DE60124363T2

DE60124363T2 - Methode zur Herstellung von genormten und/oder subtrahierten cDNA

Info

Publication number: DE60124363T2
Application number: DE60124363T
Authority: DE
Inventors: Yoshihide Tukuba-shi Hayashizaki
Original assignee: Dnaform KK; RIKEN
Current assignee: Dnaform KK; RIKEN
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2001-08-22
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2021-08-23
Also published as: US20020106666A1; EP1197552A3; EP1197552B1; US7049065B2; ATE344834T1; DE60124363D1; HK1045540A1; CA2356123A1; EP1197552A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zum Herstellen von normalisierten und/oder subtrahierten cDNA's oder von cDNA-Bibliotheken.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verbesserung der Normalisierungs- und Subtraktionsschritte durch Entfernen unspezifisch gebundener Hydride.
Stand der Technik
Verfahren zum Herstellen von cDNA-Bibliotheken sind in dem Stand der Technik offenbart worden und sind gut bekannt. Beispielsweise sind diese von Ederly I. et al. in Mol Cell Biol, 1995, 15: 3363–3371, von Kato S. et al. in Gene, 1994, 150: 243–250 und von K. Maruyama et al. in Gene, 1995, 138: 171–174 beschrieben worden.
In dem Stand der Technik beschreiben Carninci et al. in Genomics, 1996, 37: 327–336, Carninci et al. in DNA Research, 1997, 4: 61–66 und Carninci und Hayashizaki in Methods Enzymol, 1999, 303: 1–44 effiziente Verfahren zur Herstellung von cDNA's. Diese Verfahren, welche einen modifizierten "markierten Cap-Fänger" ("tapped cap trapper") umfassen, um nach dem Markieren der Cap-Struktur langsträngige, vollständig codierende und/oder Volllängen-cDNA-Bibliotheken zu selektieren, erlauben die Herstellung langer, vollständig codierender und/oder von Volllängen-cDNA-Bibliotheken, welche alle einer bestimmten codierenden Sequenz und ihre 3'- und 5'-untranslatierten Bereiche (UTR's) enthalten. Solche Bibliotheken sind insbesondere für Sequenzierprojekte im großen Maßstab nützlich, in denen die Gewinnung von langen, vollständig codierenden und/oder von Volllängen- (vollständig codierenden/Volllängen) Klonen aus verkürzten Klonen (EST-Sequenzen) benötigt wird.
Allerdings bringt die Herstellung von langen, vollständig codierenden/Volllängen-cDNA-Bibliotheken Probleme mit sich. Die Herstellung von langen oder vollständig codierenden/Volllängen-cDNA ist für kurzsträngige mRNA's effizienter als für langsträngige mRNA's (Transkripte). Des Weiteren ist das Klonieren und die Amplifikation für langsträngige cDNA's schwieriger als für kurzsträngige cDNA's, welche ferner Größenspannungen einführen. Der Einsatz von verkürzten cDNA's zur Gewinnung von zugehörigen volllängigen ist bei einer Menge im genomischen Maßstab unpraktikabel; allerdings können cDNA's in einer Standardbibliothek entweder in deren langen, vollständig codierenden/Volllängen-Form oder in deren verkürzten Form kloniert sein, was folglich die Entdeckung wenigstens eines EST für jedes Gen unabhängig von der Länge begünstigt.
Ein anderes Problem betrifft die Natur zellulärer mRNA. mRNA kann auf Basis der Expression in häufige (oder reichliche), in mittlere und in seltene mRNA eingeteilt werden. In einer typischen Zelle umfassen 5 bis 10 Arten an häufiger mRNA wenigstens 20 Prozent der mRNA-Menge, umfassen 500 bis 2.000 Arten an mittel exprimierter mRNA 40 bis 60 Prozent der mRNA-Menge und umfassen 10.000 bis 20.000 Arten an selten exprimierter mRNA weniger als 20 bis 40 Prozent der mRNA-Menge. Diese Durchschnittsverteilung kann zwischen verschiedenen Gewebearten beträchtlich differieren und die Anwesenheit zahlreicher hoch exprimierter Gene kann diese Verteilung weiter verändern. Das Sequenzieren von cDNA aus cDNA-Standardbibliotheken ist ineffektiv, selten exprimierte Gene zu entdecken, weil die mittel und hoch exprimierte cDNA letztlich im Überschuss sequenziert wird.
Sobald die meisten mRNA's der häufigen und mittleren Häufigkeitsklassen identifiziert worden sind, wird erwartet, dass die Redundanzgrade 60 übersteigen. Folglich wurde die Verwendung eines Hybridisierungsnormalisierungsverfahrens vorgeschlagen, um dieses Problem zu lösen. Das hinter der Normalisierung stehende Prinzip ist es, die Häufigkeit der häufigsten Klone zu verringern, wohingegen die Häufigkeit der weniger häufigen cDNA's erhöht wird. Verschiedene Verfahren der Normalisierung für die Herstellung von EST cDNA's werden von Soares et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9228–9232, der ein Normalisierungsverfahren zur Herstellung von EST-Sequenzen offenbart hat, eingeführt. Dieses Verfahren basiert auf der Reasoziierung von in amplifizierten Plasmidbibliotheken klonierten Nukleinsäuren. Allerdings sind amplifizierte Plasmidbibliotheken, welche einer Normalisierung unterworfen worden sind, zur Herstellung von langsträngigen, vollständig codierenden/Volllängen cDNA's nicht geeignet. Dies deshalb, weil mit Plasmidbibliotheken, bei denen kurzsträngige cDNA's effizient kloniert werden, wobei die Klonierungseffizienz mit der Länge des Stranges abnimmt, eine Klonierungsverzerrung verbunden ist. Tatsächlich muss die DNA bei Soares et al., 1994, in ein Plasmid kloniert werden und dann zu Tester-Einzelstrang-DNA umgewandelt werden. Die Ligation zu Plasmiden verringert die Stranglänge der cDNA, welche gewonnen wird (d.h. es besteht eine Tendenz, dass lange Stränge von cDNA verloren werden).
Während einer Bibliothekenamplifikation vor der Normalisierung differiert die Leichtigkeit, mit der cDNA-Klone wachsen, des Weiteren abhängig von der Plasmidlänge. Daher besteht eine dahingehende Tendenz, dass langsträngige, vollständig codierende/Volllängen-Klone nach einer Amplifikation der Bibliothek unterrepräsentiert sind. In amplifizierten Plasmidbibliotheken wird die Gewinnung von vollständig codierenden/Volllängen-Klonen noch schwerer.
In anderer Literatur, wie beispielsweise Tanaka et al., 1996, Genomics, 35: 231–235, werden Verfahren zur Herstellung von EST-Sequenzen offenbart, in denen zunächst mRNA an auf einer festen Matrix konjugiertem Oligo-dT angelagert wird. Dieses Verfahren ist wegen dem mRNA-Abbau vor der cDNA Synthese nicht zum Herstellen von normalisierten langsträngigen, vollständig codierenden/Volllängen cDNA's geeignet. Des Weiteren ist die Hybridisierungsgeschwindigkeit von auf einer festen Phase immobilisierten Nukleinsäuren langsamer als die bei einer Lösungshybridisierung.
Die mit PCR und mit Normalisierungstechniken auf Basis fester Matrix erzeugten Bibliotheken, welche in dem Stand der Technik bekannt sind, weisen eine Sequenzredundanz auf, welche zu der von in EST-Projekten eingesetzten, nicht normalisierten cDNA-Bibliotheken ähnlich ist.
Ein weiteres Problem besteht darin, dass es bei der Herstellung von cDNA-Bibliotheken oder -Enzyklopädien (beispielsweise einer Säugetier-Volllängen-cDNA-Enzyklopädie) mit dem Ziel des Sammelns wenigstens einer langsträngigen, vollständig codierenden/Volllängen-cDNA für jedes exprimierte Gen unabhängig von der Gewebequelle nicht nur wünschenswert ist, cDNA's zu entfernen, welche in der Bibliothek häufig vorliegen, sondern auch, cDNA's zu entfernen, welche in vorherigen Bibliotheken bereits vorgekommen sind, um so die Entdeckung von neuen langsträngigen, vollständig codierenden/Volllängen-cDNA's zu beschleunigen.
Um dieses Problem zu lösen, sind Subtraktionshybridisierungsverfahren vorgeschlagen worden.
Sagerstrom et al., Annu. Rev. Biochem., 1997, 66: 751–83 gibt einen Überblick über die in dem Stand der Technik bekannten Subtraktionsverfahren. Die Grundidee der Subtraktion ist es, dass die Nukleinsäure, aus welcher man unterschiedlich exprimierte Sequenzen (den Tracer oder Tester) isolieren will, mit komplementärer Nukleinsäure (Driver) hybridisiert wird, von der man glaubt, dass diese keine Zielsequenzen aufweist, und in welcher die Driver in viel höherer Konzentration als die Tester vorliegen. Die Tester- und Driver-Nukleinsäurepopulationen werden hybridisiert, wobei lediglich Sequenzen Hybride bilden, welche gemeinsam in den beiden Populationen vorliegen. Nach der Hybridisierung werden die Driver-Tester-Hybride und die nicht hybridisierten Driver entfernt und die verbliebenen Nukleinsäuren können eingesetzt werden, um eine Bibliothek herzustellen, welche reich an testerspezifischen Klonen ist, oder, um Sonden herzustellen, welche eingesetzt werden können, um eine Bibliothek auf testerspezifische Klone zu screenen.
Allerdings sind mit den Subtraktionsverfahren ebenfalls einige Probleme verbunden, welche für die Normalisierung von mit auf PCR- und auf festen Matrizes basierenden Technologien beschrieben worden sind. Diese sind für die Herstellung von EST-Sequenzen geeignet, können aber nicht eingesetzt werden, um langsträngige, vollständig codierende/Volllängen cDNA's herzustellen.
Martin et al., 2000, PNAS, Bd. 97, Nr. 8, S. 3789–3791 gibt eine Erklärung für Verfahren, welche die Identifizierung exprimierter Gene einbeziehen, und vergleicht die Vorzüge von EST-Sequenzieren mit denen von Normalisierungs- und Subtraktionsverfahren.
Bonaldo et al., 1996, Genome Research, 6: 791–806 offenbart einen subtraktiven Hybridisierungsansatz, welcher speziell angewendet wird, um die Expression von Pools von bereits sequenzierten Klonen aus normalisierten Bibliotheken, welche noch zu untersuchen sind, zu verringern.
Diese Normalisierungs- und Subtraktions-Technik (Bonaldo et al., 1996) ist für die Entdeckung von Genen in großem Ausmaß bei der EST-Forschung einsetzbar, weist jedoch die bereits für den Stand der Technik angedeuteten Nachteile auf (in amplifiziertes Plasmid klonierte cDNA, wie von Soares et al., 1994 offenbart) und ist nicht für langsträngige und vollständig codierende/Volllängen cDNA-Inserts geeignet.
Insbesondere variiert, wie zuvor ausgeführt, während der Amplifikation der Bibliothek vor den Normalisierungs- und Subtraktionsschritten die Amplifikation von cDNA-Klonen abhängig von der Plasmidlänge, wobei nach der Bulk-Amplifikation der Bibliothek lange Klone unterrepräsentiert sind. Das heißt, die relative Expression langstränger cDNA-Klone nimmt ab, was derartiges Klonieren schwierig macht.
Ein weiteres Problem des von Bonaldo et al. offenbarten Normalisierungs- und Subtraktionsverfahrens ist, dass sowohl die Normalisierungs- als auch die Subtraktionsschritte eine Inkubation erfordern und ein Inkubationszeitraum insbesondere das Aufbrechen von Plasmiden – größeren Plasmiden (enthaltend langsträngige cDNA's) verursacht. Als eine Konsequenz der Normalisierungs- und Subtraktionsschritte ist die Anzahl der resultierenden langen Klone sehr beschränkt oder gleich null.
Dies bestätigt ebenfalls die Ungeeignetheit dieses Verfahrens zur Herstellung von normalisierten und subtrahierten langsträngigen, vollständig codierenden/Volllängen-cDNA's.
Shibata et al., 1998, Nippon Bunshi Scibutsu Gakkai Nenkai Program Kouen Youshishuu, Bd. 1P-565, S. 322, schlagen vor, die Effizienz der Gewinnung von Volllängen-cDNA durch zufälliges Sequenzieren und dann durch Auswählen der Sequenzen unter Einsatz eines Verfahrens, welches die Subtraktions- und Normalisierungsverfahren kombiniert, zu erhöhen, um cDNA-Bibliotheken mit weniger häufigen und weniger mittleren Sequenzen in den resultierenden Bibliotheken zu erzeugen.
Ein mit den Normalisierungs- und/oder Subtraktionsverfahren verbundenes Problem ist, dass sich aufgrund der komplementären Bindung von fehlerhaften Sequenzen in diesen Schritten unspezifisch gebundene Tester/Driver-Hybride bilden. Die Entfernung solcher Hybride würde zu der Entfernung von Tester aus den Ziel-cDNA's führen, welche irrtümlich als häufig und/oder als bereits in anderen Bibliotheken sequenziert worden zu sein betrachtet werden, welche aber in Realität nicht häufig sind und vorher nicht sequenziert worden sind.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die vielen Probleme des Standes der Technik zu lösen, und ein effizientes Verfahren zur Herstellung von normalisierten und/oder subtrahierten langsträngigen und vollständig codierenden/Volllängen cDNA-Bibliotheken bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, welches nicht nur zur Normalisierung von cDNA geeignet ist, sondern ebenfalls zum Subtrahieren von cDNA's geeignet ist, welche bereits in anderen Bibliotheken erschienen sind. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein effizientes Verfahren zur Herstellung von normalisierten und/oder subtrahierten cDNA's, und zwar vorzugsweise von langsträngiger und/oder vollständig codierender/Volllängen-cDNA oder von cDNA-Bibliotheken, bereit. Basierend auf diesem Verfahren werden die Probleme der auf PCR und fester Matrix basierenden Techniken gelöst.
Dementsprechend betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von normalisierter und/oder subtrahierter cDNA.
Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

I) Herstellen unklonierter Tester-cDNA, vorzugsweise einer Tester-cDNA, welche nicht in Plasmid kloniert ist;
II) Herstellen von Driver-Polynukleotiden zur Normalisierung und/oder zur Subtraktion;
III) Normalisieren und/oder Subtrahieren (ein, zwei oder mehr Schritte), Entfernen der Tester/Driver-Hybride, welche durch die Normalisierung und/oder die Subtraktion erhalten worden sind, und Entfernen der nicht hybridisierten Driver-Polynukleotide sowie
IV) Gewinnen der normalisierten und/oder subtrahierten cDNA.

Die Tester-DNA von Schritt I) ist vorzugsweise langsträngige, vollständig codierende/Volllängen-cDNA.
Des Weiteren kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung einen Schritt V) des Herstellens einer Zweitstrang-cDNA, welche zu der normalisierten und/oder subtrahierten cDNA komplementär ist, sowie des Klonierens der Doppelstrang-cDNA, welche gewonnen wird, umfassen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von cDNA, vorzugsweise von langsträngiger, vollständig codierender/Volllängen cDNA, wobei die Normalisierungs- und Subtraktions-Driver miteinander vermischt werden, und wobei die Normalisierung und die Subtraktion in einem einzigen Schritt (Normalisierung/Subtraktion) durchgeführt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Verbessern der Normalisierung und/oder der Subtraktion durch Entfernen von RNA (Driver), welche unspezifisch an cDNA (Tester) gebunden ist, durch Behandeln des unspezifisch bindenden RNA/DNA-Hybrids mit einem Enzym, welches Einzelstrangstellen in Driver-RNA abtrennen kann, bereitgestellt. Dieses Enzym kann eine Nuklease, insbesondere eine Ribonuklease sein, welche Einzelstrang-RNA oder eine Mischung hiervon schneiden kann. Vorzugsweise kann RNase I (auch als RNase 1 bezeichnet) eingesetzt werden.
Diese Behandlung erlaubt das Schneiden in RNA, welche als ein Ergebnis unspezifischen Bindens teilweise einzelsträngig geworden ist, und folglich das selektive Entfernen nicht spezifisch gebundener RNA/DNA-Hybride in jeder Art von nicht spezifisch gebundenem RNA/DNA-Hybrid.
Dementsprechend wird ein Verfahren zum Herstellen einzelsträngiger und/oder doppelsträngiger cDNA durch Behandeln nicht spezifisch gebundener RNA/DNA-Hybride mit einem Enzym, welches Einzelstrang-RNA schneiden kann (Stellen in RNA, welche teilweise einzelsträngig geworden ist, schneiden kann), durch Entfernen der geschnittenen RNA und durch Gewinnen der cDNA bereitgestellt.
Die durch jedes der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte normalisierte und/oder subtrahierte cDNA kann einzelsträngige oder doppelsträngige cDNA sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Schema eines geeigneten Protokolls zur Herstellung normalisierter und/oder subtrahierter cDNA. A) Ein allgemeines Schema zur Herstellung einzelsträngiger langsträngiger, vollständig codierender/Volllängen-cDNA; B) Darstellung einer Population von unterschiedlichen Tester-cDNA's; C) normalisierende Driver (zelluläre mRNA) und subtrahierende Driver ("run-off" Transkripte); D) Hybridisierung; E) seltene/neue cDNA's werden zur Herstellung einer Zweitstrang-cDNA eingesetzt (normalisierte/subtrahierte cDNA Bibliothek); F) häufige cDNA's/unerwünschte cDNA's werden entfernt und können für die Herstellung von Minibibliotheken eingesetzt werden, um Subtraktion umzusetzen.
2 zeigt (auf der rechten Seite der Zeichnung) die Verwendung von RNase I, welche unspezifisch an cDNA (Tester) gebundene RNA (Driver) erkennen und schneiden kann. Mit diesem Verfahren werden neue und/oder seltene cDNA's gewonnen. Wie auf der linken Seite der Figur gezeigt, wird der neue und/oder seltene Tester, welcher nicht spezifisch an den Driver gebunden ist, durch Partikel eingefangen und entfernt, wenn keine RNase I Behandlung durchgeführt wird.
3 zeigt auf der rechten Seite ein Elektrophoresemuster von in einem einzigen Schritt durchgeführter Normalisierung/Subtraktion von Pankreas-cDNA verglichen mit einem Lauf von Pankreas-cDNA, welche nicht normalisiert/subtrahiert worden ist. Dieses Beispiel der Normalisierung/Subtraktion zeigt ein visuelles Bild der Entfernung von sehr häufigen Volllängen-cDNA's, welche in dem Beispiel von cDNA, welche nicht normalisiert/subtrahiert worden ist (angezeigt durch Pfeile), sichtbar sind.
4 zeigt die Ergebnisse einer Plaque-Hybridisierung von Kopien für die Gene EF-1 alpha, Carbonylreduktase und Uteroglobin enthaltend eine Standardlängen (nicht normalisiert und nicht subtrahiert)-cDNA Bibliothek (links) oder eine normalisierte Längen cDNA-Bibliothek (rechts). Auf der rechten Seite (normalisiert) zeigt der Pfeil die Plaques an, welche gezählt worden sind. Die Anzahl der Plaques (Klone), welche für die normalisierte Bibliothek gezählt worden sind, ist beträchtlich niedriger als die für die Standardbibliothek.
5 zeigt Ergebnisse, in denen die Erhöhung in der Sequenzredundanz (oder die Abnahme in der Entdeckung neuer Gene) in Standard cDNA-Bibliotheken (-000 Bibliotheken) stark ansteigt; aber in normalisierten/subtrahierten Volllängen-cDNA-Bibliotheken (-100 Bibliotheken) ist der Anstieg in der Redundanz vergleichsweise gering. Neue Gene (Prozent) sind innerhalb einer gegebenen cDNA-Bibliothek als Einzelstücke (Prozent) dargestellt.
6 zeigt eine Elektrophoreseverfahrenuntersuchung zum Evaluieren der Wirksamkeit des Entfernens eines gefangenen Drivers/Testers unter Einsatz des auf der vorliegenden Erfindung basierenden Subtraktionsverfahrens.
Lediglich ein Klon (cDNA) Tester wurde eingesetzt und dieser wurde mit einem mit derselben cDNA hergestellten Driver subtrahiert.
Die Spuren 1 bis 3 zeigen subtrahierte cDNA, wenn eine Biotinylierung auf Eis durchgeführt wurde, und die Spuren 4 bis 6 zeigen subtrahierte cDNA, wenn eine Biotinylierung bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt wurde. Die Spuren 7 bis 9 enthalten Tester und Driver ohne Partikelbehandlung (daher nicht entfernt) bei 100 Prozent, 10 Prozent bzw. 2 Prozent.
Die Spur 9 zeigt, dass eine Menge von 2 Prozent, selbst wenn gering, immer noch sichtbar ist. In den Spuren 1 bis 6 ist kein Tester/Driver-Hybrid sichtbar, was zeigt, dass die Subtraktion nahezu 100 Prozent betrug.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein effizientes Verfahren zur Herstellung von normalisierter und/oder subtrahier ter cDNA oder von cDNA-Bibliotheken, vorzugsweise von langen und/oder vollständig codierenden/Volllängen cDNA-Bibliotheken, durch Herstellen unklonierter cDNA als Tester bereitgestellt. Die unklonierte Tester-cDNA kann cDNA sein, welche nicht in Plasmid kloniert worden ist.
Dieses Verfahren benötigt keinen PCR-Klonierungsschritt und nicht die Bindung von Oligo-dT an feste Matrix vor dem/den Normalisierungs- und/oder Subtraktions-Schritt(en) (ein, zwei oder mehr Schritte). Als Ergebnis werden lange und/oder vollständig codierende/Volllängen-cDNA's gewonnen.
Dementsprechend kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung lediglich den Normalisierungsschritt, lediglich den Subtraktionsschritt, sowohl den Normalisierungsschritt als auch den Subtraktionsschritt in jeder Reihenfolge oder eine in einem einzigen Schritt durchgeführte Normalisierung und Subtraktion umfassen.
Diese normalisierten und/oder subtrahierten cDNA's werden behandelt, um, wenn diese einzelsträngig sind, einen komplementären Zweitstrang zu synthetisieren, und werden schließlich kloniert.
Dementsprechend umfasst dieses Verfahren die folgenden Schritte:

I) Herstellen einer nicht klonierten cDNA (Tester);
II) Herstellen von Polynukleotid (Driver) für die Normalisierung und/oder die Subtraktion;
III) Durchführen des/der Normalisierungs- und/oder Subtraktionsschritte) (ein, zwei oder mehr Schritte) und Entfernen der durch die Normalisierung und/oder die Subtraktion gewon nenen Tester/Driver-Hybride und der nicht hybridisierten Driver-Polynukleotide sowie
IV) Gewinnen normalisierter und/oder subtrahierter cDNA (seltene und/oder neue cDNA's), wobei die Normalisierungsdriver aus demselben Gewebe erhaltene RNA oder DNA sind oder aus Nukleinsäuren desselben Ursprung wie die Tester-cDNA bestehen,

Wenn die Tester-cDNA einzelsträngig ist, umfasst das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung des Weiteren einen Schritt V): Herstellen des cDNA-Zweitstranges und Klonieren.
Die vorgenannten Schritte I) bis V) können, wenn zweckmäßig, mehrere Male (zweimal, dreimal, etc.) wiederholt werden.
Die nicht klonierte Tester-cDNA von Schritt I) kann nicht in Plasmid codierte cDNA sein. Die Tester-cDNA von Schritt I) kann ein reverses Transkript von mRNA in der Form einer nicht klonierten cDNA sein. Die nicht klonierte cDNA von Schritt I) ist vorzugsweise eine lange und/oder eine vollständig codierende/Volllängen Tester-cDNA.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "Volllängen-cDNA" eingesetzt, um 5'- und 3'-UTR-Sequenzen und T-Primer Oligonukleotide (welche zu poly-A enthaltender mRNA komplementär sind) zu bezeichnen. "Vollständig codierende cDNA" bedeutet eine cDNA-Sequenz, welche wenigstens ein Startcodon sowie ein Stoppcodon umfasst. Unter "langsträngiger cDNA" wird eine cDNA-Sequenz verstanden, welche nahezu vollständig codierend und/oder volllängig ist, der aber an dem 3'-Ende (korrespondierend zu dem 5'-Ende von mRNA) oder an dem 5'-Ende eine oder mehrere Basen fehlen, wenn ein cDNA-Strang komplementär zu cDNA, welche komplementär zu mRNA ist (das heißt, cDNA mit derselben Richtung wie das Gen), betrachtet wird. Dieser frühe Stopp (vor dem Erreichen des 5'-Endes) kann durch die Bildung einer Sekundärstruktur in der mRNA an der Cap-Struktur verursacht sein, was die Synthese von cDNA verhindert.
Die Tester-cDNA gemäß der vorliegenden Erfindung kann einzel- oder doppelsträngig sein. In dem Fall von Doppelstrang wird diese gemäß der in dem Stand der Technik bekannten Techniken, um eine Dissoziation von Doppelstrang-cDNA in Einzelstrang zu ermöglichen, und in der Gegenwart von Driver-RNA, um die Bildung von cDNA/RNA-Hybrid zu erlauben, behandelt. Ein Beispiel dieser Technik umfasst das Vermischen der Tester-Doppelstrang-cDNA und der Driver-RNA in der Gegenwart von Formamid bei einer Konzentration von mehr als 50 %, vorzugsweise 80 %, bei einer Temperatur von 40 °C bis 60 °C, vorzugsweise 50 °C, in einem gewöhnlichen Hybridisierungspuffer.
Die Tester-cDNA von Schritt I) kann durch jedes in dem Stand der Technik zur cDNA Herstellung bekannte Verfahren hergestellt werden, vorzugsweise durch jedes Verfahren zur Herstellung von langsträngigen und/oder vollständig codierenden und Volllängen-cDNA's. Beispiele sind Ederly et al., Kato et al. sowie Maruyama et al. (die Oligofangmethode).
Insbesondere ist das Oligofangverfahren ein Verfahren, bei dem Phosphorsäureester unvollständiger cDNA's ohne 5'-Cap's mit alkalischer Phosphatase entfernt werden und dann alle cDNA's mit Tabaksäure-Pyrophosphatase (TAP), welche als Entcapenyzm eingesetzt wird, behandelt werden, so dass lediglich Volllängen-cDNA's Phosphate aufweisen.
Vorzugsweise wird ein Verfahren eingesetzt, welches die von Carninci et al., 1996, Genomics 37: 327–336 und die von Carninci und Hayashizaki, 1999, Methods Enzymol., 303: 1–44 beschriebene Cap-Markierungstechnik verwendet.
Ein Beispiel dieses Verfahrens ist schematisch in dem Abschnitt A der 1 dargestellt.
mRNA wird aus Gewebe isoliert und RNA-DNA-Hybride werden ausgehend von Primern, wie beispielsweise Oligo-dT oder zufälligen oder spezifischen Primeradaptern, durch reverse Transkriptase unter Einsatz von mRNA als Matrize ("Template") hergestellt. Ein Markierungsmolekül wird dann chemisch an die Diolstruktur der 5'-Cap (^7MeG_pppN)-Stelle der das Hybrid bildenden mRNA gebunden. Schließlich werden RNA-DNA-Hybride, welche eine DNA korrespondierend zu langer, vollständig codierender/Volllängen-mRNA tragen, von den Hybriden, welche Markierungsmoleküle tragen, durch Binden der Markierungsmoleküle abgetrennt.
Markierungsmoleküle, welche nach der Bildung der RNA-DNA-Hybride an den Cap gebunden sind, sind insbesondere vorteilhaft, weil die Hybridstruktur von RNA-DNA die chemische Hydrolyse von mRNA während der für das Markieren von mRNA's mit Markierungsmolekülen notwendigen Aldehydbildung aus der Diolstruktur vermeiden kann. Als ein Ergebnis hiervon wird die Effizienz der vollständig codierenden/Volllängen cDNA-Synthese erhöht.
Die Markierungsmoleküle können beispielsweise durch eine ringöffnende Oxidationsreaktion der 5'-Cap-Stellen-Diolstruktur mit einem Oxidationsmittel, wie beispielsweise Natriumperiodat, um ein Dialdehyd zu bilden, und nachfolgende Reaktion des Dialdehyds mit einem ein Hydrazinende aufweisenden Markierungsmolekül an die 5'-Cap-Stelle gebunden werden.
Beispiele für Markierungsmoleküle mit Hydrazinenden sind Biotin, Avidin und Streptavidin sowie Digoxygeninmoleküle mit Hydrazinenden. Ein Molekül, welches eine Reaktionsspezifität zeigt, wie Antigene und Antikörper, kann ebenfalls als Markierungsmolekül eingesetzt werden. Das Markierungsmolekül, welches als Anhängermolekül eingesetzt wird, ist nicht spezifisch beschränkt.
Dementsprechend umfasst die zur Umsetzung der auf der vorliegenden Erfindung basierenden Verfahren eingesetzte Herstellung von cDNA die Schritte:

(1) Synthetisieren eines ersten Stranges von cDNA durch reverse Transkriptase unter Bildung eines mRNA/cDNA-Hybrids,
(2) chemisches Binden eines Markierungsmoleküls an die Diolstruktur der 5'-Cap (^7MeG_pppN)-Stelle der das Hybrid bildenden mRNA,
(3) Einfangen langer, vollständig codierender und volllängiger cDNA-Hybride sowie
(4) Entfernen einzelsträngiger mRNA durch Schneiden mit einem Enzym (vorzugsweise mit RNase H), welches Einzelstrang-mRNA schneiden kann, oder durch Einsatz einer Base (vorzugsweise von NaOH).

Ein spezifischeres Beispiel eines Verfahrens zur Herstellung von cDNA umfassend die Schritte (1) Synthetisieren von Erststrang-cDNA bis (7) Synthetisieren von doppelsträngiger vollständig codierender/Volllängen-cDNA (mit beispielsweise Biotin als Markierungsmolekül) ist wie folgt:

(1) Synthese von Erststrang-cDNA (Synthese eines RNA-DNA-Hybrids),
(2) Biotinylierung einer mRNA des RNA-DNA-Hybrids,
(3) Ribonuklease I (RNase I)-Verdau,
(4) Einfangen eines vollständig codierenden/Volllängen cDNA-Hybrids (mit Avidin oder Streptavidin-Partikeln),
(5) Entfernen von Hybrid-RNA (RNase H-Verdau),
(6) Hinzufügen eines G-Endes durch terminale Deoxynukleotidyltransferase sowie
(7) Herstellung eines Zweitstranges (doppelsträngige vollständig codierende/Volllängen-cDNA), welcher mit Oligo-C geprimt ist.

Alternativ dazu kann der Schritt (5) mit einer Base (vorzugsweise mit NaOH) durchgeführt werden. Die in Schritt (6) hergestellte cDNA kann für den Zweck der vorliegenden Erfindung als Tester-cDNA eingesetzt werden. Nach der Normalisierung und/oder der Subtraktion kann der Schritt (7) durchgeführt werden. Die durch das Verfahren von Schritt I) erhaltene cDNA besteht aus mehreren Populationen von cDNA, nämlich häufiger (oder hoch exprimierter oder Klasse I) cDNA, mittlerer (oder Klasse II) cDNA und seltener cDNA (Klasse III), wie in dem Abschnitt B der 1 gezeigt (mittlere und häufige sind in Abschnitt B zusammen als häufig dargestellt). Einige dieser cDNA's müssen so betrachtet werden, dass diese kürzlich in anderen Bibliotheken gesammelt worden sind, und diese sind in dem Abschnitt B als zuvor gesammelte cDNA dargestellt. Die cDNA's, welche erhalten worden sind, sind in dem Abschnitt B als "Tester" dargestellt.
In dem Schritt II) werden "Driver" für die Normalisierung und/oder die Subtraktion hergestellt.
Normalisierungs-Driver sind RNA oder DNA, welche aus demselben Gewebe wie die Population und/oder aus derselben Population, welche man beabsichtigt, zu entfernen, erhalten werden.
Die Normalisierugns-Driver können beispielsweise zelluläre mRNA's derselben Bibliothek sein, das heißt Teilmengen der anfänglich zur Herstellung der cDNA-Bibliothek eingesetzten mRNA's (Ausgangsmaterial mRNA). Normalisierungs-Driver können ebenfalls aus derselben Bibliothek erhaltene cDNA sein, welche man beabsichtigt, zu normalisieren. In diesem Fall müssen aus der cDNA-Bibliothek, beispielsweise durch PCR, einzelsträngige cDNA's hergestellt werden.
Die Subtraktions-Driver sind aus einem anderen Gewebe, von dem man beabsichtigt, zu substrahieren, erhaltene RNA oder DNA oder RNA oder DNA, welche aus demselben oder einem unterschiedlichen Stamm (System), von dem man beabsichtigt, zu subtrahieren, erhalten worden ist, oder welche aus demselben, zu einer anderen Population als der Population, welche man eliminieren will, gehörenden Gewebe erhalten worden ist.
In dem Subtraktionsschritt kann in vitro transkribierte RNA aus einer DNA-Bibliothek, vorzugsweise Klone aus unterschiedlichen Gewebe oder aus demselben, aber einer unterschiedlichen Population angehörenden Gewebe und mit dem Cap-Einfangverfahren hergestellt, eingesetzt werden. Allerdings können für den Zweck der vorliegenden Erfindung mit jedem in dem Stand der Technik bekannten Verfahren, beispielsweise dem von Sagerstrom et al., 1997, Annu. Rev. Biochem., 66: 751–83, hergestellte Substraktions-Driver eingesetzt werden.
Beispielsweise können die Subtraktions-Driver "run-off"-Transkripte aus Minibibliotheken sein, welche exprimierte Gene, umgeordnete Klone und in einigen Fällen (aber nicht notwendigerweise) vorher sequenzierte cDNA's enthält.
Subtraktions-"run-off"-Transkripte werden durch RNA-Polymerase (beispielsweise T7, T3, SP6 oder K11 RNA-Polymerase) aus DNA-Matrizen erhalten, welche geeignete Promotoren tragen, wie beispielsweise eine DNA-Sequenz flankiert mit Promotoren, Plasmiden, Phagen und Analoga hiervon. In dem Fall von Plasmiden können die Substraktionstranskripte durch Amplifizieren der cDNA-Bibliothek oder einer umgeordneten Bibliothek mit einer festen oder flüssigen Phase hergestellt werden. Vorzugsweise können die Subtraktionstranskripte durch Überführen von aus Platten mit Vertiefungen (beispielsweise Platten mit 384 Vertiefungen bzw. 384- well Platten) erhaltenen Kolonien auf LB+ Ampicillin-Agar-Platten, Wachsen derselben bei einer Temperatur zwischen 30 °C und 37 °C und nachfolgendes Übernachtwachstum sowie Sammeln der Kolonien für die Verwendung bei der Plasmidherstellung in großem Maßstab hergestellt werden.
DNA kann ebenfalls für Subtraktions-Driver eingesetzt werden. In diesem Fall kann aus, aus unterschiedlichen Geweben oder aus demselben, aber zu einer anderen DNA-Population gehörenden Gewebe, erhaltenen Klonen isolierte Einzelstrang-DNA eingesetzt werden.
Minibibliotheken sind ein Teil der Klone des Ausgangsgewebes oder anderer Gewebe enthaltende Bibliotheken.
Ein schematisches Beispiel der Herstellung von Drivern für die Normalisierung und/oder für die Subtraktion ist in dem Abschnitt C der 1 dargestellt. Allerdings umfassen die auf der vorliegenden Erfindung basierenden Verfahren lediglich den Normalisierungsschritt, lediglich den Subtraktionsschritt, die Normalisierungs- und Subtraktionsschritte in jeder beliebigen Reihenfolge oder die Normalisierung/Subtraktion in einem einzigen Schritt. Diese Driver können mit einem Markierungsmolekül verbunden sein. Dieses (erste) Markierungsmolekül kann jedes Molekül sein, das an die Driver binden kann oder sich an die Driver anhängen kann, und welches ferner an eine Matrix binden kann, was die Entfernung des Drivers erlaubt. Das Markierungsmolekül kann auch ein zweites Markierungsmolekül binden, welches dasselbe wie das erste Markierungsmolekül oder ein anderes Molekül sein kann, wobei das zweite Markierungsmolekül sich an eine Matrix oder an ein weiteres Markierungsmolekül binden kann. Bevorzugte Markierungsmolekül sind Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxygenin oder jeder Antikörper hierfür, vorzugsweise ein Antibiotin, ein Antiavidin, ein Antistreptavidin oder ein Antidigoxygenin-Antikörper, oder jeder Antigen-Antikörper hiervon. Allerdings sind die Anhängermoleküle nicht auf diese Substanzen beschränkt.
Die Schritte IIII) und IV) können abhängig davon, ob die Normalisierungs- und die Subtraktionsschritte aufeinanderfolgend oder in einem einzelnen Schritt durchgeführt werden, in unterschiedlicher Reihenfolge ausgeführt werden.
Gemäß einem ersten Ansatz wird der Normalisierungsschritt (III) durch Vermischen mit Normalisierungsdrivern gefolgt von der Entfernung der Hybride und der Gewinnung der normalisierten Einzelstrang-cDNA's (Schritt IV) durchgeführt. Anschließend werden diese Einzelstrang-cDNA's mit subtraktiven Drivern vermischt (Schritt III), werden die Hybride entfernt und werden die (normalisierten und) subtrahierten Einzelstrang-cDNA's gewonnen (Schritt IV). Die Einzelstrang-cDNA's, welche gewonnen werden, bestehen, wie in dem Abschnitt D der 1 beispielhaft dargestellt, aus seltenen und neuen cDNA's. Die Normalisierungs- und die Subtraktionsschritte können auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden.
Gemäß einem anderen Ansatz werden die in Schritt II) hergestellten Normalisierungsdriver und die subtraktiven Driver miteinander vermischt, wobei in Schritt III) ein einziger Normalisierungs-/Subtraktionsschritt durchgeführt wird.
Die Durchführung der Normalisierung/Subtraktion in einem einzelnen Schritt bietet den Vorteil, dass lediglich ein Inkubationsschritt (anstelle von zwei) durchgeführt wird. Das Durchführen der Normalisierung und der Subtraktion in zwei unterschiedlichen Schritten ist mit dem Problem verbunden, dass zwei Inkubationsschritte durchgeführt werden und bei jedem Inkubationsschritt die Tendenz besteht, dass die Anzahl von langen und/oder vollständig codierenden/Volllängen-cDNA's verringert wird. Folglich ist das Durchführen eines einzelnen Inkubationsschrittes vorteilhaft.
Allerdings kann der Normalisierungs- und/oder der Subtraktionsschritt und kann der einzelne Normalisierungs-/Subtraktionsschritt, falls erforderlich, vor der endgültigen Gewinnung der seltenen neuen cDNA's und der Synthese der Zweitstrang-cDNA wiederholt werden.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung von normalisierter und subtrahierter cDNA umfassend die Schritte I) Herstellen einer Tester-cDNA, welche gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unkloniert sein kann, aber nicht darauf beschränkt ist, II) Herstellen von Polynukleotid-Normalisierungsdriver und Polynukleotid-Subtraktionsdriver (Normalisierungs/Subtraktions-Driver), III) Durchführen der Normalisierung und der Subtraktion in einem einzigen Schritt durch Vermischen des Testers und der Normalisierungs-/Subtraktionsdriver miteinander sowie IV) Gewinnen der normalisierten und subtrahierten cDNA.
Dieses Verfahren schließt den Schritt der Zugabe eines Enzyms ein, welches einzelsträngige Driver-RNA, welche nicht spezifisch an Einzelstrang gebunden ist, schneiden kann, beispielsweise unter Verwendung von RNase I und Entfernen der geschnittenen einzelsträngigen Driver-RNA. Dieser Schritt der Zugabe von RNase 1 oder anderem Enzym, welches einsträngige RNA schneiden kann, wird später im Detail beschrieben.
Die Herstellung von Normalisierungs- und/oder subtraktiven Drivern, der/die Hybridisierungsschritt(e) (ein oder mehrere) sowie die Entfernung von "uninteressierenden cDNA's", d.h. der bei den Normalisierungs- und/oder Subtraktionsschritten hergestellten Hybride und einzelne Driver (Driver, welche keine Hybride bilden), können durch jede in dem Stand der Technik bekannte Technik durchgeführt werden. Beispielsweise können diese wie von Bonaldo et al. 1996 und von Sagerstrom et al. 1997, Annu. Rev. Biochem., 66: 751–783 (gemäß Seite 765; ebenfalls Tabelle 1) durchgeführt werden.
Als ein spezifisches Beispiel kann die von Barr F.G. und Beverly S. Emanuel, 1990, Analytical Biochemistry, 186: 369–373 oder von Hazel L. Sive und Tom St. John, 1988, Nucleic Acids Research, Bd. 16, Nummer 22, Seite 10.937 beschriebene Hybridisierungstechnik, welche photoaktiviertes Biotin, Streptavidinbinden und organische Extraktion einbezieht, eingesetzt werden.
Allerdings können die in dem Stand der Technik bekannten Techniken, wie beispielsweise die von Sagerstrom et al. 1997 beschriebene, eingesetzt werden.
Nach der Normalisierung und/oder der Subtraktion werden die Tester/Driver-Hybride durch eines der in dem Stand der Technik bekannten Verfahren, wie beispielsweise dem von Sagerstrom et al., 1997, Seite 765 beschriebenen, entfernt. Beispielsweise kann dies durch die Zugabe einer Matrix, wie beispielsweise von Partikeln, vorzugsweise von magnetischen Partikeln oder von Agarosepartikeln, erfolgen. Die Partikeln werden vorzugsweise, wie zuvor ausgeführt, mit einem Markierungsmolekül beschichtet oder diese binden an Markierungsmoleküle. Mit Streptavidin beschichtete Partikel (im Allgemeinen als "Streptavidin-Partikel" bezeich net), sind bevorzugt, wobei magnetische poröse Streptavidin-Glaspartikel (MPG-Partikel; CPG Inc.) besonders bevorzugt sind. Mit Avidin, Biotin, Digoxygenin, einem Antikörper oder einem Antigen beschichtete oder daran gebundene Partikel können ebenfalls eingesetzt werden. Der die Partikel beschichtende oder an die Partikel gebundene Antikörper (ein, zwei oder mehr Arten Partikel) kann ein Antikörper sein, welcher allgemein Markierungsmoleküle erkennen kann, vorzugsweise ein Antikörper, welcher an die Driver gebundenen Antikörper erkennt, oder ein Antibiotin-Antikörper, ein Antiavidin-Antikörper, ein Antistreptavidin-Antikörper oder ein Antidigoxygenin-Antikörper, welcher an die Driver gebundenes Biotin, Avidin, Streptavidin oder Digoxygenin erkennt.
Ein Beispiel von magnetischen Partikeln, welche mit Biotin als Markierungsmolekül beschichtet sind oder daran gebunden sind und ein Tester/Driver-Hybrid-Partikelaggregat bilden, ist in dem Abschnitt F der 1 dargestellt.
Streptavidin oder Avidin/Phenol kann anstelle von Magnetpartikeln eingesetzt werden, um das Hybrid zu entfernen (Sive H.L. und St. John T., 1988, Nucleic Acids Res., 16: 10937 und Sagerstrom et al., 1997).
Es ist auch möglich, Hydroxyapatit (HAP) sowie nicht markierte RNA einzusetzen, um Tester/Driver-Hybride zu entfernen. Ein Beispiel wird von Sagerstrom et al., Seite 765 und Tabelle 1 beschrieben.
Wie aus der Elektrophorese der 6 und aus Beispiel 3 ersehen werden kann, erlaubt das auf der vorliegenden Erfindung basierende Subtraktionsverfahren eine nahezu 100-prozentige Entfernung der substrahierten Tester/Driver-Hybride.
Die cDNA der entfernten Tester/Driver-Hybride kann für die Herstellung von cDNA-Minibibliotheken eingesetzt werden, welche, wie in dem Abschnitt F der 1 gezeigt, für weitere Subtraktionsschritte eingesetzt werden können.
Die normalisierten und subtrahierten cDNA's (seltene und neue cDNA's), welche in dem Schritt IV) gewonnen werden, werden dann, wie schematisch in dem Abschnitt E der 1 gezeigt, so behandelt, dass cDNA-Zweitstränge synthetisiert werden, werden einer Restriktionshydrolyse unterworfen, ligiert und in Vektoren kloniert.
Der Vorteil des auf der vorliegenden Erfindung basierenden Verfahrens ist, dass dieses in der subtrahierten/normalisierten Bibliothek ein hohes Verhältnis von langen, vollständig codierenden/Volllängen-cDNA's aufrecht erhält. Des Weiteren erhöht die vorliegende Erfindung die Entdeckung neuer Gene verglichen mit den Ergebnissen erhalten unter Einsatz von gemäß dem Stand der Technik hergestellten Volllängen cDNA-Standardbibliotheken.
Das heißt, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung normalisierte und/oder subtrahierte cDNA (Tester-cDNA) ist eine unklonierte cDNA; vorzugsweise eine cDNA, welche nicht in einem Plasmid kloniert ist. Vorzugsweise ist der Tester gemäß der vorliegenden Erfindung ein reverses Transkript von mRNA in der Form von unklonierter cDNA. Diese cDNA ist vorzugsweise ein Einzelstrang. Folglich kann das Problem der Klonierungsverzerrung gegenüber großen cDNA's in Plasmidbibliotheken aus dem Stand der Technik und das durch die auf PCR und festen Matrices basierenden Normalisierungstechniken in Bibliotheken erzeugte Problem vermieden werden und der Vorteil der vermehrten Entdeckung von neuen Genen wird erreicht.
Wie zuvor in dem den Stand der Technik betreffenden Abschnitt ausgeführt ist das die Normalisierungs- und/oder Subtraktionsverfahren betreffende Problem, dass sich während diesen Schritten aufgrund des komplementären Bindens unvollkommener Sequenzen nicht spezifische Tester/Driver-Hybride bilden. Beispielsweise wird dies durch die Querreaktivität zwischen ähnlichen, aber nicht identischen Sequenzen in Testern und Drivern verursacht. Die Entfernung solcher Hybride beseitigt von den Tester-cDNA's diejenigen cDNA's, welche irrtümlich als häufig erachtet werden und/oder als bereits in anderen Bibliotheken sequenziert worden zu sein erachtet werden sowie andere wünschenswerte Sequenzen. Dies stellt einen wesentlichen Nachteil von normalisierten/subtrahierten Bibliotheken dar.
Dieses Problem ist schematisch in der 2 dargestellt. Auf der linken Seite der 2 sind Normalisierungs- und/oder subtraktive Driver (mRNA, obere Stränge) unspezifisch (dort liegt ein Teil der mRNA vor, welcher nicht an die cDNA gebunden ist) an cDNA's (untere Stränge) gebunden, welche neu und/oder selten sind, von denen aber irrtümlich geglaubt wird, dass diese häufig sind und/oder kürzlich gesammelt worden sind. Tester-cDNA's, welche an Driver gebunden sind, obgleich unspezifisch, werden während der Normalisierung und/oder der Subtraktion, wie in der 1 angezeigt, entfernt. Folglich gehen diese, wenn die Tester-cDNA's neu und/oder seltene cDNA's sind, verloren.
Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Driver bei einem solchen unspezifischen Binden, wie beispielsweise auf der rechten Seite der 2 dargestellt, welche unspezifisch an Tester-cDNA's gebunden sind, durch den Abbau von RNA mit RNase I oder einigen ande ren, weiter unten beschriebenen Enzymen entfernt und neue und/oder seltene cDNA wird gewonnen.
Wie in der 2 gezeigt stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem unspezifisch bindende RNA/DNA-Hybride durch ein Enzym, welches einzelsträngige RNA schneidet (ein Enzym mit der Fähigkeit, einzelsträngige Stellen in nicht spezifisch an Tester-cDNA gebundener Driver-RNA zu schneiden), verarbeitet (verdaut) werden, um nicht spezifisch an cDNA (Tester) gebundene einzelsträngige Stellen von RNA (Driver) zu verdauen. Anschließend werden Hybride mit RNA, welche geschnitten worden sind, von den Tester-cDNA's entfernt (denaturiert), um die geschnittene RNA aus dem System zu entfernen, wodurch Tester-cDNA's zurückgelassen werden und die Effizienz der Normalisierung und der Subtraktion erhöht wird (das heißt, der unerwünschten Ausschluss des seltenen cDNA-Systems wird verringert).
Für das Verfahren zur Entfernung von RNA-Fragmenten von unspezifisch gebundenen RNA/DNA-Hybriden, welche mit Enzymen, welche einzelsträngige RNA schneiden, behandelt worden sind, besteht keine Beschränkung. Beispielsweise können die Hybride, wie in der 2 gezeigt, bei einer geeigneten Temperatur verarbeitet werden, um Hybride mit RNA, welche geschnitten worden ist, von der Tester-cDNA zu entfernen, das heißt zu denaturieren, und die von der Tester-cDNA befreite RNA kann unter Verwendung von beispielsweise an die RNA gebundene Markierungen beseitigt werden. Die Entfernung von Hybriden mit RNA, welche geschnitten worden ist, von der Tester-cDNA beeinträchtigt nicht spezifisch gebundene RNA/DNA-Hybride. Die Bedingungen zum selektiven Denaturieren von Hybriden, welche geschnitten worden sind, sowie die Stranglänge des Hybridteils, welcher verkürzt worden ist, werden entsprechend ausgewählt. Die Denaturierungsbedingungen hängen nicht nur von der Temperatur, sondern auch von dem pH-Wert des Systems (der wässrigen, die Hybride enthaltenden Lösung), den Salzkonzentrationen und dergleichen ab. Die Denaturierung wird beispielsweise durch Verarbeiten bei einer Temperatur von 25 °C bis 100 °C (das heißt bis zu dem Siedepunkt), vorzugsweise zwischen 37 °C und 70 °C und besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 65 °C durchgeführt. Die Anwendung der vorgenannten Temperatur denaturiert Hybride von teilweise geschnittener RNA, wobei die vorher in den Hybriden enthaltene RNA von der cDNA dissoziiert, die dissoziierte RNA unter Verwendung von an die RNA gebundenen Markierungen an Partikel gebunden wird und die an die Partikel gebundenen RNA-Fragmente durch die herkömmlichen Verfahren mit einem Magnet entfernt werden. Spezifisch gebundene RNA/DNA-Hybride werden unter den zuvor genannten Denaturierungsbedingungen instand gehalten und die in derselben Weise wie zuvor ausgeführt an die RNA gebundenen Markierungen können zum Binden an Partikel und zum Entfernen eingesetzt werden. Das heißt, es wird eine herkömmliche Normalisierung und/oder Subtraktion durchgeführt.
Eine einzelstrangspezfische RNA-Endonuklease (Ribonuklease) kann als das zuvor beschriebene Enzym, welches einzelsträngige RNA schneidet, verwendet werden. Zur Verwendung geeignete Beispiele sind für Pyrimidin (U und C) spezifische RNaseA, für U spezifische RNase 4, für G spezifische RNase T1, für U spezifische RNase 2 oder RNase 3 sowie RNase I, welche jedes Ribonukleosid abbauen kann (Hyone-Myong Eun, Kapitel "Nukleasen"; Sorrentino Salvatore und Libonati Massimo, 1997, FEBS Letters, 404: 1–5; diese Autoren verwenden arabische Zahlen, um die vorgenannten Ribonukleasen zu benennen; allerdings werden diese Ribonukleasen in der Literatur auch mit römischen Nummern versehen). Alternativ dazu kann RNase T2 mit einer geringen Basenspezifität als das einzelsträngige RNA schneidende Enzym eingesetzt werden (BioTechniques, 232, Bd. 12, Nr. 2, 1992).
Vorzugsweise wird RNase I als das einzelsträngige RNA schneidende Enzym eingesetzt. Es kann ebenfalls eine Mischung der zuvor aufgeführten Ribonukleasen eingesetzt werden. Hybride können durch die herkömmlichen Verfahren der Wirkung einzelstrangspezifischer RNA-Endonukleasen unterworfen werden. Beispielsweise können 0,01 bis 1 Einheit einer einzelstrangspezifischen RNA-Endonuklease pro 1 μg Driver eingesetzt werden.
Der Schritt des Abbauens von Driver-mRNA, welche unspezifisch an Tester-cDNA's gebunden ist, kann bei dem auf der vorliegenden Erfindung basierenden Normalisierungs-/Subtraktionsschritt, nach dem Normalisierungs- und/oder Subtraktionsschritt oder nach einem einzelnen Normalisierungs-/Subtraktionsschritt durchgeführt werden.
Die Tester-cDNA gemäß diesem Verfahren kann klonierte oder unklonierte cDNA sein. Unklonierter Tester kann beispielsweise eine cDNA sein, welche nicht in einem Plasmid kloniert ist. Die Tester-cDNA ist vorzugsweise ein reverses Transkript von mRNA in der Form von unklonierter cDNA.
Die Tester-cDNA ist vorzugsweise eine langsträngige, vollständig codierende und/oder Volllängen-cDNA, welche vorzugsweise gemäß dem zuvor beschriebenen Cap-Markierungsverfahren hergestellt worden ist.
Dementsprechend umfasst eine weitere Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere die Schritte:

(a) Herstellen von Tester-cDNA's,
(b) Herstellen von Normalisierungs- und/oder Subtraktions-Driver-RNA,
(c) Durchführen der Normalisierung und/oder der Subtraktion in jeder beliebigen Reihenfolge in zwei Schritten oder Durchführen der Normalisierung J Subtraktion in einem einzelnen Schritt durch Vermischen der Normalisierungs-/Subtraktions-Driver-RNA's mit den Tester-cDNA's,
(d) Zugabe eines Enzyms, welches Einzelstrangstellen auf Driver-RNA's, welche unspezifisch an Tester-cDNA's gebunden sind, schneiden kann,
(e) Entfernen der geschnittenen Einzelstrang-Driver-RNA's aus Schritt d) von den Tester und Entfernen der Tester/Driver-Hybride,
(f) Gewinnen normalisierter und/oder subtrahierter cDNA's sowie
(g) Herstellen von Zweitstrang-cDNA's und Klonieren der gewonnenen cDNA's.

Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zum Herstellen normalisierter und/oder subtrahierter cDNA, in dem ein Enzym, welches einzelsträngige Driver-RNA, welche unspezifisch an Tester-cDNA gebunden ist, abbauen kann, zugefügt wird und die abgebaute einzelsträngige Driver-RNA entfernt wird. Bei diesem Verfahren werden Tester-cDNA und einzelsträngige Driver-RNA, welche unspezifisch an die Tester-cDNA ge bunden ist, enthaltende Hybride der Wirkung eines Enzyms unterworfen, welches einzelsträngige Driver-RNA abbauen kann, und nach dem Abbau wird die abgebaute einzelsträngige Driver-RNA aus dem die Hybride enthaltenden System entfernt.
Bei diesem Verfahren wird in der gleichen Weise wie zuvor das zum Abbauen einzelsträngiger RNA befähigte Enzym entweder aus der aus RNAse I, RNase A, RNase 4, RNase T1, RNase T2, RNase 2 und RNase 3 bestehenden Gruppe ausgewählt oder dieses ist eine Mischung hiervon, wobei RNase I bevorzugt ist. Ferner kann die cDNA langsträngige, vollständig codierende und/oder Volllängen-DNA sein.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann eingesetzt werden, um eine, zwei oder mehr cDNA-Bibliotheken herzustellen. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene cDNA und cDNA-Bibliotheken.
Schließlich erlauben die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung folgendes:

(i) hocheffiziente Entfernung von Driver-mRNA's,
(ii) keine relevante Verringerung der cDNA-Größe nach der Hybridisierung, welche die Häufigkeit von langen, vollständig codierenden/Volllängen-cDNA's beeinträchtigen würde,
(iii) Geeignetheit für sowohl Normalisierung als auch Subtraktion,
(iv) geringe Kreuzreaktivität zwischen ähnlichen, aber nicht identischen Sequenzen sowie
(v) hochgradige Leistungsfähigkeit, Reproduzierbarkeit und Einfachheit der Handhabung sowohl hinsichtlich der Größe der hergestellten Driver als auch hinsichtlich der Anzahl der Bibliotheken.

Die Verfahren und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele weiter beschrieben.
Beispiel 1
Herstellung von RNA
Scheiben von Gehirngewebe (0,5–1 g) (oder von anderen wie in Beispiel 2 beschriebenen Geweben) wurden in 10 ml Lösung D (Chomczynski, P. und Sacchi, N., 1987, Annal. Biochem., 162: 156–159) homogenisiert und mit 1 ml 2 M Natriumacetat (pH 4,0) und derselben Menge einer Mischung von Phenol/Chloroform (Volumenverhältnis 5:1) extrahiert. Nach der Extraktion wurde zu der wässrigen Phase dasselbe Volumen Isopropanol zugegeben, um RNA zu präzipitieren. Diese Probe wurde für eine Stunde auf Eis inkubiert und bei 4000 UpM für 15 Minuten unter Kühlen inkubiert, um die Präzipitate zu sammeln. Die Präzpitate wurden mit 70 %-igem Ethanol gewaschen und in 8 ml Wasser aufgelöst. Eine 2 ml-Menge von 5 M NaCl und 16 ml einer wässrigen Lösung (pH 7,0) enthaltend 1 Prozent CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid), 4M Harnstoff und 50 mM Tris wurden zugegeben, um RNA zu präzipitieren, und die Polysaccharide wurden entfernt (CTAB-Präzipitat). Nach einer Zentrifugation bei 4000 UpM für 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde die RNA, welche erhalten wurde, in 4 ml 7 M Guanidin-HCl gelöst. Dann wurde zu der Lösung die doppelte Menge an Ethanol zugegeben und die Mischung wurde für eine Stunde auf Eis inkubiert und bei 4000 UpM für 15 Minuten zentrifugiert. Die resultierenden Präzipitate wurden mit 70 %-igem Ethanol gewaschen und gesammelt. Die Präzipitate wurden erneut in Wasser aufgelöst und die Reinheit der RNA wurde durch Messen des OD-Verhältnisses 260/280 (> 1,8) und 230/260 (< 0,45) bestimmt.
Synthese von cDNA
Zwischen 5 und 10 μg dieser RNA, 5 μg eines ersten Stranges Primer enthaltend die BamHI und SstI Restriktionsstellen (5'(-GA)₅AGGATCCA AGAGCTC(T)₁₆VN-3') (SEQ ID NO: 1) und 11,2 μl 80-prozentiges Glycerin wurden zu einem Gesamtvolumen von 24 μl vermischt. Die RNA-Primer-Mischung wurde bei 65 °C für 10 Min. denaturiert. Simultan dazu wurden 18,2 μl 5 X Erststrangsynthesepuffer, 9,1 μl 0,1 M DTT, 6,0 μl (jeweils) von 10 mM dTTP, dGTP, dATP und 5-Methyl-dCTP (anstelle von dCTP), 29,6 μl gesättigte Trehalose (ungefähr 80 Prozent, niedriger Metallgehalt; Fluka Biochemika) sowie 10,0 μl Superscript II reverse Transkriptase (200 U/μl) zu einem Gesamtvolumen von 76 μl vermischt. Eine 1,0 μl-Menge [alpha-³²P]dGTP wurde in einem dritten Röhrchen platziert. Die mRNA, das Glycerin und die Primer wurden auf Eis mit der den Superscript II enthaltenden Lösung vermischt und eine Teilmenge (20 Prozent) wurde schnell in das das [alpha-³²P]dGTP enthaltenen Röhrchen zugefügt. Eine Erststrang-cDNA-Synthese wurde in einem Thermocycler mit einem beheizten Deckel (beispielsweise MJ Research) gemäß dem nachfolgenden Programm durchgeführt: Schritt 1,45 °C für 2 Min.; Schritt 2, Gradientenanlagern: Abkühlen auf 35 °C über 1 Min.; Schritt 3, Beenden des Anlagerns: 35 °C für 2 Min.; Schritt 4,50 °C für 5 Min.; Schritt 5, Erhöhen auf 60 °C bei 0,1°C pro Sekunde; Schritt 6,55 °C für 2 Min.; Schritt 7,60 °C für 2 Min.; Schritt 8, Zurückspringen zu Schritt 6 und Wiederholen für 10 zusätzliche Zyklen. Der Einbau der Radioaktivität erlaubte eine Abschätzung der Ausbeute an cDNA (Carninci und Hayashizaki, 1999). Die erhaltene cDNA wurde mit Proteinase K behandelt, mit Phenol/Chloroform und Chloroform extrahiert und in Ethanol unter Einsatz von Ammoniumacetat als Salz präzipitiert (Carninci und Hayashizaki, 1999).
Biotinylierung von mRNA
Vor der Biotinylierung wurde die Diolgruppe des Caps und das 3'-Ende der mRNA in einem Endvolumen von 50 μl aus suspendiertem mRNA-/Erststrang-cDNA-Hybrid, 66 mM Natriumacetat (pH 4,5) und 5 mM NaIO₄ oxidiert. Die Proben wurden im Dunklen für 45 Min. auf Eis inkubiert. Dann wurden die mRNA/cDNA-Hybride durch Zugabe von 0,5 μl 10 %-igem SDS, 11 μl 5 M NaCl und 61 μl Isopropanol präzipitiert. Nach der Inkubation im Dunkeln für 45 Min. auf Eis oder bei –20 °C oder bei –80 °C für 30 Min. wurden die Proben für 10 Min. bei 15.000 UpM zentrifugiert. Schließlich wurden die mRNA-/cDNA-Hybride zweimal mit 70 prozentigem Ethanol gespült und in 50 μl Wasser resuspendiert. Der Cap wurde dann in einem Endvolumen von 210 μl durch Zugabe von 5 μl 1 M Natriumacetat (pH 6,1), 5 μl 10-prozentigem SDS und 150 μL 10 mM Biotinhydrazid Langarm (Vector Biosystem) biotinyliert.
Nach einer Übernacht (10 bis 16 Stunden)-Inkubation bei Raumtemperatur (22 °C bis 26 °C) wurden die mRNA/cDNA-Hybride durch Zugabe von 75 μl 1 M Natriumacetat (pH 6,1), 5 μl 5 M NaCl und 750 μl absolutem Ethanol präzipitiert und auf Eis für 1 Stunde oder bei –20 °C bis –80 °C für 30 Min. inkubiert. Die mRNA-/cDNA-Hybride wurden durch Zentrifugation für 10 Min. bei 15.000 UpM pelletiert und das Pellet wurde einmal mit 70 prozentigem Ethanol und einmal mit 80 prozentigem Ethanol ge waschen. Die mRNA-/cDNA-Hybride wurden in 70 μl 0,1X TE (1 mM Tris [pH 7,5], 0,1 mM EDTA) resuspendiert.
Einfangen und Freisetzen von Volllängen-cDNA
Eine 500 μl Menge MPG-Streptavidin-Partikel und 100 μg DNA-freie tRNA wurden vereint und die Mischung wurde unter gelegentlichem Rühren für 30 Min. auf Eis inkubiert. Die Partikel wurden unter Einsatz eines Magnetständers für 3 Minuten abgetrennt und der Überstand wurde entfernt. Die Partikel wurden dann dreimal mit 500 μl einer Wasch-/Bindungs-Lösung (2 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 8,0) gewaschen.
Zur gleichen Zeit wurde 1 Einheit RNase I (Promega) pro μg Ausgangs-mRNA zu der mRNA/cDNA-Hybrid-Probe in von dem Hersteller bereitgestelltem Puffer (Endvolumen 200 μl) zugefügt und die Probe wurde für 15 Min. bei 37 °C inkubiert. Um die Reaktion zu beenden, wurde die Probe auf Eis inkubiert und 100 μg tRNA und 100 μl 5 M NaCl wurden zugefügt. Um die vollständig codierenden/Volllängen-mRNA-/cDNA-Hybride einzufangen, wurden die biotinylierte, RNase I behandelte mRNA-/cDNA sowie die gewaschenen Partikel vereint und in 400 μl der Wasch-/Bindungslösung resuspendiert. Nach dem Vermischen wurde das Röhrchen für 30 Min. bei Raumtemperatur sanft rotiert. Die vollständig codierende/Volllängen-cDNA verblieb auf den Partikeln und die verkürzten cDNA's taten dies nicht. Die Partikel wurden auf einem Magnetrührer aus dem Überstand abgetrennt. Die Partikel wurden sanft gewaschen, um nicht spezifisch absorbierte cDNA zu entfernen: zwei Waschschritte mit Wasch-/Bindungslösung; ein Waschschritt mit 0,4 prozentigem SDS und 50 μg/ml tRNA; ein Waschschritt mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,2 mM EDTA, 40 μg/ml tRNA; 10 mM NaCl und 20 prozentigem Glycerin sowie einmal mit 50 μg/ml tRNA in Wasser.
Die cDNA wurde von den Partikeln durch Zugabe von 50 μl 50 mM NaOH und 5 mM EDTA sowie durch Inkubieren für 10 Min. bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Vermischen freigesetzt. Die Partikel wurden dann magnetisch entfernt und die extrahierte cDNA wurde auf Eis in ein 50 μl 1 M Tris-HCl, pH 7,5 enthaltendes Röhrchen transferiert. Der Auflösungszyklus wurde einmal oder zweimal mit 50 μl Teilmengen 50 mM NaOH und 5 mM EDTA wiederholt, bis der Hauptteil der cDNA (80 bis 90 Prozent, wie durch Messen der Radioaktivität mit einem mit der Hand gehaltenen Monitor gemessen) von den Partikeln wiedergewonnen worden ist.
Um Spuren von RNA zu entfernen, welche später mit der biotinylierten Driver-RNA interferieren könnten, wurden zu der wiedergewonnenen cDNA schnell 100 μl 1 M Tris-HCl, pH 7,0 und 1 μl RNase I (10 U/μl) auf Eis zugegeben; die Probe wurde dann bei 37 °C für 10 Min. inkubiert. Die cDNA wurde mit Proteinase K behandelt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und zurückextrahiert. Zwei bis drei μg Glykogen wurden dann zugefügt und die Probe wurde in einem silikonisierten Röhrchen aus Ethanol präzipitiert. Alternativ dazu wurde die Probe durch eine Runde Ultrafiltration mit einem Microcon 100 (Millipore) für 40 bis 60 Min. bei 2.000 UpM konzentriert. Nach der Präzipitation aus Ethanol konnte die cDNA in 20 μl 0,1 X TE wieder aufgelöst werden. In diesem Experiment wurde ein RNase H-Verdau nicht durchgeführt. Allerdings wurde eine Hydrolyse mit NaOH durchgeführt, welche Doppelstränge gleichzeitig hydrolysieren und denaturieren kann.
CL-4B Spinnsäulenfiltration von cDNA
Die cDNA-Proben wurden mit CL-4B Chromatographie (Carninci und Hayashizaki, 1999) oder auf einer S-400 Spinnsäule (Amersham- Pharmacia) im Wesentlichen wie von dem Hersteller beschrieben behandelt.
Oligo-dG Tailing der Erstrang-cDNA
Die cDNA-Probe, 5 μl 0X TdT-Puffer (2 M Kaliumcacodylat [pH 7,2], 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol), 5 μl 50 μM dGTP, 5 μl 10 mM CoCl₂ und 40 Einheiten terminale Deoxynukleotidyltransferase wurden in einem Endvolumen von 50 μl vermischt. Die Proben wurden bei 37 °C für 30 Min. inkubiert. Am Ende wurde die Reaktion mit 20 mM EDTA beendet. Die cDNA wurde mit Proteinase K behandelt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und in Ethanol präzipitiert. Die Probe wurde letztlich in TE (10 mM Tris pH 7,5–8,0, EDTA 1 mM) wieder aufgelöst. Nachdem die Schwanzlänge, wie beschrieben (Carninci und Hayashizaki, 1999), überprüft wurde, wurde die cDNA zum Gebrauch in verifizierenden Bibliotheken (siehe unten) in eine Zweitstrangsynthese eingesetzt oder zum Gebrauch bei der Normalisierung und/oder der Subtraktion als Tester-cDNA eingesetzt.
Normalisierungs-Driver
Teilmengen von Ausgangs-mRNA enthaltenden Driver-mRNA's werden "Normalisierung oder Normalisierungs-Driver" genannt. Um die Konzentration der Normalisierungs-Driver zu berechnen, wurde die ribosomale/strukturelle RNA-Kontamination in der Ausgangs-mRNA durch die Annahme, dass die Einbaugeschwindigkeit der Erststrangsynthese die tatsächliche mRNA-Konzentration reflektiert, folglich unter der Annahme einer 100-prozentigen Effizienz des Primens und der Verlängerung, annähernd berechnet. Unter der Annahme, dass das Verhältnis von mRNA umgerechnet in Erststrang-cDNA zu der tatsächlichen mRNA- Konzentration korrespondiert, wurden weniger als Volllängen-cDNA's aus der Betrachtung ausgeschlossen. Obwohl nicht die gesamte mRNA mit Primern versehen ist, hat ein leichter Überschuss von Normalisierungs-Driver selten so einen dramatischen Effekt wie ein Mangel an Driver. Daher wurde angenommen, dass die Menge an mRNA in der Probe dieselbe wie die Menge an erzeugter Erststrang-cDNA war.
Subtraktions-Driver
Die subtraktiven Driver bestanden aus großen Mengen von aus klonierten Minibibliotheken und umgeordneten Bibliotheken, welche aus der nicht redundanten RIKEN cDNA-Enzyklopädie unter Einsatz von T7- und T3-RNA-Polymerasen hergestellt worden sind, hergestellten "run-off"-Transkripten.
Die Minibibliotheken enthielten ungefähr 1.000 bis 2.000 Klone cDNA in der Probe, welche aus vorherigen, durch dieselben Verfahren wie das in der vorliegenden Ausführungsform beschriebene Experiment durchgeführten Normalisierungsexperimenten stammten. Unter Einsatz des Standardprotokolls wurden aus der eingefangenen Teilmenge (häufige cDNA-Fraktion) Minibibliotheken hergestellt, was das Nebenprodukt der Normalisierungsexperimente war. Nach der Normalisierung wurde die häufige cDNA-Fraktion mit 50 mM NaOH/5 mM EDTA von den Partikeln entfernt. Nach der Neutralisation wurde eine Zweitstrang-cDNA hergestellt. Das Klonieren wurde in einer zu der zuvor beschriebenen (Carninci und Hayashizaki, 1999) analogen Weise durchgeführt. Plamid wurde in Masse ausgeschnitten und 1.000–2.000 Klone pro Minibibliothek wurden auf Agarose/Ampicillin amplifiziert. Um Driver herzustellen, wurden 20.000 bis 50.000 Kolonien auf SOB Agarose/Ampicillin (Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ausplattiert (Plattengröße: 150 mm Durchmesser) und die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Bakterienzellen wurden von den Platten in der Gegenwart einer Resuspendierungslösung (Wizard DNA Extraction Kit; Promega) abgeschabt und nachfolgend wurde dem Herstellerprotokoll gefolgt.
Herstellung von nicht redundantem cDNA-Bibliothekdriver
Einzelne Klone von in den vorherigen Experimenten, welche in der gleichen Weise wie für die vorliegende Ausführungsform beschrieben durchgeführt wurden, erhaltenen Volllängen-cDNA's wurden für die Subtraktion umgeordnet. Die umgeordneten cDNA's wurden von 384-well Platten auf SOD-Agarose/Ampicillin-Platten geschichtet. Plasmidextraktion, DNA-Verdau und RNA-Herstellung wurden in der gleichen Weise wie für die Minibibliotheken durchgeführt.
Nachdem die Bibliothek an der SstI-Stelle kloniert worden war, wurde das extrahierte Plasmid an Mehrfachklonierungsstellen an dem 3'-Ende mit SstI behandelt (in dem Fall von aus Leber und Lungen extrahierter mRNA wurde die Minibibliothek mit XhoI an der Stelle des 3'-Endes kloniert und PvuI wurde eingesetzt). Unter Einsatz von, abhängig von der Karte des für die Herstellung des Drivers eingesetzten Konstruktes, entweder T3- oder T7-RNA-Polymerase (Life Technologies) wurde RNA synthetisiert, um "sense run-off" RNA's herzustellen. T3-Polymerase wurde für die mit PvuI-geschnittenen Minibibliotheken und T7-Polymerase wurde für die mit SstI-geschnittenen Minibibliotheken eingesetzt. RNA wurde unter Einsatz von RNA-Polymerasen (Life Technologies) gemäß den Herstellerangaben hergestellt. Für 30 Min. wurde ein extensiver Verdau mit 1 bis 2 μl DNase I (RQ1, RNase-frei, Promega) durchgeführt. Dann wurde ein Proteinase K- Verdau durchgeführt, gefolgt von der Extraktion mit Phenol/Chloroform sowie Chloroform und cDNA wurde präzipitiert.
Biotin-Markierung von normalisierten/subtrahierten Driver-RNA's
Um die Driver-RNA's vor der Markierung weiter aufzureinigen, wurde das RNeasy Kit (QIAGEN) gemäß den Herstellerangaben eingesetzt. Anschließend wurde das "Mirus nucleic acid biotinylation kit" (Panvera) in im Wesentlichen derselben Weise wie von dem Hersteller beschrieben eingesetzt. Eine 10 μg Menge der RNA-Mischung wurde durch eine Kombination mit 10 μl Label IT-Reagens und 10 μl Labelling-Puffer A bis zu einem Endvolumen von 100 μl markiert, wobei den Angaben des Kitprotokolls gefolgt wurde. Die Reaktion wurde für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert, wobei die biotinylierte RNA danach durch Zugabe von 1/20 des Volumens 5 M NaCl und von zwei Volumina 99 prozentigem Ethanol präzipitiert wurde. Nach der Standardethanolpräzipitation wurde das Pellet einmal mit 80 prozentigem Ethanol gewaschen, in 20 μl "1X Mirus labelling buffer A" resuspendiert und bis zum Gebrauch bei –80 °C gelagert (alternativ dazu kann die mRNA unter Einsatz des "psoralen-biotinylation kit" (Ambion) gemäß den Herstellerangaben markiert werden).
Normalisierung/Subtraktion
Die Driver-RNA's und cDNA wurden unter Einsatz von Proteinase K gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion, Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation deproteiniert. Die am Schwanz mit Oligo-dG versehene cDNA wurde als Substrat eingesetzt, welches mit den Driver-RNA's und den Blockierungsoligonukleotiden (Biotin-dG₅ bis -dG₃₀, hier wurde Biotin-dG₁₆ eingesetzt) vermischt wurde, um die in dem subtrahierenden Driver vorliegende C-Ausdehnung zu hybridisieren, und welches mit Oligo-dT- Primer vermischt wurde, um die polyA-Sequenzen zu blockieren. Allerdings kann jedes Oligonukleotid eingesetzt werden, welches zwischen Drivern und cDNA's gemeinsame Sequenzen blockieren kann.
Die Hybridisierung wurde typischerweise bei RoT-Werten von 1 bis 500 (RoT ist in den Beispielen von Sagerstrom et al., 1997 definiert) in einem Puffer enthaltend 80 Prozent Formamid (aus einer deionisierten Stammlösung), 250 mM NaCl, 25 mM HEPES (pH 7,5) und 5 mM EDTA durchgeführt. Die Hybridisierung wurde bei 42 °C in einem Trockenofen durchgeführt; gleiche Volumina von so wenig wie 5 μl benötigen keine Überlagerung mit Mineralöl. Nach der Hybridisierung wurde die Probe durch Zugabe von 2,5 Volumina absolutem Ethanol präzipitiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Probe wurde dann für 10 Minuten bei 15.000 UpM zentrifugiert und einmal mit 70 Prozent Ethanol gewaschen; die cDNA (sowohl Einzelstrang-cDNA als auch mRNA/Einzelstrang-cDNA-Hybride) wurde sorgfältig in 10 μl Wasser auf Eis resuspendiert.
Behandlung mit RNase I
Die bei dem vorgenannten Schritt erhaltenen Tester/Driver-Hybride können mit RNase I behandelt werden, um die nicht spezifisch an die Tester-cDNA gebundene mRNA-Normalisierungs- und Subtraktionsdriver zu entfernen.
Nach der Entfernung des Überstandes von der Probe wurde das nach der Hybridisierung wie zuvor beschrieben präzipitierte Pellet in 45 μl doppelt destilliertem Wasser oder in TE 0,1 X (1 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) auf Eis (um das nicht spezifische wiederholte Anlagern zu minimieren) resuspendiert. Das Pellet wurde vor dem Durchführen des nächsten Schrittes vollständig wieder aufgelöst.
Eine 5 μl Menge 10 x RNase I Puffer (Promega) und 0,5 Einheiten RNase I wurden dann pro 10 μg Driver-RNA zugefügt.
Die Mischung wurde bei 37 °C für 10 Min. inkubiert, für 10 Min. auf 65 °C erhitzt und auf Eis platziert (sofern notwendig können die Proben mit Proteinase K, Phenol/Chloroform und Chloroform behandelt werden und vor dem Verfahren mit den nächsten Schritt mit Ethanol präzipitiert werden).
Entfernung von Hybrid
Der nächste Schritt kann mit der normalisierten/subtrahierten Mischung durchgeführt werden, gleichgültig, ob diese mit RNase I wie in dem vorstehenden Schritt dargelegt behandelt worden ist oder nicht.
Getrennt voneinander wurden 50 μl MPG-Streptavidin magnetische Partikel (CPG Inc.) für jeweils 1 μg biotinylierte Driver-RNA hergestellt; es wurde festgestellt, dass eine 5 μl-Menge an Partikeln mehr als 400 ng biotinylierten Driver binden kann. Zu jeweils 50 μl Partikeln wurden 10 μg tRNA als Blockierungsreagenz zugefügt und die Partikel wurden unter gelegentlichem Schütteln bei Raumtemperatur für 10 bis 20 Min. oder für 30 bis 60 Min. auf Eis inkubiert. Ein Magnetständer wurde eingesetzt, um die Partikel zu entfernen, welche dreimal mit einem großen Überschuss 1 M NaCl und 10 mM EDTA gewaschen wurden und in einem zu dem ursprünglichen Volumen der Partikelsuspension äquivalenten Volumen von 1 M NaCl und 10 mM EDTA resuspendiert wurden.
Die blockierten Partikel wurden mit der wieder aufgelösten Tester/Driver-Mischung vermischt und die gesamte Lösung wurde bei Raumtemperatur für 15 Min. unter gelegentlichem sanften Vermischen inkubiert. Nach dem Entfernen der Partikel unter Einsatz eines Magnetständers für 3 Min. wurde der Überstand, welcher die einzelsträngige normalisierte/subtrahierte cDNA enthielt, wiedergewonnen. Die Partikel wurden einmal mit einem überschüssigen Volumen Bindungspuffer (1 M NaCl, 10 mM EDTA) gewaschen, um jegliche verbliebene ssDNA zu gewinnen. Die Radioaktivität der markierten Proben wurde vor und nach der Prozedur gemessen, um die Ausbeute an Normalisierung/Subtraktion abzuschätzen.
Eine Microcon 100 Ultrafiltration wurde wie von dem Hersteller (Millipore) beschrieben durchgeführt, um die cDNA-Lösung auf ungefähr 50 μl zu konzentrieren. Daran anschließend wurde die cDNA durch das Standard-Isopropanolverfahren pelletiert. Das Pellet wurde in 44 μl 0,1 × TE, zu welchem 5 μl RNase I-Puffer und 1 Einheit RNase I zugefügt wurden, um ein Volumen von 50 μl zu ergeben, resuspendiert. Die Proben wurden dann für 20 Min. bei 37 °C inkubiert, wonach 400 μl 0,2 %-iges SDS zugefügt wurden, um die RNase I zu inaktivieren. Spuren von abgebauten RNA's, blockierende Oligonukleotide, SDS und Puffer wurden durch Ultrafiltration mit einem Microcon 100-Filter bei 2.000 UpM und 25 °C entfernt, bis die Volumen auf weniger als 20 μl verringert wurden. Die Proben wurden durch Zugabe von 400 μl 0,1X TE entsalzt und dann wie zuvor in insgesamt drei Waschschritten zentrifugiert. Die cDNA wurde durch Invertieren des Filters in ein neues Röhrchen und durch Zentrifugieren bei 9.000 UpM für 1 Min. gesammelt.
Synthese von Zweitstrang-cDNA
Die Zweitstrangsynthese und die Klonierungsschritte waren für die normalisierte/subtrahierte cDNA, die Standardkontrollbiliotheken und die Minibibliotheken identisch. In der gleichen Weise wie für den Erststrang-cDNA-Primer wurde ein XhoI enthaltender Primer, 5'-(GA)₇TTCTCGAGTTAATTAAATTAATC₁₃-3' (SEQ ID NO: 2) hergestellt und durch Standardtechniken aufgereinigt.
Um eine Zweitstrangreaktion herzustellen, wurde am Schwanz mit Oligo-dG versehene cDNA mit 6 μl 100 ng/μl Zweitstrangprimeradapter, 6 μl EX-Taq Zweitstrangpuffer (Takara) und 6 μl an 2,5 mM (jeweils) dNTP's vermischt. Die Reagenzien wurden mit dem Enzym bei 50 °C (gewöhnlich zwischen 45 °C und ungefähr 80 °C) vereinigt, um eine hohe Spezifität des Primens ("Heißstart" ["hot start"] genannt) zu gewährleisten. Das Primen wurde dann durch Zugabe von 3 μl 5 U/μl Ex Taq Polymerase (Takara) bei 65 °C in einem Thermocycler durchgeführt. Nach dem Vermischen wurde die Anlagerungstemperatur mit einer Negativsteigung auf 45 °C für die XhoI-Primer (35 °C für die SstI-Primer in dem Fall von Leber- und Lungenbibliotheken von Beispiel 2) eingestellt. Nach 10 Minuten bei der Anlagerungstemperatur wurde die Zweitstrang-cDNA während einer Inkubation bei 68 °C für 20 Min. verlängert. Der Anlagerungs-Verlängerungs-Zyklus wurde einmal mehr wiederholt, gefolgt von einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 72°C für 10 Min. Bei Beginn des Heißstarts wurde eine 5 μl-Teilmenge mit 0,5 μl [alpha³²P]dGTP oder [alpha³²P]dCTP vermischt und eingebaut. Die markierte Teilmenge wurde am Ende der Reaktion eingesetzt, um die cDNA zu messen und die Zweitstrangausbeute zu berechnen (Carninci und Hayashizaki, 1999).
Klonieren von cDNA
Die Zweitstrang-cDNA wurde mit Proteinase K behandelt, mit Phenol/Chloroform und Chloroform extrahiert und gemäß Standardverfahren mit Ethanol präzipitiert. Die cDNA wurde dann unter Verwendung von 25 U/μg von jeweils BamHI und XhoI (oder SstI und XhoI für Lungen- und Leberbibliotheken von Beispiel 2) geschnitten. Nach der Restriktionshydrolyse wurde die cDNA mit Proteinase K behandelt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und auf einer CL-4B Spinnsäule (Pharmacia) gereinigt. Nach der Ethanolpräzipitation wurde die cDNA im Wesentlichen wie in der Literatur beschrieben (Carninci und Hyashizaki, 1999) kloniert.
Eingesetzte Methodik und Geräte
Die Plaque-Hybridisierung wurde mit einem zufälligen Primer und markierten spezifischen Sonden gemäß den Standardprotokollen (Sambrook et al., 1989) durchgeführt.
Eine Alkalielektrophorese wurde wie in der Literatur beschrieben (Sambrook et al., 1989) durchgeführt. Alle Autoradiographiesignale wurden unter Einsatz des Bas 2000 Bildverarbeitungssystems (Fuji) visuell angezeigt.
Die Bakterien wurden mit kommerziell erhältlichen Pickmaschinen (Q-bot und Q-pix; Genetics, UK) gesammelt und auf 384-well Platten überführt.
Duplikatplatten wurden eingesetzt, um Plasmid-DNA herzustellen. Die Plasmid-DNA von jeder der 384-well Platten wurde unterteilt und auf vier 96-well Platten gewachsen. Nach Übernachtwachstum wurden die Plasmide entweder manuell (Itoh e al., 1997, Nucleic Acids Res 25: 1315–1316) oder automatisch (Itoh et al., 1999, Genome Res. 9: 463–470) extrahiert.
Die Sequenzen wurden typischerweise auf eine RISA-Sequenzeinheit (Shimadzu, Japan) oder unter Einsatz des Perkin Elmer-Applied Biosystems ABI 377 in Einklang mit den Standardsequenzverfahren wie bei spielsweise von Hillier et al., 1996, Genome Research, 6:807-828 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzprimer waren die M13 Vorwärts- und Rückwärtsprimer (die zuvor beschriebenen SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6).
Beispiel 2
Lungen- und Lebergewebe
cDNA-normalisierte/subtrahierte Bibliotheken (und Minibibliotheken) wurden aus Lungen- und Lebergeweben in der gleichen Weise wie in dem Beispiel 1 für Gehirngewebe beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass ein Primer enthaltend eine XhoI-Stelle (5'(GA)₈ACTCGAG(T)₁₆VN-3') (SEQ ID NO: 4) und für aus Leber- und Lungengeweben extrahierte mRNA ein eine SstI-Stelle enthaltender Primer 5'-(GA)₉GAGCTCACTAGTTTAATTAAATTAATC₁₁-3' (SEQ ID NO: 3) eingesetzt wurde. Die anderen Schritte waren dieselben wie die für das Gehirngewebe beschriebenen.
Beispiel 3
Effizienz der Entfernung des Driver/Tester-Fangs
Herstellung einer RNA-Matrize
Es wurde ein pBluescript-Plasmid enthaltend ein 5 kB-Fragment von "reeler"-cDNA (Hirotsune et al., Nature Genetics, 1995, Mai, 10: (77–83)) eingesetzt.
RNA wurde aus 2,5 μl Template-Plasmid-DNA (an der NotI-Restriktionsstelle geschnitten) unter Standardbedingungen in vitro transk ribiert: 20 μl Gibco-BRL 5 X Puffer, 5 μl rNTP's (jeweils 10 mM), 5 μl 0,1M DTT und 20 Einheiten T7-RNA-Polymerase in einem Endvolumen von 100 μl. Die Reaktion wurde durch Inkubation für 3 Stunden bei 37 °C durchgeführt. Es wurden auch 2 μl alpha-³²P-rUTP zu der Reaktion zugefügt, um die RNA zu markieren.
Daran anschließend wurden 20 Einheiten RQ1-DNase (Promega) zugefügt, um Spurenmengen an Matrizen-DNA (Plasmid) zu entfernen, und die erhaltene Probe wurde bei 37 °C für 15 Min. inkubiert. Zu der Probe wurde NaCl in einer Endkonzentration von 250 mM zugefügt. Die erhaltene Probe wurde einmal mit Phenol (äquilibriert mit Tris)/Chloroform und einmal mit Chloroform deproteiniert. Zu der RNA wurden dann zwei Volumina Ethanol zugefügt, um die RNA zu präzipitieren. Nach einer Zentrifugation für 20 Min. bei 15.000 UpM wurde die präzipitierte RNA von dem Überstand abgetrennt. Das Präzipitat wurde einmal mit 70 Prozent Ethanol gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugation. Das Pellet wurde dann in Wasser wieder aufgelöst.
Herstellung von cDNA (Tester)
cDNA wurde aus Matrizen-RNA, wie in dem Handbuch von Superscript II (Gibco BRL-Life Technology) spezifiziert, hergestellt mit der Ausnahme, dass der Primer, welcher für den Klon spezifisch war, SK-Primer (5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3') (SEQ ID NO: 7) war, und dass alpha³²-P-dGTP eingesetzt wurde, um den Erststrang für die spätere Verfolgung zu markieren. Nach einer Phenol/Chloroform-Extraktion und nach einer Ethanol-Präzipitation gemäß dem Standardverfahren wurde die cDNA mit einer Base (50 mM NaOH für 30 Min.) behandelt, um die hydrolysierte, hybridisierte RNA zu entfernen, und mit 200 mM Tris bei pH 7,00 neutralisiert. Eine Menge von 20 Einheiten RNase I wurde zugefügt. Am Ende wurde die DNA erneut mit Phenol/Chloroform extrahiert und unter Standardbedingungen mit Ethanol präzipitiert.
Biotinylierung von RNA
Die RNA-Matrize wurde als Driver eingesetzt. Teilmengen von 500 ng RNA wurden mit dem "biotin-psoralen kit" (Ambion) auf Eis (Proben 1 bis 3) oder bei Raumtemperatur (Proben 4 bis 6) für 30 Min. (1, 4), 45 Min. (2, 5) und 60 Min. (3, 6) (siehe 6) biotinyliert.
Nach der Biotinylierung wurden 50 ng cDNA (6.000 CPM) und 10 μg RNA zu 150 ng biotinyliertem Driver (hergestellt unter den Bedingungen 1 bis 6, folglich unter Einsatz von 6 Röhrchen) zufügt (wobei 21.000 CPM gezählt wurden). Nach einer Standard Phenol/Chloroform-Extraktion und nach einer Ethanol-Präzipitation wurden die Proben in 5 μl Hybridisierungspuffer (80 Prozent Formamid, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes pH 7,5, 5 mM EDTA) wieder aufgelöst und über Nacht (14 Stunden) bei 42° inkubiert.
Nach der Ethanol-Präzipitation (in der gleichen Weise wie in den anderen Ausführungsformen durchgeführt) wurden die Proben (6 Röhrchen) dann mit Streptavidin/Magnetpartikeln (dem in Beispiel 1 beschriebenen Subtraktionsschritt) vermischt. Der Überstand (ungebunden) wurde dann mit Ethanol unter Standardbedingungen unter Zugabe von 4 μg Glykogen präzipitiert, um eine quantitative Präzipitation zu gewährleisten, und nach einer Resuspendierung auf einem Standard-RNA-/Formaldehyd-Minigel (Spuren 1 bis 6) aufgetragen. Nach 1 Stunde Elektrophorese bei 60 V wurde das Gel getrocknet und mit einem Bas 2000 Bildverarbeitungsanalysiergerät (Fuji) entwickelt. Dies zeigte die Effizienz der Entfernung von Driver und Tester. Die Seite der (Spuren 7 bis 9) wurde für unbehandelte Probe (mRNA/cDNA) entsprechend 10 Prozent und 2 Prozent der Ausgangszähler von 100 eingesetzt. Die Intensität des Signals zeigte die Effizienz der Entfernung der Driver-/Tester-Mischung an.
Beispiel 4
Evaluierungsmethoden der vorliegenden Erfindung
Verringerung der Häufigkeit häufiger cDNA's
Mehrere normalisierte/subtrahierte cDNA-Bibliotheken wurden aus Pankreasgewebe in der gleichen Weise wie zuvor für Gehirngewebe beschrieben unter Einsatz von Driver-RNA's und Minibibliotheken abgeleitet aus den umgeordneten, nicht redundanten gemäß den zuvor beschriebenen Ausführungsformen hergestellten cDNA's, um unnötiges Wiedersequenzieren von bereits anwesenden Klonen zu verringern, hergestellt.
Die Zweitstrang-cDNA aus einer Standardpankreas-cDNA-Bibliothek (ohne Normalisierung/Subtraktion) wurde mit ihrem normalisierten/subtrahierten Gegenstück (3) verglichen. Die normalisierte/substrahierte cDNA wurde in einem einzigen Normalisierungs-/Subtraktionsschritt hergestellt. Die Normalisierung wurde bei RoT = 10 durchgeführt und die Subtraktion wurde unter Einsatz eines Satzes von wie zuvor beschrieben bei RoT = 20 hergestellten Minibibliotheken durchgeführt (die Subtraktion kann bei einem RoT-Wert von bis zu ungefähr 500 durchgeführt werden), wobei jede 1.000 bis 2.000 redundante, meist häufige Klone aus Leber-, Lungen-, Gehirn- oder Plazenta-Gewebe enthielt. Die Minibibliotheken wurden durch Klonieren der hochexprimierten Fraktionen von vorher hergestellten normalisierten cDNA-Bibliotheken erzeugt. Dann wurden amplifizierte cDNA-Minibibliotheken eingesetzt, um die subtrahierenden Driver (wie zuvor beschrieben) herzustellen. Der RoT der subtrahierenden Driver glich einer Einheit für alle 200 Klone (beispielsweise RoT = 5, wenn 1.000 Klone eingesetzt wurden). Die Durchschnittslänge der normalisierten, subtrahierten cDNA war größer als die der nicht normalisierten, nicht substrahierten cDNA, was zeigt, dass lange cDNA's (welche langsamer wandern) seltener exprimiert werden als die kürzesten cDNA's. Des Weiteren waren zu den cDNA's von hochexprimierten mRNA's korrespondierende Banden aus der normalisierten-subtrahierten Bibliothek nicht sichtbar.
Die 3 zeigt einen Elektrophoreselauf ohne Normalisierung/Subtraktion (Standard-cDNA). Es sind einige wenige, hochintensive, aus häufigen RNA's abgeleitete Banden sichtbar. Im Unterschied dazu waren diese Banden bei der normalisierten-subtrahierten cDNA nicht mehr länger sichtbar, was eine Abnahme in der cDNA zeigt. Ferner ist die relative Intensität der langen mRNA's (> ~ 3 kB) entsprechenden cDNA's in der normalisierten/subtrahierten cDNA größer als in den Standardbibliotheken.
Ein anderer Weg zum Nachweisen der Vorteile der Normalisierung/Substraktion ist in der 4 dargestellt.
Wie zuvor beschrieben hergestellte Lungen-Erststrang-cDNA wurde als Matrize eingesetzt. Die funktionell einer normalisierten cDNA-Bibliothek entsprechenden Gene, welche bei einer Plaque-Hybridisierung häufig exprimiert wurden, nahmen in der normalisierten Bibliothek ab. Als 10.000 Plaques der normalisierten Lungenbibliothek untersucht wurden, nahm der Verlängerungsfaktor 1-alpha von 90 Plaques in der Referenzbibliothek auf 10 in der normalisierten Bibliothek ab. Carbonylreduktase verringerte sich von ungefähr 70 Plaques auf 3. Und Uteroglobin wurde von ungefähr 510 Plaques auf 2 verringert. Die Plaques wurden gezählt. Es befanden sich mehr Plaques in den cDNA-Standard-Bibliotheken (ungefähr 10-mal mehr in der Standardbibliothek als in der normalisierten Bibliothek). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Häufigkeit der häufig exprimierten cDNA's in der normalisierten Bibliothek viel geringer war als in der Kontrolle.
Beispiel 5
Erhöhen der Häufigkeit der Entdeckung von seltenen Genen
Das Sequenzieren einer Bibliothek in großem Maßstab ist der beste Weg, die Konzentration an seltenen cDNA's zu untersuchen. Eine Anzahl von Bibliotheken (Tabelle 1) wurde durch das zuvor dargelegte Verfahren aus mehreren Mausgeweben hergestellt und durch Überprüfen der Durchschnittsgröße der cDNA-Inserts (Insertgröße), der Sequenzdurchläufe (Seq.), der Cluster (Sp.), der Redundanz (Red.), des Erscheinens neuer Klone (einzig) und der Anwesenheit von vollständig codierender/Volllängen-cDNA basierend auf den Prozenten der Sequenzen mit dem ersten ATG-Codon (Codierungsprozent) ausgewertet.
[Tabelle 1]
Das Bestimmen des Grades der Sequenzredundanz war die Endevaluierung der Effizienz des Normalisierungs-/Subtraktions-Verfahrens. Aus einer Teilmenge der Ausgangs-cDNA hergestellte Standardbibliotheken (angedeutet durch die Bezugszeichen 22-000, 23-000, 26-000 und 31-000) sind zum Vergleich gezeigt (Tabelle 1).
In einer erfolgreich normalisierten-subtrahierten cDNA-Bibliothek (Bibliothek 49-304 aus Maushodengewebe) war die Redundanz der 3'-Endsequenzen so gering wie 1,63 (berechnet durch Teilen der Gesamtzahl der sequenzierten Klone, 8.900, durch die Anzahl der unterschiedlichen Cluster, 5.444). Es wurde angenommen, dass Redundanzen von weniger als 2,0 in mehr als 10.000 bis 15.000 3'-Endsequenzen in erfolgreichen cDNA-Bibliotheken aus komplexen Geweben (beispielsweise Hoden, Gehirn und Thymus) erwartet werden konnte.
Normalisierte/subtrahierte cDNA-Bibliotheken erleichtern die effiziente und erhöhte Gewinnung unbekannter Gene. Beispielsweise erzeugten die Bibliotheken 22-100, 23-100, 26-100 und 31-100 höhere Werte für neue Daten pro Sequenzreaktion als die Standardbibliothekgegenstücke 22-000, 23-000, 25-000 und 31-000 (5).
Das Sequenzieren mehrerer cDNA's aus mehreren Bibliotheken zeigte eine Verringerung in der Sequenzredundanz in den normalisierten-subtrahierten Bibliotheken verglichen mit den Standard-cDNA-Bibliotheken (5).
In der 5 entspricht 100 Prozent der Entdeckung eines neuen Genes einem Redundanzwert von 1, 50 Prozent entsprechen einem Redundanzwert von 2, 25 Prozent entsprechen einem Redudanzwert von 4 usw.
Die Normalisierung erhöht verglichen mit Standardbibliotheken bei einem vorgegebenen Sequenzierungsaufwand die Häufigkeit der Entdeckung neuer Gene.
Beispiel 6
Vergleichsbeispiel zu den Normalisierungs-Subtraktions-Verfahren der vorliegenden Erfindung
Die Wichtigkeit des Einsatzes eines unspezifisch an cDNA (Tester) gebundene Einzelstrang-RNA (Driver) schneidenden Enzyms wurde überprüft. Dementsprechend wurden durch das Normalisierungs-/Subtraktions-Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Subbibliotheken mit, durch das Normalisierungs-/Subtraktions-Verfahren und den Schritt des Entfernens unspezifischen Hybrids hergestellten Subbibliotheken verglichen.
Gemäß dem ersten Teil von Beispiel 1 (durch den den Normalisierungs-/Subtraktionsschritt einschließenden Teil) hergestellte normalisierte/subtrahierte cDNA's wurden in zwei Subtraktionsbibliotheken unterteilt. Die erste Subbibliothek wurde einer Zweitstrang-cDNA-Synthese und Klonieren (ohne Entfernung unspezifisch gebundener Hybride) unterworfen, wohingegen die zweite Bibliothek der wie in Beispiel 1 beschriebenen RNase I Behandlung (Entfernung unspezifisch gebundener Hybride) unterworfen wurde. Die hergestellten Mausgewebe waren wie folgt: Medulla oblongata für Bibliothek 63, olfaktorisches Gehirn für Bibliothek 64, Dickdarm für Bibliothek 90 und Blinddarm für Bibliothek 91. Die Daten sind in der Tabelle 2 dargestellt.
[Tabelle 2]
Die Subbibliotheken 63-304-R, 64-304-R, 90-300-R, 90-304-R, 91-300-R bezeichnen Subbibliotheken, welche nicht mit RNase I behandelt wurden.
Die Subbibliotheken 63-305-R, 64-305-R, 90-302-R, 90-306-R, 91-302-R bezeichnen mit RNase I behandelte Subbibliotheken.
Die Kombinationen der zu derselben Bibliothek gehörenden Subbibliotheken sind: 63-304-R und 63-305-R, 64-304-R und 64-305-R, 90-300-R und 90-302-R, 90-304-R und 90-306-R sowie 91-300-R und 91-302-R.
Die Anzahl der Cluster für jede Subbibliothek bezeichnet die Anzahl der verschiedenen Klone (das heißt Cluster), welche die Subbibliothek enthält. Jeder Cluster kann ein oder mehr Klone mit derselben Sequenz enthalten (das heißt dieselbe Sequenz tritt etliche Male auf).
"Einzelne Klone" zeigen die Anzahl der aus einem Subbibliothekscluster erhaltenen neue Klone an, welche nicht zuvor sequenziert worden sind.
Die "Prozentzahl einzelner Klone" (beispielsweise der Wert "8,4" für die Subbibliothek 63-304-R) bezeichnet die Anzahl einzelner entdeckter Klone (beispielsweise "252" für die Subbibliothek 63-304-R) geteilt durch die Anzahl der Cluster ("2987" für die Subbibliothek 63-304-R).
Die Daten der Tabelle 2 zeigen, dass alle Tests der Behandlung mit RNase I zu hohen Prozentzahlen für die einzelnen Klone führten (beispielsweise 15,4 Prozent für die Subbibliotheken 63-304-R und 63-305-R). Dies zeigt, dass eine Anzahl von unentdeckten (einzelnen) Klonen, welche unspezifisch an Driver-mRNA gebunden sind, durch die RNase I Behandlung aus Hybriden freigesetzt, gewonnen und entdeckt worden sind.
Die Klonsequenzen wurden auf einer RISA-Sequenziereinheit (Shimadzu, Japan) aufgetragen. Als Sequenzierungsprimer wurden M13-Vorwärts- und -Rückwärtsprimer eingesetzt. Vorwärts: M13 Oligo (5'-TGTAAAAC GACGGCCAGT-3') (SEQ ID NO: 5); Rückwärts: 1233REV Oligo (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3') (SEQ ID NO: 6).
Die Sequenzierung wurde gemäß einem Standardsequenzprotokoll (Hillier et al., 1996, Genome Res., 6: 807–828) durchgeführt.

Claims

Verfahren zum Herstellen von normalisierter und/oder subtrahierter cDNA umfassend die folgenden Schritte: I) Herstellen von Tester-cDNA; II) Herstellen von Driver-Polynukleotiden zur Normalisierung und/oder Subtraktion; III) Durchführen einer Normalisierung und/oder Subtraktion und Entfernen der Tester-Driver Hybride sowie nicht hybridisierter Driver-Polynukleotide sowie IV) Wiedergewinnen der normalisierten und/oder subtrahierten cDNA, wobei die Normalisierungs-Driver RNA oder DNA sind, welche aus demselben Gewebe wie die Tester-cDNA erhalten wurden oder aus Nukleinsäuren desselben Ursprungs wie die Tester-cDNA bestehen, und wobei in Schritt (III) vor der Entfernung der Tester-Driver Hybride und der nicht hybridisierten Driver-Polynukleotide Einzelstrang-Driver-RNA oder -DNA, welche an die Einzelstrang-Tester-cDNA in einer unspezifischen Weise gebunden ist, geschnitten wird und die resultierende, geschnittene Einzelstrang-Driver-RNA oder -DNA entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Tester-cDNA von Schritt (I) ein reverses Transkript einer mRNA in der Form von klonierter/nicht-klonierter cDNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Tester-cDNA einzelsträngig ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Normalisierung in Schritt (III) zuerst durchgeführt wird, gefolgt von der Subtraktion, oder wobei die Subtraktion in Schritt (III) zuerst durchgeführt wird, gefolgt von der Normalisierung, oder wobei in Schritt (III) die Normalisierung und die Subtraktion gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Abbau der Driver-mRNA nachfolgend oder gleichzeitig oder nach einem Einfach-/Vielfach-Normalisierungs-/Subtraktionsschritt in Schritt (III) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (III) die Normalisierung und die Subtraktion als ein einziger Schritt durch Vermischen der Tester und der Driver miteinander durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Schritt (III) wiederholt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Subtraktion gemäß Schritt (III) unter Einsatz der gemäß Patentanspruch 1 oder Patentanspruch 36 hergestellten, normalisierten und/oder subtrahierten Tester-cDNA als Driver wiederholt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Driver-Polynukleotide zur Normalisierung und/oder Subtraktion RNA und/oder DNA sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Driver-DNA cDNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Normalisierungs-Driver DNA sind und die Subtraktions-Driver RNA sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Normalisierungs-Driver RNA und die Subtraktions-Driver RNA oder DNA sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Subtraktions-Driver DNA und die Normalisierungs-Driver RNA sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Subtraktions-Driver RNA und die Normalisierungs-Driver RNA oder DNA sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Normalisierungs-Driver zelluläre mRNA oder cDNA enthalten, welche aus derselben Genbibliothek, demselben Gewebe oder derselben cDNA-Population, wie die zu normalisierende, stammen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Subtraktions-Driver zelluläre mRNA oder cDNA enthalten, welche aus einer Genbibliothek, einem Gewebe oder einer cDNA-Population stammen, welche von der zu subtrahierenden unterschiedlich ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, 14 und 15, wobei die Normalisierungs-Driver und die Subtraktions-Driver lediglich RNA sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, des Weiteren umfassend einen Schritt (V) des Herstellens eines Zweitstranges an wiedergewonnener cDNA und Durchführen einer Klonierung.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die an Einzelstrang-cDNA nicht spezifisch gebundene Einzelstrang-Driver-RNA mit einem zum Schneiden von Einzelstrang-RNA geeigneten Enzym geschnitten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei das Enzym eine einzelstrangspezifische RNA-Endonuklease ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Enzym entweder ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RNase I, RNaseA, RNase4, RNaseT1, RNaseT2, RNase2 und RNase3 oder eine Mischung hiervon enthält.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Enzym RNase I ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die normalisierte und/oder die subtrahierte cDNA eine langsträngige, vollständig codierende und/oder Volllängen-cDNA ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Tester-cDNA durch Versehen des 5'-Endes der RNA mit einer Cap-Struktur hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Herstellung der Tester-cDNA folgende Schritte umfasst: (1) Synthetisieren eines Erststranges cDNA mittels reverser Transkriptase unter Bildung von mRNA/cDNA-Hybriden; (2) chemisches Binden eines Markierungsmoleküls an die Diolstruktur der 5'-Cap(GpppN)-Stelle der die Hybride bildenden mRNA; (3) Einfangen von langsträngigen, vollständig codierenden und/oder Volllängen cDNA-Hybriden sowie (4) Entfernen von Einzelstrang-mRNA durch Verdau mit einem Enzym, welches Einzelstrang-mRNA schneiden kann.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Markierungsmolekül Digoxygenin, Biotin, Avidin oder Streptavidin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Tester/Driver-Hybride an Markierungsmoleküle gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Markierungsmolekül Avidin, Streptavidin, Biotin, Digoxygenin, ein Antikörper oder ein Antigen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei die Tester/Driver-Hybride durch den Einsatz einer Matrix entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Matrix magnetische Partikel oder Agarosepartikel enthält.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die magnetischen Partikel oder Agarosepartikel mit einem Markierungsmolekül überzogen sind oder an ein Markierungsmolekül gebunden sind, welches an Tester/Driver-Hybride gebundene Markierungsmoleküle binden kann.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die magnetischen Partikel oder Agarosepartikel mit einem Markierungsmolekül überzogen sind oder an ein Markierungsmolekül gebunden sind, welches an Avidin, Streptavidin, Biotin, Digoxygenin, einen Antikörper oder ein Antigen, das an ein Tester/Driver-Hybrid gebunden ist, binden kann.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei der die Partikel überziehende Antikörper an Biotin oder an Avidin oder an Streptavidin oder an Digoxygenin bindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, wobei das Tester/Driver-Hybrid durch den Einsatz von Streptavidin/Phenol entfernt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34, wobei Hydroxyapatit sowie unmarkierte RNA eingesetzt werden, um das Tester/Driver-Hybrid zu entfernen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34 eingesetzt, um eine, zwei oder mehrere Genbibliotheken herzustellen.