichteten Verdopplungszeit von elf Tagen in Übereinstimmung zu bringen, beträgt ein Wert der Zugabekonstante K, der eingestellt werden kann, maximal 0,069, auch wenn die Bakterienzelle und die Wachstumsrate eine Beziehung von 1:1, d.h. eine ideale Beziehung haben, wobei die Behandlungsrate verdoppelt wird, wenn sich die Bakterienzelle verdoppelt. Wenn man davon ausgeht, dass die 1:1-Beziehung zwischen der Bakterienzelle und der Wachstumsrate in Wirklichkeit niemals zustande kommt, beträgt der vernünftige Wert der Zugabekonstante K weniger als 0,05. Somit kann der Wert der Zugabekonstante K im vierten Aspekt erst eingestellt werden, nachdem die neuen Erkenntnisse durch die Erfinder präsentiert wurden, nämlich dass die Verdopplungszeit 1,8 Tage beträgt.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß einem der Aspekte eins bis drei bereitgestellt, wobei die Zugabekonstante K des Substrats im Bereich von 0,06 bis 0,15 eingestellt wird.
Der fünfte Aspekt definiert den starker bevorzugten Bereich der Zugabekonstante K. Die Zugabekonstante K liegt stärker bevorzugt im Bereich von 0,06 bis 0,15. Dies ist deshalb der Fall, weil die optimale Zugabekonstante K etwas variiert, abhängig von den Kultivierungsbedingungen der anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien. Somit ist es bevorzugt, dass die Zugabekonstante K auf den Bereich von 0,06 bis 0,15 eingestellt werden sollte, um die Zugabekonstante K weniger empfindlich gegenüber den Kultivierungsbedingungen zu machen.
Gemäß einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß einem der Aspekte eins bis drei bereitgestellt, wobei die Zugabekonstante K des Substrats im Bereich von 0,07 bis 0,12 eingestellt wird.
Der sechste Aspekt definiert den Bereich, der gegenüber den Kultivierungsbedingungen viel weniger empfindlich ist. Es ist besonders bevorzugt, dass die Zugabekonstante K beim Züchten der anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien auf diesen Bereich eingestellt werden sollte.
Gemäß einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß einem der Aspekte eins bis sechs bereitgestellt, weiterhin umfassend ein schrittweises Erhöhen der Zugaberate Y' des Substrats, um eine steigende Kurve zu erreichen, die durch die Formel: Y = A × exp(K × T) dargestellt ist, und ein Steuern einer Nitrit-Stickstoffkonzentration, die bei jedem einzelnen Schritt im Kultivierungstank erhöht wird, so dass sie maximal 70 mg/l nicht übersteigt.
Dies ist der Fall, weil die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien Nitrit als Substrat verwenden, während sie die außergewöhnlichen Eigenschaften besitzen, dass ihre Aktivität durch außerordentlich hohe Nitritkonzentrationen abgeschwächt oder in extremen Fällen sogar inaktiviert wird. Wenn bei der Züchtung solche Eigenschaften nicht berücksichtigt werden, kann keine wirksame Züchtung durchgeführt werden.
In dem siebten Aspekt wird das Substrat in den Kultivierungstank zugegeben, so dass die Zugaberate Y' des Substrats schrittweise erhöht wird, um eine steigende Kurve zu erreichen, die durch die Formel: Y = A × exp(K × T) dargestellt ist. Außerdem wird eine Nitrit-Stickstoffkonzentration, die bei jedem einzelnen Schritt im Kultivierungstank erhöht wird, so gesteuert, dass sie maximal 70 mg/l nicht übersteigt. Hierdurch wird die Möglichkeit ausgeschlossen, dass die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien während der Kultivierung in der Aktivität abgeschwächt oder inaktiviert werden. Es ist stärker bevorzugt, die Nitrit-Stickstoffkonzentration, die bei jedem einzelnen Schritt erhöht wird, so zu steuern, dass sie 50 mg/l nicht übersteigt.
Gemäß einem achten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß einem der Aspekte eins bis sieben bereitgestellt, weiterhin umfassend, nachdem die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in die logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind, Bestimmen einer tatsächlichen Verbrauchsrate y des Substrats aus der Differenz zwischen einer Konzentration des Substrats, das in den Kultivierungstank zugegeben wird, und einer Konzentration des Substrats, das in einer Flüssigkeit verbleibt, die aus dem Kultivierungstank abgelassen wird, Berechnen einer Verbrauchskonstante k des Substrats aus einer Formel für die Verbrauchsrate des Substrats, die durch y = a × exp(k × T) dargestellt ist, und der bestimmten Verbrauchsrate y des Substrats, wobei y die Verbrauchsrate des Substrats darstellt, k die Verbrauchskonstante des Substrats bedeutet, T die Anzahl von Kultivierungstagen vom Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab angibt und a eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens darstellt, und Einstellen der Zugabekonstante K, so dass sie der berechneten Verbrauchskonstante k entspricht.
Die Zugabekonstante K wird auf den Bereich von 0,05 bis 0,28 wie vorstehend beschrieben eingestellt. Im achten Aspekt wird die optimale Zugabekonstante K in diesem Bereich eingestellt.
Der achte Aspekt stellt die weitere Eliminierung von Abfall des Substrats und eine wirksame Züchtung bereit, indem die Zugabekonstante K so eingestellt wird, dass die Zugaberate des Substrats mit der Verbrauchsrate des Substrats übereinstimmt. Da also die tatsächliche Verbrauchsrate y des Substrats aus der Differenz zwischen einer Konzentration des Substrats, das in den Kultivierungstank zugegeben wird, und einer Konzentration des Substrats, das in einer Flüssigkeit verbleibt, die aus dem Kultivierungstank abgelassen wird, bestimmt werden kann, wird diese bestimmte Verbrauchsrate y des Substrats verwendet, um die Verbrauchskonstante k aus der Formel y = a × exp(k × T) für die Verbrauchsrate des Substrats zu berechnen. Danach kann die Zugabekonstante K so eingestellt werden, dass sie mit der berechneten Verbrauchskonstante k übereinstimmt, wodurch das in den Kultivierungstank zugegebene Substrat bei der Züchtung verbraucht wird, ohne dass Abfall entsteht.
Um die vorstehend beschriebene Aufgabe zu erfüllen, wird gemäß einem neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien bereitgestellt, wobei in einem Kultivierungstank anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien gezüchtet werden, welche die als Substrate verwendeten Stoffe Nitrit und Ammonium anaerob denitrifizieren, wobei die Vorrichtung Folgendes umfasst: ein Ammonium-Zugabegerät, das Ammonium, eines der Substrate, bei einer bestimmten Konzentration in den Kultivierungstank zugibt, ein Nitrit-Zugabegerät, das Nitrit, das andere Substrat, bei einer bestimmten Konzentration in den Kultivierungstank zugibt, und ein Steuergerät, das eine Zugaberate Y des Substrats, das in den Kultivierungstank zugegeben wird, nachdem die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in eine logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind, so steuert, dass die folgende Formel: Y = A × exp(K × T) erfüllt wird, wobei Y die Zugaberate des Substrats darstellt, K eine Zugabekonstante des Substrats bedeutet, T die Anzahl von Kultivierungstagen von Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab angibt und A eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens darstellt.
Es ist anzumerken, dass sowohl „a" als auch „A" „eine Substratkonzentration zu Beginn der Züchtungsverfahrens" bedeutet. „a" ist „eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens" hinsichtlich der Verbrauchsrate, und „A" bedeutet „eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens" hinsichtlich der Zugaberate.
Der neunte Aspekt stellt die vorliegende Erfindung in Form einer Vorrichtung bereit. Das Steuergerät steuert die Zugaberate Y des Substrats, das in den Kultivierungstank zugegeben wird, so dass die Formel: Y = A × exp(K × T) erfüllt wird, wenn die als Substrate dienenden Stoffe Ammonium und Nitrit aus dem Ammonium-Zugabegerät und dem Nitrit-Zugabegerät in den Kultivierungstank zugegeben werden, wodurch die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien gezüchtet werden. Hierbei kann das Substrat zugegeben werden, ohne dass Abfall entsteht, wodurch ein Impfschlamm mit hohen Konzentrationen von Bakterienzellen erzeugt wird. Deshalb können die Kosten für die Zugabe des Substrats reduziert werden, und außerdem können die Kosten für die Behandlung von Abfallflüssigkeiten signifikant reduziert werden.
Gemäß einem zehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Vorrichtung zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß dem neunten Aspekt bereitgestellt, wobei die Bakterien Bakterien sind, welche eine DNA-Sequenz eines 16S-rRNA-Gens aufweisen, wobei die spezielle Region hiervon mindestens eine der Sequenzen mit SEQ ID NO: 1 bis 9 enthält.
In dem zehnten Aspekt wird die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung mit solchen Bakterien verwendet, welche eine DNA-Sequenz eines 16S-rRNA-Gens aufweisen, wobei die spezielle Region hiervon mindestens eine der Sequenzen mit SEQ ID NO: 1 bis 9 enthält, und dadurch kann eine noch stärker bevorzugte Wirkung erreicht werden.
Gemäß einem elften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Vorrichtung zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß dem Aspekt neun oder zehn bereitgestellt, wobei das Steuergerät das Ammonium-Zugabegerät und das Nitrit-Zugabegerät so steuert, dass das Verhältnis von Ammonium-Stickstoff zu Nitrit-Stickstoff, zugegeben in den Kultivierungstank, innerhalb des Bereichs von 1:0,5 bis 1:2,0 liegt.
Das Steuergerät steuert das Ammonium-Zugabegerät und das Nitrit-Zugabegerät so, dass das Verhältnis von Ammonium-Stickstoff zu Nitrit-Stickstoff, zugegeben in den Kultivierungstank, innerhalb des Bereichs von vorzugsweise 1:0,5 bis 1:2,0, stärker bevorzugt von 1:1 bis 1:1,5, besonders bevorzugt von 1:1,3, liegt.
Gemäß einem zwölften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Vorrichtung zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß einem der Aspekte neun bis elf bereitgestellt, weiterhin umfassend ein erstes Messgerät, welches eine Konzentration des in den Kultivierungstank zugegebenen Substrats misst, und ein zweites Messgerät, welches eine Konzentration des Substrats misst, das in einer aus dem Kultivierungstank abgelassenen Flüssigkeit verbleibt, wobei das Steuergerät eine Verbrauchsrate y des Substrats aus der Differenz zwischen einem Messergebnis des ersten Messgeräts und einem Messergebnis des zweiten Messgeräts bestimmt, danach eine Verbrauchskonstante k des Substrats aus der bestimmten Verbrauchsrate y des Substrats und einer Formel y = a × exp(k × T) für die Verbrauchsrate des Substrats berechnet, wobei y die Verbrauchsrate des Substrats darstellt, k die Verbrauchskonstante des Substrats bedeutet, T die Anzahl von Kultivierungstagen vom Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab angibt und a eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens darstellt, und sodann die Zugabekonstante K auf der Grundlage der berechneten Verbrauchskonstante k einstellt.
Als ein Beispiel der Einstellung der Zugabekonstante K auf der Grundlage der Verbrauchskonstante k wird die Zugabekonstante K so eingestellt, dass sie mit der Verbrauchskonstante k übereinstimmt. Auf diese Weise können eine weitere Eliminierung von Abfall des Substrats und eine wirksame Züchtung erfolgen, indem die Zugabekonstante K so eingestellt wird, dass sie mit der Verbrauchsrate des Substrats übereinstimmt.
Wie vorstehend beschrieben können in dem Verfahren und mit der Vorrichtung zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung Substrate zugegeben werden, ohne dass Abfall entsteht, wodurch Impfschlamm mit hohen Konzentrationen von Bakterienzellen erzeugt wird, und damit kann das Verfahren innerhalb einer kurzen Zeit in Gang gesetzt werfen, wobei anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien mit Ammonium und Nitrit als Substrate gezüchtet werden. Deshalb können die Kosten für die Zugabe des Substrats reduziert werden, und außerdem können die Kosten für die Behandlung von Abfallflüssigkeiten signifikant reduziert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt ein Diagramm dar, wobei ein Ergebnis eines kontinuierlichen Kultivierungstests erläutert wird, der durchgeführt wurde, um eine Verdopplungszeit von anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien zu bestätigen.
2 stellt ein Diagramm dar, das eine Beziehung zwischen einer Kultivierungszeit und einer Denitrifikationszeit zeigt, wenn eine geeignete Zugaberate eines Substrats verwendet wird.
3 stellt ein Diagramm dar, wobei ein Ergebnis eines kontinuierlichen Kultivierungstests erläutert wird, der durchgeführt wurde, um eine Zugabekonstante K in der Formel: Y = A × exp(K × T) einzustellen.
4 stellt ein Gesamt-Blockschema dar, das eine Vorrichtung zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien der vorliegenden Erfindung zeigt.
5 stellt ein Diagramm dar, wobei ein schrittweises Zugabeverfahren als ein Aspekt von Substratzugabeverfahren erläutert wird.
6 stellt ein Diagramm dar, wobei eine Beziehung zwischen der Aktivität von anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien und einer Nitrit-Stickstoffkonzentration erläutert wird.
Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Nachstehend werden die bevorzugten Ausführungsformen eines Verfahrens und einer Vorrichtung zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben, wobei auf die beiliegenden Zeichnungen Bezug genommen wird.
Die Erfinder haben, wie nachstehend beschrieben wird, das Folgende herausgefunden, wodurch sie die vorliegende Erfindung vervollständigt haben.

(1) Als man anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien, die eine DNA-Sequenz eines 16S-rRNA-Gens aufwiesen, wobei die spezielle Region hiervon mindestens eine der vorstehend beschriebenen Sequenzen (1) bis (9) enthielt, bezüglich der Verdopplungszeit untersuchte, betrug die Verdopplungszeit nicht elf Tage, wie kürzlich berichtet wurde, sonders höchstens 1,8 Tage. Für die Züchtung der anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, die eine solche Verdopplungszeit aufweisen, ist ein Züchtungsverfahren erforderlich, das auf einer dafür geeigneten Technik beruht. Nachstehend werden die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, welche mindestens eine der vorstehend beschriebenen Sequenzen (1) bis (9) enthalten, als „neue anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien" bezeichnet.
(2) Das Züchtungsverfahren umfasst das Steuern einer Zugaberate Y eines Substrats, das in einen Kultivierungstank zugegeben wird, nachdem die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in eine logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind, so dass die folgende Formel: Y = A × exp(K × T) (Berechnungsformel 1) erfüllt wird, wobei die Zugaberate des Substrats durch Y dargestellt ist, eine Zugabekonstante des Substrats durch K dargestellt ist, die Anzahl von Kultivierungstagen vom Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab durch T dargestellt ist und eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens durch A dargestellt ist. Hierdurch wird eine wirksame Züchtung ohne ineffektive Zugabe des Substrats möglich gemacht. In diesem Züchtungsverfahren besteht ein wichtiger Punkt darin, dass die Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens auf A gesetzt wird und die Züchtung dann bei dieser Konzentration unter konstanten Bedingungen in Gang gesetzt wird, und dass das Substrat erst dann in einer größeren Menge zugegeben wird, nachdem die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in eine logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind, so dass die Berechnungsformel 1 erfüllt wird. Denn wenn eine große Substratmenge schon ab dem frühen Stadium des Züchtungsverfahrens vor Beginn der logarithmischen Wachstumsphase in den Kultivierungstank eingeführt wird, sind viele Tage erforderlich, bevor die logarithmische Wachstumsphase beginnt, und es erfolgt kein wirksames Wachstum. Die Entscheidung darüber, ob die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in die logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind oder nicht, wird an dem Zeitpunkt getroffen, wenn der Verbrauch des Substrats festgestellt wird. Im Allgemeinen sollte der Beginn der logarithmischen Wachstumsphase bevorzugt auf den Zeitpunkt festgesetzt werden, wenn der Verbrauch von etwa der Hälfte der Konzentration des zugegebenen Substrats begonnen hat. Somit sollte eine Züchtungsvorrichtung bevorzugt zusammen mit einem Gerät bereitgestellt werden, mit welchem der Beginn der logarithmischen Wachstumsphase nachgewiesen werden kann (das nachstehend beschrieben wird).

Die Formel: Y = A × exp(K × T) wird auf jeden der Stoffe Ammonium und Nitrit, welche die Substrate von anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien darstellen, angewendet. Die Zugaberate des Substrats wird für Ammonium als Ya = A × exp(K × T) ausgedrückt. In diesem Fall bedeutet A eine Substrat-(Ammonium-)Konzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens, und K bedeutet eine Zugabekonstante von Ammonium. Alternativ wird die Zugaberate des Substrats für Nitrit als Yn = A × exp(K × T) ausgedrückt, wobei A eine Substrat-(Nitirit-)Konzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens und K eine Zugabekonstante von Nitrit bedeutet.

(3) Die Zugabekonstante K des Substrats in der Berechnungsformel 1 muss auf einen numerischen Wert eingestellt werden, welcher der Verdopplungszeit von 1,8 Tagen entspricht, wobei er auf den Bereich von vorzugsweise 0,05 bis 0,28, stärker bevorzugt von 0,06 bis 0,15, besonders bevorzugt von 0,07 bis 0,12, eingestellt wird. Diese Zugabekonstante K kann noch passender eingestellt werden, indem die Zugabekonstante K so eingestellt wird, dass sie mit der Verbrauchskonstante k übereinstimmt, die aus einer Verbrauchsrate des Substrats bestimmt wird, dargestellt durch y = a × exp(k × T) (Berechnungsformel 2). In dieser Berechnungsformel 2 ist die Verbrauchsrate des Substrats durch y dargestellt, die Anzahl von Kultivierungstagen vom Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab ist durch T dargestellt, die Verbrauchskonstante ist durch k dargestellt und eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens ist durch a dargestellt.

Anschließend wird ein Kultivierungstest beschrieben, aus welchem die vorstehend beschriebenen Erkenntnisse hergeleitet werden.

(A) Als erstes wird ein kontinuierlicher Kultivierungstest zur Bestätigung der maximalen Rate der Verdopplungszeit (Wachstumsrate) der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien beschrieben.

Als Schlammprobe wurde ein Schlamm verwendet, der die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien enthielt, die alle der vorstehend beschriebenen Sequenzen (1) bis (9) aufwiesen (vgl. Ikuta H., Isaka K. und Sumino T., (2004) Acclimatization of novel anaerobic ammonium-oxidizing bacteria by continuous cultivation system, Proceedings of 38^th Annual Meeting of Japan Society an Water Environment, S. 372).
Die DNA-Sequenz eines 16S-rRNA-Gens der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien wurde durch die folgenden Verfahren bestätigt: RNA wurde daraus extrahiert und anschließend mit Eub341f-Primern (Dokument 1) und AMX 820-Primern (Dokument 2) amplifiziert, anschließend wurde die Basensequenz in einem Sequenzer bestätigt.

Dokument 1: Muyzer G., Brinkhoff T., Nubel U., Santegoeds C., Schafer H. und Wawer C., Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology, 1998, 3.4.4, S. 1-27, in: Akkermans A. D. L., van Elsas J. D., de Bruija F. J., (Hrsg.), Molecular microbial ecology manual, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Niederlande.
Dokument 2: Schmid M., Twachtmann U., Klein M., Strous M., Juretschko S., Jetten M. S. M., Metzger J. W., Schleifer, K. H., Wagner M., 2000, Molecular evidence for genus level diversity of bacteria capable of catalyzing anaerobic ammonium Oxidation, System. Appl. Microbiol. 23: 93-106.

Als Abwasserprobe wurde synthetisches anorganisches Abwasser wie in Tabelle 1 dargestellt verwendet. Eine Substratkonzentration in dem synthetischen anorganischen Abwasser wurde eingestellt, indem die Ammonium- und Nitritkonzentrationen verändert wurden. Tabelle 1

Substrat	zugegebene Menge	Einheit
NaNO₂	50 ~ 250 (bezogen auf Stickstoff)	mg/l
(NH₄)SO₄	50 ~ 210 (bezogen auf Stickstoff)	mg/l
KHCO₃	500	mg/l
KH₂PO₄	27	mg/l
MgSO₄·7H₂O	300	mg/l
CaCl₂·2H₂O	180	mg/l
T. Element S1	1	ml/l
T. Element S2	1	ml/l

Anmerkungen:

T. Element S1: EDTA: 5 g/l, FeSO₄: 5 g/l
T. Element S2: EDTA: 15 g/l, ZnSO₄·7H₂O: 0,43 g/l, CoCl₂·6H₂O: 0,24 g/l, MnCl₂·4H₂O: 0,99 g/l, CuSO₄·5H₂O: 0,25 g/l, NaMoO₄·2H₂O: 0,22 g/l, NiCl₂·6H₂O: 0,19 g/l, NaSeO₄·10H₂O: 0,21 g/l, H₃BO₄: 0,014 g/l.

Als Testvorrichtung wurde ein Kultivierungstank mit Aufwärtsströmung („upflow cultivation tank") (Reaktor) mit einem Nutzvolumen von 200 ml verwendet, der mit nichtgewebtem Material aus Polyesterfaser mit einem prozentualen Anteil einer offensichtlichen Packung von 50 % verpackt war. Außen am Kultivierungstank war ein Wassermantel angebracht, wobei die Wassertemperatur auf 37°C eingestellt wurde.
Der Schlamm, der die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien enthielt, wurde bei einer SS-Konzentration von 180 mg/l in den Kultivierungstank eingebracht, hierauf folgte der kontinuierliche Kultivierungstest unter HRT-Bedingungen von drei Stunden und bei einer Wassertemperatur von 37°C. Die Nitritkonzentration betrug zu Beginn der Züchtung 70 mg/l, bezogen auf die Stickstoffkonzentration, während die Ammoniumkonzentration auf 80 mg/l, bezogen auf die Stickstoffkonzentration, eingestellt wurde. Jedoch ist es wünschenswert, dass Ammonium bei einem anaeroben Ammonium-Oxidations-Verfahren in einer Menge, die etwa 10 bis 20 mg/l über dem theoretischen Verhältnis von 1:1,32 von Ammonium-Stickstoff zu Nitrit-Stickstoff liegt, eingeführt werden sollte, da Ammonium sich während des Kultivierungstests verflüchtigen könnte, wodurch seine Konzentration erniedrigt werden könnte, mit dem Ergebnis, dass nur die Nitritkonzentration noch entsprechend verbleiben würde.
Die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien wurden unter Verwendung eines FISH-Verfahrens (Fluorescence In Situ Hybridization) gemessen, wobei die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien gefärbt und danach unter dem Mikroskop gezählt wurden. Im FISH-Verfahren wird eine Sonde verwendet, die in der Lage ist, die Gene der anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien spezifisch anzufärben, wodurch eine selektive Farbentwicklung zustande kommt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um AMX820-Primer. In diesem Fall sterben die Bakterien während der Messung in dem FISH-Verfahren ab. Deshalb kann der Schlamm, nachdem er aus einem Kultivierungstank entnommen und gemessen wurde, nicht mehr in den Kultivierungstank für eine kontinuierliche Kultivierung zurückgegeben werden. Aus diesem Grund wurden vier Kultivierungstanks unter den gleichen Kultivierungsbedingungen zubereitet und gleichzeitig laufengelassen. Danach wurden annähernd alle Bakterienzellen aus einem der Kultivierungstanks gewaschen und gewonnen, worauf die Messung folgte, dies erfolgte jeweils im Abstand von einer Woche von dem Zeitpunkt ab, wenn Änderungen in der Wasserqualität festgestellt wurden (Durchführung der Denitrifikation) (vgl. Schmid M., et al., (2000), Molecular evidence for genus level diversity of bacteria capable of catalyzing anaerobic ammonium Oxidation, System. Appl. Microbiol. 23: 93-106).
In 1 ist ein Diagramm dargestellt, das ein Ergebnis des kontinuierlichen Kultivierungstests zeigt, wobei Denitrifikationsraten (kg-N/m³/Tag) von Ammonium und Nitrit, bezogen auf Kultivierungstage, und Änderungen der Anzahl der anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, bezogen auf Kultivierungstage, dargestellt sind.
Wie in 1 dargestellt nahm die Zahl (Konzentration) der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien im Kultivierungstank von 1,1 × 10⁶ Zellen/ml (14. Tag) auf 1,7 × 10⁷ Zellen/ml (21. Tag) deutlich zu, so dass es sehr wahrscheinlich ist, dass es sich bei dem Zeitraum vom 14. bis zum 21. Tag um eine logarithmische Wachstumsphase handelt. Es folgte ein allmähliches Wachstum auf 2,1 × 10⁷ Zellen/ml am 27. Tag und 4,3 × 10⁷ Zellen/ml am 34. Tag.
Danach wurde die Wachstumsrate der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien aus der Zahl der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien für den Zeitraum vom 14. Tag bis zum 21. Tag, bei dem es sich wahrscheinlich um eine logarithmische Wachstumsphase handelt, berechnet. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass die Verdopplungszeit 1,8 Tage betrug, dies war viel kürzer als die früher berichtete Verdopplungszeit von elf Tagen, und die spezifische Wachstumsrate (μ) betrug 0,39 Tage^–1. Die Verbrauchskonstante des Substrats in der Berechnungsformel 2 lässt man für den Zeitraum vom 14. Tag bis zum 21. Tag, bei dem es sich wahrscheinlich um eine logarithmische Wachstumsphase handelt, auf y = 0,003 × exp(0,28 × T) kommen. In diesem Fall beträgt die Verbrauchskonstante k des Substrats 0,28. Somit wird die Zugabekonstante K, bezogen auf die Zugaberate Y des Substrats, in der Berechnungsformel 1 auf einen Wert in der Größenordnung der Verbrauchskonstante 0,28 eingestellt, wodurch eine wirksame Züchtung ohne Abfall des Substrats ermöglicht wird.
Wie aus diesem Ergebnis ersichtlich ist, macht die Wachstumsrate in der logarithmischen Wachstumsphase vom 14. Tag bis zum 21. Tag die Verdopplungszeit von maximal 1,8 Tagen möglich, in welcher die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien mit einer Rate wachsen können, die viel schneller ist als diejenige, die früher mit einer Verdopplungszeit von elf Tagen berichtet wurde.
In diesem kontinuierlichen Kultivierungstest wurden der Typ und die relative Zahl der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien durch ein Clonierungsverfahren (vgl. Dokument 3) während des frühen Stadiums des Züchtungsverfahrens und nach der Kultivierung gemessen. Als Ergebnis wurde dabei praktisch keine Änderung festgestellt. So wurde gezeigt, dass die betreffenden neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, die eine DNA-Sequenz einer 16S-rRNA aufwiesen, wobei die spezielle Region hiervon die vorstehend beschriebenen Sequenzen (1) bis (9) enthielt, in gleicher Art und Weise wuchsen. Weitere Informationen zum Clonierungsverfahren finden sich in Dokument 3.

Dokument 3: Kaneko N., Yoshie S., Aoi Y., Tuneda S. und Hirata A., (2004), Biological structure analysis of microorganisms involved in anaerobic ammonium Oxidation reaction, Proceedings of 38^th Annual Meeting of Japan Society an Water Environment, S. 373.

Wie jedoch aus dem Ergebnis von 1 ersichtlich ist, ist die Wachstumsrate vom 21. Tag an niedriger als diejenige vom 14. Tag bis zum 21. Tag. Dies ist deshalb der Fall, weil die Zugaberate des Substrats nicht verändert wurde, mit dem Ergebnis, dass die Zugabe des Substrats ein stärker geschwindigkeitsbegrenzender Faktor war als die Wachstumsrate der Bakterienzellen. Somit ist es ziemlich wichtig, die Zugaberate des Substrats richtig zu steuern, wobei man berücksichtigen muss, dass das Wachstum schneller als abläuft mit der früher berichteten Wachstumsrate. In der vorliegenden Erfindung wurde die geeignete Zugaberate des Substrats sorgfältig untersucht und konkret bestimmt, wie nachstehend beschrieben ist.

(B) Kontinuierlicher Kultivierungstest, durchgeführt zur Bestimmung einer geeigneten Zugaberate des Substrats zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien, die eine Verdopplungszeit von maximal 1,8 Tagen aufweisen.

2 ist ein Ergebnis eines Abwasserbehandlungs-Tests, durchgeführt ohne geschwindigkeitsbegrenzende Zugabe des Substrats unter Verwendung der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, die eingeschlossen und immobilisiert waren, und zeigt in logarithmischer Darstellung eine Denitrifikationsrate (kg-N/m³/Tag) ab dem 10. Tag, wenn der Verbrauch des Substrats festgestellt wurde, d.h. vom Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab. Wie aus 2 ersichtlich ist, liegt jeder Punkt auf einer Geraden, und der jeweilige Kultivierungstag und die Denitrifikationsrate haben während der logarithmischen Wachstumsphase über lange Zeit einen direkten Zusammenhang. In diesem Fall betrug die Verbrauchskonstante k des Substrats 0,053.
Wenn also die Zugabe des Substrats zum geschwindigkeitsbegrenzenden Faktor wird, und nicht die Wachstumsrate der Bakterienzellen, wobei es sich um ein Problem in der Kultivierungszeit ab dem 21. Tag handelt, ist es somit wichtig, wie aus der Abbildung ersichtlich ist, dass das Substrat in Übereinstimmung mit dieser Zugaberate des Substrats zugegeben wird.
Die Verbrauchskonstante k des Substrats wurde für die logarithmische Wachstumsphase (14. Tag bis 21. Tag) in 1 bestimmt. Als Ergebnis wurde ein Wert von k = 0,28 erhalten. Deshalb wurde der Test in Abschnitt (A) erneut durchgeführt, wobei das Substratzugabeverfahren verändert wurde. Nämlich wurde die Züchtung ab dem Zeitpunkt, an dem der Verbrauch des Substrat festgestellt wurde, so durchgeführt, dass die Formel Y = A × exp(K × T) für die Zugaberate des Substrats erfüllt wurde. Noch genauer gesagt wurde das Substrat bei einer Zugaberate zugegeben, die für Ammonium Ya = 80 × exp(0,28 × T) und für Nitrit Yn = 70 × exp(0,28 × T) entsprach.
Als Ergebnis betrug die Konzentration von Bakterienzellen am 27. Tag der Kultivierungszeit 2,7 × 10⁸. Somit wurde bestätigt, dass das Wachstum weiterhin mit einer schnellen Wachstumsrate erfolgte. Ammonium- und Nitritkonzentrationen im behandelten Wasser betrugen jeweils 40 mg/l oder weniger. Außerdem wurde bestätigt, dass die Substratkonzentration im Abwasser nach der Züchtung reduziert werden konnte.
(C-1) Wenn Substrat von einem frühen Stadium des Züchtungsverfahrens an in großen Mengen eingeführt wird.
In diesem Test wurde die gleiche Vorrichtung wie in Abschnitt (A) verwendet, wobei die Züchtung mit einer im Voraus erhöhten Substratkonzentration durchgeführt wurde. Hierfür wurde die Ammoniumkonzentration auf 150 mg/l, bezogen auf die Stickstoffkonzentration, eingestellt, und die Nitritkonzentration wurde auf 150 mg/l, bezogen auf die Stickstoffkonzentration, eingestellt. Impfschlamm wurde bei einer SS-Konzentration von 180 mg/l in den Kultivierungstank eingeführt.
Als Ergebnis wurde sogar noch 25 Tage nach Beginn des Züchtungsverfahrens im Abfluss ein Abwasser erhalten, das eine sehr hohe Ammonium und Nitritkonzentration von jeweils 140 mg/l aufwies, und außerdem waren bis zum Beginn der logarithmischen Wachstumsphase sogar 25 Tage erforderlich. Die Verbrauchskonstante k, bezogen auf die Verbrauchsrate y des Substrats, war mit 0,021 sehr niedrig, und zwar auch noch nach Beginn der logarithmischen Wachstumsphase.
(C-2) Wenn die Züchtung mit einer Zugabekonstante K durchgeführt wird, die auf 0,09 eingestellt ist.
In diesem Test wurde die gleiche Vorrichtung wie in Abschnitt (A) zum Durchführen der Züchtung verwendet. Die anfängliche Substratkonzentration war auch die glei che wie in Abschnitt (A). Die Substrate, Ammonium und Nitrit, wurden bei einer Zugaberate, die für Ammonium auf Ya = 80 × exp(0,09 × T) und für Nitrit auf Yn = 70 × exp(0,09 × T) eingestellt war, von dem Zeitpunkt (18. Tag) an zugegeben, an dem der Verbrauch des Substrats festgestellt wurde.
Als Ergebnis konnten die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien vom 14. Tag bis zum 27. Tag der Kultivierungszeit bei einer Wachstumsrate gezüchtet werden, die eine Verdopplungszeit von fünf Tagen möglich machte. Die Ammonium- und Nitritkonzentrationen im behandelten Wasser betrugen vom 22. Tag an jeweils 5 mg/l oder weniger. Wie aus diesem Ergebnis ersichtlich ist, konnte die Züchtung bei einer schnelleren Rate als derjenigen mit der berichteten Verdopplungszeit von elf Tagen durchgeführt werden, wobei jedoch die Wachstumsrate durch die geschwindigkeitsbegrenzende Zugabe des Substrats leicht verringert wurde.
(C-3) Verfahren zum Steuern der Verbrauchsrate des Substrats auf Grundlage der bestätigten Verbrauchsrate --- 1.
In diesem Test wurde die gleiche Vorrichtung wie in Abschnitt (A) zum Durchführen der Züchtung verwendet. Impfschlamm wurde bei der gleichen Konzentration (180 mg/l) wie im Vergleichsbeispiel eingeführt. Jedoch wurden beim Substratzugabeverfahren die Ammonium- und Nitritkonzentrationen während des frühen Stadiums des Züchtungsverfahrens auf 38 mg/l bzw. 50 mg/l, bezogen auf die Stickstoffkonzentration, gesetzt. Die Züchtung erfolgte unter konstanten Bedingungen, bis der Verbrauch von etwa der Hälfte der Substratmenge festgestellt wurde. Die Überwachung, um festzustellen, ob etwa die Hälfte der Substratmenge verbraucht war oder nicht, erfolgte, indem an einem Zufluss und an einem Abfluss des Kultivierungstanks jeweils Stickstoff-Messgeräte für Ammonium und für Nitrit angebracht wurden.
Der Verbrauch von etwa der Hälfte der Substratmenge wurde nach neun Tagen Betrieb festgestellt, während die Verbrauchskonstante k, bezogen auf die Verbrauchsrate y des Substrats, in der Berechnungsformel 2 0,1 betrug.
Deshalb wurde entschieden, dass die logarithmische Wachstumsphase begonnen hat. Danach wurde die Zugaberate des Substrats unter der Bedingung der Zugabekonstante K = 0,1 so gesteuert, dass die Berechnungsformel 1 der Zugaberate Y des Substrats erfüllt wurde. Die Zugaberate Y des Substrats wurde gesteuert, indem die Substratkonzentration verändert wurde, wobei die Fließrate des synthetischen anorganischen Abwassers unter konstante Bedingungen gehalten wurde. Insbesondere wurde die Zugaberate von Ammonium auf Ya = 38 × exp(0,1 × T) gesetzt, während die Zugaberate von Nitrit auf Yn = 50 × exp(0,1 × T) gesetzt wurde.
Als Ergebnis konnte die Denitrifikationsrate des Kultivierungstanks innerhalb kurzer Zeit ab dem Beginn des Züchtungsverfahrens auf 8,0 kg-N/m³/Tag gesteigert wer den, und die Ammonium- und Nitritkonzentrationen in dem behandelten Wasser konnten jeweils auf 25 mg/l oder weniger reduziert werden.
Wie vorstehend beschrieben konnte eine hohe Aktivität erhalten werden, und die Kultivierung konnte mit großer Effizienz durchgeführt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass die Menge den zugegebenen Substrats aufgrund des Fehlens einer ineffektiven Zugabe des Substrats reduziert werden konnte.
(C-4) Verfahren zum Steuern der Verbrauchsrate des Substrats auf Grundlage der bestätigten Verbrauchsrate --- 2.
In diesem Test wurde die gleiche Vorrichtung wie in Abschnitt (A) zum Durchführen der Züchtung verwendet. Impfschlamm wurde bei einer Konzentration von 250 mg/l eingeführt, wobei es sich um eine höhere Konzentration als bei dem Test im Abschnitt (C-3) handelte. Beim Substratzugabeverfahren wurden die Ammonium- und Nitritkonzentrationen während des frühen Stadiums des Züchtungsverfahrens auf 50 mg/l bzw. 66 mg/l, bezogen auf die Stickstoffkonzentration, eingestellt. Die Züchtung erfolgte so lange unter konstanten Bedingungen, bis der Verbrauch von etwa der Hälfte der Substratmenge festgestellt wurde. Die Überwachung, um festzustellen, ob etwa die Hälfte der Substratmenge verbraucht war oder nicht, erfolgte in gleicher Weise wie in dem Test von Abschnitt (C-3).
Der Verbrauch des Substrats begann am 4. Tag des Züchtungsverfahrens. Etwa am 8. Tag erreichte der Verbrauch von Ammonium und Nitrit die Verbrauchsrate y des Substrats in der Berechnungsformel 2, und die Verbrauchskonstante von k = 0,14 wurde erhalten.
Deshalb wurde die Zugaberate Y des Substrats ab dem 9. Tag des Züchtungsverfahrens so gesteuert, dass die Berechnungsformel 1 erfüllt wurde, während die Zugabekonstante K auf 0,14 gesetzt war.
Als Ergebnis wurde das Substrat entsprechend der Zugaberate des Substrats in der Berechnungsformel 1 verbraucht. Die Nitritkonzentration im Kultivierungstank konnte während der logarithmischen Wachstumsphase konstant bei 50 mg/l oder weniger gehalten werden. Außerdem wurde keine Abschwächung der Aktivität der anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien festgestellt. Somit wurden innerhalb einer kurzen Zeit vom Beginn des Züchtungsverfahrens an eine hohe Aktivität und eine effiziente Züchtung erreicht. Weiterhin wurde auch gezeigt, dass die zugegebene Substratmenge aufgrund des Fehlens einer ineffektiven Zugabe des Substrats reduziert werden konnte.
Diese Testergebnisse zeigen, dass eine wirksame Züchtung ohne eine ineffektive Substratzugabe erfolgen kann, indem die Züchtung vor Beginn der logarithmischen Wachstumsphase bei einer niedrigeren Substratkonzentration als derjenigen, die nach Beginn der logarithmischen Wachstumsphase verwendet wird, unter konstanten Bedingungen durchgeführt wird und sodann die Zugaberate Y des in den Kultivierungstank zugegebenen Substrats vom Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab so gesteuert wird, dass die Gleichung Y = A × exp(K × T) erfüllt wird.

(D) Als nächstes wird ein kontinuierlicher Kultivierungstest zum Einstellen der Zugabekonstante K des Substrats in der Berechnungsformel 1 beschrieben.

Aufgrund der Tatsache, dass anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien erst in einem System von gleichzeitig vorliegenden Mikroorganismen lebensfähig sind und dass sie schwierig zu isolieren sind, variiert die Verbrauchskonstante k des Substrats, abhängig von Bedingungen, wie Immobilisierungsverfahren der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, Typ des Immobilisierungsmaterials, Form des Kultivierungstanks und Aktivität des Impfschlamms. Folglich variiert auch die optimale Zugabekonstante K etwas. Somit ist es zum Eistellen eines Werts der Zugabekonstante K erforderlich, einen Wert in dem Bereich einzustellen, in welchem seine Häufigkeit empirisch hoch ist.
Ein Kultivierungstest wurde mit der gleichen Vorrichtung wie in dem vorstehend beschriebenen Test durchgeführt, wobei die Verdopplungszeit bei mehreren verschiedenen Immobilisierungsverfahren (Einschluss-Immobilisierung, Adhäsions-Immobilisierung und Granula unter Verwendung der Selbst-Granulierung von Mikroorganismen) und Immobilisierungsstoffen zum Immobilisieren der anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien bestätigt wurde.
Wie aus 3 ersichtlich ist, wurde als Ergebnis der Wert der Verbrauchskonstante k des Substrats mit einer großen Häufigkeit im Bereich von 0,05 bis 0,28, mit einer noch größeren Häufigkeit im Bereich von 0,06 bis 0,15 und mit der größten Häufigkeit im Bereich von 0,07 bis 0,12 festgestellt, wenn man es von der Beziehung aus betrachtet, die zwischen der Verbrauchskonstante k des Substrats und ihrer Häufigkeit (Häufigkeit des Auftretens) bestätigt wurde. Somit ist es bevorzugt, dass die Zugabekonstante K in der Berechnungsformel 1 auf den Bereich von 0,05 bis 0,28 eingestellt werden sollte, um die Zugaberate Y des Substrats zu steuern. Stärker bevorzugt liegt die Zugabekonstante K innerhalb des Bereichs von 0,06 bis 0,15 und besonders bevorzugt von 0,07 bis 0,12. Der Einfluss von Kultivierungsbedingungen kann abgeschwächt werden, indem die Zugabekonstante K auf diese Bereiche eingestellt wird.
Wenn man also in dieser Hinsicht versucht, die Zugabekonstante K in Übereinstimmung mit der früher berichteten Verdopplungszeit von elf Tagen einzustellen, beträgt der Wert der Zugabekonstante K, der eingestellt werden kann, maximal 0,069, auch wenn die Bakterienzelle und die Wachstumsrate eine Beziehung von 1:1 haben, d.h. eine ideale Beziehung, wobei die Behandlungsrate verdoppelt wird, wenn sich die Bakterienzelle verdoppelt. Wenn man in Betracht zieht, dass die 1:1-Beziehung zwischen der Bakterienzelle und der Wachstumsrate in Wirklichkeit niemals auftritt, beträgt der vernünftige Wert der Zugabekonstante K weniger als 0,05. Somit kann der Wert der Zugabekonstante K erst in den vorstehend beschriebenen Bereichen eingestellt werden, nachdem die neuen Erkenntnisse der Erfinder, dass die Verdopplungszeit 1,8 Tage beträgt, präsentiert wurden.

(E) Als nächstes wird eine Vorrichtung zum Züchten der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien der vorliegenden Erfindung, die auf Grundlage der Erkenntnisse konstruiert wurde, mit Bezug auf das entsprechende Gesamt-Blockdiagramm beschrieben.

Wie in 4 gezeigt besteht die Vorrichtung 10 zum Züchten der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien hauptsächlich aus einem Kultivierungstank mit Aufwärtsströmung („upflow cultivation tank") 12, einem Ammonium-Zugabegerät 14, welches Ammonium (Substrat) in den Kultivierungstank 12 zugibt, einem Nitrit-Zugabegerät 16, welches Nitrit (Substrat) in den Kultivierungstank 12 zugibt, einem Abwasser-Zugabegerät 18, welches Abwasser (z.B. synthetisches anorganisches Abwasser), welches das Substrat enthält, in den Kultivierungstank 12 zugibt, und einem Steuergerät 20, welches eine Zugaberate des Substrats, das in den Kultivierungstank 12 zugegeben wird, steuert.
Impfschlamm der anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, der z.B. aus Abwasserschlamm akkumuliert und kultiviert wurde, wird in den Kultivierungstank 12 eingeführt. Vorzugsweise werden Festbetten, Adhäsionspellets und Einschluss-Immobilisierungspellets verwendet, so dass die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien nicht aus dem Kultivierungstank 12 auslaufen können. Stoffe, die in den verwendeten Festbetten vorzugsweise eingesetzt werden, schließen ein, sind jedoch nicht speziell beschränkt auf Kunststoff-Rohstoffe, wie Polyethylen, Polyester, Polypropylen und Vinylchlorid sowie Fasern mit Aktivkohle. Die Form der Festbetten schließen ein, sind jedoch nicht speziell beschränkt auf faserförmige Festbetten, Chrysanthemumförmige Festbetten und Honigwaben-förpmige Festbetten. Das offensichtliche Volumen der Festbetten wird auf vorzugsweise 30 bis 80 %, stärker bevorzugt auf 40 bis 70 %, eingestellt. Vorzugsweise werden Festbetten mit einer Porosität nicht unter 80 % verwendet.
Immobilisierungsstoffe für die Adhäsionspellets schließen ein, sind jedoch nicht speziell beschränkt auf Polyvinylalkohol, Alginsäure, Polyethylenglykol-basiertes Gel und Kunststoffpellets, wie Cellulose, Polyester, Polypropylen und Vinylchlorid. Vorzugsweise werden Adhäsionspellets verwendet, die eine kugelförmige, zylindrische, poröse, würfelförmige, schwammartige oder honigwabenartige Form oder dergleichen aufweisen.
Das bevorzugte Immobilisierungsmaterial für die Einschluss-Immobilisierungspellets ist zwar ein Polyethylenglykol-basiertes Gel, jedoch wurden für die Immobilsierungsstoffe keine speziellen Einschränkungen festgelegt, so lange sie keine ungünstige Wirkung auf Bakterienzellen ausüben. Zusätzlich zu Festbetten, Adhäsionspellets und Einschluss-Immobilisierungspellets können in der vorliegenden Erfindung auch Granula verwendet werden, wobei die Selbst-Granulierung von Mikroorganismen ausgenützt wird.
In dem Ammonium-Zugabegerät 14 führt eine erste Rohrleitung 24 von einem Ammoniumreservoir 22, in welchem eine Ammoniumlösung mit einer bestimmten Konzentration enthalten ist, zum Boden des Kultivierungstanks 12. Etwa in der Mitte der ersten Rohrleitung 24 ist eine erste Pumpe 26 angebracht, welche die Menge der Ammonium-Zugabe einstellt. In dem Nitrit-Zugabegerät 16 bildet eine zweite Rohrleitung 30 die Verbindung von einem Nitritreservoir 28, in welchem eine Nitritlösung mit einer bestimmten Konzentration enthalten ist, zu etwa der Mitte der ersten Rohrleitung 24, während etwa in der Mitte der zweiten Rohrleitung 30 eine zweite Pumpe 32 angebracht ist, welche die Menge der Nitritzugabe einstellt. Vorzugsweise sollten das Ammoniumreservoir 22 und das Nitritreservoir 28, die Vorratsbehälter für die Zugabe dieser Substrate sind, unterschiedliche Tanks sein, in welchen Ammonium und Nitrit in einem flüssigen Zustand aufbewahrt werden. Da jedoch Nitrit instabil ist, sollte Nitrit vorzugsweise jedes Mal, wenn es verwendet wird, homogenisiert werden, und es sollte nicht für längere Zeit in einem flüssigen Zustand gehalten werden.
In dem Abwasser-Zugabegerät bildet eine dritte Rohrleitung 36 die Verbindung von einem Abwasserreservoir 34, in welchem z.B. ein synthetisches anorganisches Abwasser enthalten ist, zu etwa der Mitte der zweiten Rohrleitung 30, wobei etwa in der Mitte der dritten Rohrleitung 36 eine dritte Pumpe 38 angebracht ist, welche die zugegebene Abwassermenge einstellt. Diese Geräte erlauben die Zugabe der Substrate, Ammonium und Nitrit, und die Zugabe von Abwasser in den unteren Teil des Kultivierungstanks 12. Die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien werden in dem Kultivierungstank 12 gezüchtet. Eine Abfluss-Rohrleitung 40, welche aus dem Kultivierungstank 12 Abwasser (nachstehend als das behandelte Wasser bezeichnet), in welchem die Substrate verbraucht wurden, abfließen lässt, ist mit dem oberen Ende des Kultivierungstanks 12 verbunden.
An einem Zufluss (erste Rohrleitung 24 in 4) des Kultivierungstanks 12 ist ein erstes Stickstoff-Messgerät 42 angebracht, welches Stickstoffkonzentrationen von Ammonium- und Nitrit-Zugabe in den Kultivierungstank 12 nachweist, während an einem Abfluss (Abfluss-Rohrleitung 40 in 4) des Kultivierungstanks 12 ein zweites Stickstoff-Messgerät 44 angebracht ist, welches Stickstoffkonzentrationen von Ammonium und Nitrit misst, die in dem behandelten Wasser verbleiben, welches aus dem Kultivierungstank 12 abläuft. Die in dem ersten und in dem zweiten Stickstoff-Messgerät 42 und 44 bestimmten Messwerte werden fortlaufend in das Steuergerät 20 eingegeben.
In das Steuergerät 20 werden im Voraus die Berechnungsformel 1 einer Zugaberate Y des Substrats, dargestellt durch Y = A × exp(K × T), und die Berechnungsformel 2 einer Verbrauchsrate y des Substrats, dargestellt durch y = a × exp(k × T), eingegeben. In diesen Formeln stellt Y die Zugaberate des Substrats dar, K bedeutet eine Zugabekonstante des Substrats, T stellt die Anzahl von Kultivierungstagen vom Beginn einer logarithmischen Wachstumsphase ab dar, A bedeutet eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens, y stellt die Verbrauchsrate des Substrats dar, k bedeutet eine Verbrauchskonstante des Substrats und a stellt eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens dar. Das Steuergerät 20 steuert die Zugaberate Y des in den Kultivierungstank 12 zugegebenen Substrats gemäß der Berechnungsformel 1. Das Steuergerät 20 bestimmt die tatsächliche Verbrauchsrate y des Substrats aus der Differenz zwischen einem Messwert des ersten Stickstoff-Messgeräts 42 und einem Messwert des zweiten Stickstoff-Messgeräts 44, d.h. aus der durch die Züchtung verbrauchten Substratmenge, berechnet dann die Verbrauchskonstante k des Substrats aus der bestimmten Verbrauchsrate y des Substrats und Berechnungsformel 2 und legt die Zugabekonstante K für die Berechnungsformel 1 auf Grundlage der berechneten Verbrauchskonstante k fest. Z.B. wird die Zugabekonstante K so festgelegt, dass sie mit der Verbrauchskonstante k übereinstimmt. Durch dieses Verfahren kann ein Wert der Zugabekonstante K genau bestimmt werden und auf einen Wert innerhalb des Bereichs von 0,05 bis 0,28 optimal eingestellt werden.
Beim Züchten der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien mit der Kultivierungsvorrichtung 10, die wie vorstehend beschrieben konstruiert wurde, stellt das Steuergerät 20 die Substratkonzentration für jeden der Stoffe Ammonium und Nitrit zu Beginn des Züchtungsverfahrens auf A ein und setzt die Züchtung bei dieser Konzentration unter konstanten Bedingungen in Gang. Nachdem die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in eine logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind, steuert das Steuergerät 20 die Zugaberate Y des Substrats, das in den Kultivierungstank 12 zugegeben wird, so dass die Berechnungsformel 1: Y = A × exp(K × T) erfüllt wird. In diesem Fall liegt das Verhältnis von Ammonium-Stickstoff zu Nitrit-Stickstoff, zugegeben in den Kultivierungstank 12, im Bereich von vorzugsweise 1:0,5 bis 1:2,0, stärker bevorzugt von 1,1 bis 1:1,5, besonders bevorzugt von 1:1,3.
Bei einer solchen Kultivierung kann durch das erste und das zweite Stickstoff-Messgerät 42 und 44 festgestellt werden, ob die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in die logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind oder nicht. Wenn nämlich der Verbrauch des Substrats nach Beginn der logarithmischen Wachstumsphase plötzlich stark ansteigt, ändert sich die Differenz zwischen einem Messwert des ersten Stickstoff-Messgeräts 42 und einem Messwert des zweiten Stickstoff-Messgeräts 44 rasch, wobei sie klein wird. Somit kann der Beginn der logarithmi schen Wachstumsphase sichergestellt werden, indem diese Änderung überwacht wird. Wenn z.B. der Messwert des zweiten Stickstoff-Messgeräts 44 die Hälfte des Messwerts des ersten Stickstoff-Messgeräts 42 ausmacht, kann man davon ausgehen, dass die logarithmische Wachstumsphase begonnen hat.
Die Vorrichtung 10 zum Züchten der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien der vorliegenden Erfindung, die wie vorstehend beschrieben konstruiert wurde, ist eine Vorrichtung, die anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien wirksam züchtet, wobei sie jedoch nicht auf die Herstellung von Impfschlamm beschränkt sein soll. Wenn z.B. der Kultivierungstank als ein anaerober Ammonium-Oxidations-Tank einer Anlage zur Abwasserbehandlung dient, kann die Vorrichtung 10 auch für ein Akklimatisationsverfahren verwendet werden, wenn die Vorrichtung in Gang gesetzt wird oder wenn es zu einer Inaktivierung von anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in dem anaeroben Ammonium-Oxidations-Tank gekommen ist.
Wenn die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, die in dem Kultivierungstank 12 gezüchtet werden, in einen Tank mit anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien einer Anlage zur Abwasserbehandlung zugegeben werden, ist es bevorzugt, dass die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien für die Verwendung eingeschlossen und immobilisiert sein sollten. Anschließend wird die Züchtung der neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in Einschluss-Immobilisierungspellets beschrieben.
Die in 4 dargestellte Kultivierungsvorrichtung 10 wurde in diesem Pellet-Züchtungstest verwendet, wobei die neuen anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in Pelletgel eingeschlossen und immobilisiert und dann in den Kultivierungstank 12 zugegeben wurden, worauf die Züchtung folgte. Als Immobilisierungsgel wurde ein Polyethylenglykol-basiertes Prepolymer mit einer auf 15 % eingestellten Polymerkonzentration verwendet. Die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien wurden bei einer SS-Konzentration von 3000 mg/l in diesem Immobilisierungsgel eingeschlossen und immobilisiert. Danach wurde dieses Einschluss-Immobilisierungspellet bei einer prozentualen Pellet-Packung von 10 % in den Kultivierungstank 12 gepackt.
Das in dem Test verwendete Abwasser bestand aus einem synthetischen anorganischen Abwasser, wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Ammonium- und Nitritkonzentrationen wurden zu Beginn des Verfahrens jeweils auf 50 mg/l, bezogen auf die Stickstoffkonzentration, eingestellt. Danach wurden die Substrate in den Kultivierungstank 12 zugegeben, so dass die Berechnungsformel 1 bei der gemessenen Wasserqualität erfüllt wurde, während die Konzentration des Nitrit, das in dem aus dem Kultivierungstank 12 abfließenden behandelten Wasser verblieb, so gesteuert wurde, dass es nicht über 50 mg/l, bezogen auf die Stickstoffkonzentration, anstieg.
5 zeigt eine Modifikation (Verfahren mit schrittweiser Zugabe) eines Zugabe- und Steuerverfahrens für das in den Kultivierungstank zugegebene Substrat unter Verwendung der in 4 dargestellten Kultivierungsvorrichtung 10. Hierbei erhöht das schrittweise Zugabeverfahren schrittweise die Zugaberate Y' des Substrats, so dass eine steigende Kurve, die durch Berechnungsformel 1 dargestellt ist, erreicht wird, und es steuert die Nitrit-Stickstoffkonzentration, die mit jedem einzelnen Schritt erhöht wird, im Kultivierungstank so, dass sie nicht über maximal 70 mg/l ansteigt. In diesem Test wird die Nitritkonzentration so gesteuert, dass sie nicht über 50 mg/l, bezogen auf die Stickstoffkonzentration, ansteigt.
Das verwendete Abwasser war ein synthetisches anorganisches Abwasser, wie in Tabelle 1 dargestellt. Impfschlamm wurde bei einer Konzentration von 220 mg/l in den Kultivierungstank 12 eingeführt. Die Ammonium- und Nitritkonzentrationen wurden während des frühen Stadiums des Züchtungsverfahrens auf 38 mg/l bzw. 50 mg/l, bezogen auf die Stickstoffkonzentration, eingestellt. Die Züchtung erfolgte unter konstanten Bedingungen so lange, bis festgestellt wurde, dass der Verbrauch die Nitrit-Stickstoffkonzentration von 10 mg/l ergeben hat. Danach ging man davon aus, dass die logarithmische Wachstumsphase begonnen hat, und die Zugabe des Substrats wurde so gesteuert, dass die Berechnungsformel 1 erfüllt wurde.
Beim Steuern der Zugabe des Substrats wird eine steigende Kurve A, dargestellt durch o, in dem Fall hergeleitet, wenn die Zugaberate von Ammonium so gesteuert wird, dass die Berechnungsformel 1 erfüllt wird, und eine steigende Kurve B, dargestellt durch ☐, wird in dem Fall hergeleitet, wenn die Zugaberate von Nitrit so gesteuert wird, dass die Berechnungsformel 1 erfüllt wird, wie in 5 dargestellt. Im Gegensatz dazu wird eine stufenförmige Linie C, dargestellt durch ⦁, in dem Fall hergeleitet, wenn die Zugaberate von Ammonium schrittweise erhöht wird, so dass sie sich der durch die Berechnungsformel 1 dargestellten steigenden Kurve A nähert, und eine stufenförmige Linie D, dargestellt durch ∎, wird in dem Fall hergeleitet, wenn die Zugaberate von Nitrit schrittweise erhöht wird, so dass sie sich der durch die Berechnungsformel 1 dargestellten steigenden Kurve B nähert.
Als Ergebnis hat die Nitrit-Stickstoffkonzentration in der Messung am 9. Tag auf 8 mg/l abgenommen. In diesem Fall betrug die Verbrauchskonstante k der steigenden Kurve B, bestimmt aus der Berechnungsformel 2, 0,08.
Die Konzentration, bei der Nitrit zugegeben wird, kann in Übereinstimmung mit der steigenden Kurve B verändert werden. Bei einer schrittweisen Zugabe in diesem Test wurde die Züchtung durchgeführt, indem die Nitrit-Stickstoffkonzentration im Kultivierungstank 12 auf Grundlage der steigenden Kurve B mit Aliquots von 50 mg/l in Intervallen von etwa fünf Tagen, wenn im Kultivierungstank 12 das Nitrit knapp wurde, erhöht wurde. Ammonium wurde in einer Menge zugegeben, die auf der Nitrit- Stickstoffkonzentration basierte, so dass die Ammonium-Stickstoffkonzentration einen Wert erreichte oder darüber lag, der bestimmt wurde, indem die Nitrit-Stickstoffkonzentration durch 1,32 geteilt wurde. Als Ergebnis konnten die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien bei einer hohen Verbrauchskonstante k, die bei 0,08 gehalten wurde, gezüchtet werden, während eine hohe Aktivität erhalten blieb.
Wie vorstehend beschrieben verwenden die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien Nitrit als Substrat. Andererseits wird ihre Aktivität durch sehr hohe Nitritkonzentrationen abgeschwächt, oder sie werden dadurch sogar inaktiviert. Wenn also die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien mit dem schrittweise zugegebenen Substrat gezüchtet werden, ist es deshalb wichtig, darauf zu achten, dass die Nitrit-Stickstoffkonzentration im Kultivierungstank 12 nicht plötzlich zu stark erhöht wird. Dies ist auch aus 6 ersichtlich, die eine Beziehung zwischen einer Stickstoffkonzentration des im Kultivierungstank 12 verbleibenden Nitrit und der Aktivität von anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien zeigt.
6 zeigt die Beziehung zwischen einer Stickstoffkonzentration des im Kultivierungstank 12 verbleibenden Nitrit und der Aktivität von anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien, nachdem die Nitrit-Stickstoffkonzentration im Kultivierungstank 12 plötzlich stark erhöht wurde.
Wie aus 6 ersichtlich ist, liegt die Aktivität bei 100, wenn die Stickstoffkonzentration des im Kultivierungstank 12 verbleibenden Nitrit 50 mg/l oder weniger beträgt. Dagegen nimmt die Aktivität allmählich ab, wenn die Nitrit-Stickstoffkonzentration über 50 mg/l angestiegen ist, und sie nimmt stark ab, nachdem die Nitrit-Stickstoffkonzentration über 70 mg/l angestiegen ist. Wenn also das Substrat in den Kultivierungstank 12 zugegeben und schrittweise erhöht wird, ist es bevorzugt, die Nitrit-Stickstoffkonzentration, die mit jedem einzelnen Schritt erhöht wird, im Kultivierungstank 12 so zu steuern, dass sie nicht über maximal 70 mg/l ansteigt, und es ist stärker bevorzugt, sie auf 50 mg/l oder weniger einzustellen.
Die Zugaberate des Substrats kann durch ein Verfahren eingestellt werden, wobei die Konzentration des Substrats eingestellt wird oder wobei die Fließrate der Zugabe des Substrats eingestellt wird.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien, wobei in einem Kultivierungstank (12) anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien gezüchtet werden, welche die als Substrate verwendeten Stoffe Nitrit und Ammonium anaerob denitrifizieren, wobei das Verfahren das Steuern einer Zugaberate Y des Substrats, das in den Kultivierungstank (12) zugegeben wird, nachdem die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in eine logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind, umfasst, so dass die folgende Formel: Y = A × exp(K × T) erfüllt wird, wobei Y die Zugaberate des Substrats darstellt, K eine Zugabekonstante des Substrats bedeutet, T die Anzahl von Kultivierungstagen vom Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab angibt und A eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens darstellt.
Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien nach Anspruch 1, wobei die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien Bakterien sind, die eine DNA-Sequenz eines 16S-rRNA-Gens aufweisen, wobei die spezielle Region hiervon mindestens eine der Sequenzen mit SEQ ID NO: 1 bis 9 enthält.
Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verhältnis von Ammonium-Stickstoff zu Nitrit-Stickstoff, zugegeben in den Kultivierungstank (12), so gesteuert wird, dass es innerhalb des Bereichs von 1:0,5 bis 1:2,0 liegt.
Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zugabekonstante K des Substrats im Bereich von 0,05 bis 0,28 eingestellt wird.
Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zugabekonstante K des Substrats im Bereich von 0,06 bis 0,15 eingestellt wird.
Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zugabekonstante K des Substrats im Bereich von 0,07 bis 0,12 eingestellt wird.
Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiterhin umfassend ein schrittweises Erhöhen der Zugaberate Y' des Substrats, so dass eine steigende Kurve erreicht wird, die durch die Formel: Y = A × exp(K × T) dargestellt ist, und Steuern einer Nitrit-Stickstoffkonzentration, die bei jedem Schritt im Kultivierungstank erhöht wird, so dass sie maximal 70 mg/l nicht übersteigt.
Verfahren zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 7, weiterhin umfassend, nachdem die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in die logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind, a. Bestimmen einer tatsächlichen Verbrauchsrate y des Substrats aus einer Differenz zwischen einer Konzentration des Substrats, das in den Kultivierungstank (12) zugegeben wird, und einer Konzentration des Substrats, das in einer Flüssigkeit verbleibt, die aus dem Kultivierungstank (12) abgelassen wird, b. Berechnen einer Verbrauchskonstante k des Substrats aus einer Formel für die Verbrauchsrate des Substrats, dargestellt durch y = a × exp(k × T), und der bestimmten Verbrauchsrate y des Substrats, wobei y die Verbrauchsrate des Substrats darstellt, k die Verbrauchskonstante des Substrats bedeutet, T die Anzahl von Kultivierungstagen vom Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab angibt und a eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens darstellt, c. und Einstellen der Zugabekonstante K, so dass sie der berechneten Verbrauchskonstante k entspricht.
Vorrichtung (10) zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien, wobei in einem Kultivierungstank (12) anaerobe Ammonium-oxidierende Bakterien gezüchtet werden, welche die als Substrate verwendeten Stoffe Nitrit und Ammonium anaerob denitrifizieren, wobei die Vorrichtung (10) umfasst: a. ein Ammonium-Zugabegerät (14), das Ammonium, eines der Substrate, bei einer bestimmten Konzentration in den Kultivierungstank (12) zugibt, b. ein Nitrit-Zugabegerät (16), das Nitrit, das andere Substrat, bei einer bestimmten Konzentration in den Kultivierungstank (12) zugibt, c. ein Steuergerät (20), welches eine Zugaberate Y des Substrats, das in den Kultivierungstank (12) zugegeben wird, nachdem die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien in eine logarithmische Wachstumsphase eingetreten sind, so steuert, dass die folgende Formel: Y = A × exp(K × T) erfüllt wird, wobei Y die Zugaberate des Substrats darstellt, K eine Zugabekonstante des Substrats bedeutet, T die Anzahl von Kultivierungstagen von Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab angibt und A eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens darstellt.
Vorrichtung (10) zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien nach Anspruch 9, wobei die anaeroben Ammonium-oxidierenden Bakterien Bakterien sind, die eine DNA-Sequenz eines 16S-rRNA-Gens aufweisen, wobei die spezielle Region hiervon mindestens eine der Sequenzen mit SEQ ID NO: 1 bis 9 enthält.
Vorrichtung (10) zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Steuergerät (20) das Ammonium-Zugabegerät (14) und das Nitrit-Zugabegerät (16) so steuert, dass das Verhältnis von Ammonium-Stickstoff zu Nitrit-Stickstoff, zugegeben in den Kultivierungstank (12), innerhalb des Bereichs von 1:0,5 bis 1: 2,0 liegt.
Vorrichtung (10) zum Züchten anaerober Ammonium-oxidierender Bakterien nach einem der Ansprüche 9 bis 11, weiterhin umfassend ein erstes Messgerät (42), welches eine Konzentration des in den Kultivierungstank zugegebenen Substrats misst, und ein zweites Messgerät (44), welches eine Konzentration des Substrats misst, das in einer aus dem Kultivierungstank (12) abgelassenen Flüssigkeit verbleibt, wobei das Steuergerät (20) eine Verbrauchsrate y des Substrats aus einer Differenz zwischen einem Messergebnis des ersten Messgeräts (42) und einem Messergebnis des zweiten Messgeräts (44) bestimmt, danach eine Verbrauchskonstante k des Substrats aus der bestimmten Verbrauchsrate y des Substrats und einer Formel y = a × exp(k × T) für die Verbrauchsrate des Substrats berechnet, wobei y die Verbrauchsrate des Substrats darstellt, k die Verbrauchskonstante des Substrats bedeutet, T die Anzahl von Kultivierungstagen vom Beginn der logarithmischen Wachstumsphase ab angibt und a eine Substratkonzentration zu Beginn des Züchtungsverfahrens darstellt, und die Zugabekonstante K auf der Grundlage der berechneten Verbrauchskonstante k einstellt.