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DE60105609T2 - Metabolismuskontrolle mittels zusamensetzungen des humanen 2-oxoglutarat-trägers - Google Patents

Metabolismuskontrolle mittels zusamensetzungen des humanen 2-oxoglutarat-trägers Download PDF

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DE60105609T2
DE60105609T2 DE60105609T DE60105609T DE60105609T2 DE 60105609 T2 DE60105609 T2 DE 60105609T2 DE 60105609 T DE60105609 T DE 60105609T DE 60105609 T DE60105609 T DE 60105609T DE 60105609 T2 DE60105609 T2 DE 60105609T2
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ogc
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Genentech Inc
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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die größte Menge des Sauerstoffverbrauchs im Gewebe eines Tieres wird durch ein genau ausgewogenes System gesteuert, in welchem die Geschwindigkeit des Katabolismus der Nahrungsmittel in den Mitochondrien zum größten Teil durch den Fluß von Elektonen entlang der Elektronentransportkette geregelt ist. Gleichzeitiges Pumpen der Protonen auswärts über die mitochondriale innere Membran etabliert einen elektrochemischen Protonengradienten oder eine protonentreibende Kraft (Δ p), welche die ATP-Synthese durch einen Einwärtsfluß von Protonen durch die F1F0-ATP-Synthase steuert. Somit sind Nahrungsmittelverbrennung, Elektronentransport, Protonenfluß und ATP-Umwandlung direkt miteinander gekoppelt. Jedoch wird ein Teil des Δp als Einwärtsprotonenfluß unabhängig von der ATP-Synthase abgezweigt, ein Phänomen, das als "proton leak" oder "entkoppeln" bekannt ist. Nahrungsmittelverbrennung und Elektronentransport/Auswärtsprotonenpumpen steigen auf die Abzweigung von Δp hin an; somit könnte das immanente proton leak in den Mitochondrien für einen signifikanten Teil der täglichen Energieaufwendung Rechnung tragen (schätzungsweise zwischen 20 und 40 % des metabolischen Umsatzes im Gewebe) [Brand et al., Biochim. Biophys. Acta, 1187:132–139 (1994); Rolfe et al., Am. J. Physiol., 276:C692–C699 (1999)].
  • Das erste Anzeichen, daß spezifische Proteine dem proton leak in den Mitochondrien in Säugetieren zugrunde liegen könnten, ergab sich aus Studien des braunen adipösen Gewebes (BAT), eines spezialisierten Gewebes, in welchem ein großer Teil des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs von der ATP-Synthese unter Bedingungen entkoppelt wird, in welchen die adaptionelle Thermogenese getriggert wird (d. h. Kälteaussetzung bei Nagetieren) [Nicholls und Locke, Physiol. Rev., 64:1–64 (1984)]. Das hitzebildende Nutzloscyclisieren des Protonenkreislaufs in den Mitochondrien des BAT wurde als mit einem spezifischen Protein verbunden angesehen, das Entkopplungsprotein (UCP, anschließend UCP1 genannt) genannt wird [Nicholls und Locke, supra; Ricquier et al., FASEB J., 5:2237–2242 (1991)]
  • UCPs wurden zunächst in braunen Fettzellen von Winterschlaf-haltenden Tieren, so wie Bären, gefunden und beschrieben. Es wurde vermutet, daß UCPs solchen Winterschlaf-haltenden Tieren und anderen Tieren, die an kaltes Wetter angepaßt sind, helfen, um die Körpertemperaturen bei kaltem Wetter in ihrem Kern dadurch beizubehalten, daß die metabolische Geschwindigkeit des Körpers im Ruhezustand erhöht wird. Da Menschen relativ geringe Mengen braunes adipöses Gewebe besitzen, wurde zunächst vermutet, daß UCPs eine weniger wichtige Rolle beim menschlichen Metabolismus spielen.
  • Verschiedene unterschiedliche menschliche Entkopplungsproteine wurden nun beschrieben [siehe im allgemeinen Gura, Science, 280:1369–1370 (1998)]. Das menschliche Entkopplungsprotein, das UCP1 genannt wird, wurde durch Nicholls et al. identifiziert. Nicholls et al. zeigten, daß die innere Membran von braunen Fettzellmitochondrien für Proteine sehr durchlässig war, und die Forscher führten die beobachtete Durchlässigkeit auf ein Protein, genannt UCP1, in der mitochondrialen Membran zurück. Nicholls et al. berichteten, daß das UCP1 durch die Bildung einer solchen Permeabilität die Anzahl der ATPs reduziert, die aus einer Nahrungsmittelquelle hergestellt werden können, und somit die metabolische Geschwindigkeit erhöht und Hitze generiert [Nicholls et al., Physiol. Rev., 64, 1–64 (1984)].
  • Es wurde später herausgefunden, daß UCP1 tatsächlich nur in braunem adipösem Gewebe gebildet wird [Bouillaud et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:445–448 (1985); Jacobsson et al., J. Biol. Chem., 260:16250–16254 (1985)]. Genetische Kartierungsstudien haben gezeigt, daß das menschliche UCP1-Gen auf Chromosom 4 angeordnet ist [Cassard et al., J. Cell. Biochem., 43:255–264 (1990)].
  • Trotz der Begrenzung von UCP1 auf BAT unter den meisten Bedingungen tritt ein signifikanter proton leak in allen Geweben auf, in welchen er gemessen wurde, was zu der Möglichkeit führt, daß UCPs körperweit vorhanden sind und die metabolische Geschwindigkeit im ganzen Tier beeinflussen. Bis heute wurden vier putative UCP-Homologe identifiziert, mit homologspezifischen Gewebeexpressionsmustern [siehe Adams. J. Nutr., 130:711-71 (2000)].
  • Ein anderes menschliches UCP, genannt UCPH oder UCP2, wurde ebenso beschrieben [Gimeno et al., Diabetes, 46:900–906 (1997); Fleury et al., Nat. Genet., 15:269–272 (1997); Boss et al., FEBS Letters, 408:39–42 (1997); siehe ebenso Wolf Nutr. Rev., 55:178–179 (1997)]. Fleury et al. lehren, daß das UCP2-Protein eine 59%ige Aminosäureidentität zu UCP1 aufweist und daß UCP2 Regionen dem menschlichen Chromosoms 11 zugeschrieben werden kann, welche mit Hyperinsulinämie und Übergewicht in Verbindung stehen [Fleury et al., supra]. Es wurde ebenso berichtet, daß UCP2 in einer Vielzahl von adulten Geweben exprimiert wird, so wie Gehirn und Muskel- und Fettzellen [Gimeno et al., supra, und Feury et al., supra].
  • Ein drittes humanes UCP, UCP3, wurde kürzlich durch Boss et al., supra; Vidal-Puig et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 235:79–82 (1997); Solanes et al., J. Biol. chem., 272:25433–25436 (1997); und Gong et al., J. Biol. chem., 272:24129–24132 (1997)beschrieben. [Siehe ebenso Great Britain Patent Nr. 9716886]. Solanes et al. berichtet, daß, anders als UCP1 und UCP2, UCP3 vorzugsweise in menschlichen Skelettmuskeln exprimiert wird und daß das UCP3-Gen dem menschlichen Chromosom 11 zugeordnet werden kann, und zwar benachbart zu dem UCP2-Gen [Solanes et al., supra]. Gong et al. beschreiben, daß die UCP3-Expression durch bekannte thermogene Stimuli gesteuert werden kann, so wie Thyroidhormon, beta3-adrenergische Agonisten und Leptin [Gong et al., supra].
  • Um ein putatives UCP zu charakterisieren, kann ein in vitro-Assay verwendet werden, der das mitochondriale Membranpotential (Δψm) mißt. Die ektopische Expression von UCP-Homologen in Säugetierzellinien und in Hefe führt zu einem Abfall von Δψm, was konsistent mit dem Entkoppeln unter diesen Bedingungen ist. Als eine negative Kontrolle bei solchen Experimenten ist es bevorzugt, ein Molekül zu verwenden, das ein in Mitochondrien-angeordneter Träger ist, der Verbindungen auf eine elektroneutrale Art und Weise austauscht. Der humane 2-Oxoglutaratträger (menschliches OGC) zeigt diese Charakteristiken auf. Weiterhin wurde berichtet, daß die Expression von humanem OGC in transformierten Hefen die mitochondriale Funktion nicht beeinflußte [Sanchis et al., J. Biol. Chem., 273(51):34611–34615 (1998)]
  • J. Bioenergetics and Biomembranes, Bd. 25, Nr. 5, Seiten 435–446, beschreibt die Proteinüberfamilie des mitochondrialen Transports.
  • Biochemical Journal, Bd. 344, Nr. 2, 01.12.1999, Seiten 313–321, beschreibt die Identifikation von adipösen gewebespezifischen mitochondrialen Entkopplungsproteinen und Faktoren, die geweberelevante metabolische Prozesse negativ beeinflussen können.
  • FEBS letters, Bd. 449, Nrn. 2–3, 2.3.04.1999, Seiten 129–134, beschreibt Studien, die demonstrieren, daß der mitochondriale Oxoglutaratträger keine Entkopplungsaktivität in einem Hefeexpressionssystem aufweist.
  • J. Bioenergetics and Biomembranes, Juni 1998, Bd. 30, Nr. 3, Seiten 277–284, beschreibt die Analyse von der Verteilung von mitochondrialen Transportern in dem humanen Gewebe auf dem mRNA-Niveau.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es wurde nun herausgefunden, daß OGC die Charakteristika eines UCP aufweist, d. h. es verändert das mitochondriale Membranpotential. Basierend auf den veröffentlichen Berichten der Charakteristika von humanem OGC, die oben ausgeführt sind, hätte man nicht vorhersagen können, daß die Überexpression des Moleküls in menschlichen Zellen eine Wirkung auf das mitochondriale Membranpotential innerhalb dieser Zellen haben würde. Trotzdem beeinflußt die Überexpression von humanem OGC das mitochondriale Membranpotential auf einem ähnlichem Niveau wie bekannte UCPs. Somit hat humanes OGC überraschenderweise die Charakteristiken eines UCP.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert. In gewissen Ausführungsformen wird eine Säugetierzelle mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die die Expression oder Aktivität von humanem OGC erhöht, wobei die erhöhte Expression von humanem OGC dadurch das mitochondriale Membranpotential in der Zelle absenkt. Wenn die Säugetierzelle in vivo kontaktiert wird, sind solche Zusammensetzungen bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von metabolischen Zuständen, so wie Übergewicht, nützlich.
  • In anderen Ausführungsformen wird eine Säugetierzelle mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die die Expression oder Aktivität von humanem OGC absenkt, wobei die abgesenkte Expression von humanem OGC dadurch das mitochondriale Membranpotential in der Zelle erhöht. Wenn die Säugetierzelle in vivo kontaktiert wird, sind solche Zusammensetzungen bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines metabolischen Zustands, so wie Kachexia, nützlich.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet Assays zum Screenen von Verbindungen oder Zusammensetzungen für die Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential zu verändern. Solche Verbindungen oder Zusammensetzungen sind exzellente Kandidaten als Therapeutika für metabolische Zustände. Solche Zusammensetzungen können kleine Moleküle beinhalten. Wenn die Zusammensetzung für eine Variante von humanem OGC codiert, kann der Assay verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Variante die Fähigkeit, mitochondriale Membranpotentiale zu verändern, verglichen mit nativem humanem OGC, beibehält, erhöht oder absenkt. Außerdem können alternative native Formen miteinander verglichen werden.
  • Ebenso sind diagnostische Verwendungen und Kits zum Detektieren eines metabolischen Zustands hierin beschrieben. In gewissen Ausführungsformen umfaßt die Verwendung das Detektieren von humaner OGC-Expression oder eines Mangels an humaner OGC-Expression in einer Zelle oder in einer Gewebeprobe. In anderen Ausführungsformen dient die Verwendung der Detektion einer Veränderung der Sequenz von humanem OGC, was eine Veränderung in der humanen OGC-Aktivität oder eine Veränderung in dem Genom bewirkt, was die Expression von humanem OGC beeinflußt.
  • Eine genauere Beschreibung dieser Ausführungsformen und anderer Ausführungsformen ist hierunter gegeben. Weiterhin werden im Lichte der vorliegenden Offenbarung zusätzliche Ausführungsformen dem Fachmann offensichtlich sein.
  • I. Definitionen
  • Die Begriffe "humanes OGC-Polypeptid", "humanes OGC-Protein" und "humanes OGC" umfassen, wenn sie hierin verwendet werden, humanes QGC mit nativer Sequenz und humane OGC-Varianten (welche hierin genauer definiert sind). Das humane OGC kann aus einer Vielzahl von Quellen isoliert sein, so wie aus humanen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder kann durch rekombinante und/oder synthetische Verfahren hergestellt werden.
  • Ein "humanes OGC mit nativer Sequenz" umfaßt ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie humanes OGC, das aus der Natur abgeleitet ist. Solches humanes OGC mit nativer Sequenz kann aus der Natur isoliert werden oder kann durch rekombinante und/oder synthetische Mittel produziert werden. Der Begriff "humanes OGC mit nativer Sequenz" umfaßt insbesondere natürlich auftretende trunkierte Formen oder Isoformen, natürlich auftretende variierte Formen (z. B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende allele Varianten des humanen OGC. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das humane OGC mit nativer Sequenz eine reife oder Gesamtlängen-humane native Sequenz. Verschiedene solche Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten diejenigen, für die die Nucleinsäuren mit den GenBank-Zugangsnummern NM_003562 und AF070548 codieren. Es gibt einen einzelnen Nucleotidunterschied zwischen NM_003562 und AF070548 (G nach A) bei Position 36 (relativ zu dem Start ATG), was in einer Veränderung in den entsprechenden Proteinen bei Position 12 resultiert (M nach I).
  • "Humane OGC-Variante" beinhaltet humanes OGC mit wenigstens etwa 90 % Aminosäuresequenzidentität bezüglich der Aminosäuresequenz von nativem humanem OGC. Solche humanen OGC-Varianten beinhalten beispielsweise humane OGC-Polypeptide, wobei ein oder mehrere Aminosäurereste hinzugefügt oder deletiert sind, und zwar an dem N- oder C-Terminus ebenso wie innerhalb einer oder mehrerer interner Domänen. Normalerweise wird eine humane OGC-Variante eine wenigstens etwa 90%ige Aminosäuresequenzidentität aufweisen und vorzugsweise wenigstens etwa eine 95%ige Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von nativem humanem OGC.
  • "Prozent (%) Aminosäuresequenzidentität" bezüglich der humanen OGC-Sequenzen, die hierin identifiziert sind, ist definiert als der Prozentsatz der Aminosäurereste in der humanen OGC-Sequenz, die identisch zu den Aminosäureresten in der Kandidatensequenz sind, nachdem die Sequenzen aneinandergelagert sind und entsprechende Lücken, wenn erforderlich, eingeführt sind, um den maximalen Prozentsatz einer Sequenzidentität zu erreichen, und ohne Berücksichtigung irgendwelcher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität. % Identität kann bestimmt werden durch WU-BLAST-2, erhalten von [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460–480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html]. WU-BLAST-2 verwendet verschiedene Suchparameter, von denen die meisten auf voreingestellte Werte eingestellt sind. Die anpaßbaren Parameter werden auf die folgenden Werte eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11. Die HSP S- und HSP S2-Parameter sind dynamische Werte und werden durch das Programm selbst etabliert, abhängig von der Zusammensetzung der entsprechenden Sequenz und der Zusammensetzung der bestimmten Datenbank, mit welcher die Sequenz von Interesse verglichen wird; jedoch können diese Werte angepaßt werden, um die Sensitivität zu erhöhen. Ein %iger Aminosäuresequenzidentitätswert wird bestimmt durch die Anzahl von entsprechenden identischen Resten, geteilt durch die Gesamtzahl der Reste der "längeren" Sequenz in der Region, die verglichen wurde. Die "längere" Sequenz ist diejenige mit den meisten tatsächlichen Resten in der aneinandergelagerten Region (Lücken, die duch WU-Blast-2 eingeführt werden, um die Alignment-Bewertung zu maximieren, werden ignoriert).
  • Der Begriff "Positive" im Kontext von Sequenzvergleich, der ausgeführt wird wie oben beschrieben, beinhaltet Reste in den verglichenen Sequenzen, die nicht identisch sind, aber die ähnliche Eigenschaften haben (z. B. als ein Ergebnis von konservativen Substitutionen). Der %-Wert der Positiven wird bestimmt durch den Anteil der Reste, die einen positiven Wert in der BLOSUM 62-Matrix erzielen, geteilt durch die Gesamtanzahl der Reste in der längeren Sequenz, wie oben definiert.
  • Auf eine ähnliche Art und Weise ist die "Prozent (%) Nucleinsäuresequenzidentität" definiert als der Prozentsatz der Nucleotide in einer humanen OGC-Sequenz, die identisch zu den Nucleotiden in den Kandidatensequenzen sind. Die Identitätswerte können durch das BLASTN-Modul von WU-BLAST-2 generiert werden, wobei WU-BLAST-2 auf voreingestellte Parameter eingestellt ist, wobei overlap span und overlap fraction auf 1 bzw. 0,125 eingestellt sind.
  • "Isoliert", wenn hierin verwendet, um die verschiedenen Polypeptide, die hierin offenbart sind, zu beschreiben, bedeutet, daß ein Polypeptid von einem Bestandteil dessen natürlicher Umgebung identifiziert und abgetrennt und/oder zurückgewonnen wurde. Kontaminierende Bestandteile von dessen natürlicher Herkunft sind Materialien, die typischerweise mit diagnostischen oder therapeutischen Verwendungen des Polypeptids störend interagieren würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinöse oder nichtproteinöse lösliche Stoffe beinhalten. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) zu einem Grad aufgereinigt werden, der ausreicht, um wenigstens 15 Reste des N-Terminus oder der internen Aminosäuresequenz durch die Verwendung eines spinning cup-Sequenzierers zu erhalten, oder (2) bis zur Homogenität durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassieblau oder vorzugsweise Silberfärbung. Isoliertes Polypeptid beinhaltet Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da wenigstens ein Bestandteil der natürlichen Umgebung des humanen OGC nicht vorhanden sein wird. Normalerweise wird isoliertes Polypeptid durch wenigstens einen Aufreinigungsschritt hergestellt werden.
  • Ein "isoliertes" Nucleinsäuremolekül, das für ein humanes OGC-Polypeptid codiert, ist ein Nucleinsäuremolekül, das aus wenigstens einem kontaminierenden Nucleinsäuremolekül, mit dem es normalerweise in der natürlichen Quelle der Nucleinsäure, die für humanes OGC codiert, assoziiert ist, identifiziert und abgetrennt ist. Ein isoliertes humanes Nucleinsäuremolekül, das für OGC codiert, befindet sich in einer anderen Form oder Umgebung als in der, in der es in der Natur gefunden wird. Isolierte Nucleinsäuremoleküle sind daher von den Nucleinsäuremolekülen, die für humanes OGC codieren, verschieden, da sie in natürlichen Zellen existieren. Jedoch beinhaltet ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein humanes OGC-Polypeptid codiert, Nucleinsäuremoleküle, die für humanes OGC codieren, die in Zellen enthalten sind, die normalerweise humanes OGC exprimieren, wo beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einem chromosomalen Ort angeordnet ist, der von dem natürlicher Zellen verschieden ist.
  • Der Begriff "Kontrollsequenzen" betrifft DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel verbundenen codierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryonten geeignet sind, beinhalten beispielsweise einen Promotor, optional eine Operatorsequenz, und einen Ribosombindeort. Von eukaryotischen Zellen ist bekannt, daß sie Promotoren, Polyadenylierungssignal und Enhancer verwenden.
  • Eine Nucleinsäure ist "operabel verbunden", wenn sie in einer funktionalen Beziehung zu einer anderen Nucleinsäuresequenz angeordnet ist. Beispielsweise ist DNA für eine Vorsequenz oder für eine Sekretionsleadersequenz operabel mit DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn es als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflußt; oder ein Ribosombindeort ist operabel mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn er so angeordnet ist, daß er die Translation vereinfacht. Im allgemeinen bedeutet "operabel verbunden", daß die verbundenen DNA-Sequenzen kontinuierlich verbunden sind, und im Falle einer Sekretionsleadersequenz kontinuierlich und in Lesephase. Jedoch müssen Enhancer nicht kontinuierlich sein. Das Verbinden wird erreicht durch Ligation bei bequemen Restriktionsorten. Wenn solche Orte nicht existieren, werden synthetische Oligonucleotidadaptoren oder Linker verwendet, in Übereinstimmung mit der konventionellen Praxis.
  • Der Begriff "Antikörper" ist in seinem breitesten Sinne verwendet und umfaßt insbesondere einzelne antihumane OGC-monoklonale Antikörper (einschließlich Agonisten, Antagonisten und neutralisierende Antikörper) und anti-humane OGC-Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität. Der Begriff "monoklonale Antikörper", wie hierin verwendet, betrifft einen Antikörper, der von einer Population aus im wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde, d.h. die individuellen Antikörper, die die Population umfaßt, sind identisch, außer bezüglich möglicher natürlicherweise auftretender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können.
  • "Stringenz" der Hybridisierungsumsetzungen ist durch den Fachmann mit durchschnittlicher Begabung leicht bestimmbar und ist im allgemeinen eine empirische Berechnung, abhängig von Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration. Im allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für ein sauberes Annealen, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen benötigen. Hybridisierung hängt im allgemeinen von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, zu reannealen, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unterhalb deren Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad der gewünschten Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als ein Ergebnis folgt, daß höhere relative Temperaturen dazu tendieren würden, die Umsetzungsbedingungen stringenter zu machen, während niedrigere Temperaturen dies weniger tun. Für zusätzliche Details und Erklärungen der Stringenz von Hybridisierungsumsetzungen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
  • "Stringente Bedingungen" oder "Bedingungen mit hoher Stringenz", wie hierin definiert, können durch solche identifiziert werden, die: (1) niedrige ionische Stärke und hohe Temperatur zum Waschen verwenden, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50 °C; (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel verwenden, so wie Formamid, beispielsweise 50 % (v/v) Formamid mit 0,1 % Bovinserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C; oder (3) 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, sonifizierte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C mit Waschungen bei 42 °C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55 °C, gefolgt durch eine Waschung mit hoher Stringenz bestehend aus 0,1 × SSC enthaltend EDTA bei 55 °C, verwenden.
  • "Moderat stringente Bedingungen" können identifiziert werden wie beschrieben durch Sambrook et al., Molecular Cloniong: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 und beinhalten die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z. B. Temperatur, Innenstärke und % SDS), die weniger stringent sind als diejenigen, die oben beschrieben sind. Ein Beispiel von moderat stringenten Bedingungen ist Übernacht-Inkubierung bei 37 °C in einer Lösung umfassend 20 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA, gefolgt durch Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50 °C. Der begabte Fachmann wird erkennen, wie die Temperatur, die Ionenstärke usw. wie erforderlich angepaßt werden müssen, um Faktoren wie Sondenlänge und ähnliches zu berücksichtigen.
  • Der Begriff "Epitop-getagged", wenn hierin verwendet, meint ein chimeres Polypeptid, umfassend ein humanes OGC-Polypeptid, das mit einem "tag-Polypeptid" verbunden ist. Das tag-Polypeptid weist ausreichend Reste auf, um ein Epitop zur Verfügung zu stellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, und ist trotzdem kurz genug, so daß es nicht mit der Aktivität des Polypeptids, mit dem es verbunden ist, interferiert. Das tag-Polypeptid ist vorzugsweise außerdem relativ einzigartig, so daß der Antikörper nicht wesentlich mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete tag-Polypeptide haben im allgemeinen wenigstens sechs Aminosäurereste und normalerweise zwischen ungefähr 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen ungefähr 10 und 20 Aminosäurereste).
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Immunoadhäsin" antikörperartige Moleküle, welche die Bindespezifität eines heterologen Proteins (ein "Adhäsin") mit den Effektorfunktionen von Immunoglobulinkonstanten Domänen kombiniert. Strukturell umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindespezifität, welche von der Antigenerkennung und dem Bindeort eines Antikörpers verschieden ist (d. h. ist "heterolog"), und einer konstanten Immunoglobulindomänensequenz. Der Adhäsinteil eines Immunoadhäsinmoleküls ist typischerweise eine kontinuierliche Aminosäuresequenz, die wenigstens den Bindeort eines Rezeptors oder eines Liganden umfaßt. Die konstante Immunoglobulindomänensequenz in dem Immunoadhäsin kann aus irgendeinem Immunoglobulin erhalten werden, so wie IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2) IgE, IgD oder IgM.
  • "Aktiv" oder "Aktivität" für die Zwecke hierin meint eine Form oder Formen von humanem OGC, welche die biologische und/oder immunologische Aktivität von nativem oder natürlich auftretendem humanem OGC beibehalten. Eine bevorzugte Aktivität ist die Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential auf eine Art und Weise zu beeinflussen, die in einer Hoch- und Herunterregulierung der metabolischen Rate und/oder der Wärmeproduktion resultiert. Eine solche Aktivität beinhaltet die Bildung von Protonenlecks in der mitochondrialen Membran, die in einem Anstieg des metabolischen Umsatzes resultiert.
  • Der Begriff "Antagonist" wird in seinem breitesten Sinn verwendet und beinhaltet jegliches Molekül, das teilweise oder vollständig eine biologische Aktivität eines antiven humanen OGC-Polypeptids, das hierin offenbart ist, blockiert, inhibiert oder neutralisiert. Auf eine ähnliche Art und Weise wird der Begriff "Agonist" in seinem breitesten Sinn verwendet und beinhaltet jegliches Molekül, das eine biologische Aktivität eines hierin offenbarten nativen humanen OGC-Polypeptids mimt. Geeignete agonistische oder antagonistische Moleküle beinhalten insbesondere agonistische oder antagonistische Antikörper oder Antikörperfragmente oder Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten von nativen humanen OGC-Polypeptiden.
  • "Behandlung" betrifft sowohl therapeutische Behandlung als auch prophylaktische oder vorbeugende Maßnahmen, wobei das Ziel ist, den betreffenden pathologischen Zustand oder Fehlzustand zu vermeiden oder zu verlangsamen (abzumildern). Diejenigen, die einen Bedarf für eine Behandlung haben, beinhalten diejenigen, die den Fehlzustand bereits aufweisen, ebenso wie diejenigen, die dazu neigen, den Fehlzustand zu haben, oder diejenigen, bei denen der Fehlzustand vermieden werden soll.
  • "Chronische" Verabreichung betrifft die Verabreichung von einem Mittel oder von Mitteln auf eine kontinuierliche Art und Weise, im Gegensatz zu einem akuten Modus, um so die initiale therapeutische Wirkung (Aktivität) für eine ausgedehnte Zeitperiode beizubehalten. "Unterbrochene" Verabreichung ist eine Behandlung, die nicht kontinuierlich ohne Unterbrechung ausgeführt wird, sondern die eher eine cyclische Natur aufweist.
  • "Säugetier" für die Zwecke der Behandlung betrifft jegliches Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, domestizierte und Farmtiere, und Zoo-, Sport- oder Haustiere, so wie Hunde, Katzen, Kühe, Pferde, Schafe, Schweine usw. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
  • Die Verabreichung "in Kombination mit" einem oder mehreren therapeutischen Mitteln beinhaltet die simultane (gleichzeitige) oder nacheinander abfolgende Verabreichung in irgendeiner Reihenfolge.
  • "Metabolische Fehlzustände" sind Krankheiten, Fehlzustände oder Symptome, die mit dem metabolischen Umsatz und/oder der Wärmeproduktion in Verbindung stehen. Beispiele solcher Fehlzustände beinhalten Übergewicht, Kachexia, virale Infektionen, Krebse und bakterielle Infektionen.
  • II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
  • A. Verwendung für Humanes OGC
  • Wie hierin offenbart, hat humanes OGC überraschenderweise eine Entkopplungsaktivität. UCPs sind nützlich zum Detektieren und Behandeln von metabolischen Fehlzuständen. Solche und andere Verwendungen unter Verwendung von UCP-Zusammensetzungen sind im Stand der Technik bekannt, z. B. siehe WO 00/04037.
  • Nucleotidsequenzen (oder deren Komplement), die für humanes OGC codieren, haben verschiedene Anwendungen in der Technik der Molekularbiologie, einschließlich Verwendungen als Hybridisierungssonden, beim Chromosom- und Genmapping und bei der Bildung von antisense-RNA und -DNA. Humane OGC-Nucleinsäure wird ebenso für die Herstellung von humanen OGC-Polypeptiden durch rekombinante Techniken, wie hierin beschrieben, nützlich sein.
  • Das humane OGC-Gen mit nativer Gesamtlängensequenz oder Fragmente davon können unter anderem als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Library verwendet werden, um das humane OGC-Gen in seiner Gesamtlänge zu isolieren oder um andere Gene zu isolieren (beispielsweise diejenigen, die für natürlich auftretende Varianten des humanen OGC oder OGC von anderen Spezies codieren), welche eine gewünschte Sequenzidentität zu der nativen humanen OGC-Sequenz aufweisen. Optional beträgt die Länge der Sonden etwa 20 bis etwa 80 Basen. Die Hybridisierungssonden können von der Nucleotidsequenz der humanen OGC-codierenden Region oder von genomischen Sequenzen, einschließlich Promotoren, Enhancerelementen und Introns des humanen OGC mit nativer Sequenz, abgeleitet sein. Beispielsweise wird ein Screeningverfahren das Isolieren der codierenden Region des humanen OGC-Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz umfassen, um eine ausgewählte Sonde von etwa 40 Basen zu synthetisieren. Hybridisierungssonden können durch eine Vielzahl von Markierungen markiert werden, einschließlich Radionucleotiden, so wie 32P oder 35S, oder enzymatischen Markern, so wie alkalischer Phosphatase, gekoppelt an die Sonde über Avidin/Biotin-Kopplungssysteme. Markierte Sonden mit einer Sequenz, die komplementär zu derjenigen des humanen OGC-Gens der vorliegenden Erfindung ist, können verwendet werden, um Libraries humaner cDNA, genomischer DNA und mRNA zu screenen, um zu bestimmen, zu welchen Mitgliedern dieser Libraries die Sonde hybridisiert. Hybridisierungstechniken sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • Die Sonden können ebenso bei PCR-Techniken verwendet werden, um einen Sequenzpool zur Identifizierung von eng verwandten humanen OGC-codierenden Sequenzen zu bilden.
  • Nucleotidsequenzen, die für ein humanes OGC codieren, können ebenso verwendet werden, um Hybridisierungssonden zum Mappen des Gens zu konstruieren, welches für humanes OGC codiert, und für die genetische Analyse von Individuen mit genetischen Fehlzuständen. Die Nucleotidsequenzen, die hierin zur Verfügung gestellt werden, können auf ein Chromosom und auf spezifische Bereiche eines Chromosoms unter Verwendung von bekannten Techniken, so wie in situ-Hybridisierung, Verbindungsanalyse gegen bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungsscreening mit Libraries, gemapped werden.
  • Wenn die codierenden Sequenzen für humanes OGC für ein Protein codieren, welches an ein anderes Protein bindet, kann das humane OGC in Assays verwendet werden, um die anderen Proteine oder Moleküle zu identifizieren, die in die Bindeinteraktion involviert sind. Durch solche Verfahren können Inhibitoren der Bindeinteraktion identifiziert werden. Proteine, die in solche Bindeinteraktionen involviert sind, können ebenso verwendet werden, um nach Peptid- oder Kleinmolekülinhibitoren oder Agonisten der Bindeinteraktion zu screenen. Screeningassays können entworfen werden, um Leitstrukturen zu finden, die die biologische Aktivität eines nativen humanen OGC oder eines Proteins, das mit humanem OGC interagiert, mimt. Solche Screeningassays werden Assays beinhalten, die für high-throughput-Screening von chemischen Libraries verwendbar sind, was sie insbesondere nützlich zum Identifizieren von Kleinmolekülmedikamentenkandidaten macht. Die erwähnten Kleinmoleküle beinhalten synthetische organische oder anorganische Verbindungen. Die Assays können in einer Vielzahl von Formaten ausgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindeassays, biochemischer Screeningassays, Immunoassays und zellbasierter Assays, welche im Stand der Technik gut bekannt sind.
  • Nucleinsäuren, welche für humanes OGC oder für dessen modifizierte Formen codieren, können ebenso verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder "knock out"-Tiere zu generieren, welche wiederum bei der Entwicklung oder beim Screenen von therapeutisch nützlichen Reagenzien nützlich sind. Ein transgenes Tier (z. B. eine Maus oder Ratte) ist ein Tier mit Zellen, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in das Tier oder einen Vorfahr des Tieres in einem pränatalen, z. B. einem embryonalen Stadium, eingeführt wurde. Ein Transgen ist eine DNA, welche in das Genom einer Zelle integriert wird, aus welcher sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann die cDNA, die für humanes OGC codiert, verwendet werden, um genomische DNA zu klonieren, die für humanes OGC codiert, in Übereinstimmung mit etablierten Techniken und den genomischen Sequenzen, die verwendet werden, um transgene Tiere zu generieren, die Zellen enthalten, welche DNA exprimieren, die für humanes OGC codiert. Verfahren zum Generieren von transgenen Tieren, insbesondere Tieren, so wie Mäusen oder Ratten, sind im Stand der Technik konventionell geworden und sind beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4,736,866 und 4,870,009 beschrieben.
  • Typischerweise sind bestimmte Zellen ein Ziel für die Inkorporierung von einem humanem OGC-Transgen mit gewebespezifischen Enhancern. Transgene Tiere, die eine Kopie eines Transgens enthalten, das für humanes OGC codiert, das in die Keimbahn des Tieres in einem embryonalen Stadium eingeführt wurde, können verwendet werden, um die Wirkung von erhöhter Expression von DNA, die für humanes OGC codiert, zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, von denen gedacht wird, daß sie Schutz vor beispielsweise pathologischen Zuständen verleihen, die mit dessen Überexpression oder Unterexpression in Verbindung stehen. In Übereinstimmung mit dieser Facette der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt, und ein reduziertes Auftreten des pathologischen Zustandes, verglichen mit nicht behandelten Tieren, die das Transgen enthalten, würde eine potentielle therapeutische Intervention für den pathologischen Zustand anzeigen.
  • Alternativ können nichthumane Homologe des OGC verwendet werden, um ein OGC "knock out"-Tier zu konstruieren, welches ein defektes oder geändertes Gen aufweist, das für OGC codiert, als ein Ergebnis der homologen Rekombination zwischen dem endogenen Gen, das für OGC codiert, und veränderter genomischer DNA, die für OGC codiert, die in eine embryonale Zelle des Tieres eingeführt wurde. Beispielsweise kann cDNA, die für OGC codiert, verwendet werden, um genomische DNA zu klonieren, die für OGC codiert, in Übereinstimmung mit etablierten Techniken. Ein Teil der genomischen DNA, die für OGC codiert, kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, so wie ein Gen, das für einen auswählbaren Marker codiert, welcher verwendet werden kann, um die Integration zu überwachen. Typischerweise werden einige Kilobasen von nichtveränderter flankierener DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) in den Vektor mit einbezogen [siehe z. B. Thomas und Capecchi, Cell, 51:503 (1987) für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren]. Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellinie (z. B. durch Elektroporation) eingeführt, und Zellen, in denen die eingeführte DNA homolog mit der endogenen DNA rekombiniert wird, werden ausgewählt [siehe z. B. Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Die ausgewählten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tieres (z. B. Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimere zu bilden [siehe z. B. Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, Hrsg. (IRL, Oxford, 1987), S. 13–152]. Ein chimerer Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoschwangeres weibliches Fostertier implantiert werden, und aus dem Embryo kann so ein "knock out"-Tier entwickelt werden. Nachkommenschaft, die die homolog rekombinierte DNA in deren Stammzellen enthält, kann durch Standardtechniken identifiziert werden und kann verwendet werden, um Tiere sich entwickeln zu lassen, in welchen alle Zellen des Tieres die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise hinsichtlich deren Fähigkeit, sich gegen gewisse pathologische Zustände zu wehren, und hinsichtlich der Entwicklung von pathologischen Zuständen aufgrund der Abwesenheit des OGC-Polypeptids charakterisiert werden.
  • Nucleinsäuren, die für die OGC-Polypeptide codieren, vorzugsweise humane OGC-Polypeptide, können ebenso bei der Gentherapie verwendet werden. Bei Gentherapieanwendungen werden Gene in Zellen eingeführt, um eine in vivo-Snthese eines therapeutisch wirksamen genetischen Produkts zu erreichen, beispielsweise für den Ersatz eines defekten Gens. "Gentherapie" beinhaltet sowohl konventionelle Gentherapie, wo ein anhaltender Effekt durch eine einzelne Behandlung erzielt wird als auch die Verabreichung gentherapeutischer Mittel, welche die einmalige oder wiederholte Verabreichung einer therapeutisch wirksamen DNA oder mRNA beinhaltet. Antisense-RNAs und -DNAs können als therapeutische Mittel zum Blockieren der Expression von gewissen Genen in vivo verwendet werden. Es wurde bereits gezeigt, daß kurze antisense-Oligonucleotide in Zellen inkorporiert werden können, wo sie als Inhibitoren agieren, trotz deren niedrigen intrazellulären Konzentrationen, die durch deren begrenzte Aufnahme durch die Zellmembran bedingt sind (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143–4146 [1986]). Die Oligonucleotide können modifiziert werden, um deren Aufnahme zu verstärken, z. B. durch Ersetzen von deren negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch ungeladene Gruppen.
  • Es gibt eine Vielzahl von Techniken, die zum Einführen von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen erhältlich sind. Die Techniken variieren abhängig davon, ob die Nucleinsäure in kultivierte Zellen in vitro oder in vivo in die Zellen des vorgesehenen Wirts transferiert werden soll. Techniken, die für den Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen in vitro geeignet sind, beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphatpräzipitationsverfahren usw. Die gegenwärtig bevorzugten in vivo-Gentransfertechniken beinhalten die Transfektion mit viralen (typischerweise retroviralen) Vektoren und virale Beschichtungsprotein-Liposom-vermittelte Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205–210 [1993]). Bei einigen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäurequelle mit einem Mittel zur Verfügung zu stellen, das die Zielzelle anstrebt, so wie einem Antikörper, der spezifisch für ein Zelloberflächenmembranprotein oder für die Zielzelle ist, einem Liganden für einen Rezeptor auf der Zielzelle usw. Wo Liposomen verwendet werden, können Proteine, die an ein Zelloberflächenmembranprotein binden, das mit Endozytose assoziiert ist, zum Anvisieren und/oder zum Vereinfachen der Aufnahme verwendet werden, z. B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, welche beim Cyclisieren eine Internalisierung unterlaufen, Proteine, die die intrazelluläre Anordnung zum Ziel haben und die intrazelluläre Halbwertszeit erhöhen. Die Technik der rezeptorvermittelten Endozytose ist beispielsweise beschrieben durch Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–44432 (1987); und Wgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414 (1990). Für einen Rückblick auf das Genmarkieren und auf Gentherapieprotokolle siehe Anderson et al., Science 256, 808–813 (1992).
  • Es wird vermutet, daß die humane OGC-Gentherapie Anwendungen beispielsweise bei der therapeutischen Verwendung für metabolische Zustände hat. Dies kann beispielsweise unter Verwendung von Techniken erreicht werden, die oben beschrieben sind, und durch Einführen eines viralen Vektors, der ein humanes OGC-Gen enthält, in gewisse Gewebe (wie Muskel oder Fett), um den metabolischen Umsatz in diesen Zielgeweben zu erhöhen und dadurch den Energieverbrauch zu erhöhen.
  • Im allgemeinen werden therapeutische Verwendungen, die humanes OGC verwenden, durch die Erfindung umfaßt. Nahrungsmittelverbrennung, Elektronentransport, Protonenpumpen und O2-Verbrauch (auf welche gemeinsam als metabolischer Umsatz Bezug genommen werden kann) sind mit der ATP-Synthese verbunden. Es kann eine "Ineffizienz" in Säugetieren geben, so daß ein Teil des metabolischen Umsatzes (in einigen Fällen kann dieser größer als 20 sein) einem H+-"Leck" zurück in den Matrixraum ohne ATP-Synthese zugeschrieben werden kann.
  • Wie in den Beispielen hierin beschrieben, ist humanes OGC in die Katalyse des H+-Lecks involviert und spielt dabei eine Rolle bei der energetischen Ineffizienz in vivo. Dementsprechend kann das Modulieren von humaner OGC-Aktivität oder von humanen OGC-Mengen (Gegenwart oder Expression) in Säugetiergeweben (insbesondere metabolisch wichtige Gewebe) gleichzeitig das H+-Leck, den metabolischen Umsatz und die Wärmeproduktion modulieren. Die Modulierung (entweder in einem Hochregulierungs- oder in einem Herunterregulierungsmodus) des metabolischen Umsatzes in einem Säugetier hat eine Vielzahl von therapeutischen Anwendungen, einschließlich der Behandlung von Übergewicht und den Symptomen, die mit einem Schlaganfall, einem Trauma (so wie einem Verbrennungstrauma), Sepsis und Infektion in Verbindung stehen.
  • Bei der therapeutischen Verwendung für Übergewicht werden Fachleute anerkennen, daß die Modulierung des mitochondrialen Membranpotentials verwendet werden kann, um den metabolischen Umsatz des Körpers zu erhöhen und dabei die Fähigkeit eines Individuums zu verstärken, Gewicht zu verlieren. Screeningassays können ausgeführt werden, um Moleküle zu identifizieren, welche die Expression oder Aktivität (so wie das Entkoppeln) von humanem OGC hochregulieren können. Moleküle, die humane OGC-Aktivität hochregulieren, senken dabei das mitochondriale Membranpotential ab. Die so identifizierten Moleküle können verwendet werden, um den metabolischen Umsatz zu erhöhen und um den Gewichtsverlust zu verstärken.
  • Bei der therapeutischen Verwendung für Kachexia werden Fachleute anerkennen, daß die Modulierung des mitochondrialen Membranpotentials verwendet werden kann, um den metabolischen Umsatz des Körpers abzusenken und dabei die Fähigkeit eines Individuums zu verstärken, Gewicht zuzulegen. Screeningassays können ausgeführt werden, um Moleküle zu identifizieren, welche die Expression oder Aktivität (so wie das Entkoppeln) von humanem OGC herunterregulieren können. Moleküle, die humane OGC-Aktivität herunterregulieren, erhöhen dabei das mitochondriale Membranpotential. Die so identifizierten Moleküle können dann verwendet werden, um den metabolischen Umsatz abzusenken und um die Gewichtszunahme zu verstärken.
  • Humanes OGC kann ebenso für diagnostische Verwendungen verwendet werden. Beispielsweise kann die Gegenwart oder die Abwesenheit von humaner OGC-Aktivität oder alternativ die Über- oder zu geringe Expression von humanem OGC in den Zellen eines Individuums detektiert werden. Der begabte Praktiker kann die Information verwenden, die aus solchen Detektionsassays resultiert, um bei der Vorhersage von metabolischen Zuständen oder von Risiko für den Beginn von Übergewicht zu assistieren. Wenn beispielsweise bestimmt wird, daß die humane OGC-Aktivität in einem Patienten unnormal hoch oder niedrig ist, könnten Therapien, so wie Hormontherapie oder Gentherapie, verabreicht werden, um die humane OGC-Aktivität oder -Expression zu einem cytologisch akzeptablen Stadium zurückzuführen.
  • Dementsprechend können die humanen OGC-Moleküle, die in dieser Anmeldung beschrieben sind, für die Diagnose nützlich sein. Beispielsweise kann die Gegenwart oder Abwesenheit von humaner OGC-Aktivität oder alternativ die Über- oder zu geringe Expression in den Zellen eines Individuums oder in Geweben unter Verwendung von Assays detektiert werden, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich derjenigen, die in den Beispielen hierunter beschrieben sind. Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren der Expression von humanem OGC (oder desen Isoformen) in einer Säugetierzelle oder einer Gewebeprobe zur Verfügung, die das In-Kontakt-Bringen einer Säugetierzelle oder einer Gewebeprobe mit einer DNA-Sonde und das Analysieren der Expression von humanem OGC mRNA-Transkript in der Probe umfaßt. Quantitative RT-PCR-Verfahren unter Verwendung von DNA-Primern und Sonden, welche isoformspezifisch sind, können ebenso verwendet werden, um bei der Quantifizierung der mRNA-Häufigkeit spezifischer Isoformen zu assistieren. Weiterhin können DNA-Array-Technologien im Stand der Technik verwendet werden, um die RNA-Häufigkeit einer oder mehrerer Isoformen zu quantifizieren. Die Probe kann verschiedene Säugetierzellen oder -gewebe umfassen, einschließlich, aber nicht limitiert auf Lebergewebe, weißes adipöses Gewebe und Skelettmuskel. Der begabte Fachmann kann die Information, die aus solch einem Detektionsassay resultiert, verwenden, um bei der Vorhersage von metabolischen Zuständen oder Beginn von Übergewicht zu assistieren. Wenn beispielsweise bestimmt wird, daß die humanen OGC-Expressions- (oder Häufigkeits-) -Spiegel oder Verteilungsspiegel in einem Patienten unnormal hoch oder niedrig sind, verglichen mit einer Kontrollsäugetierpopulation mit entsprechendem Alter und normalem Körpergewicht (oder alternativ mit einer Säugetierpopulation, die als übergewichtig diagnostiziert ist), kann eine Therapie, so wie Gentherapie, Nahrungsaufnahmekontrolle usw., verwendet werden, um das Säugetier zu behandeln.
  • Die Detektion von beeinträchtigter humaner OGC-Expression oder -funktion in dem Säugetier kann ebenso verwendet werden, um beim Diagnostizieren oder bei der therapeutischen Verwendung für eine beeinträchtigte neurale Aktivität oder eine neurale Degenerierung zu assistieren. Es ist im Stand der Technik bekannt, daß reaktive Sauerstoffspezies einen zellulären Schaden in verschiedenen Geweben verursachen können, insbesondere im Gehirngewebe, und dort insbesondere in neuronalem Gehirngewebe. Ein Anstieg der Gegenwart oder der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies wurde mit dem Down-Syndrom in Verbindung gebracht, ebenso wie mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen. Es wird vermutet, daß humanes OGC oder dessen Isoformen die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies regulieren können und eine schützende Rolle spielen können.
  • Dementsprechend werden bei der therapeutischen Verwendung für die oben beschriebenen Zustände Fachleute anerkennen, daß die Modulation von humaner OGC-Expression oder -Aktivität verwendet werden kann, um beispielsweise den metabolischen Umsatz des Körpers zu erhöhen und dadurch die Fähigkeit eines Individuums für den Gewichtsverlust zu erhöhen. Screeningassays können ausgeführt werden, um Moleküle zu identifizieren, welche die Expression oder Aktivität (so wie das Entkoppeln) von humanem OGC hochregulieren können. Die so identifizierten Moleküle können dann verwendet werden, um den metabolischen Umsatz zu erhöhen und den Gewichtsverlust zu verstärken. Die humanen OGC-Polypeptide sind bei Assays zum Identifizieren von Leitstrukturen für therapeutisch aktive Mittel nützlich, die die Expression oder Aktivität von humanem OGC modulieren. Kandidatenmoleküle oder Verbindungen können mit Säugetierzellen oder -geweben untersucht werden, um die Wirkung(en) der Kandidatenmoleküle oder -verbindungen auf die humane OGC-Expression oder -Aktivität zu bestimmen. Solche Screeningassays können für high-throughput-Screening von chemischen Libraries verwendet werden und sind insbesondere nützlich zum Identifizieren von Kleinmolekülmedikamentenkandidaten. Kleinmoleküle beinhalten, sind aber nicht limitiert auf synthetische organische oder anorganische Verbindungen. Die Assays können in einer Vielzahl von Formaten ausgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindeassays, biochemischer Screeningassays, Immunoassays, zellbasierter Assays usw. Solche Assayformate sind im Stand der Technik bekannt.
  • Dementsprechend wird in einer Ausführungsform ein Verfahren zum Ausführen eines Screeningassays zur Verfügung gestellt, um ein Molekül zu identifizieren, welches entweder die Aktivität und/oder die Expression von humanem OGC erhöht oder hochreguliert, umfassend die Schritte des Exponierens einer Säugetierzelle oder -gewebeprobe, von der vermutet wird, daß sie humanes OGC umfaßt, gegenüber einem Kandidatenmolekül und anschließendes Analysierens der Expression und/oder Aktivität von humanem OGC in dieser Probe. Bei diesem Verfahren kann die Probe weiterhin hinsichtlich des mitochondrialen Membranpotentials analysiert werden. Optional ist humanes OGC ein natives Polypeptid oder irgendeine spezifische Isoform von humanem OGC, das hierin identifiziert ist. Die Probe, die analysiert wird, kann verschiedene Säugetierzellen oder -gewebe umfassen, einschließlich, aber nicht limitiert auf menschliches Gehirngewebe und adipöses Gewebe. Der Screeningassay kann ein in vitro- oder ein in vivo-Assay sein. Beispielhaft kann ein in vivo-Screeningassay in einem transgenen Tier ausgeführt werden, wobei ein Promotor für ein humanes OGC-Gen mit einem Reportergen, so wie Luciferase oder beta-Galactosidase, verbunden sein kann. Optional kann "knock in"-Technologie in dieser Hinsicht verwendet werden, in welcher solch ein Reportergen 5' zu dem Promotor inseriert wird (welcher wiederum mit einer genomischen Sequenz verbunden ist, die für humanes OGC codiert). Solche Techniken sind im Stand der Technik bekannt. Das bei dem Screeningassay verwendete Kandidatenmolekül kann ein Kleinmolekül sein, umfassend eine synthetische organische oder anorganische Verbindung. Bei einer alternativen Ausführungsform wird der Screeningassay ausgeführt, um ein Molekül zu identifizieren, welches die Aktivität und/oder Expression von humanem OGC absenkt oder herunterreguliert. Die Wirkung(en), die solche Kandidatenmoleküle auf die Expression und/oder Aktivität von humanem OGC haben können, können mit einer Kontroll- oder Referenzprobe verglichen werden, so wie beispielsweise die Expression oder Aktivität von humanem OGC, die in einem ähnlichen Säugetier beobachtet wird.
  • B. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Agonisten oder Antagonisten von humanem OGC können in pharmazeutische Zusammensetzungen mit einbezogen werden. Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise die Agonisten oder Antagonisten und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Ein "pharmazeutisch akzeptabler Träger" beinhaltet jegliche und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und ähnliches, die mit pharmazeutischer Verabreichung kompatibel sind (Gennaro, 2000). Bevorzugte Beispiele solcher Träger oder Verdünnungsmittel beinhalten, aber sind nicht limitiert auf Wasser, Salzlösung, Finger-Lösungen, Dextroselösung und 5 % humanes Serumalbumin. Liposomen und nichtwäßrige Vehikel, so wie fixierte Öle, können ebenso verwendet werden. Außer wenn ein konventionelles Medium oder Mittel mit einer aktiven Verbindung nicht kompatibel ist, ist die Verwendung dieser Zusammensetzungen umfaßt. Zusätzlich zugesetzte aktive Verbindungen können ebenso in die Zusammensetzungen mit einbezogen werden.
  • 1. Allgemeine Erwägungen
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung des Agonisten oder Antagonisten wird so formuliert, daß sie mit dessen vorgesehenem Weg der Verabreichung kompatibel ist, einschließlich intravenöser, intradermaler, subkutaner, oraler (z. B. Inhalation), transdermaler (d. h.topisch), transmukosaler und rektaler Verabreichung. Lösungen oder Suspensionen, die für parenterale, intradermale oder subkutane Anwendung verwendet werden, können beinhalten: ein steriles Verdünnungsmittel, so wie Wasser für die Injektion, Salzlösung, fixierte Öle, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel, so wie Benzylalkohol oder Methylparaben; Antioxidantien, so wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner, so wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); Puffer, so wie Acetate, Citrate oder Phosphate, und Mittel zum Anpassen der Tonizität, so wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH kann mit Säuren oder Basen angepaßt werden, so wie Chlorwasserstoffsäure oder Natriumhydroxid. Die parenterale Präparation kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Phiolen für mehrfache Dosen, hergestellt aus Glas oder Plastik, eingeschlossen sein.
  • 2. Injizierbare Formulierungen
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Injektion geeignet sind, beinhalten sterile wäßrige Lösungen (wenn wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Präparation von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Für die intravenöse Verabreichung beinhalten geeignete Träger physiologische Salzlösung, bakteriostatisches Wasser CREMOPHOR ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) oder phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). In allen Fällen muß die Zusammensetzung steril sein und sollte fluid sein, so daß sie unter Verwendung einer Spritze verabreicht werden kann. Solche Zusammensetzungen sollten während der Herstellung und Lagerung stabil sein und müssen gegen die Kontamination mit Mikroorganismen, so wie Bakterien und Pilzen, geschützt sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, enthaltend beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (so wie Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol) und geeignete Mischungen. Eine geeignete Fluidität kann beibehalten werden beispielsweise unter Verwendung einer Beschichtung, so wie Lecithin, durch Erhalten der erforderlichen Partikelgröße in dem Fall einer Dispersion und durch Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen. Verschiedene antibakterielle oder antifungale Mittel, beispielsweise Paraben, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure und Thimerosal können Mikroorganismen als Kontaminierung enthalten. Isotonische Mittel, beispielsweise Zucker, Polyalkohole, so wie Manitol, Sorbitol und Natriumchlorid, können in die Zusammensetzung mit eingebracht werden. Zusammensetzungen, die die Absorption verzögern können, beinhalten Mittel, so wie Aluminiummonostearat und Gelatine.
  • Sterile injizierbare Lösungen können durch das Miteinbeziehen der aktiven Verbindung in der erforderlichen Menge in ein entsprechendes Lösungsmittel mit einem Inhaltsstoff oder einer Kombination von Inhaltsstoffen, wie erforderlich, hergestellt werden, gefolgt durch Sterilisierung. Im allgemeinen werden Dispersionen hergestellt durch das Miteinbeziehen der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel, das ein Grunddispersionsmedium enthält und die anderen erforderlichen Inhaltsstoffe. Verfahren für die Präparation von sterilem Pulver für die Präparation von sterilen injizierbaren Lösungen beinhalten Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen, die ein Pulver ergeben, das den aktiven Inhaltsstoff und jeglichen erwünschten Inhaltsstoff aus einer sterilen Lösung enthält.
  • 3. Orale Zusammensetzungen
  • Orale Zusammensetzungen beinhalten im allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen eßbaren Träger. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder in Tabletten komprimiert sind. Für den Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung in Hilfsstoffe eingeschlossen und in der Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können unter Verwendung eines fluiden Trägers für die Verwendung als eine Mundwaschung hergestellt werden, wobei die Verbindung in dem fluiden Träger oral angewendet wird. Pharmazeutisch kompatible Bindemittel und/oder Adjuvansmaterialien können mit eingeschlossen werden. Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und ähnliches können jegliche der folgenden Inhaltsstoffe oder Verbindungen einer ähnlichen Natur enthalten: ein Bindemittel, so wie mikrokristalline Cellulose, Tragantgummi oder Gelatine; einen Hilfsstoff, so wie Stärke oder Lactose, ein Disintegrationsmittel, so wie Alginsäure, PRIMOGEL oder Maisstärke; ein Schmiermittel, so wie Magnesiumstearat oder STEROTES; ein Gleitmittel, so wie kolloidales Siliciumdioxid; ein Süßungsmittel, so wie Sucrose oder Saccharin; oder ein Geschmacksmittel, so wie Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangengeschmack.
  • 4. Zusammensetzungen zur Inhalation
  • Für die Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen als ein Aerosolspray aus einem Vernebler oder einem unter Druck stehenden Container übertragen, der ein geeignetes Treibmittel enthält, z. B. ein Gas, so wie Kohlendioxid.
  • 5. Systemische Verabreichung
  • Eine systemische Verabreichung kann ebenso transmukosal oder transdermal erfolgen. Zur transmukosalen oder transdermalen Verabreichung werden Durchdringungsmittel ausgewählt, die die Zielbarriere(n) durchdringen können. Transmukosale Durchdringungsmittel beinhalten Detergenzien, Gallensalze und Fusidinsäurederivate. Nasensprays oder Zäpfchen können zur transmukosalen Verabreichung verwendet werden. Für die transdermale Verabreichung werden die aktiven Verbindungen als Tinkturen, Salben, Gele oder Cremes formuliert.
  • Die Verbindungen können ebenso in der Form von Zäpfchen (z. B. mit einer Basis, so wie Kakaobutter oder anderen Glyceriden) oder Retentionsklistiers für die rektale Übertragung hergestellt werden.
  • 6. Träger
  • In einer Ausführungsform werden die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, die die Verbindung gegen die schnelle Ausscheidung aus dem Körper schützen, so wie einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung, einschließlich Implantaten und mikroverkapselten Übertragungssystemen. Biologisch abbaubare oder biokompatible Polymere können verwendet werden, so wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Solche Materialien können kommerziell von ALZA Corporation (Mountain View, CA) und NOVA Pharmaceuticals, Inc. (Lake Elsinore, CA) erhalten oder durch einen Fachmann hergestellt werden. Liposomale Suspensionen können ebenso als pharmazeutisch akzeptable Träger verwendet werden. Diese können gemäß Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten bekannt sind, so wie in (Eppstein et al., US-Patent Nr. 4,522,811, 1985).
  • 7. Einheitsdosierung
  • Orale Formulierungen oder parenterale Zusammensetzungen in Einheitsdosierungsform können hergestellt werden, um die Verabreichung und die Einheitlichkeit der Dosierungen zu vereinfachen. Die Einheitsdosierungsform bezeichnet physikalisch diskrete Einheiten, die als einzelne Dosierungen für das Subjekt, das behandelt werden soll, geeignet sind, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge einer aktiven Verbindung in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger. Die Spezifizierung für die Einheitsdosierungsformen der Erfindung werden durch die einzigartigen Eigenschaften der aktiven Verbindung und den bestimmten erwünschten therapeutischen Effekt und die inhärenten Limitierungen des Compoundierens der aktiven Verbindung diktiert und hängen direkt davon ab.
  • 8. Gentherapiezusammensetzungen
  • Die Nucleinsäuremoleküle, die für humanes OGC codieren, können in Vektoren inseriert werden und als Gentherapievektoren verwendet werden. Gentherapievektoren können an ein Subjekt durch beispielsweise intravenöse Injektion, lokale Verabreichung (Nabel und Nabel, US-Patent Nr. 5,328,470, 1994) oder durch stereotaktische Injektion (Chen et al., 1994) übergeben werden. Die pharmazeutische Präparation eines Gentherapievektors kann ein akzeptables Verdünnungsmittel beinhalten oder kann eine Matrix mit langsamer Freisetzung umfassen, in welche das Genübertragungsvehikel eingebettet ist. Alternativ kann die pharmazeutische Präparation eine oder mehrere Zellen enthalten, die das Genübertragungssystem produzieren, wenn der vollständige Genübertragungsvektor intakt aus rekombinanten Zellen, z. B. retroviralen Vektoren, produziert werden kann.
  • 9. Dosierung
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin andere therapeutisch aktive Verbindungen wie hierin aufgeführt umfassen, welche normalerweise bei der Behandlung von Zuständen angewendet werden, die mit humanem OGC in Verbindung stehen.
  • Bei der Behandlung oder Vorbeugung von Zuständen, welche die humane OGC-Modulierung erfordern, wird ein angemessenes Dosierungsniveau eines Agonisten oder Antagonisten im allgemeinen etwa 0,01 bis 500 mg pro kg Körpergewicht des Patienten pro Tag betragen, was als einzelne oder mehrere Dosierungen verabreicht werden kann. Vorzugsweise wird das Dosierungsniveau etwa 0,1 bis etwa 250 mg/kg pro Tag betragen; besonders bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 100 mg/kg pro Tag. Ein geeignetes Dosierungsniveau kann etwa 0,01 bis 250 mg/kg pro Tag, etwa 0,05 bis 100 mg/kg pro Tag oder etwa 0,1 bis 50 mg/kg pro Tag betragen. Innerhalb dieses Bereichs kann die Dosierung 0,05 bis 0,5, 0,5 bis 5 oder 5 bis 50 mg/kg pro Tag betragen. Für die orale Verabreichung werden die Zusammensetzungen vorzugsweise in der Form von Tabletten zur Verfügung gestellt, die 1,0 bis 1000 Milligramm des aktiven Inhaltsstoffs, insbesondere 1,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 50,0, 75,0, 100,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 400,0 500,0, 600,0, 750,0, 800,0, 900,0 und 1000,0 Milligramm des aktiven Inhaltsstoffs für die symptomatische Anpassung der Dosierung an den Patienten, der behandelt werden soll, enthalten. Die Verbindungen können in einem Rahmen von 1- bis 4-mal am Tag verabreicht werden, vorzugsweise einmal oder zweimal pro Tag.
  • Jedoch können das spezifische Dosierungsniveau und die Häufigkeit der Dosierung für jeden bestimmten Patienten variiert werden und werden von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich der Aktivität der spezifischen Verbindung, die verwendet wird, der metabolischen Stabilität und Länge der Wirkung der Verbindung, des Alters, des Körpergewichts, des allgemeinen Gesundheitszustands, des Geschlechts, der Nahrungsaufnahme, der Art und Weise und der Zeit der Verabreichung, der Geschwindigkeit der Ausscheidung, der Medikamentenkombination, der Schwere des bestimmten Zustands und des Wirts, der die Therapie unterläuft.
  • 10. Kits für pharmazeutische Zusammensetzung
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einem Kit, einem Container, einer Packung oder einem Dispenser gemeinsam mit Instruktionen für die Verabreichung beinhaltet sein, um einen metabolischen Fehlzustand oder eine Erkrankung zu behandeln. Wenn die Erfindung als Kit zur Verfügung gestellt wird, können die unterschiedlichen Bestandteile der Zusammensetzung in einzelne Container verpackt sein und direkt vor der Verwendung miteinander vermischt werden. Solch eine separate Verpackung der Bestandteile kann eine Langzeitlagerung ohne den Verlust der Funktionen der aktiven Bestandteile erlauben.
  • Kits können Reagenzien in separaten Containern beinhalten, die die Ausführung eines spezifischen Tests erleichtern, so wie eines diagnostischen Tests oder einer Gewebetypisierung. Beispielsweise können humane OGC DNA-Templates und geeignete Primer zur internen Kontrolle zur Verfügung gestellt werden.
  • (a) Container oder Gefäße
  • Die Reagenzien, die in Kits beinhaltet sind, können in Containern jeglicher Art zur Verfügung gestellt werden, so daß die Lebensdauer der unterschiedlichen Bestandteile konserviert wird und nicht durch die Materialen des Containers adsorbiert oder geändert wird. Beispielsweise können versiegelte Glasampullen lyophilisiertes humanes OGC oder Puffer enthalten, die unter einem neutralen nichtreagierenden Gas, so wie Stickstoff, verpackt wurden. Ampullen können aus jeglichem geeigneten Material bestehen, so wie Glas, organischen Polymeren, so wie Polycarbonat, Polystyrol usw., Keramik, Metall oder jeglichem anderen Material, das typischerweise verwendet wird, um Reagenzien aufzunehmen. Andere Beispiele von geeigneten Containern beinhalten einfache Flaschen, die aus ähnlichen Substanzen wie Ampullen hergestellt werden können, und Schutzhüllen, die aus folienverkleidetem Innenleben, so wie Aluminium oder einer Legierung, bestehen können. Andere Container enthalten Teströhrchen, Phiolen, Kolben, Flaschen, Spritzen oder ähnliches. Container können einen sterilen Zugangsort haben, so wie eine Flasche, die einen Stopper aufweist, der durch eine hypoderme Injektionsnadel durchstochen werden kann. Andere Container können zwei Bereiche aufweisen, die durch eine leicht entfernbare Membran getrennt sind, was es nach deren Entfernung erlaubt, daß sich die Bestandteile vermischen. Entfernbare Membranen können aus Glas, Plastik, Gummi usw. hergestellt sein.
  • (b) Bedienungsanleitungen
  • Kits können ebenso mit Bedienungsanleitungen zur Verfügung gestellt werden. Die Anleitungen können auf Papier oder auf einem anderen Substrat gedruckt sein und/oder können als elektronisch lesbares Medium zur Verfügung gestellt werden, so wie eine Floppy disc, CD-ROM, DVD-ROM, Zip disc, Videoband, Laserdisc, Audioband usw. Detaillierte Instruktionen können nicht physisch mit dem Kit in Verbindung stehen; statt dessen kann ein Anwender auf eine Internet Website verwiesen werden, die durch den Hersteller oder Verteiler des Kits angegeben ist, oder können als elektronische Post zur Verfügung gestellt werden.
  • C. Gesamtlängenhumanes OGC
  • In gewissen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid codiert, auf das in der vorliegenden Erfindung als humanes OGC Bezug genommen wird, verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Nucleotidsequenz die mit der GenBank-Zugangsnummer NM_003562 (Tabelle 1) und AF070548 (Tabelle 2), wobei die Nucleotidsequenz von AF070548 am meisten bevorzugt ist. Aus Gründen der Einfachheit wird in der vorliegenden Beschreibung auf das Protein, für das AF070548 codiert, ebenso wie auf alle weiteren nativen Homologe und Varianten, die in der vorangegangenen Definition von humanem OGC beinhaltet sind, als "humanes OGC" Bezug genommen, unabhängig von deren Herkunft oder deren Herstellungsart.
  • Figure 00400001
  • D. Humane OGC-Varianten
  • Zusätzlich zu der gesamtlängennativen Sequenz von humanen OGC-Polypeptiden, die hierin beschrieben sind, wird in Erwägung gezogen, daß humane OGC-Varianten nützlich sein können. Humane OGC-Varianten können durch Einführen von entsprechenden Nucleotidveränderungen in die DNA des humanen OGC und/oder durch die Synthese des gewünschten humanen OGC-Polypeptids hergestellt werden. Fachleute werden anerkennen, daß Aminosäureveränderungen posttranslationale Prozesse des humanen OGC verändern können, so wie die Veränderung der Anzahl oder Position der Glycosylierungsorte oder die Veränderung der Membranankereigenschaften.
  • Variationen in der nativen Gesamtlängensequenz von humanem OGC oder in verschiedenen Domänen des humanen OGC, das hierin beschrieben ist, können ausgeführt werden beispielsweise unter Verwendung von irgendeiner der Techniken und Richtlinien für konservative und nichtkonservative Mutationen, die beispielsweise in US-Patent Nr. 5,364,934 ausgeführt sind. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehrerer Codons sein, die für humanes OGC codieren, die in einer Veränderung der Aminosäuresequenz des humanen OGC resultiert, verglichen mit der nativen Sequenz von humanem OGC. Optional findet die Variation durch Substitution von wenigstens einer Aminosäure durch irgendeine andere Aminosäure in einer oder mehreren der Domänen des humanen OGC statt. Anleitung darin, zu bestimmen, welcher Aminosäurerest inseriert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die gewünschte Aktivität negativ zu beeinflussen, kann durch den Vergleich der Sequenz des humanen OGC mit der von homologen bekannten Proteinmolekülen und durch Minimieren der Anzahl von Aminosäuresequenzveränderungen, die in Regionen mit hoher Homologie gemacht werden, gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen können das Ergebnis des Ersetzens einer Aminosäure mit einer anderen Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften sein, so wie der Ersatz eines Leucins mit einem Serin, d. h. konservative Aminosäureaustausche. Insertionen oder Deletionen können optional im Bereich von 1 bis 5 Aminosäuren sein. Die erlaubten Variationen können dadurch bestimmt werden, daß systematisch Insertionen, Deletionen oder Substitutionen. von Aminosäuren in der Sequenz gemacht werden und, wenn gewünscht, durch Testen der resultierenden Varianten hinsichtlich deren Aktivität in Assays, die im Stand der Technik bekannt oder hierin beschrieben sind.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist auf humane OGC-Varianten gerichtet, welche Fragmente des Gesamtlängen-humanen OGC sind. Vorzugsweise behalten solche Fragmente eine gewünschte Aktivität oder Eigenschaft des Gesamtlängen-humanen OGC.
  • Die Variationen können gemacht werden unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, so wie Oligonucleotid-vermittelte (site-directed) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese. Site-directed Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], Restriktionsauswahlmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] oder andere Techniken können mit der klonierten DNA ausgeführt werden, um die DNA der humanen OGC-Variante zu produzieren.
  • Die Scanningaminosäureanalyse kann ebenso verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer kontinuierlichen Sequenz zu identifizieren. Unter den bevorzugten Scanningaminosäuren sind relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren beinhalten Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanningaminosäure unter dieser Gruppe, da dies die Seitenkette hinter dem beta-Kohlenstoff eliminiert, und es ist weniger wahrscheinlich, daß dies die Hauptkettenkonformation der Variante verändert [Cunningham und Wells, Science, 244:1081–1085 (1989)). Alanin ist ebenso typischerweise bevorzugt, da es die häufigste Aminosäure ist. Weiterhin wird sie häufig sowohl in verdeckten als auch in exponierten Positionen gefunden [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Wenn die Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen von Varianten ergibt, kann eine isosterische Aminosäure verwendet werden.
  • E. Modifikationen von humanem OGC
  • Die Verwendung von kovalenten Modifikationen von humanem OGC sind innerhalb des Umfangs dieser Erfindung umfaßt. Eine Art der kovalenten Modifikation beinhaltet das Umsetzen von Targetaminosäureresten eines humanen OGC-Polypeptids mit einem organischen derivatisierenden Mittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des humanen OGC zu reagieren. Die Derivatisierung mit bifunktionalen Mitteln ist beispielsweise nützlich zum Quervernetzen von humanem OGC mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche für die Verwendung bei dem Verfahren zum Aufreinigen von antihumanen OGC-Antikörpern und umgekehrt. Gewöhnlich verwendete Quervernetzungsmittel beinhalten beispielsweise 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester, einschließlich Disuccinimidylestern, so wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionale Maleimide, so wie Bis-N-maleimido-1,8-octan, und Mittel, so wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
  • Andere Modifikationen beinhalten die Deamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen der Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung von jeglichen C-terminalen Carboxylgruppen.
  • Ein anderer Typ der kovalenten Modifikation der humanen OGC-Polypeptids, das im Umfang dieser Erfindung umfaßt ist, umfaßt das Verändern des nativen Glycosylierungsmusters des Polypeptids. "Verändern des nativen Glycosylierungsmusters" ist hierin für Zwecke vorgesehen, um das Deletieren von einem oder mehreren Kohlenhydratresten, die in humanem OGC mit nativer Sequenz gefunden werden (entweder durch Entfernen des dem zugrundeliegenden Glycosylierungsorts oder durch Deletieren der Glycosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel), und/oder das Hinzufügen von einem oder mehreren Glycosylierungsorten, die in humanem OGC mit nativer Sequenz nicht vorhanden sind, zu bezeichnen. Zusätzlich beinhaltet der Ausdruck qualitative Veränderungen der Glycosylierung des nativen Proteins, was eine Veränderung in der Natur und in den Proportionen der verschiedenen Kohlenhydratreste, die vorhanden sind.
  • Die Hinzufügung von Glycosylierungsorten zu dem humanen OGC-Polypeptid kann durch Verändern der Aminosäuresequenz erreicht werden. Die Veränderung kann beispielsweise durch die Hinzufügung oder durch Substitution von einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten in humanes OGC mit nativer Sequenz (für O-verbundene Glycosylierungsorte) erreicht werden. Die humane OGC-Aminosäuresequenz kann optional durch Veränderungen auf dem DNA-Niveau verändert werden, insbesondere durch Mutieren der DNA, die für das humane OGC-Polypeptid codiert, an vorher ausgewählten Basen, so daß die generierten Codons in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden.
  • Ein weiteres Mittel für das Erhöhen der Anzahl der Kohlenhydratreste auf dem humanen OGC-Polypeptid ist durch chemisches oder enzymatisches Koppeln von Glycosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren sind im Stand der Technik beschrieben, z. B. in WO 87/05330, publiziert am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259–306 (1981).
  • Das Entfernen der Kohlenhydratreste, die an dem humanen OGC-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch mutationale Substitution von Codons erreicht werden, die für Aminosäurereste codieren, die als Target für die Glycosylierung dienen. Chemische Deglycosylierungstechniken sind im Stand der Technik bekannt und beschrieben beispielsweise durch Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) und durch Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydratresten auf Polypeptiden kann durch die Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exoglycosidasen erreicht werden, wie beschrieben durch Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
  • Eine weitere Art der kovalenten Modifikation von humanem OGC umfaßt das Verbinden des humanen OGC-Polypeptids mit einem aus einer Vielzahl von nichtproteinösen Polymeren, z. B. Polyethylenglycol (PEG), Polypropylenglycol oder Polyoxyalkylenen, in dieser Weise ausgeführt in US-Patent Nrn. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 oder 4,179,337.
  • Das humane OGC kann ebenso so modifiziert werden, daß es ein chimeres Molekül bildet, das humanes OGC umfaßt, das mit einem anderen heterologen Polypeptid oder einer anderen heterologen Aminosäuresequenz fusioniert ist.
  • In einer Ausführungsform umfaßt solch ein chimeres Molekül eine Fusion des humanen OGC mit einem tag-Polypeptid, welches ein Epitop zur Verfügung stellt, an welches ein anti-tag-Antikörper selektiv binden kann. Das Epitop-tag wird allgemein an dem Amino- oder Carboxylterminus von humanem OGC angeordnet. Die Gegenwart solcher Epitop-getaggten Formen des humanen OGC können unter Verwendung eines Antikörpers gegen das tag-Polypeptid detektiert werden, Ebenso ermöglicht das Vorsehen eines Epitop-tags, daß das humane OGC leicht durch Affinitätsaufreinigung unter Verwendung eines anti-tag-Antikörpers oder eines anderen Typs einer Affinitätsmatrix, die an das Epitop-tag bindet, aufgereinigt werden kann. Verschiedene tag-Polypeptide und deren entsprechende Antikörper sind im Stand der Technik gut bekannt. Beispiele beinhalten Polyhistidin (poly-his)- oder Polyhistidinglycin (poly-his-gly)-tags; das flu HA tag-Polypeptid und dessen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159–2165 (1988)]; das c-myc-tag und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610–3616 ([1985)]; und das Herpes Simplex-Virus Glycoprotein D (gD)-tag und dessen Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547–553 (1990)]. Andere tag-Polypeptide beinhalten das Flag-Peptid [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204–1210 (1988)]; das KT3 Epitop-Peptid [Martin et al., Science, 255:192–194)]; ein α-Tubulin-Epitop-Peptid [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; und das T7 Gen 10-Proteinpeptid-tag [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].
  • In einer alternativen Ausführungsform kann das chimere Molekül eine Fusion des humanen OGC mit einem Immunoglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunoglobulins umfassen. Für eine bivalente Form des chimeren Moleküls (ebenso als "Immunoadhäsin" bezeichnet) könnte solch eine Fusion mit der Fc-Region eines IgG-Moleküls stattfinden. Die Ig-Fusionen beinhalten vorzugt die Substitution einer löslichen (Transmembrandomänendeletierten oder inaktivierten) Form eines humanen OGC-Polypeptids anstelle von wenigstens einer variablen Region innerhalb eines Ig-Moleküls. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Immunoglobulinfusion die Hinge-, CH2- und CH3- oder die Hinge-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen eines IgG1-Moleküls. Für die Herstellung von Immunoglobulinfusionen siehe auch US-Patent Nr. 5,428,130 vom 27. Juni 1995.
  • Das humane OGC kann ebenso auf eine Art und Weise modifiziert werden, um ein chimeres Molekül zu bilden, umfassend humanes OGC fusioniert an einen Leucinzipper. Verschiedene Leucinzipperpolypeptide sind im Stand der Technik beschrieben. Siehe z. B. Landschulz et al., Science, 240:1759 (1988); WO 94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters, 344:1991 (1994); Maniatis et al., Nature, 341:24 (1989). Fachleute werden anerkennen, daß der Leucinzipper entweder mit dem 5'- oder dem 3'-Ende des humanen OGC-Moleküls fusioniert sein kann.
  • F. Herstellung von humanem OGC
  • Die Beschreibung hierunter betrifft primär die Produktion von humanem OGC durch das Kultivieren von Zellen, die mit einem Vektor, der humane OGC-Nucleinsäure enthält, transformiert oder transfiziert worden sind. Es wird natürlich in Erwägung gezogen, daß alternative Verfahren, welche im Stand der Technik gut bekannt sind, verwendet werden können, um humanes OGC herzustellen. Beispielsweise kann die humane OGC-Sequenz oder Teile davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasentechniken hergestellt werden [siehe z. B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149–2154 (1963)]. Die Proteinsynthese in vitro kann ausgeführt werden unter Verwendung von Verfahren per Hand oder durch Automatisierung. Die automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) unter Verwendung der Instruktionen des Herstellers erreicht werden. Verschiedene Teile von humanem OGC können chemisch separat synthetisiert und unter Verwendung von chemischen oder enzymatischen Verfahren kombiniert werden, um Gesamtlängen-humanes OGC herzustellen.
  • 1. Isolieren von DNA, die für humanes OGC codiert
  • Vektoren, die humanes OGC enthalten, sind kommerziell erhältlich (InCyte Pharmaceuticals; Palo Alto, CA). Alternativ kann DNA, die für humanes OGC codiert, aus einer cDNA-Library erhalten werden, die aus einem Gewebe hergestellt wurde, von dem vermutet wird, daß es die humane OGC-mRNA enthält und es auf einem detektierbaren Niveau exprimiert. Dementsprechend kann humane OGC-DNA bequem aus einer cDNA-Library erhalten werden, die aus humanem Gewebe hergestellt wurde. Das humane OGC-codierende Gen kann ebenso aus einer genomischen Library oder durch Oligonucleotidsynthese erhalten werden.
  • Die Libraries können mit Sonden gescreent werden (so wie Antikörper auf humanes OGC oder Oligonucleotide mit wenigstens 20–80 Basen), die dafür entworfen wurden, das Gen von Interesse oder das Protein, für das das Gen codiert, zu identifizieren. Das Screenen der cDNA oder der genomischen Library mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren ausgeführt werden, so wie beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Ein alternatives Mittel, um das Gen zu isolieren, das für humanes OGC codiert, ist die Verwendung der PCR-Methodologie [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
  • Verfahren zum Screenen einer cDNA-Library sind im Stand der Technik gut bekannt. Die Oligonucleotidsequenzen, die als Sonden ausgewählt wurden, sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend unverwechselbar sein, so daß das Auftreten falscher Positiver minimiert wird. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise markiert, so daß es nach der Hybridisierung an die DNA in der gescreenten Library detektiert werden kann. Verfahren des Markierens sind im Stand der Technik gut bekannt und beinhalten die Verwendung von radioaktiven Markern wie 32P-markiertem ATP, Biotinylierung oder Enzymlabeling. Hybridisierungsumstände, einschließlich moderater Stringenz und hoher Stringenz, werden durch Sambrook et al., supra, zur Verfügung gestellt und sind oben in Abschnitt I beschrieben.
  • Sequenzen, die durch solche Library-Screenverfahren identifiziert wurden, können verglichen und mit anderen bekannten Sequenzen aneinandergelagert werden, die in öffentlichen Datenbanken deponiert und aus ihnen erhältlich sind, so wie der GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken. Sequenzidentität (entweder auf dem Aminosäure- oder Nucleotidniveau) innerhalb definierter Bereiche des Moleküls oder über die gesamte Sequenzlänge kann durch Sequenzalignment unter Verwendung von Computersoftwareprogrammen wie BLAST, BLAST2, ALIGN, DNAstar und INHERIT bestimmt werden, um die Identität oder die Positiven für den Sequenzvergleich zu messen.
  • 2. Auswahl und Transformation von Wirtszellen
  • Wirtszellen werden mit Expressions- oder Klonierungsvektoren, die hierin für die humane OGC-Produktion beschrieben sind, transfiziert oder transformiert und in einer konventionellen Nahrungsmittellösung kultiviert, die so modifiziert ist, daß sie zum Induzieren der Promotoren, zur Auswahl der Transformanten oder zum Amplifizieren der Gene, die für die gewünschten Sequenzen codieren, geeignet ist. Die Kulturbedingungen, so wie Medium, Temperatur, pH und ähnliches können durch den begabten Fachmann ohne unangemessenes Herumexperimentieren ausgewählt werden. Im allgemeinen können Prinzipien, Protokolle und praktische Techniken zum Maximieren der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, Hrsg. (IRL Press, 1991] und Sambrook et al., supra, gefunden werden.
  • Verfahren für die Transfektion sind dem durchschnittlich begabten Fachmann bekannt, beispielsweise Calciumphosphat und Elektroporation. Abhängig von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken ausgeführt, die für solche Zellen angemessen sind. Die Calciumbehandlung, die Calciumchlorid verwendet, wie durch Sambrook et al, supra, beschrieben, oder Elektroporation wird im allgemeinen für Prokaryonten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird für die Transformation von gewissen Pflanzenzellen verwendet, wie beschrieben durch Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) und WO 89/05859, publiziert am 29. Juni 1989. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphatpräzipitierungsverfahren von Graham und van der Eb, Virology, 52:456–457 (1978) verwendet werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierwirtszellsystemtransformationen wurden in US-Patent Nr. 4,399,216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise ausgeführt gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Jedoch können auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, so wie durch Kern-Mikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyornithin, ebenso verwendet werden. Für verschiedene Techniken zum Transformieren von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527–537 (1990) und Mansour et al., Nature, 336:348–352 (1988).
  • Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in den Vektoren hierin beinhalten Prokaryontenzellen, Hefezellen oder höhere Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryonten beinhalten, aber sind nicht limitiert auf Eubacteria, so wie gramnegative oder grampositive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, so wie E. coli. Verschiedene E. coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, so wie der E. coli K12-Stamm MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli-Stamm W3110 (ATCC 27,325) und K5 772 (ATCC 53,635).
  • Zusätzlich zu Prokaryonten sind eukaryotische Mikroben, so wie filamentöse Fungi oder Hefen, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für humane OGC-codierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein gewöhnlich verwendeter Wirtsorganismus eines niederen Eukaryoten.
  • Geeignete Wirtszellen für die Expression von glycosyliertem humanem OGC werden von multizellulären Organismen abgeleitet. Beispiele von Zellen wirbelloser Organismen beinhalten Insektenzellen, so wie Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, ebenso wie Pflanzenzellen. Beispiele von nützlichen Säugetierwirtszellen beinhalten Chinesische Hamster-Eierstockzellen (CHO-Zellen) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele beinhalten die Affennieren-CVl-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651; die humane embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert für das Wachstum in Suspensionskulturen, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Chinesische Hamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243–251 (1980)); humane Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); humane Leberzellen (Hep G2, HB 8065), und Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Die Auswahl der angemessenen Wirtszelle liegt innerhalb der Begabung des Durchschnittsfachmanns.
  • 3. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
  • Die Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA) die für humanes OGC codiert, kann in einen replizierbaren Vektor zum Klonieren (Amplifizierung der DNA) oder zur Expression inseriert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in der Form eines Plasmids, eines Cosmids, eines viralen Partikels oder einer Phage vorliegen. Die entsprechende Nucleinsäuresequenz kann in einen Vektor durch eine Vielfalt von Verfahren inseriert werden. Im allgemeinen wird DNA in einen entsprechenden Restriktionsendonucleaseort (oder Orte) unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, inseriert. Vektorbestandteile beinhalten im allgemeinen eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminierungssequenz, sind aber nicht limitiert hierauf. Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, enthaltend einen oder mehrere dieser Bestandteile, verwendet Standardligierungstechniken, welche dem begabten Fachmann bekannt sind.
  • Das humane OGC kann rekombinant nicht nur direkt produziert werden, sondern ebenso als Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid, welches eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einem spezifischen Spaltort an dem N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im allgemeinen kann die Signalsequenz ein Bestandteil des Vektors sein oder kann ein Teil der DNA sein, die für humanes OGC codiert, die in den Vektor inseriert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryontische Signalsequenz sein, ausgewählt beispielsweise aus der Gruppe, bestehend aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, lpp oder hitzestabilen Enterotoxin II-Leadersequenzen. Für die Hefesekretion kann die Signalsequenz z. B. die Hefeinvertase-Leadersequenz, α-Faktor-Leadersequenz (einschließlich Saccharomyces und Kluyveromyces α-Faktor-Leadersequenzen, wobei die letzteren in US-Patent Nr. 5,010,182 beschrieben sind) oder Säurephosphatase-Leadersequenz, die C. albicans Glucoamylase-Leadersequenz ( EP 362,179 , publiziert am 4. April 1990) oder das Signal, das in WO 90/13646, publiziert am 15. November 1990, beschrieben wurde, sein. Bei der Expression in Säugetierzellen können Säugetiersignalsequenzen verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu steuern, so wie Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden von der gleichen Spezies oder von verwandten Spezies, ebenso wie virale Sekretionsleadersequenzen.
  • Sowohl die Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefen und Viren gut bekannt. Der Ursprung der Replikation von dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der 2 μm-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind zum Klonieren von Vektoren in Säugetierzellen nützlich.
  • Expressions- und Klonierungsvektoren werden typischerweise ein Selektionsgen enthalten, auch selektierbarer Marker genannt. Typische Selektionsgene codieren für Proteine, die (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Defizite komplementieren oder (c) kritische Nahrungsstoffe zur Verfügung stellen, die aus dem komplexen Medium nicht erhältlich sind, z. B. das Gen, das für D-Alaninracemase für Bacilli codiert.
  • Ein Beispiel von geeigneten auswählbaren Markern für Säugetierzellen sind diejenigen, die die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die kompetent dafür sind, die humane OGC-codierende Nucleinsäure aufzunehmen, so wie DHFR oder Thymidinkinase. Eine angemessene Wirtszelle, wenn Wildtyp-DHFR verwendet wird, ist die CHO-Zellinie, der die DHFR-Aktivität fehlt, hergestellt und propagiert wie beschrieben durch Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Ein geeignetes Selektionsgen für die Verwendung bei Hefe ist das trp1-Gen, das in dem Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Stamm der Hefe zur Verfügung, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
  • Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten normalerweise einen Promotor, der operabel mit der Nucleinsäuresequenz verbunden ist, die für das humane OGC codiert, um die mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die durch eine Vielzahl von potentiellen Wirtszellen erkannt werden, sind gut bekannt. Promotoren, die für die Verwendung mit prokaryontischen Wirten geeignet sind, beinhalten die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776 ] und Hybridpromotoren, so wie den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21–25 (1983)]. Promotoren für die Verwendung bei bakteriellen Systemen werden ebenso eine Shine-Dalgarno (S.D.)-Sequenz enthalten, die operabel mit der DNA verbunden ist, die für humanes OGC codiert.
  • Beispiele von geeigneten Promotorsequenzen für die Verwendung mit Hefen beinhalten die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] oder andere glycolytische Enzyme [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], so wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
  • Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind mit dem zusätzlichen Vorteil, daß die Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert ist, sind die Promotorbereiche für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Säurephosphatase, degradative Enzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus in Verbindung stehen, Metallothionein, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwendung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung bei der Hefeexpression sind weiter in EP 73,657 beschrieben.
  • Humane OGC-Transkription aus Vektoren in Säugetierwirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren, so wie Polyomavirus, Fowlpoxvirus (UK 2,211,504, publiziert am 5. Juli 1989), Adenovirus (so wie Adenovirus 2), bovinem Papillomavirus, Aviansarcomavirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z. B. dem Actinpromotor oder einem Immunoglobulinpromotor, und aus Hitzeschockpromotoren erhalten wurden, vorausgesetzt, daß solche Promotoren mit den Wirtszellsystem kompatibel sind.
  • Die Transkription einer DNA, die für das humane OGC codiert, durch höhere Eukaryoten, kann durch das Einfügen einer Enhancersequenz in den Vektor verstärkt werden. Enhancer sind cis-agierende Elemente der DNA, normalerweise etwa von 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um dessen Transkription zu erhöhen. Viele Enhancersequenzen sind nun aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwenden. Beispiele beinhalten den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Ursprungs der Replikation (bp 100–270), den Cytomegalovirus-Frühpromotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Ursprungs der Replikation und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor bei einer Position 5' oder 3' der humanen OGC-Sequenz gespleißt werden, ist jedoch vorzugsweise an der 5'-Seite des Promotors angeordnet.
  • Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Fungi-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, humane Zellen oder Zellen mit einem Zellkern aus anderen multizellulären Organismen) verwendet werden, werden ebenso Sequenzen enthalten, die für die Terminierung der Transkription und zum Stabilisieren der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind normalerweise aus untranslatierten Bereichen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs vom 5'-Ende und gelegentlich vom 3'-Ende erhältlich. Diese Bereiche enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente in dem nichttranslatierten Bereich der mRNA, die für humanes OGC codiert, transkribiert werden.
  • Noch weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für die Adaptation an die Synthese von humanem OGC in rekombinanten Wirbeltierzellkulturen geeignet sind, sind in Gething et al., Nature, 293:620–624 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40–46 (1979); EP 117,060 ; und EP 117,058 beschrieben.
  • 4. Detektieren der Genamplifikation/Expression
  • Die Genamplifikation und/oder Expression kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch konventionelles Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription der mRNA zu quantifizieren [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201–5205 1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder durch in situ-Hybridisierung, unter Verwendung einer entsprechend markierten Sonde, basierend auf den Sequenzen, die hierin zur Verfügung gestellt werden. Alternativ können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe erkennen, einschließlich DNA-Duplexen, RNA-Duplexen und DNA-RNA-Hybridduplexen oder DNA-Protein-Duplexen. Die Antikörper können wiederum markiert sein und der Assay kann ausgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, so daß nach der Bildung des Duplexes auf der Oberfläche die Gegenwart eines Antikörpers, der an den Duplex gebunden ist, detektiert werden kann.
  • Die Genexpression kann alternativ durch immunologische Verfahren gemessen werden, so wie immunohistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeabschnitten, und durch einen Assay der Zellkultur- oder Körperfluide, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für das immunohistochemische Färben und/oder den Assay der Probenfluide geeignet sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jeglichem Säugetier hergestellt werden. Bequemerweise können die Antikörper gegen humane OGC-Polypeptide mit nativer Sequenz oder gegen ein synthetisches Peptid oder gegen exogene Sequenzen, die mit humaner OGC-DNA fusioniert sind und für ein spezifisches Antikörperepitop codieren, hergestellt werden.
  • 5. Aufreinigung des Polypeptids
  • Formen von humanem OGC können aus Kulturmedium oder Wirtszellysaten zurückgewonnen werden. Wenn sie membrangebunden sind, können sie von der Membran unter Verwendung einer geeigneten Detergenzlösung (z. B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung freigesetzt werden. Zellen, die bei der Expression von humanem OGC verwendet werden, können durch verschiedene physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen werden, so wie Gefrier-Tau-Zyklen, Sonifizierung, mechanischen Aufbruch oder zellysierende Mittel.
  • Es kann gewünscht. werden, humanes OGC aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden aufzureinigen. Die folgenden Verfahren sind beispielhaft für geeignete Aufreinigungsverfahren: durch Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Siliciumdioxid oder auf einem Kationenaustauschharz, so wie DEAE; Chromatofokussieren; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatpräzipitierung; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Protein A-Sepharose-Säulen, um Kontaminanten, so wie IgG, zu entfernen; und Metallchelat-bildende Säulen, um Epitopgetaggte Formen von humanem OGC zu binden. Verschiedene Verfahren zur Proteinaufreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise beschrieben in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Der Aufreinigungsschritt/die Aufreinigungsschritte werden beispielsweise von der Natur des Herstellungsverfahrens, das verwendet wird und dem besteimmten humanen OGC, das produziert wird, abhängen.
  • G. Anti-humane OGC-Antikörper
  • In gewissen Ausführungsformen können anti-humane OGC-Antikörper verwendet werden. Beispielhafte Antikörper beinhalten polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper.
  • 1. Polyklonale Antikörper
  • Die anti-humanen OGC-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind dem begabten Fachmann bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier gezogen werden, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, wenn gewünscht, einer Adjuvans. Typischerweise wird das Immunisierungsmittel und/oder die Adjuvans in das Säugetier durch mehrfache subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert. Das Immunisierungsmittel kann das humane OGC-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon enthalten. Es kann nützlich sein, das Immunisierungsmittel an ein Protein zu konjugieren, von dem bekannt ist, daß es in dem immunisierten Säugetier immunogen wirkt. Beispiele solcher immunogenen Proteine beinhalten, sind aber nicht limitiert auf keyhole limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, Bovinthyroglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor. Beispiele von Adjuvantien, welche verwendet werden können, beinhalten Freund's vollständiges Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl Lipid A, synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Das Immunisierungsprotokoll kann durch den Fachmann ohne unangemessenes Herumexperimentieren ausgewählt werden.
  • 2. Monoklonale Antikörper
  • Die antihumanen OGC-Antikörper können alternativ monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können durch Hybridomaverfahren hergestellt werden, so wie diejenigen, die durch Kohler und Milstein, Nature, 256:495 (1975) beschrieben wurden. Bei einem Hybridomaverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes angemessenes Wirtstier typischerweise mit einem Immunisierungsmittel immunisiert, um Lymphozyten herauszufordern, die Antikörper produzieren oder in der Lage sind, solche Antikörper zu produzieren, die spezifisch an das Immunisierungsmittel binden werden. Alternativ können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
  • Das Immunisierungsmittel wird typischerweise das humane OGC-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon enthalten. Im allgemeinen werden entweder periphere Blutlymphozyten ("PBLs") verwendet, wenn Zellen humaner Herkunft gewünscht werden, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen, wenn nichthumane Säugetierquellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zellinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, so wie Polyethylenglycol, fusioniert, um eine Hybridomazelle zu bilden [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), S. 59–103]. Immortalisierte Zellinien sind gewöhnlicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomazellen von Nagetier-, Rinder- und humaner Herkunft. Normalerweise werden Ratten- oder Maus-Myelomazellinien verwendet. Die Hybridomazellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder das Überleben der nichtfusionierten immortalisierten Zellen hemmen. Beispielsweise, wenn den parentalen Zellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Kulturmedium für die Hybridoma typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium") enthalten, wobei die Substanzen das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern.
  • Bevorzugte immortalisierte Zellen sind diejenigen, die effizient fusionieren, ein hohes Expressionsniveau des Antikörpers durch ausgewählte Antikörperproduzierende Zellen stabil unterstützen und gegenüber einem Medium, so wie HAT-Medium, sensitiv sind. Bevorzugtere immortalisierte Zellinien sind mausartige Myelomalinien, welche beispielsweise von dem Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California und der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten werden können. Humane Myeloma- und Maus-humane Heteromyelomazellinien wurden ebenso für die Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern beschrieben [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), S. 51–63].
  • Das Kulturmedium, in welchem die Hybridomazellen kultiviert werden, kann hinsichtlich der Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, die gegen humanes OGC gerichtet sind, durch einen Assay getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindespezifität von monoklonalen Antikörpern, die durch Hybridomazellen produziert werden, durch Immunopräzipitation oder durch einen in vitro-Bindeassay, so wie einen radioaktiven Immunoassay (RIA) oder enzymverbundenen Immunoabsorbensassay (ELISA), bestimmt. Solche Techniken und Assays sind im Stand der Technik bekannt. Die Bindeaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980) bestimmt werden.
  • Nachdem die gewünschten Hybridomazellen identifiziert wurden, können die Klone durch limitierende Verdünnungsverfahren subkloniert werden und durch Standardverfahren wachsen gelassen werden [Goding, supra]. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck beinhalten beispielsweise Dulbeccos's Modified Eagle's Medium und RPMI-640 Medium. Alternativ können die Hybridomazellen in vivo als Aszites in einem Säugetier wachsen gelassen werden.
  • Die monoklonalen Antikörper, die durch die Subklone ausgeschieden werden, können aus dem Kulturmedium oder dem Aszitesfluid durch konventionelle Immunoglobulinaufreinigungsverfahren, so wie beispielsweise Protein A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, isoliert oder aufgereinigt werden.
  • Die monoklonalen Antikörper können ebenso durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden, so wie diejenigen, die in US-Patent Nr. 4,816,567 beschrieben sind. DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung codiert, kann leicht unter Verwendung von konventionellen Verfahren isoliert und sequenziert werden (z. B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten der murinen Antikörper codieren). Die Hybridomazellen der Erfindung dienen als bevorzugte Quelle solcher DNA. Sobald sie isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren angeordnet werden, welche dann in Wirtszellen transfiziert werden, so wie Affen-COS-Zellen, Chinesische Hamster-Eierstockzellen (CHO-Zellen) oder Myelomazellen, die sonst kein Immunoglobulinprotein produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten. Die DNA kann beispielsweise ebenso durch Substituieren der codierenden Sequenz für die humanen konstanten Schwer- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen murinen Sequenzen (US-Patent Nr. 4,816,567; Morrison et al., supra] oder durch kovalentes Verbinden der gesamten codierenden Sequenz für ein Nicht-Immunoglobulin-Polypeptid oder eines Teils davon mit der Immunoglobulin-codierenden Sequenz modifiziert werden. Solch ein Nicht-Immunoglobulin-Polypeptid kann für die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung substituiert werden oder kann für die variablen Domänen eines ein-Antigen-Kombinierungsorts eines Antikörpers der Erfindung substituiert werden, um einen chimeren bivalenten Antikörper zu erhalten.
  • Die Antikörper können monovalente Antikörper sein. Verfahren zum Herstellen von monovalenten Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise involviert ein Verfahren die rekombinante Expression der Immunoglobulin-leichten Kette und der modifizierten schweren Kette. Die schwere Kette ist im allgemeinen an irgendeinem Punkt in der Fc-Region trunkiert, um so zu vermeiden, daß sich die schweren Ketten quervernetzen. Alternativ werden die relevanten Cysteinreste mit anderen Aminosäureresten substituiert oder deletiert, um so ein Quervernetzen zu vermeiden.
  • In vitro-Verfahren sind ebenso zum Herstellen von monovalenten Antikörpern geeignet. Der Verdau von Antikörpern, um Fragmente davon zu produzieren, insbesondere Fab-Fragmente, kann unter Verwendung von Techniken erreicht werden, die routinegemäß im Stand der Technik bekannt sind.
  • 3. Humane und humanisierte Antikörper
  • Die anti-humanen OGC-Antikörper der Erfindung können weiterhin humanisierte Antikörper oder humane Antikörper umfassen. Humanisierte Formen von nicht-humanen (z. B. murinen) Antikörpern sind chimere Immunoglobuline, Immunoglobulinketten oder Fragmente davon (so wie Fv, Fab, Fab', Fab')2 oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), welche eine minimale Sequenz enthalten, die von nicht-humanem Immunoglobulin abgeleitet ist. Humanisierte Antikörper beinhalten humane Immunoglobuline (Empfängerantikörper), bei welchen Reste einer komplementären Bestimmungsregion (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR von nicht-humanen Spezies (Donorartikörper), so wie Maus, Ratte oder Kaninchen, die die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapazität haben, ersetzt werden. In einigen Fällen werden Fv-Rahmenreste des humanen Immunoglobulins durch entsprechende nicht-humane Peste ersetzt. Humanisierte Antikörper können ebenso Reste umfassen, welche weder in dem Empfängerantikörper noch in dem importierten CDR oder in Rahmensequenzen gefunden werden. Im allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im wesentlichen alle von wenigstens einer und typischerweise von zwei variablen Domänen, in welchen alle oder im wesentlichen alle der CDR-Regionen denjenigen eines nicht-humanen Immunoglobulins entsprechen und alle oder im wesentlicher. alle der FR-Regionen diejenigen einer humanen Immunoglobulinkonsenssequenz sind, umfassen. Der humanisierte Antikörper wird optimalerweise ebenso wenigstens einen Teil einer Immunoglobulin-konstanten Region- (Fc) umfassen, typischerweise die eines humanen Immunoglobulins [Jones et al., Nature, 321:522–525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593–596 (1992)].
  • Verfahren zum Humanisieren von nichthumanen Antikörpern sind im Stand der Technik gut bekannt. Im allgemeinen hat ein humanisierter Antikörper eine oder mehrere Aminosäuresequenzen, die in ihn aus einer Quelle, die nichthuman ist, eingeführt wurden. Diese nichthumanen Aminosäuresequenzen werden oft "Import"-Reste genannt, welche typischerweise einer "Import"-variablen Domäne entnommen wurden. Die Humanisierung kann im wesentlichen folgend dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern ausgeführt werden [Jones et al., Nature, 321–525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534–1536 (1988)] durch Substituieren von Nagetier-CDRs oder CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines humanen Antikörpers. Dementsprechend sind solche "humanisierten" Antikörper chimere Antikörper (US-Patent Nr. 4,816,567), wobei im wesentlichen weniger als eine intakte humane variable Domäne durch die entsprechende Sequenz einer nichthumanen Spezies substituiert worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise humane Antikörper, bei welchen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste von analogen Orten in Nagetierantikörpern substituiert worden sind.
  • Humane Antikörper können ebenso unter Verwendung verschiedener Techniken produziert werden, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich Phagendisplay-Libraries [Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Die Techniken von Cole et al. und Boerner et al. sind ebenso für die Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern erhältlich (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985) und Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86–95 (1991)]. Auf ähnliche Art und Weise können humane Antikörper durch Einführen von humanen Immunoglobulinloci in transgene Tiere, z. B. Mäuse, bei welchen die endogenen Immunoglobulingene teilweise oder vollständig inaktiviert wurden, hergestellt werden. Nach der Challenge wird eine humane Antikörperproduktion beobachtet, welche stark dem ähnelt, was in Menschen in jeglicher Hinsicht gesehen wird, einschließlich der Genanordnung, des Aufbaus und des Antikörperrepertoires. Diese Herangehensweise ist beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 und in den folgenden wissenschaftlichen Publikationen: Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856–859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845- 51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg und Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65–93 (1995) beschrieben.
  • 4. Bispezifische Antikörper
  • Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise humane oder humanisierte Antikörper, die Bindespezifitäten für wenigstens zwei unterschiedliche Antigene haben. In dem vorliegenden Fall ist eine der Bindespezifitäten für humanes OGC, und die andere ist für jegliches andere Antigen und vorzugsweise für ein Zelloberflächenprotein oder einen -rezeptor oder eine -rezeptoruntereinheit.
  • Verfahren zum Herstellen von bispezifischen Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt. Traditionell basiert die rekombinante Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Co-Expression von zwei Immunoglobulin-Schwerketten/Leichtkettenpaaren, wo die zwei Schwerketten unterschiedliche Spezifitäten haben [Milstein und Cuello, Nature, 305:537–539 (1983)]. Aufgrund der zufälligen Auswahl von Immunoglobulin-Schwer- und Leichtketten produzieren diese Hybridoma (Quadroma) eine potentielle Mischung aus zehn unterschiedlichen Antikörpermolekülen, von denen lediglich eines die korrekte bispezifische Struktur hat. Die Aufreinigung des richtigen Moleküls wird normalerweise durch Affinitätschromatographieschritte erreicht. Ähnliche Verfahren sind in WO 93/08829, publiziert am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J., 10:3655–3659 (1991) offenbart.
  • Variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindespezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinierungsorte) können in die Immunoglobulin-konstanten Domänensequenzen fusioniert werden. Die Fusion findet vorzugsweise mit einer Immunoglobulin-Schwerketten-konstanten Domäne statt, umfassend wenigstens einen Teil der Hinge-, CH2- und CH3-Regionen. Es ist bevorzugt, die erste Schwerketten-konstante Region (CH1), die den Ort enthält, der für das Binden der leichten Kette erforderlich ist, in wenigstens einer der Fusionen zu haben. DNAs, die die Immunoglobulin-Schwerketten-Fusionen enthalten und, wenn gewünscht, die Immunoglobulin-Leichtketten, werden in separate Expressionsvektoren inseriert und werden in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Weitere Details über das Herstellen von bispezifischen Antikörpern sind beispielsweise in Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) beschrieben.
  • 5. Heterokonjugatantikörper
  • Heterokonjugatantikörper befinden sich ebenso im Umfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugatantikörper sind aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern zusammengesetzt. Solche Antikörper wurden beispielsweise dafür vorgeschlagen, Immunsystemzellen auf nicht gewünschte Zellen hinzuweisen [US-Patent Nr. 4,676,980], und ebenso für die Behandlung von HIV-Infektion [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 ]. Es wird in Erwägung gezogen, daß die Antikörper in vitro unter Verwendung von bekannten Verfahren in der synthetischen Proteinchemie hergestellt werden können, einschließlich derjenigen, die Quervernetzungsmittel beinhalten. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Bilden einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele von geeigneten Reagenzien zu diesem Zweck beinhalten Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat und diejenigen, die beispielsweise in US-Patent Nr. 4,676,980 offenbart sind.
  • H. Verwendungen für anti-humane OGC-Antikörper
  • Die anti-humanen OGC-Antikörper der Erfindung haben verschiedene Verwendungszwecke. Beispielsweise können anti-humane OGC-Antikörper in diagnostischen Assays für humanes OGC verwendet werden, z. B. zum Detektieren seiner Expression in spezifischen Zellen oder Geweben. Verschiedene diagnostische Assaytechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, können verwendet werden, so wie kompetitive Bindeassays, direkte oder indirekte Sandwichassays und Immunopräzipitierungsassays, ausgeführt in entweder heterogenen oder homogenen Phasen [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987), S. 147–158]. Die Antikörper, die bei den diagnostischen Assays verwendet werden, können mit einer detektierbaren Einheit markiert werden. Die detektierbare Einheit sollte in der Lage sein, entweder direkt oder indirekt ein detektierbares Signal zu produzieren. Beispielsweise kann die detektierbare Einheit ein radioaktives Isotop sein, so wie 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I, eine fluoreszente oder chemilumineszente Verbindung, so wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, so wie alkalische Phosphatase, beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase. Jegliches Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, um den Antikörper an eine detektierbare Einheit zu binden, kann verwendet werden, einschließlich derjenigen Verfahren, die durch Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982) offenbart sind.
  • Anti-humane OGC-Antikörper sind ebenso für die Affinitätsaufreinigung von humanem OGC aus rekombinanten Zellkulturen oder natürlichen Quellen nützlich. Bei diesem Verfahren werden Antikörper gegen humanes OGC auf einem geeigneten Träger immobilisiert, so wie Sephadex-Harz oder Filterpapier, unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit einer Probe in Kontakt gebracht, die das humane OGC enthält, das aufgereinigt werden soll, und danach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, der im wesentlichen sämtliches Material in der Probe außer dem humanen OGC entfernen wird, welches an den immobilisierten Antikörper gebunden ist. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das das humane OGC von dem Antikörper freisetzen wird.
  • Die folgenden Beispiele werden lediglich für illustrative Zwecke angeboten und sind nicht dafür vorgesehen, den Umfang der Erfindung in irgendeiner Art und Weise einzuschränken.
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel beschreibt die überraschende Fähigkeit von humanem OGC, als ein Entkopplungsprotein zu wirken. Die Überexpression von humanem OGC in 293-Zellen senkte Δψm in den Zellen ebenso wirksam wie UCP3 ab. Somit kann humanes OGC den Metabolismus durch Ändern der Zellatmung beeinflussen.
  • In einem Experimentensatz, um zu bestimmen, ob ein putatives UCP, wenn es überexprimiert wird, Δψm absenken konnte, wurde humanes OGC als negative Kontrolle ausgewählt. Diese Herangehensweise war logisch basierend auf der elektroneutralen Natur des 2-Oxoglutarat2–/Malat2–-Austausches, der durch den Träger katalysiert wird [siehe Indiveri et al., (1987) J. Biol. Chem. 262(33):15979–15983], dessen klarer Anordnung in der mitochondrialen inneren Membran [Palmisano et al., (1998) Biochem. J. 333:151–158] und dessen bekannter fehlender Wirkung auf die mitochondriale Funktion in OGC-transformierten Hefen [Sanchis et al., (1998) J. Biol. Chem. 273/51):34611–34615].
  • Überraschenderweise verminderte die Überexpression von humanem OGC signifikant Δψm, was eine vorher nichtbekannte Entkopplungsaktivität dieses Proteins signalisierte. Tatsächlich war OGC fast so wirkungsvoll wie UCP3 beim Verursachen eines Abfalls in Δψm von 293-Zellen, wie durch die Anzahl an Zellen, die einen abgesenkten Δψm aufzeigten, eingeschätzt wurde. Basierend auf solchen Resultaten konnte man die Möglichkeit nicht ausschließen, daß OGC (und vielleicht andere Träger, von denen gegenwärtig nicht gedacht wird, daß sie eine Entkopplungsaktivität haben) das globale Protonenleck in Säugetieren beeinflussen könnte.
  • Materialien und Verfahren, die bei diesem Beispiel verwendet wurden
  • Expressionskonstrukte
  • Eine Gesamtlängen-humane 2-Oxoglutarat-cDNA, kloniert in pINCY (Klon 2581467; pINCY-huOGC) wurde von InCyte Pharmaceuticals (Palo Alto, CA, USA) erworben und in pRK5E zu Expressionsanalysen subkloniert (pRK5E-huOGC). Verglichen mit der publizierten Sequenz. [Iacobazzi, V., Palmieri, F., Runswick, M.J. und Walker, I.E. (1992), DNA-Sequenz 3:79–88] (GenBank-Zugang NM 003562) zeigt pRK5E-huOGC eine Differenz (G→A) bei Position 36 (relativ zum Start-ATG) auf und codiert für ein Protein mit einem einzelnen Aminosäurenunterschied (M12I). Jedoch entspricht pRK5E-huOGC dem Klon 24408 in der öffentlichen Datenbank (GenBank-Zugang AF070548). Weiterhin codiert pRK5E-huOGC für die häufigste Form von OGC in Menschen, da die sorgfältige Durchsicht von InCyte und öffentlichen EST-Datenbanken ergibt, daß die pRK5E-huOGC-Proteinsequenz den entsprechenden Bereichen der ESTs entsprechen, die von wenigstens 22 separaten humanen cDNA-Libraries abgeleitet sind (wohingegen die publizierte Sequenz keinem der EST an Aminosäureposition 12 entsprach). Die Konstruktion des pcDNA3-UCP3-Expressionsvektors ist anderswo beschrieben [Mao, W., Yu, X.X., Zhong, A., Li, W., Brush, J., Sherwood, S.W., Adams, S.H. und Pan, G. (1999), FEBS Letters 443:326-330].
  • Mitochondriale Membranpotentialmessungen
  • Transfektionen und Messungen von Δψm wurden ausgeführt unter Verwendung von Protokollen, die vorher beschrieben wurden [Yu et al., FASEB J., Aug. 2000; 14(11):1611–8]. 293-Zellen wurden mit pGreen Lantern-1 (green fluorescent protein, GFP; GIBCO BRL) gemeinsam mit pRK7-Vektor alleine (Kontrolle) oder mit den Expressionsvektoren enthaltend humanes OGC oder UCP3 (siehe oben) co-transfiziert. Ungefähr 24 h danach wurden die behandlungsbezogenen Unterschiede bezüglich Δψm in green-fluorescent protein (GFP)-positiven Zellen durch Aufzeichnen von Veränderungen der Fluoreszenzintensität des Δψm-sensitiven Farbstoffs TMRE (Tetramethylrhodaminethylester; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) bestimmt. Der Grad der Verringerung von Δψm wurde durch die Verschiebung der relativen Anzahl der Zellen, die ein abgesenktes Δψm aufzeigten, überprüft. Die Transfektionsprotokolle, die hierin verwendet wurden, resultierten in einer wenigstens 30-fachen Überexpression jedes Gens, eingeschätzt gemäß Realzeit RT-PCR-Analyse der mRNA-Häufigkeit.

Claims (19)

  1. Ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen die das Entkoppeln bewirken, umfassend: (a) in Kontakt bringen einer menschlichen Zelle oder einer Säugetiergewebeprobe mit einer Kandidaten-Verbindung; (b) Analysieren der Expression eines Polypeptids umfassend eine Aminosäuren-Sequenz mit wenigstens 90% Sequenz-Identität zu einem Polypeptid, für das die SEQ ID Nr. 1 oder 2, wie in den Tabellen 1, 2 zur Verfügung gestellt, kodiert, innerhalb der Probe; und (c) Analysieren des mitochondrialen Membranpotenzials.
  2. Ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine Polypeptid-Variante mit wenigstens 90 % Sequenz-Identität zu einem Polypeptid, für das die SEQ ID Nr. 1 oder 2 kodiert, wie durch die Tabellen 1 und 2 zur Verfügung gestellt, Entkopplungs-Aktivität hat, umfassend: (a) in-Kontakt-bringen einer Säugetier-Zelle mit einer Nukleinsäure, die für die Polypeptid-Variante kodiert, von der vermutet wird, dass sie Entkopplungs-Aktivität hat, wobei die Polypeptid-Variante anschließend in der Zelle exprimiert wird; und (b) Analysieren des mitochondrialen Membranpotenzials in der Zelle.
  3. Die Verwendung einer Nukleinsäure, kodierend für ein Polypeptid umfassend eine Aminosäure-Sequenz mit wenigstens 90 % Sequenz-Identität zu einem Polypeptid, für das die SEQ ID Nr. 1 oder 2, wie in den Tabellen 1,2 zur Verfügung gestellt, kodiert, oder eine antisense Nukleinsäure davon, für die Herstellung eines Medikaments zum Modellieren der metabolischen Geschwindigkeit in einem Säugetier durch die Hoch-Regelung oder Herunter-Regelung der Entkopplungs-Aktivität eines Polypeptids umfassend eine Aminosäure-Sequenz mit wenigstens 90 % Sequenz-Identität zu einem Polypeptid, für das die SEQ ID Nr. 1 oder 2 kodiert.
  4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die Hoch-Regulierung der Entkopplungs-Aktivität einen Anstieg der metabolischen Geschwindigkeit in dem Säugetier stimuliert.
  5. Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei das Säugetier übergewichtig ist.
  6. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die Nukleinsäure die Expression des Polypeptids in wenigstens einer Zelle in dem Säugetier erhöht.
  7. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die Nukleinsäure eine Nukleinsäure-Sequenz mit 100 % Identität zu der Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 oder 2, wie zur Verfügung gestellt in den Tabellen 1,2, umfasst.
  8. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die Herunter-Regulierung der Entkopplungs-Aktivität ein Absinken der metabolischen Geschwindigkeit in den Säugetier stimuliert.
  9. Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die Nukleinsäure die Expression des Polypeptids in wenigstens einer Zelle in dem Säugetier absenkt.
  10. Ein in vitro Verfahren zum Absenken des mitochondrialen Membranpotenzials in einer Säugetier-Zelle, umfassend das in-Kontakt-bringen der Zelle in vitro mit einer Nukleinsäure , die für ein Polypeptid kodiert, dass eine Aminosäure-Sequenz mit wenigstens 90 % Sequenz-Identität zu einem Polypeptid umfasst, für das eine Nukleotidsequenz aus SEQ ID 1 oder 2, wie in den Tabellen 1,2 zur Verfügung gestellt, kodiert, wobei die Expression der Nukleinsäure-Sequenz das mitochondriale Membranpotenzial in der Zelle absenkt.
  11. Die Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid umfassend eine Aminosäure-Sequenz mit wenigstens 90 % Sequenz-Identität zu einem Polypeptid kodiert, für das die SEQ ID Nr. 1 oder 2, wie durch die Tabellen 1,2 zur Verfügung gestellt, kodiert, für die Herstellung eines Medikaments zum Modellieren der metabolischen Geschwindigkeit in einem Säugetier, wobei die Expression der Nukleinsäure das mitochondriale Membranpotenzial in der Zelle absenkt.
  12. Ein in vitro Verfahren zum Absenken des mitochondrialen Membranpotenzials in einer Säugetier- Zelle, umfassend das in-Kontakt-bringen der Zelle in vitro mit einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäure-Sequenz mit wenigstens 90 % Sequenz-Identität zu einem Polypeptid, für das SEQ ID Nr. 1 oder 2, wie in den Tabellen 1,2 zur Verfügung gestellt, kodiert, umfasst, dass in der Lage ist, die Expression eines Polypeptids umfassend eine Aminosäure-Sequenz mit wenigstens 90 % Sequenz-Identität zu einem Polypeptid, für das die SEQ ID Nr. 1 oder 2 kodiert, zu erhöhen, wobei er die erhöhte Expression des Polypeptids das mitochondriale Membranpotenzial in der Zelle absenkt.
  13. Verwendung einer Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid umfassend eine Aminosäure-Sequenz mit wenigstens 90 % Sequenz-Identität zu einem Polypeptid, für das SEQ ID Nr. 1 oder 2, wie in den Tabellen 1,2 zur Verfügung gestellt, kodiert, das in der Lage ist, die Expression eines Polypeptids zu erhöhen, dass eine Aminosäure-Sequenz umfasst, für die die Nukleinsäure SEQ ID Nr. 1 oder 2 kodiert, für die Herstellung eines Medikaments zum Modellieren der metabolischen Geschwindigkeit in einem Säugetier, wobei die erhöhte Expression des Polypeptids das mitochondriale Membranpotenzial in der Zelle absenkt.
  14. Ein Verfahren gemäß Anspruch 12 oder eine Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die Nukleinsäure eine Nukleinsäure eine Sequenz mit 100 Identität zu der Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 oder 2, wie in den Tabellen 1,2 zur Verfügung gestellt, umfasst.
  15. Ein Verfahren gemäß Anspruch 10, 12 oder 14 oder eine Verwendung gemäß einem der Ansprüche 11, 13 oder 14, wobei die Zelle eine menschliche Zelle ist.
  16. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäure-Sequenz eine wenigstens 95 % Sequenz-Identität zu dem Polypeptid aufweist, für das SEQ ID Nr. 1 oder 2, wie zur Verfügung gestellt in den Tabellen 1,12, kodiert.
  17. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Säugetier-Zelle oder die Säugetiergewebeprobe menschlicher Natur ist.
  18. Verwendung eines Polypeptids umfassend eine Aminosäure-Sequenz mit wenigstens 90 % Sequenz-Identität zu einem Polypeptid, für das SEQ ID Nr. 1 oder 2, wie in den Tabellen 1,2 zur Verfügung gestellt, kodiert, für die Herstellung eines Medikaments zum Modellieren der metabolischen Geschwindigkeit in einem Säugetier.
  19. Verwendung eines Polypeptids umfassend eine Aminosäure-Sequenz mit wenigstens 90 % Sequenz-Identität zu einem Polypeptid, für das SEQ ID Nr. 1 oder 2 kodiert, wie in den the Tabellen 1,2 zur Verfügung gestellt, zum Modellieren der metabolischen Geschwindigkeit in einem Säugetier durch Absenken des mitochondrialen Membranpotenzials in einer Säugetier-Zelle.
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