DE60110801T2

DE60110801T2 - Verfahren zur herstellung von auf chitosan basierenden filmen mit verbessertem zellanhaftvermögen, daraus resultierendes produkt and anwendungen

Info

Publication number: DE60110801T2
Application number: DE60110801T
Authority: DE
Inventors: Jose Luis Lopez Lacomba; Jesus Manuel Garcia Cantalejo; Jose Vicente Sanz Casado; Viviana Monica Ramos
Original assignee: OSFARMA SL
Current assignee: OSFARMA SL
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2001-08-10
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2021-08-11
Also published as: ES2169681B1; WO2002011782A8; WO2002011782A1; US20090186066A1; JP5366350B2; ES2246337T3; US20030124172A1; JP2004505678A; EP1308177A1; DE60110801D1; EP1308177B1; ATE295190T1; BR0113106A; AU2001282153A1; ES2169681A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung fällt in das technische Gebiet der Herstellung eines Films auf Chitosan-Basis und seiner Anwendungen in der pharmazeutischen, Nahrungsmittel- und Biotechnologie-Industrie. Insbesondere schlägt die Erfindung ein neues Verfahren zur Behandlung von Chitosan vor, welches die Gewinnung von Chitosan-Filmen mit erhöhter Zellhaftfähigkeit ermöglicht, und sie trägt so zu wichtigen Anwendungen in Medizin, Pharmazie und Biotechnologie bei, die bis heute nicht erreicht wurden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Chitosan ist ein Polymer von natürlichem Ursprung, das durch teilweise Deacetylierung von Chitin erhalten wird, eines Homopolymers von β-1, 4-2-Acetamid-D-glucosamin, von denen letzteres das nach Zellulose am meisten vorkommende Polysaccharid in der Natur ist.
Sowohl Chitin als auch Chitosan besitzen wichtige und tatsächliche Anwendungen in der Nahrungsmittel-, pharmazeutischen und Biotechnologie-Industrie. Dies kann man leicht ersehen, indem man sich einen Überblick über die Patente verschafft, die in den vergangenen Jahren für deren mögliche Verwendungen angemeldet wurden, und indem man den grundsätzlich anwendungs-orientierten Charakter eines internationalen Symposiums auf dem Gebiet beachtet (Domard et al., Advances in Chitin Sciences, Vol. II, 7^th ICCC (Euchis 97), Jacques Andre Publisher (1998); Peter et al., Advances in Chitin Sciences, Vol. IV (Euchis 99), Universität Potsdam (2000)).
Chitosan zeigt einige Eigenschaften, die seine Verwendung für die medizinische/pharmazeutische Industrie besonders geeignet machen. Einerseits ist es ein biologisch verträgliches und biologisch abbaubares Polymer (Lim et al., J. Biomed. Mater. Res. (Appl. Biomater.) 43, 282-290 (1998); Muzzarelli et al., Biomaterials, 14(1), 39-43 (1993)), mit antimykotischen und antimikrobiellen Eigenschaften (Sano et al., J. Dental Res., 66, 141-149 (1987); Ramos, V. Doctoral Thesis, Univ. Nacional del Sur, Bahia Blanca, Argentina, (1999)), welches eine große Zahl verschiedener physikalischer Zustände annehmen kann, z.B. poröse Matrizen, Gele, Hydrogele, Fasern, Filme, etc., in Abhängigkeit von dem Verfahren, dem es unterzogen wurde.
Andererseits ist es ein Produkt, das eine große Zahl von Substanzen durch Adsorption immobilisieren kann, und es bietet die Möglichkeit, vorausgesetzt, dass eine große Zahl von reaktiven Gruppen vorhanden ist, über verhältnismäßig einfache Reaktionen Substanzen kovalent zu immobilisieren, welche eine gewünschte biologische Aktivität liefern (bioaktive Substanzen), sowie jene seiner Derivatisierung mit verschiedenen funktionellen Gruppen (WO 92/09635; Muzzarelli und Zattini, J. Biol. Macromol. 8, 137-143 (1986); und Muzzarelli et al. Carbohydr. Polymers 11, 307-320 (1989)).
Die angegebenen Zitate weisen auf einen enormen Bereich von Möglichkeiten hin, den seine Verwendung auf dem Gebiet der Biotechnologie bietet, mit einigen bedeutenden Anwendungen, die bereits entwickelt wurden, wie z.B. seine Verwendung bei der Herstellung von medizinischen Nahtmaterialien oder als Bestandteil eines Wundverbandes ( US 6,022,556 ), bei denen manche der vorstehend erwähnten Eigenschaften ausgenutzt werden.
Der in vivo-Abbau von Chitosan führt zu Oligomeren von D-Glucosamin, deren nachfolgender Abbau die Gewinnung von Produkten ermöglicht, welche in den biosynthetischen Stoffwechselweg der Hyaluronsäure eintreten können, welche dieses Produkt zu einer geeigneten Wahl für die gesteuerte Wiederherstellung von Knochen- und Knochenknorpelverletzungen macht. Seine positive Wirkung auf die Behandlung dieser Art von Verletzung ist in der Literatur offenbart.
Bis heute ist jedoch auf dem Gebiet der gesteuerten Gewebewiederherstellung, insbesondere bei Knochen- und Knochenknorpel-Wunden, kein Produkt auf Chitosan-Basis oder Derivate desselben auf dem Markt.
Der Grund kann in einer fehlenden Eignung des Chitosans für eine homogene Zellhaftung und Vermehrung auf einer dreidimensionalen Matrix dieser Verbindung gefunden werden, eines der Merkmale, das die in der Gewebe-Technologie verwendeten Matrizen besitzen sollten (Atala und Mooney, Synthetic Biodegradable Polymer Scaffolds, Birkhäuser, Boston (1997)). Falls man auf den biomedizinischen Anwendungen von Chitosan forscht, liegt seine grundsätzliche Verwendung, abgesehen von jenen eines Nahtmaterials und eines Bestandteils von Wundverbänden, die bereits erwähnt wurden, in der Tat in seiner Verwendung als Füllmaterial, indem es vielleicht als ein Bindemittel in Form eines Hydrogels wirkt oder als ein Mittel, das verkapselte bioaktive Substanzen freisetzt.
Lediglich ein Patent wurde in der nordamerikanischen Patentdatenbank gefunden, das aus den letzten 20 Jahren stammt, bei dem Chitosan als ein Träger für die gesteuerte Regeneration verwendet wird, und in diesem Patent wird der zuvor erwähnte Nachteil dadurch überwunden, dass die dreidimensionale Gaze des Chitosans mit einem Film aus Poly-(Milchsäure-co-Glycol) (polylacticcoglycol film) beschichtet wird ( US 5,830,493 ), so dass die Fähigkeit zur Fixierung und Adsorption der betreffenden bioaktiven Substanzen, die zuvor erwähnt wurden, während des Verfahrens verloren geht.
Falls andererseits die Film-bildenden Eigenschaften zu dieser Aktivierungsfähigkeit mittels Adsorption oder durch Bindung von Verbindungen von biologischem Interesse hinzukommen, würde ein Material erhalten werden, das im Prinzip für die Beschichtung von Prothesen, Implantaten und sogar dreidimensionalen Gazen anderer Polymere geeignet sein würde, welches in der Gewebe-Technologie verwendet werden kann, so dass die durch dieses aktivierte Chitosan induzierte biologische Wirkung genau in dem ausgewählten Bereich des Organismus hervorgerufen werden würde.
Eine erneute Literatursuche zeigt das Fehlen in Bezug auf die Ausnutzung dieser Film-bildenden Fähigkeit auf diesem Gebiet; der einzig bemerkenswerte Umstand ist seine Verwendung als ein Beschichtungsmaterial für Dialysesysteme ( US 5,885,609 ), wobei dieses Material so behandelt wird, dass seine mögliche Zellhaftung reduziert wird.
Es existieren zwei wesentliche Nachteile für die Verwendung von Chitosan in dem angegebenen Sinn. Einerseits kann das Stabilisationsverfahren, das normalerweise für Chitosan-Filme verwendet wird, die Struktur des zu beschichtenden Trägers in negativer Weise beeinflussen. In diesem Sinn sollte man berücksichtigen, dass Chitosan normalerweise in saurem Medium löslich wird, und dass Chitosan-Filme, die aus solchen Lösungen gewonnen wurden, diesen sauren Charakter beibehalten, bei dem Chitosan als Chitosan-Ion vorliegt. Ein auf diesem Weg gebildeter Film, überträgt bei Kontakt mit Wasser oder gepufferten physiologischen Lösungen (z.B. Phosphatpuffer-Lösung (PBS)) einen sauren Charakter auf diese Lösung, und der Film verliert rasch seinen Zusammenhalt und zerfällt in einem kurzen Zeitraum. Aufgrund dieses Phänomens ist es notwendig, ihn zu stabilisieren, wobei das normalerweise verwendete Verfahren aus dem Eintauchen von Chitosan in eine stark basische Lösung, normalerweise NaOH, für mindestens 1 Stunde, besteht. Dieser basische Charakter ist einer, der manche der gewöhnlicherweise in der Gewebe-Technologie verwendeten Träger beeinflussen kann, beispielsweise Polymilchsäure oder Polyglycolsäure.
Der zweite Nachteil, vielleicht der bedeutendste unter dem Gesichtspunkt seiner praktischen Anwendung, liegt in der geringen Zellhaftung, falls sie mit jener verglichen wird, die in einem Chitosan-Film erhalten wird, der entsprechend den vorhandenen Protokollen gebildet wurde, mit Bezug auf jene, die in den handelsüblichen Plastikwaren erzeugt wurde, die für diesen Zweck behandelt wurden. Darüber hinaus wird diese Eigenschaft durch den Mangel an Homogenität der Zellhaftung verschlechtert. Die Zellen vermehren sich lediglich an bestimmten Stellen auf dem Film und verändern drastisch ihre morphologische Gestalt, was wiederum eine erhebliche Veränderung im Stoffwechsel und den besonderen Eigenschaften derselben in Bezug auf das beinhaltet, was für diese Zelllinien als normal angesehen wird.
Darüberhinaus macht somit das geringe Ausmaß und der Mangel an Gleichförmigkeit in der Zellhaftung die Verwendung als ein Beschichtungsmaterial schwierig, sowohl für die in der medizinisch-chirurgischen und der dentalen Praxis gewöhnlicherweise verwendeten Prothesen, oder auch für Gazen von Biomaterialien, die bereits in der Gewebe-Technologie verwendet werden, wie z.B. Poly-L-Milchsäure oder Polyanhydride.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung behandelt das Problem der Bereitstellung von Chitosan-Filmen, die eine gute Zellhaftung und Vermehrung ermöglichen, und die zusätzlich durch den Einbau von Substanzen mit biologischer Aktivität aktiviert werden können, was sie mit einer wichtigen Anwendung auf dem medizinisch-pharmazeutischen Gebiet versehen würde.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Lösung beruht auf der Tatsache, dass die Erfinder beobachtet haben, dass die Durchführung eines Trocknungsschrittes bei einem zuvor stabilisierten und gewaschenen Film auf Chitosan-Basis die Fähigkeit zur Zellhaftung an diesem Film auf Chitosan-Basis, der dieser Trocknungsbehandlung unterzogen wurden, in beträchtlicher Weise erhöht. Mittels dieser Behandlung ist es möglich, einen Film auf Chitosan-Basis zu erhalten, der die Eigenschaften der Zellhaftung und der Vermehrung zeigt, welche ähnlich zu oder größer als jene sind, die in handelsüblichen Plastikwaren erhalten werden (z.B. Napfplatten), die für diesen Zweck behandelt wurden, sowie Eigenschaften, die es ihnen erlauben, Substanzen mit biologischer Aktivität, einschließlich Knochen-morphogenetischer Proteine (bone morphogenetic proteins, BMP), sowohl durch Adsorption als auch kovalent zu immobilisieren, und dabei ihre biologische Aktivität beizubehalten.
Daher stellt ein Verfahren für die Herstellung eines Films auf Chitosan-Basis mit erhöhter Zellhaftfähigkeit einen Gegenstand dieser Erfindung dar. Dieser Film stellt einen weiteren Gegenstand dieser Erfindung dar.
Ein weiterer zusätzlicher Gegenstand dieser Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung eines Films auf Chitosan-Basis mit erhöhter Zellhaftfähigkeit, der mit einer Substanz mit biologischer Aktivität biologisch aktiviert ist. Der erhaltene Film stellt einen weiteren zusätzlichen Gegenstand dieser Erfindung dar.
Ein weiterer zusätzlicher Gegenstand dieser Erfindung besteht in einem ganz oder teilweise beschichteten Produkt, das mit einem Film auf Chitosan-Basis beschichtet ist, wie z.B. einem Implantat für eine dentale oder traumatologische Verwendung.
Ein weiterer zusätzlicher Gegenstand dieser Erfindung besteht in den Anwendungen dieser Filme auf Chitosan-Basis, wie z.B. in der Verwendung dieses Films auf Chitosan-Basis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit als einem Vehikel für den Transport und die Freisetzung von Substanzen mit biologischer Aktivität, oder in ihrer Verwendung bei der Ausarbeitung eines Films auf Basis von biologisch aktiviertem Chitosan mit einer erhöhten Fähigkeit zur Zellhaftung. Dieser Film auf Basis von biologisch aktiviertem Chitosan kann wiederum in vielfachen Anwendungen verwendet werden, wie z.B. bei der Induktion von biologischer Aktivität in einem Empfängerorganismus, bei der Verstärkung der Osteointegration von Implantaten für eine dentale oder traumatologische Verwendung und/oder bei der Regeneration von Geweben, beispielsweise Knochengewebe, neben anderen Anwendungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine Fotografie, die durch inverse optische Mikroskopie (100-fach) einer Zellkultur C2C12 erhalten wurde, die in Näpfe überimpft wurde, welche Chitosan-Filme enthielten, die mit NaOH stabilisiert und nicht der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit entsprechend der Erfindung (Vergleichsbeispiel) unterzogen wurden, wobei das rundliche Aussehen der Zellen beobachtet werden kann, welches darauf hinweist, dass sie sich in Suspension befinden.
2 zeigt eine Fotografie, die durch inverse optische Mikroskopie (100-fach) einer Zellkultur C2C12 erhalten wurde, die in Näpfe überimpft wurde, welche Chitosan-Filme enthielten, die mit NaOH stabilisiert und nicht der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit entsprechend der Erfindung (Vergleichsbeispiel) unterzogen wurden, in einem späteren Stadium als jenes in 1 gezeigte, nämlich nach dem Wechsel des Kulturmediums mit dem als Folge auftretenden Dahinkriechen (subsequent dragging) der Zellen, die nicht auf dem Film haften, bei denen man Gruppierungen von Zellen in Form von Trauben sehen kann, welche auf ein atypisches Wachstumsmuster hinweisen.
3 ist eine Fotografie, die durch inverse optische Mikroskopie (100-fach) einer Zellkultur C2C12 erhalten wurde, die in Näpfe überimpft wurde, welche Chitosan-Filme enthielten, die mit Glutaraldeyd und NaOH stabilisiert und nicht der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit entsprechend der Erfindung (Vergleichsbeispiel) unterzogen wurden, wobei man eine veränderte Morphologie dieser Zellen aufgrund ihrer Haftung auf dem Film sehen kann, welche auf ein anormales Wachstumsmuster hinweisen, sowie auf eine Veränderung ihrer Zellarchitektur.
4 ist eine Fotografie, die durch inverse optische Mikroskopie (100-fach) einer Zellkultur C2C12 erhalten wurde, die in Näpfe überimpft wurde, welche Chitosan-Filme enthielten, die mit NaOH stabilisiert und der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit entsprechend der Erfindung (Beispiel 1) unterzogen wurden, bei denen man sehen kann, dass die gesamte Oberfläche des Films vollständig mit Zellen in Form einer Monoschicht bis zum Erreichen der Konfluenz bedeckt ist.
5 ist eine Fotografie, die durch inverse optische Mikroskopie (100-fach) einer Zellkultur C2C12 erhalten wurde, die in Näpfe überimpft wurde, welche Chitosan-Filme enthielten, die mit NaOH stabilisiert und der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit entsprechend der Erfindung (Beispiel 1) unterzogen wurden, in einem früheren Stadium im Vergleich zu dem in 4 gezeigtem, bei dem man Teile des Films sehen kann, die noch nicht mit Zellen beschichtet sind.
6 ist eine Fotografie, die durch inverse optische Mikroskopie (100-fach) einer Zellkultur ROS 17/2.8 erhalten wurde, die in Näpfe überimpft wurde, welche Chitosan-Filme enthielten, die mit NaOH stabilisiert und der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit entsprechend der Erfindung (Beispiel 1) unterzogen wurden, wobei man sehen kann, dass die gesamte Oberfläche des Films vollständig mit Zellen in Form einer Monoschicht bis zur erreichten Konfluenz bedeckt ist.
7 ist eine Fotografie (100-fach), die durch Scanning-Elektronenmikroskopie (SEM) eines Fragments einer Titanschraube erhalten wurde, die bei den Untersuchungen der Implantate in Versuchstieren verwendet wurde, und die zuvor mit einem Chitosan-Film beschichtet wurde, wobei man die Linien der mechanischen Bearbeitung der Schraube sehen kann.
8 ist eine Fotografie (100-fach), die durch Scanning-Elektronenmikroskopie (SEM) eines Fragments einer Titanschraube erhalten wurde, die bei den Untersuchungen der Implantate in Versuchstieren verwendet wurde, die mit einem Chitosan-Film beschichtet wurde, der mit NaOH stabilisiert und einer Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurde, welche durch diese Erfindung bereitgestellt wird.
9 ist ein Balkendiagramm, welches den Gesamtproteingehalt der Zellkultur veranschaulicht, der durch das Bradford-Verfahren bestimmt wurde, mit Bezug auf die Kulturzeit (Tage), wobei der Absorptionswert in jedem Fall auf den Proteingehalt der Zellkultur und indirekt auf die Menge der Zellen hinweist, die auf dem Film haften; die unter Verwendung einer herkömmlichen Napfplatte (Kunststoff) als Referenz erhaltenen Werte wurden mit den Werten verglichen, die unter Verwendung von Chitosan-Filmen erhalten wurden, welche mit verschiedenen Behandlungen zur Stabilisierung stabilisiert und nicht einer Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden, welche durch diese Erfindung bereitgestellt wird. Behandlung 1: Stabilisierung mit Phosphatpuffer; Behandlung 2: Stabilisierung mit NaOH; Behandlung 3: Stabilisierung mit Glutaraldehyd und NaOH; und Behandlung 4: Stabilisierung mit Glutaraldehyd.
10 ist ein Balkendiagramm, welches den Gesamtproteingehalt der Zellkultur veranschaulicht, der durch das Bradford-Verfahren bestimmt wurde, mit Bezug auf die Kulturzeit (Tage), wobei der Absorptionswert in jedem Fall auf den Proteingehalt der Zellkultur und indirekt auf die Menge der Zellen hinweist, die auf dem Film haften; die unter Verwendung einer herkömmlichen Napfplatte (Kunststoff) als Referenz erhaltenen Werte wurden mit den Werten verglichen, die unter Verwendung von Chitosan-Filmen erhalten wurden, welche mit unterschiedlichen Behandlungen zur Stabilisierung stabilisiert und nachfolgend der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden, die durch diese Erfindung bereitgestellt wird. Behandlung 1: Stabilisierung mit Phosphatpuffer; Behandlung 2: Stabilisierung mit NaOH; Behandlung 3: Stabilisierung mit Glutaraldehyd und NaOH; und Behandlung 4: Stabilisierung mit Glutaraldehyd.
11 ist ein Balkendiagramm, welches den Anteil an rhBMP-2 veranschaulicht, das durch Chitosan-Filme absorbiert wird, welche mit NaOH stabilisiert und der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden, welche durch diese Erfindung bereitgestellt wird, im Vergleich zur Menge des zugegebenen Proteins.
12 ist ein Balkendiagramm, welches den Anteil an rhBMP-2 veranschaulicht, das durch Chitosan-Filme absorbiert wird, die mit Glutaraldehyd stabilisiert und der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden, welche durch diese Erfindung bereitgestellt wird, im Vergleich zur Menge des zugegebenen Proteins.
13 ist ein Balkendiagramm, welches die gesamte Aktivität der alkalischen Phosphatase/Proteins in den Näpfen an unterschiedlichen Tagen veranschaulicht; die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass rhBMP-2, das an Chitosan-Filmen gebunden ist, welche durch unterschiedliche Behandlungen stabilisiert und der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden, welche durch diese Erfindung bereitgestellt wird, aktiv bleibt; die erhaltenen Werte werden mit jenen verglichen, die unter Verwendung einer herkömmlichen Napfplatte (Kunststoff) als Referenz erhalten wurden.
14 ist ein Balkendiagramm, welches das Drehmoment oder das Kraftmoment zeigt, das nötig ist, um das zuvor in den flachen Teil des Schienbeins von Kaninchen implantierte Implantat zu lösen, das bei verschiedenen Zeiten verwendet wurde; die Ergebnisse, die unter Verwendung von Titanschrauben erhalten wurden, die mit einem Chitosan-Film beschichtet waren, der durch diese Erfindung bereitgestellt wird, und der mit verschiedenen Behandlungen stabilisiert wurde (NaOH: Behandlung 2; Glutaraldehyd und NaOH: Behandlung 3; und Glutaraldehyd: Behandlung 4), und der der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähig keit unterzogen wurde, die durch diese Erfindung bereitgestellt wird, und der mit rhBMP-2 biologisch aktiviert war, wurden mit den Ergebnissen verglichen, die mit den Kontrollen (nicht beschichtete Titanschrauben) erhalten wurden. Darüber hinaus wurden für Vergleichszwecke die mit handelsüblichen Schrauben Osseotite^® und TiUnite^® (Nobel Pharma) erhaltenen Ergebnisse aufgenommen (die Daten stammen von Gottlob et al., Applied Osteointegration Research, 2000, 1: 25-27).
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft, allgemein, die Herstellung von Filmen auf Chitosan-Basis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, und die biologisch aktiviert werden kann, sowie auf die resultierenden Filme und ihre Anwendungen.
Im Allgemeinen umfasst das Herstellungsverfahren für Filme auf Chitosan-Basis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, die durch diese Erfindung bereitgestellt werden, im Allgemeinen die allgemeinen Schritte der Bildung des Films auf Chitosan-Basis, seine Stabilisierung und Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit des stabilisierten Films. Andererseits kann die biologische Aktivierung des Films auf Chitosan-Basis durchgeführt werden, sobald sich der Film gebildet hat, oder alternativ, durch Einbau der Substanz mit biologischer Aktivität auf einer beliebigen Stufe in dem Herstellungsverfahren für den Film, beispielsweise während der Auflösung der Chitosan-Lösung oder während der Stabilisierung des Films, in Abhängigkeit von der Stabilität und der Natur der Substanzen mit biologischer Aktivität, die verwendet werden sollen, sowie während des Verfahrens, dem der Film in anderen Stufen unterzogen wurde.
Insbesondere liefert die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines Films auf Chitosan-Basis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, nachfolgend als das Verfahren der Erfindung bezeichnet, welches umfasst:

a) Auflösen von Chitosan, gegebenenfalls zusammen mit einem biologisch abbaubaren Polymer, in einem Solubilisierungsmedium, das eine wässrige Lösung von einer Säure umfasst;
b) Ausbringen der aus Stufe a) resultierenden Lösung auf eine Oberfläche;
c) Trocknen der auf die Oberfläche aufgebrachten Lösung, um einen Film auf Chitosan-Basis zu erhalten;
d) in Kontaktbringen des Films auf Chitosan-Basis mit einem Stabilisierungsmittel, das aus i) einer wässrigen Lösung einer Base, (ii) einem pH-Puffer gleich oder größer 5, (iii) einem Verknüpfungsmittel und (iv) Mischungen aus denselben ausgewählt ist;
e) Waschen des stabilisierten Films auf Chitosan-Basis, der in Stufe d) erhalten wurde; und
f) Trocknen des stabilisierten Films auf Chitosan-Basis bei einer Temperatur, die zwischen 15°C und 80°C liegt, in der Gegenwart eines Luftstroms.

Der Film auf Chitosan-Basis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren, beinhaltet vollständig oder teilweise Chitosan. Chitosan ist ein natürliches Polymer, das durch teilweise Deacetylierung von Chitin erhalten wird. Chitin kann aus vielen verschiedenen Quellen erhalten werden, beispielsweise aus Schalentieren, Pilzen, etc. Der Ursprung des Chitins, das für die Gewinnung des Chitosans verwendet wird, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, ist nicht von Bedeutung. In ähnlicher Weise ist es möglich, Modifikationen des Chitosans auszuführen, um verschiedene funktionelle Gruppen einzuführen, welche z.B. den biologischen Abbau des Chitosans in vivo begünstigen, die Knochenregeneration anregen, etc. Um diesen Umstand zu erläutern, können diese funktionellen Gruppen Phosphon-Gruppen, Carboxymethyl-Gruppen, Methylpyrrolidon-Gruppen, etc. umfassen. Im Allgemeinen kann eine beliebige Modifikation des Chitosans durchgeführt werden, vorausgesetzt, dass das Endprodukt seine Film-bildende Eigenschaft behält. In einer besonderen Ausführungsform umfasst das in der vorliegenden Erfindung verwendete Chitosan ein Chitosan, das mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen derivatisiert wurde, die unter Phosphan-Gruppen, Carboxymethyl-Gruppen, Methylpyrrolidon-Gruppen und deren Mischungen ausgewählt wurden.
Chitosan, das ein Polymer ist, welches durch teilweise Deacetylierung von Chitin erhalten wird, zeigt einen sehr breiten Bereich von Molekulargewichten und von Graden der Deacetylierung. Diese Parameter hängen von den spezifischen Bedingungen ab, die in der basischen Hydrolyse verwendet werden, welche mit dem Ausgangsmaterial (Chitin) durchgeführt wird, sowie von dessen Ursprung. Somit ist es möglich, Chitosane zu erhalten, deren durchschnittliches Molekulargewicht beispielsweise zwischen 150,000 und 2,000,000 und sogar mehr liegen, mit Graden der Deacetylierung, die zwischen 65 % und 95 % oder sogar mehr liegen. Jedes dieser Chitosane kann für die Umsetzung der vorliegenden Erfindung in die Praxis verwendet werden, obwohl jene Chitosane mit mittleren und geringen durchschnittlichen Molekulargewichten bevorzugt werden, beispielsweise zwischen 200,000 und 500,000, und mit mittleren und hohen Graden der Deacetylierung, beispielsweise zwischen 65 % und 95 %.
Das biologisch abbaubare Polymer, für den Fall, dass es verwendet wird, kann ein beliebiges natürliches oder synthetisches Polymer sein, vorausgesetzt, dass es in Wasser oder in einem wässrigen Säuremedium löslich und biologisch abbaubar ist. Erläuternde Beispiele von biologisch abbaubaren Polymeren, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Polyglycolsäure, Alginate, Carrageen, Collagen, etc., und deren Mischungen.
Das Solubilisierungsmedium für Chitosan, gegebenenfalls zusammen mit dem biologisch abbaubaren Polymer, ist ein Medium, welches eine wässrige Lösung einer organischen oder anorganischen Säure umfasst, mit einem pH gleich oder kleiner als 3,5.
Im Allgemeinen kann eine beliebige Säure verwendet werden, in der Chitosan, und falls anwendbar, das biologisch abbaubare Polymer, löslich sind. Um diesen Um stand zu erläutern, kann diese Säure Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Äpfelsäure, etc. sein. In einer besonderen Ausführungsform ist das Solubilisierungsmedium eine wässrige Lösung von Essigsäure.
Die Konzentration des Chitosans in der sich ergebenden Lösung kann innerhalb eines breiten Bereiches variieren, und sie kann Konzentrationen von bis zu 5 % Chitosan erreichen (mit anderen Worten, höher als jene, die normalerweise bei der Bildung von Chitosan-Filmen verwendet werden).
Die Chitosan-Lösung, gegebenenfalls zusammen mit dem biologisch abbaubaren Polymer, nachfolgend die Lösung auf Chitosan-Basis genannt, sollte eine Viskosität besitzen, die für die Anwendung geeignet ist, für die sie beabsichtigt ist. Diese Viskosität kann innerhalb eines breiten Bereiches variieren, in Abhängigkeit davon, ob diese Lösung auf Chitosan-Basis auf eine flache Oberfläche oder auf eine komplexe Oberfläche aufgebracht werden soll, oder ob sie als ein Medium zur Beschichtung eines Artikels durch Eintauchen verwendet werden soll, beispielsweise eine Schraube von der Art, die in dentalen Implantaten verwendet wird.
Die Viskosität der Lösung auf Chitosan-Basis wird durch einige Faktoren bestimmt, die der Lösung selbst innewohnen. Einerseits wird sie durch die Konzentration des Chitosans, andererseits durch das durchschnittliche Molekulargewicht des Chitosans, das zur Herstellung dieser Lösung verwendet wird, bestimmt und schließlich durch das verwendete Solubilisierungsmedium.
Im Allgemeinen ist die Viskosität nicht ein bestimmender Faktor in der praktischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ausgenommen den Fall einer Bildung von Filmen auf komplexen Oberflächen, bei der dieser Parameter ausreichend hoch sein muss, um die Bildung eines homogenen Films darauf während des Verfahrens der Verdampfung des Lösungsmediums zu ermöglichen.
In einigen praktischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurden 1 %ige Lösungen von Chitosan in 50 mM Essigsäure routinemäßig verwendet, welche intrinsische Viskositäten besaßen, die in Abhängigkeit von dem Molekulargewicht des verwendeten Chitosans von 17 g.dL^–1 bis 4 g.dL^–1 variierten.
Sobald die Lösung auf Chitosan-Basis mit der geeigneten Viskosität hergestellt wurde, wird diese Lösung gleichförmig mittels herkömmlicher Verfahren aufgetragen oder verteilt, z.B. durch Sprühen, Eintauchen, Auftragen mit einer Bürste, etc. auf einer Oberfläche, z.B. einer flachen oder komplexen Oberfläche, oder auf einer Oberfläche, die mit einem Film auf Chitosan-Basis beschichtet werden soll, der durch diese Erfindung bereitgestellt wird.
Sobald die Lösung auf Chitoan-Basis auf dieser Oberfläche aufgetragen wurde, wird eine Trocknung durchgeführt, um das Lösungsmittel zu entfernen, z.B. durch einfache Verdampfung, und ein Film auf Chitosan-Basis wird auf dieser Oberfläche erhalten.
Die Trocknung kann durch jedes herkömmliche Verfahren durchgeführt werden. Im Allgemeinen kann sie bei einer Temperatur durchgeführt werden, die zwischen der Raumtemperatur und einer Temperatur liegt, bei der eine thermische Zersetzung des Chitosans nicht auftritt, beispielsweise bei einer Temperatur, die zwischen 15°C und 80°C liegt, gegebenenfalls in Gegenwart eines Luftstroms, für einen geeigneten Zeitraum, solange man keine Gewichtsveränderung beobachtet. Im Allgemeinen vermindert eine zunehmende Temperatur die Dauer dieses Schrittes. Wenn die Filme auf Chitosan-Basis für Anwendungen vorgesehen sind, die einen Bezug auf das Zellwachstum und die Vermehrung besitzen, ist es nützlich, in einem sterilen Raum oder in einer Kammer mit einem Luftstrom von laminarem Fluss zu arbeiten, um einen nicht verunreinigten Film zu erhalten. In einer besonderen Ausführungsform wird die Trocknung des Films auf Chitosan-Basis in einem Luftstrom bei einer Temperatur durchgeführt, die zwischen 20°C und 40°C liegt. Bei den angegebenen Bedingungen kann der Trocknungsschritt zwischen 12 und 24 Stunden dauern.
Der zuvor erhaltene Film auf Chitosan-Basis kann aufgrund seines stark sauren Charakters nicht unmittelbar verwendet werden. Wie bereits früher darauf hingewiesen wurde, zersetzt sich dieser Film bei Kontakt mit Wasser oder mit physiologisch gepufferten Lösungen, wie z.B. PBS, rasch. Aufgrund dieses Umstandes ist es notwendig, den Film vor der Anwendung zu stabilisieren.
Um den zuvor gebildeten Film auf Chitosan-Basis zu stabilisieren, wird der Film mit einem Stabilisierungsmittel in Kontakt gebracht, welches sein kann (a) ein Neutralisierungsmittel, wie z.B. eine wässrige Lösung einer Base oder eines pH-Puffers mit einem pH-Wert von gleich oder größer als 5; (b) ein Vernetzungs-bildendes Mittel; oder (c) deren Mischungen.
Das Verfahren, welches normalerweise für die Stabilisierung der Chitosan-Filme verwendet wird, besteht aus dem Eintauchen des Films (oder des Gegenstands oder der Oberfläche, die damit beschichtet ist) in eine stark basische Lösung, im Allgemeinen 1 M NaOH für mindestens 1 Stunde, bis zu einer Zeit von höchstens 24 Stunden. Jedoch kann dieses Verfahren, wie es bereits erwähnt wurde, die Stabilität des Filmbeschichteten Trägers in negativer Weise beeinflussen. Die Wirkung der Behandlung führt ebenfalls, und dies ist genau ihr Zweck, zu einer völligen Neutralisierung der auf den Chitosan-Ionen vorhandenen Ladungen, und gibt somit zu einer starken Verminderung in der Wechselwirkung zwischen dem Film und dem Film-beschichteten Träger Anlass.
Obwohl es möglich ist, das zuvor erwähnte Stabilisierungsprotokoll zu verwenden, ist es in der vorliegenden Erfindung vorzuziehen, weniger drastische Bedingungen bei der basischen Behandlung zu verwenden, und somit sowohl die Konzentration der verwendeten Base (NaOH) als auch die Zeit der Exposition dieser gegenüber zu vermindern. In einer besonderen Ausführungsform wird eine Eintauchzeit in eine wässrige Lösung von 0,5 M NaOH verwendet, die zwischen 30 und 40 Minuten liegt.
In alternativer Weise ist es möglich, andere mildere Medien zu verwenden, wie z.B. solche, die durch Pufferlösungen mit einem pH gleich oder größer als 5 bereitgestellt werden, z.B. Carbonat- oder Phosphat-Pufferlösungen, um die Ladung des Chitosan-Films zu neutralisieren.
Ein anderer Weg zur Stabilisierung des gebildeten Films auf Chitosan-Basis umfasst die Vernetzung zwischen den im Film vorhandenen Ketten des Chitosans mittels der Verwendung von Vernetzungs-bildenden Mitteln, wie z.B. bifunktionelle Reagenzien. In einer besonderen Ausführungsform ist das verwendete Vernetzungsmittel Glutaraldehyd, obgleich dies das gewöhnlicherweise verwendete bifunktionale Reagenz ist. Glutaraldehyd kann mit einem stark alkalischen Medium verwendet werden, wie z.B. jenem, das durch NaOH bereitgestellt wird, oder in anderer Weise mit einem milderen Medium, wie z.B. jenem, das durch den Carbonat- oder Phosphat-Puffer bereitgestellt wird. In diesen Fällen wird die Stabilisierung des Films mit der Vernetzung der Chitosan-Ketten zur gleichen Zeit bewirkt wie die Neutralisierung seiner Ladungen.
Für die Stabilisierung der zuvor erhaltenen Filme auf Chitosan-Basis ist es in Übereinstimmung mit dem Vorstehenden möglich, in einer besonderen Ausführungsform einen Phosphat-Puffer von einer Molarität zu verwenden, die zwischen 0,1 und 1 M liegt, vorzugsweise bei 0,25 M, bei einem pH-Wert nahe der Neutralität. Glutaraldehyd kann als ein Vernetzungs-bildendes Mittel verwendet werden, bei Konzentrationen von bis zu 0,1 %, bevorzugt weniger als 0,05 % und stärker bevorzugt weniger als 0,025 % oder weniger. Kombinationen von beiden stabilisierenden Wirkungen wurden ebenfalls verwendet, z.B. eine gleichzeitige Behandlung mit NaOH und Glutaraldehyd in Konzentration von 0,5 M bzw. 0,025 %. In einer anderen besonderen Ausführungsform wurde ein Stabilisierungsmittel verwendet, das einen Puffer umfasst, wie z.B. einen Phosphat-Puffer oder Carbonat-Puffer, und Glutaraldehyd.
Die Expositionszeit gegenüber verschiedenen Mitteln ist verschieden, wobei die Exposition zwischen 30 und 45 Minuten bevorzugt wird, obwohl längere Zeiten möglich sind.
Sobald der Film auf Chitosan-Basis stabilisiert wurde, wird das für diesen Zweck verwendete Stabilisierungsmittel entfernt, und es wird einige male gewaschen, um die Rückstände des verwendeten Stabilisierungsmittels zu beseitigen, mit einem ausreichenden Volumen an PBS oder einem anderen Medium, das mit der biologischen Verwendung, die für diese Filme vorgeschlagen wird, verträglich ist.
Der auf diese Weise stabilisierte Film ist noch nicht imstande, eine gleichförmige und homogene Zellhaftung über die gesamte Oberfläche zu erbringen. Falls nach erfolgtem Waschen das Überimpfen der festgesetzten, haftenden Zelllinien durchgeführt wird, weisen die Untersuchungen der Menge der vorhandenen DNA darauf hin, dass lediglich annähernd ein Drittel der überimpften Zellen an dem Film haften, entsprechend dem zuvor beschriebenen Verfahren (1), wie es im Vergleichsbeispiel gezeigt wurde. Diese Haftung ist nicht homogen, sondern sie tritt stattdessen an bestimmten Stellen des Films auf, wobei ein großer Teil seiner Oberfläche ohne haftende Zellen vorliegt (2). Darüber hinaus neigt die in diesen haftenden Zellen erzeugte Zellvermehrung nicht dazu, eine Ausdehnung über die gesamte Oberfläche des Films zu erbringen, sondern sie ist vielmehr um den anfänglichen Punkt der Haftung lokalisiert (2), verändert die zelluläre Cytoarchitektur, und die typische Morphologie der Fibroblasten dieser Zelllinien ändert sich (3). Diese Tatsache macht es unmöglich, diese Filme auf Chitosan-Basis in der Praxis für eine gesteuerte Regeneration des Gewebes zu verwenden.
Die vorstehend erwähnte Zellhaftung ist sehr variabel, in Abhängigkeit vom Ursprung des Chitosans, des für die Herstellung des Chitosans verwendeten Verfahrens, des durchschnittlichen Molekulargewichts des verwendeten Chitosans, der Zeit und der Bedingungen der Lagerung des Chitosan-Films vor der Stabilisierung, etc. Es gibt keine klare wechselseitige Beziehung zwischen den verschiedenen erwähnten Variablen und der homogenen Zellhaftung auf dem Film, so dass stark variiende Ergebnisse erhalten werden, wie eingangs gesagt.
Die Tatsache, dass eine verlängerte Lagerzeit (hin und wieder von Monaten) des Films auf Chitosan-Basis die Zellhaftung in günstiger Weise zu beeinflussen scheint, mit Bezug auf denselben gebildeten und unmittelbar verwendeten Film (wobei der Einfluss des Molekulargewichts des verwendeten Chitosans ausgeschlossen wird, die Gewichte der Schichten sind ebenfalls die gleichen), scheint darauf hinzuweisen, dass eine geringe strukturelle Veränderung hervorgerufen wird, welche eine ausgeklügelte Wirkung auf die Haftung besitzt.
Nichtsdestotrotz weist die zufällige Natur dieser Erscheinung auf die Notwendigkeit hin, ein Verfahren zu entwickeln, welches das Verhalten des Chitosan-Films in Bezug auf die Fähigkeit zur Zellhaftung und Vermehrung vereinheitlicht, so dass eine „Aktivierung" des Chitosans in diesem Sinne entsteht. Mit diesem Ziel werden die folgenden Schritte des Verfahrens der Erfindung ausgeführt, welche aus einer Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit des stabilisierten Films bestehen.
Während der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass die Ausführungsform, bei der mindestens eine zweite Trocknung des bereits stabilisierten Films auf Chitosan-Basis und ein Waschen bei den selben Bedingungen wie bei jenen stattfindet, die bei dessen anfänglicher Bildung verwendet wurden, das Verhalten des Chitosan-Films in Bezug auf die Zellhaftung vereinheitlicht und, Zelldichten nach dem Überimpfen ergibt, die zu jenen ähnlich sind, die durch dieselben Zellen in Flaschen von im Handel erhältlichen Kulturen erbracht werden, wobei das Niveau der enzymatischen Aktivität (die auf die Lebensfähigkeit der Kultur hinweisen) und die Menge der DNA mit solchen äquivalent ist, die später von diesen erhalten wurden. Die Zellvermehrung ist homogen, und die typische mikroskopische Zellmorphologie dieser überimpften Linien bleibt erhalten.
Die zweite Trocknung wird durch ein beliebiges herkömmliches Verfahren bei einer Temperatur ausgeführt, die zwischen 15°C und 80°C liegt, in Gegenwart eines Luftstroms während eines geeigneten Zeitraums. Die Trocknung wird durchgeführt, bis es keine Gewichtsveränderung gibt. In einer besonderen Ausführungsform wird die Trocknung des Films auf Chitosan-Basis in einem Luftstrom bei einer Temperatur durchgeführt, die zwischen 20°C und 40°C liegt. Bei den angegebenen Bedingungen wird ein konstantes Gewicht üblicherweise in 12-24 Stunden erreicht.
Der Film auf Chitosan-Basis, welcher durch das Verfahren der Erfindung erhalten werden kann, besitzt eine erhöhte Zellhaftfähigkeit. Die Fähigkeit eines Films zur Zellhaftung kann durch verschiedene Untersuchungen bestimmt werden. Um diesen Umstand zu erläutern, kann diese Fähigkeit zur Zellhaftung durch Verwendung einer beliebigen haftenden Zelllinie bestimmt werden, z.B. C2C12-Zellen, mittels des Untersuchungsverfahrens, das als „Ethidium Homodimer Versuch" bezeichnet wird (siehe Beispiel 1, bei dem das Protokoll für dieses Verfahren beschrieben ist), welches, kurz gesagt, die Kultivierung von C2C12-Zellen in Näpfen, die mit einem Film auf Chitosan-Basis beschichtet sind, oder die unbeschichtet sind (Plastik), die Lyse der Zellen, die Zugabe des Ethidium-Homodimers, die Inkubation und das Ablesen der bei 645 nm emittierten Fluoreszenzintensität nach Anregung bei 530 nm umfasst. Im Sinne dieser Beschreibung bezieht sich der Ausdruck „Film auf Chitosan-Basis mit erhöhter Zellhaftfähigkeit" auf die Tatsache, dass dieser Film auf Chitosan-Basis eine Zellhaftfähigkeit besitzt, die größer ist als jene, welche derselbe Film unter normalen Bedingungen besäße, d.h., ohne dass er zuvor irgendeiner besonderen Behandlung unterzogen worden wäre, um ihre Fähigkeit zur Zellhaftung zu aktivieren. Um diesen Umstand zu erläutern, liefert die Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit dieser Erfindung einen Film auf Chitosan-Basis mit einer Zellhaftfähigkeit, die durch diese Behandlung aktiviert wurde und die durch den Ethidium Homodimer-Versuch bestimmt wurde, welche gleich der oder größer als die Zunahme von mindestens 25 %, vorzugsweise von mindestens 50 % im Wert der Fähigkeit zur Zellhaftung ist, die durch diesen Ethidium Homodimer-Versuch an einem Chitosan-Film bestimmt wurde, der nicht dieser Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurde.
Der Film auf Chitosan-Basis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, welche durch das Verfahren der Erfindung erhalten werden kann, stellt einen weiteren Gegenstand dieser Erfindung dar.
Der Film auf Chitosan-Basis mit einer Zellhaftfähigkeit kann verwendet werden, um Zellen anhaften und wachsen zu lassen. Um dies auszuführen, kann es nützlich sein, Substanzen mit einer Fähigkeit zur Anregung der Zellvermehrung auf diesem Film zu immobilisieren.
Darüber hinaus kann der Film auf Chitosan-Basis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit als ein Vehikel für Substanzen mit biologischer Aktivität verwendet werden, so dass er die Substanzen mit biologischer Aktivität fixieren oder immobilisieren kann, und sie gegebenenfalls an den betreffenden Stellen freisetzen kann.
Daher liefert die Erfindung einen biologisch aktivierten Chitosan-Film mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, welcher diesen Chitosan-Film, der entsprechend dem Verfahren der Erfindung erhalten werden kann, und mindestens eine Substanz mit biologischen Aktivität umfasst.
Als eine Substanz mit biologischen Aktivität kann jede Substanz von natürlichem, synthetischem oder rekombinantem Ursprung verwendet werden, die fähig ist, eine biologische Wirkung in einem Empfängerorganismus auszuüben, wie z.B. dem menschlichen oder tierischen Körper. Um diesen Umstand zu erläutern, kann diese Substanz mit einer biologischen Aktivität ein Antibiotikum, ein Hormon, ein Protein, etc. sein. In einer besonderen Ausführungsform ist diese Substanz mit einer biologischen Aktivität ein Protein, welches zu den Knochen-morphogenetischen Proteinen (bone morphogenetic proteins, BMP) gehört, wie z.B. einem humanen, natürlichen oder rekombinanten BMP, oder einem Dimer oder Heterodimer derselben, z.B. einem rekombinanten humanen BMP (rhBMP). In einer besonderen Ausführungsform wird dieses rhBMP ausgewählt aus rhBMP-2, rhBMP-4, rhBMP-7, Dimeren oder Heterodimeren derselben, und Mischungen derselben.
Der biologisch aktivierte Chitosan-Film mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit kann durch ein Verfahren erhalten werden, welches das Kontaktieren eines Chitosan-Films mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, der entsprechend dem Verfahren der Erfindung erhalten werden kann, mit dieser Substanz mit biologischer Aktivität umfasst.
In alternativer Weise kann der biologisch aktivierte Chitosan-Film mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit mittels eines Verfahrens erhalten werden, welches das Kontaktieren dieser Substanz mit einer biologischen Aktivität entweder mit einer Chitosan-Lösung, gegebenenfalls zusammen mit einem biologisch abbaubaren Polymer, in einem Solubilisierungsmedium, das eine wässrige Lösung einer Säure umfasst, in einem Schritt a) des Verfahrens der Erfindung, oder auch in anderer Weise das Kontaktieren des Films auf Chitosan-Basis mit dem Stabilisierungsmittel in Schritt d) des Verfahrens der Erfindung umfasst.
Die Behandlung zur biologischen Aktivierung des stabilisierten, gewaschenen und getrockneten Films auf Chitosan-Basis hat das Ziel, diesen Film biologisch zu aktivieren, um die gewünschte biologische Aktivität im Empfängerorganismus zu induzieren. Diese Induktion wird durch Fixierung dieser Substanz mit biologischer Aktivität mit dem Film auf Chitosan-Basis erreicht. Die Fixierung oder Immobilisierung dieser Substanz mit biologischer Aktivität mit dem Film auf Chitosan-Basis kann entweder durch direkte Adsorption dieser Substanz auf dem Film erreicht werden, oder durch deren kovalente Immobilisierung auf dem Film, beispielsweise durch Wechselwirkung der in Proteinen vorhandenen reaktiven Gruppen mit Glutaraldeyd.
Beispiel 2 beschreibt die Induktion der Aktivität der alkalischen Phosphatase auf der Zelllinie C2C12, welche durch rhBMP-2 erbracht wurde, das auf Chitosan-Filmen adsorbiert oder kovalent immobilisiert wurde. Diese Induktion ist im Vergleich günstig mit jener, die in dieser Zelllinie erhalten wurde, welche auf handelsübliches Plastik überimpft und mit derselben Dosis von rhBMP-2 in Lösung behandelt wurde, wobei die Dosis im Kulturmedium während der gesamten Zeit des Versuchs vorhanden war. Wie man in Beispiel 2 sehen kann (siehe Tabelle V), scheint es eine synergistische Wirkung zwischen dem Chitosan und dem rhBMP-2 in Bezug auf seine biologische Wirkung zu geben.
Die Erfindung liefert ebenfalls einen Artikel oder ein Produkt, das mit einem Film auf Chitosan-Basis beschichtet ist, welches einen Träger und eine ganze oder teilweise Beschichtung dieses Trägers mit einem Chitosan-Film mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit umfasst, der gegebenenfalls biologisch aktiviert ist. In einer besonderen Ausführungsform ist dieser beschichtete Artikel oder das Produkt eine Prothese oder ein medizinisch-chirurgisches Implantat, z.B. ein Implantat für eine dentale oder traumatologische Verwendung, und dieser Film auf Chitosan-Basis ist ein biologisch aktivierter Film auf Chitosan-Basis, der mindestens ein BMP umfasst. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird dieser Träger ausgewählt unter Gazen und Matrizen von biologisch verträglichen und/oder biologisch abbaubaren Polymeren, die in der Gewebe-Technologie verwendet werden.
In einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung die Verwendung eines biologisch aktivierten Films auf Chitosan-Basis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, der durch diese Erfindung bereitgestellt wird, bei der Induktion einer biologischen Aktivität in einem Empfängerorganismus, bei der Verstärkung der Osteointegration von Implantaten, die in, der Dentalchirurgie oder in der traumatologischen Chirurgie ganz oder als Teil der Zone des Empfängerorganismus', bei der man eine Verbesserung wünscht, und/oder bei der Regeneration des Knochengewebes verwendet werden.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung eines biologisch aktivierten Chitosan-Films mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, welcher durch diese Erfindung bereitgestellt wird, bei der Ausarbeitung eines Implantats für eine dentale oder traumatologische Verwendung.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus Mittel zur Induktion einer biologischen Aktivität in einem Empfängerorganismus, wobei ein Träger mit einem biologisch aktivierten Film auf Chitosan-Basis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, welcher durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, in diesen Organismus implantiert werden soll, der dieser biologischen Aktivität bedarf.
Die Erfindung betrifft ferner Mittel zur Verbesserung der Osteointegration von Implantaten für eine dentale oder traumatologische Verwendung in einem Empfängerorganismus, wobei ein Implantat, das mit einem biologisch aktivierten Film aus Chitosan mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit beschichtet ist, und das durch diese Erfindung bereitgestellt wird, in diesen Empfängerorganismus implantiert werden soll, der einer Verbesserung der Osteointegration dieses Implantats bedarf, wobei diese Substanz mit einer biologischen Aktivität ein BMP ist.
Die Erfindung betrifft ferner Mittel für die Regeneration des Knochengewebes in einem Empfängerorganismus, wobei eine Matrix zur Knochenerzeugung, die mit einem biologisch aktivierten Film aus Chitosan mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit beschichtet ist, welcher durch die folgende Erfindung bereitgestellt wird, in einen Empfängerorganismus eingesetzt werden soll, welcher der Regeneration des Knochengewebes bedarf, wobei diese Substanz mit einer biologischen Aktivität ein BMP ist.
Als ein Ergebnis dieser Beschreibung, wie es hier in Einzelheiten beschrieben wurde, ist es möglich, zum ersten mal auf dem uns betreffenden Gebiet des Standes der Technik Filme auf Chitosan-Basis zu erhalten, die fähig sind, eine gute Zellhaftung und Vermehrung zu ermöglichen, und die darüber hinaus durch Einbau von Substanzen mit einer biologischen Aktivität aktiviert werden können. Diese Filme auf Chitosan-Basis stellen einen biologisch verträglichen und einen biologisch abbaubaren Film dar, welcher in perfekter Weise an die Form des Gegenstands oder des Implantats angepasst werden kann, das beschichtet werden soll, und an den Zellen aus dem Wirtsorganismus anhaften können.
In dem Fall von dreidimensionalen porösen Matrizen, die häufig in der Gewebe-Technologie verwendet werden, erlaubt sie die Bildung eines Verbundmaterials, das die mechanischen Eigenschaften des Trägers ausnutzt, und die es ermöglicht, dass eine geeignete Porosität für das Eindringen und das Wachstum des umgebenden Gewebes beibehalten werden kann, da das Chitosan die im Korpus der Matrix gebildeten Poren nicht blockiert, da es in Form eines Films vorliegt. Gleichzeitig ermöglicht seine Zellhaftfähigkeit zusammen mit der biologischen Aktivierung, die in dem gesamten Material sowohl auf der Außenfläche als auch auf der Innenfläche entsteht, dass die gewünschte biologische Wirkung gleichzeitig überall in dem Korpus der Matrix entstehen kann, und nicht aufgrund eines Eindringens nach innen. Das Aktivierungsmittel ist vom ersten Augenblick verfügbar, um seine Wirkung auf den gesamten Trägerkörper zu entfalten.
Diese besonderen Eigenschaften der neuen Filme auf Chitosan-Basis, die durch diese Erfindung bereitgestellt werden, machen sie besonders geeignet für die Verbesserung der Osteointegration von Implantaten und Prothesen, die gewöhnlich in der medizinisch-chirurgischen Praxis verwendet werden, mittels der Beschichtung dieser Materialien mit einem Film auf Chitosan-Basis und seiner Aktivierung mittels des Einbaus von Faktoren, welche das Knochenwachstum induzieren, wie z.B. BMPs von natürlichem oder rekombinantem Ursprung, in dimerer oder heterodimerer Form.
In ähnlicher Weise sind die Filme auf Chitosan-Basis der vorliegenden Erfindung ebenso besonders nützlich für die Wiederherstellung von Knochen- und Knochenknorpel-Wunden, welche auf der Beschichtung von Gazen oder Stücken von biologisch verträglichen und/oder biologisch abbaubaren Polymeren beruht, die gewöhnlich in der Gewebe-Technologie verwendet werden, mittels der ganzen oder teilweisen Beschichtung derselben mit einem Film auf Chitosan-Basis, der durch diese Erfindung bereitgestellt wird, und die durch Einbau von BMPs und/oder anderen Substanzen mit einer biologischen Aktivität aktiviert werden.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung und sollten nicht so angesehen werden, als begrenzten sie deren Umfang.
Vergleichsbeispiel: Wachstum von Zelllinien auf nicht-aktivierten Chitosan-Filmen für die Zellhaftung
Eine 1 % Chitosan-Lösung wird in 50 mM Essigsäure hergestellt. Die Lösung wird sterilisiert durch Filtration durch ein 0,22 μm Filter, nachdem sie einer Vorfiltration durch ein 0,45 μm Filter unterzogen wurde.
200 μl dieser Lösung werden in die Näpfe einer 48-Napfplatte gegeben, wobei man einige davon frei lässt, um sie als eine Kontrolle des im Handel erhältlichen Kunststoffs zu verwenden.
Die Platte wird in einem Luftstrom in einer Kammer mit einer laminaren Strömung während einer Nacht bei einer Temperatur von 30°C getrocknet. Sobald sie trocken ist, werden die Näpfe dreimal mit 400 μl von einigen der folgenden Stabilisierungsmittel für einen Zeitraum von 30 bis 45 Minuten behandelt: (i) 0,5 M NaOH; 0,25 M Phosphat; (ii) 0,025 % Glutaraldehyd; und (iii) einer Lösung von 0,5 M NaOH und 0,025 % Glutaraldehyd.
Nachdem der Behandlungszeitraum verstrichen ist, wird das Medium entfernt und die Platten werden viermal mit 400 μl PBS gewaschen, so dass das Medium 10 Minuten während der Waschschritte mit dem Film in Kontakt bleibt.
Schließlich wird die PBS entfernt, und 200 μl Zellkultur-Medium (DMEM mit hoher Glucosekonzentration, mit Penicillin/Streptomycin) werden zugegeben, und die Näpfe werden mit C2C12- oder ROS-Zellen mit einer Dichte von 10,000 Zellen/cm² beimpft. Das Medium wird schließlich mit weiteren 200 μl Kulturmedium ergänzt, und die Näpfe werden bei 37°C in einem CO₂-Ofen inkubiert. Am nächsten Tag wird das Medium entfernt und die einschlägigen Versuche werden mit den verschiedenen Näpfen durchgeführt.
Nachdem die entsprechenden Werte für die Nullkontrolle für jede Bedingung abgezogen wurden, werden die erhaltenen Ergebnisse in den Tabellen I und II für die Zelllinien C2C12 bzw. ROS dargestellt. Falls nicht anders angegeben, zeigen die Werte in Klammern in allen Fällen das Prozentverhältnis zwischen dem in jedem Fall erhaltenen Wert und dem entsprechenden Wert, der mit einer herkömmlichen Napfplatte (Kunststoff) erhalten wurde, welche als Referenz verwendet wurde.
Die Protokolle, denen zufolge die unterschiedlichen Versuche durchgeführt wurden, sind die folgenden:
Calcein AM:
Das Medium wird entfernt, und die Platten werden mit 200 μl PBS gewaschen. Die PBS wird entfernt, und 100 μl Calcein AM-Lösung werden pro Napf zugegeben (erhalten aus der Mischung von 10 μl Stammlösung von Calcein AM (4 mM) mit 10 ml PBS). Die Platte wird 1 Stunde bei Raumtemperatur in Dunkelheit inkubiert, und die Intensität der Fluoreszenz, welche der Anregung bei 490 nm folgt und bei 530 nm emittiert wird, wird abgelesen.
Ethidium-Homodimer:
Das Calcein AM wird entfernt, und die Zellen werden durch Zugabe von Methanol bei 70 % abgetötet. Nach dem Zelltod wird das Methanol entfernt, und 100 μl Ethidium-Homodimer-Lösung werden pro Napf zugegeben (erhalten aus der Zugabe von 20 μl Stammlösung des Ethidium-Homodimers (2 mM) zu 10 ml PBS). Nach der Inkubation für 30 Minuten wird die Intensität der Fluoreszenz abgelesen, welche der Anregung bei 530 nm folgt und bei 645 nm emittiert wird.
MTT:
40 μl (1/10 des in dem Napf vorhandenen Volumens) einer Lösung, die durch die Rekonstitution von 15 mg MTT in 3 ml PBS gebildet wurde, werden zu dem Kulturmedium gegeben. Die Mischung wird für 2 Stunden bei 37°C in einem CO₂-Ofen inkubiert. Ein gleiches Volumen der Solubilisierungslösung (im wesentlichen Triton X-100 in Isopropanol) wird zu jedem Napf nach diesen 2 Stunden zugegeben, und nach Auflösung der gebildeten Formazan-Kristalle durch wiederholtes Pipettieren wird die optische Dichte (OD) bei 570 nm und bei 690 nm abgelesen, entsprechend dem Protokoll, das durch den Lieferanten dieses Versuchs-Kits (Sigma Chemical Company) bereitgestellt wird.
Andererseits zeigte die Beobachtung durch inverse optische Mikroskopie (Linse: 10-fach, und Binocular: 10-fach, insgesamt 100-fach) der Kulturzellen von C2C12 und ROS, dass nur annähernd ein Drittel der eingesetzten Zellen an dem gebildeten Film haften, entsprechend dem beschriebenen Verfahren (1) und dass die Haftung nicht homogen ist, sondern dass sie an bestimmten Stellen des Films auftritt, wobei ein großer Teil der Oberfläche ohne anhaftende Zellen vorliegt. Darüber hinaus kann man auch sehen, dass die Zellvermehrung in diesen anhaftenden Zellen nicht dazu neigt, zu einer Ausdehnung über den gesamten Film zu führen, sondern vielmehr um den anfänglichen Punkt des Haltens herum lokalisiert ist (2), sich die Cytoarchitektur der Zellen verändert, und sich die typische Morphologie der Fibroblasten dieser Zelllinien verändert (3). Diese Tatsache macht die praktische Verwendung dieser Filme auf Chitosan-Basis für die Verwendung in der gesteuerten Regeneration des Gewebes unmöglich. Daher ist der Chitosan-Film, der entsprechend dem in diesem Beispiel beschriebenen Protokoll erhalten und stabilisiert wurde, nicht imstande, eine gleichförmige und homogene Zellhaftung über die gesamte Oberfläche zu zeigen.
Beispiel 1: Wachstum der Zelllinien auf aktivierten Chitosan-Filmen für die Zellhaftung
Man folgt dem in dem Vergleichsbeispiel beschriebenen Verfahren.
Nach dem Waschen mit PBS wird das Medium entfernt, und eine zweite Trocknung des Films wird bei 30-35°C in einem Luftstrom durchgeführt.
Sobald er trocken ist, werden 200 μl Kulturmedium (DMEM mit hoher Glucosekonzentration) zugegeben, die Zellen werden mit derselben Dichte wie im Vergleichsbeispiel überimpft, und die Näpfe werden mit zusätzlichen 200 μl Medium ergänzt. Die Platten werden schließlich in einem CO₂-Ofen bei 37°C inkubiert. Am folgenden Tag werden dieselben Analysen mit den Platten durchgeführt wie jene, die im Vergleichsbeispiel beschrieben sind, wobei man den bereits beschriebenen Protokollen folgt. Die erhaltenen Ergebnisse für die Zelllinien C2C12 bzw. ROS sind in den Tabellen III bzw. IV dargestellt.
Beim Vergleich der in den Tabellen III und IV gezeigten Werte mit jenen, in den Tabellen I und II gezeigten kann man sehen, dass das Wachstum der untersuchten Zelllinien auf den Chitosan-Filmen, die einer Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfä higkeit unterzogen wurden (Beispiel 1), viel größer ist, als jenes, das auf den Chitosan-Filmen erhalten wurde, welche nicht dieser Aktiverungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden (Vergleichsbeispiel).
In ähnlicher Weise zeigt die Beobachtung durch inverse optische Mikroskopie (100-fach) der Zellkulturen von C2C12 und ROS auf Chitosan-Filmen, die verschiedenen Behandlungen zur Stabilisierung und der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden, dass die eingesetzten Zellen in ausreichendem Maße auf dem gebildeten Film haften, entsprechend dem beschriebenen Verfahren, und dass das Zellwachstum in diesen anhaftenden Zellen dazu neigt, zu ihrer Ausdehnung über die gesamte Oberfläche des Films zu führen, wobei die Zellarchitektur sich nicht ändert (4-6). Diese Tatsache macht die praktische Verwendung der Filme auf Chitosan-Basis für die gesteuerte Regeneration von Gewebe möglich. Daher ist der Chitosan-Film, der entsprechend den in diesem Beispiel beschriebenen Protokoll erhalten, stabilisiert und in Bezug auf seine Zellhaftfähigkeit aktiviert wurde, imstande, eine gleichförmige und homogene Zellhaftung über die gesamte Oberfläche zu zeigen.
Beispiel 2
Aktivierung von Chitosan-Filmen durch rhBMP-2
Eine Lösung, die durch 40 μl rhBMP-2 (bei einer Konzentration von 1 mg/ml in 50 mM Essigsäure) gebildet wird, wird auf Filme aufgetragen, die entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll hergestellt wurden, nach einer Trocknung im Bereich von Sekunden. Dann folgte eine Verdünnung mit 160 μl PBS. Die Näpfe wurden bei 4°C über Nacht gehalten, und dann wurde am folgenden Tag das Medium mit dem Protein entfernt. Die Näpfe werden anschließend mit C2C12 entsprechend den in dem Vergleichsbeispiel oder in Beispiel 1 beschriebenen Protokollen mit einer anfänglichen Zelldichte von 20,000 Zellen/cm² beimpft.
40 μl rhBMP-2 bei einer Konzentration von 1 mg/ml werden zu den Kontrollnäpfen aus Plastik nach dem Beimpfen gegeben, während keine Zugabe von rhBMP-2 zu den Zellen erfolgt, die auf die Chitosan-Filme überimpft wurden.
Am dritten Tag wird das Kulturmedium entfernt und durch ein gleiches Volumen frischen Mediums ausgetauscht, und eine neue Zugabe von rhBMP-2 wird bei den Kontrollzellen durchgeführt. Während des gesamten Versuches erfolgt keine Zugabe von rhBMP-2 bei denjenigen Zellen, die auf Chitosan-Filme überimpft wurden, so dass die erzeugte Aktivierung durch das auf dem Film adsorbierte rhBMP-2 vor dem Überimpfen der Zellen erbracht werden muss.
In der Tabelle V sind die erhaltenen Ergebnisse für die durch rhBMP-2 induzierte Aktivität der alkalischen Phosphatase gesammelt.
Das Protokoll, dem durch Ausführen dieses Versuches gefolgt wurde, lautet wie folgt. Das Kulturmedium wird entfernt, und die Platten werden einmal mit 200 μl PBS gewaschen. Das PBS wird entfernt und 100 μl Lösung für die Zelllyse (Triton X-100 bei 0,1 %, 50 mM Tris HCl pH 6,8 und 10 mM MgCl₂) werden pro Napf zugegeben. Die Lösung wird dreimal bei –80°C eingefroren und wieder aufgetaut. Schließlich werden 15 μl dieser Lösung für die Lyse aus jedem Napf entfernt, und 150 μl einer 1:1 Lösung von alkalischer Phosphatase und Substrat werden zugegeben (Sigma Chemical Company), mit einem Vorwärmen auf 37°C und einer Herstellung unmittelbar vor der Verwendung. Die Lösung wird 10 Minuten bei 37°C inkubiert, und die Reaktion wird nach 10 Minuten gestoppt, nach denen die Zugabe von 150 μl 0,5 M NaOH pro Napf erfolgt. Schließlich wird die OD bei 405 nm abgelesen.
Beispiel 3
Beschichtung einer Schraube für ein Implantat
Eine Titanschraube (7) wird in eine Lösung von 1 % Chitosan in 50 mM Essigsäure getaucht. Sie wird dann herausgenommen und in einem Luftstrom getrocknet, wobei die Schraube in gleichmäßiger Drehung gehalten wird, so dass sich der Film gleichförmig über die gesamte Oberfläche erstreckt (8).
Sobald sich der Film gebildet hat, wird er nach einem der in dem Beispiel 1 beschriebenen Verfahren behandelt und gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren aktiviert. Sie wird dann im proximalen Drittel der Innenseite des flachen Teils des Schienbeins von Kaninchen einer Züchtung aus Neuseeland implantiert, die 2,5 kg wogen, und die von der Abteilung für Tierzucht der Universidad Complutense of Madrid (UCM) geliefert wurden. Nach drei Wochen wurden die Tiere getötet, und man beobachtete, dass die Haftung fester ist als in den Kontrollen (Titanschrauben ohne Beschichtung), und Kräfte zwischen 20 – 60 Newton nötig sind, um die Schrauben zu lösen.
Beispiel 4
Bestimmung des Gesamtproteingehalts der Zellkultur
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um den Gesamtproteingehalt der Zellkultur mittels des Bradford-Verfahrens zu bestimmen, in Bezug auf die Kulturzeit (Tage). Bei diesem Versuch ist der Wert der Absorption ein Hinweis auf den Proteingehalt der Zellkultur und daher auf die Anzahl der Zellen, die auf dem Film haften. Die Werte, welche unter Verwendung einer herkömmlichen Napfplatte (Plastik) als Referenz erhalten wurden, werden mit den Werten verglichen, die unter Verwendung von Chitosan-Filmen erhalten wurden, welche mit verschiedenen Behandlungen zur Stabilisierung stabilisiert und nicht einer Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden, welche durch diese Erfindung bereitgestellt wird (Beispiel 4.1) und gegenüber den Werten, die unter Verwendung von Chitosan-Filmen erhalten wurden, welche mit verschiedenen Stabilisierungsbehandlungen stabilisiert und einer Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden, die durch diese Erfindung bereitgestellt wird (Beispiel 4.2).
4.1 Chitosan-Filme ohne Aktivierung der Zellhaftfähigkeit
Um diesen Versuch durchzuführen, wurden 7 Platten mit 48 Näpfen (Costar) wie nachfolgend beschrieben hergestellt. Jede Platte besaß einige Näpfe, die unterschiedliche Chitosan-Filme (1 cm²) in dreifacher Anordnung enthielten, die durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren erhalten wurden, und die mittels verschiedener Behandlungen (Behandlung 1: Phosphat-Puffer; Behandlung 2: NaOH; Behandlung 3: Glutaraldehyd und NaOH; und Behandlung 4: Glutaraldehyd) stabilisiert und nicht einer Aktivierungsbehandlung der Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden. Näpfe mit Film, jedoch ohne Zellen, Näpfe ohne Film, Näpfe ohne Zellen, und Näpfe mit Zellen wurden als Kontrollen und Nullwerte verwendet.
Anschließend wurden 200 μl Zellkulturmedium (DMEM mit hoher Glucosekonzentration mit Penicillin/Streptomycin) zu jedem Napf gegeben. Die Näpfe wurden mit C2C12- oder ROS-Zellen mit einer Dichte von 10,000 Zellen/cm² belegt. Jeder Napf wird mit weiteren 200 μl Kulturmedium ergänzt und bei 37°C in einem CO₂-Ofen für den feststehenden Zeitraum inkubiert (1-7 Tage).
Um den Versuch zur Bestimmung des Gesamtproteins der Zellkultur nach dem Bradford-Verfahren durchzuführen, wurde dem folgenden Verfahren gefolgt. Am Tag des Versuchs wurde in einem ersten Schritt das Kulturmedium entfernt und anschließend wurden die Näpfe mit 400 μl PBS zweimal gewaschen, um Rückstände der Proteine zu beseitigen, die in dem Medium hätten vorhanden sein können, und die den Versuch hätten stören können. 200 μl Bradford-Reagenz (BioRad) pro Napf wurden zusammen mit 800 μl destilliertem Wasser oder milliQ zugegeben. Die Platten wurden 30 Minuten in der Dunkelheit bei Raumtemperatur inkubiert, und die Absorption wurde bei 595 nm abgelesen.
Nachdem die Werte für die Nullwerte entsprechend einer jeden Bedingung abgezogen wurden, werden die erhaltenen Ergebnisse in 9 gezeigt, aus der die Zufälligkeit der erhaltenen Werte ersehen werden kann, und wie erwartet beobachtet man, dass die Zellen sich mit größerer Effizienz an das Plastik geheftet haben als an die verschiedenen Chitosan-Filme, bei denen die Zellhaftung nicht auftritt oder vom vierten Tag an nahezu nicht auftritt (der mit dem Wechsel des Kulturmediums und der nachfolgenden Entfernung der nicht-haftenden Zellen zusammenfällt), wie es durch die drastische Abnahme in den Werten für die Absorption gezeigt wird, die vom vierten Tag an gemessen werden.
4.2 Chitosan-Filme mit Aktivierung der Zellhaftfähigkeit
Das in Beispiel 4.1 beschriebene Verfahren wurde genau wiederholt, jedoch wurden die in diesem Beispiel verwendeten Chitosan-Filme durch Chitosan-Filme ersetzt, welche durch verschiedene Behandlungen (Behandlung 1: Phosphat-Puffer; Behandlung 2: NaOH; Behandlung 3: Glutaraldehyd und NaOH; und Behandlung 4: Glutaraldehyd) stabilisiert und der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit gemäß der Erfindung unterzogen wurden, die in Beispiel 1 beschrieben ist.
Nachdem die Werte für die Nullkontrollen entsprechend einer jeden Bedingung abgezogen wurden, werden die erhaltenen Ergebnisse in 10 gezeigt, aus der ersehen werden kann, dass die Zellen in diesem Fall sich in einem Ausmaß an die Chitosan- Filme angeheftet haben, das ähnlich dem oder sogar größer ist als jenes für Kunststoff, sogar nach dem vierten Tag.
Beim Vergleich der in den 9 und 10 gezeigten Werte wird beobachtet, dass die Haftfähigkeit und das Wachstum der untersuchten Zelllinien auf den Chitosan-Filmen, welche der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden, sehr viel größer sind als jene, die auf den Chitosan-Filmen erhalten wurden, welche nicht dieser Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden.
Beispiel 5
Adsorption von rhBMP-2
Ein geeignetes Volumen einer Lösung von rhBMP-2 (bei einer Konzentration von 1 mg/ml in 50 mM Essigsäure) wird, um die gewünschte Menge des Proteins im Napf zu erhalten (5-400 μg von rhBMP-2), zu Filmen gegeben, die entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll hergestellt wurden, und in Abschnitten von 1 cm² auf die Näpfe einer 48-Napf-Platte aufgetragen, und das Volumen wird bis zu 200 μl mit PBS ergänzt, wenn das Volumen der zu dem Napf gegebenen Proteinlösung weniger als 200 μl betrug. Anschließend wurde die Platte bedeckt und in einer kalten Kammer bei 4°C über Nacht gehalten. Am folgenden Tag wurde die Proteinlösung aus den Näpfen entfernt (Überstand) und der Gesamtproteingehalt in dem Überstand wird durch das Bradford-Verfahren (Beispiel 4) bestimmt. Durch Berechnung der Unterschiede zwischen den Werten, welche mit der Stammlösung des Proteins erhalten wurden, wird die Menge des auf dem Chitosan-Film adsorbierten Proteins erhalten.
Die Ergebnisse der Adsorption des rhBMP-2 durch Chitosan-Filme, welche mit NaOH oder mit Glutaraldehyd stabilisiert wurden, und die der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden, welche durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, sind in den 11 bzw. 12 gezeigt, wobei der Fehlerbalken dem Mittelwert einiger Experimente entspricht.
Beispiel 6
Aktivierung von Chitosan-Filmen durch rhBMP-2 im Verlauf der Zeit
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um die Fähigkeit der Aktivierung von Chitosan-Filmen mittels rhBMP-2 über den Verlauf der Zeit zu bewerten. Um dies durchzuführen, werden 10 μg rhBMP-2 (aus einer Lösung von rhBMP-2 bei einer Konzentration von 1 mg/ml in 50 mM Essigsäure) zu den Filmen gegeben, welche entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll hergestellt und in den Näpfen einer 48-Napfplatte aufgetragen wurden. Die nicht mit einem Film beschichteten Näpfe wurden als Kontrollen verwendet.
Die Platten wurden bei 4°C über Nacht gehalten, und am folgenden Tag wurde das Medium mit dem Protein entfernt. Anschließend wurde das Kulturmedium zugegeben, und die Beimpfung mit C2C12 wurde entsprechend dem im Vergleichsbeispiel oder im Beispiel 1 beschriebenen Protokollen durchgeführt, mit einer anfänglichen Zelldichte von 10,000 Zellen/cm².
Nach dem Beimpfen wurden 10 μg rhBMP-2 zu den Plastikkontrollnäpfen gegeben, während keine folgende Zugabe von rhBMP-2 zu denjenigen Zellen erfolgte, die auf Chitosan-Filme überimpft wurden.
Am vierten Tag wird das Kulturmedium entfernt und gegen ein gleiches Volumen frischen Mediums ausgetauscht, und es erfolgt eine erneute Zugabe von rhBMP-2 zu den Kontrollzellen. Während des gesamten Versuches erfolgt keine Zugabe von irgendeinem rhBMP-2 zu den Zellen, die auf Chitosan-Filme überimpft wurden, so dass die erzeugte Aktivierung durch das auf dem Film adsorbierte rhBMP-2 vor dem Überimpfen der Zellen erbracht werden muss.
13 zeigt die Ergebnisse, die für die Aktivität der alkalischen Phosphatase (siehe das in Beispiel 2 beschriebene Versuchsprotokoll) welche durch das gesamte rhBMP-2 in den Näpfen an verschiedenen Tagen induziert wurde. Die erhaltenen Er gebnisse zeigen, dass rhBMP-2, das an die Chitosan-Filme gebunden ist, welche durch verschiedene Behandlungen stabilisiert wurden (Behandlung 1: Phosphat-Puffer; Behandlung 2: NaOH; Behandlung 3: Glutaraldehyd und NaOH; und Behandlung 4: Glutaraldehyd) und die der Aktivierungsbehandlung für die Zellhaftfähigkeit unterzogen wurden, die durch diese Erfindung bereitgestellt wird, während des betrachteten Zeitraums aktiv bleibt.
Beispiel 7: Bestimmung des notwendigen Drehmoments, um ein Implantat zu lockern
Dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren zufolge werden Schrauben hergestellt, die mit Chitosan-Filmen beschichtet sind, die durch verschiedene Behandlungen stabilisiert wurden (Behandlung 2: NaOH, Behandlung 3: Glutaraldehyd und NaOH; und Behandlung 4: Glutaraldehyd). Sobald die Filme sich auf den Schrauben gebildet haben, wird die Zellhaftfähigkeit durch Adsorption von rhBMP-2 entsprechend dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren biologisch aktiviert. Unbeschichtete Titanschrauben wurden als Kontrollen verwendet.
Anschließend wurde eine mit einem Chitosan-Film beschichtete Schraube in das proximale Drittel der Innenseite des flachen Teils des Schienbeins von Kaninchen einer Züchtung aus Neuseeland implantiert, die 2,5 kg wogen, und die von der Abteilung für Tierzucht der Universidad Complutense of Madrid (UCM) geliefert wurden, und die Kontrollschraube wurde in den flachen Teil des anderen Schienbeins desselben Tieres implantiert. Die Implantation wurde unter Verwendung herkömmlicher Verfahren durchgeführt. Die Tiere wurden ohne irgendeine Beschränkung ihrer Bewegungsfreiheit gehalten, und nach der angegebenen Zeit (5-7 Wochen) wurden die Tiere getötet, um die Osteointegration des Implantats durch Bestimmung des notwendigen Drehmoments zu bewerten, um die Schrauben zu lockern.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 14 gezeigt und zeigen eine stabilere Haftung im Fall der mit einem Chitosan-Film beschichteten Schrauben als in den Kontrol len (unbeschichtete Titanschrauben). Zusätzlich wurde der Wert des mit handelsüblichen Schrauben Osseotite^® und TiUnite^® (Nobel Pharma) (die Daten stammen von Gottlob et al., Applied Osteointegration Research, 2000, 1:25-27) erhaltenen Drehmoments wurden zu Vergleichszwecken angegeben.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Films auf Chitosanbasis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Auflösen von Chitosan, optional zusammen mit einem biologisch abbaubaren Polymer, in einem Solubilisierungsmedium, das eine wäßrige Lösung von einer Säure umfaßt; b) Ausbringen der aus Stufe a) resultierenden Lösung auf eine Oberfläche; c) Trocknen der auf die Oberfläche aufgebrachten Lösung, um einen Film auf Chitosanbasis zu erhalten; d) den Film auf Chitosanbasis mit einem Stabilisierungsmittel in Kontakt bringen, das aus i) einer wäßrigen Lösung von einer Base, (ii) einem pH-Puffer gleich oder größer 5, (iii) einem Verknüpfungsmittel und (iv) Mischungen aus denselben ausgewählt ist; e) Waschen des stabilisierten Films auf Chitosanbasis, der in Stufe d) erhalten wurde; und f) Trocknen des stabilisierten Films auf Chitosanbasis bei einer Temperatur, die zwischen 15°C und 80°C liegt, in der Gegenwart eines Luftstroms.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Chitosan ein mittleres Molekulargewicht umfaßt, das zwischen 150.000 und 2.000.000, bevorzugt zwischen 200.000 und 500.000 liegt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Chitosan einen Deacetylierungsgrad umfaßt, der zwischen 65 % und 95 % liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Chitosan ein Chitosan umfaßt, das mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen derivatisiert wurde, die aus Phosphon-, Carboxymethyl-, Methylpyrrolidon-Gruppen und deren Mischungen ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Solubilisierungsmedium eine wäßrige Lösung von einer organischen oder anorganischen Säure mit einem pH gleich oder kleiner 3,5 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Säure aus Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure und Äpfelsäure ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Chitosan zusammen mit einem biologisch abbaubaren Polymer aufgelöst wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das biologisch abbaubare Polymer aus Polyglycolsäure, Alginat, Carrageen, Collagen und deren Mischungen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Stabilisierungsmittel eine wäßrige Lösung von Natriumhydroxid, Phosphatpuffer, Carbonatpuffer oder Glutaraldehyd umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Stabilisierungsmittel eine wäßrige Lösung aus Natriumhydroxid und Glutaraldehyd umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Stabilisierungsmittel (i) einen Puffer, der aus Phosphat und Carbonatpuffer ausgewählt ist, und (ii) Glutaraldehyd umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Trocknen des stabilisierten Chitosanfilms in einer Stufe f) bei einer Temperatur, die zwischen 20°C und 40°C liegt, in der Gegenwart eines Luftstroms ausgeführt wird.
Film auf Chitosanbasis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, der gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 erhalten werden kann, wobei der Film auf Chitosanbasis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit eine Zellhaftfähigkeit um faßt, die gleich oder größer als der Anstieg von zumindest 25 % des Werts der Zellhaftfähigkeit gegenüber einem Chitosanfilm ist, der keiner Zellhaftfähigkeits-Aktivierungsbehandlung unterzogen wurde, wobei die Zellhaftfähigkeit durch den Ethidium-Homodimer-Versuch bestimmt wird.
Biologisch aktivierter Film auf Chitosanbasis mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit, der einen Film auf Chitosanbasis mit erhöhter Zellhaftfähigkeit nach Anspruch 13 und zumindest eine biologisch aktive Substanz umfaßt.
Biologisch aktivierter Film auf Chitosanbasis nach Anspruch 14, wobei die biologisch aktive Substanz aus der Gruppe bestehend aus Antibiotika, Hormonen und Proteinen mit einer biologischen Aktivität im Körper von Menschen und Tieren ausgewählt ist.
Biologisch aktivierter Film auf Chitosanbasis nach Anspruch 15, wobei die biologisch aktive Substanz ein knochenbildendes Protein (BMP) ist.
Biologisch aktivierter Chitosanfilm nach Anspruch 16, wobei das BMP ein menschliches, natürliches oder rekombiniertes BMP oder dessen Dimer oder Heterodimer ist.
Biologisch aktivierter Chitosanfilm nach Anspruch 18, wobei das BMP aus rhBMP-2, rhBMP-4, rhBMP-7, ihren Dimeren oder Heterodimeren und deren Mischungen ausgewählt ist.
Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktivierten Chitosanfilms mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit nach einem der Ansprüche 14 bis 18, das einen Schritt umfaßt, in dem ein Chitosanfilm nach Anspruch 13, oder der nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 erhalten werden kann, mit einer biologisch aktiven Substanz in Kontakt gebracht wird.
Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktivierten Chitosanfilms mit einer erhöhten Zellhaftfähigkeit nach einem der Ansprüche 14 bis 18, das einen Schritt umfaßt, in dem eine biologisch aktive Substanz mit (i) der Chitosanlösung, optional zusammen mit einem biologisch abbaubaren Polymer, in einem Solubilisierungsmedium, das eine wäßrige Lösung von einer Säure umfaßt, in Stufe a) des Verfahrens nach Anspruch 1 in Kontakt gebracht wird, oder alternativ mit (ii) dem Film auf Chitosanbasis mit dem Stabilisierungsmittel in Stufe d) des Verfahrens nach Anspruch 1.
Mit einem Film auf Chitosanbasis beschichtetes Produkt, das einen Träger und eine Gesamt- oder Teilbeschichtung des Trägers mit einem Chitosanfilm nach einem der Ansprüche 13 bis 18 umfaßt.
Produkt nach Anspruch 21, wobei der Träger aus der Gruppe bestehend aus einer Prothese und medizinisch-chirurgischen Implantaten ausgewählt ist.
Produkt nach Anspruch 21, wobei der Träger ein dentales oder traumatologisches Implantat ist und der Film auf Chitosanbasis ein biologisch aktivierter Chitosanfilm ist, der zumindest ein BMP umfaßt.
Produkt nach Anspruch 21, wobei der Träger aus der Gruppe bestehend aus Gazen und Matrizen von biokompatiblen und/oder biologisch abbaubaren Polymeren ausgewählt ist, die im Tissue Engineering bzw. in der Zellkulturtechnik verwendet werden.
Verwendung eines biologisch aktivierten Chitosanfilms nach einem der Ansprüche 14 bis 18, bei der Entwicklung eines Produkts, das mit dem Film zur Herbeiführung einer biologischen Aktivität in dem aufnehmenden Organismus beschichtet wird, bei der Verbesserung der Osteointegration von Implantaten von dentalem und traumatologischem Nutzen in ihrer Gesamtheit oder in Teilen im Bereich des aufnehmenden Organismus, wo eine Verbesserung und/oder die Regenerierung von Knochengeweben gewünscht wird.
Verwendung eines biologisch aktivierten Chitosanfilms nach einem der Ansprüche 14 bis 18, bei der die Entwicklung eines Implantats für einen dentalen oder traumatologischen Verwendungszweck.