DE60121293T2

DE60121293T2 - Pharmazeutische zusammensetzungen, welche steroidische strukturen enthalten, und deren verwendungen

Info

Publication number: DE60121293T2
Application number: DE60121293T
Authority: DE
Inventors: Victor Barry The Oxford Science Park POTTER; John Michael The Oxford Science Park REED; Walter Elger; Gudrun Roddersen; Henrich-Thomas Proske
Original assignee: Sterix Ltd
Current assignee: Sterix Ltd
Priority date: 2000-01-14
Filing date: 2001-01-11
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2021-01-12
Also published as: WO2001051055A3; CZ20022282A3; WO2001051055A2; DE60121293D1; SK10022002A3; TR200100070A2; PL357020A1; MXPA01000464A; AR028196A1; CO5280199A1; NO20023392L; TR200100070A3; IL150471A0; JP2003519658A; KR20020087930A; BG106914A; CN1404394A; HRP20020665A2; ATE332140T1; HUP0300887A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung eine Verbindung in einer Menge enthält, so daß eine Dosierung von nicht mehr als 200 μg/Tag bereitgestellt wird. Die Verbindung ist eine zyklische Verbindung, die ein Ringsystem und eine Sulfamatgruppe umfaßt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Östrogene spielen eine wesentliche Rolle bei der hormonellen Empfängnisverhütung, in der Hormonersatztherapie (HRT) in der Menopause und zur Behandlung von gynäkologischen Erkrankungen (z.B. Brustkarzinom) und andrologischen Erkrankungen (z.B. Prostatakarzinom). Für HRT und Empfängnisverhütung werden Östrogene hauptsächlich zusammen mit einem Gestagen, z.B. Levonorgestrel, Desogestrel, Norethisteron, Cyproteronacetat, Chlormadinonacetat und Dienogest, eingesetzt.
Wenn Sie für die Empfängnisverhütung eingesetzt werden, werden Östrogene für eine sichere Unterdrückung der Follikelreifung und der Ovulation benötigt, aber darüber hinaus ersetzen sie die endogene Eierstockausscheidung von Östradiol, welche in großem Maße unterdrückt wird. Dieser Ersatz ist wichtig für die Aufrechterhaltung eines künstlichen Menstruationszyklus und anderer Genitalfunktionen, was durch die einfache Anwendung eines Gestagens nicht in einem zufriedenstellenden Maße erreicht werden könnte.
Darüber hinaus erfüllen endogene und exogene Östrogene wichtige Funktionen des zentralen Nervensystems und des Stoffwechsels im weiblichen Organismus: normale Östrogenmengen leisten einen entscheidenden Beitrag zum Wohlbefinden der Frau. Ihr Vorhandensein in dem System wirkt der Entwicklung von kardiovaskulären Erkrankungen durch verschiedene Mechanismen entgegen: Erzeugung von „günstigen" Lipoproteinmustern im Blut, Hemmung von Lipidablagerungen in den Wänden von Blutgefäßen, Reduzierung des Blutdrucks durch günstige Beeinflussung des vaskulären Tonus, Erniedrigung des Perfusionswiderstands in wichtigen Gefäßabschnitten, Dämpfung von kontraktilen Stimuli am Gefäßmuskel. Die Blutgefäßinnenwandschichten setzen, wenn sie durch Östrogene beeinflußt werden, Faktoren frei, die der Bildung von Thromben entgegenwirken. Östrogene sind auch unverzichtbar für den Erhalt der Knochenstruktur bei Frauen.
Ihr Fehlen kann zu einer Zerstörung des Knochens führen (Osteoporose). Diese letztgenannten Wirkungen von Östrogenen auf das „zentrale Nervensystem" und den „Stoffwechsel" sind ein Hauptgesichtspunkt von HRT. Es kann angenommen werden, daß Östrogene in dem männlichen Organismus analoge Funktionen haben und daß ihre Entfernung zu ähnlichen Störungen führt wie bei Frauen. Ein Unterschied zwischen den zwei Geschlechtern ist, daß die Hormonproduktion bei Männern weniger regelmäßig und in einem späteren Alter als bei Frauen ausfällt.
Aber trotz aller positiven Aspekte von Östrogentherapie gibt es auch ungelöste Probleme, welche die therapeutische Anwendung von Östrogenen beschränken oder unerwünschte Wirkungen verursachen.
Die bekannten Östrogene zeigen pharmakokinetische Defizite. Natürliche Östrogene (Östradiol, Östron, Östronsulfat, Ester von Östradiol, Östriol) werden nur in einem sehr geringen Ausmaß biologisch verfügbar, wenn sie oral eingenommen werden. Dieses Ausmaß kann so stark von Person zu Person variieren, daß man keine allgemeinen Dosierungsempfehlungen geben kann. Eine schnelle Entfernung der Substanzen aus dem Blut ist ein weiteres Problem. Ein Östrogenersatz bei HRT muß häufig auf das Individuum eingestellt werden.
Das gleiche gilt für synthetische Östrogene. Das wichtigste synthetisch veränderte östrogenartige Steroid ist Ethinylöstradiol (EE). Dieses Östrogen dominiert bei der oralen hormonellen Empfängnisverhütung. Neben EE wird in wenigen Fällen Mestranol verwendet; dies ist ein „Wirkstoffvorläufer", der im Organismus zu EE verstoffwechselt wird. Wenn es oral an Menschen verabreicht wird, besitzt EE eine viel bessere Bioverfügbarkeit als die oben erwähnten natürlichen Östrogene, aber seine orale Bioverfügbarkeit variiert in einem großen Maße von Individuum zu Individuum. Mehrere Autoren haben darauf hingewiesen und auf die Tatsache, daß sich Konzentrationen im Blut nach einer oralen Verabreichung dieser Substanz als sehr unregelmäßig erwiesen haben (Goldzieher, J. W. 1989, Goldzieher, J. W. 1990, Humpel, M. 1987, Kuhnz, 1993).
Darüber hinaus zeigen die bekannten Östrogene pharmakodynamische Defizite. Nach Resorption aus dem Darmlumen treten oral verabreichte aktive Bestandteile über die Leber in den Organismus ein. Diese Tatsache ist von besonderer Bedeutung für östrogenartige Mittel, da die Leber ein Zielorgan für Östrogene ist; die orale Aufnahme von Östrogenen führt zu starken östrogenartigen Effekten in der Leber. Die Ausscheidungsaktivität, die in der menschlichen Leber durch Östrogene gesteuert wird, umfaßt die Synthese von Transferproteinen CBG, SHBG, TBG, Angiotensinogen, mehreren Faktoren, die für die Physiologie der Blutgerinnung wichtig sind, und Lipoproteinen. Wenn natürliche Östrogene in den weiblichen Organismus eingebracht werden, während man eine Passage durch die Leber vermeidet (z.B. durch transdermale Verabreichung), bleiben die erwähnten Leberfunktionen nahezu unverändert. Therapeutisch äquivalente Dosen von natürlichen Östrogenen (siehe Definition oben) führen, wenn sie oral verabreicht werden, zu deutlichen Reaktionen von hepatischen Parametern: Erhöhung von SHBG, CBG, Angiotensinogen, HDL (High Density Lipoprotein). Diese hepatischen Effekte von Östrogen sind deutlich stärker, wenn man anstelle von natürlichen Östrogenen Formulierungen von Pferdeöstrogen (sogenannte konjugierte Östrogene) verwendet (Campbell, S. et al., 1981). Ethinylöstradiol und DES besitzen eine noch größere hepatische Östrogenizität.
Hinsichtlich Gonadotropin-hemmender Eigenschaften ist EE etwa 4- bis 18-fach stärker östrogenartig in der Leber als es oral verabreichte natürliche Östrogene sind (Campbell, S. et al., 1981). Dies ist eine sehr unerwünschte Abweichung von Eigenschaften.
Diese Defizite haben erhebliche klinische Signifikanz, wenn bekannte natürliche und synthetische Östrogene verabreicht werden sollen.
Eine bekannte Komplikation, die nach Verabreichung hoher Dosen von Östrogen an Männer, die unter Prostatakarzinom leiden, auftreten kann, ist zum Tode führende Thromboembolie. Das Potential von EE, in der Leber Nebenwirkungen zu erzeugen, bestimmt, obwohl in einer etwas abgeschwächten Form, die Strategie von oraler hormoneller Empfängnisverhütung. Mit einem Blick auf gewünschte empfängnisverhütende Wirkungen und die Aufrechterhaltung des Menstruationsvorgangs auf der einen Seite und die Notwendigkeit, das beträchtliche Nebenwirkungspotential zu berücksichtigen, auf der anderen Seite kann die Kontrolle der EE-Mengen im Blut mit einer Gratwanderung verglichen werden. Es ist gut möglich, daß ein großer Prozentsatz von Frauen orale Empfängnisverhütungsmittel nicht anwenden kann, weil entweder Unregelmäßigkeiten bei der Menstruationsblutung oder mit Östrogen verbundene Nebenwirkungen den Toleranzschwellenwert übersteigen.
Hinweise legen nahe, daß Östrogene, die Hauptmitogene sind, die an der Förderung des Wachstums von Tumoren in endokrinabhängigen Geweben, wie beispielsweise der Brust und dem Endometrium, beteiligt sind. Obwohl Plasmaöstrogenkonzentrationen in Frauen mit oder ohne Brustkrebs ähnlich sind, sind die Mengen an Östron und Östradiol in einem Brusttumor signifikant höher als in normalem Brustgewebe oder Blut. Man nimmt an, daß die in situ-Synthese von Östrogen einen wichtigen Beitrag zu den hohen Mengen von Östrogenen in Tumoren leistet, und daher sind Inhibitoren der Östrogenbiosynthese, insbesondere spezifische Inhibitoren, von besonderem Wert für die Behandlung von endokrinabhängigen Tumoren.
In den vergangenen zwei Jahrzehnten bestand beträchtliches Interesse an der Entwicklung von Inhibitoren des Aromatase-Stoffwechselweges, welcher den Androngenvorläufer Androstendion in Östron umwandelt. Es gibt jedoch jetzt Hinweise, daß der Östronsulfatase-(E1-STS-)Stoffwechselweg, d.h. die Hydrolyse von Östronsulfat in Östron (E1-S in E1) im Gegensatz zum Aromatase-Stoffwechselweg die Hauptquelle für Östrogen in Brusttumoren ist. Diese Theorie wird von einer geringen Reduzierung der Plasmaöstrogen-Konzentration in Frauen mit Brustkrebs nach der Menopause, die mit Aromatase-Inhibitoren, wie beispielsweise Aminoglutethimid und 4-Hydroxyandrostendion, behandelt wurden, und auch durch die Tatsache, daß die Plasma-E1S-Konzentration in diesen mit Aromatase-Inhibitor behandelten Patienten relativ hoch bleibt, gestützt. Die lange Halbwertszeit von E1S im Blut (10–12 h) im Vergleich mit den unkonjugierten Östrogenen (20 Minuten) sowie hohe Niveaus an Steroidsulfatase-Aktivität in der Leber und normalen und malignen Brustgeweben stützen diese Theorie ebenfalls.
Die PCT/GB92/01587 lehrt neue Steoridsulfatase-Inhibitoren und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese enthalten, für eine Verwendung in der Behandlung von östronabhängigen Tumoren, insbesondere Brustkrebs. Diese Steoridsulfatase-Inhibitoren sind Sulfamatester, wie beispielsweise N,N-Dimethylöstron-3-sulfamat und vorzugsweise Östron-3-sulfamat (auch bekannt als „EMATE"). Weitere Sulfamatester sind in der WO 96/05216 und der WO 96/05217 offenbart. Diese Sulfamatester umfassen Östradiol-3-sulfamat (welches hierin als J995) bezeichnet wird.
EMATE (Östron-3-O-sulfamat) hat die folgende Struktur:
Es ist bekannt, daß EMATE ein potenter E1-STS-Inhibitor ist, da es mehr als 99% Inhibition von E1-STS-Aktivität in intakten MCF-7-Zellen bei 0,1 mM zeigt. EMATE hemmt auch das E1-STS-Enzym in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Art und Weise, was darauf hindeutet, daß es als ein auf aktive Stellen gerichteter Inaktivator wirkt. Obwohl EMATE ursprünglich für die Hemmung von E1-STS entworfen wurde, hemmt es auch Dehydroepiandrosteron-Sulfatase (DHA-STS), was ein Enzym ist, von dem man annimmt, daß es eine zentrale Rolle der Regulierung der Biosynthese des östrogenen Steroids Androstendiol spielt. Es gibt nun auch Hinweise, die nahelegen, daß Androstendiol eine sogar noch größere Bedeutung als ein Promotor von Brusttumorwachstum hat. EMATE ist auch in vivo aktiv, da es zu einer nahezu vollständigen Hemmung der Aktivitäten von Rattenleber-E1-STS (99%) und DHA-STS (99%) führte; wenn es entweder oral oder subkutan verabreicht wurde. Darüber hinaus wurde von EMATE gezeigt, daß es in Ratten eine das Gedächtnis verbessernde Wirkung hat. Studien in Mäusen haben eine Verbindung zwischen DHA-STS-Aktivität und der Regulierung eines Teils der Immunantwort nahegelegt. Man nimmt an, daß dies auch in Menschen auftreten könnte. Das verbrückende O-Atom in dem Sulfamatrest in EMATE ist für die hemmende Aktivität wichtig. Daher sind, wenn das 3-O-Atom durch andere Heteroatome ersetzt wird, wie beispielsweise in Östron-3-N-sulfamat und Östron-3-S-sulfamat, diese Analogen schwächere, nicht zeitabhängige Inaktivatoren.
Obwohl eine optimale Stärke der Hemmung von E1-STS in EMATE erreicht worden sein könnte, ist es möglich, daß Östron während der Sulfatasehemmung freigesetzt wird und daß EMATE und dessen Östradiol-verwandte östrogenartige Aktivität aufweisen können.
Ahmed et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999 Jan. 27; 254(3): 811–5) berichten über eine Studie über das Struktur-Aktivitäts-Verhältnis von steroiden und nicht-steroiden Inhibitoren von STS.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen bereitzustellen, die für eine knochenschützende Hormonersatztherapie ohne Endometrium-Stimulation, die Hemmung von E1-STS sowie andere therapeutische Anwendungen geeignet sind.
ZUSAMMENGEFAßTE ASPEKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, daß Zusammensetzungen, die eine zyklische Verbindung bereitstellen, wobei die zyklische Verbindung ein Ringsystem und eine Sulfamatgruppe („eine Sulfamatverbindung") umfaßt, in einer Menge, so daß eine Dosierung von nicht mehr als 200 μg/Tag bereitgestellt wird, eine knochenschützende Hormonersatztherapie ohne Endometrium-Stimulation und/oder die Hemmung von E1-STS bereitstellen kann. Bei der durch die Zusammensetzung für eine Anwendung in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Dosierung zeigen die verabreichten Verbindungen ein günstigeres Verhältnis zwischen gewünschten und therapeutisch ungewünschten Wirkungen.
Die Sulfamatverbindungen umfassen wenigstens eine Ringkomponente. Diese Ringkomponente umfaßt wenigstens vier Atome in dem Ring. Typischerweise werden diese vier Atome Kohlenstoffatome sein. Somit wird diese Ringkomponente typischerweise eine Hydrocarbylgruppe sein. Die zyklische Verbindung umfaßt auch eine Sulfamatgruppe als weitere(n) Substituenten an dem Ringsystem. Die Sulfamatgruppe ist ein Substituent an der Ringkomponente.
AUSFÜHRLICHE ASPEKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments für die knochenschützende Hormonersatztherapie ohne Endometrium-Stimulation bereitgestellt, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung folgendes umfaßt:

(i) eine Verbindung der Formel (I)
worin X ein Hydrocarbylring mit wenigstens 4 Atomen in dem Ring ist, K eine Hydrocarbylgruppe ist und Rs eine Sulfamatgruppe ist,
(ii) optional vermischt mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, Arzneistoffsträger oder Hilfsstoff,

In einem alternativen Aspekt umfaßt die pharmazeutische Zusammensetzung eine Verbindung, wobei die Verbindung in einer Menge vorhanden ist, daß die oben beschriebene Verbindung oder ein Metabolit davon dem Blutplasma des zu behandelnden Subjekts in einer Menge von nicht mehr als 200 μg/Tag bereitgestellt wird.
Die oben genannte maximale Dosierung und alle Dosierungen, auf die in der vorliegenden Beschreibung Bezug genommen wird, beziehen sich auf eine Dosierung für ein Subjekt von 70 kg, wenn es nicht anders angegeben ist. Ein Fachmann auf dem Gebiet wäre einfach in der Lage, die angegebenen Dosierungen für ein Subjekt mit einem anderen Gewicht als 70 kg zu verändern.
Die Dosierung pro Tag wird berechnet, indem man die an das Subjekt zu verabreichende Dosis durch den erwarteten Dosierungszeitraum in Tagen teilt. Der erwartete Dosierungszeitraum wird typischerweise der Zeitraum bis zu der nächsten Verabreichung, der Zeitraum, über welchen die Dosis eine Wirkung haben soll, oder der Zeitraum, über welchen die Dosis eine Wirkung haben muß, sein.
Zur Vereinfachung der Bezugnahme werden diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung nun unter geeigneten Abschnittsüberschriften diskutiert. Jedoch sind die Lehren unter jedem Abschnitt nicht notwendigerweise auf den jeweiligen Abschnitt beschränkt.
BEVORZUGTE ASPEKTE
Vorzugsweise liegt die Verbindung in der Zusammensetzung in einer Menge für die Bereitstellung einer Dosierung von 10 bis 200 μg/Tag vor.
Vorzugsweise liegt die Verbindung in der Zusammensetzung in einer Menge für die Bereitstellung einer Dosierung von 50 bis 200 μg/Tag vor.
Vorzugsweise liegt die Verbindung in der Zusammensetzung in einer Menge für die Bereitstellung einer Dosierung von 20 bis 50 μg/Tag vor.
In einem weiteren Aspekt liegt die Verbindung in der Zusammensetzung in einer Menge für die Bereitstellung einer Dosierung von nicht mehr als oder weniger als 100 μg/Tag vor.
Die Zusammensetzung kann so formuliert werden, daß eine tägliche, wöchentliche oder monatliche Verabreichung die gewünschte tägliche Dosis liefert. Z.B. kann die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung bereitstellen, welche die Sulfamatverbindung in einer Menge von nicht mehr als 200 μg/Dosis (für eine tägliche Dosis), nicht mehr als 1,4 mg/Dosis (wöchentliche Dosis) oder nicht mehr als 5 mg/Dosis (monatliche Dosis) enthält. Es wird klar sein, daß die Zusammensetzung auch für eine mehr oder weniger häufige als eine tägliche, wöchentliche oder monatliche Verabreichung formuliert werden kann.
Vorzugsweise ahmt X in Kombination mit K eine Steroidstruktur nach.
Vorzugsweise ist K eine zyklische Gruppe.
Vorzugsweise ist X ein sechsgliedriger Ring.
Vorzugsweise weist der Ring X sechs Kohlenstoffatome in dem Ring auf.
Vorzugsweise hat die Verbindung der Formel I die als Formel II wiedergegebene Formel, wobei jedes von Rs, X und K die oben angegebenen Bedeutungen hat.
Vorzugsweise werden die Gruppe K und der Ring X zusammen, einschließlich aller Substituenten, maximal etwa 50 Kohlenstoffatome, eher nicht mehr als etwa 30 bis 40 Kohlenstoffatome, enthalten.
Vorzugsweise ist X in Kombination mit K eine Steroidringstruktur.
Vorzugsweise sind die Gruppe K und der Ring X eine Steroidringstruktur oder ein substituiertes Derivat davon.
Vorzugsweise befindet sich die Rs-Gruppe an Position 3 des Rings X. Vorzugsweise ist Rs eine Sulfamatgruppe.
Vorzugsweise hat die Verbindung die Formel III,
wobei X, K und Rs wie oben definiert sind und wobei Rh1 eine optionale Halogengruppe ist, Rh2 eine optionale Halogengruppe ist und wenigstens einer von Rh1 und Rh2 vorhanden ist.
Vorzugsweise befindet sich Rh1 an Position 2 des Rings X.
Vorzugsweise befindet sich Rh2 an Position 4 des Rings X.
Für einige Anwendungen haben die Verbindungen vorzugsweise keine oder eine minimale Östrogenwirkung.
Für einige Anwendungen haben die Verbindungen vorzugsweise eine Östrogenwirkung.
EINIGE VORTEILE
Wesentliche Vorteile der vorliegenden Erfindung umfassen die verbesserten Pharmakokinetiken und Pharmakodynamiken der Zusammensetzung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Sulfamatverbindungen bei der verabreichten Dosierung einen niedrigen hepatischen Stoffwechsel aufweisen. Es wird angenommen, daß die Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung, wie beispielsweise EMATE und J995, eine hohe Affinität zu Erythrozyten haben, nämlich bis zu 99% der Verbindung in Blut werden so gebunden. Eine Leberpassage der Verbindung in diesem Kompartiment vermeidet eine Extraktion, Stoffwechsel und einen Effekt der ersten Leberpassage. Somit haben die verabreichten Sulfamatverbindungen eine hohe Bioverfügbarkeit.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Sulfamatverbindungen eine geringe Variation der Konzentration im Plasma zwischen Individuen zeigen. Die Verminderung der Variation von Östrogenniveaus in dem Blut zwischen Individuen erlaubt insbesondere die Bereitstellung eines einzigen Produkts sowohl für hysterektomierte als auch nicht-hysterektomierte Subjekte, ohne daß die Entwicklung separater Produkte erforderlich ist.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Sulfamatverbindungen eine langsame Entfernung aus dem Subjekt zeigen. Die Zusammensetzung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung liefert gleichbleibende Plasmamengen an Östron (E1) und Östradiol (E2).
Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Sulfamatverbindungen bei der verabreichten Dosierung eine geringe Hormonwirkung haben. Daher werden die Risiken einer Thrombose der tiefen Vene reduziert.
Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß bei der verabreichten Dosierung ein Knochenschutz bereitgestellt wird, obwohl die Dosis unter dem Endometrium-Proliferations/Stimulationsschwellenwert liegt. Wie es oben beschrieben wurde, sind Östrogene unentbehrlich zur Bewahrung der Knochenstruktur bei Frauen. Ihr Fehlen kann zu einer Zerstörung des Knochens führen (Osteoporose). Jedoch wird bei einer typischen HRT Östron in solch einer Dosis verabreicht, daß neben den vorteilhaften Wirkungen das Endometrium proliferiert. Die Zusammensetzung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung liefert eine Hormonersatztherapie für den Knochenschutz ohne Endometriumstimulation.
Somit liefert die vorliegende Erfindung, wie es zuvor erwähnt wurde, die Verwendung einer Verbindung, wie sie hierin definiert ist, vorzugsweise eine Zusammensetzung, wie sie hierin definiert ist, bei der Herstellung eines Medikaments für die knochenschützende Hormonersatztherapie ohne Endometriumstimulation.
Ein weiterer Vorteil ist, daß die Zusammensetzung ohne die Aufnahme von Progestinen formuliert werden kann.
Ein weiterer Vorteil ist, daß die Zusammensetzung ohne die Aufnahme von Gestagenen formuliert werden kann.
Ein weiterer Vorteil ist, daß einige der Verbindungen nicht zu Verbindungen verstoffwechselt werden können, die Hormonaktivität zeigen oder induzieren.
Einige der Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind auch dahingehend vorteilhaft, daß sie oral aktiv sein können.
Daher nimmt man von einigen Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung an, daß sie auch andere therapeutische Anwendungen als für die Behandlung von endokrinabhängigen Krebsarten haben, wie beispielsweise die Behandlung von Autoimmunkrankheiten.
HORMONERSATZTHERAPIE
Die Zusammensetzung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann so formuliert werden, daß sie eine Hormonersatztherapie bereitstellt. Die Zusammensetzung wird so formuliert werden, daß sie die Sulfamatverbindung in einer Menge enthält, so daß, in Abhängigkeit von der vorgeschriebenen Häufigkeit der Verabreichung, die erforderliche tägliche Dosierung an Sulfamatverbindung bereitgestellt wird.
In einem Aspekt wird die Zusammensetzung so formuliert, daß sie eine tägliche Verabreichung erlaubt. Diese Zusammensetzung kann in Kombination mit Progestinen formuliert werden.
In allen Aspekten der vorliegenden Erfindung, einschließlich täglicher oraler Verabreichung, wird eine Hormonersatztherapie in einer geeigneteren Art und Weise als die Anwendung eines Transdermalpflasters, einem typischen Verabreichungsweg für HRT, erreicht.
TÄGLICH
Wenn eine tägliche Kur von z.B. einer Verabreichung von 100 μg/Tag bereitgestellt wird, werden insbesondere die folgenden wesentlichen Vorteile beobachtet:

• Reduzierung der Variation von Östrogenmengen im Blut des Subjekts zwischen Individuen,
• gleichbleibende Plasmamengen von E1 und E2

Wenn eine tägliche Kur mit einer Verabreichung von 20 bis 50 μg/Tag bereitgestellt wird, werden insbesondere die folgenden wesentlichen Vorteile beobachtet:

• es wird keine Gebärmutterblutung beobachtet,
• keine Brustdrüsenwirkung

WÖCHENTLICH
In einem Aspekt wird die Zusammensetzung so formuliert, daß sie eine wöchentliche Verabreichung erlaubt. Eine wöchentliche Dosis von 0,5 bis 2 mg/Woche, z.B. 1 mg/Woche, kann bereitgestellt werden.
Eine wöchentliche Dosis wird aus Bequemlichkeitsgründen sowohl über Pflaster als auch die tägliche Verabreichung der Zusammensetzung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung vorteilhaft sein.
MONATLICH
Es wird auch eine monatliche HRT-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen, bei der eine einzelne monatliche Dosierung von 2 bis 4 mg oder bis zu 5 mg/Dosis an Verbindung bereitgestellt wird.
STEROIDSULFATASE
Steroidsulfatase, die auch manchmal als Steroidsulfatase oder Sterylsulfatase oder kurz "STS" bezeichnet wird, hydrolysiert mehrere sulfatierte Steroide, wie beispielsweise Östronsulfat, Dehydroepiandrosteronsulfat und Cholesterolsulfat. STS wurde die Enzymnummer EC 3.1.6.2 zugewiesen.
STS wurde kloniert und exprimiert. Siehe beispielsweise Stein et al. (J. Biol. Chem. 264: 13865–13872 (1989)) und Yen et al. (Cell 49: 443–454 (1987)).
STS ist ein Enzym, das mit einer Vielzahl von Krankheitszuständen in Verbindung gebracht wurde.
Zum Beispiel haben Forscher herausgefunden, daß ein vollständiges Fehlen von STS Ichthyose hervorruft. Gemäß einigen Arbeitern ist STS-Mangel ziemlich häufig in Japan. Die gleichen Arbeiter (Sakura et al., J Inherit Metab Dis 1997 Nov.; 20(6): 807–10) haben auch berichtet, daß allergische Erkrankungen, wie beispielsweise Bronchialasthma, allergische Rhinitis oder atopische Dermatitis, mit einem Steroidsulfatasemangel einhergehen können.
Zusätzlich zu Krankheitszuständen, die durch ein vollständiges Fehlen von STS-Aktivität hervorgerufen werden, kann auch eine erhöhte Menge an STS-Aktivität zu Krankheitszuständen führen. Wie es oben erwähnt wurde, gibt es z.B. starke Hinweise, die eine Rolle von STS bei Brustkrebswachstum und Metastasenbildung unterstützen.
STS wurde auch mit anderen Krankheitszuständen in Verbindung gebracht. Zum Beispiel haben Le Roy et al. (Behav Genet 1999 März; 29(2): 131–6) festgestellt, daß es eine genetische Korrelation zwischen Steroidsulfatasekonzentration und einer Auslösung von Angriffsverhalten in Mäusen geben könnte. Die Autoren schlußfolgern, daß eine Sulfatisierung von Steroiden die Antriebskraft für ein komplexes Netzwerk sein könnte, einschließlich Genen, von denen durch Mutagenese gezeigt wurde, daß sie mit Aggression in Verbindung stehen.
STS-INHIBITION
Es wird angenommen, daß einige Krankheitszustände, die mit STS-Aktivität in Verbindung stehen, auf die Umwandlung eines nicht aktiven, sulfatisierten Östrons in ein aktives, nicht sulfatisiertes Östron zurückzuführen ist. Bei Krankheitszuständen, die mit STS-Aktivität in Verbindung stehen, wäre es wünschenswert, die STS-Aktivität zu hemmen.
Hierin umfaßt der Begriff "hemmen" das Reduzieren und/oder Eliminieren und/oder Maskieren und/oder Verhindern der schädlichen Wirkung von STS.
STS-INHIBITOR
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung als ein STS-Inhibitor wirken.
Hierin bedeutet der Begriff "Inhibitor", wie er hierin in Bezug auf die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine Verbindung, die STS-Aktivität hemmt, wie beispielsweise Reduzierung und/oder Eliminierung und/oder Maskierung und/oder Verhinderung der schädlichen Wirkung von STS. Der STS-Inhibitor kann als ein Antagonist wirken.
Die Fähigkeit von Verbindungen, Östronsulfataseaktivität zu hemmen, kann untersucht werden, indem man entweder intakte MCF-7-Brustkrebszellen oder Plazentamikrosome verwendet. Darüber hinaus kann ein Tiermodell verwendet werden. Details über geeignete Testprotokolle werden in den folgenden Abschnitten angegeben. Es ist festzuhalten, daß auch andere Tests verwendet werden können, um STS-Aktivität und somit STS-Hemmung zu bestimmen. Zum Beispiel kann auch auf die Lehren der WO-A-99/50453 verwiesen werden.
Für einige Anwendungen ist die Verbindung vorzugsweise weiter gekennzeichnet durch das Merkmal, daß, wenn die Sulfamatgruppe durch eine Sulfatgruppe unter Bildung eines Sulfatderivats substituiert wäre, dann das Sulfatderivat durch ein Enzym mit Steroidsulfataseaktivität (EC 3.1.6.2) hydrolysierbar wäre, d.h. wenn es mit Steroidsulfatase EC 3.1.6.2 bei einem pH-Wert von 7,4 und bei 37°C inkubiert würde.
Wenn die Sulfamatgruppe der Verbindung durch eine Sulfatgruppe unter Bildung einer Sulfatverbindung zu ersetzen wäre, dann wäre diese Sulfatverbindung in einer bevorzugten Ausführungsform durch ein Enzym mit Steroidsulfataseaktivität (EC 3.1.6.2) hydrolysierbar und würde einen Km-Wert von weniger als 200 mmolar, vorzugsweise weniger als 150 mmolar, vorzugsweise weniger als 100 mmolar, vorzugsweise weniger als 75 mmolar, vorzugsweise weniger als 50 mmolar, liefern, wenn sie mit Steroidsulfatase EC 3.1.6.2 bei einem pH-Wert von 7,4 und bei 37°C inkubiert würde.
GRUPPE K
Die Gruppe K braucht nicht eine zyklische Struktur zu sein. In diesem Zusammenhang kann die Gruppe K eine lineare Struktur sein, welche die Fähigkeit besitzt, sich an eine ringartige Struktur anzupassen, wenn sie in vivo vorliegt.
In einem bevorzugten Aspekt ist die Gruppe K zyklisch, so daß sie die zyklische Gruppe K bildet.
Die zyklische Gruppe K muß nicht notwendigerweise mit dem Ring X kondensiert sein. In diesem Zusammenhang können diese durch eine geeignete Abstandshaltergruppe, welche eine Hydrocarbylgruppe sein kann, voneinander getrennt sein.
In einem bevorzugten Aspekt ist die zyklische Gruppe K mit dem Ring X kondensiert.
Die Gruppe K kann eine polyzyklische Gruppe sein, welche nicht ein kondensierter Polyzyklus zu sein braucht.
Somit bilden die Gruppe K und der Ring X in einem bevorzugten Aspekt eine polyzyklische Verbindung. Wie es angegebenen ist, umfaßt hierin der Begriff „polyzyklisch" kondensierte und nicht-kondensierte Ringstrukturen, einschließlich Kombinationen davon.
Wenigstens eine der zyklischen Gruppen K und X kann eine heterozyklische Gruppe (ein Heterozyklus) oder eine nicht-heterozyklische Gruppe sein.
Wenigstens eine der zyklischen Gruppen K und X kann eine gesättigte Ringstruktur oder eine ungesättigte Ringstruktur (wie beispielsweise eine Arylgruppe) sein.
Vorzugsweise ist wenigstens eine der zyklischen Gruppen ein Arylring.
Wenn die zyklische Gruppe polyzyklisch ist, dann können einige oder alle der Ringkomponenten der Verbindung miteinander kondensiert oder über eine oder mehrere geeignete Abstandshaltergruppen verbunden sein.
Die polyzyklische Verbindung kann eine Anzahl von kondensierten Ringen umfassen. In diesem Aspekt können die kondensierten Ringe jede Kombination von Ringen unterschiedlicher Größe umfassen, wie beispielsweise 3 sechsgliedrige Ringe (6, 6, 6), einen sechsgliedrigen Ring, einen siebengliedrigen Ring und einen sechsgliedrigen Ring (6, 7, 6), einen sechsgliedrigen Ring und zwei achtgliedrige Ringe (6, 8, 8) etc.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, wobei die polyzyklischen Verbindungen keine (6, 6, 7)-Ringe sind. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, wobei die polyzyklischen Verbindungen nur Ringe enthalten, die nicht siebengliedrig sind.
Vorzugsweise wird die polyzyklische Verbindung, einschließlich aller Substituenten, nicht mehr als etwa 50 Kohlenstoffatome, üblicherweise nicht mehr als etwa 30 bis 40 Kohlenstoffatome enthalten.
Die polyzyklische Verbindung kann wenigstens zwei Ringkomponenten oder wenigstens drei Ringkomponenten oder wenigstens vier Ringkomponenten umfassen.
Vorzugsweise umfaßt die polyzyklische Verbindung vier Ringkomponenten.
Bevorzugte polyzyklische Verbindungen besitzen eine Steroidringkomponente oder Bio-Isostere davon.
HYDROCARBYL
Der Begriff „Hydrocarbylgruppe", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine Gruppe, die wenigstens C und H enthält und die optional einen oder mehrere geeignete Substituenten enthalten kann. Beispiele für solche Substituenten können Halogen, Alkoxy, Nitro, eine Alkylgruppe, eine zyklische Gruppe etc. umfassen. Zusätzlich zu der Möglichkeit, daß die Substituenten eine zyklische Gruppe sind, kann eine Kombination aus Substituenten eine zyklische Gruppe bilden. Wenn die Hydrocarbylgruppe mehr als ein C enthält, dann brauchen diese Kohlenstoffe nicht notwendigerweise miteinander verknüpft zu sein. Z.B. können wenigstens zwei der Kohlenstoffatome über ein geeignetes Element oder eine geeignete Gruppe miteinander verknüpft sein. Somit kann die Hydrocarbylgruppe Heteroatome enthalten. Geeignete Heteroatome sind den Fachleuten auf dem Gebiet geläufig und umfassen z.B. Schwefel, Stickstoff und Sauerstoff. Ein nicht-beschränkendes Beispiel für eine Hydrocarbylgruppe ist eine Acylgruppe.
Eine typische Hydrocarbylgruppe ist eine Kohlenwasserstoffgruppe. Hierin bezeichnet der Begriff „Kohlenwasserstoff" jede unter einer Alkylgruppe, einer Alkenylgruppe, einer Alkinylgruppe, wobei die Gruppen linear, verzweigt oder zyklisch sein können, oder eine Arylgruppe. Der Begriff „Kohlenwasserstoff" umfaßt auch solche Gruppen, die aber optional substituiert sind. Wenn die Kohlenwasserstoffgruppe eine verzweigte Struktur mit (einem) Substituenten daran ist, dann kann die Substitution entweder an dem Kohlenwasserstoffrückgrat oder an der Verzweigung sein; alternativ können die Substitutionen an dem Kohlenwasserstoffrückgrat und an der Verzweigung sein.
SULFAMATGRUPPE
In einer Ausführungsform hat der Ring X eine Sulfamatgruppe als einen Substituenten. Der Begriff „Sulfamat", wie er hierin verwendet wird, umfaßt einen Ester von Sulfamidsäure oder einen Ester eines N-substituierten Derivats von Sulfamidsäure oder ein Salz davon.
Wenn Rs eine Sulfamatgruppe ist, dann wird die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung als eine Sulfamatverbindung bezeichnet.
Typischerweise hat die Sulfamatgruppe die Formel (R1)(R2)N-S(O)(O)-O-, worin vorzugsweise R1 und R2 unabhängig voneinander unter H, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl oder Kombinationen davon ausgewählt sind oder zusammen Alkylen darstellen, wobei das oder jedes Alkyl oder Cycloalkyl oder Alkenyl optional ein oder mehrere Heteroatome oder -gruppen enthält.
Wenn sie substituiert sind, können die N-substituierten Verbindungen für die Verwendung in dieser Erfindung einen oder zwei N-Alkyl-, N-Alkenyl-, N-Cycloalkyl- oder N-Aryl-Substituenten, von denen einer oder jeder vorzugsweise maximal 10 Kohlenstoffatome aufweist, enthalten. Wenn R1 und/oder R2 Alkyl ist/sind, sind die bevorzugten Gruppen solche, bei denen R1 und R2 jeweils unabhängig voneinander unter niederen Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, d.h. Methyl, Ethyl, Propyl etc. R1 und R2 können beide Methyl sein. Wenn R1 und/oder R2 Aryl ist/sind, sind typische Gruppen Phenyl und Tolyl (PhCH3; o). Wenn R1 und R2 Cycloalkyl repräsentieren, sind typische Gruppen Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl etc. Wenn sie miteinander verbunden sind, repräsentieren R1 und R2 typischerweise eine Alkylengruppe, die eine Kette mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen liefert, welche optional durch ein oder mehrere Heteroatome oder -gruppen unterbrochen ist, z.B. liefert sie einen 5-gliedrigen Heterozyklus, z.B. Morpholino, Pyrolidino oder Piperidino.
Innerhalb der Gruppen Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl sind substituierte Gruppen eingeschlossen, die als Substituenten darin eine oder mehrere Gruppen enthalten, welche die Sulfatase-hemmende Aktivität der betreffenden Verbindung nicht stören. Beispielsweise umfassen nicht störende Substituenten Hydroxy, Amino, Halogen, Alkoxy, Alkyl und Aryl.
In einigen Ausführungsformen kann die Sulfamatgruppe eine Ringstruktur bilden, indem sie an ein oder mehrere Atome in oder an der Gruppe X kondensiert ist oder mit diesen verbunden ist.
In einigen Ausführungsformen kann mehr als eine Sulfamatgruppe vorhanden sein. Beispielsweise können zwei Sulfamate vorhanden sein (d.h. bis-Sulfamatverbindungen). Wenn diese Verbindungen auf einem Steroidkern beruhen, ist vorzugsweise die zweite (oder wenigstens eine der zusätzlichen) Sulfamatgruppe an Position 17 des Steroidkerns lokalisiert. Diese Gruppen brauchen nicht die gleichen zu sein.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist wenigstens eines von R1 und R2 H.
In einigen weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind sowohl R1 als auch R2 H.
NACHAHMER
In einem Aspekt können X und K ein Nachahmer einer Steroidringstruktur sein.
Der Begriff „Nachahmer", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, daß etwas eine ähnliche oder unterschiedliche Struktur, aber eine ähnliche funktionale Wirkung hat.
Mit anderen Worten, die Gruppe K und der Ring X können zusammen ein Bio-Isoster der Ringe eines Steroids oder ein aktiver Teil davon sein.
In einem bevorzugten Aspekt sind die Gruppe K und der Ring X zusammen ein Bio-Isoster der Ringe von Östron oder ein Teil davon.
STEROIDRINGSTRUKTUR
In einem bevorzugten Aspekt bilden X und K eine Steroidringstruktur, d.h. ein Cyclopentanophenanthren-Gerüst, oder Bio-Isostere davon.
Es ist auf dem Gebiet gut bekannt, daß eine klassische Steroidringstruktur die folgende generische Formel hat:
In der oben gezeigten Formel sind die Ringe in der herkömmlichen Art und Weise gekennzeichnet.
Ein Beispiel für ein Bio-Isosteres ist, wenn einer oder mehrere der Ringe A, B, C und D ein heterozyklischer Ring ist/sind und/oder wenn einer oder mehrere der Ringe A, B, C und D substituiert wurde/wurden und/oder wenn einer oder mehrere der Ringe A, B, C und D modifiziert wurde/wurden, wobei aber das Bio-Isostere in der Abwesenheit der Sulfamatgruppe steroidartige Eigenschaften besitzt.
In diesem Zusammenhang kann die Struktur einer bevorzugten polyzyklischen Struktur wie folgt wiedergegeben werden:
worin jeder Ring A', B', C' und D' unabhängig voneinander einen heterozyklischen Ring oder einen nicht-heterozyklischen Ring darstellt, wobei die Ringe unabhängig voneinander substituiert oder unsubstituiert, gesättigt oder ungesättigt sein können.
Z.B. kann irgendeiner oder können mehrere der Ringe A', B', C' und D' unabhängig voneinander mit geeigneten Gruppen substituiert sein, wie beispielsweise einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Hydroxygruppe, einer Halogengruppe, einer Hydrocarbylgruppe, einer Oxyhydrocarbylgruppe etc.
Ein Beispiel für D' ist ein fünf- oder sechsgliedriger, nicht-heterozyklischer Ring mit wenigstens einem Substituenten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Ring D' mit einer Ethinylgruppe substituiert.
Wenn irgendeiner der Ringe A', B', C' und D' ein heterozyklischer Ring ist, dann enthält dieser heterozyklische Ring vorzugsweise eine Kombination aus C-Atomen und wenigstens einem N-Atom und/oder wenigstens einem O-Atom. Es können auch andere heterozyklische Atome in dem Ring vorhanden sein.
Beispiele für geeignete, bevorzugte Steroidkernringe A' bis D' der Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Ringe A–D von Dehydroepiandrosteron und Östrogenen, einschließlich Östron. Bevorzugte Östrogene umfassen natürliche Östrogene, wie beispielsweise Östron, Östradiol, Östratriol Epiöstriol, und konjugierte Östrogene (Equilenin-Derivate).
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ein Wirkstoffvorläufer eines natürlichen Östrogens, vorzugsweise eines unter Östron, Östradiol, Östratriol und Epiöstriol ausgewählten natürlichen Östrogens, ist.
Bevorzugte Steroidkernringe A'–D' der Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen die Ringe A–D von:
Östronen und substituierten Östronen, nämlich:

Östron
4-OH-Östron
6α-OH-Östron
7α-OH-Östron
16α-OH-Östron
16β-OH-Östron
17-Desoxyöstron
Östron

Östradiole und substituierte Östradiole, nämlich:

4-OH-17β-Östradiol
6α-OH-17β-Östradiol
7α-OH-17β-Östradiol
4-OH-17α-Östradiol
6α-OH-17α-Östradiol
7α-OH-17α-Östradiol
16α-OH-17α-Östradiol
16α-OH-17β-Östradiol
16β-OH-17α-Östradiol
16β-OH-17β-Östradiol
17α-Östradiol
17β-Östradiol
17α-Ethinyl-17β-östradiol
17β-Ethinyl-17α-östradiol
17-Desoxyöstradiol

Östriole und substituierte Östriole, nämlich:

Östriol
4-OH-Östriol
6α-OH-Östriol
7α-OH-Östriol
17-Desoxyöstriol

Dehydroepiandrosterone und substituierte Dehydroepiandrosterone, nämlich:

Dehydroepiandrosterone
6α-OH-Dehydroepiandrosterone
7α-OH-Dehydroepiandrosterone
16α-OH-Dehydroepiandrosterone
16β-OH-Dehydroepiandrosterone

In allgemeinen Begriffen kann das Ringsystem A'B'C'D' eine Vielzahl von nicht-störenden Substituenten enthalten. Insbesondere kann das Ringsystem A'B'C'D' eine oder mehrere Hydroxy-, Alkyl-, insbesondere niedere (C₁-C₆)-Alkyl-, z.B. Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, sec-Butyl-, tert-Butyl-, n-Pentyl- und andere Pentylisomere, und n-Hexyl- und andere Hexylisomere, Alkoxy-, insbesondere niedere (C₁-C₆)-Alkoxy-, z.B. Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy- etc., Alkinyl-, z.B. Ethinyl-, oder Halogengruppen, z.B. Fluorsubstituenten, enthalten.
In einem besonders bevorzugten Aspekt ist eine Steroidringstruktur mit bevorzugten Substituenten der vorliegenden Erfindung kombiniert, so daß die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung unter Verbindungen der folgenden Formeln ausgewählt ist:
NICHT-STEROIDSTRUKTUREN
In einer alternativen Ausführungsform kann die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung keinen Steroidkern enthalten oder nicht auf einem Steroidkern beruhen. In diesem Zusammenhang kann die polyzyklische Verbindung ein Nicht-Steroid-Ringsystem enthalten oder darauf beruhen, wie beispielsweise Diethylstilboöstrol, Stilboöstrol, Kumarine, Flavonoide, Combrestatin und andere Ringsysteme. Andere geeignete Nicht-Steroid-Verbindungen für die Verwendung in oder als die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann man in der US-A-5567831 finden.
ANDERE SUBSTITUENTEN
Die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann andere Substituenten aufweisen als Rh1, Rh2 und Rs. Z.B. können diese anderen Substituenten einer oder mehrere unter den folgenden sein: eine oder mehrere Sulfamatgruppen, eine oder mehrere Phosphonatgruppen, eine oder mehrere Thiophosphonatgruppen, eine oder mehrere Sulfonatgruppen, eine oder mehrere Sulfonamidgruppen, eine oder mehrere Halogengruppen, eine oder mehrere O-Gruppen, eine oder mehrere Hydroxygruppen, eine oder mehrere Aminogruppen, eine oder mehrere Schwefel-enthaltende Gruppen, eine oder mehrere Hydrocarbylgruppen, wie beispielsweise eine Oxyhydrocarbylgruppe.
OXYHYDROCARBYL
Der Begriff „Oxyhydrocarbylgruppe", wie er hier verwendet wird, meint eine Gruppe, die wenigstens C, H und O umfasst, und die optional ein oder mehrere andere geeignete Substituenten umfassen kann. Beispiele für solche Substituenten können Halogen-, Alkoxy-, Nitro-, eine Alkylgruppe, eine cyclische Gruppe, etc. umfassen. Zusätzlich zu der Möglichkeit, dass die Substituenten eine cyclische Gruppe darstellen, kann eine Kombination der Substituenten eine cyclische Gruppe ausbilden. Wenn die Oxyhydrocarbylgruppe mehr als ein C umfasst, dann müssen diese Kohlenstoffatome nicht notwendigerweise miteinander verbunden sein. Beispielsweise können wenigstens zwei der Kohlenstoffatome über ein geeignetes Element oder eine Gruppe verbunden sein. Somit kann die Oxohydrocarbylgruppe Heteroatome enthalten. Geeignete Heteroatome werden Fachleuten bekannt sein und beinhalten z.B. Schwefel und Stickstoff.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Oxyhydrocarbylgruppe eine Oxy-Kohlenwasserstoffgruppe.
Hier bedeutet der Begriff „Oxy-Kohlenwasserstoff" ein beliebiges von einer Alkoxygruppe, einer Oxyalkenylgruppe, einer Oxyalkinylgruppe, wobei diese Gruppen linear, verzweigt oder cyclisch sein können, oder eine Oxyarylgruppe. Der Begriff Oxy-Kohlenwasserstoff beinhaltet auch diese Gruppen, wenn sie optional substituiert sind. Wenn der Oxy-Kohlenwasserstoff eine verzweigte Struktur mit daran befindlichem/befindlichen Substituent(en) ist, so kann die Substitution entweder am Kohlenwasserstoff-Rückgrat oder der Verzweigung vorliegen; alternativ können die Substitutionen am Kohlenwasserstoffrückgrat und an der Verzweigung vorliegen.
Typischerweise besitzt die Oxyhydrocarbylgruppe die Formel C1-6O (wie etwa C1-3O).
14C-Gehalt des Rückstands wird jeweils durch Szintillations-Spektrometrie bestimmt. [Anmerkung des Übersetzers: unvollständiger Satz] Die Masse an hydrolysiertem Östron-3-Sulfat wurde aus den erhaltenen 3H-Zählimpulsen (korrigiert für die verwendeten Volumina des Mediums und der organischen Phase und für die Wiedergewinnung von zugegebenem [14C]-Östron) und der spezifischen Aktivität des Substrats berechnet. Jede Versuchs-Charge beinhaltet Inkubationen von Mikrosomen, hergestellt aus einer Sulfatase-positiven humanen Plazenta (Positivkontrolle) und Kolben ohne Zellen (um erkennbare nicht-enzymatische Hydrolyse des Substrats zu bestimmen). Die Anzahl an Zellkernen pro Kolben wird unter Verwendung eines Coulter Counters nach Behandeln der Zell-Monolayer mit Zaponin bestimmt. Ein Kolben in jeder Charge wird verwendet, um den Zellmembranstatus und die Lebensfähigkeit unter Verwendung des Trypan Blau-Ausschlussverfahrens (Phillips, H. J. (1973) In: Tissue culture and applications [Herausgeber: Kruse, D. F. & Patterson, M. K.]; S. 406–408; Academic Press, New York) zu bestimmen.
Die Ergebnisse für die Steroidsulfatase-Aktivität werden ausgedrückt als Mittelwert ±1 Standardabweichung des während der Inkubationsphase (20 Stunden) gebildeten Gesamtprodukts (Östron + Östradiol), berechnet für 106 Zellen und für Werte mit statistischer Signifikanz, wobei die Angabe als Prozentsatz der Reduzierung (Inhibition) gegenüber Inkubationen ohne Östron-3-Sulfamat ausgedrückt wird. Es wurde ein ungepaarter Student t-Test verwendet, um die statistische Signifikanz der Ergebnisse zu testen.
ASSAY ZUR BESTIMMUNG DER STS-AKTIVITÄT UNTER VERWENDUNG PLAZENTALER MIKROSOMEN (PROTOKOLL 2)
Inhibition der Steroidsulfatase-Aktivität in plazentalen Mikrosomen:
Sulfatase-positive humane Plazenta aus normal abgeschlossenen Schwangerschaften wird gründlich mit der Schere zerkleinert, einmal mit kaltem Phosphatpuffer (pH 7,4, 50 mM) gewaschen und dann in kaltem Phosphatpuffer (5 ml/g Gewebe) resuspendiert. Die Homogenisierung erfolgt mit einem Ultra-Turrax-Homogenisator unter Verwendung von drei 10 Sekunden-Stößen, getrennt durch 2-minütige Kühlphasen in Eis. Zellkerne und Zelltrümmer werden durch Zentrifugation (4°C) bei 2000 g für 30 Minuten abgetrennt, und Teilvolumina (2 ml) des Überstandes werden bei –20°C gelagert. Die Proteinkonzentration der Überstände wird durch das Verfahren von Bradford (Anal. Biochem., 72, 248–254 (1976)) bestimmt.
Die Inkubationen (1 ml) erfolgen unter Verwendung einer Proteinkonzentration von 100 mg/ml, einer Substratkonzentration von 20 mM [6,7-3H]Östron-3-sulfat (spezifische Aktivität 60 Ci/mmol, von New England Nuclear, Boston, Mass., USA) und einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei [Anmerkung des Übersetzers: unvollständiger Satz]
TIERVERSUCHSMODELL ZUR BESTIMMUNG DER ÖSTROGENEN AKTIVITÄT (PROTOKOLL 4)
Fehlen von Östrogenität in vivo:
Die Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines Tiermodells, insbesondere unter Verwendung von Ratten mit Ovariektomie, untersucht werden. Bei diesem Modell stimulieren Verbindungen, die östrogen sind, das Uteruswachstum.
Die Verbindung (0,1 mg/kg/Tag für fünf Tage) wurde oral an Ratten verabreicht, wobei eine weitere Gruppe von Tieren nur den Träger (Propylenglykol) erhielt. Eine weitere Gruppe erhielt die östrogene Verbindung EMATE subkutan in einer Menge von 10 μg/Tag für fünf Tage. Am Ende der Studie wurden die Uteri erhalten und gewogen, wobei die Ergebnisse als Uterusgewicht/Gesamt-Körpergewicht × 100 ausgedrückt werden.
Verbindungen, die keinen signifikanten Einfluss auf das Uteruswachstum haben, sind nicht östrogen.
REPORTER
Es kann eine breite Vielzahl von Reportern bei den Assay-Verfahren (sowie bei den Screens) der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wobei bevorzugte Reporter praktischerweise detektierbare Signale bereitstellen (z.B. durch Spektroskopie). Beispielhaft kann ein Reportergen für ein Enzym codieren, das eine Reaktion katalysiert, die die Lichtabsorptionseigenschaften verändert.
Andere Protokolle beinhalten Enzym-gekoppelten Immunosorptions-Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA) und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Es kann sogar ein bipositioneller, monoklonal basierter Immunoassay, der monoklonale Antikörper benutzt, die reaktiv für zwei sich nicht störende Epitope sind, verwendet werden. Diese und andere Assays sind unter anderem beschrieben in Hampton R et al. (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) und Maddox DE et al. (1983, J Exp Med 15, 8: 121 1).
Beispiele für Reportermoleküle beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, β-Galactosidase, Invertase, Grünes Fluoreszenzprotein, Luciferase, Chloramphenicol-Acetyltransferase, -Glucuronidase, Exo-Glucanase und Glucoamylase. Alternativ können radioaktiv markierte oder mit Fluoreszenz-Tag markierte Nukleotide in die naszierenden Transkripte eingebaut werden, die dann identifiziert werden, wenn sie an Oligonukleotid-Sonden gebunden sind.
In einem weiteren Beispiel stellt eine Anzahl von Firmen, wie etwa Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) und US Biochemical Corp (Cleveland, OH) kommerzielle Kits und Protokolle für Assay-Verfahren bereit. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen beinhalten solche wie Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszierende oder chromogene Mittel, sowie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel und dergleichen. Patente, die über die Verwendung solcher Markierungen unterrichten, beinhalten US-A-3817837; US-A-3850752; US-A-3939350; US-A-3996345; US-A-4277437; US-A-4275149 und US-A-4366241.
WIRTSZELLEN
Der Begriff „Wirtszelle", im Bezug auf die vorliegende Erfindung, beinhaltet eine jede Zelle, die das Ziel für das Mittel der vorliegenden Erfindung umfassen kann.
Somit stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Wirtszellen bereit, die mit einem Polynukleotid transformiert oder transfiziert sind, das das Ziel der vorliegenden Erfindung darstellt oder dieses exprimiert. Vorzugsweise wird dieses Polynukleotid in einem Vektor für die Replikation und Expression von Polynukleotiden getragen, die das Ziel darstellen sollen oder dieses exprimieren sollen. Die Zellen werden so ausgewählt, dass sie mit diesem Vektor kompatibel sind, und können beispielsweise prokaryotisch (z.B. bakteriell), pilzlich bzw. Hefe oder Pflanzenzellen sein.
Das gram-negative Bakterium E. coli wird in breitem Umfang als Wirt für die heterologe Genexpression verwendet. Jedoch neigen große Mengen an heterologem Protein dazu, im Inneren der Zelle zu akkumulieren. Die nachfolgende Reinigung des gewünschten Proteins aus der Masse der intrazellulären E. coli-Proteine kann manchmal schwierig sein.
Im Gegensatz zu E. coli sind die Bakterien der Gattung Bacillus als heterologe Wirte sehr geeignet, da sie die Fähigkeit besitzen, Proteine in das Kulturmedium zu sekretieren. Andere als Wirte geeignete Bakterien sind diejenigen der Gattung Streptomyces und Pseudomonas.
In Abhängigkeit von der Natur des Polynukleotids, das für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder der Erwünschtheit einer weiteren Prozessierung des exprimierten Proteins können eukaryotische Wirte, wie etwa Hefen oder andere Pilze bevorzugt sein. Im allgemeinen sind Hefezellen gegenüber Pilz-Zellen bevorzugt, da sie leichter zu manipulieren sind. Jedoch werden manche Proteine entweder schwach aus den Hefezellen sekretiert oder werden in einigen Fällen nicht korrekt prozessiert (z.B. Hyperglykosylierung in Hefe). In diesen Fällen sollte ein anderer pilzlicher Wirtsorganismus ausgewählt werden.
Beispiele geeigneter Expressionswirte im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind Pilze, wie etwa die Aspergillus-Spezies (wie etwa solche, die beschrieben sind in der EP-A-0184438 und der EP-A-0284603) und Trichoderma-Spezies; Bakterien, wie etwa Bacillus-Spezies (wie etwa solche, die beschrieben sind in der EP-A-0134048 und der EP-A-0253455), Streptomyces-Spezies und Pseudomonas-Spezies; sowie Hefen, wie etwa Kluyveromyces-Spezies (wie etwa diejenigen, die beschrieben sind in der EP-A-0096430 und der EP-A-0301670) und Saccharomyces-Spezies. Beispielhaft können typische Expressionswirte ausgewählt werden aus Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis and Saccharomyces cerevisiae.
Die Verwendung geeigneter Wirtszellen, wie etwa von Hefe-, Pilz- und Pflanzenwirtszellen, kann posttranslationale Modifikationen bereitstellen (z.B. Myristoylierung, Glykosylierung, Trunkierung, Lipidierung, sowie die Phosphorylierung von Tyrosin, Serin oder Threonin), wie es erforderlich sein mag, um den rekombinanten Expressionsprodukten der vorliegenden Erfindung optimale biologische Aktivität zu verleihen.
ORGANISMUS
Der Begriff „Organismus" im Bezug auf die vorliegende Erfindung beinhaltet jedweden Organismus, der das Ziel gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder davon erhaltene Produkte beinhalten kann. Beispiele von Organismen können einen Pilz, Hefe oder eine Pflanze beinhalten.
Der Begriff „transgener Organismus" im Bezug auf die vorliegende Erfindung beinhaltet jedweden Organismus, der das Ziel gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder erhaltene Produkte umfasst.
TRANSFORMATION WIRTSZELLEN/WIRTSORGANISMEN
Wie früher angezeigt, kann der Wirtsorganismus ein prokaryotischer oder ein eukaryotischer Organismus sein. Beispiele geeigneter prokaryotischer Wirte beinhalten E. coli und Bacillus subtilis. Die Lehre über die Transformation prokaryotischer Wirte ist in der Technik gut dokumentiert, siehe z.B. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
Wenn ein prokaryotischer Wirt verwendet wird, so kann es nötig sein, die Nukleotidsequenz vor der Transformation in geeigneter Weise zu modifizieren – wie etwa durch die Entfernung von Introns.
Bei einer anderen Ausführungsform kann der transgene Organismus eine Hefe sein. In diesem Zusammenhang sind auch Hefen in breitem Umfang als Vehikel für die heterologe Genexpression verwendet worden. Die Spezies Saccharomyces cerevisiae besitzt eine lange Geschichte der industriellen Verwendung, einschließlich ihrer Verwendung für die heterologe Genexpression. Die Expression heterologer Gene in Saccharomyces cerevisiae ist übersichtsartig von Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al., Herausgeber, S. 401–429, Allen and Unwin, London) und von King et al., (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton und G T Yarronton, Herausgeber, S. 107–133, Blackie, Glasgow) beschrieben worden.
Aus verschiedenen Gründen ist Saccharomyces cerevisiae für die heterologe Genexpression gut geeignet. Zum ersten ist sie für Menschen nicht pathogen und unfähig, bestimmte Endotoxine zu produzieren. Zum zweiten besitzt sie eine lange Geschichte sicherer Verwendung über Jahrhunderte der kommerziellen Nutzung für verschiedene Zwecke. Dies hat zu einer breiten öffentlichen Akzeptanz geführt. Drittens hat die ausgedehnte kommerzielle Nutzung und die Forschung, die diesem Organismus gewidmet wurde, zu einem Schatz an Wissen über die Genetik und Physiologie sowie über die Eigenschaften von Saccharomyces cerevisiae bei der Fermentation im großen Maßstab geführt.
Ein Übersichtsartikel über die Prinzipien der heterologen Genexpression in Saccharomyces cerevisiae und die Sekretion von Genprodukten wurde geschrieben von E Hinchcliffe, E Kenny (1993, „Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Band 5, Anthony H Rose und J Stuart Harrison, Herausgeber, 2. Auflage, Academic Press Ltd.).
Es sind verschiedene Typen von Hefevektoren verfügbar, einschließlich integrativer Vektoren, die für ihre Aufrechterhaltung die Rekombination mit dem Wirtsgenom benötigen, und sich autonom replizierende Plasmidvektoren.
Um die transgene Saccharomyces herzustellen, werden Expressionskonstrukte erstellt, indem man die Nukleotidsequenz in ein Konstrukt inseriert, das für die Expression in Hefe konzipiert ist. Es sind mehrere Typen von Konstrukten, die für die heterologe Expression verwendet werden, entwickelt worden. Die Konstrukte enthalten einen in Hefe aktiven Promotor, der fusioniert wird mit der Nukleotidsequenz, wobei für gewöhnlich ein Promotor mit Herkunft aus Hefe, wie etwa der GAL1-Promotor, verwendet wird. Gewöhnlich wird eine Signalsequenz mit Herkunft aus Hefe, wie etwa die Sequenz, die für das SUC2-Signalpeptid codiert, verwendet. Ein in Hefe aktiver Terminator steht am Ende des Expressionssystems.
Für die Transformation von Hefe sind diverse Transformationsprotokolle entwickelt worden. Beispielsweise kann eine transgene Saccharomyces gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem man den Lehren der folgenden Veröffentlichungen folgt: Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); und Ito, H et al., (1983, J Bacteriology 153, 163–168).
Die transformierten Hefezellen werden unter Verwendung verschiedener Selektionsmarker selektiert. Unter den Markern, die für die Transformation verwendet werden, ist eine Reihe auxotropher Marker, wie etwa LEU2, HIS4 und TRP1, sowie dominante Antibiotika-Resistenzmarker, beispielsweise Marker für Aminoglykosid-Antibiotika, z.B. G418.
Ein anderer Wirtsorganismus ist eine Pflanze. Das grundlegende Prinzip bei der Herstellung genetisch modifizierter Pflanzen besteht darin, genetische Information in das Pflanzengenom zu inserieren, um so eine stabile Aufrechterhaltung des inserierten genetischen Materials zu erhalten. Es existieren mehrere Techniken für das Inserieren genetischer Information, mit den beiden Hauptprinzipien einer direkten Einführung der genetischen Information und einer Einführung der genetischen Information unter Verwendung eines Vektorsystems. Eine Übersichtsdarstellung der allgemeinen Techniken ist in den Artikeln von Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205–225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994, 17–27) zu finden. Weitere Lehren über die Transformation einer Pflanze sind in der EP-A-0449375 zu finden.
Somit stellt die vorliegende Erfindung außerdem ein Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle mit einer Nukleotidsequenz bereit, die das Ziel sein soll oder das Ziel exprimieren soll. Mit der Nukleotidsequenz transformierte Wirtszellen können unter Bedingungen kultiviert werden, die für die Expression des codierten Proteins geeignet sind. Das von einer rekombinanten Zelle produzierte Protein kann auf der Oberfläche der Zelle präsentiert werden. Wenn gewünscht, und wie von Fachleuten verstanden wird, können Expressionsvektoren, die codierende Sequenzen enthalten, mit Signalsequenzen für eine direkte Sekretion der codierten Sequenzen durch eine bestimmte prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran erstellt werden. Andere rekombinante Konstrukte können zu der codierenden Sequenz hinzukommen, etwa eine Nukleotidsequenz, die für eine Polypeptiddomäne codiert, die die Reinigung der löslichen Proteine erleichtern wird (Kroll D J et al. (1993) DNA Cell Biol. 12: 441–53).
VARIANTEN/HOMOLOGE/DERIVATE
Zusätzlich zu den hier genannten spezifischen Aminosäuresequenzen und Nukleotidsequenzen umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Varianten, Homologen und Derivaten hiervon. Hier kann der Begriff „Homologie" mit „Identität" gleichgesetzt werden.
Im vorliegenden Kontext ist eine homologe Sequenz so zu verstehen, dass sie eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die wenigstens zu 75, 85 oder 90% identisch ist, bevorzugt zu wenigstens 95 oder 98% identisch. Obwohl Homologie auch in Begriffen von Ähnlichkeit (d.h. Aminosäureresten mit ähnlichen chemischen Eigenschaften/Funktionen) betrachtet werden kann, ist es im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bevorzugt, Homologie in Begriffen von Sequenzidentität auszudrücken.
Homologievergleiche können mit dem Auge durchgeführt werden, oder, üblicherer Weise, mit Hilfe eines leicht verfügbaren Sequenzvergleichsprogramms. Diese kommerziell erhältlichen Computerprogramme können die % Homologie zwischen zwei oder mehr Sequenzen berechnen.
Die prozentuale Homologie kann über zusammenhängende Sequenzen berechnet werden, d.h. eine Sequenz wird einem Alignment mit der anderen Sequenz unterzogen, und jede Aminosäure in einer Sequenz wird direkt mit der korrespondieren Aminosäure in der anderen Sequenz verglichen, bei jeweils einem Rest zur gleichen Zeit. Dies wird als „lückenloses" Alignment bezeichnet. Typischerweise werden solche lückenlosen Alignments nur über eine relativ kurze Anzahl von Resten durchgeführt.
Obwohl dies ein sehr einfaches und konsistentes Verfahren ist, berücksichtigt es nicht, dass z.B. bei einem ansonsten identischen Sequenzpaar eine Insertion oder Deletion bewirken wird, dass die folgenden Aminosäurereste aus dem Alignment herausgenommen werden, was potentiell in einer großen Verringerung der prozentualen Homologie resultiert, wenn ein allgemeines Alignment durchgeführt wird. Demzufolge sind die meisten Sequenzvergleichsverfahren so gestaltet, dass sie optimale Alignments produzieren, die mögliche Insertionen und Deletionen berücksichtigen, ohne dabei das allgemeine Homologieergebnis unnötig zu belasten. Dies wird erreicht, indem man „Lücken" in das Sequenz-Alignment einführt, um eine Maximierung der lokalen Homologie zu versuchen.
Jedoch ordnen diese komplexeren Verfahren jeder Lücke, die im Alignment auftritt, „Lückenstrafen" zu, so dass bei der gleichen Anzahl identischer Aminosäuren ein Sequenz-Alignment mit möglichst wenig Lücken – was eine höhere Verwandtschaft zwischen den zwei verglichenen Sequenzen widerspiegelt – ein höheres Ergebnis erzielen wird als ein Alignment mit vielen Lücken. Es werden typischerweise „affine Lückenkosten" verwendet, die für die Existenz einer Lücke relativ hohe Kosten veranschlagen, und eine kleinere Strafe für jeden nachfolgenden Rest in der Lücke. Dies ist das am weitesten verwendete System zur Bewertung von Lücken. Hohe Lückenstrafen werden natürlich optimierte Alignments mit weniger Lücken ergeben. Die meisten Alignmentprogramme erlauben es, dass die Lückenstrafen modifiziert werden. Jedoch ist es bevorzugt, die Default-Werte zu verwenden, wenn solche Software für Sequenzvergleiche verwendet wird. Wenn beispielsweise das GCG Wisconsin Bestfit Paket (siehe unten) verwendet wird, so ist die Default-Lückenstrafe bei Aminosäuresequenzen –12 für eine Lücke und –4 für jede Erweiterung.
Die Berechnung der maximalen prozentualen Homologie erfordert deshalb zunächst die Herstellung eines optimalen Alignments, das Lückenstrafen berücksichtigt. Ein geeignetes Computerprogramm zur Durchführung solcher Alignments ist das GCG Wisconsin Bestfit Paket (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Beispiele für andere Software, die Sequenzvergleiche durchführen kann, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, das BLAST-Paket (siehe Ausubel et al., 1999 ibidem, Kapitel 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 403–410) und die GENEWORKS-Reihe von Vergleichswerkzeugen. Sowohl BLAST als auch FASTA sind für die Offline- und Online-Suche verfügbar (siehe Ausubel et al., 1999 ibidem, Seiten 7–58 bis 7–60). Es ist jedoch bevorzugt, das GCG Bestfit-Programm zu verwenden.
Eine weitere nützliche Literaturstelle ist diejenige, die sich in FEMS Microbiol. Lett 1999 Mai 15; 174 (2): 247–50 findet (und ein veröffentlichtes Erratum erscheint in FEMS Microbiol Lett 1999 Aug 1; 177(1): 187 8).
Obwohl die endgültige prozentuale Homologie in Begriffen der Identität gemessen werden kann, basiert der Alignment-Prozess selbst typischerweise nicht auf einem Alles-oder-Nichts-Paarvergleich. Stattdessen wird allgemein eine skalierte Ähnlichkeitsergebnis-Matrix verwendet, die jedem paarweisen Vergleich auf Basis einer chemischen Ähnlichkeit oder einer evolutionären Distanz Ergebniswerte zuordnet. Ein Beispiel für eine solche üblicherweise verwendete Matrix ist die BLOSUM62-Matrix, die Default-Matrix für die Reihe der BLAST-Programme. Die GCG-Wisconsin-Programme verwenden generell entweder die allgemeinen Default-Werte oder eine Gebrauchs-Symbolvergleichstabelle, sofern geliefert (siehe Benutzerhandbuch für weitere Details). Es ist bevorzugt, die allgemeinen Default-Werte für das GCG-Paket zu verwenden, oder, im Falle anderer Software, die Default-Matrix, wie etwa BLOSUM62.
Sobald die Software ein optimales Alignment erstellt hat, ist es möglich, den %-Wert der Homologie, bevorzugt die prozentuale Sequenzidentität, zu berechnen. Die Software tut dies typischer Weise als Teil des Sequenzvergleichs und erzeugt ein numerisches Ergebnis.
Die Sequenzen können auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten aufweisen, die eine stille Veränderung hervorrufen und in einer funktionell äquivalenten Substanz resultieren. Absichtliche Aminosäuresubstitutionen können auf Basis der Ähnlichkeit hinsichtlich der Polarität, der Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipathischen Natur der Reste durchgeführt werden, solange die sekundäre Bindungsaktivität der Substanz erhalten bleibt. Beispielsweise beinhalten negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren beinhalten Lysin und Arginin; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilitätswerten beinhalten Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin.
Konservative Substitutionen können z.B. gemäß der folgenden Tabelle durchgeführt werden. Aminosäuren im selben Block in der zweiten Spalte und bevorzugt in derselben Linie in der dritten Spalte können gegeneinander ausgetauscht werden:
EXPRESSIONSVEKTOREN
Die Nukleotidsequenz zur Verwendung als Ziel oder für die Expression des Ziels kann in einen rekombinanten replizierbaren Vektor eingebaut werden. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nukleotidsequenz in und/oder aus einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren und zu exprimieren. Die Expression kann unter Verwendung von Kontrollsequenzen kontrolliert werden, die Promotoren/Enhancer und/oder andere Expressionsregulationssignale beinhalten. Es können prokaryotische Promotoren und Promotoren, die in eukaryotischen Zellen funktionell sind, verwendet werden. Es können gewebespezifische oder Stimuli-spezifische Promotoren verwendet werden. Es können auch chimäre Promotoren verwendet werden, die Sequenzelemente von zwei oder mehr der oben beschriebenen verschiedenen Promotoren umfassen.
Das durch die Expression der Nukleotidsequenz von einer rekombinanten Wirtszelle erzeugte Protein kann in Abhängigkeit von der verwendeten Sequenz und/oder dem verwendeten Vektor sekretiert werden oder es kann intrazellulär enthalten sein. Die codierenden Sequenzen können mit Signalsequenzen entworfen werden, die die Sekretion der die Substanz darstellenden Sequenzen durch eine bestimmte prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran steuern.
FUSIONSPROTEINE
Die Zielaminosäuresequenz kann als Fusionsprotein hergestellt werden, beispielsweise um die Extraktion und Reinigung zu erleichtern. Beispiele für Fusionsprotein-Partner beinhalten Glutathion-S-Transferase (GST), 6 × His, GAL4 (DNA-Bindungs- und/oder Transkriptionsaktivierungsdomäne) und β-Galactosidase. Es kann auch günstig sein, eine proteolytische Spaltstelle zwischen dem Fusionsproteinpartner und der Proteinsequenz von Interesse einzufügen, um eine Entfernung der Fusionsproteinsequenzen zu erlauben. Vorzugsweise wird das Fusionsprotein die Aktivität des Ziels nicht behindern.
Das Fusionsprotein kann ein Antigen oder eine antigene Determinante umfassen, die mit der Substanz der vorliegenden Erfindung fusioniert ist. Bei dieser Ausführungsform kann das Fusionsprotein ein nicht natürlich vorkommendes Fusionsprotein sein, das eine Substanz umfasst, die als ein Adjuvans in dem Sinne wirken kann, als sie eine generalisierte Stimulation des Immunsystems bereitstellt. Das Antigen oder die antigene Determinante kann entweder an den Amino-Terminus oder an den Carboxy-Terminus der Substanz angefügt werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Aminosäuresequenz an eine heterologe Sequenz ligiert werden, um für ein Fusionsprotein zu codieren. Beispielsweise kann es zum Durchtesten von Peptidbibliotheken auf Mittel, die befähigt sind, die Substanzaktivität zu beeinflussen, nützlich sein, wenn eine chimäre Substanz codiert wird, die ein heterologes Epitop exprimiert, das von einem kommerziell erhältlichen Antikörper erkannt wird.
THERAPIE
Die Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können als therapeutische Mittel, d.h. bei therapeutischen Anwendungen, verwendet werden.
Der Begriff „Therapie" beinhaltet heilende Effekte, lindernde Effekte und prophylaktische Effekte.
Die Therapie kann an Menschen oder Tieren, bevorzugt weiblichen Tieren, erfolgen.
PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments bereit, wobei die Zusammensetzung eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung und optional einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein Verdünnungsmittel oder einen Hilfsstoff (einschließlich Kombinationen hiervon) umfasst.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können für den Gebrauch am Menschen oder Tier in der Human- und Veterinärmedizin sein und werden typischerweise einen oder mehrere von einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel, Träger oder Hilfsstoff umfassen. Akzeptable Träger oder Verdünnungsmittel für die therapeutische Verwendung sind in der pharmazeutischen Technik wohlbekannt und werden beispielsweise beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro, Herausgeber, 1985). Die Auswahl eines pharmazeutischen Trägers, Hilfsstoffs oder Verdünnungsmittels kann im Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsroute und die pharmazeutische Standardpraxis erfolgen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können als – oder zusätzlich zu – dem Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel (ein) beliebige(s) Bindemittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, Beschichtungsmittel oder Solubilisierungsmittel beinhalten.
Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Farbstoffe und sogar Geschmacksstoffe können in der pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt werden. Beispiele für Konservierungsstoffe beinhalten Natriumbenzoat, Sorbinsäure und Ester von p-Hydroxybenzoesäure. Antioxidantien und Suspendiermittel können ebenfalls verwendet werden.
In Abhängigkeit von den verschiedenen Zufuhrsystemen kann es unterschiedliche Erfordernisse für die verschiedenen Zusammensetzungen/Formulierungen geben. Beispielhaft kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung formuliert werden, um unter Verwendung einer Minipumpe oder über eine Schleimhaut-Route verabreicht zu werden, z.B. als nasales Spray oder Aerosol für die Inhalation oder als einnehmbare Lösung oder parenteral, wobei die Zusammensetzung in einer injizierbaren Form formuliert ist, zur Verabreichung, z.B. über eine intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Route. Alternativ kann die Formulierung so gestaltet sein, dass sie über beide Routen zugeführt wird.
Da, wo das Mittel mukosal über die Magendarm-Schleimhaut zu verabreichen ist, sollte es in der Lage sein, während des Durchgangs durch den Magendarmtrakt stabil zu bleiben; beispielsweise sollte es resistent gegenüber proteolytischem Abbau sein, stabil bei saurem pH und beständig gegenüber den Detergenseffekten von Gallenflüssigkeit.
Wo es passend ist, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Inhalation, in Form eines Zäpfchens oder Pessars, topisch in Form einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder als Stäubepuder, in der Verwendung als Hautpflaster, oral in Form von Tabletten, die Hilfsstoffe, wie etwa Stärke oder Laktose, enthalten, oder in Kapseln oder Kügelchen entweder alleine oder im Gemisch mit Hilfsstoffen, oder in Form von Elixieren, Lösungen oder Suspensionen mit Geschmacks- oder Farbstoffen verabreicht werden, oder sie können parenteral, z.B. intravenös, intramuskulär oder subkutan, injiziert werden. Bei der parenteralen Verabreichung könnnen die Zusammensetzungen am besten in Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet werden, die andere Substanzen enthalten kann, z.B. genügend Salze oder Monosaccharide, um die Lösung isotonisch mit Blut zu machen. Für die bukkale oder sublinguale Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Lutschtabletten verabreicht werden, die in konventioneller Weise formuliert werden können.
KOMBINATIONSPHARMAZEUTIKUM
Die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit einem oder mehreren anderen Wirkstoffen, wie etwa einem oder mehreren anderen pharmazeutisch aktiven Mitteln, verwendet werden.
Beispielsweise können die Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Kombination mit anderen STS-Inhibitoren und/oder anderen Inhibitoren, wie etwa einem Aromatasehemmer (wie z.B. 4-Hydroxyandrostendion (4-OHA) und/oder Steroiden, wie etwa den natürlich vorkommenden Sterneuorosteroiden Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS) und Pregnenolonsulfat (PS) und/oder anderen strukturell ähnlichen organischen Verbindungen verwendet werden.
Die Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können alleine oder in Kombination mit einem Progestin verwendet werden. Vorzugsweise werden die Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Abwesenheit von einem Progestin verwendet. Daher ist in einem bevorzugten Aspekt die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung im wesentlichen frei von Progestin.
Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem biologischen Antwortmodifikator verwendet werden.
Der Begriff „biologischer Antwortmodifikator" („BRM") beinhaltet Cytokine, Immunmodulatoren, Wachstumsfaktoren, die Hämatopoese regulierende Faktoren, Kolonie-stimulierende Faktoren, chemotaktische, hämolytische und thrombolytische Faktoren, Zelloberflächenrezeptoren, Liganden, Leukozyten-Adhäsionsmoleküle, monoklonale Antikörper, präventive und therapeutische Impfstoffe, Hormone, Komponenten der extrazellulären Matrix, Fibronectin, etc. Bei einigen Anwendungen ist der biologische Antwortmodifikator bevorzugt ein Zytokin. Beispiele von Zytokinen beinhalten: Interleukine (IL), wie etwa IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-19; Tumornekrosefaktor (TNF), wie etwa TNF-α; Interferon alpha, beta und gamma; TGF-β. Bei einigen Anwendungen ist das Zytokin vorzugsweise Tumornekrosefaktor (TNF). Bei einigen Anwendungen kann der TNF irgendein Typ von TNF sein, wie etwa TNF-α, TNF-β, einschließlich Derivaten oder Gemischen hiervon. Bevorzugter ist das Zytokin TNF-α. Informationen über TNF sind in der Technik zu finden, wie etwa in der WO-A-98/08870 und der WO-A-98/13348.
VERABREICHUNG
Typischerweise wird ein Arzt die tatsächliche Dosis bestimmen, die für ein Individuum am geeignetsten sein wird, und diese wird mit dem Alter, dem Gewicht und der Antwort des spezifischen Patienten variieren. Die unten angegebenen Dosierungen sind Beispiele für den durchschnittlichen Fall. Es kann natürlich individuelle Umstände geben, wo höhere oder niedrigere Dosisbereiche günstig sind.
Die Zusammensetzungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können durch direkte Injektion verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann für die parenterale, mukosale, intramuskuläre, intravenöse, subkutane, intraokulare oder transdermale Verabreichung formuliert werden.
Das spezifische Dosierungsniveau und die Häufigkeit der Dosierung für einen bestimmten Patienten können variiert werden und werden von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich der Aktivität der spezifischen verwendeten Verbindung, der metabolischen Stabilität und der Wirkungsdauer dieser Verbindung, dem Alter, Körpergewicht, der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht, der Ernährung, der Art und Zeit der Verabreichung, der Exkretionsrate, der Wirkstoffkombination, dem Schweregrad des spezifischen Zustands und dem die Behandlung durchmachenden Wirtsindividuum.
Neben den typischen Weisen der Verabreichung – die oben angegeben sind – beinhaltet der Begriff „verabreicht" auch die Verabreichung durch Techniken, wie etwa Lipid-vermittelte Transfektion, Liposomen, Immunliposomen, Lipofectin, kationische faziale Amphiphile (CFAs) und Kombinationen hiervon. Die Routen für solche Verabreichungsmechanismen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, die mukosale, nasale, orale, parenterale, gastrointestinale, topische oder sublinguale Route.
Der Begriff „verabreicht" beinhaltet, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Verabreichung über eine mukosale Route, z.B. als Nasenspray oder aerosol zur Inhalation oder als einnehmbare Lösung; sowie eine parenterale Route, bei der die Zufuhr über eine injizierbare Form erfolgt, wie z.B. eine intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Route.
Somit können die STS-Inhibitoren für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in einer beliebigen geeigneten Weise für die pharmazeutische Verabreichung formuliert werden, und zwar unter Verwendung konventioneller pharmazeutischer Formulierungstechniken und pharmazeutischer Träger, Adjuvanzien, Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel, etc., und dabei gewöhnlich für die parenterale Verabreichung. Dosierungen können in einzelnen Dosierungsschemata, in aufgespalteten Dosierungsschemata und/oder in Schemata mit multiplen Dosen, die über mehrere Tage andauern, verabreicht werden. Für die orale Verabreichung können sie in Tabletten, Kapseln, Lösung oder Suspension formuliert werden. Alternativ werden die Verbindungen für die parenterale Verabreichung in einem geeigneten parenteral verabreichbaren Träger formuliert und stellen einzelne tägliche Dosierungsraten bereit. Wirksame Tagesdosen werden jedoch von der inhärenten Aktivität des aktiven Wirkstoffs und dem Körpergewicht des Patienten abhängen, wobei solche Variationen im Bereich der Fähigkeit und Beurteilung des Arztes stehen.
Nervenzellen und quergestreifte Muskelzellen, teilen sich überhaupt nicht; andere, wie etwa die Fibroblasten, die das Heilen von Wunden unterstützen, vermehren sich bei Bedarf, sind aber ansonsten ruhend. [Anmerkung des Übersetzers: unvollständiger Satz]
Nach wie vor muss jede eukaryotische Zelle, die sich teilt, bereit sein, gleichwertiges genetisches Material an zwei Tochterzellen weiterzugeben. Die DNA-Synthese bei Eukaryoten erfolgt nicht während des Zellteilungszyklus, sondern ist auf einen Teil hiervon vor der eigentlichen Zellteilung beschränkt.
Die Beziehung zwischen eukaryotischer DNA-Synthese und Zellteilung ist in Kulturen von Säugerzellen, die alle zu Wachstum und Teilung befähigt waren, gründlich analysiert worden. Im Gegensatz zu Bakterien wurde herausgefunden, dass eukaryotische Zellen nur einen Teil ihrer Zeit mit DNA-Synthese zubringen, und dass diese Stunden vor der Zellteilung (Mitose) abgeschlossen wird. Somit tritt eine zeitliche Lücke nach der DNA-Synthese und vor der Zellteilung auf; das Auftreten einer weiteren Lücke wurde nach der Teilung und vor der nächsten Runde der DNA-Synthese gefunden. Diese Analyse führte zu der Schlussfolgerung, dass der eukaryotische Zellzyklus aus einer M-Phase (mitotischen Phase), einer G1-Phase (der ersten Lücke), der S (DNA-Synthese-)Phase und einer G2-Phase (der zweiten Lücke) besteht, woran sich wieder eine M-Phase anschließt. Die Phasen zwischen den Mitosen (G1, S und G2) sind insgesamt als die Interphase bekannt.
Viele sich nicht teilende Zellen in Geweben (z.B. alle ruhenden Fibroblasten) beenden den Zellzyklus nach der Mitose und gerade vor der DNA-Synthese; von solchen „ruhenden" Zellen sagt man, dass sie den Zellzyklus verlassen haben und sich im G0-Zustand befinden.
Es ist möglich, Zellen zu identifizieren, wenn sie sich in einem der drei Interphase-Stadien des Zellzyklus befinden, und zwar unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (FACS), um deren relativen DNA-Gehalt zu messen: eine Zelle, die sich in G1 (vor der DNA-Synthese) befindet, besitzt eine definierte Menge x an DNA; während S (DNA-Replikation) besitzt sie zwischen x und 2x; und wenn sie sich in G2 (oder M) befindet, besitzt sie 2x an DNA.
Die Stadien der Mitose und Zytokinese in einer Tierzelle sind wie folgt:

(a) Interphase: Das G2-Stadium der Interphase geht dem Beginn der Mitose unmittelbar voraus. Die chromosomale DNA hat sich repliziert und hat während der S-Phase an Protein gebunden, jedoch sind die Chromosomen noch nicht als abgegrenzte Strukturen zu erkennen. Der Nukleolus ist die einzige Kernsubstruktur, die unter dem Lichtmikroskop sichtbar ist. Bei einer diploiden Zelle vor der DNA-Replikation gibt es zwei morphologische Chromosomen jedes Typs, und man sagt, die Zelle sei 2n. In G2, nach der DNA-Replikation, ist die Zelle 4n. Dort gibt es vier Kopien jeder chromosomalen DNA. Da sich die Schwesterchromosomen noch nicht voneinander getrennt haben, werden diese als Schwester-Chromatiden bezeichnet.
(b) Frühe Prophase: Centriolen, jede mit einer neu gebildeten Tochter-Centriole, beginnen zu den entgegengesetzten Polen der Zelle zu wandern; die Chromosomen sind als lange Fäden zu sehen. Die Kernmembran beginnt, sich zu kleinen Vehikeln aufzulösen.
(c) Mittlere und späte Prophase: Die Chromosomen-Kondensation ist abgeschlossen; jede sichtbare Chromosomen-Struktur setzt sich aus zwei Chromatiden zusammen, die an ihren Centromeren zusammengehalten werden. Jede Chromatide enthält eines der zwei neu replizierten Tochter-DNA-Moleküle. Die aus Mikrotubuli bestehende Spindel beginnt, sich von den Regionen in direkter Nachbarschaft der Centriolen, die näher zu ihren Polen hin wandern, strahlenförmig auszudehnen. Einige Spindelfasern reichen von Pol zu Pol; sie müssen die Chromatiden erreichen und sich an den Kinetochoren anheften.
(d) Metaphase: Die Chromosomen wandern zum Äquator der Zelle, wo sie in der Äquatorialebene aufgereiht werden. Die Schwesterchromatiden haben sich noch nicht getrennt.
(e) Anaphase: Die beiden Schwesterchromatiden trennen sich in unabhängige Chromosomen. Jedes enthält ein Centromer, das über eine Spindelfaser mit einem Pol verbunden ist, zu dem es wandert. Somit wird eine Kopie jedes Chromosoms an jede Tochterzelle weitergegeben. Gleichzeitig verlängert sich die Zelle, ebenso wie die Spindeln von Pol zu Pol. Die Zytokinese beginnt, wenn sich die Spaltungsfurche auszubilden beginnt.
(f) Telophase: Es bilden sich neue Membranen um die Tochterkerne; die Chromsomen dekondensieren und werden weniger abgegrenzt, der Nukleolus wird wieder sichtbar, und es bildet sich die Kernmembran um jeden Tochterkern. Die Zytokinese ist nahezu abgeschlossen, und die Spindel verschwindet, wenn die Mikrotubuli und die anderen Fasern depolymerisieren. Im Laufe der Mitose wächst das „Tochter"-Centriol an jedem Pol, bis es seine volle Länge erreicht hat. In der Telophase ist die Verdoppelung jeder der ursprünglichen Centriolen abgeschlossen, und neue Tochter-Centriolen werden während der nächsten Interphase erzeugt.
(g) Interphase: Beim Abschluss der Zytokinese tritt die Zelle in die G1-Phase des Zellzyklus ein und durchläuft den Zyklus dann erneut.

Es wird erkennbar sein, dass der Zellzyklus ein extrem wichtiger zellulärer Prozess ist. Abweichungen vom normalen Zellzyklus können in einer Reihe medizinischer Störungen resultieren. Ein gesteigerter und/oder unkontrollierter Zellzyklus kann zu Krebs führen. Ein herabgesetzter Zellzyklus kann zu degenerativen Zuständen führen. Die Verwendung der Verbindung, wie sie hierin beschrieben ist, kann ein Mittel bereitstellen, um solche Erkrankungen und Zustände zu behandeln.
Somit kann die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet für die Verwendung bei der Behandlung von Zellzyklus-Störungen, wie etwa Krebs, einschließlich hormonabhängiger und hormonunabhängiger Krebsarten, sein.
Zusätzlich kann die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sein für die Behandlung von Krebs, wie etwa Brustkrebs, Eierstockkrebs, endometrialem Krebs, Sarkomen, Melanomen, Prostatakrebs, Pankreaskrebs etc., sowie weiteren soliden Tumoren.
Bei einigen Anwendungen wird der Zellzyklus inhibiert und/oder verhindert und/oder angehalten, wobei der Zellzyklus bevorzugt verhindert und/oder angehalten wird. Bei einem Aspekt kann der Zellzyklus in der G2/M-Phase inhibiert und/oder verhindert und/oder angehalten werden. Bei einem Aspekt kann der Zellzyklus irreversibel verhindert und/oder inhibiert und/oder angehalten werden, wobei der Zellzyklus bevorzugt irreversibel verhindert und/oder angehalten wird.
Mit dem Begriff „irreversibel verhindert und/oder inhibiert und/oder angehalten" ist gemeint, dass es nach der Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung bei einer Entfernung der Verbindung so ist, dass die Wirkungen der Verbindung, nämlich die Verhinderung und/oder Inhibition und/oder das Anhalten des Zellzyklus, nach wie vor beobachtet werden können. Spezifischer ausgedrückt, ist mit dem Begriff „irreversibel verhindert und/oder inhibiert und/oder angehalten" gemeint, dass, wenn in Übereinstimmung mit dem hier dargestellten Zellzyklustest-Protokoll getestet wird, die mit einer Verbindung von Interesse behandelten Zellen nach dem Stadium 2 des Protokolls I ein geringeres Wachstum als Kontrollzellen zeigen. Details über dieses Protokoll sind unten dargestellt.
Somit stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verbindungen bereit, die: eine Inhibition des Wachstums von Östrogenrezeptor-positiven (ER+) und ER-negativen (ER–)-Brustkrebszellen in vitro durch das Verhindern und/oder die Inhibition und/oder das Anhalten des Zellzyklus bewirken; und/oder eine Regression von Nitrosomethyl-Harnstoff (NMU)-induzierten Brusttumoren bei intakten Tieren (d.h. Tieren ohne Ovariektomie) verursachen; und/oder den Zellzyklus bei Krebszellen verhindern und/oder inhibieren und/oder anhalten; und/oder die in vivo wirken, indem sie den Zellzyklus verhindern und/oder inhibieren und/oder anhalten, und/oder die als ein Zellzyklus-Agonist wirken.
ZELLZYKLUS-ASSAY (PROTOKOLL 6)
Prozedur:
Stufe 1:
MCF-7-Brustkrebszellen werden in Multiwell-Kulturplatten mit einer Dichte von 105 Zellen/Well angeimpft. Man lässt die Zellen sich anhaften und bis zu einer Konfluenz von etwa 30% wachsen, wonach sie wie folgt behandelt werden:
Kontrolle – keine Behandlung
Verbindung von Interesse (COI) 20 μM
Man lässt die Zellen für 6 Tage in Wachstumsmedium, das die COI enthält, wachsen, mit einem Austausch von Medium/COI alle 3 Tage. Am Ende dieser Zeitspanne wurden die Zellzahlen unter Verwendung eines Coulter-Zellzählers ausgezählt.
Stufe 2:
Nach der Behandlung der Zellen für eine 6-tägige Zeitspanne mit der COI werden die Zellen mit einer Dichte von 104 Zellen/Well erneut ausgesät. Es werden keine weiteren Behandlungen zugegeben. Man lässt die Zellen für weitere 6 Tage in Gegenwart von Wachstumsmedium wachsen. Am Ende dieser Zeitspanne werden die Zellzahlen erneut ausgezählt.
KREBS
Wie angezeigt, können die Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung einer Zellzyklusstörung sein. Eine spezielle Zellzyklusstörung ist Krebs.
Krebs bleibt eine Haupttodesursache in den meisten westlichen Ländern. Bislang entwickelte Krebstherapien haben das Blockieren der Wirkung oder Synthese von Hormonen einbezogen, um das Wachstum hormonabhängiger Tumoren zu inhibieren. Jedoch wird derzeit eine aggressivere Chemotherapie für die Behandlung hormonunabhängiger Tumoren verwendet.
Daher würde die Entwicklung eines Pharmazeutikums für die Antikrebsbehandlung hormonabhängiger und/oder hormonunabhängiger Tumoren, der jedoch einige oder alle der mit Chemotherapie in Zusammenhang stehenden Nebenwirkungen fehlen, einen großen therapeutischen Fortschritt darstellen.
Es ist bekannt, dass Östrogene nach ihrer Synthese eine Anzahl von Hydroxylierungs- und Konjugationsreaktionen durchmachen. Bis vor kurzem wurde angenommen, dass derartige Reaktionen einen Teil eines metabolischen Prozesses darstellen, der Östrogene schließlich wasserlöslich macht und ihre Beseitigung aus dem Körper verstärkt. Es ist nun ersichtlich, dass einige Hydroxymetaboliten (z.B. 2-Hydroxy und 16-alpha-Hydroxy) und Konjugate (z.B. Östronsulfat, E1S) wichtig sind, um einige der komplexen Wirkungen zu bestimmen, die Östrogene im Körper haben.
Forscher haben die Bildung von 2- und 16-hydroxylierten Östrogenen im Zusammenhang mit Bedingungen untersucht, die das Brustkrebsrisiko verändern. Es gibt nun Anhaltspunkte, dass Faktoren, die die Aktivität von 2-Hydroxylase verstärken, mit einem verringerten Krebsrisiko in Zusammenhang stehen, während diejenigen, die die 16-alpha-Hydroxylierung verstärken, das Risiko von Brustkrebs erhöhen können. Ein weiteres Interesse an der biologischen Rolle von Östrogenmetaboliten ist durch das zunehmende Ausmaß an Anhaltspunkten angeregt worden, dass 2-Methoxyöstradiol einen endogenen Metaboliten mit antimitotischen Eigenschaften darstellt. 2-MeOE2 wird aus 2-Hydroxy-Östradiol (2-OHE2) durch Katechol-Östrogen-Methyl-Transferase gebildet, ein Enzym, das im Körper weit verbreitet ist.
Forscher haben gezeigt, dass 2-MeOE2 in vivo das Wachstum von Tumoren hemmt, die aus der subkutanen Injektion von Meth A Sarkom, B16 Melanom oder MDA-MB-435 Östrogen-Rezeptor-negativen (ER-)-Brustkrebszellen entstehen. Es inhibiert auch die endotheliale Zellproliferation und -Migration und die in vitro-Angiogenese. Es wurde vorgeschlagen, dass die Fähigkeit von 2-MeOE2, das Tumorwachstum in vivo zu inhibieren, eher auf dessen Fähigkeit zurückgehen könnte, die Tumor-induzierte Angiogenese zu hemmen als auf eine direkte Inhibition der Proliferation von Tumorzellen.
Der Mechanismus, durch den 2-MeOE2 seine potenten anti-mitogenen und anti-angiogenetischen Wirkungen ausübt, wird noch untersucht. Es gibt Anhaltspunkte, dass es bei hohen Konzentrationen die Mikrotubuli-Polymerisation hemmen kann und als ein schwacher Inhibitor der Colchicin-Bindung an Tubulin wirkt. Jüngst jedoch, bei Konzentrationen, die die Mitose blockieren, die Tubulinfilamente in den Zellen [Anmerkung des Übersetzers: unvollständiger Satz]
THERAPIE UNTER BERÜCKSICHTIGUNG VON ÖSTROGEN
Wir glauben, dass einige der Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung nützlich für die Kontrolle der Östrogenspiegel im Körper sein können, insbesondere bei Frauen. Somit können einige der Verbindungen nützlich sein zur Bereitstellung eines Mittels zur Kontrolle der Fruchtbarkeit, wie etwa einer oralen Verhütungs-Tablette, -Pille, -Lösung oder -Lutschtablette. Alternativ kann die Verbindung in Form eines Implantats oder eines Pflasters vorliegen.
Somit können die Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung nützlich sein, mit Östrogen in Zusammenhang stehende hormonelle Zustände zu behandeln, insbesondere mit Östrogenmangel in Zusammenhang stehende hormonelle Zustände zu behandeln.
Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung hormoneller Zustände zusätzlich zu den mit Östrogen assoziierten Zuständen sein. Somit kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung auch befähigt sein, die hormonelle Aktivität zu beeinflussen, und sie kann außerdem befähigt sein, eine Immunantwort zu beeinflussen.
Autoimmunität, einschließlich z.B. rheumatoider Arthritis, Typ I und II Diabetes, systemischem Lupus erythematodes, multipler Sklerose, Myasthenia gravis, Thyroiditis, Vaskulitis, Colitis ulcerosa und Crohn'scher Erkrankung, Hautkrankheiten, wie z.B. Psoriasis und Kontaktdermatitis; Graft-versus-Host-Krankheit; Ekzem; Asthma und Organabstoßung nach Transplantation. [Anmerkung des Übersetzers: unvollständiger Satz]
Beispielsweise wird angenommen, dass STS-Inhibitoren die normale physiologische Wirkung von DHEA oder verwandten Steroiden auf Immun- und/oder Entzündungsantworten verhindern können.
Die Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können nützlich sein für die Herstellung eines Medikaments zum Offenlegen einer endogenen Glucokortikoid-artigen Wirkung.
ANDERE THERAPIEN
Es versteht sich außerdem, dass die Verbindung/Zusammensetzung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung andere wichtige medizinische Implikationen besitzen kann.
Beispielsweise kann die Verbindung oder Zusammensetzung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung der Erkrankungen sein, die sich aufgezählt finden in der WO-A-99/52890 – viz:
Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung oder Zusammensetzung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung der in der WO-A-98/05635 aufgezählten Erkrankungen sein. Zur Erleichterung der Bezugnahme wird ein Teil dieser Liste nun bereitgestellt: Krebs, Entzündung oder entzündliche Erkrankungen, Hautkrankheiten, Fieber, Kardiovaskuläre Zustände, Hämorrhagie, Koagulation und Akutphasen-Reaktion, Kachexie, Anorexie, akute Infektion, HIV-Infektion, Schockzustände, Wirts-Transplantat-Unverträglichkeit, Autoimmunerkrankungen, Reperfusionsverletzungen, Meningitis, Migräne und Aspirin-abhängige Anti-Thrombose; Tumorwachstum, -invasion und -ausbreitung, Angiogenese, Metastasen, maligne Erkrankungen, Aszites und maligne Pleuraleffusion; cerebrale Ischämie, ischämische Herzerkrankungen, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Osteoporose, Asthma, Multiple Sklerose, Neurodegeneration, Alzheimer-Krankheit, Arteriosklerose, Schlaganfall, Vaskulitis, Crohn'sche Erkrankung und Colitis ulcerosa; Periodontitis, Gingivitis; Psoriasis, Neurodermatitis, chronische Geschwüre, Epidermolysis bullosa; Ulzeration der Augenhornhaut, Retinopathie und chirurgische Wundheilung; Rhinitis, allergische Konjunktivitis, Ekzeme, Anaphylaxie; wiederkehrende Stenose, kongestives Herzversagen, Endometriose, Arteriosklerose oder Endosklerose.
Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung oder Zusammensetzung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung von Krankheiten sein, die in der WO-A-98/07859 aufgelistet sind. Zur Erleichterung der Bezugnahme wird ein Teil dieser Liste nun bereitgestellt: Zytokin- und Zellteilungsaktivität und Differenzierungsaktivität; immunsupprimierende oder immunstimulierende Aktivität (z.B. zur Behandlung von Immundefizienz, einschließlich Infektion mit dem humanen Immunschwäche-Virus, Regulation des Lymphozytenwachstums, Behandlung von Krebs und zahlreichen Autoimmunerkrankungen, Verhinderung von Transplantatabstoßung oder Induzieren von Tumor-Immunität); Regulierung der Hämatopoese, z.B. Behandlung von myeloiden oder lymphoiden Erkrankungen; Förderung des Wachstums von Knochen, Knorpel, Sehnen, Bändern und von Nervengewebe, z.B. für die Wundheilung, Behandlung von Verbrennungen, Geschwüren und periodontaler Erkrankung und Neurodegeneration; Inhibition oder Aktivierung des Follikel-stimulierenden Hormons (Modulation der Fertilität); chemotaktische/chemokinetische Aktivität (z.B. zur Mobilisierung spezifischer Zelltypen zu Stellen der Verletzung oder Infektion); hämostatische und thrombolytische Aktivität (z.B. zur Behandlung von Hämophilie und Schlaganfall); entzündungshemmende Aktivität (zur Behandlung z.B. von septischem Schock oder Crohn'scher Erkrankung); als antimikrobielle Mittel; als Modulatoren z.B. des Stoffwechsels oder des Verhaltens; als Analgetika; zur Behandlung spezifischer Defizienz- bzw. Mangelkrankheiten; zur Behandlung z.B. von Psoriasis; in der Human- oder Veterinärmedizin.
Zusätzlich oder alternativ kann die Zusammensetzung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung von Krankheiten sein, die in der WO-A-98/09985 aufgelistet sind. Zur Erleichterung der Bezugnahme wird ein Teil dieser Liste nun bereitgestellt: Inhibitorische Aktivität gegenüber Makrophagen und/oder T-Zellen, und somit entzündungshemmende Aktivität; Antiimmunaktivität, d.h. inhibitorische Wirkungen gegenüber einer zellulären und/oder humoralen Immunantwort, einschließlich einer Antwort, die nicht mit Entzündung in Zusammenhang steht; Inhibition der Befähigung von Makrophagen und T-Zellen, sich an Bestandteile der extrazellulären Matrix und an Fibronectin anzuheften, ebenso wie heraufregulierte Fas-Rezeptor-Expression in T-Zellen; Inhibition unerwünschter Immunreaktionen und Entzündungsreaktionen, einschließlich Arthritis, einschließlich rheumatoider Arthritis, mit Überempfindlichkeit verbundene Entzündung, allergische Reaktionen, Asthma, systemischer Lupus erythematodes, Kollagenerkrankungen und andere Autoimmunerkrankungen, mit Arteriosklerose assoziierte Entzündung, Arteriosklerose, arteriosklerotische Herzerkrankung, Reperfusionsverletzung, Herzstillstand, Myocardinfarkt, entzündliche Gefäßerkrankungen, Atemnotsyndrom oder andere cardiopulmonale Erkrankungen, mit peptischem Geschwür assoziierte Entzündung, Colitis ulcerosa und andere Erkrankungen des Magendarmtrakts, Leberfibrose, Leberzirrhose oder andere Lebererkrankungen, Thyroiditis oder andere Drüsenerkrankungen, Glomerulonephritis oder andere renale und urologische Erkrankungen, Otitis oder andere Halsnasenohrenerkrankungen, Dermatitis oder andere dermale Erkrankungen, periodontale Erkrankungen oder andere dentale Erkrankungen, Orchitis oder Epididymoorchitis, Infertilität, Hodentrauma oder andere Hodenerkrankungen mit Immunbezug, Plazentafehlfunktion, Plazentainsuffizienz, habituelle Fehlgeburt, Eklampsie, Prä-Eklampsie und andere Immun- und/oder Entzündungs-bezogene gynäkologische Erkrankungen, posteriore Uveitis, intermediäre Uveitis, anteriore Uveitis, Konjunktivitis, Chorioretinitis, Uveoretinitis, optische Neuritis, intraokulare Entzündung, z.B. Retinitis oder zystoides Maculaödem, sympathische Ophthalmie, Skleritis, Retinitis pigmentosa, Immun- und Entzündungskomponenten der degenerativen Erkrankung des Augenhintergrunds, Entzündungskomponenten bei Augenverletzung, infektionsbedingte Augenentzündung, proliferative Vitreoretinopathien, akute ischämische optische Neuropathie, exzessive Vernarbung, z.B. nach operativer Glaukomfiltration, Immun- und/oder Entzündungsreaktionen gegen Augenimplantate und andere Immun- und Entzündungs-bezogene Augenerkrankungen, mit Autoimmunerkrankungen oder Autoimmunzuständen assoziierte Entzündung, Erkrankungen sowohl des Zentralnervensystems (ZNS) als auch beliebiger anderer Organe, bei denen eine Unterdrückung von Immun- und/oder Entzündungsprozessen sinnvoll wäre, Parkinson-Erkrankung, Komplikationen und/oder Nebenwirkungen bei der Behandlung der Parkinson-Erkrankung, mit AIDS in Zusammenhang stehender Demenz-Komplex, HIV-bedingte Enzephalopathie, Devic-Syndrom, Sydenham-Chorea, Alzheimer-Erkrankung und andere degenerative Erkrankungen, Zustände oder Erkrankungen des ZNS, Entzündungskomponenten bei Schlaganfall, Post-Polio-Syndrom, Immun- und Entzündungskomponenten psychiatrischer Erkrankungen, Myelitis, Enzephalitis, subakute sklerosierende Panenzephalitis, Enzephalomyelitis, akute Neuropathie, subakute Neuropathie, chronische Neuropathie, Guillaim-Barre-Syndrom, Sydenham-Chorea, Myasthenia gravis, Pseudotumor cerebri, Down-Syndrom, Huntington-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Entzündungskomponenten bei ZNS-Quetschung oder ZNS-Verletzung oder bei Infektionen des ZNS, Entzündungskomponenten bei Muskelatrophien und -Dystrophien, und Immun- und Entzündungs-bezogene Erkrankungen, Zustände oder Störungen des zentralen und peripheren Nervensystems, post-traumatische Entzündung, septischer Schock, infektiöse Erkrankungen, Entzündungskomplikationen oder Nebenwirkungen bei Chirurgie, Knochenmarktransplantation oder andere Transplantationskomplikationen und/oder Nebenwirkungen, Entzündungs- und/oder Immunkomplikationen und Nebenwirkungen der Gentherapie, z.B. infolge der Infektion durch einen viralen Träger, oder mit AIDS assoziierte Entzündung, die Unterdrückung oder Inhibition einer humoralen und/oder zellulären Immunantwort zur Behandlung oder Milderung proliferativer Monozyten- oder Leukozyten-Erkrankungen, z.B. von Leukämie, durch die Verminderung der Menge an Monozyten oder Lymphozyten, die Verhinderung und/oder Behandlung der Transplantatabstoßung bei der Transplantation natürlicher oder künstlicher Zellen, Gewebe und Organe, wie etwa Hornhaut, Knochenmark, Organen, Linsen, Schrittmachern, natürlichem oder künstlichem Hautgewebe.
VERBINDUNGSHERSTELLUNG
Die Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem man einen geeigneten Alkohol mit einem geeigneten Chlorid umsetzt. Beispielsweise können die Sulfamatverbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem man einen geeigneten Alkohol mit einem geeigneten Sulfamoylchlorid der Formel R1R2NSO2Cl umsetzt.
Typische Bedingungen für das Durchführen der Reaktion sind wie folgt:
Natriumhydrid und ein Sulfamoylchlorid werden zu einer gerührten Lösung des Alkohols in wasserfreiem Dimethylformamid bei 0°C hinzugegeben. Nachfolgend lässt man den Reaktionsansatz sich auf Raumtemperatur erwärmen, wonach das Rühren für weitere 24 Stunden fortgesetzt wird. Das Reaktionsgemisch wird auf eine kalte gesättigte Lösung von Natriumbicarbonat gegossen, und die resultierende wässrige Phase wird mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte werden über wasserfreiem MgSO4 getrocknet. Filtration, gefolgt vom Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum und Co-Verdampfen mit Toluol ergab einen Roh-Rückstand, der durch Blitzchromatographie weiter gereinigt wird.
Bevorzugt wird der Alkohol vor der Reaktion mit dem Sulfamoylchlorid, so wie es passend ist, derivatisiert. Da, wo es nötig ist, können funktionelle Gruppen in dem Alkohol in bekannter Weise geschützt und die Schutzgruppe oder -gruppen am Ende der Reaktion entfernt werden.
Bevorzugt werden die Sulfamatverbindungen gemäß der Lehre von Page et al. (1990 Tetrahedron 46; 2059–2068) hergestellt. Alternativ können die Sulfamatverbindungen gemäß der WO 96/05216 oder der WO 96/05217 hergestellt werden.
ZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die für eine Knochen schützende Hormonersatztherapie ohne Endometriumstimulation geeignet sind.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun rein beispielhaft unter Bezugnahme auf die anhängenden Figuren beschrieben.
1 zeigt ein Flußdiagramm;
2 zeigt ein Diagramm;
3 zeigt ein Diagramm;
4 zeigt ein Diagramm;
5 zeigt ein Diagramm;
6 zeigt ein Diagramm;
7 zeigt Diagramme;
8 zeigt Diagramme;
9 zeigt ein Diagramm;
10 zeigt ein Diagramm;
11 zeigt Diagramme.
Die folgende(n) Verbindung(en) für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung wurde(n) hergestellt:
Herstellung von Östron-3-sulfamat
Natriumhydrid (60%-ige Dispersion; 2 Äq.) und Sulfamoylchlorid (2 Äq.) wurden zu einer gerührten Lösung von Östron (1 Äq.) in wasserfreiem Dimethylformamid bei 0°C hinzugefügt. Anschließend wurde die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, woraufhin das Rühren für weitere 24 Stunden fortgesetzt wurde.
Das Reaktionsgemisch wurde auf eine kaltgesättigte Lösung von Natriumbicarbonat gegossen, und die resultierende wäßrige Phase wurde mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Filtration, gefolgt von Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum und Co-Verdampfen mit Toluol ergab einen rohen Rückstand, der durch Blitzchromatographie weiter gereinigt wurde.
Eine Analyse zeigt die folgenden Daten:
δ¹H (270 MHz; CD₃OD): 0,91 (s, 3H, C₁₈-Me), 1,40–2,55 (Serie von m 13H), 2,90–2,92 (m, 2H), 7,04 (br d, 2H, J = 10,44 Hz), 7,33 (br d, 1H, J = 8,42 Hz).
δ¹³H (67,8 MHz; CD₃OD): 14,53 (q, C₁₈-Me), 22,80 (t), 27,24 (t), 27,73 (t), 30,68 (t), 33,05 (t), 37,01 (t), 39,76 (d), 45,73 (s, C₁₈), 51,86 (d), 120,76 (d), 123,54 (d), 127,89 (d), 139,83 (s), 150,27 (s), 223,87 (s, C = O).
m/z (%): 349 (9) (m⁺), 270 (100), 213 (26), 185 (43), 172 (31), 159 (21), 146 (36), 91 (33), 69 (37), 57 (73), 43 (56), 29 (24).
Studien mit Östradiolsulfamat (J995)
Technologie
Östradiolsulfamat (J995) wurde hinsichtlich seiner hormonellen Eigenschaften in vitro und in vivo untersucht. In vitro-Studien umfaßten die Bewertung seiner spezifischen Bindung an Östrogenrezeptoren unter Verwendung von cytosolischen Präparationen von Gebärmuttergewebe von Ratten und Mäusen und MCF-7-Tumorzellen. in vivo-Studien wurden an mehreren Tierarten durchgeführt, einschließlich intakten und ovarektomisierten Ratten und Cynomulgus-Affen. Diese Spezies diente ausführlichen pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Studien bei parenteraler und oraler Verabreichung der Verbindung.
Studien im Menschen wurden mit oraler Verabreichung der Verbindung in Frauen nach der Menopause durchgeführt. Es wurden mehrere Dosen bei einzelner und mehrfacher Verabreichung bewertet. In vitro-Studien wurden mit Lösungen in öligen Trägern für eine parenterale Verabreichung durchgeführt. Eine orale Behandlung wurde mit Suspensionen von kristallinem J995 in wäßrigen Trägern durchgeführt. Klinische Studien wurden mit amorpher Wirksubstanz, die galenisch mit einem Gemisch von herkömmlichen Bestandteilen als Kapseln oder Tabletten formuliert war, durchgeführt.
In vitro-Studien zeigten, daß J995 per se keine Affinität für den Östrogenrezeptor hat. Es gab keine spezifische Bindung von radioaktiv markiertem J995 an den Östrogenrezeptor von Mäusen, Ratten und vom Menschen. Ein großer Überschuß von J995 war nicht in der Lage, spezifisch gebundenes, radioaktiv markiertes Östradiol zu verdrängen. Beide Erkenntnisse sind ein starker Hinweis darauf, daß J995 nach der Umwandlung von einem hormonell inaktiven in ein hormonell aktives Molekül östrogenartige Wirkungen ausübt. Der Wirkstoffvorläufer J995 oder sein Hauptmetabolit Östronsulfamat (EMATE) wird zu Sulfamidsäure und den natürlichen östrogenartigen Hormonen Östradiol bzw. Östron hydrolysiert (1).
Aufgrund eines bevorzugten Transports in Erythrozyten haben der Wirkstoffvorläufer und J995 eigentümliche pharmakokinetische Eigenschaften. J995 zirkuliert nicht in der Plasmafraktion von Blut, wie es herkömmliche Östrogene tun, aber eine Menge von 98 bis 99% von J995 zirkuliert in dem Erythrozytenkompartiment. Dieser Erythrozytentransport führt zu stark reduzierter hepatischer Hormonwirkung und Extraktion bei der ersten Leberpassage und zu lang andauernder Freisetzung des J995 aus Erythrozyten, welche als ein Depot wirken.
Vorteile von J995 in Bezug auf die orale Östrogentherapie:
• Reduzierung der individuellen Variation von Blutniveaus (2 und 3):
Der Gold-Standard der oralen Östrogentherapie ist Ethinylöstradiol. Diese Verbindung führt nicht zu gut definierten Blutniveaus (4). Der Nachteil dieser individuellen Variation ist die Notwendigkeit, in den meisten Individuen höhere Dosen als notwendig zu verabreichen, um eine akzeptable Rate für erfolgreiche Behandlungen zu erzielen.
• Reduzierung der Östrogendosis und Beladung von aktiven Metaboliten, von denen angenommen wird, daß sie das Wachstum einiger hormonabhängiger Tumore fördern:
Die herkömmliche orale Östrogenersatztherapie mit den sogenannten konjugierten Östrogenen, Östradiol, Östradiolvalerat oder Östronsulfat, führt zu einem großen Pool von Östronsulfat im Kreislauf. Die Hydrolyse von einem Teil dieses Metaboliten führt zu den therapeutisch relevanten Blutniveaus von Östron und Östradiol. Jedoch hat Östronsulfat den Nachteil, daß es von Sulfatase in Brusttumorgewebe besonders aktiv hydrolysiert wird, was stark wachstumsfördernde Östrogene erzeugen kann. J995 führt im Verhältnis zu seiner Dosis zu höheren und viel länger andauernden Östradiolniveaus als Östradiolvalerat bei der gleichen Dosis (6, 7). Der abstromig auftretende Metabolit Östronsulfat bleibt um wenigstens den Faktor 10 niedriger als unter Östradiolvaleratbehandlung (5).
• Reduzierung von hepatischen östrogenartigen Effekten:
Eine hohe Dosis von Östrogen ist für eine herkömmliche orale Östrogentherapie wesentlich, um mit dem erheblichen hepatischen Verlust an Hormon fertig zu werden. Der Nachteil dieser hohen Dosis ist eine unvorteilhafte Wirkung auf östrogenregulierte hepatische Funktionen. Diese umfassen eine Wirkung auf Faktoren des hemostatischen Systems und verwandte thromboembolische Störungen, Erhöhung von Angiotensinogen im Kreislauf und nachfolgende Wirkungen auf adrenale, renale und vaskuläre Funktionen, Veränderungen der Gallensekretion und des Lipidmetabolismus. Der Leberumgehungsmechanismus der Wirkung von J995 und die Strategie der ultrageringen Dosis gemäß dieser Erfindung vermeidet die entsprechenden unerwünschten Wirkungen von klimakterischer Östrogenbehandlung. Oral verabreichtes J995 erreicht den Erythrozytenpool zu fast 100%. Viel mehr als 50% dieses Wirkstoffvorläufers erscheint im Kreislauf als Östron und Östradiol (11). Dies erlaubt eine stark reduzierte Dosis im Vergleich zur herkömmlichen oralen Östrogentherapie pro Zeiteinheit.
• Erreichen von konstanten Blutniveaus:
Blutniveaus von Östrogenen fluktuieren von Tag zu Tag unter herkömmlicher täglicher oraler Östrogenbehandlung (5, 6, 7), wogegen J995 zu sehr konstanten, lang anhaltenden Blutniveaus führt (5, 6, 7, 8, 9, 10). 9 zeigt nahezu konstante Östronsulfatniveaus, welche die aufstromig gelegene Erzeugung von Östradiol und Östron nach 14 Tagen der Behandlung mit J995 bei einer sehr geringen Dosis von 100 μg pro Tag in der Auswaschphase über 144 Stunden wiederspiegeln.
• Wirkungen von Östradiolsulfamat in Östrogen-defizienten Knochen:
Mit der etablierten oralen Östrogentherapie können konstante und gut definierte Blutniveaus, wie sie hierin beschrieben sind, nicht erreicht werden. J995 erlaubt eine präzise osteoprotektive Behandlung unmittelbar unterhalb des Schwellenwertes, welcher zu Endometriumwachstum führt. Das Fehlen von Endometriumseffekten erlaubt in einem bevorzugten Aspekt die Verwendung von J995 ohne die gleichzeitige Verabreichung von Progestinen.
Verbesserungen, die mit einer Nur-Östrogen-Präparation für die Östrogenersatztherapie auf der Grundlage von J995 erreicht werden können
• Blutungsfreie Therapie:
Der Grund für eine kombinierte Östrogen/Progestin-Behandlung ist die Kontrolle von Endometriumproliferation, welche ein Risiko für eine Endometriumkrebsentwicklung darstellt. Der Preis für diesen schützenden wesentlichen Effekt ist ziemlich erheblich. Sowohl die zyklische als auch die kontinuierliche kombinierte Behandlung führen zu Gebärmutterblutungen, welche wahrscheinlich der wichtigste Grund zur Unterbrechung der Östrogenersatztherapie sind.
• Wirkungen auf das Wohlbefinden:
Ein weiterer etablierter negativer Aspekt dieser Behandlung ist eine Beeinträchtigung der positiven Wirkungen, welche Östrogene auf das Wohlbefinden von Frauen im Klimakterium ausüben.
• Brust:
Es ergeben sich Fragen aufgrund der proliferativen Wirkungen von Progestinen in der Brust in Analogie zu den Wirkungen von Progesteron während der Schwangerschaft. Die Bedenken hinsichtlich dieser Wirkungen beziehen sich auf ihre potentielle Rolle in der Entwicklung von Brustkrebs.
• Stoffwechselnebenwirkungen:
Progestine, wie Progesteron selbst, haben wichtige Wirkungen auf ein breites Spektrum von Stoffwechselfunktionen. Diese umfassen die Sekretion von Insulin und Insulinresistenz, welche reduziert ist, und Wirkungen auf den Lipidstoffwechsel. Entsprechende Wirkungen stellen unerwünschte Effekte im Zusammenhang mit Östrogenersatztherapie dar.
Bedeutung von Östrogenersatztherapie:
Frauen haben einen konstanten Verlust an Knochenmasse nach der Einstellung der Eierstocköstrogensekretion nach der Menopause. Aufgrund der Tatsache, daß die Lebenserwartung von Frauen sehr hoch und nach wie vor steigend ist, ist es zwingend erforderlich, Knochenverlust und die daraus resultierende Skelettzerbrechlichkeit zu verhindern. Dies ist mit Abstand der wichtigste Risikofaktor für Körperbehinderung und auch für Morbidität und Mortalität in hohem Alter.

Claims

Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments für die Knochen schützende Hormonersatztherapie ohne endometrische Stimulation, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung folgendes umfaßt: (i) eine Verbindung der Formel (I)
worin X ein Hydrocarbylring mit wenigstens 4 Atomen in dem Ring ist, K eine Hydrocarbylgruppe ist und Rs eine Sulfamatgruppe ist, (ii) optional vermischt mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, Arzneistoffsträger oder Hilfsstoff, wobei die Verbindung in einer Menge für die Bereitstellung einer Dosis von nicht mehr als 200 μg/Tag vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung in einer Menge für die Bereitstellung einer Dosis von 10 bis 200 μg/Tag vorliegt.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Verbindung in einer Menge für die Bereitstellung einer Dosis von 50 bis 200 μg/Tag vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Verbindung in einer Menge für die Bereitstellung einer Dosis von 20 bis 50 μg/Tag vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung in einer Menge von nicht mehr als 200 μg/Dosis vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung in einer Menge von nicht mehr als 1 mg/Dosis vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung in einer Menge von nicht mehr als 4 mg/Dosis vorliegt.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei X in Kombination mit K eine Steroidstruktur nachahmt.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei K eine zyklische Gruppe ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei X ein sechsgliedriger Ring ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Ring X sechs Kohlenstoffatome in dem Ring aufweist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Verbindung die Formel II
hat, wobei jedes von Rs, X und K wie in einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 definiert ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei X in Kombination mit K eine Steroidringstruktur ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Gruppe K und der Ring X eine Steroidringstruktur oder ein substituiertes Derivat davon sind.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei sich die Rs-Gruppe an Position 3 des Rings X befindet.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei Rs eine Sulfamatgruppe ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Verbindung die Formel III
hat, wobei X, K und Rs wie in einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 definiert sind und wobei Rh1 eine optionale Halogengruppe ist, Rh2 eine optionale Halogengruppe ist und wenigstens einer von Rh1 und Rh2 vorhanden ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei sich Rh1 an Position 2 des Rings X befindet.
Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, wobei sich Rh2 an Position 4 des Rings X befindet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel I unter den folgenden Verbindungen ausgewählt ist: