DE602004009199T2

DE602004009199T2 - Wirkungen von sporoderm-gebrochenen germinationsaktivierten ganoderma-sporen auf die behandlung von rückenmarksverletzungen und die proliferation und/oder differenzierung von neuralen stammzellen in verletztem rückenmark

Info

Publication number: DE602004009199T2
Application number: DE602004009199T
Authority: DE
Inventors: Chee-Keung Mongkok Chung; Siu-Kan Mongkok TONG
Original assignee: Chung Chee-Keung Kowloon; Enhan Technology Holdings International Co Ltd
Current assignee: Chung Chee-Keung Kowloon; Enhan Technology Holdings International Co Ltd
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2004-08-02
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2024-08-03
Also published as: US20060269568A1; EP1656151A1; ATE374035T1; WO2005011720A1; CA2534374A1; EP1656151B1; DE602004009199D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Verwendung von Sporoderm-gebrochenen, Keimungs-aktivierten Ganoderma-Sporen (GASP) zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines eine Rückenmarksverletzung aufweisenden Säugers. Die GASP sind beim Fördern der Regenerierung der Axone und Verbessern des Überlebens der motorischen Neuronen im Rückenmark besonders wirksam. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die oben genannte Verwendung zum Fördern der Proliferation und/oder der Differenzierung von Nervenstammzellen in einem Säuger, besonders nachdem der Säuger eine Rückenmarksverletzung aufweist, durch Verabreichen der Sporoderm-gebrochenen, Keimungs-aktivierten Ganoderma-Sporen (GASP) an den Säuger.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Rückenmark koordiniert die Bewegung und Sinnesempfindung des Körpers zum und vom Gehirn. Es ist ein komplexes Organ, das Nervenzellen (auch bekannt als Neuronen) und Bindegewebszellen (auch bekannt als Neurogliazellen oder Gliazellen) enthält. Ein typisches Neuron besteht aus einem Zellkörper, der den Kern und das umgebende Zytoplasma (Perikaryon) enthält; einigen kurzen, sternförmigen Fortsätzen (Dendriten); und einem langen Fortsatz (das Axon), welcher in zweigartigen Ästen (Telodendronen) endet und viele Verzweigungen (Collaterale) aufweist, die entlang seines Verlaufs vorstehen. Das Axon bildet zusammen mit seiner Hülle oder Umhüllung die Nervenfaser. Die Neuroglia- oder Gliazellen bilden die stützende Struktur des Nervengewebes. Es gibt drei Arten von Gliazellen, welche die Astrozyten, die Oligodendrozyten und die Mikroglia sind. Die Astrozyten und die Oligodendrozyten (im ganzen Makroglia) sind ektodermalen Ursprungs. Diese Zellen übertreffen die Neuronen im Gehirn und im Rückenmark zahlenmäßig bei weitem und erfüllen viele wesentliche Aufgaben. Der Oligodendrozyt erzeugt die Myelinumhüllung, die die Axone isoliert, und verbessert die Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit der Nervensignalübertragung. Astrozyten, lange sternförmige Gliazellen, regulieren die Zusammensetzung des die Neuronen umgebenden Fluids. Einige dieser Zellen bilden nach Verletzung auch Narbengewebe. Mikroglia sind mesodermalen Ursprungs. Sie sind kleinere Zellen, die als Reaktion auf Verletzung aktiviert werden und helfen, Abfallprodukte aufzuräumen. All diese Gliazellen produzieren Substanzen, die das Neuronenüberleben unterstützen und das Axonwachstum beeinflussen.
Es gibt mehrere Arten von Neuronen, die innerhalb des Rückenmarks liegen und die die Rückenmarksfunktionen ausführen. Große motorische Neuronen weisen lange Axone auf, die die Skelettmuskulatur im Nacken, im Rumpf und in den Gliedmaßen kontrollieren. Sensorneuronen (auch Dorsalwurzel-Ganglienzellen genannt) weisen Axone auf, welche Informationen vom Körper in das Rückenmark übertragen. Spinale Interneuronen, welche vollständig innerhalb des Rückenmarks liegen, helfen, sensorische Informationen einzubinden und erzeugen koordinierte Signale, die Muskeln kontrollieren.
Viele Axone im Rückenmark werden von Umhüllungen aus einer isolierenden Substanz bedeckt, die Myelin genannt wird, welche ihnen ein weißliches Aussehen verleiht; deshalb wird der Bereich, in dem sie liegen, "weiße Substanz" genannt. Die Neuronen selbst bilden mit ihren baumartigen Dendriten, die Signale von anderen Neuronen empfangen, die "graue Substanz". Diese graue Substanz liegt in einem schmetterlingsförmigen Bereich im Zentrum des Rückenmarks. Das Rückenmark ist wie das Gehirn von drei Membranen (Meningen) umschlossen: Die Pia Mater, die Arachniodea und die Dura Mater. Das Rückenmark wird außerdem von Knochenringen umgeben, die Wirbel genannt werden.
Das Rückenmark und das Gehirn bilden zusammen das zentrale Nervensystem (ZNS). Im Gegensatz zu den Neuronen des peripheren Nervensystems (PNS), welche Signale zu den Gliedmaßen, dem Rumpf und anderen Teilen des Körpers übertragen, wird allgemein angenommen, dass Neuronen des ZNS nach Verletzung nicht regenerieren (Walker, New Eng. Jr. Med., (1991) 324: 1885–1887). Allerdings findet neueste Forschung Stütze, dass das verletzte Rückenmark erfolgreich regeneriert werden kann, vorausgesetzt, dass die beschädigten Neuronen in der Lage sein müssen, die Verletzung zu überleben oder ersetzt zu werden, und die Axone müssen in der Lage sein, wieder zu wachsen und geeignete Ziele zu finden. Axone und ihre Ziele müssen dann interagieren, um Synapsen, die spezialisierten Strukturen, die als funktionelle Verbindungen zwischen den Neuronen fungieren, zu errichten.
Das Rückenmark ist etwa 18 Inches lang und erstreckt sich vom Grund des Gehirns hinunter zur Mitte des Rückens bis zur Taille. Das Rückenmark ist entlang seiner Länge in Abschnitte aufgeteilt. Die Spinalnerven, die sich vom Rückenmark zu anderen Teilen des Körpers hin verzweigen, sind tiefere motorische Neuronen (LMNs). Einunddreißig Spinalnervenpaare gehen bei jeder vertebralen Ebene ab und ein und kommunizieren mit bestimmten Bereichen des Körpers. Die Abschnitte des Nackens oder der Halsregion, die als C1 bis C8 bezeichnet werden, kontrollieren Signale zum Nacken, zu den Armen und zu den Händen. Die im Brust- oder oberen Rückenbereich (T1 bis T12) leiten Signale zum Rumpf und einigen Teilen der Arme weiter. Die in der oberen Lenden- oder mittleren Rückenregion, genau unter den Rippen (L1 bis L5), kontrollieren Signale zu den Hüften und den Beinen. Schließlich liegen die Sakralabschnitte (S1 bis S5) genau unter den Lendenabschnitten im mittleren Rücken und kontrollieren Signale zur Leistengegend, den Zehen und einigen Teilen der Beine. Die Auswirkungen von Rückenmarksverletzungen in verschiedenen Abschnitten spiegelt diese Einteilung wieder.
Die Neuronen des Gehirns und des Rückenmarks sprechen auf Signale anders an als die meisten anderen Zellen des Körpers, einschließlich derer im peripheren Nervensystem (PNS). Das Gehirn und das Rückenmark (d. h. das ZNS) werden innerhalb der knochigen Kavitäten abgegrenzt, die sie schützen, die sie aber auch verwundbar gegenüber durch Schwellen oder kräftige Verletzung verursachte Komprimierungsschäden macht. Zellen des ZNS haben eine sehr hohe Metabolisierungsgeschwindigkeit und sind bezüglich Energie auf Blutglukose angewiesen. Der "Sicherheitsfaktor", d. h. das Ausmaß, in dem der normale Blutfluß das für gesundes Funktionieren notwendige Minimum übersteigt, ist im ZNS viel geringer als in anderen Geweben. Aus diesen Gründen sind ZNS-Zellen gegenüber Verringerungen im Blutfluß (Ischämie) besonders verletzlich. Andere besondere Merkmale der ZNS sind die "Blut-Hirn-Schranke" und die "Blut-Rückenmark-Schranke". Diese Schranken, die von Zellen gebildet werden, die die Blutgefäße in der ZNS umsäumen, schützen die Neuronen durch Einschränken des Eindringens von möglicherweise gesundheitsschädlichen Substanzen und Zellen des Immunsystems. Trauma kann diese Schranken beeinträchtigen und vielleicht zu weiteren Schäden im Gehirn und Rückenmark beitragen. Die Blut-Rückenmark-Schranke verhindert auch den Eintritt einiger möglicherweise therapeutischen Wirkstoffe. Letztendlich unterscheiden sich die Gliazellen und die extrazelluläre Matrix (das Material, das die Zellen umgibt) im Gehirn und Rückenmark von denen in den peripheren Nerven. Jeder dieser Unterschiede zwischen der PNS und dem ZNS trägt zu deren unterschiedlichem Ansprechen gegenüber Verletzung bei.
Obwohl das Rückenmark gut geschützt ist, tritt Rückenmarksverletzung aufgrund von Ursachen wie Trauma (z. B. Autounfall, Gewalt, Stürze, Sport) und Krankheit (z. B. Polio, Spina Bifita, Friedreichs Ataxie) auf. In den Vereinigten Staaten leben etwa 450.000 Leute mit Rückenmarksverletzung, und es gibt jedes Jahr etwa 10.000 neue Fälle, wobei die meisten Männer im Alter von zwischen 16 bis 30 einschließen. Die Rückenmarksverletzung kann in vollständige Verletzung (keine motorischen und sensorischen Funktionen unter der Ebene der Verletzung) und unvollständige Verletzung (etwas Funktion unter der primären Ebene der Verletzung) eingeteilt werden. Die Genesung von einer Rückenmarksverletzung ist viel schwieriger, weil die Neuronen sehr spezialisiert sind und nicht in der Lage sind, sich zu teilen und neue Zellen zu bilden.
Üblicherweise führen Verletzungen des Rückenmarks nicht zu einem Schnitt durch das Mark; stattdessen quetschen sie die Axone. Forscher, die die aus Autopsien erhaltenen Rückenmärker untersuchten, haben mehrere verschiedene Arten von Rückenmarksverletzungen ermittelt. Die häufigsten Arten von Rückenmarksverletzungen sind Quetschungen (Quetschen des Rückenmarks) und Komprimierungsverletzungen (verursacht durch Druck auf das Rückenmark). Andere Verletzungsarten schlossen durch eine Kugel oder andere Gegenstände verursachte Risse und das Zentralmark-Syndrom ein.
Der Schaden, der den Rückenmarksaxonen innerhalb der ersten wenigen Stunden nach der Verletzung zustößt, ist komplex und tritt stufenweise ein. Der normale Blutfluß wird unterbrochen, was bei einigen der Gewebe des Rückenmarks einen Sauerstoffmangel verursacht. Einbluten in den verletzten Bereich führt zum Schwellen, was die Rückenmarksaxone weiter komprimieren und schädigen kann. Die chemische Umgebung wird destruktiv, hauptsächlich aufgrund der Freisetzung von hochreaktiven Molekülen, z. B. freien Radikalen. Diese Moleküle lösen Zellmembranen auf, was das Töten von Zellen, die ursprünglich nicht verletzt wurden, einschließt. Makrophagen, die in die Verletzungsstelle eindringen, um Fremdkörper aufzuräumen, können unverletztes Gewebe ebenfalls beschädigen. Nicht-neuronale Zellen, wie Astrozyten, können sich zu oft teilen, wobei sie eine Narbe bilden, die das Nachwachsen der verletzten Nervenaxone behindert.
Die frühen Vorgänge, die einer Rückenmarksverletzung folgen, können später zu anderen Schadensarten führen. Innerhalb von Wochen oder Monaten können sich an der Verletzungsstelle Zysten bilden, welche sich mit zerebrospinalem Fluid füllen. Normalerweise entwickelt sich um die Zysten herum Narbengewebe, das dauerhafte Kavitäten erzeugt, die sich ausdehnen können und weiter Neuronen schädigen können. Auch Nervenzellaxone, die ursprünglich nicht beschädigt wurden, verlieren oft ihr Myelin. Im Zeitablauf können diese und andere Vorgänge zu mehr Gewebedegeneration und einem größeren Funktionsverlust beitragen.
Wirksame Arzneimitteltherapie für Rückenmarksverletzung wurde erst in den 1990ern Realität, als Methylprednisolon, das erste Arzneimittel, das die Verbesserung der Genesung von Rückenmarksverletzung zeigte, von klinischen Studien zu Standardverwendungen vorrückte. Die NASCIS II-Studie (National Acute Spinal cord Injury Study II), eine multizentrische klinische Studie, die Methylprednisolon mit Placebo und dem Arzneimittel Naloxon verglich, zeigte, dass innerhalb von 8 Stunden nach Verletzung verabreichtes Methylprednisolon die Genesung in Menschen deutlich verbessert. Vollständig gelähmte Patienten, denen Methylprednisolon verabreicht wurde, stellten etwa 20% ihrer verlorenen motorischen Funktion wieder her, verglichen zu 8% Funktionswiederherstellung bei unbehandelten Patienten. Teilweise gelähmte Patienten stellten im Durchschnitt 75% ihrer Funktion wieder her, verglichen mit 59% bei Leuten, die das Arzneimittel nicht erhielten. Patienten, die mehr als 8 Stunden nach Verletzung mit Naxolon oder mit Methylprednisolon behandelt wurden, verbesserten sich nicht signifikant mehr als Patienten, denen ein Placebo verabreicht wurde (National Institutes of Health, "Spinal Cord Injury: Emerging Concepts", (1996) www.ninds.nih.gov/healt_and_medical/pubs). Die Ergebnisse der klinischen Studie von Methylprednisolon revolutionierten die Ansicht, dass es ein Fenster mit der Möglichkeit zum akuten Behandeln von Rückenmarksverletzung gibt.
Heute werden mehr Arzneimittel zur Behandlung von Rückenmarksverletzung getestet. Zum Beispiel offenbart das U.S. Patent-Nr. 6,291,493 die Verwendung von Clomethiazol (5-(2-Chlorethyl)-4-methylthiazol) zum Behandeln pathologischer Zustände, die durch Komprimierung des Rückenmarks, ob traumatisch hervorgerufen oder aufgrund von einer durch Tumore verursachten Kompression, Blutung, infektiöse Prozesse oder spinale Stenose verursacht werden. U.S. Patent-Nr. 6,288,069 offenbart die Verwendung von 9-substituierten Hypoxanthin-Derivaten (wie N-4-Carboxyphenyl-3-(6-oxohydropurin-9-yl)propanamid), um die Regenerierung oder das Überleben eines motorischen Neurons eines Säugers oder eines sensorischen Neurons eines Säugers zu stimulieren. U.S. Patent-Nr. 6,143,714 offenbart die Verwendung eines hepatozytischen Wachstumsfaktors (HGF), um das Überleben, das Wachstum und die Differenzierung motorischer Neuronen zu fördern.
Erst vor Kurzem wurden Befunde berichtet, dass Neuronen in bestimmten Bereichen der adulten ZNS, z. B. im Riechkolben, wo Signale von den Neuronen von dem Riechorgan das Gehirn und den gezähntes Gyrus des Hippokampus erreichen, erneuert werden können. Da Neuronen nicht in der Lage sind, sich zu teilen, wies der Zugang an neuen Neuronen auf die Existenz unreifer Zellen hin, d. h. Vorläufer- oder Stammzellen, welche Neuronen generieren können.
Stammzellen sind undifferenzierte Zellen, die zur Proliferation, Selbst-Erhaltung und Produktion einer großen Anzahl an differenzierten, funktionellen Nachkommen, die das Gewebe nach Verletzung regenerieren, fähig sind. Stammzellen, die aus der frühen embryonalen Blastula, d. h. vor der Gastrulation, isoliert wurden, können Zellarten aller verschiedener Abstammungen produzieren (Keller, Curr. Opin. Cell Biol., 7: 862–869 (1995)). Allerdings spielen Stammzellen in Erwachsenen die Rolle des Ersetzens der Zellen, welche durch natürlichen Zelltod, Verletzung oder Krankheit verloren gingen. Diese Nervenstammzellen überlebten und differenzierten in Neuronen und Neurogliazellen, wenn sie in das Gehirn transplantiert wurden (Johansson et al., Cell (1999), 96(1): 25–34). Es gibt im Rückenmark auch eine bestimmte Anzahl an Nervenstammzellen. Sie sind proliferierende Zellen im Ependym des spinalen Zentralkanals in adulten Säugern (Frisen et al., J. Cell Biol. (1995), 131: 453–464; Yamamoto et al., Exp. Neurol. (2001), 172: 115–127)). Ein Verfahren zur Isolierung von Ependym-Nervenstammzellen wurde kürzlich in U.S. Patent 6,541,247 beschrieben.
Die Existenz von Nervenstammzellen in der ZNS adulter Säuger wurde als Erstes durch Kultivieren von Zellen aus dem adulten Rattengehirn und -rückenmark gezeigt. Unter bestimmten Kultur-Bedingungen kann eine Population multipotenter Nervenstammzellen fortgepflanzt werden (Reynolds et al., Science (1992) 255: 1707–1710). Unter diesen Bedingungen proliferieren einzelne Zellen in vitro, und die Nachkommen bilden ein Cluster aggregierte Zellen. Derartige Zellklone lösen sich in vitro nach ein paar Tagen von der Petrischale ab. Die Zellen machen mit der Proliferation weiter und bilden ein als Neurosphäre bezeichnetes, charakteristisches, sphäroides Zellaggregat dicht geclusterter Zellen, wobei alle von diesen von einer einzigen Zelle stammen. Die meisten der Zellen in der Neurosphäre exprimieren Nestin, ein Zwischenfilament, das in neuroepithelen Stammzellen gefunden wird (Lendahl et al., Cell (1990), 60: 585–595), aber sie exprimieren keine Marker, die für differenzierte Zellen typisch sind. Diese undifferenzierten Zellen differenzieren schnell, wenn sie auf einem adhäsiven Substrat plattiert werden oder wenn Serum zum Kulturmedium zugegeben wird. Es ist wichtig, dass ein Klon von Zellen, die von einer einzelnen Zellen stammen, Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten generieren kann, was beweist, dass mindestens die ursprüngliche Zelle multipotent war (Reynolds et al., Science, ebenda). Wenn ein Zellklon dissoziiert wird, werden zudem viele der Zellen neue Cluster undifferenzierter multipotenter Zellen bilden, was folglich das Kriterium dafür erfüllt, Stammzellen zu sein.
Die Entwicklung der Säuger-ZNS beginnt im Frühstadium der fötalen Entwicklung und setzt sich bis zum postnatalen Zeitabschnitt fort ( U.S. Patent-Nr. 6,497,872 ). Der erste Schritt bei der Nervenentwicklung ist die Zellgeburt, welche die genaue temporale und räumliche Sequenz ist, in welcher Stammzellen und Stammzellnachkommen (d. h. Tochterstammzellen und Vorläuferzellen) proliferieren. Prolifierierende Zellen werden zu Neuroblasten, Glioblasten und neuen Stammzellen führen.
Der zweite Schritt ist ein Zeitabschnitt der Zellart-Differenzierung und Migration, wenn undifferenzierte Vorläuferzellen sich in Neuroblasten und Glioblasten differenzieren, welche zu Neuronen und Gliazellen führen und zu ihren endgültigen Positionen migrieren. Zellen, welche vom Neuralrohr stammen, führen zu Neuronen und Glia der ZNS, während von der Neuralleiste stammende Zellen zu den Zellen des peripheren Nervensystems (PNS) führen. Bestimmte Faktoren, die während der Entwicklung anwesend sind, wie der Nerven-Wachstumsfaktor (NGF), fördern das Wachstum von Nervenzellen. NGF wird von Zellen der Neuralleiste abgesondert und stimuliert das Keimen und Wachsen der Nervenaxone.
Die dritte Stufe in der Entwicklung findet statt, wenn die Zellen spezifische phänotypische Beschaffenheiten, wie die Expression bestimmter Neurotransmitter, erwerben. Zu diesem Zeitpunkt verlängern Neuronen auch Vorgänge, welche in Bezug auf ihre Ziele Synapsen bilden. Primär werden Neuronen während des fötalen Zeitabschnitts generiert, während Oligodendrozyten und Astrozyten während des frühen postnatalen Zeitabschnitts generiert werden. Bis zum späten postnatalen Zeitabschnitt weist die ZNS ihre vollständige Anzahl an Nervenzellen auf.
Der letzte Schritt der ZNS-Entwicklung ist der selektive Zelltod, wobei die Degeneration und der Tod spezifischer Zellen, Fasern und synaptischer Verbindungen die komplexe Schaltung des Nervensystems "feinabstimmen". Dieses "Feinabstimmen" geht während des ganzen Lebens des Wirts weiter. Später im Leben kann die selektive Degenerierung aufgrund des Alterns, von Infektionen und anderen unbekannten Ätiologien zu neurodegenerativen Krankheiten führen.
Es gibt zunehmend Beweise, dass Nervensystemverletzungen Stammzellen in der adulten ZNS beeinflussen könnten. Sowohl nach Rückenmarks- als auch nach Gehirnverletzungen ist die Nestin-expression jeweils in Zellen, die den Zentralkanal umsäumen und in der subventrikulären Zone liegen, erhöht (Frisen et al., J. Cell Biol., ebenda). Diese Zellen können von Stammzellen stammen. Mit der Zeit werden Nestin-exprimierende Zellen stufenweise weiter vom Zentralkanal und den lateralen Ventrikeln entfernt angetroffen, und diese Zellen exprimieren astrozytische Marker (Frisen et al., J. Cell Biol., ebenda). Diese Daten zeigen, dass Stammzellen oder Vorläuferzellen, die sich in der Nähe des ventrikulären Systems befinden, veranlaßt werden, zu proliferieren, zu der Stelle der Verletzung zu migrieren und zu Astrozyten zu differenzieren.
Gegenwärtig sind in der klinischen Praxis keine Verfahren verfügbar, um die Generierung neuer Zellen im Nervensystem zu stimulieren. Die Transplantation von Zellen von menschlichen Embryonen oder Tieren wurden mit einigen vielversprechenden Ergebnissen getestet. Allerdings weisen diese Verfahren einige Probleme auf – hauptsächlich ethische und immunologische – was es sehr unwahrscheinlich macht, dass sie in einer großen Anzahl von Patienten verwendet werden werden. Dementsprechend ist die Entdeckung eines Proliferations- und Differenzierungsfaktors bei Nervenstammzellen in der adulten ZNS von Säugern wichtig, und könnte es ermöglichen, Strategien zu entwickeln, um die Generierung neuer Neuronen- oder Gliazellen zu stimulieren.
Kürzlich offenbarten Cheung et al., FEBS Lett. (2000), 486: 291–296, dass Ganoderma lucidum-Extrakt unter Verwendung eines primären neuronalen Zellsystems in vitro neuronale Differenzierung induziert (d. h. PC12-Zellen). Die PC12-Zellen stammen von Ratten-Phäochromozytom-Zellen, welche auf den Nerven-Wachstumsfaktor (NGF) ansprechen. Das von Cheung et al. beschriebene Ganoderma lucidum-Extrakt wird aus den Fruchtkörpern der Ganoderma lucidum hergestellt.
In der in den nachfolgenden Abschnitten vorzustellenden Erfindung wird eine neue Verwendung der Sporodem-gebrochenen, Keimungs-aktivierten Ganoderma-Sporen (GASP) von Ganoderma lucidum zur Behandlung einer Rückenmarksverletzung unternommen. Die GASP wurden kürzlich zur Verwendung beim Behandeln von Patienten mit Krebs, AIDS, Hepatitis, Diabetes und kardiovaskulären Krankheiten offenbart, und können radikalische Oxidation und hepatotoxische Wirkungen verhindern oder inhibieren. Siehe U.S. Patent-Nr. 6,316,002 und 6,468,542. Im Gegensatz zu Methylprednisolon, das Patienten innerhalb 8 Stunden nach Verletzung verabreicht werden muß, um wirksam zu sein, können die GASP Menschen und Tieren zu einer viel späteren Zeit verabreicht werden, während sie immer noch eine deutliche Verbesserung erzielen. Ein weiterer Nutzen der Verwendung der GASP ist, dass sie nicht-toxisch sind, so dass den Patienten höhere Dosen verordnet werden können.
Darüber hinaus wird eine neue Verwendung der GASP als eine wirksame, sichere und geeignete Alternative zum Induzieren der Proliferation von Eigen-Nervenstammzellen der verletzten ZNS und Migration zu dem verletzten Bereich und ferner die Differenzierung in Neuronen zur Ersetzung beschädigter oder verlorener Neuronen beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verwendung gemäß Anspruch 1 bereit. Das Medikament dient zur Behandlung einer Rückenmarksverletzung durch Verabreichen einer wirksamen Menge an Keimungs-aktivierten Ganoderma-Sporen (GASP) in einem Säuger, bevorzugt einem Menschen, nach einer Rückenmarksverletzung. Ganoderm (Ganoderma Lucidum Leyss ex Fr. Karst) ist ein vielporiger Pilz. Er gehört zur Klasse der Basidiomyzeten, der Familie Polypolaceae und der Gattung Ganoderma. Die GASP sind Sporoderm-gebrochen. Die GASP werden dem Säuger bevorzugt oral innerhalb etwa eines Tages (nach) der Rückenmarksverletzung verabreicht.
Die Ursachen der Rückenmarksverletzung schließen Komprimierung oder Trennung des Rückenmarks (wie Trennung der ventralen Wurzel des Rückenmarks, oder Trennung oder Quetschung des Ischiasnervs), Trauma (wie Verkehrsunfall, Gewalt, Stürze, Sport etc.) oder eine Krankheit (wie Polio, Spina Bifida oder Friedenreichs Ataxie) ein. Zudem kann die Rückenmarksverletzung aufgrund von Beschädigung oder Tod von Neuronen innerhalb des verletzten Rückenmarks oder Quetschung von Axonen innerhalb des verletzten Rückenmarks vorliegen.
Die GASP werden einem Säuger, einschließlich eines Menschen, bevorzugt oral in der Menge von etwa 0,5–15 g pro kg Körpergewicht pro Tag, am vorteilhaftesten etwa 8 g pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht.
Durch die Verwendung der vorliegenden Erfindung wird das Überleben von Neuronen, besonders von motorischen Neuronen, nach einer Rückenmarksverletzung durch Verabreichen einer wirksamen Menge der GASP an einen Säuger, bevorzugt einen Menschen, dessen Rückenmark verletzt wurde, verbessert. Die GASP sind Sporoderm-gebrochen. Es ist bevorzugt, dass die GASP dem Säuger innerhalb 1 Tages (nach) der Rückenmarksverletzung verabreicht werden. Die wirksame Menge der GASP beträgt etwa 0,5–15 g pro kg Körpergewicht pro Tag, bevorzugt 8 g pro kg Körpergewicht pro Tag.
In einer anderen Ausführungsform wird die oben genannte Verwendung zum Fördern der Axonregenerierung nach einer Rückenmarksverletzung bereitgestellt, was die Verabreichung, bevorzugt die orale Verabreichung einer wirksamen Menge der GASP an einen Säuger, bevorzugt einen Menschen, der eine Rückenmarksverletzung aufweist, voraussetzt. Die GASP sind Sporoderm-gebrochen. Die GASP werden bevorzugt oral an den Säuger innerhalb 1 Tages nach der Rückenmarksverletzung verabreicht. Die GASP werden bevorzugt in einer Menge von etwa 0,5–15 g pro kg Körpergewicht pro Tag, am vorteilhaftesten etwa 8 g pro kg Körpergewicht pro Tag an den Säuger verabreicht.
In einer noch weiteren Ausführungsform wird die oben genannte Verwendung zum Fördern der Proliferation und/oder Differenzierung von Nervenstammzellen in einem Säuger bereitgestellt. Das Verfahren setzt die Verabreichung einer wirksamen Menge an Sporoderm-gebrochenen, Keimungs-aktivierten Ganoderma-Sporen (GASP) in einem Säuger, bevorzugt einem Menschen, voraus. Die GASP sind besonders wirksam beim Fördern der Proliferation und/oder Differenzierung von Nervenstammzellen, nachdem der Säuger eine Rückenmarksverletzung hat. Die Ursachen für eine Rückenmarksverletzung schließen Kompression oder Trennung des Rückenmarks, Trauma (wie Autounfall, Gewalt, Stürze, Sport etc.) oder eine Krankheit (wie Polio, Spina Bifida oder Friedenreichs Ataxie) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Darüber hinaus kann die Rückenmarksverletzung aufgrund der Beschädigung oder des Todes von Neuronen innerhalb des verletzten Rückenmarks oder aufgrund von Quetschung der Axone innerhalb des verletzten Rückenmarks vorliegen. Die GASP werden bevorzugt oral an einen Säuger, einschließlich eines Menschen, in der Menge von etwa 0,5–15 g pro kg Körpergewicht pro Tag, am vorteilhaftesten etwa 8 g pro kg Körpergewicht pro Tag, verabreicht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die ventrale Wurzel mit abgeschnittener Stelle in der rechten Seite der L3-, L4- und L5-Nerven des in den Beispielen 1 und 2 verwendeten Tiermodells.
2 zeigt Bilder des Rückenmarks, das 35 Tage, nachdem die rechte Seite der ventralen Wurzeln abgeschnitten wurde, mit Neutralrot gefärbt wurde. Überlebende motorische Neuronen wurden rot gefärbt und erschienen in diesen Bildern gegenüber dem blauen Hintergrund als violette Flecken. Wie in der Kontrollgruppe (A) gezeigt, war die Anzahl überlebender motorischer Neuronen in der verletzten (rechten) Seite merklich geringer als die in der unverletzten (linken) Seite. Wie in der GASP-Behandlungsgruppe (B) gezeigt, war die Anzahl der überlebenden motorischen Neuronen in den verletzten (rechts) und unverletzten (links) Seiten statistisch nicht signifikant, was darauf hinweist, dass die GASP beim Fördern des Überlebens lumbaler motorischer Neuronen nach einer Rückenmarksverletzung aufgrund von Abschneiden der ventralen Wurzeln wirksam waren.
3 zeigt die Bilder der Nervengewebe, die zuerst mit Nikotinamidadenindinukleotidphosphat-Diaphorase (NADPH-d) gefärbt wurden und mit Neutralrot neu gefärbt wurden. Die Bilder (A) und (B) sind Nervengewebe von Ratten in der Kontrollgruppe jeweils 14 und 35 Tage nach Abschneiden der ventralen Wurzel. Die Bilder (C) und (D) sind Nervengewebe von Ratten in der GASP-Behandlungsgruppe, jeweils 14 und 35 Tage nach dem Abschneiden der ventralen Wurzeln. Überlebende motorische Neuronen wurden mit Neutralrot gefärbt. Die Pfeile in den Bildern (A) und (C) sind auf Neuronen gerichtet, die bezüglich der neuronalen Stickoxid-Synthase (nNOS) Aktivität positiv waren und in einer violetten Farbe eingefärbt wurden. Verglichen mit der Kontrollgruppe (A) gab es 14 Tage nach dem Abschneiden der ventralen Wurzeln in den Nervengeweben der GASP-Behandlungsgruppe (C) eine hohe Anzahl nNOS-positiver Neuronen, was darauf hinweist, dass die GASP beim Fördern des Überlebens von motorischen Neuronen nach Rückenmarksverletzung wirksam waren.
4 zeigt die Bilder von Nervengeweben (bei 100X Vergrößerung), die zuerst mit NADPH-d gefärbt wurden und dann mit Neutralrot neu gefärbt wurden. Die Bilder (A) und (B) sind Nervengewebe von Ratten in den Kontroll- und GASP-Behandlungsgruppen jeweils 14 Tage nach dem Abschneiden der ventralen Wurzeln. Überlebende motorische Neuronen wurden mit Neutralrot gefärbt. Die Pfeile in den Bildern sind auf Neuronen gerichtet, die bezüglich der nNOS-Aktivität positiv waren und in einer violetten Farbe eingefärbt wurden.
5 zeigt die abgeschnittene Stelle in der rechten Seite des Ischiasnervs des in den Beispielen 3–6 verwendeten Tiermodells.
6 zeigt die Bilder von L4-Rückenmarkabschnitten, die mit einem zurückgehenden Fluorogold-Tracer (FG) markiert wurden, nachdem die rechte Seite des Ischiasnervs abgeschnitten wurde, gefolgt von wieder zusammengenähten Perineurium-Schichten. Die Bilder (A) und (B) zeigen jeweils die unverletzten (linken) und verletzten (rechten) Seiten der Kontrollgruppe. Die Bilder (C) und (D) zeigen jeweils die unverletzten (linken) und verletzten (rechten) Seiten der GASP-Behandlungsgruppe. Die Anzahl FG-markierter Neuronen in den unverletzten Seiten beider Gruppen (siehe (A) und (C)) wurde verglichen. Die FG-markierten Neuronen in der verletzten Seite der Kontrollgruppe (B) schienen viel weniger als die der GASP-Behandlungsgruppe (D) zu sein, was darauf hindeutet, dass die GASP beim Fördern der Regenerierung der verletzten motorischen Neuronenaxone wirksam waren.
7 zeigt die Transduktions-Diagramme der Ischiasnerven an der unverletzten Seite (A) und der verletzten Seite (C) der Kontrollgruppe, und der unverletzten Seite (B) und der verletzten Seite (D) der GASP-Behandlungsgruppe, nachdem die rechte Seite des Ischiasnervs abgeschnitten und wieder zusammengenäht wurde. Der Peak-zu-Peak-Wert und die elektrische Impuls-Transduktionsgeschwindigkeit der elektrischen Impulse wurden bestimmt. Wenn Diagramm (C) und (D) verglichen wurden, waren der Peak-zu-Peak-Wert und die Impuls-Transduktion in Diagramm (D) höher und schneller, was darauf hindeutet, dass die GASP-Behandlung die elektrische Impuls-Transduktion im verletzten Ischiasnerv verbesserte. Dies legt nahe, dass eine 6-wöchige GASP-Behandlung beim Fördern der Regeneration der Axone im verletzten Ischiasnerv wirksam war.
8 zeigt die Hämatoxylin- und Eosin- (H & E) Färbungen eines normalen Wadenmuskels (A); eines Wadenmuskels der Kontrollgruppe, nachdem der Ischiasnerv für 6 Wochen abgetrennt war (B); und eines Wadenmuskels der GASP-Behandlungsgruppe, nachdem der Ischiasnerv für 6 Wochen abgetrennt war (C). Normales Wadenmuskelgewebe zeigte, wie in (A) gezeigt, ein regelmäßiges, glattes und paralleles Muster. Der Wadenmuskel der Kontrollgruppe (B) zeigte ausgeprägte Unregelmäßigkeit, während der Wadenmuskel der GASP-Behandlungsgruppe (C) das meiste des normalen Musters beibehielt. Dies deutet darauf hin, dass die GASP den Wadenmuskel nach der Rückenmarksverletzung erhalten.
9 zeigt die Mallory-Färbungen reparierter Ischiasnervengewebe in der Kontrollgruppe (A) und der GASP-Behandlungsgruppe (B) nach dem Abschneiden des Ischiasnervs. Rote Farbe kennzeichnet Nervenfaserregenerierung, die am häufigsten in den Nervengeweben der GASP-Behandlungsgruppe (B) und merklich geringer in dem der Kontrollgruppe (A) gesehen wurde. Dies deutet darauf hin, dass die GASP beim Fördern der Nervenfaserregeneration wirksam waren.
10 zeigt die BrdU-fluoreszierende Immunohistochemie eines Querschnitts eines normalen Ratten-Rückenmarks. Der Pfeil (↑) kennzeichnet die BrdU-positiven Zellen im Ependym des spinalen Zentralkanals unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung. Das Ependym ist die umhüllende Membran der Ventrikel des Gehirns und des Zentralkanals des Rückenmarks.
11 zeigt die BrdU-fluoreszierende Immunohistochemie eines Querschnitts eines Ratten-Rückenmarks 1 Tag nach einer Rückenmarksverletzung. Der Pfeil (↑) kennzeichnet die BrdU-positiven Zellen im Ependym des spinalen Zentralkanals und die umliegenden Bereiche unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung.
12 zeigt die Nestin-fluoreszierende Immunohistochemie eines Querschnitts eines Ratten-Rückenmarks 1 Tag nach einer Rückenmarksverletzung. Der Pfeil (↑) kennzeichnet Nestin-positive Zellen im Ependym des spinalen Zentralkanals und der umliegenden Bereiche unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung.
13 zeigt die Nestin-fluoreszierende Immunohistochemie eines Querschnitts eines Ratten-Rückenmarks 4 Wochen nach einer Rückenmarksverletzung. Der Pfeil (↑) kennzeichnet die Nestin-positiven Zellen in der verletzten weißen Substanz der verletzten Behandlungsgruppe unter dem Fluoreszenzmikroskop in 200facher Vergrößerung.
14A zeigt die doppelte, BrdU- und Nestin-fluoreszierende Immunohistochemie eines Querschnitts von verletztem Rückenmark 4 Wochen nach Rückenmarksverletzung. Der Pfeil (↑) kennzeichnet die BrdU-positiven Zellen in der weißen Substanz des verletzten Rückenmarks der verletzten Behandlungsgruppe unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung.
14B zeigt die gleiche Ansicht wie in 14A. Der Pfeil (↑) zeigt unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung, dass einige der BrdU-positiven Zellen auch Nestin exprimieren.
15A zeigt eine doppelte, BrdU- und NF-fluoreszierende Immunohistochemie eines Querschnitts von verletztem Rückenmark 4 Wochen nach spinaler Verletzung. Der Pfeil (↑) kennzeichnet die BrdU-positiven Zellen in der spinalen weißen Substanz der verletzten Behandlungsgruppe unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung.
15B zeigt die gleiche Ansicht wie in 15A. Der Pfeil (↑) zeigt unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung, dass einige der BrdU-positiven Zellen auch NF exprimierten.
16A zeigt die doppelte, BrdU- und Oligodendrozytinfluoreszierende Immunohistochemie eines Querschnitts von verletztem Rückenmark 4 Wochen nach spinaler Verletzung. Der Pfeil (↑) kennzeichnet die BrdU-positiven Zellen in der spinalen weißen Substanz der verletzten Behandlungsgruppe unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung.
16B zeigt die gleiche Ansicht wie in 16A. Der Pfeil (↑) zeigt unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung, dass einige der BrdU-positiven Zellen auch Oligodendrozytin exprimierten.
17A zeigt die doppelte, BrdU- und GFAP-fluoreszierende Immunohistochemie eines Querschnitts von verletztem Rückenmark 4 Wochen nach spinaler Verletzung. Der Pfeil (↑) kennzeichnet die BrdU-positiven Zellen in der spinalen weißen Substanz der verletzten Behandlungsgruppe unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung.
17B zeigt die gleiche Ansicht wie in 17A. Der Pfeil (↑) zeigt unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung, dass einige der BrdU-positiven Zellen auch GFAP exprimierten.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur effektiven Behandlung einer Rückenmarksverletzung und ein Verfahren zum Fördern der Proliferation und/oder Differenzierung von Nervenstammzellen in einem Säuger, besonders nach einer Rückenmarksverletzung, bereit. Das Verfahren schließt die Verabreichung einer wirksamen Menge Keimungs-aktivierten Ganoderma-Sporenpulvers (GASP) an einen eine Rückenmarksverletzung aufweisenden Säuger ein.
Ganoderma (Ganodernma Lucidum Leyss ex Fr. Karst) ist ein vielporiger Pilz, der zu der Klasse Basidiomyzeten, der Familie Polypolaceae und der Gattung Ganoderma gehört. Ganodermasporen sind winzige und nebelartige Sporen von 5–8 μm Größe, die extrem harte und widerstandsfähige doppelschichtige äußere Sporenhäute aufweisen, was es folglich schwierig macht, sie aufzubrechen. Die Sporen enthalten hohe Konzentrationen von vielen biologisch wirksamen Substanzen, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren, Polysaccharide, Vitamine, Sterine, Spuren-Mineralien, Aminosäuren und Triterpene einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Die in der vorlegenden Erfindung verwendeten GASP sind Sporoderm-gebrochen (d. h. die doppelschichtigen äußeren Sporenhäute der Sporen werden gebrochen, so dass die biologisch wirksamen Substanzen in den Sporen freigesetzt werden), welche durch das im U.S. Patent-Nr. 6,316,002 (das "'002 Patent") Verfahren produziert werden. Durch das einzigartige Sporen-Brechverfahren, das in dem '002 Patent beschrieben wird, werden die biologisch wirksamen Substanzen in der GASP in hohen Ausbeuten erhalten, und die funktionellen Aktivitäten der biologisch wirksamen Substanzen werden erfolgreich bewahrt.
Im Folgenden wird eine allgemeine Beschreibung des im '002 Patent verwendeten Verfahrens, das zur Darstellung der GASP führt, gezeigt.
I. Einweichen, um Keimung zu induzieren:
Reife und vollkommene Sporen von Ganoderma lucidum werden sorgfältig ausgewählt, um einen Einweich-Vorgang auszuführen, um Keimung zu induzieren. Die Sporen wurden in klarem oder destilliertem Wasser, biologischer Salzlösung oder anderen Nährlösungen, die den Sporen von Ganoderma lucidum schnelles Keimen ermöglichen könnten, aufbewahrt. Beispiele von Nährlösungen schließen Kokosnußsaft oder eine 1–5% Malzextraktlösung, 0,5–25% Extrakte von Ganoderma lucidum-Sporokarpen oder Ganoderma lucidum-Capillitia, 0,1–5% Biotin enthaltende Kulturlösung, 0,1–3% einbasisches Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat enthaltende Kulturlösung ein. Die Wahl der Lösung würde von der erforderlichen Einweichzeit, der Menge an zu verarbeitenden Sporen und anderen derartigen Faktoren, wie Verfügbarkeit des Materials, abhängen. Es könnten eine oder mehrere der obigen Keimungslösungen verwendet werden, wobei die zugegebene Menge das 0,1–5fache des Gewichts der Sporen von Ganoderma lucidum beträgt. Die Einweichzeit kann nach der Temperatur des Wassers festgelegt werden, und üblicherweise wurde das Einweichen für 30 min bis 8 h mit der Temperatur des Wassers bei 20–43°C durchgeführt. Bevorzugt betrugen die Einweichzeiten 2–4 Stunden, und die Temperatur des Wassers betrug 25–35°C.
II. Aktivierungskultur:
Die Sporen von Ganoderma lucidum wurden aus der Einweichlösung entfernt und überschüssiges Wasser wurde entfernt, indem ihm erlaubt wurde, abzutropfen. Die Sporen wurden dann bei einer konstanten Temperatur und Feuchtigkeit in einen gut belüfteten Kultivierungsbehälter gelegt, so dass die Sporen-Aktivierungskultur durchgeführt werden konnte. Die relative Feuchtigkeit der Kultur wurde üblicherweise auf 65–98% eingestellt, die Kulturtemperatur wurde auf 18–48°C eingestellt und die Aktivierungszeit dauerte von 30 min bis 24 h. Bevorzugt beträgt die Feuchtigkeit 85–97% und die Temperatur beträgt 25–35°C. Unter Verwendung des durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Verfahrens erreichte die Aktivierung von Sporen von Ganoderma lucidum eine Rate von mehr 95%. Während der Aktivierung wurden die Zellwände der Sporen von rotem Ganoderma lucidum deutlich aufgeweicht, so dass es leichter war, die Zellwände der Sporen zu durchdringen.
III. Behandlung der äußeren Sporenhäute:
Nach dem Keimungsaktivierungsprozeß wurden die Sporen durch Enzymolyse behandelt. Dieser Vorgang wurde bei einer niedrigen Temperatur und unter Bedingungen unter Verwendung von Chitinase, Cellulase oder anderen Enzymen, welche herkömmlicherweise in der Industrie verwendet werden, durchgeführt, so dass die Enzymaktivität aufrecht erhalten wurde. Der Vorgang war abgeschlossen, wenn die äußeren Sporenhäute ihre Widerstandsfähigkeit verloren hatten und brüchig wurden. Alternativ wurden physikalische Behandlungen durchgeführt, um die Zellwände zu durchdringen, zum Beispiel Mikronisierung, Walzenpressen, Mahlen, Hochdruck-Mikrostrombehandlung und andere üblicherweise in der Industrie verwendete mechanische Verfahren können mit einer Durchdringungsrate von über 99% durchgeführt werden.
IV. Trocknen oder Extrahieren:
Das Trocknen wurde bei geringer Temperatur unter Verwendung von Standardverfahren, die Gefriertrocknen oder Vakuumtrocknen etc. einschließen, welche üblicherweise in der Industrie verwendet werden, durchgeführt. Die erhaltenen Produkte wiesen einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 4% auf. Nach dem Trocknen wurden die biologisch wirksamen Substanzen mit Wasser oder Alkohol oder durch Dünnfilm-Kondensation extrahiert. Die extrahierten biologisch, wirksamen Substanzen könnten durch Dialyse weiter gereinigt werden, um zu gewährleisten, dass die Endprodukte keine Verunreinigungen enthalten.
V. Pharmazeutische Formulierungen der biologisch wirksamen Substanzen:
Die biologisch wirksamenwirksamen Substanzen können dann zu gereinigten Pulvern, Extrakt-Pasten, Lösungen zur Injektion und/oder für oralen Gebrauch gemacht werden. Die Erfindung umfaßt auch die Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen der Wirkstoffe unter Verwendung von im Fachgebiet wohlbekannten Hilfsmitteln und Verfahren zur Herstellung. Zudem können die biologisch wirksamen Substanzen durch irgendein geeignetes Verfahren dosiert werden, das Tabletten, Kapseln, Lösungen, Zäpfchen, Nasensprays, Parenteralien oder Injektionseinrichtungen einschließt. Die Wahl des Verfahrens zur Verabreichung wird durch die klinische Lage des Patienten bestimmt. Die biologisch wirksamen Substanzen der vorliegenden Erfindung, die durch die beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, schließen aktive Gene, Induzierer des biotisch möglichen Promotors, Induzierer des multizellulären Aktivators, Induzierer von Interferon, Lacton A, Ganoderma-Polysaccharid, Ganodermasporen-Fettsäuren, langkettige Alkyl-Kohlenwasserstoffe von Ganoderma Sporen, Ganoderma Triterpene, Sterine, Hyperoxid-Dismutase, Viamin E, aktives Glykoprotein, bestimmte Wachstumsfaktoren, Ganoderma-Säure A, Hyperoxid-Dismutase (SOD), wirksame Glykoproteine, mehrfach aktive Enzyme und Wachstumsfaktoren usw. ein. Diese biologisch wirksamen Substanzen tragen im Ganzen zu den in den späteren Abschnitten beschriebenen therapeutischen Verwendungen bei.
GASP sind nicht-toxisch. Das bevorzugte Verfahren zur Verabreichung der GASP ist das durch orale Aufnahme. Gegenwärtig werden die GASP von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassen, um als Diät-Zusatz in Kapselform unter dem Namen Enhanvol^® und Holistol verwendet zu werden, die von der Enhan Technology Holdings International Co., Ltd. in Hongkong verkauft werden. Jede GASP-Kapsel enthält 0,3 g GASP. Die empfohlene Dosierung für GASP ist, wenn es als Diät-Zusatz verwendet wird, 4 mal täglich jedesmal 4 Kapseln. Dementsprechend beträgt die tägliche Dosis GASP als Diät-Zusatz für einen Erwachsenen mit 60 kg etwa 0,08 g/kg Körpergewicht pro Tag.
Es wurde jedoch gezeigt, dass keine physiologischen und pathologischen Auffälligkeiten gefunden wurden, wenn an die Patienten und Tiere 8 g/kg/Tag GASP verabreicht wurden. 0,5 g bis 15 g/kg/Tag GASP wurde an Tiere verabreicht und zeigte signifikante Wirkungen bei Behandlung von Rückenmarksverletzungen. Es ist allerdings verständlich, dass die Dosis für irgendeinen bestimmten Patienten von einer Reihe von Faktoren, die Alter, Körpergewicht, allgemeine Gesundheit, Geschlecht, Ernährungsgewohnheiten, Verabreichungszeit, Darreichungsform, Ausscheidungsgeschwindigkeit, Arzneimittel-Kombination und die Schwere der Krankheit einschließen, abhängt. Aus diesen Gründen bleibt die Dosierung dem Ermessen des erfahrenen Klinikers überlassen.
Die vorliegende Erfindung wird unter Verwendung eines Ratten-Modells durchgeführt. Nach Metz et al., J. Neurotrauma (2000), 17(1): 1–17) können die funktionalen, elektrophysiologischen und morphologischen Ergebnisparameter, die der Rückenmarksverletzung in Ratten folgen, auf die im Menschen extrapoliert werden. Metz et al. sammelten Daten von menschlichen Patienten mit chronischer Rückenmarksverletzung und verglichen diese mit denen von Ratten mit Quetschungs-Rückenmarksverletzung, induziert durch einen Gewichtssturz. Im Hinblick auf funktionelle, elektrophysiologische und morphologische Ergebnisse deuten die Ergebnisse auf eine analoge Beziehung zwischen Ratten und Menschen hin, was zeigt, dass Ratten als ein adäquates Tiermodell für die Forschung an funktionellen und morphologischen Änderungen nach Rückenmarksverletzung und die Wirkungen neuer Behandlungsstrategien dienen können.
In der vorliegenden Erfindung wurden fünf (5) Gewebe-Färbemittel und fünf (5) fluoreszierende neuronale Marker verwendet. Die fünf Gewebe-Färbemittel sind Neutralrot (siehe z. B. 2, 3 und 4), Nikotinamidadenindinukleotidphosphat-Diaphorase (NADPH-d) (siehe z. B. 3 und 4), Fluorogold (siehe z. B. 6), Hämatoxylin und Eosin (siehe z. B. 8) und Mallorys Färbemittel (siehe z. B. 9). Die fünf fluoreszierenden neuronalen Marker sind BrdU, Nestin, Neurofilament (NF), Oligodendrozytin und gliales, fasriges Säureprotein (GFAP). Die fluoreszierenden neuronalen Marker werden verwendet, um die Proliferation von Zellen im Allgemeinen (basierend auf der Färbung von BrdU), die undifferenzierten Nervenstammzellen (basierend auf der Färbung von Nestin), die neu gebildeten Neuronen von Nervenstammzellen (basierend auf der Färbung von NF), die neu gebildeten Oligodendrozyten von Nervenstammzellen (basierend auf der Färbung von Oligodendrozytin) und die neu gebildeten Astrozyten (basierend auf der Färbung von GFAP) zu untersuchen.
Die folgenden Versuchspläne sind veranschaulichend, aber schränken den Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht ein. Vernünftige Variationen, wie sie der vernünftige Fachmann ausführen würde, können hierin gemacht werden, ohne vom Rahmen der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Beispiel 1
Wirkungen von GASP auf das Überleben lumbaler motorischer Neuronen
Tiermodell:
Es wurden gesunde SD-Ratten, die vom Guangdong medizinischen Tierzentrum geliefert wurden, mit Körpergewichten von etwa 100 g ausgewählt.
Methode:
Die SD-Ratten wurden in zwei Gruppen eingeteilt, d. h. in die GASP-Behandlungsgruppe und in die Kontrollgruppe. In jeder Ratte wurde die rechte Seite der ventralen Wurzeln an den L3, L4 und L5 Lumbalnerven abgeschnitten (siehe 1). Die linke Seite der ventralen Wurzeln blieb unversehrt, um als Vergleich verwendet zu werden.
GASP (20 g) wurde bis zu einer Endkonzentration von 20% in 100 ml 0,5% Natriumcarboxymethylcellulose aufgelöst. Nachdem die ventralen Wurzeln für etwa einen Tag abgeschnitten waren, wurde den Ratten in der GASP-Behandlungsgruppe 35 Tage zweimal täglich etwa 2 ml GASP-Lösung mittels Sondenfütterung gefüttert. Die tägliche GASP-Dosis betrug 8 g/kg/Tag. Den Ratten in der Kontrollgruppe wurde 35 Tage zweimal täglich die gleiche Menge an 0,5% Natriumcarboxymethylcellulose gefüttert. Alle Ratten wurden unter gleichen Bedingungen gehalten.
Am Ende des Behandlungszeitraums wurden die Nervengewebe von beiden Gruppen gesammelt. Abschnitte des Rückenmarks wurden unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd fixiert, in eine 30% Zuckerrohr in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) eingeweicht und in Scheiben mit 30 μm Dicke gefriergeschnitten. Jede fünfte Scheibe wurde ausgewählt und eine Gesamtzahl von 10 Scheiben wurde mit Neutralrot gefärbt. Die überlebenden Neuronen in den segmentierten Scheiben wurden rot gefärbt und wurden gemäß der Verfahren von Clarke und Oppenheim gezählt. Für jede Ratte wurden die überlebenden motorischen Neuronen auf den zehn Nervenscheiben gemittelt.
Es wurde eine statistische Analyse unter Verwendung des T-Tests durchgeführt.
Ergebnisse:

Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 und 2 gezeigt. Tabelle 1. Wirkungen der GASP auf das Überleben motorischer Neuronen nach dem Abschneiden der lumbalen ventralen Wurzeln

	Kontrollgruppe (n = 6)	GASP-Behandlungsgruppe (n = 7)	P*
Anzahl der überlebenden motorischen Neuronen in der unverletzten (linken) Seite	15,02 ± 0,86	15,45 ± 0,81	>0,05
Anzahl der überlebenden motorischen Neuronen in der verletzten (rechten) Seite	6,43 ± 1,49	13,61 ± 0,74
P**	<0,01	<0,01
%-Überleben ***in der verletzten (rechten) Seite	56,88 ± 3,20	89,88 ± 2,24	<0,01

*: der p-Wert bezeichnet den Vergleich zwischen der Kontroll- und der GASP-Behandlungsgruppe
**: der p-Wert bezeichnet den Vergleich zwischen der Anzahl an Neuronen in der unverletzten (linken) Seite und der verletzten (rechten) Seite innerhalb derselben Gruppe
***: %-Überleben wurde als das Prozentverhältnis der Anzahl an Neuronen in der verletzten (rechten Seite zu der in der unverletzten (linken) Seite bestimmt.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Anzahl der überlebenden motorischen Neuronen in den unverletzten Seiten in beiden Gruppen ähnlich waren. Nach dem Abschneiden der L3, L4 und L5 Nerven war die Anzahl an überlebenden motorischen Neuronen in der verletzten Seite ohne Behandlung allerdings signifikant geringer (6,43 ± 1,49) als im Vergleich zur unverletzten Seite (15,02 ± 0,86) und der verletzten Seite der GASP-Behandlungsgruppe (13,61 ± 0,74). Die %-Überlebensrate der GASP-Behandlungsgruppe betrug 90%, was signifikant höher war als die der Kontrollgruppe (57%). Ähnliche Befunde wurden bei den Neutralrot-Färbungen der Rückenmarksgewebe (2) beobachtet.
Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass 35 Tage GASP-Behandlung bei 8 g/kg/Tag beim Fördern des Überlebens lumbaler motorischer Neuronen mit bis zu 90% Überlebensrate in Ratten, nachdem deren ventrale Wurzeln abgeschnitten wurden, wirksam war
Schlußfolgerung:
Es wurde gezeigt, dass die GASP beim Fördern des Überlebens motorischer Neuronen nach einer Nervenverletzung infolge von Durchtrennung wirksam waren.
Beispiel 2
Wirkungen von GASP auf das Überleben lumbaler motorischer Neuronen
Die Aktivität der neuronalen Stickoxid-Synthase (nNOS) in den verletzten Neuronen deutet das Überleben der motorischen Neuronen an. Die histochemische Nikotinamidadenindinukleotidphosphat-Diaphorase (NADPH-d)-Reaktion wird als ein geeigneter Marker für die nNOS-Aktivität erachtet. Daher kann die Messung der Aktivität von nNOS unter Verwendung der NADPH-d-Färbeverfahren verwendet werden, um das Überleben der motorischen Neuronen zu ermitteln.
Methode:
Die Tiermodelle wurden wie in Beispiel 1 oben beschrieben vorbereitet, gruppiert und behandelt.
Nach 14 Behandlungstagen wurden 5 (fünf) Ratten von jeder Gruppe getötet und ihre jeweiligen Nervengewebe wurden gesammelt. Die in jeder Gruppe verbleibenden Ratten wurden bis Tag 35 weiter mit ihrer täglichen GASP- oder Natriumcarboxymethylcelluloselösungs-Dosis gefüttert. Diese Ratten wurden dann getötet und die Nervengewebe wurden gesammelt.
Abschnitte der Rückenmarksgeweben wurden unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd fixiert, in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS), die 30% Rohrzucker enthält, eingeweicht, und zur Verwendung als Scheiben in 30 μm Dicke gefrier-geschnitten. Die ausgewählten Nervengewebeabschnitte wurden in einer NADPH-Lösung inkubiert und für 1–3 Stunden inkubiert, gewaschen und dann mit 1% Neutralrot wieder gefärbt.
Die statistische Analyse der Behandlungs- und Kontrollgruppen wurde unter Verwendung des T-Tests durchgeführt.
Ergebnisse:

Die Ergebnisse der nNOS-Aktivität in den Nervengeweben werden in Tabelle 2 und den 3 und 4 gezeigt. Tabelle 2. Auswirkungen der GASP auf das Überleben der motorischen Neuronen 14 Tage nach dem Abschneiden der lumbalen ventralen Wurzeln

	Kontrollgruppe (n = 5)	GASP-Behandlungsgruppe (n = 5)	P*
Anzahl der überlebenden motorischen Neuronen in der unverletzten (linken) Seite	13,69 ± 0,70	15,26 ± 0,30
Anzahl an nNOS-positiven Neuronen in der verletzten (rechten) Seite	1,41 ± 0,26	5,55 ± 0,60
%-nNOS-positiv in der verletzten (rechten) Seite**	10,36 ± 1,85	38,29 ± 4,37	<0,01

*: der p-Wert bezeichnet den Vergleich zwischen der Kontroll- und der GASP-Behandlungsgruppe
**: %-nNOS-positiv wurde als das Prozentverhältnis der Anzahl an nNOS-positiven Neuronen zu der der überlebenden motorischen Neuronen in der verletzten (rechten) Seite der ventralen Wurzeln bestimmt.

Wie in Tabelle 2 und den 3 und 4 gezeigt, war die Anzahl der überlebenden motorischen Neuronen (in Rot gefärbt) nach 14 Tagen nach dem Abschneiden der ventralen Wurzeln bei der unverletzten Seite der Kontrollgruppe ähnlich zu der der GASP-Behandlungsgruppe. Allerdings war die Anzahl an nNOS- positiven Neuronen (in Violett gefärbt) der Kontrollgruppe merklich geringer als die der GASP-Behandlungsgruppe. Wie in 3(B) und 3(D) gezeigt, gab es in der GASP-Behandlungsgruppe (D) mehr überlebende motorische Neuronen als die in der Kontrollgruppe (B). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die GASP positive Wirkungen beim Fördern des Überlebens der motorischen Neuronen, nachdem die Nerven der ventralen Wurzeln abgeschnitten wurden, aufwiesen.
Schlußfolgerung:
Es wurde gezeigt, dass die GASP beim Fördern des Überlebens der Neuronen nach einer Rückenmarksnervenverletzung infolge von Durchtrennung wirksam waren.
Beispiel 3
Wirkungen der GASP auf die Regenerierung verletzter Axone
Tiermodell:
In dieser Studie wurde ein Ratten-Ischiasnerv-Abschneide/Wiedernäh-Modell verwendet. Kurz gesagt wurde ein Abschnitt der rechten Seite des Ischiasnervs des Versuchstiers freigelegt und wie in 5 gezeigt abgeschnitten. Die Epineuriumschichten der zwei offenen Enden des Ischiasnervs wurden dann mikrochirurgisch zusammengenäht, um ein Tiermodell zu liefern, das Schnitt/Quetschungs-Verletzungsarten nachahmt. Die linke Seite des Ischiasnervs blieb unberührt, um als Vergleich zur verletzten Seite verwendet zu werden.
Methode:
Die Tiermodelle wurden wie in den Beispielen 1–2 oben vorbereitet und in 2 Gruppen aufgeteilt, die GASP-Behandlungs- und die Kontroll-Gruppen.
Die GASP (20 g) wurde bis zu einer Endkonzentration von 20% in 100 ml 0,5% Natriumcarboxymethylcellulose aufgelöst. Den Ratten in der GASP-Behandlungsgruppe wurden zweimal täglich mittels Sondenfütterung etwa 2 ml GASP-Lösung gefüttert. Die tägliche GASP-Dosis betrug 8 g/kg/Tag. Den Ratten in der Kontrollgruppe wurde zweimal täglich die gleiche Menge an 0,5% Natriumcarboxymethylcellulose gefüttert. Alle Ratten wurden unter den gleichen Bedingungen gehalten.
Fluorogold (FG), ein zurückgehender fluoreszierender Tracer, wurde verwendet, um die Regeneration der Axone zu verfolgen. 2,5 μl 3% FG-Lösung wurden unter Verwendung eines Mikroinjektors sowohl in die verletzten (rechten) als auch in die unverletzten (linken) Seiten innerhalb der Ischiasnerven injiziert. Bei der verletzten (rechten) Seite wurde FG 5 mm distal zur Verletzungsstelle injiziert. Dann wurden die L4 Rückenmärker aus den Versuchsratten entfernt, gefriergeschnitten und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. "FG%" wurde als das Prozentverhältnis der Anzahl an FG-positiven Neuronen an der verletzten Seite gegenüber derjenigen an der unverletzten Seite desselben Tiers berechnet.
Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des T-Tests ausgeführt.
Ergebnisse:

Die Ergebnisse der Axonregenerationsstudien unter Verwendung von FG sind in Tabelle 3 und in 6 gezeigt. Tabelle 3. Auswirkungen der GASP auf die Regeneration der verletzten Axone

FG-positive Neuronen	Kontrollgruppe (n = 5)	GASP-Behandlungsgruppe (n = 5)	P*
unverletzte (linken) Seite	18,27 ± 0,97	16,99 ± 0,96	>0,05
verletzte (rechten) Seite	3,37 ± 0,38	9,75 ± 0,64
P**	<0,01	<0,01	<0,01
FG% ***	17,89 ± 4,41	59,41 ± 3,47

*: der p-Wert bezeichnet den Vergleich zwischen der Kontroll- und der GASP-Behandlungsgruppe
**: der p-Wert bezeichnet den Vergleich zwischen der Anzahl an Neuronen in der unverletzten (linken) Seite und der verletzten (rechten) Seite innerhalb derselben Gruppe
***: FG% wurde als Prozentverhältnis der Anzahl an FG-positiven Neuronen in der verletzten (rechten) Seite zu der in der unverletzten (linken) Seite bestimmt.

FG ist ein zurückgehender fluoreszierender Tracer. Er wurde an der distalen Seite der Abschneide/Wiedernäh-Verletzung injiziert, folglich war Detektion der FG-gelabelten Neuronen in dem Rückenmarksbereich ein Hinweis für die Axonregeneration.
Wie in Tabelle 3 und 6 gezeigt, war die Anzahl an FG-gelabelten Neuronen in den unverletzten Stellen beider Gruppen ähnlich – im Gegensatz zur Anzahl der FG-gelabelten Neuronen in den verletzten Seiten beider Gruppen, die signifikant geringer war. Allerdings zeigten die FG-gelabelten Neuronen in der verletzten Seite der GASP-Gruppe eine signifikant größere Anzahl als die in der verletzten Seite der Kontrollgruppe.
Basierend auf dem Zählen der FG-gelabelten Neuronen an den verletzten und den unverletzten Seiten der Ischiasnerven kann die Regenerierungsrate (%) der Axone durch Teilen der Anzahl der FG-gelabelten Neuronen an der verletzten Seite des Ischiasnervs durch die Anzahl der FG-gelabelten Neuronen an der unverletzten Seite des Ischiasnervs in demselben Tier bestimmt werden. Gemäß dieser Berechnung betrug die Regenerierungsrate der Axone bei der Kontrollgruppe etwa 18% und bei der GASP-Behandlungsgruppe etwa 59%.
Schlußfolgerung:
Es wurde gezeigt, dass die GASP beim Behandeln von Quetschungsverletzungen des Rückenmarks, insbesondere beim Fördern der Regenerierung der Axone, wirksam waren.
Beispiel 4
Elektrophysiologische Wirkungen der GASP auf die Regenerierung der verletzten Axone
Methode:
Die Tiermodelle wurden wie in Beispiel 3 oben vorbereitet und behandelt.
Nach sechs Wochen Behandlung mit oder ohne GASP wurden die Ratten anästhesiert und die Ischias- und Suralnerven wurden freigelegt. Ein elektrischer Stimulator wurde mesial zur reparierten Stelle befestigt und die Aufzeichnungselektrode wurde an der distalen Seite angebracht. Nach der elektrischen Stimulation wurde der sich entlang des Nervs bewegende Impuls verfolgt und aufgezeichnet. Das gleiche Vorgehen wurde bei der unverletzten Seite wiederholt. Die Transduktionsgeschwindigkeiten der verletzten und unverletzten Ischiasnerven wurden bestimmt. Das Verhältnis der Transduktionsgeschwindigkeit der verletzten Seite zu der der der unverletzten Seite wurde als Marker für die Axonregeneration verwendet. Die Peak-zu-Peak-Werte der elektrischen Impulse, die sich in den verletzten und unverletzten Stellen entlang der Nerven bewegen, wurden bestimmt und als ein Indikator für die Axonregeneration verwendet.
Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des T-Tests durchgeführt.
Ergebnisse:

Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 und 7 gezeigt. Tabelle 4. Elektrophysiologische Auswirkungen der GASP auf die Regenerierung der verletzten Axone

Peak-zu-Peak-Wert[mV]	Kontrollgruppe (n = 5)	GASP-Behandlungsgruppe (n = 5)	P*
unverletzte (linke) Seite	14,44 ± 0,14	19,30 ± 0,15	>0,05
verletzte (rechte) Seite	0,74 ± 0,01	7,75 ± 0,09
P**	<0,01	<0,01	<0,01
%	5,13 ± 0,08	40,19 ± 0,51

*: der p-Wert bezeichnet den Vergleich zwischen der Kontroll- und der GASP-Behandlungsgruppe
**: der p-Wert bezeichnet den Vergleich zwischen der Anzahl an Neuronen in der unverletzten (linken) Seite und der verletzten (rechten) Seite innerhalb derselben Gruppe
***: "%" wurde als das Prozentverhältnis des in der verletzten (rechten) Seite gemessenen Peak-zu-Peak-Werts zu dem der unverletzten (linken) Seite bestimmt.

Nachdem der Ischiasnerv abgeschnitten wurde und seine äußeren Schichten zusammengenäht wurden, war die Transduktion eines elektrischen Impulses entlang der Nerven über die Stelle der Verletzung ein Hinweis für die Regeneration der Nervenaxone. Wie in Tabelle 4 und 7(A) und (B) gezeigt, waren die Transduktionen der elektrischen Impulse in den unverletzten Seiten beider Gruppen im Hinblick auf die Peak-zu-Peak-Werte und die Transduktionsgeschwindigkeit ähnlich. Allerdings hörte die Transduktion einer elektrischen Stimulation in der verletzten Seite der Kontrollgruppe fast vollständig auf (Tabelle 4, 7(C)). Im Vergleich dazu bewegte sich etwa 40% der elektrischen Stimulation entlang des Ischiasnervs über die Seite der Verletzung bei einer geringeren Geschwindigkeit an der verletzten Seite der GASP-Behandlungsgruppe. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die GASP-Behandlung in Ratten bei 8 g/kg/Tag für 6 Wochen zum Fördern der Axonregenerierung, nachdem der Ischiasnerv abgeschnitten wurde und die Außenschichten wieder zusammengenäht wurden, wirksam war.
Schlußfolgerung:
Es wurde gezeigt, dass die GASP beim Fördern der Axonregenerierung bei einer Rückenmarksverletzung infolge von Quetschung wirksam waren.
Beispiel 5
Wirkungen der GASP auf die Regenerierung der verletzten Axone
Methode:
Die Tiermodelle wurden wie in Beispiel 3 oben beschrieben vorbereitet und behandelt.
Nach 6 Wochen Behandlung mit oder ohne die GASP wurden die Wadenmuskeln (Musculus peronaeus longus) sowohl von den verletzten als auch den unverletzten Stellen jeder Ratte entfernt. Die isolierten Muskeln wurden gewogen und protokolliert. Die Muskelatrophie der isolierten Muskeln wurde bestimmt. Die isolierten Muskeln wurden dann mit Hämatoxylin und Eosin (H&E Farbe) zur Verwendung in histologischen Studien gefärbt .
Ergebnisse:
Es wurde die markierte Muskelatrophie und die Gewichtsabnahme in den Wadenmuskeln, die von der verletzten Seite der Kontrollgruppe isoliert wurden, beobachtet. Wie in 8(A) gezeigt, wies normales Wadenmuskelgewebe ein regelmäßiges, glattes und paralleles Muster auf. Der Wadenmuskel der Kontrollgruppe (8(B)) wies merkliche Unregelmäßigkeit auf, während der Wadenmuskel der GASP-Behandlungsgruppe ( 8(C)) den größten Teil des normalen Musters beibehielt. Dies legt nahe, dass die GASP die Wirkungen des Erhaltens des Wadenmuskels nach der Nervenverletzung aufwies.
Schlußfolgerung:
Es wurde gezeigt, dass die GASP den Muskelerhalt nach einer Rückenmarks-Nervenverletzung förderten.
Beispiel 6
Wirkungen der GASP auf die Regeneration von Nervenfasern in den verletzten Axonen
Methode:
Die Tiermodelle wurden wie in Beispiel 3 oben vorbereitet und behandelt.
Nach 6 Wochen Behandlung wurden die Ischiasnervenaxone sowohl von den verletzten als auch von den unverletzten Seiten jeder Ratte entfernt. Die isolierten Nervengewebe wurden fixiert, geschnitten und dann mit Mallorys Farbe gefärbt.
Ergebnisse:
Wie in 9 gezeigt, zeigt rote Farbe Nervenfaserregeneration an, welche hauptsächlich in dem Nervengewebe der GASP-Behandlungsgruppe (9(B)) und merklich weniger in dem der Kontrollgruppe (9(A)) gesehen wurde. Dies deutet darauf hin, dass die GASP beim Fördern der Nervenfaserregeneration in Ratten, nachdem der Ischiasnerv abgeschnitten wurde, gefolgt vom Wieder-Nähen der äußeren Schichten des Ischiasnervs, wirksam war.
Schlußfolgerung:
Es wurde gezeigt, dass die GASP beim Fördern der Nervenfaserregeneration nach einer Nervenquetschungsverletzung wirksam waren.
Beispiel 7
Präparierung des spinalen Halbschnitt-Tiermodells, BrdU-Injektion und GASP-Behandlung
Tier-Einteilung:
Sechsundzwanzig (26) weibliche SD-Ratten (150–180 g) wurden vom Versuchstier-Zentrum der Sun Yat-sen Universität erworben. Die Tiere wurden in drei Gruppen aufgeteilt: Die normale Kontrollgruppe (2 Ratten), die verletzte Kontrollgruppe (12 Ratten: 2 Ratten in der 1-Tagesgruppe, jeweils 5 Ratten in den 2-Wochen- und 4-Wochen-Gruppen) und die verletzte Behandlungsgruppe (12 Ratten: 2 Ratten in der 1-Tagesgruppe, jeweils 5 Ratten in den den 2-Wochen- und 4-Wochen-Gruppen).
Vorbereitung des Tiermodells:
1% Natriumpentobarbital (35–40 mg/kg) wurde intraperitoneal injiziert, um die Ratten in der verletzten Kontrollgruppe und der verletzten Behandlungsgruppe zu anästhesieren. Die Haut auf dem Rücken der Ratten wurde an der Mittellinie aufgeschnitten. Der Thorax (T) 12 Spinalabschnitt wurde unter einem Operationsmikroskop freigelegt und der Halbschnitt der rechten Seite des Rückenmarks wurde durchgeführt. Nach der Operation wurde Penicillin intramuskulär injiziert.
BrdU-Injektion und -Behandlung:
Die Tiere in allen drei Gruppen erhielten für 10 aufeinanderfolgende Tage zweimal täglich eine intraperitonale Injektion von BrdU (50 mg/kg). Nach der Rückenmarksverletzung wurde den Tieren in der verletzten Behandlungsgruppe zweimal täglich eine GASP-Lösung von 8 g/kg/Tag über den Magen verabreicht. Der verletzten Kontrollgruppe wurde eine 5%-Natriumcarboxycellulose-Lösung (d. h. das Lösungsmittel in der GASP-Lösung) über den Magen verabreicht. Die GASP wurden von der Enhan Technology Holdings International Co., Ltd. bereitgestellt. Herkömmlicherweise wird das Thymidin-Analogon 5-BrdU verwendet, um die DNA-Synthese und Zellproliferation zu untersuchen. Es ist ein nichtradioaktives Molekül. Während der S-Phase (Synthese) des Zellwachstums, wo der zelluläre DNA-Gehalt sich zwischen den G1 und G2 Zellphasen verdoppelt, wird BrdU in der DNA stöchiometrisch durch Thymidin ersetzt. Eine Messung der aufgenommenen BrdU hängt mit dem neuen DNA-Gehalt zusammen, d. h. mit dem Zustand oder der Position der Zellen in der S-Phase. Folglich hängt die Detektion von BrdU-substituierter DNA funktionell mit der Synthese von DNA während der S-Phase der Zellzyklen zusammen.
Beispiel 8
Perfusion, Fixierung und Probennahme
Die Tiere in den jeweiligen Gruppen wurden am 1. Tag, nach 2 Wochen und nach 4 Wochen nach der Rückenmarksverletzung durch eine intraperitonale Injektion von 1% Natriumpentobarbital anästhesiert. Der Brustkorb der anästhesierten Tiere wurde geöffnet und es wurde ein Katheter vom linken Ventrikel zur Aorta eingeführt. Zuerst wurde das Tier schnell mit physiologischer Salzlösung durchströmt, dann folgte die Perfusion mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (pH 7,4), um das Gewebe der Tiere zu fixieren. Der T8-L1 Spinalabschnitt wurde geerntet, in eine frische Fixierlösung gelegt und vier Stunden fixiert und dann über Nacht bei 4°C in eine 30% Saccharose-Lösung gelegt. Die T10, T11, T12, T13 und L1 Spinalabschnitte wurden fortlaufend in Querschnitte in Scheiben von 30 μm Dicke gefrier-geschnitten.
Beispiel 9
Fluoreszenzimmunohistochemie
Die Querschnittsschnitte der Rückenmärker wurden zuerst dreimal mit 0,01 M PBS gespült, wobei das Spülen jedesmal etwa 5 Minuten dauerte. Die Spinalschnitte wurden dann 30 Minuten bei 37°C in 2 N HCl, gefolgt von 0,1 M Natriumborat-Puffer (pH 8,3) für 15 Minuten und 20,2% Triton X-100 Lösung für 20 Minuten bei 37°C, eingeweicht. Die Spinalschnitte wurden dann für 20 Minuten bei 37°C in normalem Schafserum inkubiert.
Maus-anti-BRDU Primärantikörper wurden tropfenweise zugegeben, und die Spinalschnitte wurde weiter 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Spinalschnitte wurden dreimal mit 0,01 M PBS gespült, wobei das Spülen jedesmal 5 Minuten dauerte. Dann wurde der byotinyllierte Sekundärantikörper tropfenweise zugegeben, und die Spinalschnitte wurden 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Spinalschnitte wurden dreimal mit 0,01 M PBS gespült, wobei das Spülen jedesmal 5 Minuten dauerte. Die SABC-cys3 Fluoreszenzkomplex-Lösung wurde tropfenweise zugegeben, und die Spinalschnitte wurden 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Spinalschnitte wurden dreimal mit 0,01 M PBS gespült, wobei das Spülen jedesmal 5 Minuten dauerte. Als Negativ-Kontrolle wurde der Primärantikörper weggelassen und durch PBS ersetzt. Der Rest der Vorgehensweisen waren die gleichen wie oben beschrieben.
Nach Abschluß des BrdU-Färbens wurden die Spinalschnitte jeder Ratte in 4 aufgeteilt, wobei jeder jeweils mit den fluoreszierenden immunohistochmischen Farben Nestin (Nervenstammzellenmarker), NF (Neuronenmarker), Oligodendrozytin (Oligodendrozyten-Marker) und GFAP (Astrogliazellen-Marker) behandelt wird.
Die Zahl der BrdU-positiven Zellen im Ependym des Zentralkanals der quergeschnittenen Spinalschnitte wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 10 × 20 Vergrößerung gezählt. Für jede Ratte wurden zehn Spinalschnitte gezählt, um die durchschnittliche Anzahl BrdU-positiver Zellen im Ependym des Zentralkanals pro Spinalschnitt zu bestimmen. Die berechneten Ergebnisse jeder Gruppe wurden als die durchschnittliche Anzahl BrdU-positiver Zellen im Ependym des Zentralkanals ± Standardabweichung ausgedrückt. Der t-Test der durchschnittlichen Anzahl von zwei Proben wurde durchgeführt.
Ergebnisse der Beispiele 7–9:
1. Normales Ependym im Rückenmarkzentralkanal
In den spinalen Querschnitten der Nacken- und Thoraxbereiche der normalen Kontrollgruppe erschienen die ependymalen Zellen des Zentralkanals als runder Umriß, im lumbalen Bereich jedoch als ovaler Umriß. Zwecks Lokalisierung der Proliferation der ependymalen Zellen wurden hauptsächlich BrdU-positive Zellen im Ependym gezählt. Dies war so, weil die meisten der BrdU-positiven Zellen am Ependym lokalisiert waren (10). Nur wenige BrdU-positive Zellen waren in der spinalen weißen Substanz und grauen Substanz verteilt. Die Detektion der Nestin-Expression kann zur Bestimmung der Zellauszahlen der neuronalen Stammzellen führen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich nur eine geringe Anzahl an Nestin-positiven Zellen im Ependym befinden.
2. Ependymzell-Proliferation und Nestin-Expression im Rückenmarkzentralkanal nach spinalem Halbschnitt
1 Tag nach der spinalen Verletzung verdickte sich die ependymale Zellschicht des Zentralkanals. Nach spinalem Halbschnitt nahmen die BrdU-positiven Zellen merklich zu (11), und in den verletzten Tieren wurde eine größere Anzahl BrdU-positiver Zellen als in den normalen Kontroll-Tieren beobachtet. Währenddessen wurden in der spinalen weißen Substanz und grauen Substanz nach spinalem Halbschnitt mehr BrdU-positive Zellen beobachtet als die in der normalen Kontrollgruppe gesehenen. Dieses Phänomen wurde auch in einigen spinalen Abschnitten nahe der verletzten Seite beobachtet. Nach 2 Wochen nach der Rückenmarksverletzung war die Anzahl BrdU-positiver Zellen im Ependym geringer als die am 1. Tag nach spinaler Verletzung gesehenen, aber immer noch höher als die der normalen Kontrollgruppe nach 2 Wochen. Währenddessen gab es mehr BrdU-positive Zellen der Tiere in der verletzten Behandlungsgruppe als die in der verletzten Kontrollgruppe. 4 Wochen nach der spinalen Verletzung wurden im Ependym weniger BrdU-positive Zellen gesehen, aber deren Anzahl war immer noch signifikant höher als die der normalen Kontrollgruppe. Die Anzahl BrdU-positiver Zellen der verletzten Behandlungsgruppe war höher als die der verletzten Kontrollgruppe (Tabelle 1).
Folglich wurden am 1. Tag, nach 2 Wochen und nach 4 Wochen nach der spinalen Verletzung BrdU-positive Zellen im Ependym des Rückenmarkzentralkanals beobachtet. Bei fortschreitender Zeit nahm die Anzahl BrdU-positiver Zellen ab. Die BrdU-positiven Zellen existierten nicht nur im Ependym des Zentralkanals, sondern auch in der spinalen weißen Substanz und der grauen Substanz. Je näher an der verletzten Stelle, desto mehr BrdU-positive Zellen gab es im Ependym. Tabelle 5. Durchschnittliche Anzahl der BrdU-positiven Zellen (x ± s) im Ependym des Rückenmarkzentralkanals 4 Wochen nach spinalem Halbschnitt

Gruppe Anzahl der Ratten durchschnittliche Anzahl BrdU-positiver Zellen

normale Kontrolle 2 18,17 ± 2,81

verletzt/Kontrolle 5 29,91 ± 3,68

verletzt/Behandlung 5 45,67 ± 3,62

t-Test: Paarweiser Vergleich zwischen den 3 Gruppen, P < 0,05

Am 1. Tag nach dem spinalen Halbschnitt vermehrten sich die Nestin-positiven Zellen im Ependym des Zentralkanals. Es gab auch Nestin-positive Zellen in der spinalen weißen Substanz und der grauen Substanz (12). Nach 2 Wochen und 4 Wochen nach der Rückenmarksverletzung gab es nur eine geringe Anzahl Nestin-positiver Zellen im Ependym des Zentralkanals, während die meisten in der spinalen weißen Substanz und in der grauen Substanz verteilt waren. In den spinalen Abschnitten nahe der verletzten Stelle wies die weiße Substanz ventral zum Halbschnitt der verletzten Stelle radiale Nestin-positive Vorsprünge auf. Auch Nestin-positive Zellkörper und deren Vorsprünge wurden in anderer weißer Substanz gesehen (13).
Nach 2 Wochen und nach 4 Wochen nach der spinalen Verletzung verdickte sich die ependymale Zellschicht des spinalen Zentralkanals der verletzten Behandlungsgruppe, die mehr BrdU-positive Zellen als die der verletzten Kontrollgruppe aufwies. Durch die Ergebnisse immunohistochemischer Doppelfärbungen mit BrdU und Nestin, BrdU und NF, BrdU und Oligodendrozytin und BrdU und GFAP wurde herausgefunden, dass es im Ependym des Zentralkanals keine positiven Zellen mit Doppelfärbungen gab. Allerdings gab es in der spinalen weißen Substanz der verletzten Behandlungsgruppe eine geringe Anzahl positiver Zellen mit Doppelfärbungen von BrdU und Nestin (14A und 14B), BrdU und NF (15A und 15B), BrdU und Oligondendrozytin (16A und 16B) und BrdU und GFAP (17A und 17B).
Diskussion:
Die obige Untersuchung bestätigte, dass die ependymalen Zellen des Zentralkanals 1 Tag nach dem spinalen Halbschnitt proliferierten, aber die Anzahl an proliferierten Zellen mit fortschreitender Zeit abnahm. Je näher an der spinalen verletzten Seite, desto mehr Proliferation der ependymalen Zellen gab es. Proliferierte Zellen existierten nicht nur in den ependymalen Zellen des Zentralkanals, sondern auch in der spinalen weißen Substanz und der grauen Substanz. Währenddessen exprimierten einige proliferierte Zellen Nestin, was darauf hinweist, dass diese Zellen nicht in neuronale Stammzellen differenzierten. Diese Befunde stimmten mit dem Bericht von Yammamoto et al., Exp. Neurol., 2001; 172(1): 115–127) überein, dass Nervenstammzellen nicht nur im Ependym des spinalen Zentralkanals existierten, sondern auch in anderen Teilen des Rückenmarks. Zudem war die Anzahl proliferierter Ependymalzellen des Zentralkanals in Ratten der verletzten Behandlungsgruppe höher als die der verletzten Kontrollgruppe, was darauf hindeutet, dass GASP die Wirkungen des Förderns der Zellproliferation der Ependymalzellen des Zentralkanals im verletzten Rückenmark aufweisen.
Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung bestätigten, dass eine kleine Anzahl proliferierter Ependymalzellen nach der spinalen Verletzung in Nervenstammzellen, nervenähnlichen Zellen, Oligodendrozyten-ähnliche Zellen und Astroglia-ähnliche Zellen differenzieren, was möglicherweise die Reparatur des verletzten Rückenmarks einschloss.
Schlußfolgerung:
Die GASP sind beim Fördern der Proliferation und/oder Differenzierung von Nervenstammzellen in Ratten, die eine spinale Rückenmarksverletzung aufweisen, wirksam.
Während die Erfindung durch Beispiele und im Hinblick auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es verständlich, dass die Erfindung nicht auf die offenbarten Ausführungsformen begrenzt ist.

Claims

Verwendung von Sporoderm-gebrochenen, Keimungs-aktivierten Ganoderma-Sporen (GASP) zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines Säugers mit Rückenmarksverletzung.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die GASP zur oralen Verabreichung an den Säuger sind.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die GASP zur oralen Verabreichung an den Säuger innerhalb 1 Tages der Rückenmarksverletzung sind.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Rückenmarksverletzung durch irgendeine der folgenden Gegebenheiten verursacht wird: Komprimierung oder Trennung des Rückenmarks; ein Trauma; Trennung einer ventralen Wurzel des Rückenmarks; Trennung oder Quetschung des Ischiasnervs; eine Krankheit; Schädigung oder Tod von Neuronen innerhalb des verletzten Rückenmarks; und Quetschung von Axonen mit verletztem Rückenmark.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die Krankheit Polio, Spina bifida oder Friedreichs Ataxie ist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die Neuronen motorische Neuronen sind.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Menge an GASP für das Medikament 0,5–15 g pro kg Körpergewicht pro Tag beträgt.
Verwendung gemäß irgendeinem der vorangehenden Ansprüche zum Verbessern des Überlebens von Neuronen nach einer Rückenmarksverletzung.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Neuron ein motorisches Neuron im verletzten Rückenmark ist.
Verwendung gemäß irgendeinem der vorangehenden Ansprüche zum Fördern der Axonregenerierung bei einer Rückenmarksverletzung.
Verwendung gemäß irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Behandlung eines Säugers mit Rückenmarksverletzung zum Fördern einer Proliferation und/oder einer Differenzierung neuronaler Stammzellen in einem Säuger ist.
Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die neuronalen Stammzellen zu irgendeiner der folgenden Zellarten differenziert werden: Neuronen, Astrocyten; und Oligodendrocyten.