DE60116137T2

DE60116137T2 - Derivatisierung von proteinen in wässrigem lösungsmittel

Info

Publication number: DE60116137T2
Application number: DE60116137T
Authority: DE
Inventors: Gregory Gregoriadis
Original assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Current assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Priority date: 2000-05-16
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2021-05-15
Also published as: DE60116137D1; WO2001087922A3; EP1335931A2; WO2001087922A2; ES2256234T3; US6962972B2; JP2003533537A; ATE313554T1; AU2001258536A1; EP1335931B1; US20030129159A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Derivatisierung von Proteinen, in denen ein Denaturierungsmittel in der Reaktionsmischung enthalten ist, um hohe Substitutionsgrade zu erzielen. Das Verfahren ist besonders auf Derivatisierungsverfahren anwendbar, welche die Reaktion eines Aldehyd-Reagens mit epsilon-Aminogruppen nicht-terminaler Lysyl-Einheiten von Proteinen beinhalten. Neue derivatisierte Proteinverbindungen weisen hohe Substitutionsgrade von Polysialinsäure-Ketten auf.
In unserer früheren Anmeldung WO-A-92/22331 beschreiben wir Verfahren, in denen Polysaccharide, insbesondere Polysialinsäuren, zur Derivatisierung von Arzneizufuhrsystemen oder Proteinen verwendet werden, um die Zirkulationszeit der Substrate zu erhöhen, ihre Immunogenität zu erniedrigen und/oder ihre in-vivo-Stabilität zu erhöhen. Es liegt keinerlei ausgearbeitetes Beispiel einer Derivatisierungsreaktion mit einem Protein vor. Roy et al. beschreiben in J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1993, 264–265, die Derivatisierung durch Michael-Addition einer Acryl-funktionellen Sialinsäure an primäre Aminogruppen von Proteinen. Die Reaktion wird in Anwesenheit von Ammoniumbicarbonat durchgeführt, das nicht allgemein als Denaturierungsmittel beschrieben wird.
Es ist bekannt, dass Natriumdodecylsulfat in der Konzentration von 0,01 M eine Auswirkung auf die dreidimensionale Konformation von Proteinen in wässrigen Zusammensetzungen hat. Zum Beispiel zeigen Prakash et al. in Int. J. Peptide Protein Res. (1980) 15, 305–313, unter Verwendung zirkulardichroitischer Spektren, dass SDS im α-Globulin von Sesamum indicum L (einem Sesamsamen) mehr α-helikale Struktur induziert. Visser et al. verwenden in Biochemistry (1971)10(5) 743–752 verschiedene optische Charakteristika von Elastase und anderen Enzymen, um Konformationsänderungen in Anwesenheit von SDS zu ermitteln. Die Proteinkonzentrationen in den Lösungen variierten von 0,01 bis 0,1 %, während die SDS-Konzentration im Bereich von 0,2 bis 2 Gew.-% lag. Es wurde gezeigt, dass SDS unter diesen Bedingungen die Aktivität von mehreren Enzymen irreversibel hemmt.
Es ist bekannt, Disulfidbrücken zwischen zwei Cystein-Einheiten eines Proteins in Anwesenheit von Harnstoff zu reduzieren, was die Entfaltung des Proteins fördert und die Zugänglichkeit der Disulfidgruppen für das Reduktionsmittel Mercaptoethanol erhöht.
In der US 5,738,846 werden Proteine mit nicht-antigenen Polymeren wie Polyethylenglycol oder Kohlenhydraten konjugiert. Beispiele umfassen Konjugationen, die in Anwesenheit von Tensiden durchgeführt werden, welche angeblich die Konjugation an Lysyl-Reste an der aktiven Stelle eines Proteins verhindern.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren bereitgestellt, in dem ein Protein mit mindestens zwei derivatisierbaren seitenständigen Gruppen (die Seitenketten von Aminoacyl-Einheiten sind) in wässriger Lösung mit einem Derivatisierungsreagens umgesetzt wird, bei dem es sich um eine Polysialinsäure handelt, um ein Protein-Derivat bereitzustellen, und das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Derivatisierungsreaktion in Anwesenheit einer wirksamen denaturierenden Konzentration eines Denaturierungsmittels durchgeführt wird.
Der Substitutionsgrad des Produktes an den seitenständigen Gruppen beträgt vorzugsweise mindestens zwei Äquivalente Gruppen pro Mol Protein.
Das Verfahren umfasst gewöhnlich einen anschließenden Schritt, in dem das Protein-Derivat von dem Denaturierungsmittel abgetrennt wird, vorzugsweise durch ein Verfahren, das einen Dialyseschritt beinhaltet.
In dem Verfahren kann das Denaturierungsmittel ein chaotropes Ion, wie I^– oder SCN^–, ein großes, von einer starken Säure abgeleitetes Anion, wie ClO₄ ^– oder CCl₃COO^–, ein organisches Lösungsmittel, Harnstoff oder ein Derivat, wie eine Guanidinverbindung, sein. Es handelt sich bevorzugt um eine amphiphile Verbindung, noch bevorzugter ein anionisches Amphiphil. Bei dem anionischen Amphiphil handelt es sich vorzugsweise um den Sulfatmonoester eines Alkohols mit 8 bis 24 Kohlenstoffatomen. Es wird bevorzugt in Form eines Alkalimetallsalzes zur Reaktionsmischung gegeben. Bei dem Amphiphil handelt es sich vorzugsweise um ein Natrium- oder Kalium-C_8-24-alkylsulfat, am bevorzugtesten Natriumdodecylsulfat.
In der Erfindung liegt das Amphiphil gewöhnlich in einer Konzentration im Bereich von 0,0001 bis 0,01 M, bevorzugter im Bereich von 0,0005 bis 0,005 M und am bevorzugtesten bei etwa 0,001 M vor.
In der Erfindung hat das Ausgangsprotein mindestens 2, bevorzugter mindestens 5, zum Beispiel 10 oder mehr derivatisierbare Gruppen, die alle gleicher Art sind. Bei den Gruppen kann es sich um Hydroxylgruppen, Thiolgruppen, Carbonsäuregruppen oder bevorzugt primäre Amingruppen handeln. Am bevorzugtesten sind die derivatisierbaren Gruppen Seitenketten von Lysyl-Einheiten. Das Protein weist deshalb vorzugsweise mindestens 2, bevorzugter mindestens 5, zum Beispiel 10 oder mehr Lysyl-Einheiten im Gerüst auf. Bevorzugt werden mindestens 2 reaktive Gruppen derivatisiert, bevorzugter werden mindestens 5 reaktive Gruppen derivatisiert, d.h., der Derivatisierungsgrad des Proteins beträgt mindestens 5.
In der Erfindung ist das Derivatisierungsreagens eine Verbindung mit einer reaktiven Gruppe, die für die Reaktion mit einem Protein in wässriger Lösung, gegebenenfalls in Anwesenheit von Kupplungsverbindungen, geeignet ist. Kupplungsverbindungen und die Aktivierungschemie werden zum Beispiel in "Methods in Enzymology" 135B (Immobilised Enzymes and Cells), 1987, Mosbach Hsg., Academic Press Inc., New York, und in Nucci, M. L. et al. Adv. Drug Delivery Reviews 6, 133–151 (1991), beschrieben.
Bei dem Reagens handelt es sich zum Beispiel um eine Verbindung, die verwendet wird, um Stabilität zu verleihen, die Immunogenität zu verringern oder die Zirkulationszeit oder Löslichkeit eines Proteins zu erhöhen, oder um das Protein auf ein Ziel auszurichten.
Die vorliegende Erfindung ist von besonderem Nutzen, wenn das Derivatisierungsreagens, das mit den seitenständigen Gruppen des primären Amins umgesetzt werden soll, eine Aldehyd-Verbindung ist. In diesem Fall erzeugt die Kondensation des Proteins mit dem Reagens unter reduzierenden Bedingungen ein Produkt mit einer sekundären Amin-Verknüpfung.
Am bevorzugtesten ist die Aldehyd-Verbindung ein Derivat des Polysaccharids, das zum Beispiel durch die kontrollierte Oxidation eines Alkohols erzeugt wird. Am bevorzugtesten wird der Aldehyd in einem Vorschritt erzeugt, welcher ein erster Schritt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sein kann, in dem eine Polysialinsäure unter kontrollierten Oxidationsbedingungen, zum Beispiel unter Verwendung von Natriumperiodat, in einer wässrigen Reaktion umgesetzt wird. Die Polysialinsäure oder ein Derivat weist am bevorzugtesten eine terminale Sialinsäuregruppe auf und umfasst am bevorzugtesten mindestens 5 Sialinsäure-Einheiten, die durch 2 → 8- oder 2 → 9-Verbindungen miteinander verknüpft sind. Eine geeignete Polysialinsäure weist ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts im Bereich von 2 bis 2000 kDa, bevorzugt im Bereich von 5 bis 50 kDa auf. Am bevorzugtesten stammt die Polysialinsäure aus einer bakteriellen Quelle, wobei sie zum Beispiel das Polysaccharid B aus E. coli K1, N. meningitidis, Moraxella liquefaciens oder Pasteurella aeruginosa oder das K92-Polysaccharid aus dem E. coli-Stamm K92 ist oder davon abgeleitet ist. Am bevorzugtesten ist sie Colominsäure aus E. coli K1.
Es wird angenommen, dass Proteine mit mindestens 5 seitenständigen Polysialinsäure-Ketten neu sind. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein neues Protein bereitgestellt, das mindestens 5 seitenständige Polysialinsäure-Ketten aufweist, die jeweils mindestens 5 miteinander verknüpfte Sialinsäure-Einheiten aufweisen.
Ein Sialinsäure-Reagens wird zum Beispiel unter kontrollierten Oxidationsbedingungen mit Natriumperiodat umgesetzt, um einen terminalen Aldehyd am C₇-Atom zu bilden. Die Oxidationsbedingungen beinhalten bevorzugt Natriumperiodat in einer Konzentration von etwa 0,1 M, das im Überschuss verwendet wird, um eine Salinsäure-Lösung zu derivatisieren. Die Reaktionsbedingungen beinhalten bevorzugt eine 5- bis 60-minütige Reaktion bei Raumtemperatur. Zur Desaktivierung von überschüssigem Periodat werden konventionelle Mittel, wie die Reaktion mit Ethylenglycol, eingesetzt.
Der Derivatisierungsschritt des Verfahrens der Erfindung wird bevorzugt mit dem Protein in der wässrigen Reaktionsmischung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 60°C, bevorzugt 10 bis 45°C durchgeführt, zum Beispiel bei einer erhöhten Temperatur im Bereich von 30 bis 40°C. Das Protein liegt vorzugsweise in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 100 g/l, besonders bevorzugt im Bereich von 1 bis 20 g/l vor. Die Reaktionsmischung kann weitere Bestandteile, wie gelöste anorganische Salze, enthalten, zum Beispiel um die Lösung bei einem geeigneten pH zu puffern.
Das Protein, das in der Erfindung derivatisiert wird, kann zum Beispiel eine therapeutisch aktive Verbindung sein. Die Derivatisierungsreaktion kann zum Beispiel dazu dienen, die Hydro- oder Lipophilie des Proteins zu steuern, zum Beispiel um dessen Löslichkeit in flüssigen Medien anzupassen, insbesondere um dessen Hydrophilie und Löslichkeit in wässrigen Medien zu erhöhen. Die Derivatisierungsreaktion kann wie in unserer früheren Veröffentlichung WO-A-92/22331 dazu dienen, die Zirkulationszeit einer therapeutischen Verbindung zu erhöhen, ihre Immunogenität zu verringern und/oder ihre Lagerstabilität zu erhöhen. Die Anwesenheit der denaturierenden Verbindung erhöht den Derivatisierungsgrad, wodurch die Verbesserung der Löslichkeit, der Zirkulationszeit und/oder der Immunogenität oder die Erhöhung der Stabilität des Proteins gefördert wird. Es wurde gefunden, dass diese Erhöhung des Derivatisierungsgrades vorgenommen werden kann, ohne die Aktivität des Proteins, zum Beispiel dessen Enzymaktivität, nachteilig zu beeinflussen. So desaktiviert die Anwesenheit des anionischen Amphiphils das Protein nicht irreversibel, im Gegensatz zu den Befunden von Visser et al. (a.a.O.), sondern hemmt die Desaktivierung, wie nachstehend gezeigt. Alternativ kann die Derivatisierung dazu dienen, für ein aktives oder passives Targeting durch das Anbringen von Polymeren oder Bindungsliganden zu sorgen.
Pharmazeutisch aktive Proteine, deren Verfügbarkeit im Blutkreislauf durch die Erfindung vorteilhaft verlängert würde, sind Cytokine, wie Interleukine, zum Beispiel IL-2, IL-6 oder IL-1, Interferone, Tumornekrosefaktor (TNF), Wachstumsfaktoren, Peptidhormone, wie Insulin, sowie Enzyme, zum Beispiel zur Verwendung in der Enzymtherapie, sowie Immunglobuline und Aprotinin.
Alternativ kann das Protein ein Träger oder Adjuvans sein, und die Derivatisierungsreaktion konjugiert pharmazeutisch aktive oder diagnostisch nützliche Liganden an das Protein, um die Zufuhr des nützlichen Liganden zu einem Zielgewebe zu optimieren.
In den Figuren:
ist 1 ein Reaktionsschema für die Derivatisierung von Polysialinsäure;
zeigt 2 Ergebnisse von Beispiel 1;
zeigt 3 Ergebnisse von Beispiel 1; und
zeigt 4 Ergebnisse von Beispiel 6.
In den folgenden Beispielen wird Katalase als Modellprotein verwendet.
Allgemeine Methoden
Katalase-Bestimmung

Katalase ist ein tetrameres Hämprotein, das die Zersetzung von Wasserstoffperoxid zu Sauerstoff und Wasser katalysiert. Die Reaktion kann verwendet werden, um die Enzymaktivität zu bestimmen. Die Reaktion ist eine Reaktion erster Ordnung, wobei die Menge an zersetztem Peroxidsubstrat direkt proportional zu der Konzentration sowohl des Substrats als auch des Enzyms ist. Vorausgesetzt, die Substratkonzentration unter den Versuchen ist konstant, ist deshalb jeder Unterschied in der Zersetzungsgeschwindigkeit eine Funktion der vorliegenden Enzymaktivität. In den vorliegenden Beispielen wird die Abnahme der Wasserstoffperoxid-Extinktion bei 240 nm von 0,450 auf 0,400 ermittelt, was der Zersetzung von 3,45 μMol Wasserstoffperoxid in einer Küvette mit einem Reaktionsvolumen von 3 ml entspricht.

Die Konzentration von Katalase (aktiv und inaktiv) beruht darauf, dass das Enzym ein charakteristisches Absorptionsmaximum aufweist, die Soret-Bande bei 405 nm. Die Katalasekonzentration wird spektrophotometrisch bestimmt.

Katalase-, Insulin-, Aprotinin- und IgG-Markierung und Clearancebestimmung

Katalase, Insulin, IgG und Aprotinin werden unter Verwendung der herkömmlichen Methoden unter Verwendung von ¹²⁵I, gewöhnlich der Chloramin-T-Methode, radioaktiv markiert.

Das radioaktiv markierte Protein im Blutkreislauf wurde unter Verwendung von Techniken bestimmt, die in Fernandes, A.I. et al., Biochem. Biophys. Acta (1997) 1341, 26–34, beschrieben werden.

Aktivierung von Colominsäure (Polysialinsäure)

Die Colominsäure ist ein Derivat von E. coli K1 mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 10 kDa. Das Polysaccharid besteht im Wesentlichen nur aus 2-8-verknüpften Sialinsäure-Einheiten.

Die Aktivierung (Oxidation) von Colominsäure wird wie folgt durchgeführt. Eine 0,1 M wässrige Natriumperiodat-Lösung wird gebildet. 1 ml der Natriumperiodat-Lösung wird im Dunkeln mit 10 mg Colominsäure gemischt, und die Reaktionsmischung wird 15 Minuten bei Raumtemperatur und -druck (etwa 20°C, 1 bar) gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2 ml Ethylenglycol, gefolgt von 30-minütigem Rühren unter den gleichen Bedingungen, beendet. Anschließend wird die Mischung bei 40°C ausgiebig gegen einen 0,01 gew.-%-igen Ammonium carbonat-Puffer dialysiert. Das Dialysat wird über Nacht gefriergetrocknet und dann bis zur späteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt. Das Reaktionsschema ist in 1 gezeigt.

Sialinsäure-Bestimmung

Die Sialinsäure wird bestimmt, indem eine 0,5 ml-Probe (mit einer Konzentration im Bereich von 4 bis 40 mg/ml Sialinsäure) in wässriger Lösung gebildet wird, zu der 0,5 ml Resorcin-Reagens gegeben werden. Die Mischung wird in geschlossenen Röhrchen 30 Minuten in einem Wasserbad gekocht. Die Mischung wird 20–30 Minuten gekühlt, und ihre Extinktion wird bei 570 nm gegen Kontrollmischungen eines geeigneten Puffers (d.h. von der Art und Konzentration, in der die Originalprobe vorliegt) und von Reagens abgelesen.

Proteinbestimmung

Proben, die derivatisiertes IgG, Aprotinin oder Insulin enthalten, werden unter Verwendung der Bradford-Methode auf den Gehalt an löslichem Protein untersucht. 100 μl Proteinlösung (mit einer Proteinkonzentration im Bereich von 10 bis 100 μg/ml) und 1 ml Farbreagens (Säure/Farbstoff-Lösung) werden gemischt. Die Extinktion wird bei 595 nm gegen eine geeignete Blindprobe abgelesen.

Das in den nachstehenden Beispielen verwendete IgG wurde unter Verwendung dieser Methode auf seinen Sialinsäure-Gehalt getestet. Es wurde ein Sialinsäure-Gehalt von 2 % festgestellt. Dieser Wert wird bei der Bestimmung des Polysialinylierungs-Grades unter Verwendung der Colominsäure-Derivatisierung gemäß den Beispielen berücksichtigt.

Reagenzien

Die Katalase wurde von Sigma bezogen. Insulin wird von Sigma bezogen. Das IgG ist Rinderserum-IgG von Sigma. Aprotinin wurde von BDH bezogen. Das Monomethoxypolyethylenglycolsuccinimidylsuccinat (Molekulargewicht etwa 5 kDa) wurde von Sigma bezogen. Colominsäure wurde von Sigma bezogen. Das Natriumdodecylsulfat wurde von Sigma bezogen. Harnstoff wurde von BDH bezogen.

Beispiel 1 – Reaktion von Katalase mit Colominsäure

Das vorliegende Beispiel erläutert die Auswirkung der Reaktionszeit bei der Derivatisierungsreaktion aktivierte Colominsäure-Katalse durch Bestimmung der Katalaseaktivität nach Gewinnung des derivatisierten Enzyms.

Die Derivatisierung wurde unter Verwendung von 24 mg Katalase mit 50 mg aktivierter Colominsäure in Anwesenheit von 20 mg Natriumcyanoborhydrid in 5 ml Kaliumhydrogenphosphat-Puffer durchgeführt. Die Reaktanten werden für eine Dauer von bis zu 48 Stunden bei 35 bis 40°C gerührt. Für eine Derivatisierungsreaktion in Gegenwart von SDS wird festes SDS in dem Phosphatpuffer so gelöst, dass sich eine Endkonzentration von 1 × 10^–3 M SDS ergibt.

Nach den Reaktionszeiten 0 Stunden (d.h. so schnell wie möglich nach Ansetzen der Reaktionsmischung), 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden wird die Reaktion durch Zugabe von 70 %-iger Ammoniumsulfat-Lösung gestoppt, um das Protein zu fällen. Die gefällte Mischung wird auf Eis gekühlt und 1 Stunde gerührt, dann 45 Minuten bei 3500 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, und das Pellet wird mit gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung gewaschen, erneut 10 Minuten bei gleicher Geschwindigkeit zentrifugiert, und der Überstand wird verworfen. Das Pellet wird in 5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung aufgenommen. Die resultierende Lösung wird bei –4°C ausgiebig gegen viermal ausgewechselte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung dialysiert. Die Lösung wird dann über eine Sephadex (eingetragene Marke) G-100-Säule geschickt, und die Peaks werden gesammelt und auf den Katalase- und Colominsäure-Gehalt untersucht.

2 zeigt das Konjugationsverhältnis (den Substitutionsgrad) von Colominsäure zu Katalase in Anwesenheit und Abwesenheit von SDS. Die Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit von SDS das maximale Konjugationsverhältnis um einen Faktor von etwa 3 erhöht. Der maximale Derivatisierungsgrad in Anwesenheit von SDS beträgt etwa 8 Mol Colominsäure pro Mol Katalase.

Die derivatisierten Katalase-Verbindungen werden auch gegen native Katalase auf ihre Enzymaktivität getestet. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Die Ergebnisse in 3 für Katalase allein zeigen die Auswirkung, wenn man Katalase den Reaktionsbedingungen, jedoch ohne Zugabe von aktivierter Colominsäure, aussetzt. Dies zeigt, dass unter diesen Bedingungen Katalaseaktivität verloren geht, dass aber der Aktivitätsverlust durch Polysalinylierung gehemmt wird. Die Hemmung ist größer, wenn die Polysalinylierung in Gegenwart von SDS erfolgt.

Beispiel 2 – Bestimmung der Auswirkung einer Änderung der SDS-Konzentration auf die Katalaseaktivität

Zur Derivatisierung der Katalase wurde das in Versuch 1 verwendete allgemeine Kupplungsverfahren verwendet, mit der Ausnahme, dass eine SDS-Konzentration von 0,01 Gew.-%, 0,02 Gew.-% und 0,029 Gew.-% (1 × 10^–3 M) verwendet wurde, wobei die Derivatisierungsreaktion über 48 Stunden fortgesetzt wurde.

Die derivatisierten Katalaseprodukte wurden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen allgemeinen Tests auf ihre Katalaseaktivität untersucht. Die gemessenen Zeiten, in denen die Enzyme die Extinktionen von 0,45 auf 0,40 veringern, sind im Vergleich zu nativer Katalase in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Beispiel 3

Native Katalase, Katalase, die unter Verwendung von 1 × 10^–3 M SDS bei einer Reaktionsdauer von 48 Stunden derivatisiert wurde, und Katalase, die bei Anwendung der gleichen Reaktionszeit, aber in Abwesenheit von SDS derivatisiert wurde, wurden bei unterschiedlichen Wasserstoffperoxid-Konzentrationen hinsichtlich der Bildung von Hanes Woolf-Diagrammen verglichen. Die Km (Substratkonzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte ihres Maximalwertes beträgt) beträgt für native Katalase 83,95 mM, für die in Abwesenheit von SDS hergestellte Colominsäure-Katalase beträgt die Km 114,4 mM, und für die in Anwesenheit von SDS modifizierte Katalase beträgt die Km 140,8 mM.

Beispiel 4 – Polysialinylierung von Proteinen in Gegenwart und in Abwesenheit von SDS

Bei jedem Protein wird 1 mg ¹²⁵I-markiertes und unmarkiertes Protein mit 83,3 mg aktivierter Colominsäure in Anwesenheit von 20 mg Natriumborhydrid in 5 ml Kaliumhydrogenphosphat umgesetzt. Bei Reaktionen in Anwesenheit von SDS wird SDS so gelöst, dass eine Endkonzentration von 1 × 10^–3 M gebildet wird. Die Derivatisierungsreaktion wird 48 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von 35 bis 40°C durchgeführt.

Nach der Reaktion wird das derivatisierte Protein unter Verwendung der gleichen allgemeinen Technik wie in Beispiel 1, aber unter Verwendung einer Zentrifugation bei 9000 U/min gewonnen. Die für die Isolierung verwendete Säule ist Sephadex G-50.

Tabelle 2 zeigt die Konjugationsausbeuten, d.h. den Derivatisierungsgrad, mit und ohne SDS für die vier Proteine.

Aprotinin weist 4 Lysyl-Einheiten mit derivatisierbaren Aminogruppen und zwei terminale Aminogruppen auf, die für eine Derivatisierung durch Aldehyd-Reagenzien zur Verfügung stehen.

Tabelle 2

Die Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit von SDS den Derivatisierungsgrad bei jedem der getesteten Proteine erhöht.

Beispiel 5 – In-vivo-Clearancegeschwindigkeiten

Das markierte Insulin, Aprotinin und IgG, in ihrer nativen Form und in Anwesenheit und Abwesenheit von SDS mit Colominsäure (Polysialinsäure PSS) derivatisiert, werden Mäusen verabreicht, um die Clearancegeschwindigkeit aus dem Blutkreislauf zu bestimmen. Die in-vivo-Tests werden unter Anwendung der in Beispiel 1 der WO-A-92/22331 beschriebenen allgemeinen Technik durch Injektion von Protein oder derivatisiertem Protein mit der in Tabelle 3 gezeigten Dosis durchgeführt. Den Tiere wurde unmittelbar vor und unmittelbar nach der Injektion, nach 30 Minuten, 1 Stunde, 4 Stunden, 6 Stunden, 12 Stunden, 24 und 48 Stunden über die Schwanzvene Blut entnommen, um die im Blutkreislauf verbleibende Konzentration an ¹²⁵I-Marker zu bestimmen. Aus der logarithmischen Kurve der prozentualen Anfangsradioaktivität gegen die Zeit nach der Injektion wird die Fläche unter der Kurve bestimmt. Die Ergebnisse für die verschiedenen Proteine sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass die Derivatisierung jedes Proteins mit Colominsäure zu einer Zunahme der Zirkulationszeit führt, was die in der WO-A-92/22331 gezeigten Ergebnisse bestätigt. Der Grad der Zunahme der Zirkulationszeit wird signifikant erhöht, wenn die Derivatisierung in Anwesenheit von SDS durchgeführt wird.

Beispiel 6 – Derivatisierung in Anwesenheit von Harnstoff

Das Derivatsierungsverfahren gemäß Beispiel 1 wurde unter Verwendung von IgG anstelle von Katalase wiederholt. Es wurden 5 M Harnstoff oder 1 × 10^–3 M SDS verwendet. Die Reaktion in den einzelnen Aliquoten der Reaktionsmischung wurde nach 6, 12, 24 und 48 Stunden gestoppt. Der Derivatisierungs grad wurde nach Bestimmung des Proteingehalts unter Verwendung der oben beschriebenen Bradford-Technik und des Sialinsäuregehalts unter Verwendung der oben beschriebenen Resorcin-Methode ermittelt. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.

Die Ergebnisse in 4 zeigen, dass die Anwesenheit von Harnstoff in Konzentrationen, von denen normalerweise erwartet wird, dass sie zu einer Veränderung der Proteinkonformation führen, den Derivatisierunsgrad erhöht, jedoch in geringerem Umfang als SDS.

Beispiel 7 – Polysialinylierung von IgG in Gegenwart von SDS

IgG, wie es in den obigen Beispielen verwendet wurde, wurde unter den in Beispiel 4 verwendeten allgemeinen Bedingungen in Abwesenheit oder Anwesenheit von 10^–3 M SDS einer Derivatisierung mit oxidierter Colominsäure (CS) unterzogen.

Der Derivatisierungsgrad polysialinylierter IgGs wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Methoden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Die Anwesenheit von SDS erhöht den Derivatisierungsgrad bei einem Polysialinsäure-Reagens.

Der Derivatisierungsgrad PEGylierter und polysialinylierter IgGs wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Methoden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

Die Gegenwart von SDS erhöht den Derivatisierungsgrad sowohl bei einem PEG-Reagens als auch bei einem Polysialinsäure-Reagens. Das PEG-Reagens ergibt einen höheren Substitutionsgrad als das Colominsäure-Reagens.

Claims

Verfahren, in dem ein Protein mit mindestens zwei derivatisierbaren seitenständigen Gruppen (die Seitenketten von Aminoacyl-Einheiten sind) in wässriger Lösung mit einem derivatisierenden Reagens, bei dem es sich um eine Polysialinsäure handelt, umgesetzt wird, um ein Protein-Derivat bereitzustellen, und das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Derivatisierungsreaktion in Anwesenheit einer wirksamen denaturierenden Konzentration eines Denaturierungsmittels durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Denaturierungsmittel eine amphiphile Verbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 2, in dem die amphiphile Verbindung anionisch ist.
Verfahren nach Anspruch 3, in dem das Denaturierungsmittel ein C_8-24-Alkylsulfatmonoester, bevorzugt ein Alkalimetallsalz, bevorzugter Natriumdodecylsulfat, ist.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem das Denaturierungsmittel in einer Konzentration im Bereich von 0,0001–0,01 M vorliegt.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem das Protein-Derivat aus dem Denaturierungsmittel isoliert wird, vorzugsweise in einem Gewinnungsschritt, der eine Dialyse beinhaltet.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem das Protein mindestens 5, bevorzugt mindestens 10 derivatisierbare Gruppen aufweist.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem die derivatisierbaren Gruppen alle die gleichen sind und ausgewählt sind aus Hydroxyl-, Thiol-, Carbonsäure- und Amingruppen und bevorzugt alle Amingruppen, insbesondere epsilon-Aminogruppen von Lysyl-Resten, sind.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem das Reagens ein Aldehyd-Derivat einer Polysialinsäure ist.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem das Protein eine therapeutisch aktive Verbindung ist.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem der Substitutionsgrad des Produkts mindestens 2, bevorzugt mindestens 5 beträgt.
Protein-Verbindung mit mindestens 5 seitenständigen Polysialinsäure-Ketten, die jeweils mindestens 5 Sialinsäure-Einheiten aneinander geknüpft und ein Molekulargewicht im Bereich von 2 bis 2000 kDa aufweisen.
Protein-Verbindung nach Anspruch 12, in der die Polysialinsäure-Ketten durch sekundäre Amin-Verknüpfungen an den Seitenketten von nicht-terminalen Lysyl-Einheiten angebracht sind.
Protein-Verbindung nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, in der die Polysialinsäure-Ketten mindestens 10, vorzugsweise 20–50 wechselseitig verknüpfte Sialinsäure-Einheiten aufweisen.