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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung für die Gelelektrophorese,
vor allem für
die Durchführung
einer horizontalen Elektrophorese mit Acrylamid-Gelen. Die vorliegende
Erfindung bezieht sich ferner auf die gefahrlose Handhabung und
die Entsorgung derartiger Gele.
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Hintergrund
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Die
Gelelektrophorese, die allgemein verwendetes Verfahren auf dem Gebiet
der molekularbiologischen Forschung ist, stellt eine Technik dar,
die dafür
vorgesehen ist, DNA-, RNA- und Proteinmoleküle auf der Basis ihres Gewichts,
ihrer Größe und ihrer
Form zu trennen, zu identifizieren und zu reinigen. Diese Technik,
deren Durchführung
einfach und schnell ist, wird ausgeführt, indem zunächst ein
Gel hergestellt wird. Wenn das Gel fertig ist, wird es in eine Gelkammer
eingebracht, in eine Pufferlösung eingetaucht
und mit einer Stromquelle verbunden. Sobald die Moleküle durch
das elektrische Feld, das sich in dem Gel bildet, stimuliert werden,
wandern sie mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Gelmatrix.
Die Wanderungsgeschwindigkeit jeder Molekülsorte hängt von der elektrischen Ladung,
der Größe und der
Form der Moleküle
sowie von der Zusammensetzung des Gels ab. Am häufigsten wandern die kleineren
Moleküle
mit einer größeren Geschwindigkeit
durch die Matrix als die Moleküle
mit einer größeren Größe. Im Allgemeinen
wird eine ausreichende Puffermenge (typischerweise TAE, TBE oder
Proteinlaufpuffer) verwendet, um zu gewährleisten, dass sich das elektrische
Feld in dem Gel ausbildet und dass das Gel mit dem Puffer bedeckt
ist, wodurch das Gel während
der Elektrophorese vor dem Austrocknen ge schützt wird. Wenn eine Probe,
die die interessierende Molekülsorte
enthält,
in das Gel geladen wird, wird typischerweise ein Ladefarbstoff verwendet.
Der Ladefarbstoff ermöglicht
normalerweise die leichte Sichtbarmachung der Lösung während des Ladevorgangs, und
außerdem
ermöglicht
er es, die Dichte der Probe zu erhöhen, um zu gewährleisten,
dass die Probe vollständig
und gleichmäßig in einer
entsprechenden Tasche in dem Gel angeordnet wird, und er ermöglicht weiterhin
die Sichtbarmachung der Wanderung während der Elektrophorese.
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Die
am häufigsten
verwendeten Gele werden entweder mit Agarose oder mit Acrylamid
hergestellt, die beide in variierenden Formen, Größen und Dicken
bereitgestellt werden können.
Der entscheidende Faktor hinsichtlich der Wahl des speziellen Gels
und seiner physikalischen Attribute hängt im Allgemeinen mit der
Größe der zu
trennenden Moleküle zusammen.
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Acrylamid
wird üblicherweise
für relativ
kleine Moleküle,
wie Proteine, ausgewählt,
während Agarose
für größere Moleküle, wie
DNA oder RNA, verwendet wird. Unabhängig davon ist Agarose die bevorzugte
Wahl für
die horizontale Gelelektrophorese, die typischerweise in offene
Schlitten gegossen wird, während
Acrylamid typischerweise nur für
die vertikale Gelelektrophorese verwendet wird, das zwischen zwei
Glasplatten gegossen wird, und es wird auf dem Fachgebiet nicht
für die
horizontale Elektrophorese verwendet. Der Grund hierfür besteht
darin, dass Acrylamid nicht dazu neigt, eine mechanisch stabile
Taschenstruktur zu liefern, weil das Acrylamid-Gel sehr elastisch
ist und weil seine Dicke sehr gering ist (bis zu 1,5 mm), und wenn
es für
die horizontale Gelelektrophorese verwendet wird, neigen benachbarte
Taschen dazu, einzubrechen bzw. nachzugeben, wodurch jegliche Möglichkeit
zunichte gemacht wird, darin Proben zu laden. Wenn Acrylamid-Gele
bei der vertikalen Elektrophorese verwendet werden, wird die Abmessung
der Taschen in Richtung der Tiefe mit dem elektrischen Feld ausgerichtet,
und relativ tiefe und schmale Taschen können bereitgestellt werden,
die in Bezug auf die benachbarten Taschen einen im Wesentlichen
genauen Abstand aufweisen. Außerdem
werden bei der vertikalen Elektrophorese die Taschen zwischen zwei
parallelen, beabstandeten vertikalen Glasplatten erzeugt, die dadurch,
dass sie zwei gegenüberliegende
Wände für jede Tasche
bilden, es möglich
machen, dass die Taschen stabil bleiben. Die vertikale Gelelektrophorese
ist jedoch nicht ohne Nachteile. Es ist beispielsweise einfacher,
Proben in horizontale Geltaschen als in vertikale Geltaschen einzubringen.
Es ist außerdem
schwierig, vertikale Acrylamid-Gele zu gießen, insbesondere Gradientengele,
und für
die Proben werden spezielle Pipettenspitzen für die Probenzufuhr benötigt. Bei
der vertikalen Gelelektrophorese befindet sich ein Pufferbehälter in
einem vertikalen Abstand zu dem anderen Pufferbehälter auf,
und es kommt häufig
vor, dass fließender
Puffer von dem oberen Behälter
in den unteren Behälter
rinnt; gegebenenfalls wird der obere Pufferbehälter entleert, wodurch die
elektrische Verbindung zwischen den oberen Elektroden und dem Gel
unterbrochen wird.
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Nicht
polymerisiertes Acrylamid stellt ein starkes Neurotoxin dar und
wird durch die Haut absorbiert. Die Wirkungen von Acrylamid sind
kumulativ. Auch wenn polymerisiertes Acrylamid als nichttoxisch
eingestuft wird, sollte es dennoch wegen der Möglichkeit, dass es kleine Mengen
an nicht polymerisiertem Acrylamid enthalten kann, mit Sorgfalt
gehandhabt werden. Während
der Handhabung und wenn die Gele nach der Verwendung entsorgt werden,
muss demnach der Kontakt mit den Anwendern strikt vermieden werden,
insbesondere wenn das Acrylamid nicht polymerisiert ist und/oder
in Pulverform vorliegt.
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Es
ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung
und ein Verfahren anzugeben, mit denen die Einschränkungen
der Elektrophoresevorrichtungen und -verfahren des Stands der Technik überwunden
werden.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Gel auf
Acrylamid-Basis für
die horizontale Elektrophorese anzugeben.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung
anzugeben, die die gefahrlose Handhabung und Entsorgung derartiger
Gele, die gesundheitsschädliche
Substanzen enthalten können,
ermöglicht.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung
anzugeben, deren Verwendung einfach ist.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung
anzugeben, die mechanisch relativ ist und die demnach ökonomisch
hergestellt werden kann.
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Diese
und andere Aufgaben werden gelöst, wie
dies in den Ansprüchen
der vorliegenden Erfindung dargelegt wird, indem ein vorgefertigtes
Gel für die
horizontale Elektrophorese, vor allem eine geschlossene Einwegkassette
bzw. wegwerfbare Kassette mit einem vorgefertigten Gel für die horizontale Elektrophorese
angegeben wird. Die Kassette ermöglicht
vor allem die Verwendung von Acrylamid-Gelen bei der horizontalen
Elektrophorese. Dies wird erreicht, indem ein quer angeordneter
Streifen aus Agarose im ionischen Kontakt mit dem Hauptkörper des
Acrylamid-Gels innerhalb der Kassette durch Gießen vorgefertigt wird. Der
Agarosestreifen ermöglicht
die Bildung stabiler Taschen darin (beispielsweise mit Hilfe eines
Kamms) für
das Einbringen von Proben. Eine derartige Agarose/Acrylamid-Hybridgel kombination
kann in situ von den Anwendern oft nur unter Schwierigkeiten durch
Gießen
hergestellt werden, und der Acrylamidanteil bringt während der Handhabung
und bei der Entsorgung des Gels Sicherheitsprobleme mit sich. Die
vorliegende Erfindung bietet den Anwendern demnach weiterhin beträchtliche
Vorteile, die Acrylamid-Gele
für die
horizontale Elektrophorese verwenden wollen, da die Kassette, hergestellt
mit einem vorgefertigten Acrylamid-Gel und einem vorgefertigten
Agarose-Gel, die in der Kassette enthalten sind, bereitgestellt
wird.
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Nach
einem anderen Aspekt der Erfindung umfasst die Kassette mindestens
einen und vorzugsweise ein Paar von Agarosestopfen, einen an jedem in
Längsrichtung
der Kassette vorhandenen offenen Ende. Die Stopfen isolieren die
Acrylamid-Gele im Wesentlichen vom Bereich außerhalb der Kassette, wodurch
die Möglichkeit
eines Kontakts von Menschen mit dem Acrylamid in der Kassette minimiert wird.
Dies stellt ein wichtiges Sicherheitsmerkmal dar, vor allem im Hinblick
auf die Möglichkeit,
die Kassette zu entsorgen, wodurch das Hantieren mit toxischen Substanzen
minimiert wird.
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In
der bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Kassette eine gehäuseartige
Konstruktion, die einen unteren flachen Boden und vier vertikale Wände, die
mit dem Boden an dessen Rand verbunden sind, und einen oberen Deckel,
der auf den vertikalen Wanden montiert werden kann, aufweist, wodurch
eine Gelkammer definiert wird, in die vorab ein Gel gegossen werden
kann. Die Kassette umfasst außerdem Öffnungen
an zwei gegenüberliegenden Enden
des unteren Bodens, die die ionische Verbindung zwischen dem Gel
und einer Elektrolytlösung ermöglichen,
in die die Kassette teilweise eingetaucht werden kann. Die Öffnungen
befinden sich vorzugsweise in hohlen Beinen, die sich über die Querlänge der
Kassette an den beiden in Längsrichtung
vorhandenen Enden der Kassette erstrecken, wobei die Beine ein Gel
in ionischer Verbindung mit dem Hauptkörper des Gels innerhalb der
Kassette enthalten. Dieser Aufbau ist speziell an die Verwendung
der Kassette mit Standardionenaustauschkammern angepasst. Ein Agarose/Acrylamid-Hybridgel ist
innerhalb der Kammer für
die Durchführung
der horizontalen Elektrophorese vorhanden, und in den Beinen ist
ein Agarose-Gel vorhanden, das für
die ionische Verbindung zwischen dem Hybridgel und den äußeren Pufferlösungen sorgt
und das gleichzeitig eine Sicherheitsbarriere zwischen dem Acrylamid-Gel
innerhalb der Kassette und dem Bereich außerhalb der Kassette sorgt.
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US 3,888,759 offenbart eine
Gelkassette, die eine im Wesentlichen kammerartige Konstruktion aufweist,
die an jedem in Längsrichtung
vorhandenen Ende der Kassette ein nach unten hervorstehendes, sich
in Querrichtung erstreckendes hohles Bein aufweist. Die Vorrichtung
scheint wiederverwendbar zu sein, wodurch dem Anwender verschiedene
Wahlmöglichkeiten
gegeben werden, und es scheint dem Anwender zugedacht zu sein, das
Gel jedes Mal zu gießen,
anstatt dass eine vorgefertigte Einheit bereitgestellt wird. Es
gibt jedoch keine Offenbarung und keinerlei Hinweis für die Bereitstellung
eines Hybridgels, das die horizontale Elektrophorese mit einem Acrylamid-Gel ermöglicht.
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US 5,443,704 offenbart eine
im Wesentlichen kammerartige Behälterstruktur
für ein
Elektrophoresegel, die mehr als ein darin eingebrachtes vorgefertigtes
Gel enthält.
Die verschiedenen Gele werden jedoch in einer Stapelanordnung bereitgestellt, mit
der die Vorteile der vorliegenden Erfindung nicht erhalten werden,
zumindest nicht hinsichtlich der Möglichkeit, ein Acrylamid-Gel
für die
horizontale Elektrophorese in Kombination mit einem benachbarten
Agarosestreifen zu verwenden, der dann Taschen enthält.
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US 5,064,769 offenbart ein
Gel für
den Immunoassay einer einzigen Proteinsorte, in dem horizontale
Gel einen ersten Teil umfasst, der aus einem Acrylamid-Gel hergestellt
ist, das einen Agaroseanteil (0,7 %) enthält, der ausreichend ist, um
die Erzeugung von stabilen Taschen darin zu ermöglichen. Der erste Teil des
Gels schließt
sich an einen zweiten Teil an, der aus einem Agarose-Gel hergestellt
ist. Das Acrylamid-Gel wird in der angegebenen Literaturquelle Druckschrift
nur verwendet, um die Diffusionseffekte in den Taschen zu beseitigen,
und es wird weder verwendet noch kann es erfolgreich verwendet werden,
um die Taschen zu erzeugen – dies
wird durch die 0,7 % Agarose bewerkstelligt. Die Verwendung des
Agarose-Gels in dem zweiten Teil der Gelkombination ist wohl bekannt
für die
horizontale Elektrophorese. Die Gelanordnung, die durch diese Literaturquelle
bereitgestellt wird, stellt faktisch den entgegengesetzten Weg zu
der vorliegenden Erfindung dar und ist somit eine Lehre, die in
eine andere Richtung als die vorliegende Erfindung führt. Es
gibt weder eine Offenbarung noch einen Vorschlag hinsichtlich der
Verwendung von Acrylamid für
die horizontale Gelelektrophorese oder hinsichtlich der Verwendung
von Agarose zusammen mit Acrylamid für die Herstellung der Taschen.
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In
US 3,930,983 werden eine
Anordnung und ein Verfahren für
den Nachweis von Antigenen offenbart, in der eine Trägerplatte
mit einem Agar oder Agarose als Matrix in aufeinander folgenden
Gelstreifen beschichtet wird. Es gibt jedoch weder eine Offenbarung
noch einen Vorschlag, dass verschieden vom ersten Streifen, der
die Taschen enthält,
die übrigen
Streifen aus Acrylamid-Gel anstelle von Agarose hergestellt werden
sollten. Vielmehr sieht es so aus, dass das Gel für alle Streifen
das gleiche Gel sein sollte, wobei die einzige Variable in dem monospezifischen
Antiserum besteht, das in diesen verschiedenen Streifen enthalten
ist.
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US 5,582,702 bezieht sich
auf ein in sich abgeschlossenes Elektrophoresegerät, das ein
Gehäuse
umfasst, das einen Gelkörper
enthält,
der zusammen mit Ionenaustauschmatrizes und Elektroden, die mit
einer äußeren Spannungsquelle
verbunden werden können,
in dem Gehäuse
angeordnet ist. Das Gerät
ist demnach mit existierenden Ionenaustauschkammern, die gegenwärtig für die horizontale Elektrophorese
verwendet werden, nicht allgemein kompatibel. Auch wenn in dieser
Druckschrift angegeben wird, dass das Gel aus Agarose oder Acrylamid
bestehen kann, gibt es weder eine Offenbarung noch einen Vorschlag,
wie das Problem der Unversehrtheit der Taschen, auf das man bei
Acrylamid-Gelen trifft, wenn versucht wird, diese für die horizontale
Elektrophorese zu verwenden, überwunden werden
kann. Dieses Problem wird vor allem durch diese Druckschrift nicht
angesprochen, und es gibt weder eine Offenbarung noch einen Vorschlag,
wie es überwunden
werden kann, und noch weniger gibt es eine Offenbarung oder einen
Vorschlag in Richtung der Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung.
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WO 95/20155 betrifft einen
Probenhalter in der Form einer Tasche, in den eine Probe und ein erstes
geschmolzenes Gel eingebracht werden. Wenn sich das Gemisch aus
erstem Gel und Probe verfestigt hat, wird der Probenhalter gegen
ein Ende einer Platte aus einem zweiten Gel gedrückt, wodurch das verfestigte
Gemisch aus dem ersten Gel und der Probe in den ionischen Kontakt
mit dem zweiten Gel gebracht wird. Zu keinem Zeitpunkt wird das
in verfestigter Form vorliegende erste Gel mit dem zweiten Gel in
Kontakt gebracht, bevor die Probe eingebracht wird. Das erste Gel
ist demnach in keiner Weise daran angepasst, die Probe aufzunehmen,
wenn es im verfestigten Zustand vorliegt, und daher wird die vorliegende
Erfindung weder offenbart noch nahe gelegt. Das Verfahren und die
Vorrichtung, die durch das Patent offenbart werden, erfordern immer
noch, dass das erste Gel (vermischt mit der Probe) gegossen wird,
und sie erfordern die weitere Handhabung des ersten Gels, im Gegensatz
zur vorliegenden Erfindung, in der das erste Gel und das zweite
Gel vorab durch Gießen
angefertigt werden können
und dann (wenn sie verfestigt sind) dafür vorbereitet sind, Proben,
typischerweise in Taschen in dem ersten Gel, aufzunehmen.
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WO 99/30145 betrifft eine
mit Schlitzen versehende Elektrophoresegelzusammensetzung und Verfahren
zur Verwendung dieser Zusammensetzung für die Bereitstellung eines
mehrlagigen Gels für
die vertikale Gelelektrophorese. Das Problem der Erzeugung von stabilen
Probentaschen für
die horizontale Elektrophorese in einem Acrylamid-Gel wird nicht
angesprochen und es wird auch keine Lösung für dieses Problem angegeben.
Genauer wird ein Hybridgel gemäß der vorliegenden
Erfindung weder offenbart noch vorgeschlagen, statt dessen wird
nur eine mit Schlitzen versehene Gelstruktur offenbart, die mindestens
drei Schichten aufweist: zwei erste Gelschichten auf beiden Seiten
einer mit Schlitzen versehenen zweiten Gelschicht.
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EP 471949 offenbart ein Kapillarrohr
für die Durchführung der
Kapillarzonenelektrophorese. Das Rohr wird abgeändert, indem eine Polystyrolfritte
eingeführt
wird, die das Rohr in eine stromabwärts gelegene freie Zone und
eine stromaufwärts
gelegene Zone, die ein Polyacrylamidstapelungsgel enthält, aufteilt.
Der Gelpfropfen hat die Funktion eines Filters, um die Proben vorzubehandeln,
die in der freien Zone des Rohrs analysiert werden sollen.
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WO 92/17259 beschreibt ein
Verfahren für den
Nachweis eines interessierenden gelösten Stoffs in einem Abwasserstrom.
Eine Probe, die das aufzutrennende Gemisch enthält, wird durch ein erstes System
geleitet, das imstande ist, die Bestandteile des Gemischs aufzutrennen,
und ein Detektor liefert einen ersten Ausgabewert, der die zeitliche
und/oder räumliche
Abfolge der Bestandteile beschreibt, die das erste System verlassen.
Der Abwasserstrom wird dann durch ein zweites System geleitet, das
imstande ist, einen interessierenden gelösten Stoff aus dem Abwasser
zu extrahieren, und ein Detektor liefert einen zweiten Ausgabewert,
der die zeitliche und/oder räumliche
Abfolge der Bestandteile beschreibt, die das zweite System verlassen,
die den interessierenden gelösten
Stoff nicht mehr umfassen. Der interessierende gelöste Stoff
kann dann in dem ersten Ausgabewert nachgewiesen werden, indem dieser
mit dem zweiten Ausgabewert verglichen wird. Dieses Verfahren bezieht
sich demnach auf den Nachweis einer Substanz in einem ersten zu
trennenden System, indem ein paralleles zweites zu trennendes System
eingesetzt wird.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein verfestigtes Hybridgel zur Verwendung
in einem Elektrophoreseverfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass
es mindestens einen verfestigten ersten Gelanteil benachbart zu
mindestens einem verfestigten zweiten Gelanteil umfasst, wobei der
verfestigte erste Gelanteil imstande ist, mindestens eine Probe
für die
Gelelektrophorese aufzunehmen, nachdem der erste Gelanteil in verfestigter
Form vorliegt, und wobei der zweite Gelanteil daran angepasst ist,
die Durchführung
eines Elektrophoreseverfahrens mit einer solchen Probe zu ermöglichen,
die von dem ersten Gelanteil aufgenommen werden kann. Der erste Gelanteil
ist typischerweise vor allem daran angepasst, es einer Probe, die
in diesem Gelanteil enthalten ist, zu ermöglichen, frei in den zweiten
Gelanteil zu wandern. Vor allem weist der erste Gelanteil mindestens
einen Mengenanteil an Agarose auf, der es ermöglicht, dass der erste Gelanteil
mindestens eine Probe für
die Elektrophorese aufnimmt, und der zweite Gelanteil enthält Acrylamid.
Das Hybridgel ist für die
Verwendung in einem horizontalen Elektrophoreseverfahren vorgesehen,
und der erste Gelanteil ist daran angepasst, mindestens eine Probe
für die Elektrophorese
mit Hilfe mindestens einer entsprechenden Tasche, die in dem ersten
Gelanteil ausgebildet ist, aufzunehmen.
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Das
Hybridgel wird vorzugsweise in einer geeigneten Kammer untergebracht,
die durch einen Gießschlitten
bereitgestellt wird, und ein oberer Deckel, der so ausgebildet ist,
dass er und der Schlitten ineinander greifen, kann optional bereitgestellt
werden. Der Schlitten umfasst typischerweise einen Boden, der zwei
in Längsrichtung
voneinander beabstandete Öffnungen
aufweist, wobei eine erste Öffnung
für die
Verbindung zwischen dem ersten Gelanteil und einem Bereich außerhalb
des Schlittens sorgt und die zweite Öffnung für die Verbindung zwischen dem
zweiten Gelanteil und einem Bereich außerhalb des Schlittens sorgt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Vorrichtung für die Durchführung einer
Elektrophorese, die umfasst:
ein Gehäuse, das mindestens einen Boden
und am Rand miteinander verbundene Wände umfasst, die eine erste
Kammer definieren, die ein erstes in Längsrichtung vorhandenes Ende
und ein zweites in Längsrichtung
vorhandenes Ende aufweist;
ein Hybridgel gemäß der vorliegenden
Erfindung, das in der ersten Kammer untergebracht ist, das so angeordnet
ist, dass die Wanderung in einer Richtung vom zweiten Ende zum ersten
Ende stattfindet, wenn die Vorrichtung in einem Elektrophoreseverfahren
verwendet wird;
wobei der Boden mindestens eine erste Öffnung und mindestens
eine zweite Öffnung
am ersten in Längsrichtung
vorhandenen Ende bzw. am zweiten in Längsrichtung vorhandenen Ende
umfasst, wobei die Öffnungen
dafür geeignet
sind, die ionische Verbindung zwischen dem Gel und einer externen
ionischen Pufferlösung
zu ermöglichen.
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Die
Vorrichtung weist vorzugsweise weiterhin mindestens ein erstes im
Wesentlichen hohles Querbein und ein zweites im Wesentlichen hohles Querbein
auf, die am ersten in Längsrichtung
vorhandenen Ende bzw. zweiten in Längsrichtung vorhandenen Ende
nach unten aus der Vorrichtung hervorstehen, wobei das erste Bein
und das zweite Bein einen geeigneten dritten Gelanteil bzw. vierten
Gelanteil enthalten, die über
die entsprechenden Öffnungen
mit der ersten Kammer in Verbindung stehen, wobei das erste Bein
und das zweite Bein offene untere Enden aufweisen.
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Die
Vorrichtung kann außerdem
eine erste Acrylamid-Barriere umfassen, die mit der ersten Öffnung in
Verbindung steht, um den Kontakt zwischen mindestens dem zweiten
Anteil des Hybridgels und einem Bereich außerhalb der Vorrichtung über die erste Öffnung weitgehend
zu verhindern. Diese erste Acrylamid-Barriere kann vom ersten Gelanteil
des Hybridgels umfasst sein, wobei der erste Anteil im Wesentlichen
aus Agarose besteht. Zusätzlich
oder alternativ wird die erste Acrylamid-Barriere durch den dritten
Gelanteil bereitgestellt, der in dem ersten Bein enthalten ist,
und der dritte Gelanteil kann Agarose umfassen.
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Die
Vorrichtung umfasst vorzugsweise weiterhin eine zweite Kammer, die
an die erste Kammer angrenzt und mit dieser in Verbindung steht,
die daran angepasst ist, mindestens einen Teil der ersten Acry lamid-Barriere
bereitzustellen. Die zweite Kammer kann einen fünften Gelanteil, typischerweise Agarose,
enthalten.
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Die
Vorrichtung kann weiterhin optional eine zweite Acrylamid-Barriere umfassen,
die mit der zweiten Öffnung
in Verbindung steht, um den Kontakt zwischen mindestens dem zweiten
Gelanteil des Hybridgels und einem Bereich außerhalb der Vorrichtung über die
zweite Öffnung
weitgehend zu verhindern. Die zweite Acrylamid-Barriere besteht typischerweise aus
einem sechsten Gelanteil, der zwischen dem zweiten Gelanteil des
Hybridgels und der zweiten Öffnung
eingeschoben ist, wobei der sechste Gelanteil im Wesentlichen aus
Agarose besteht. Alternativ oder zusätzlich kann die zweite Acrylamid-Barriere
mindestens teilweise durch den vierten Gelanteil bereitgestellt
werden, der in dem zweiten Bein enthalten ist, wobei der vierte
Gelanteil typischerweise Agarose umfasst.
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Die
Vorrichtung umfasst weiterhin vorzugsweise einen Deckel, um mindestens
die erste Kammer lösbar
zu verschließen,
und sie umfasst typischerweise weiterhin einen geeigneten Kamm für die Erzeugung
der Taschen, wobei der Deckel mindestens eine geeignete Öffnung aufweist,
um es dem Kamm zu ermöglichen,
in den ersten Gelanteil einzudringen. Der Deckel kann weiterhin
eine Zunge aufweisen, die sich genau über und im Abstand zu einer Plattform
befindet, die am ersten in Längsrichtung vorhandenen
Ende der Vorrichtung vorgesehen ist.
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Es
werden vorzugsweise geeignete Klebestreifen vorgesehen, um die unteren
Enden des ersten Beins bzw. des zweiten Beins reversibel zu verschließen.
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Der
Boden und das erste Bein und das zweite Bein sind vorteilhaft so
ausgebildet, dass die Vorrichtung mit Standard-Elektrophoresegerä ten verwendet
werden kann, die zwei parallele, aneinander grenzende, pufferhaltige
Wannen aufweisen, die durch eine erhöhte Plattform getrennt sind,
die den Boden unterstützt,
wobei sich das erste Bein und das zweite Bein ausreichend in die
entsprechenden Wannen erstrecken, um die ionische Verbindung mindestens
zwischen dem dritten Gelanteil und dem Puffer, der in der einen
Wanne enthalten ist, und zwischen dem vierten Gelanteil und dem
Puffer, der in der anderen Wanne enthalten ist, herzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein erfindungsgemäßes Verfahren
zum Bereitstellen eines Hybridgels, das einen ersten Gelanteil,
der mit einem zweiten Gelanteil in Verbindung steht, umfasst. Das
Verfahren kann die folgenden Schritte umfassen:
- (a)
Bereitstellen eines geschlossenen Schlittens, der eine Einfüllöffnung aufweist,
und Drehen des Schlittens in die vertikale Position, so dass sich die Öffnung ganz
oben befindet;
- (b) Hineingießen
des ersten Gelanteils durch die Öffnung
bis zu einer erforderlichen Höhe
in dem Schlitten, wonach man den ersten Anteil erstarren lässt;
- (c) Hineingießen
des zweiten Gelanteils bis zum oberen Rand des Schlittens, wonach
man den zweiten Anteil erstarren lässt;
- (d) Zurückführen des
Schlittens in eine horizontale Orientierung.
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Das
Verfahren kann alternativ die folgenden Schritte umfassen:
- (a) Bereitstellen eines offenen Schlittens;
- (b) Vorsehen einer provisorischen zurückhaltenden Querwand innerhalb
des Schlittens, die in Längsrichtung
verschoben ist, bezogen auf ein in Längsrichtung vorhandenes Ende
des Schlittens, um eine Unterkammer dazwischen zu definieren;
- (c) Hineingießen
des ersten Gelanteils in die Unterkammer, wonach man den ersten
Gelanteil erstarren lässt;
- (d) Entfernen der provisorischen zurückhaltenden Wand;
- (e) Verschließen
des Schlittens mit einem geeigneten Deckel, der eine geeignete Öffnung aufweist;
- (f) Hineingießen
des zweiten Gelanteils in das Restvolumen des Schlittens durch die Öffnung, wonach
man den zweiten Gelanteil erstarren lässt.
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Das
Verfahren umfasst vorzugsweise einen Schritt, in dem mindestens
eine Tasche in dem ersten Gelanteil erzeugt wird. Die Taschen können mit
Hilfe eines Kamms durch geeignete Öffnungen in dem Schlitten oder
alternativ mit Hilfe eines Kamms, in dem zunächst ein oberer Deckel des
Schlittens entfernt wird, erzeugt werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Durchführen eines
horizontalen Elektrophoreseverfahrens mit mindestens einer Probe,
das die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Bereitstellen
einer Hybridgelmatrix gemäß der vorliegenden
Erfindung, die mindestens einen ersten Gelanteil, an den mindestens
ein zweiter Gelanteil angrenzt, umfasst, wobei der erste Gelanteil
mindestens eine Tasche aufweist, die in diesem Gelanteil ausgebildet
ist, wobei jede Tasche daran angepasst ist, eine entsprechende Probe aufzunehmen;
- (b) Anordnen der Gelmatrix in einer geeigneten horizontalen
Elektrophoresekammer;
- (c) Einbringen der mindestens einen Probe in eine entsprechende
mindestens eine Tasche in dem ersten Gelanteil;
- (d) Versorgen der Kammer mit einer geeigneten Pufferlösung;
- (e) Anlegen einer geeigneten elektrischen Spannung an die Kammer,
um das Elektrophoreseverfahren in Gang zu bringen.
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Die
Probe kann typischerweise kleine Fragmente von Nucleinsäuren, die
mindestens ein Fragment von DNA und RNA einschließen, oder
mindestens ein geeignetes Protein enthalten.
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Beschreibung der Figuren
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1 zeigt
die Hauptbestandteile des Hybridgels gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung in einer perspektivischen Ansicht.
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2 zeigt
die Hauptbestandteile des Hybridgels gemäß einer zweiten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung in einer perspektivischen Ansicht.
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3 zeigt
die Hauptbestandteile einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung
der vorliegenden Erfindung in einer perspektivischen Ansicht mit
aufgelösten
Einzelteilen.
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4 zeigt
die zusammengesetzte Ausführungsform
gemäß 3 in
einer Seitenansicht.
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5 zeigt
die Ausführungsform
gemäß 4 in
der Draufsicht.
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6 zeigt
die Ausführungsform
gemäß 5 entlang
der Linie E-E in einer seitlichen Querschnittsansicht, die ein Hybridgel
gemäß der Ausführungsform
von 1 enthält.
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7 zeigt
eine zweite Ausführungsform
der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in einer seitlichen Querschnittsansicht.
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8 zeigt
eine dritte Ausführungsform
der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in einer seitlichen Querschnittsansicht.
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9 zeigt
eine vierte Ausführungsform
der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in einer seitlichen Querschnittsansicht.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die Ansprüche definiert, deren Inhalt
so zu lesen ist, dass er zur Offenbarung der Patentschrift gehört, und
sie wird im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf
die beigefügten
Figuren beschrieben.
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In
der vorliegenden Anmeldung ist das Wort Acrylamid so zu verstehen,
dass es sich gleichermaßen
auf Gele auf der Basis von Polyacrylamid, Bispolyacrylamid, Acrylamid
und dergleichen bezieht, zusätzlich
zu seiner üblichen
Bedeutung oder anstelle davon.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine verfestigte Hybridgelmatrix
zur Verwendung in einem Elektrophoreseverfahren, insbesondere in
einem horizontalen Elektrophoreseverfahren, und Verfahren zur Herstellung
dieser Gele.
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Unter
verfestigt wird hier verstanden, dass sich die Gelmatrix nicht mehr
in einem geschmolzenen Zustand befindet und dass sie in einer auf
dem Fachgebiet bekannten Art und Weise "abgebunden hat", "ausgehärtet ist" oder "in den Gelzustand übergegangen
ist".
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Bezug
nehmend auf 1 liegt das Hybridgel gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform, das
im Allgemeinen mit dem Bezugszeichen (36) bezeichnet wird,
typischerweise in der Form einer verfestigten Platte vor, die eine
Dicke (t) aufweist, und es ist dadurch gekennzeichnet, dass es aus
einem ersten Anteil und einem zweiten Anteil zusammengesetzt ist,
die aneinander grenzen und die sich mindestens im wechselseitigen
ionischen Kontakt befinden, wenn sie einem Elektrophoreseverfahren
unterzogen werden. Der erste Anteil (37) ist, wenn er sich im
verfestigten Zustand befindet, daran angepasst, anschließend mindestens
eine einer Elektrophorese zu unterziehenden Probe aufzunehmen, und
er umfasst deshalb mindestens eine und vorzugsweise eine Vielzahl
von Taschen (39). Der erste Anteil (37) ist als
solcher vorzugsweise aus Agarose hergestellt, obwohl er nur ausreichend
Agarose enthalten muss, um eine stabile Taschenstruktur zu liefern,
wenn er verfestigt ist und anschließend, wenn er mit einer Probe
beladen ist und während
die horizontale Elektrophorese durchgeführt wird. Vor allem in letzterem Fall,
das heißt,
wenn der erste Anteil nur kleine Mengen an Agarose enthält, kann
der erste Anteil auch andere Materialien, einschließlich andere
Geltypen, enthalten, so lange dieser Anteil weiterhin eine stabile
Taschenstruktur liefert und die Wanderung von Molekülen aus
den Taschen nicht blockiert. Es gibt auch andere weniger geeignete
Substanzen, die von Agar abgeleitet werden, die zwar stabile Taschen
liefern, aber keine effiziente Wanderung der Moleküle ermöglichen.
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Der
zweite Anteil (38) ist aus Acrylamid oder im Wesentlichen
aus Acrylamid hergestellt, und er grenzt an den ersten Anteil an,
so dass die ionische Verbindung zwischen den beiden Anteilen ermöglicht wird
und es den Molekülen,
die aus den Taschen (39) in den ersten Anteil (37)
wandern, ermöglicht
wird, ihre Wanderung durch den zweiten Anteil (38) zu durchzuführen. Das
erfindungsgemäße Hybridgel (36)
ermöglicht
demnach die horizontale Elektrophorese von Proben, indem das bevorzugte
Gel aus Acrylamid oder Gelen auf Acrylamid-Basis besteht, in Anwendungen wie beispielsweise
der Trennung kleiner Nucleinsäuren
(DNA und RNA) oder von Proteinen (unter Verwendung eines SDS-Acrylamid-Gels
in dem zweiten Anteil (38)).
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Der
erste Anteil (37) und der zweite Anteil (38) werden
typischerweise in Reihe angeordnet, und sie können in verfestigter Form in
geeigneten Schlitten, durch Gießen
vorgefertigt, bereitgestellt werden, oder sie können wie erforderlich in situ
durch Gießen
hergestellt werden. In den meisten Fällen wird der erste Anteil
(37) zuerst gegossen, und dies kann geschehen, indem ein
geschlossener Schlitten bereitgestellt wird, der eine Einfüllöffnung aufweist, und
indem der Schlitten in die vertikale Position gedreht wird, so dass
sich die Öffnung
ganz oben befindet. Der erste Gelanteil, typischerweise Agarose, wird
dann im geschmolzenen oder fluiden Zustand durch die Öffnung bis
zu der erforderlichen Höhe
in den Schlitten gegossen, und sobald er erstarrt ist, wird der
zweite Gelanteil, typischerweise ein Acrylamid-Gel, bis zum oberen
Rand des Schlittens hineingegossen. Sobald beide Gele erstarrt sind,
das heißt verfestigt
sind, kann der Schlitten zurück
in seine normale horizontale Orientierung geführt werden, und geeignete Taschen
(39) können
darin ausgebildet werden, typischerweise mit Hilfe eines Kamms,
durch geeignete Öffnungen
in dem Schlitten, oder indem zunächst
das obere Ende des Schlittens geöffnet wird.
Alternativ kann der zweite Anteil (38) zuerst gegossen
werden, während
sich der geschlossene Schlitten in der vertikalen Position befindet,
indem das Acrylamid bis zu der erforderlichen Höhe durch die Öffnung gegossen
wird. Der Schlitten wird dann zurück in die horizontale Orientierung
gebracht, und die Agarose wird in das Restvolumen des Schlittens gegossen,
und geeignete Taschen (39) werden darin wie oben ausgebildet.
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Das
Hybridgel (36) kann alternativ in einem offenen Schlitten
gegossen werden, indem zunächst eine
provisorische zurückhaltende
Querwand innerhalb des Schlittens, die in Längsrichtung verschoben ist,
bezogen auf ein in Längsrichtung
vorhandenes Ende des Schlittens, vorgesehen wird, um eine Unterkammer
dazwischen zu definieren, in die das Agarose-Gel gegossen wird,
das dann erstarrt. Anschließend
wird die provisorische zurückhaltende
Wand entfernt, und der Schlitten wird mit einem geeigneten Deckel
verschlossen, und das Acrylamid-Gel wird in das Restvolumen des
Schlittens gegossen, typischerweise bis auf die gleiche Höhe wie die
Agarose in dem ersten Gelanteil (37), um den zweiten Gelanteil
(38) zu bilden. Der zweite Gelanteil (38) befindet sich
dann in Kontakt mit dem ersten Gelanteil (37). Taschen
(39) können
in der üblichen
Weise ausgebildet werden, wie dies beispielsweise weiter oben beschrieben
wurde.
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Der
erste Anteil (37) und der zweite Anteil (38) werden
typischerweise in zwei in Reihe aufeinander folgenden, aneinander
grenzenden Anteilen bereitgestellt, wie dies weiter oben unter Bezugnahme
auf 1 beschrieben wurde. Andere Konfigurationen sind
jedoch ebenfalls möglich.
In einer zweiten Ausführungsform
des Hybridgels (36')
könnte
beispielsweise, und hierfür
wird auf 2 Bezug genommen, der erste
Anteil (37')
als ein "Pfropfen" (35') aus einem
Agarose-Gel bereitgestellt
werden, der geeignete Taschen (39') aufweist, wobei der Pfropfen (35') von einem
zweiten Anteil (38')
aus einem Acrylamid-Gel
umgeben ist.
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Für die Elektrophorese
kleiner Fragmente von Nucleinsäuren
(DNA und RNA) liegt die Dicke (t) des Gels mindestens des zweiten
Anteils (38) typischerweise im Bereich von etwa 0,3 mm
bis etwa 4 mm, während
die entsprechende Geldicke (t) für
die Elektrophorese von Proteinen typischerweise im Bereich von etwa
1 mm bis etwa 2 mm liegt.
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Während der
erste Gelanteil (37) typischerweise im Wesentlichen die
gleiche Dicke wie der zweite Gelanteil (38) hat, muss dies
nicht not wendigerweise so auf alle Ausführungsformen des Hybridgels
(36) zutreffen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Vorrichtung oder
einen Apparat und ein Verfahren für die horizontale Elektrophorese
auf der Basis eines derartigen Hybridgels (37), das einem
ersten Anteil umfasst, der ein Agarose-Gel umfasst, an den mindestens
ein zweiter Gelanteil angrenzt, der ein Acrylamid-Gel umfasst, bei
dem der erste Anteil daran angepasst ist, Proben aufzunehmen, die
einer horizontalen Elektrophorese unterzogen werden sollen. Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem vor allem eine kassettenartige
Vorrichtung, die ein derartiges Hybridgel enthält, wobei das Gel vorzugsweise darin
durch Gießen
vorgefertigt ist. Eine derartige Kassette wird außerdem vorzugsweise
mit geeigneten Fallen versehen, durch die der Kontakt des Acrylamid-Gels
mit der äußeren Umgebung,
die Anwender eingeschlossen, minimiert wird. Derartige Fallen umfassen
typischerweise eine Barrieregelsubstanz, wie Agarose, die das Acrylamid-Gel
von dem Bereich außerhalb
der Kassette isoliert, wodurch jegliche Möglichkeit eines Kontakts von
Menschen mit dem Acrylamid-Gel in der Kassette minimiert wird. Diese Gelsubstanz
enthält
eine Elektrolytlösung,
um die ionische Verbindung zwischen dem Gel und der äußeren Elektrolytlösung herzustellen.
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Eine
derartige Vorrichtung ist vorzugsweise wegwerfbar, sie kann jedoch
auch für
eine Vielzahl von Anwendungen wiederverwendbar sein. Der Ausdruck "wegwerfbar" bzw. "entsorgbar" in der vorliegenden
Anmeldung bedeutet, dass die Vorrichtungen so ausgebildet sind (in
entsprechenden Ausführungsformen),
dass sie nach einer Verwendung mit nur vernachlässigbarem finanziellem Nachteil
weggeworfen werden oder sonst wie entsorgt werden können. Ein
derartiger vernachlässigbarer
finanzieller Nachteil kann beispielsweise mit dem finanziellen Nachteil
vergleichbar sein, den man hat, wenn Plastikpi petten für die Handhabung
von Flüssigkeiten oder
Eppendorf-Röhrchen weggeschmissen
werden. Während
diese Gegenstände
mehr als einmal verwendet werden können, werden sie dennoch typischerweise
nach einer einzigen Verwendung weggeschmissen, was kostengünstiger
als die Reinigung und/oder Sterilisierung der Gegenstände für die nachfolgende
Verwendung ist.
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Unter
Bezugnahme auf die Figuren veranschaulichen die
2 bis
6 eine
bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung oder die Kassette, die
das Bezugszeichen (
1) trägt, umfasst ein Gehäuse (
100)
mit einer boxartigen Konstruktion, das eine erste Kammer (
30) umfasst,
die an die Aufnahme eines Hybridgels (
36) für die Elektrophorese
angepasst ist. Optional wird in einer zweiten Kammer (
40)
eine Barrieresubstanz untergebracht. Eine derartige Barrieresubstanz
kann eine Substanz umfassen, die daran angepasst ist, für eine Acrylamid-Barriere
zu sorgen, d. h. eine Barriere, durch die das Acrylamid in dem Hybridgel
(
36) vom Bereich außerhalb
der Kassette (
1) getrennt wird. Die Barriere-Substanz kann
alternativ ein Absorptionsmaterial enthalten, das imstande ist,
mindestens eine Zielsubstanz, die vom Hybridgel (
36) dorthin
wandert, zurückzuhalten
und eine derartige Zielsubstanz daran zu hindern, die Kassette (
1)
zu verlassen, die in der gleichzeitig anhängigen
israelischen Patentanmeldung Nr. 139447 genauer
beschrieben wird.
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Die
Kassette (1) umfasst einen gestuften unteren Boden (10),
der einen ebenen oberen Teil (11) und einen ebenen, aber
kürzeren
unteren Teil (13) aufweist, die in Längsrichtung durch eine erste
vertikale Zwischenwand (15) miteinander verbunden sind.
Die beiden Seitenwände
(12), (14) verlaufen in Längsrichtung der Kassette und
sind vorzugsweise fest mit dem Boden (10) und den Endwänden (16) und
(18) an den gegenüberliegenden
in Längsrichtung
vorhandenen Enden der Kassette (1) verbunden. Eine zweite
Zwischenwand (19) ist mit den Seitenwänden (12) und (14)
an einer in Längsrichtung vorhandenen
Stelle zwischen der ersten Zwischenwand (15) und der dazu
am nächsten
liegenden Endwand (18) verbunden. Die zweite Zwischenwand
(19) teilt beide Seitenwände (12) und (14)
in Längsrichtung
in längere
Anteile (12')
bzw. (14'),
die sich zwischen der Endwand (16) und der Zwischenwand
(19) erstrecken, und kürzere
Anteile (12'') bzw. (14''), die sich zwischen der Zwischenwand
(19) und der anderen Endwand (18) erstrecken.
Die obere Kante der zweiten Zwischenwand (19) ist im Wesentlichen
coplanar mit der oberen Kante der Endwand (16) und mit
den oberen Kanten von mindestens den längeren Seitenwandanteilen (12') und (14'), und ermöglicht es
so, einen oberen Deckel (50) darauf lösbar und verschließbar zu
montieren. Der obere Deckel (50) kann optional verschließbare Öffnungen
(51) und (53) aufweisen, die in Längsrichtung
voneinander entlang der Mittellinie des Deckels (50) beabstandet sind.
Diese Öffnungen
(51), (53) erleichtern das Eingießen des
Gels in die Kassette (1), wenn sich der Deckel (50)
an Ort und Stelle befindet, was weiter unten detaillierter beschrieben
wird. Die zweite Zwischenwand (19), die Endwand (16)
und die längeren Seitenwandanteile
(12') und
(14') definieren
somit die erste Kammer (30) der Kassette. Die zweite Kammer (40)
der Kassette wird dementsprechend durch die zweite Zwischenwand
(19), die Endwand (18) und die kürzeren Seitenwandanteile
(12'') und (14'') zusammen mit der oberen Wand
(55) und dem niedrigeren Teil (13) des Bodens
(10) definiert. Die obere Wand (55) kann wahlweise,
typischerweise fest, mit der zweiten Zwischenwand (19),
der Endwand (18) und den kürzeren Seitenwandanteilen (12'') und (14'') verbunden
sein. Die obere Wand (55) ist jedoch vorzugsweise, wie
dies in den 3 und 6 veranschaulicht
wird, fest mit dem oberen Deckel (50) verbunden und lösbar und
verschließbar
auf den oberen Kanten der zweiten Zwischenwand (19), der
Endwand (18) und den kürzeren
Seitenwandanteilen (12'') und (14'') montiert. Die untere Kante der
zweiten Zwischenwand (19) erstreckt sich jedoch nicht bis zum
niedrigeren Teil (13) des Bodens (10), und somit wird
die Verbindung zwischen der ersten Kammer (30) und der
zweiten Kammer (40) durch den in Längsrichtung vorhandenen Spalt
zwischen der ersten Zwischenwand (15) und der zweiten Zwischenwand
(19) hergestellt.
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In
der bevorzugten Ausführungsform
der Vorrichtung überlagert
demnach die erste Kammer (30) teilweise die zweite Kammer
(40), wodurch ein Bereich (31) definiert wird,
in dem sich die beiden Kammern horizontal überlappen. Zumindest ein Teil dieses
Bereichs (31) weist eine Öffnung auf, oder ist vorzugsweise
offen, wodurch die Verbindung zwischen der ersten Kammer (30)
und der zweiten Kammer (40) hergestellt wird.
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Die
Kassette (1) oder andere Ausführungsformen davon werden vorzugsweise
mit einer geeigneten Hybridgelmatrix (36) gemäß der vorliegenden Erfindung
versorgt, die in der ersten Kammer (30) untergebracht wird.
Eine geeignete Barriere-Substanz, typischerweise in der Form einer
zweiten Gelmatrix (48) wird in der zweiten Kammer (40)
untergebracht und kann ebenfalls in vorgefertigter Form in der Kassette
(1) vorgesehen werden. Die Kassette (1) oder andere
Ausführungsformen
davon können
alternativ ohne eines der Gele oder ohne beide Gele bereitgestellt
werden, die gegossen werden können,
wie sie und wann sie benötigt
werden. In jedem Fall ist die Hybridgelmatrix (36) daran
angepasst, dass in ihr die horizontale Elektrophorese durchgeführt wird.
Die zweite Gelmatrix (48) ist typischerweise daran angepasst,
eine Barriere zwischen dem Acrylamid, das in dem Hybridgel enthalten
ist (typischerweise im zweiten Anteil (38), manchmal jedoch
im ersten Anteil (37) enthalten) zu bilden, durch die der
Kontakt damit über
die Öffnung
(42) verhindert wird, während gleichzeitig
die ionische Verbindung zwischen dem Bereich au ßerhalb der Kassette und dem
Hybridgel (36) über
die zweite Gelmatrix (48) und die Öffnung (42) ermöglicht wird.
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Der
obere Deckel (50) und vorzugsweise das restliche Gehäuse (100)
werden aus einem beliebigen geeigneten ultraviolett-transparenten
Material hergestellt. Die gesamte Kassette (1) und vor
allem das Gehäuse
(100) wird vorzugsweise aus einem ökonomisch wegwerfbaren Material
hergestellt.
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An
einem Ende des Deckels (50) wird optional eine Zunge (57)
vorgesehen, und eine entsprechende Plattform (58) wird
an dem Ende (16) vorgesehen, die vorzugsweise fest mit
dem Ende verbunden ist, so dass sich die Zunge (57) genau über der Plattform
(58) und durch einen Abstand (59) wechselseitig
beabstandet davon befindet, wenn sich der Deckel (50) an
seinem Platz über
der Kammer (30) befindet. Indem ein geeignetes abgeflachtes
Werkzeug, wie beispielsweise ein Schraubenzieher oder ein Schlüssel (nicht
gezeigt) in den Zwischenraum (59) eingeführt wird
und um etwa 90° gedreht
wird, kann der Deckel (50) aufschnappen und somit von der Kammer
(30) entfernt werden.
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Über einen
Deckel (50), der geöffnet
werden kann, zu verfügen,
ist beispielsweise in Anwendungen wichtig, in denen es erforderlich
ist, einen Teil des zweiten Gelanteils (38) für die weitere
Verarbeitung, wie zum Beispiel Elektroelution oder die Übertragung
von Molekülen
von dem zweiten Gelanteil (38) auf eine Membran (Western
Blot oder Northern Blot), zu entfernen.
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Die
Kassette (1) weist außerdem Öffnungen an
den beiden gegenüberliegenden
Enden des unteren Bodens (10) auf, um die direkte oder
indirekte ionische Verbindung zwischen dem Hybridgel (38),
das in der Kassette (1) angeordnet ist, und einer Elektrolytlösung, in
die die Kassette (1) teilweise eingetaucht sein kann, zu
ermöglichen.
Daher sorgt eine Queröffnung
(32) an dem in Längsrichtung
vorhandenen Ende des höheren
Teils (11) des Bodens (10) in der Nähe der Endwand
(16) für
die Verbindung zwischen der ersten Kammer (30) und dem
Bereich außerhalb der
Kassette (1). Ähnlich
sorgt eine Queröffnung
(42) an dem in Längsrichtung
vorhandenen Ende des niedrigeren Teils (11) des Bodens
(10) in der Nähe der
Endwand (18) für
die Verbindung zwischen der zweiten Kammer (40) und dem
Bereich außerhalb der
Kassette (1).
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Die Öffnungen
(32) und (42) dienen für die Herstellung der ionischen
Verbindung zwischen den Gelen, die in der Kassette (1)
angeordnet sind, und den äußeren ionischen
Lösungen
und ermöglichen somit
die Durchführung
der Elektrophorese innerhalb der Kassette (1), wenn ein
geeignetes elektrisches Feld angelegt wird. Die Öffnungen sind jedoch vorzugsweise
am unteren Boden (10) in Form von im Wesentlichen hohlen
Beinen vorhanden, die entlang der Querrichtung der Kassette (1)
an den beiden in Längsrichtung
vorhandenen Enden der Kassette verlaufen, wobei die Beine außerdem dazu
imstande sind, ein Gel in ionischer Verbindung mit dem Hauptkörper des
Gels, das in der Kassette (1) angeordnet ist, aufzunehmen.
Dieser Aufbau in Form eines umgedrehten U ist vor allem an die Verwendung
der Kassette (1) mit Standardionenaustauschkammern angepasst,
die im Allgemeinen in Form von zwei aneinander grenzenden, pufferhaltigen
Wannen vorliegen, die durch eine erhöhte Plattform, die ideal für die Unterstützung des
Bodens (10) der Kassette (1) ist, voneinander
getrennt sind. Das eine Bein erstreckt sich nach unten in eine Wanne,
und das andere Bein erstreckt sich in die zweite Wanne, wodurch
die ionische Verbindung mindestens zwischen dem Gel, das in den
Beinen enthalten ist, und den entsprechenden Pufferlösungen in
den Wannen und zwischen den Gelen in den Beinen über das Hybridgel (36)
und die zweite Gelmatrix (48) hergestellt wird. Die eine
Wanne weist -eine Kathode auf, und die andere Wanne weist eine Anode
auf.
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Die
Kassette (1) weist demnach optional und vorzugsweise hohle
Beine (60) und (70) auf, die an den einander gegenüberliegenden
in Längsrichtung vorhandenen
Enden der Kassette vorgesehen sind. An dem einen Ende der Kassette
(1) ist das Bein (60) durch eine sich nach unten
erstreckende Verlängerung
der Endwand (16) zusammen mit sich nach unten erstreckenden
lappenartigen Vorsprüngen
(62), (64) an dem Ende der längeren Seitenwandanteile (12'') bzw. (14'')
und eine vierte Wand (65), die sich vom höheren Teil
(11) des Bodens (10) nach unten erstreckt, definiert.
In ähnlicher
Weise ist das Bein (70) an dem anderen in Längsrichtung
vorhandenen Ende der Kassette (1) durch eine sich nach
unten erstreckende Verlängerung
der Endwand (18) zusammen mit sich nach unten erstreckenden
lappenartigen Vorsprüngen
(72), (74) an dem Ende der kürzeren Seitenwandanteile (12') bzw. (14') und eine entsprechende
vierte Wand (75), die nach unten aus dem unteren Teil (13)
des Bodens (10) hervorsteht, definiert. Die beiden Beine
(60), (70) sind an ihrem entsprechenden unteren
Ende (66) bzw. (76) offen, und die Öffnungen
können
mit Hilfe von geeigneten entfernbaren Klebstreifen (nicht gezeigt),
die daran kleben, vorübergehend
verschlossen werden (zumindest vor der Verwendung der Kassette (1)).
Die unteren Enden (66), (76) stehen mit der ersten
Kammer (30) bzw. der zweiten Kammer (40) über die
Queröffnungen
(32) bzw. (42) in Verbindung.
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Wie
weiter oben angegeben wurde, ist die erste Kammer (30)
an die Aufnahme einer geeigneten Hybridgelmatrix (36) angepasst,
die an die horizontale Elektrophorese angepasst ist. Unter Bezugnahme
vor allem auf die 6 ist der erste Gelanteil (37)
des Hybridgels (36) an dem in Längsrichtung vorhandenen Ende
der Kammer (30), das sich am nächsten bei der Zwischenwand
(19) befindet, vorgesehen und ermöglicht eine relativ stabile
Taschenstruktur, die eine und vorzugsweise eine Vielzahl von Taschen
(39) umfasst, die für
die Aufnahme von Proben vorgesehen sind, die der Elektrophorese
unterzogen werden sollen. Der zweite Gelanteil (38) ist zwischen
dem ersten Gelanteil (37) und der Endwand (16)
angeordnet.
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Die
Taschen (39) können
durch einen Kamm (80) erzeugt werden, der beispielsweise
Zähne (84) aufweist,
die typischerweise durch entsprechende Öffnungen (52), die
in dem Deckel (50) vorhanden sind, in den ersten Gelanteil
(37) eingeführt
werden. Alternativ kann in dem Deckel (50) anstelle der
einzelnen Öffnungen
(52) ein gemeinsamer Spalt vorgesehen werden. Der Kamm
(80) wird typischerweise so an Ort und Stelle gehalten,
dass er in den Deckel (50) eingreift, bis die Kassette
(1) verwendet wird, woraufhin Proben in eine oder mehrere
Taschen (39) durch die entsprechenden Öffnungen (52) eingebracht
werden können.
Nach der Verwendung und vor der Entsorgung der Kassette (1)
werden die Öffnungen
(52) vorzugsweise wieder mit Hilfe des Kamms (80)
verschlossen.
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Das
Agarose/Acrylamid-Hybridgel (36) wird vorzugsweise in vorgefertigter
Form in der ersten Kammer (30) bereitgestellt. In jedem
Fall kann das erfindungsgemäße Agarose/Acrylamid-Gel
erzeugt werden, indem eine provisorische zurückhaltende Querwand (nicht
gezeigt) in die Kammer (30) eingeführt wird, die in Längsrichtung,
bezogen auf die Zwischenwand (19) angeordnet wird, wodurch
eine Unterkammer dazwischen definiert wird, in die das Agarose-Gel
gegossen wird, das man dann erstarren lässt. Anschließend wird
die provisorische zurückhaltende
Wand entfernt, und das Acrylamid-Gel wird in das Restvolumen der
ersten Kammer (30) bis auf die gleiche Höhe wie die
Agarose in dem ersten Gelanteil (37) gegossen, um den zweiten
Gelanteil (38) zu bilden. Ein anderes Verfahren zum Gießen des
Agarose/Acrylamid-Hybridgels besteht darin, die Kassette (1)
so in die ver tikale Position zu drehen, dass sich die Endwand (16)
in der obersten Position befindet. Das Acrylamid-Gel wird dann bis
zu der erwünschten Höhe (die
typischerweise der horizontalen Ausdehnung des Acrylamids entspricht,
wenn die Kassette (1) in die horizontale Position zurückgebracht
wurde) in die Kammer (30) gegossen. Anschließend wird,
die Kassette (1) befindet sich immer noch in der vertikalen
Position, die Agarose in die Kammer (30) gegossen, bis
die Kammer wie erfordert gefüllt
ist. Mit diesem Verfahren können
das Acrylamid-Gel und das Agarose-Gel durch die Öffnungen (51) bzw.
(53) oder beide durch die Öffnung (53) in die
Kammer gegossen werden. Andere Wege zum Gießen des Hybridgels sind ebenfalls
möglich.
Die Taschen (39) können
in der üblichen
Weise beispielsweise unter Verwendung eines Kamms (80)
geformt werden.
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Der
Schritt, in dem die Hybridgelmatrix (36) gegossen wird,
wird jedoch üblicherweise
durchgeführt,
nachdem die zweite Gelmatrix (48) gegossen worden ist,
was typischerweise durchgeführt
wird, nachdem die Gele (69) und (79) gegossen
worden sind, was im Folgenden beschrieben wird.
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In
der bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
wird optional eine erste Acrylamid-Barriere (90) vorgesehen,
um den Kontakt zwischen den Acrylamidanteilen des Hybridgels (36)
und der äußeren Umgebung,
vor allem während der
Handhabung und der Entsorgung der Kassette (1), zu verhindern,
während
gleichzeitig die ionische Verbindung dazwischen ermöglicht wird.
Acrylamid, das hauptsächlich
in dem zweiten Gelanteil (38), aber auch optional in dem
ersten Gelanteil (37) enthalten ist, ist toxisch und/oder
karzinogen, und ist daher für
denjenigen, der die Kassette handhabt, und für die Umgebung potentiell gesundheitsschädlich. Am
gegenüberliegenden,
in Längsrichtung
vorhandenen Ende der Kassette (1) wird vorzugsweise eine zweite
Acrylamid-Barriere (95) vorgesehen.
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Die
erste Acrylamid-Barriere (90) wird in der Form der zweiten
Kammer (40) als ein Pufferbereich zwischen dem Acrylamid
und der Öffnung
(42) vorgesehen, wodurch der Kontakt über diese Öffnung vermieden wird. Die
zweite Kammer (40), die sich in offener Verbindung mit
der ersten Kammer (30) und mindestens in ionischer Verbindung
damit befindet, wenn beide Kammern ein Gel aufgenommen haben, wird
mit einem beliebigen geeigneten Acrylamid-Barrierematerial, wie
beispielsweise einem Agarose-Gel oder einem Agar-Gel oder einem
beliebigen sonstigen, geeigneten Sicherheitsgelmaterial versehen. Die
erste Acrylamid-Barriere erstreckt sich vorzugsweise in das zweite
Bein (70).
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Eine
zweite Acrylamid-Barriere (95) wird an dem anderen in Längsrichtung
vorhandenen Ende der Kassette (1) als ein Pufferbereich
zwischen dem Acrylamid und der Öffnung
(32) vorgesehen, wodurch der Kontakt durch diese Öffnung vermieden wird.
Die zweite Falle (95) wird ökonomischerweise durch das
zweite hohle Bein (60) bereitgestellt, das beispielsweise
ein Agarose-Gel oder ein beliebiges sonstiges geeignetes Barrierematerial
enthält.
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Auf
diese Weise wird, selbst wenn die Öffnungen (76) und
(66) in den Beinen (70) bzw. (60) unverschlossen
bleiben, das Acrylamid, das in dem Hybridgel (36) enthalten
ist, nicht der äußeren Umgebung
ausgesetzt.
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Die
Acrylamid-Barrieren (90), (95) werden im Allgemeinen
hergestellt, bevor das Hybridgel (36) in der ersten Elektrophoresekammer
(30) gegossen wird. Mit entferntem Deckel (50),
eingeschlossen Teil (55), und mit unteren Enden der Beine
(60) und (70), die mit einem geeigneten klebenden
Abziehstreifen verschlossen sind, wird das Agarose-Gel (79)
oder eine andere geeignete Barriere-Substanz in das Bein (70)
und die Kammer (40) bis zu der Höhe des höheren Teils (11) des
Bodens (10) gegossen. Gleichzeitig oder daran anschließend wird
ein Agarose-Gel (69) oder eine sonstige geeignete Barriere-Substanz
in das Bein (60) vorzugsweise bis auf die Höhe des höheren Teils
(11) des Bodens (10) gegossen. Wenn die Gele (79)
und (69) erstarrt sind, kann das Agarose/Acrylamid-Hybridgel
(36) wie weiter oben beschrieben in die erste Kammer (30)
gegossen werden, wonach man es erstarren lässt.
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Alternativ
kann eine einfachere Kassette (1) ohne die erste Acrylamid-Barriere (90),
allerdings mit der zweiten Acrylamid-Barriere (95) bereitgestellt werden,
wenn dies erwünscht
ist.
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In
derartigen Fällen
kann die Kassette (1) ohne die zweite Kammer (40)
bereitgestellt werden, was zu einer vereinfachten Struktur führt. Der
Boden (10) umfasst dann nur das höhere Teil (11), die
Seitenwände
(12), (14) schließen nicht die kürzeren Seitenwandanteile
(12') bzw.
(14') ein,
und die Zwischenwand (90) wird durch die Endwand (18)
ersetzt. In gleicher Weise wird die obere Wand (55) nicht
benötigt.
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Während die
erste Acrylamid-Barriere (90) so beschrieben worden ist,
dass sie in der Form einer zweiten Kammer (40) auf einer
Höhe unterhalb
der Höhe
der ersten Kammer (30) vorliegt, die optional weiterhin
ein Bein (70) umfasst, das eine geeignete Barriere-Substanz
aufnimmt, muss dieses nicht allgemein der Fall sein. In ähnlicher
Weise ist dies auch bei der zweiten Acrylamid-Barriere, auch wenn
sie in der bevorzugten Ausführungsform
so beschrieben wurde, dass sie in der Form eines Beins (60)
vorliegt, dass eine geeignete Barriere-Substanz enthält, nicht notwendigerweise
der Fall. Die erste Acrylamid-Barriere (90) und die zweite
Acrylamid-Barriere (95) müssen beide minimal nur daran
angepasst sein, dass sie die ionische Verbin dung zwischen dem Bereich
außerhalb
der Kassette (1) über
das Bein (70) bzw. das Bein (60) und dem Hybridgel
(36), das in der ersten Kammer (30) enthalten
ist, ermöglichen
und ein geeignetes Barrierematerial zwischen dem Bereich außerhalb
der Kassette (1) und dem Acrylamid in dem Hybridgel (36),
typischerweise dem zweiten Anteil (38) davon, enthalten.
Jegliche Anordnung der ersten Acrylamid-Barriere (90) und/oder der
zweiten Acrylamid-Barriere (95), die diese Kriterien erfüllt, ist im
Allgemeinen geeignet. In einer einfacheren Kassette wird demnach
beispielsweise eine einzige Kammer bereitgestellt, in der ein Ende
und vorzugsweise beide Enden mit einem Barrierematerial, wie beispielsweise
einem Agarose-Gel, versehen sind, das an das Hybridgel, das in der
Elektrophoresekammer untergebracht ist, angrenzt und sich mit diesem in
Verbindung befindet. Während
demnach die erste Acrylamid-Barriere (90) die zweite Kammer
(40) sowie das Bein (70) umfasst, kann optional
eine einfachere Kassette (1) ohne die zweite Kammer (40)
bereitgestellt werden, wenn dies erwünscht wird.
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Weiterhin
kann die Kassette (1) optional auch ohne die Hohlbeine
(60) und (70) bereitgestellt werden, was zu einer
weiter vereinfachten Struktur führt.
Die Verbindung zwischen der ersten Kammer (30) und äußeren ionischen
Lösungen
erfolgt durch die Öffnung
(32) und die Öffnung
(42) in dem Boden (10).
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Unter
Bezugnahme auf 7 umfasst demnach eine zweite
Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ein Gehäuse
(200), das einen Boden (210) und Seitenwände umfasst,
die an ihrem unteren Ende mit dem Boden verbunden sind, wodurch
eine Kammer (234) definiert wird. Eine Hybridgelmatrix
(236), die der Hybridgelmatrix (36) der ersten
Ausführungsform ähnelt, wird
mit den entsprechenden Änderungen
in der Kammer (234) untergebracht. Die Kammer (234)
umfasst Öffnungen
(232) und (242) an den in Längs richtung vorhandenen Enden
des Bodens (210), wodurch die ionische Verbindung zwischen
der Hybridgelmatrix (236) und einer gemeinsamen (oder einem
Paar von beabstandeten) externen Pufferlösungen) hergestellt wird. In
der Hybridgelmatrix (236) werden Taschen (239)
bereitgestellt, in die die Proben, die der Elektrophorese unterzogen
werden sollen, eingebracht werden. Eine Abdeckplatte (250)
kann optional vorgesehen werden, die geeignete Öffnungen (252) für einen
Kamm (280) aufweisen, der in die Öffnungen eingesetzt werden soll,
um die Taschen (239) zu erzeugen. In dieser Ausführungsform
hat der erste Anteil (237) des Hybridgels (236)
auch die Funktion einer ersten Acrylamid-Barriere (290).
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Eine
dritte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst ein Gehäuse (300), das mit den
entsprechenden Änderungen
alle Bestandteile der oben beschriebenen zweiten Ausführungsform aufweist,
die in 8 veranschaulicht wird. Zusätzlich weist die Kammer (234)
jedoch eine zweite Acrylamid-Barriere (295) in der Form
eines dritten Gelanteils (235) auf, der an die Hybridgelmatrix
(236) angrenzt und sich mit dieser in ionischer Verbindung
befindet, der jedoch an dem gegenüberliegenden, in Längsrichtung
vorhandenen Ende des Gehäuses (200),
bezogen auf den ersten Gelanteil (237) des Hybridgels (236)
angeordnet ist. Die dritte Gelmatrix (235) enthält eine
geeignete Barriere-Substanz und stellt die ionische Verbindung zwischen
dem Hybridgel (236) und dem Bereich außerhalb der Kammer (234)
durch die Öffnung
(242) her.
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Eine
vierte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst ein Gehäuse (400), das mit den
entsprechenden Änderungen
alle Bestandteile der oben beschriebenen zweiten Ausführungsform aufweist,
die in 9 veranschaulicht wird. Die Kammer (234)
weist jedoch zusätzlich
ein Paar von Beinen (270), (260) auf, die die Öffnung (32)
bzw. (42) ähnlich
zu den Beinen (70) bzw. (80) der bevor zugten Ausführungsform
mit den entsprechenden Änderungen
nach unten verlängern.
Die erste Acrylamid-Falle (290) kann demnach unabhängig von
dem ersten Gelanteil (237) des Hybridgels (236)
sein und in dem Bein (70) in Form eines geeigneten Barrierematerials (279),
wie Agarose, enthalten sein, und dies kann bei Anwendungen der Fall
sein, bei denen der erste Gelanteil (237) auch etwas Acrylamid
enthalten kann. Alternativ kann die erste Acrylamid-Barriere (290)
sowohl den ersten Anteil (237) des Hybridgels (236)
zusammen mit Agarose oder einer ähnlichen
Barriere-Substanz (279) in dem Bein (70) umfassen.
Die zweite Acrylamid-Barriere (295) kann in Form eines vierten
Gelanteils (269) vorliegen, der an die Hybridgelmatrix
(236) angrenzt und sich mit dieser in ionischer Verbindung
befindet, der jedoch innerhalb des Beins (60) an dem anderen
in Längsrichtung
vorhandenen Ende des Gehäuses
(200), bezogen auf das andere Bein (270), angeordnet
ist. Die vierte Gelmatrix (269) enthält demnach eine geeignete Barriere-Substanz
und sorgt für
die ionische Verbindung zwischen dem Hybridgel (236) und
dem Bereich außerhalb
der Kammer (234) durch die Öffnung (242).