DE60036193T2

DE60036193T2 - Partikel zur oralen verabreichung von peptiden und proteinen

Info

Publication number: DE60036193T2
Application number: DE60036193T
Authority: DE
Inventors: Carl F. Portola Valley GROVE; Peter J. Palo Alto Dehlinger; David R. Princeton FRIEND; Francis J. San Francisco MARTIN; Mauro Dublin FERRARI
Original assignee: IMEDD; iMEDD Columbus; University of California; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: IMEDD; iMEDD Columbus; University of California; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 1999-01-11
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2020-01-08
Also published as: WO2000041740A3; US6355270B1; ATE371438T1; EP1140024A4; AU2494700A; WO2000041740A2; EP1140024B1; JP2002534485A; EP1140024A2; CA2359474A1; DE60036193D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Mikrometerbereich hergestellte Einrichtungen und insbesondere Partikel mit Mikrostruktur zur Verwendung beim Verbessern der Bioverfügbarkeit von Protein, Peptid und anderen pharmakologisch aktiven über die orale Route zugeführten Biopolymeren.
Hintergrund der Erfindung
Peptid- und proteinbasierte therapeutische Mittel weisen nach oraler Verabreichung eine schlechte Bioverfügbarkeit auf, und zwar aufgrund der schlechten Absorption solcher Makromoleküle über die Schleimhautoberflächen des Magens, des Darms und des Dickdarms. Darüber hinaus zerstören in dem Magen-Darm-Trakt (GI) in Fülle vorhandene Peptidaseenzyme viele Peptid- und Proteinmedikamente, bevor diese die Gelegenheit haben, absorbiert zu werden. Eine Vielzahl von Zuführungssystemen ist zum Verbessern der oralen Bioverfügbarkeit von Medikamenten entwickelt worden, einschließlich magensaftresistenten Tabletten (einschließlich osmotischen Pumpen), Kapseln und Partikeln, Liposomen, aus biologisch abbaubaren Polymeren, wie beispielsweise Lactid-co-glycolide, zusammengesetzte Mikro- und Nanopartikel, Mikroemulsionen mit oberflächenaktiven Mitteln, biologisch abbaubaren Hydrogelen und ähnliche. In vielen Fällen umfasst die Dosierung Penetrations-Verstärker (auch Träger genannt). Diese Mittel umfassen Gallensalz (als Natriumsalze wie beispielsweise Natriumglykocholat), anionische Detergentien (wie beispielsweise Docusatnatrium und Natriumlaurylsulfat), nichtionische Detergentien (Triglyceride mit mittlerer Kettenlänge, Propylenglykol), Salicylate, Acyl-Aminosäuren und Acylcarnitin. Von anderen Verstärkern ist bekannt, dass sie die Darmpermeabilität durch Wechselwirkung mit den Tight Junctions erhöhen. Ein Beispiel dieser Art von Mittel ist Zonulaoccludens-Toxin (ZOT). WO 98/41236 A beschreibt scheibenförmige Mikroeinrichtungen zur Verabreichung eines therapeutischen Mittels an ein ausgewähltes Ziel über den Blutstrom oder durch parenterale Verabreichung. Die Mikroeinrichtungen umfassen ein Substrat mit zylindrischen Öffnungen, biopolymere Mittel, wie beispielsweise Antikörper, und oberflächengebundene Markeranbindende Moleküle zum Abstellen der Mikroeinrichtung auf eine Tumorzelle.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt umfasst die Erfindung einen Partikel zur Verwendung bei einer oralen Applikation eines biopolymeren Medikamentes, wie beispielsweise ein Polypeptid, Protein oder Nukleinsäure, an einen Probanden. Der Partikel weist ein Substrat mit einer Stirnfläche bzw. Vorderfläche und einer Rückenfläche auf, und definiert zumindest ein Reservoir, welches sich zur Stirnfläche öffnet. In dem zumindest einen Reservoir ist in freisetzbarer Form ein Biopolymer-Mittel enthalten. Ein an einer Schleimhaut anhaftendes Mittel ist auf der Stirnfläche des Substrates zum Anhaften des Partikels an die Darmschleimhaut angeheftet, so dass aus dem Reservoir freigesetztes Medikament direkt dem Bereich der Darmschleimhaut angeboten wird, bei welchem der Partikel angeheftet ist.
Der Partikel ist vorzugsweise scheibenförmig, hat einen Durchmesser in dem Bereich von 100 μm² bis 1 mm und eine Partikeldichte von 1,00 ± 0,05 gm/cm³.
Beispielhafte Biopolymermittel umfassen Faktor VII, Erythropoietin, menschliches Wachstumshormon, verschiedene kolonie-stimulierende Faktoren wie beispielsweise GM-CSF, Interferone, Interleukine, Vasopressin, Wachstumshormonfreisetzungsfaktor, Relaxin, Somatostatin, Antikörper, Insulin, atrialen naturetischen Faktor, Glukagon, Desmopressin, Calcotonin, verschiedene aniogene Wachstumsfaktoren wie beispielsweise VEGF, LHRH-Analoge, Peptid-Antigene, Vaccine und Antisense-Oligonucleotide und Oligonucleotid-Analoge. Das Schleimhaut anhaftende Mittel kann ein Pflanzenlektin, wie beispielsweise Weizenkeim-Agglutinin, Tomaten-Lektin, Ulex europaeus-Agglutinin-I und -II, Phaseolus vulgaris-Agglutinin und Asparagus pea-Lektin (Lotus tetragonologus), Mycoplasma- Gallisepticum-Lektin, B-Untereinheit von Cholera-Toxin (CT), Escherichia-coli-Typ-1-Fimbriae, Vitamin B₁₂, Riboflavin, Folsäure oder Eisen Transferrin sein, das an die Darmschleimhaut anbindet. Das Mittel kann mit einem Trägerstoff gemischt sein, um eine kontrollierte Auflösungsrate und Freisetzung des Mittels aus dem Reservoir zu erreichen. Eines der Reservoirs kann einen Permeations-Enhancer enthalten, und eines kann einen Peptidase-Inhibitor enthalten.
Gemäß einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung eine Zusammensetzung der Partikel zur Medikament-Applikation. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise ein darmlösliches bzw. magensaftresistentes Beschichtungsmaterial, welches die Partikel verkapselt und welches, nach oraler Applikation, effektiv bzw. intakt bleibt, während es die Umgebung der Speiseröhre und des Magens mit geringem pH-Wert passiert und welches sich in der Umgebung des Darmhohlraums mit höherem pH-Wert auflöst, wobei die Partikel freigesetzt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Herstellungsverfahren im Mikrometerbereich zum Herstellen der Medikament-Applikationspartikel. Das Verfahren umfasst allgemein die Schritte (a) Aussetzen einer Schicht eines partikelbildenden Materials einer fotoablativen Lichtquelle durch eine Fotomaske, wodurch ein retikulares Gittermuster auf der Schicht entsprechend der gewünschten Partikelgröße und -form ausgebildet wird, und Fortsetzen dieser Aussetzung, bis die gewünschten Partikel gebildet sind.
Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden ersichtlich, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung in Zusammenschau mit den beigefügten Figuren gelesen wird.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1A–1E veranschaulichen übliche erfindungsgemäße Mikropartikel. Jedes ist dargestellt aus einem Substratmaterial (100) und enthält blinde Poren oder Reservoirs, wie beispielsweise 102 in den 1A–1D und 104 in 1E. Mögliche Formen umfassen scheibenförmige (1A), becherförmi ge (1B), hexagonale (1C) und ringförmige (1D).
2 zeigt die Verwendung einer magensaftresistenten bzw. darmlöslichen Kapsel (204), dem bevorzugten Mittel zum Transportieren einer erfindungsgemäßen Partikelsuspension (202) durch den Magen (206) mit einer Freisetzung im Dünndarm (210).
3 veranschaulicht medikamentgefüllte Partikel (302), die über chemisch an der Partikelstirnfläche (304) aufgepfropfte Liganden (306) an Rezeptoren anbinden, die an der Muzin-Schicht (308) ausgebildet sind, welche die Darmepithel (310) überdeckt. Jede Pore (312) der Partikel enthält eine Trockenmischung des zuzuführenden biopolymeren Medikaments und Zusatzstoffe (einschließlich Permeations-Enhancer und/oder Peptidase-Inhibitoren). Das Trockenmittel wird beim Einfließen von Wasser (314) hydratisiert und bewegt sich durch Diffusion (316) nach außen und passiert dabei durch die Darmepithel (entweder perizellulär oder transzellulär) und tritt in die portale Zirkulation der Leber (314) ein.
4 zeigt die Abfolge von Schritten bei der Top-Down-Herstellung von Mikropartikeln unter Verwendung einer Kombination von Dampf- oder Dünnfilmabscheidung gefolgt von Fotolitographie.
5A–5C veranschaulichen die strukturellen Merkmale von Mikropartikeln, die aus Trak-Etched-Polycarbonat oder -Polyesterschichten hergestellt sind. Jeder Partikel (504) umfasst mehrere gleichförmige zylindrische blinde Poren (502). Eine Schicht reaktiver chemischer Gruppen, wie beispielsweise primäre Aminogruppen (510), kann auf die Vorderseite der Partikel aufgebracht werden, und Schleimhaut anheftende Liganden (512) werden über diese Gruppen auf die Partikelstirnfläche bzw. -vorderseite gepfropft. Eine Medikament/Trägerstoff-Mischung wird in die Poren (514) gefüllt und getrocknet (5D).
6 zeigt ein Beispiel der Reaktionssequenz, die zum Anpfropfen von Proteinliganden, wie beispielsweise Pflanzenlektine, auf die Stirnfläche der Partikel verwendet werden kann. Aminogruppen an der Oberfläche werden mit einem heterobifunktionalen Reagenz, wie beispielsweise SMCC, umgesetzt, um thiol-reaktive Maleimid-Gruppen einzuführen. Lektine mit Thiol-Gruppen, wie beispielsweise Weizenkeim-Agglutinin oder Tomaten-Lektin, werden dann mit den thiol-reaktiven Gruppen umgesetzt, um Thiol-Ether-Verbindungen zwischen dem Maleimid und den Thiolen an den Proteinen auszubilden.
7A–7B veranschaulichen die Schlüsselschritte bei dem kontinuierlichen Verfahren zum Erzeugen von Mikropartikeln aus einem Polymerschicht-Vorrat. Details des Verfahrens sind bei dem nachfolgenden Beispiel B angegeben. Kurz gesagt beginnt der Prozess mit Rollen von kommerziell erhaltenen Polycarbonatschichten, die auf beiden Seiten zylindrische Poren mit einem Durchmesser von 150–200 Mikrometern, ein auf die Rückenfläche aufgebrachtes Trägermaterial und eine dünne Schicht von auf die Stirnfläche aufgebrachten reaktiven Aminogruppen umfassen. Das Material wird abgerollt und die Schichten werden auf einem mechanischen Riemen mit Führungswalzen fortbewegt. Der erste Schritt zum Umwandeln der Aminogruppen an der Oberfläche in Thiol-reaktive Gruppen ist in dem ersten Modul (7A) gezeigt. Während zu dem zweiten Modul (7B) fortgeschritten wird, wird ein Ligand chemisch auf die Oberseite des Polycarbonats aufgepfropft. Eine Medikament/Trägerstoff-Lösung (mit oder ohne Permeations-Enhancer und/oder Peptidase-Inhibitor) wird in die Poren gefüllt und in dem dritten Modul (7C) getrocknet.
8 veranschaulicht das „Stanzen" von einzelnen Mikropartikeln aus den Poylcarbonatschichten, den abschließenden Schritt des in 7 oberhalb beschriebenen Verfahrens. Die verwendete Vorrichtung ist einer Lochstanze ähnlich. Die Poylcarbonatschicht (800) gelangt unter eine Gruppe von zylindrischen Stangen (802), deren Durchmesser dem gewünschten Durchmesser der Mikropartikel entspricht. Wenn sich die Gruppe der Stangen in eine Gruppe von Aufnahmeöffnungen (804), angetrieben von einem pneumatischen Kolben (810), herabbewegt, stanzen die Stangen einzelne Mikropartikel (814) aus der Schicht, welche in dem Sammeltrichter (822) gesammelt werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Soweit nicht anders angegeben weisen die nachfolgenden Begriffe die folgenden Bedeutungen auf.
„Partikel" oder „Mikropartikel" oder „im Mikrometerbereich hergestellte Strukturen" oder „im Mikrometerbereich hergestellte Partikel" sind durch Herstellungsverfahren im Mikrometerbereich gebildete Partikel.
„Mikroeinrichtungen" oder „im Mikrometerbereich hergestellte Einrichtungen" sind Partikel, die weiter vorbereitet wurden, um biologische Mittel wie Beschichtungen und/oder therapeutische Mittel zu Umfassen.
„Herstellungsverfahren im Mikrometerbereich" bezieht sich auf Verfahren, welche ein Fotomaskieren oder eine gemusterte Bestrahlung eines Substrates zum Erzeugen der gewünschten Oberflächenmustermerkmale in dem Substrat verwenden. Beispielhafte Herstellungsverfahren im Mikrometerbereich umfassen die Fotolithographie, die Röntgenlithographie und die Elektronenstrahllithographie.
„Mikrofokaler transmucosaler Transport" bezieht sich auf die Bewegung von intakten bioaktiven Peptid-, Protein- oder anderen makromolekularen therapeutischen Mitteln von dem Hohlraum des Magen-Darm-Trakts (entweder perizellulär oder transzellulär) durch einen mikroskopischen Bereich der Schleimhautoberfläche (ungefähr 4 × 10⁴ μm²) und in die portale Zirkulation der Leber.
„Schleimhaut anhaftend" bezieht sich auf die Fähigkeit von Partikeln, an der Schleimhautschicht anzuhaften, welche die gesamte Oberfläche des Dünn- und Dickdarms auskleidet. Das Anhaften wird bewirkt durch Liganden, die auf eine Oberfläche der Partikel aufgepfropft sind, welche an chemische Rezeptoren im Muzin oder der Oberfläche der Darmepithelzellen anbinden.
„Bioerodierbar" bezieht sich auf ein Material, welches in einem physiologischen Medium auflösbar ist (beispielsweise ein erodierbares Metall), oder ein biokompatibles Polymermaterial, das unter physiologischen Bedingungen von physiologischen Enzymen und/oder chemischen Bedingungen, beispielsweise den im Magen-Darm-Trakt vorgefundenen Bedingungen, abgebaut werden kann.
Der Begriff „molekulare Beschichtung" wird hier verwendet, um eine Beschichtung zu beschreiben, welche an einer Oberfläche (Oberseite) eines Partikels angebunden ist. Die molekulare Beschichtung ist direkt an die Oberfläche des Partikels angebunden oder über eine chemische Bindung zu einer elektronenliefernden Gruppe, beispielsweise -NH₂, OH oder dergleichen, derivatisiert auf oder assoziiert mit der Oberfläche einer strukturellen Schicht der Partikel. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die molekulare Beschichtung beschränkt auf die Oberseite des Partikels, bei welcher die Reservoirs oder Poren leer sind. Molekulare Beschichtungen, die die Fähigkeit der Partikel zum Anbinden an die den Dünn- und Dickdarm bedeckende Muzin-Schicht ermöglichen (Schleimhaut anhaftende Liganden) sind bevorzugt.
A. Im Mikrometerbereich hergestellte Partikel
Die vorliegende Erfindung stellt im Mikrometerbereich hergestellte Partikel bereit, die therapeutisch bei einer Vielzahl von in vitro, in vivo und ex vivo Anwendungen, insbesondere bei oralen Applikationen, verwendbar sind. Die im Mikrometerbereich hergestellten Partikel weisen eine ausgewählte asphärische Form und einheitliche Abmessungen auf und enthalten ein therapeutisches Mittel in freisetzbarer Form. Die Aktivität des Mittels setzt ein nach seiner Freisetzung aus der Einrichtung (welche gestaltet ist, an den Schleimhautoberflächen des Darms und/oder des Dickdarms anzuhaften) und Transport des Mittels durch die Magenschleimhaut in die portale Zirkulation der Leber.
Die Form, Größe, Dichte und Zusammensetzung der erfindungsgemäßen im Mikrometerbereich hergestellten Partikel werden ausgewählt, um die anhaftende Kraft (bereitgestellt durch das Schleimhaut anhaftende, an die Oberseite des Partikels angepfropte Mittel) zu begünstigen. Dieser Kraft entgegen wirken zwei Kräfte, welche dazu tendieren, die Partikel zu lösen, sobald sie an der Darmoberfläche gebunden sind (das heißt der Fluß von verflüssigtem Material durch den Darmhohlraum als eine Konsequenz der peristaltischen Bewegung der Eingeweide).
Die Anzahl und das Volumen von Reservoirs oder Poren in jedem Partikel wird gewählt, um eine adäquate Aufnahmekapazität für den bestimmten zuzuführenden Biopolymer bereitzustellen, und um ferner die Fähigkeit zum Aufnehmen adäquater Mengen von entsprechenden Permeations-Enhancern und/oder Peptidase-Inhibitoren bereitzustellen. Beispielsweise sind Einrichtungen, die gestaltet sind, bei üblichen oralen Applikationen verwendet zu werden, im Wesentlichen scheibenförmig, becherförmig, ringförmig oder von hexagonaler Form. Beispielhafte Ausführungsformen solcher scheiben-, becher-, ring- oder hexagonal-förmiger Einrichtungen sind in den 1A–1D veranschaulicht. Es wird auf 1A–1E Bezug genommen. Jeder Partikel besteht aus einem Substrat 100 und enthält ein oder mehrere Poren oder Reservoire 102.
1E zeigt einen scheibenförmigen Partikel, der aus einem dünnen Scheibenmaterial 104 mit einem Durchmesser D zwischen ungefähr 100–5000 Mikrometern und einer Dicke zwischen ungefähr 10 und ungefähr 100 Mikrometern besteht. Die Scheibe ist gebildet aus einem einzigen Polymermaterial, welches das therapeutische Mittel (beispielsweise einen therapeutischen Biopolymer) in den Poren oder Reservoirs 106 enthalten kann. Obwohl nicht-erodierbare, biokompatible Materialien verwendet werden können, sind die bevorzugten Partikel aus bioerodierbaren Materialien gebildet, wie es nachfolgend beschrieben ist.
Die die Öffnungen zu den Reservoirs oder Poren enthaltende Oberseite des Partikels kann durch die Einführung einer 50–100 Å Schicht von reaktiven chemischen Gruppen modifiziert sein. Üblicherweise werden diese Gruppen nach der Ausbildung der Partikel hinzugefügt. Verfahren zum Derivatisieren einer Vielzahl von Glas-, Metall- und Polymeroberflächen sind bekannt. Beispielsweise können Amino- oder Thiol-Gruppen auf die Oberfläche von Polymeren unter Verwendung einer Glimm-Entladungs- oder „Plasma"-Behandlung aufgepfropft werden.
Die erfindungsgemäßen Partikel werden durch chemische Verknüpfung von Schleimhaut anheftenden Liganden an die reaktiven Gruppen an der Oberseite der Partikel Schleimhaut anhaftend gemacht. Proteinliganden werden mit amino- und thiol-reaktiven Gruppen verknüft, und zwar unter Bedingungen, die zum Ausbilden von Thioether- bzw. Amidbindungen wirksam sind. Die dargestellten Liganden sollen die Partikel an ausgewählte Zielstellen in dem Magen-Darm-Trakt, beispielsweise den Dünndarm oder den Dickdarm, anbinden. Verfahren zum Anheften von Antikörpern oder anderen Polymerbindemitteln an einen anorganischen oder polymeren Träger sind beispielsweise detailliert beschrieben in Tayler, R., Ed., PROTEIN IMMOBILZATION FUNDAMENTALS AND APPLICATIONS, Seite 109110 (1991).
Die Mindestabmessungen der Partikel werden lediglich durch das Herstellungsverfahren im Mikrometerbereich selber und die Aufnahmefähigkeit jedes Partikels begrenzt. Wie es detaillierter nachfolgend beschrieben wird, sei angemerkt, dass die „traditionelle" Fotolitographie auf eine Herstellung im Mikrometerbereich von Strukturen größer als 0,5 Mikrometer begrenzt ist, dass jedoch wesentlich kleinere Strukturen (bei der vorliegenden Erfindung werden Dimensionen von beispielsweise 50–200 nm für den Durchmesser der Einrichtungen in Erwägung gezogen) unter Verwendung bekannter Röntgenstrahl- und/oder Elektronenstrahllithographieverfahren hergestellt werden können.
Die optimalen Abmessungen, Form und Dichte des Substratmaterials der erfindungsgemäßen Partikel hängt von einer positiven Balance zwischen der dynamischen Bewegung von Fluid in den Eingeweiden, angetrieben von peristaltischen Kontraktionen des den gesamten Magen-Darm-Trakt umgebenden Eingeweidemuskels und der Fähigkeit der Partikel, an der Muzin-Schicht anzuheften, ab. Die maximale Abmessung der Einrichtung (der Durchmesser der Scheiben bei scheibenförmigen Einrichtungen) liegt üblicherweise in dem Bereich zwischen 100 (man sollte 10 Mikrometer bedenken) und 1000 Mikrometer.
Ein Schlüsselvorteil der Verwendung von Partikeln, die einen größeren Durchmesser von mehr als ein paar Mikrometer haben, ist, dass Partikel dieser Größe zu groß sind, um von den Darmepithelzellen endozytiert zu werden. Partikel, die endozytiert werden, weisen zumindest zwei Nachteile auf. Zunächst kann die therapeutische Fracht deaktiviert werden, wenn sie von den Endothelzellen bearbeitet wird, bevor sie die gewünschte Zielstelle erreicht. Zweitens ist die potentielle Toxizität des jeweiligen Trägers von größerer Bedeutung wenn er endozytiert wird, als wenn er durch den Magen-Darm-Trakt deaktiviert wird.
Bestimmte Schichten und Beschichtungen, welche bei einer Einrichtung wie oberhalb beschrieben enthalten sein können (beispielsweise eine Schicht von Schleimhaut anheftenden Liganden), können so dünn sein wie eine einzige Molekülschicht. Die Mindestgröße hängt wiederum von der Anwendung ab. In dem Falle von Einrichtungen aus biologisch abbaubaren Materialien beispielsweise lösen sich die Einrichtungen umso schneller auf, je kleiner sie sind. Die Stabilität einer Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung bei einer bestimmten Anwendung kann von einem Fachmann einfach unter Verwendung von markierten (beispielsweise fluoreszierenden oder radioaktiv markierten) Einrichtungen in einem Modellsystem bestimmt werden.
Eine weitere wichtige Eigenschaft der Partikel ist die Bioerodierbarkeit des beim Herstellen des Partikels verwendeten Materials. Einige Metalle, wie beispielsweise Eisen, lösen sich rasch in wässrigen Medien, wohingegen andere, wie beispielsweise Gold, viel langsamer erodiert werden. Daher können Metalle zu Legierungen gemischt werden, um eine gewünschte Erosionsrate zu erhalten.
Eine Vielzahl von bioerodierbaren Polymeren einschließlich Polyglykol, Polymilchsäure, Polyurethan, Zellulosen und derivatisierte Zellulosen, können ausgewählt werden, und eine Vielzahl von geladenen Polymeren, wie beispielsweise Heparinähnliche polysulfatierte oder polycarboxilierte Polymere sind zum Ausbilden von einer oder mehreren der Mikrostrukturschichten geeignet.
Ferner können die Partikel markiert werden, um eine Erfassung oder Visualisierung zu ermöglichen. Zum Beispiel werden Mikroeinrichtungen durch eine Implementation oder eine Ober flächenbefestigung von radioaktiven Isotopen, wie beispielsweise I-123, I-125, I-131, In-111, Ga-67 und Tc-99, radioaktiv gemacht. An spezielle Regionen in dem Magen-Darm-Trakt angebundene radioaktive Einrichtungen können durch Strahlungsdetektoren, wie beispielsweise die gegenwärtig bei der Scintigraphie verwendeten Röntgenkameras, identifiziert werden, was zu einer Identifikation und Lokalisierung derartiger Bereiche führt. Mikroeinrichtungen können ebenfalls mit fluoreszierenden Molekülen oder Farbstoffen markiert werden, so dass eine Konzentration von Mikroeinrichtungen visuell erfasst werden kann.
Das zum Ausbilden der Mirkostruktur verwendete Strukturmaterial wird gewählt, die gewünschte Erodierbarkeit und die gewünschten Medikamentfreisetzungseigenschaften zu erzielen. Im Falle der Medikamentenfreisetzung kann das Strukturmaterial ein oder mehrere biologisch abbaubare Polymere sein. Klassen von biologischabbauren Polymeren umfassen Polyorthoester, Polyanhydride, Polyamide, Polyalkylcyanoacrylate, Polyphosphazene und Polyester. Beispielhafte biologisch abbaubare Polymere sind beschrieben beispielsweise in den US Patenten Nr. 4,933,185 , 4,888,176 und 5,010,167 . Spezielle Beispiele derartiger biologisch abbaubarer Polymermaterialien umfassen beispielsweise Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polycaprolacton, Polyhydroxybutyrat, Poly(N-Palmitoyl)-trans-4-hydroxy-L-Prolinester) und Poly(DTH-Carbonat).
Um eine Nachverfolgung eines erfindungsgemäßen therapeutischen Partikels zu vereinfachen, kann eines der Struktur- oder Beschichtungselemente des Partikels derart gestaltet sein, dass es unter Verwendung von beispielsweise Röntgenstrahlen, Scintigraphie, Kernspinresonanz, optischer Untersuchung (beispielsweise Farbe, Fluoreszenz) oder Ultraschall erfassbar ist.
B. Zusammensetzung für orale Applikationen
Für die orale Applikation werden die Partikel üblicherweise in einer Zusammensetzung für eine orale Applikation bereitgestellt, die aus einer Mehrzahl der Partikel in einer ausge wählten freisetzbaren Form besteht. Die Zusammensetzung kann durch Mischen der Partikel mit geeigneten nichtwässrigen Trägern (wie beispielsweise Öl oder feinstzerkleinertes Pulver) und Einfüllen in einheitlichen Dosierungsmengen in übliche magensaftresistente Kapseln oder alternativ durch Verdichten zu Tabletten und Beschichten mit einem magensaftresistenten Material hergestellt werden. Die magensaftresistente Beschichtung stellt sicher, dass die Partikel trocken durch die Umgebung mit geringem (saurem) pH-Wert des Magens transportiert werden und bei vorausgewählten Bereichen des Dünn- oder des Dickdarms freigesetzt werden.
2A zeigt übliche Partikel 202 der vorliegenden Erfindung, die in übliche magensaftresistente Kapseln 204 eingefüllt sind. Wie es in 2B veranschaulicht ist, ist der magensaftresistente „Träger" gestaltet, die trockenen Partikel durch die Umgebung mit geringem pH-Wert des Magens 206 zu transportieren und die Partikel innerhalb der Umgebung mit höherem pH-Wert, die in dem Hohlraum des Dünn- und Dickdarms 208 vorgefunden wird, freizusetzen. Die Partikel binden über die Schleimhaut anhaftenden Liganden, die auf der Oberseite der Darmschleimhaut des Magen-Darm-Traktes 211 aufgepfropft sind.
Die Zusammensetzung kann mit einem Schutzpolymer beschichtet sein. Dieses Material kann mit der Filmbeschichtungstechnologie auf entweder Tabletten oder Kapseln aufgebracht sein, um das Produkt von den Auswirkungen der Magenumgebung zu schützen oder eine Freisetzung der Medikamente in dieser zu verhindern. Solche Beschichtungen sind jene, welche in dem Magen intakt bleiben, sich jedoch auflösen und den Inhalt der Dosierung freisetzen, sobald sie den Dünndarm erreichen. Der Zweck einer magensaftresistenten Beschichtung ist es, die Freisetzung von Medikamenten zu verzögern, welche durch den Mageninhalt inaktiviert werden. Darüber hinaus geschieht die Freisetzung des Medikamentes in dem Bereich, der am besten geeignet ist, die Bioverfügbarkeit des Medikamentes zu maximieren.
Eines der am weitest verbreiteten magensaftresistenten Polymere ist Zelluloseacetatphthalat (CAP). Ein anderes nützli ches Polymer ist Polyvinlyacetatphthalat (PVAP), welches weniger durchlässig gegenüber Feuchtigkeit und stabiler gegenüber Hydrolyse ist und bei einem geringeren pH-Wert als CAP ionisieren kann. Diese Eigenschaften ermöglichen eine zuverlässigere Freisetzung des Medikamentes in dem Zwölffingerdarm. Ein anderes Beispiel von gegenwärtig verwendeten Polymeren sind jene basierend auf Methacrylsäure/Metharylsäureester-Copolymeren mit säure-ionisierbaren Gruppen. Representativ unter diesen sind Polymere mit dem Markennamen Eudragit, verfügbar durch Rohm Pharma. Üblicherweise wird die magensaftresistente Beschichtung bezogen auf das Gewicht der Tablette oder der Kapsel zwischen ungefähr 0,5 Gewichtsprozent bis ungefähr 10 Gewichtsprozent aufgebracht. Sämtliche dieser Polymere sind in der Lage, das Medikament in dem Magen zu schützen, während sie eine rasche und vollständige Freisetzung der das Medikament enthaltenden Partikeln von einer Tablette oder einer Kapseln in dem Zwölffingerdarm ermöglichen.
Zusätzlich zu der äußeren magensaftresistenten Beschichtung können die Kammern, in welchen das Medikament und andere Trägerstoffe in den Partikeln angeordnet sind, ferner eine schützende Abdeckung oder Materialschicht aufweisen. Dieses Material kann eine wasserlösliche Substanz wie beispielsweise ein Zellulosederivat, wie Hydroxypropylmethylzellulose, oder Gelatine sein. Alternativ kann ein weniger wasserlösliches Polymer, wie beispielsweise Methylzellulose, verwendet werden, um die Freisetzung des Medikamentes aus den Kammern nach der Freisetzung der Partikel in den Zwölffingerdarm zu verzögern.
Die von der ALZA-Corporation (Mt. View, CA) entwickelte „ChronSet^®"-Technologie kann zum Freisetzen eines Bolus der Partikel zu vorgegebenen Zeiten und bei speziellen Absorptionsstellen in den Dünndarm nach Durchquerung des Magens verwendet werden. In diesem Falle wird eine Suspension von Partikeln in ChronSet-Kapseln gefüllt. Nach dem Verschlucken passieren die Kapseln intakt den Magen. Die Hülle ist gestaltet, die Rate der Wasserdurchtränkung des osmotisch durchlässigen Abschnittes des Systems zu regulieren. Die osmotische Maschine expandiert, um zwei Hälften der Kapsel zu drücken und zu sepa rieren. Die Länge der Kapselhälften ist speziell gestaltet, um eine Separation bei vorgewählten Zeiten zu ergeben. Die Inhalte jeder Kapseln werden in den Darmhohlraum bei 2 bis 20 Stunden nach Verabreichung ausgestoßen. Mehr als 80 % des Inhalts (in dem Falle einer Suspension von medikament-gefüllten im Mikrometerbereich hergestellten Partikeln) werden innerhalb eines Zeitrahmens von 15 Minuten ausgestoßen. Dieser Ansatz bietet ein Mittel zum Freisetzen der Suspension der Partikel in vorgewählten Bereichen des Dünn- oder Dickdarms. In dem Fall der vorliegenden Erfindung kann ein solches System verwendet werden, um die den Biopolymer enthaltenden Partikel bei Stellen in dem Dünn- oder Dickdarm freizusetzen, die zum Anbinden (d.h. Bereiche, welche Rezeptoren für die Schleimhaut anhaftenden auf den Partikeln aufgepfropften Liganden aufweisen) und/oder Adsorption optimal sind (d.h. Bereiche der Darmepithel, die gegenüber Permeations-Enhancern sensitiv sind).
C. Merkmale der Medikamentapplikation bzw. -zuführung
3 zeigt scheibenförmige Partikel 302 mit Porenöffnungen an der Oberseite eines Partikels 304 und einer Schicht von an der Oberseite 306 aufgepfropften Schleimhaut anheftenden Liganden. Die Partikel sind nach Freisetzung von einem magensaftresistenten Träger gezeigt. Sie sind an eine Muzin-Schicht 308 des Magen-Darm-Trakts über Rezeptoren in der Muzin-Schicht 309 gebunden, welche die Darmepithel 310 bedecken. Bei dem in 3A gezeigten Ausführungsbeispiel sind die Poren mit einer trockenen Medikamentmischung aus einem therapeutischen Mittel und einem Trägerstoff gefüllt, der zum Verzögern der Auflösung der Mischung für 5 bis 60 Minuten nachdem der Partikel von der magensaftresistenten Kapseln innerhalb des Hohlraums des Dünn- oder Dickdarms 312 freigesetzt wurde, gestaltet ist. Geeignete Schleimhaut anheftende Liganden sind in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt.
Es wird auf 3B Bezug genommen. Wenn Wasser in dem Magen-Darm-Trakt die trockene Medikament/Trägersubstanz-Mischung 314 soloarisiert, wird das therapeutische Mittel 316 aus den Poren freigesetzt, durchdringt die Epithel 310 und ge langt in die portale Zirkulation bzw. den Pfortaderkreislauf 318 der Leber. Andere Ausführungsbeispiele können einen erodierbaren Verschluß zum Verzögern der Freisetzung des therapeutischen Mittels umfassen. Die Poren des Partikels können mit einem Material, wie beispielsweise einem Korrosionsverzögerungsfilm verstopft sein. Die Korrosionsverzögerungsschicht ist üblicherweise aus einem Material hergestellt, das sich in der biochemischen Umgebung des Magen-Darm-Traktes schrittweise auflöst. Beispiele solcher Pfropfmaterialien umfassen dünne Metallschichten, wie beispielsweise aus Titan, Gold, Silber, Platin, Kupfer, und Legierungen und Oxide davon, Gelatine, Polysaccharide, wie beispielsweise Maltodextrin, und Enzymsensitive Materialien wie beispielsweise Peptid-Polymere. Die Dicke der Korrosionsverzögerungsschicht kann ausgewählt werden, um beispielsweise die gewünschte Verzögerung der Freisetzung innerhalb des Magen-Darm-Traktes bereitzustellen, um zu ermöglichen, dass die Einrichtung an ihrem Ziel anbindet, bevor das therapeutische Mittel freigesetzt wird. Diese Schichten können gemäß üblichen Metallabscheidungsverfahren, Sputtering oder Dünnfilmabscheidung aufgebracht werden (siehe Wagner, J Oral Implantol 18(3):231–5;1992).
5C veranschaulicht ein allgemeines Ausführungsbeispiel eines Partikels mit einer aufgepfropften Schicht von reaktiven Schleimhaut anhaftenden Liganden 512. Der Partikel umfasst Poren oder Reservoirs 514, wobei jeder von diesen mit einer Mischung eines therapeutischen Peptids/Proteins und einem Trägerstoff (oder einer Mischung von Trägerstoffen) gefüllt ist, welche ausgewählt sind, die Auflösung der Mischung zu verlangsamen (angedeutet durch das getupfte Muster in den Poren). Bei einem allgemeinen Ausführungsbeispiel ist der Schleimhaut anhaftende Ligand ein Muzin-anbindendes Mittel, üblicherweise ein Lektin, Polymer oder Antikörper eines Antikörperfragmentes, zum Anbinden des Partikels an die Darmschleimhaut. Wie es in 5D veranschaulicht ist, wird die Mischung des therapeutischen Peptids/Proteins nach Einfüllen in die Reservoirs getrocknet (wie es durch die zurückgezogenen gepunkteten Muster innerhalb jedes Reservoirs angedeutet ist).
Die Aktivität des therapeutischen Mittels wird aktiviert durch Aussetzen des Partikels der wässrigen Umgebung des Dünn- oder Dickdarms. Der Zielort kann ein bestimmter Ort im Darm sein. In dem Fall beispielsweise, bei dem das Ziel ein spezielles Segment des Dünndarms ist, kann der Ligand und die Freisetzungsrate angepasst werden, um ein Anbinden an ein solches Ziel und ein Freisetzen des Medikamentes bei der Stelle sicherzustellen.
Das in den erfindungsgemäßen therapeutischen Partikeln enthaltene therapeutische Mittel ist freisetzbar. Ein freisetzbares Mittel ist eine therapeutische Verbindung, wie beispielsweise ein Medikament, das gestaltet ist, von den Reservoirs des Partikels freigesetzt zu werden, während das Partikel an die Darmschleimhaut gebunden ist. Beispielhafte therapeutische Mittel auf Peptid- und Olionucleotidbasis zur Verwendung bei der Erfindung umfassen solche in Tabelle 3 angegebene.
Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist die Fähigkeit, bei jedem Partikel „on-board" Permeations-Enhancer zu umfassen, formuliert entweder als eine Mischung mit dem Mittel oder in separaten Kammern oder Kompartments von einzelnen Partikeln, welche in Verbindung mit dem Mittel freigesetzt werden. Eine Begrenzung der Enhancer-Freisetzung auf die Darmschleimhaut bei dem umschriebenen mikroskopischen Bereich zwischen der Mündungsseite jeder angebundenen Einrichtung und der benachbarten Schleimhautoberseite weist zwei wichtige Vorteile auf. Erstens werden fokussiert hohe Konzentrationen des Enhancers in dem gleichen Bereich wie dem Mittel erreicht. Es ist bekannt, dass die Permeations-Verstärkung stark von der lokalen Konzentration sowohl des Enhancers als auch des Mittels beeinflusst wird. Zweitens wird die große Mehrheit der Schleimhautoberfläche nicht den potentiell irritierenden Auswirkungen von hohen Konzentrationen des Enhancers ausgesetzt. Geeignete Enhancer umfassen Gallensalze, nicht-ionische oberflächenaktive Stoffe, anionische oberflächenaktive Stoffe, Lezithine, Glyceride und Fettsäuren mittlerer Kettenlänge, Salicylathe, Natrium-3-Nitrobenzoat, Acylcarnitine, Acylcholine, Acylaminosäu ren, gelatbildende Kalziumverbindungen und Peptide, die die Tight Junctions zwischen den Epithelzellen lösen können, wie beispielsweise Zot (siehe Tabelle 2).
Ein bevorzugter Enhancer für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung ist Zonula-occludens-Toxin (Zot). Zot ist ein neues von Vibrio cholerae gebildetes Toxin, das die Tight Junctions im Darm moduliert. Beispielsweise erhöht Zot bei Kaninchen reversibel die Darmpermeabilität gegenüber Insulin um 72 % (P=0,034) und gegenüber Immunoglobinen um 52 % (P=0,04) in vitro. Wenn es unter in vivo Bedingungen getestet wird, induziert Zot eine zehnfache Zunahme der Insulinabsorption in sowohl dem Kaninchen-Jejunum als auch dem Kaninchen-Ileum, wohingegen keine wesentlichen Änderungen in dem Dickdarm festgestellt wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Immunoglubinen erhalten, wobei Zot eine zweifache und sechsfache der IgG-Absorption in dem Jejunum bzw. dem Ileum bewirkte. Bei diabetischen Ratten war die Bioverfügbarkeit von oral verabreichtem Insulin zusammen mit Zot ausreichend, die Serum-Glukosekonzentrationen auf Level zu senken, die vergleichbar mit denen sind, die nach parenteraler Injetion des Hormons erhalten wurden. Die Überlebenszeit von diabetischen Tieren, die chronisch mit oralem Insulin und Zot behandelt wurden, war vergleichbar mit der, die bei parenteral behandelten Raten beoachtet wurde (Fasano, et al. J Clin Innest. 99:1158–64;1997 und Fasano, et al. Gastroenteroloy 112:839–46;1997). Der vermutliche Rezeptor im Jejunum und Ileum ist GM1 (Walia et al., Infect Immun 67:5215–5222;1995). Weitere Belege dafür, dass Zot durch öffnen der Tight Junction zwischen Darmepithelzellen wirkt, wurde von Fasano et al. (J Clin Innest 6(2):710–20;1995) berichtet.
Ein weiterer durch die Herstellung im Mikrometerbereich bereitgestellter Vorteil ist die Fähigkeit, Inhibitoren von proteolytischen Enzymen „on-board" einer jeden Einrichtung zu umfassen, formuliert entweder als eine Mischung mit dem Mittel oder dem Enhancer oder in separaten Kompartments von einzelnen Partikeln. Die Freisetzung von Enzyminhibitoren in Verbindung mit dem Mittel und in dem gleichen umschriebenen Bereich zwi schen der Mündungsseite der Einrichtung und der Schleimhautoberfläche ist vorteilhaft, da hohe Konzentration des Inhibitors in diesem Bereich erzielt werden, was den schützenden Effekt der Inhibitoren optimiert.
Nach Anbinden an die Schleimhaut wird das Medikament von einzelnen Partikeln in hohen Konzentrationen innerhalb des umschriebenen Bereiches zwischen der Oberfläche des angebundenen Partikels und der benachbarten Schleimhautoberfläche freigesetzt, wodurch ein „mikrofokussierter" transmucosaler Transport solcher Mittel bewirkt wird. Die Medikamentfreisetzung wird von mehreren Minuten bis zu einer Stunde nach der Freisetzung der Partikel aus der magensäureresistenten Kapsel in den Darmhohlraum verzögert. Diese Verzögerungszeitspanne ist darauf abgestellt, sicherzustellen, dass die Partikel die Möglichkeit haben, an die Darmschleimhaut anzubinden. Die Freisetzung wird auf eine oder zwei nachfolgend beschriebene Möglichkeiten verzögert:
Bei einer Möglichkeit wird vor dem Auffüllen der Reservoirs eine Lösung des Medikamentes mit einer Lösung einer wasserlöslichen Trägersubstanz gemischt. Die Mischung wird dann innerhalb des Reservoirs getrocknet. Der Trägerstoff wird ausgewählt, die Re-Hydratation und Auflösung der Mischung nach Freisetzung der trockenen Partikel aus der magensäureresistenten Kapsel und Aussetzung gegenüber Wasser in dem Darmhohlraum zu verzögern. Geeignete Trägerstoffe sind in Tabelle 4 aufgelistet.
Eine zweite allgemeine Freisetzungsmöglichkeit verwendet ein über der getrockneten Medikamentlösung in den Poren angeordnetes erodierbares Pfropfmaterial. Ein solches Material kann in einem Öl oder einem nichtwässrigen Lösungsmittel gelöst oder suspendiert werden und über die getrocknete Medikamentlösung gefüllt werden, wodurch die Öffnung des Reservoirs verpfropft wird. Geeignete Materialien sind in Tabelle 4 aufgelistet.
Zusätzlich zum schlechten eigentlichen Transport sind Medikamente auf Peptid- und Proteinbasis anfällig gegenüber einem Abbau durch Peptidase-Enzyme, die im Darmhohlraum reich lich vorhanden sind. Eine Vielzahl von Peptidase-Inhibitoren ist identifiziert worden. Die erfindungsgemäßen Partikel können ferner an-board Protease-Inhibitoren aufweisen, um die Bioverfügbarkeit von Medikamenten auf Peptid- und Proteinbasis weiter zu steigern. Diese Mittel umfassen, neben anderen, Aprotinin, (₁-Antiyrypsin) und EDTA. Diese Mittel bewirken, dass die Integrität der Medikamente auf Peptid- und Proteinbasis im Darmtrakt erhalten bleibt. Derartige Enzyminhibitoren können anhand der gleichen Verfahren, die oberhalb für die Permeations-Enhancer beschrieben wurde, in mit Biopolymer gefüllte erfindungsgemäße Partikel gefüllt werden. Solche „on-board"-Enzyminhibitoren werden zusammen mit dem Medikament freigesetzt, was deren Integrität während des Aufenthalts im Darmhohlraum erhält und somit den Trans-Epithel-Transport fördert.
D. Verfahren zur Herstellung im Mikrometerbereich
Eine „Top-Down"-Herstellung von Mikro-Einrichtungen unter Verwendung von von der Elektronikindustrie bevorzugten Techniken stellt die Mittel zum Erzeugen von mikroskopischen Partikeln mit einer einmaligen Kombination von für die vorliegende Erfindung nutzbaren Strukturmerkmalen bereit. Derartige Partikel können mit extrem genauen Größen und Formen hergestellt werden, und können Poren umfassen, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als Reservoirs dienen, die es ermöglichen, dass die Partikel therapeutische Biopolymere transportieren. Darüber hinaus können die Partikel asymmetrisch sein. Beispielsweise können die Poren oder Reservoirs derart hergestellt sein, dass sie sich lediglich zur Oberseite des Partikels hin öffnen. Die Oberseite (mit den Porenöffnungen) kann ferner chemisch modifiziert sein, um reaktive chemische Gruppen, wie beispielsweise primäre Amino- oder Thiolgruppen, zu enthalten, welche zum chemischen Anpfropfen von Proteinen oder anderen Arten von Liganden an lediglich diese Oberfläche verwendet werden können. Wie es aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich wird, ist die durch derartige Herstellungs verfahren im Mikrometerbereich bereitgestellte Geometrie verwendbar, um die erfindungsgemäßen Partikel herzustellen.
Zwei Herstellungsschemata im Mikrometerbereich können zum Erzeugen der erfindungsgemäßen Partikel verwendet werden. Die erste ist die sogenannte „Top-Down"-Methode, welche eine Kombination von Dünnfilmabscheidungsverfahren und Fotolithographie, Fotoablation und Ätztechniken zum Abscheiden und Entfernen von aufeinanderfolgenden Materialschichten auf einem Substrat verwendet. Bei Verwendung dieses Verfahrens werden Materialien, wie beispielsweise SiO₂ und Polymere, als dünner Film mit Standardtechniken einschließlich chemischer Abscheidung aus der Dampferphase, Sputtering und ähnlichem auf eine Opferschicht aufgebracht. Nachfolgende Materialschichten können hinzugefügt werden, einschließlich fotoresistenter Materialien, welche bei Aussetzung gegenüber einer geeigneten Wellenlänge von UV-Licht oder einer anderen Strahlungsquelle, entweder eine chemische Änderung erfährt, die die Schutzschicht anfällig gegenüber der Wirkung von Ätzmitteln (positive Schutzschicht) oder resistent gegenüber der Wirkung von Ätzmitteln (negative Resistenz) macht. Fotomasken werden verwendet, um lediglich ausgewählte Bereiche solcher Schutzschichten der Strahlungsquelle auszusetzen, und Ätzmittel werden verwendet, um die anfälligen Bereiche zu lösen.
Ein zweites allgemeines Herstellungsschema im Mikrometerbereich, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, basiert auf der Track-Etch-Technik. In diesem Fall werden Polymerfilme in einem Nuklearreaktor hochenergetischen Partikeln ausgesetzt. Diese hochenergetischen Partikel dringen bis zu einer Tiefe von 10–30 μm in den Partikel ein (abhängig von der Quelle und der Stärke des Energielevels des Partikels), was sensibilisierte Spuren in dem Polymer hinterlässt. Die Spuren werden dann mit stark alkalischen Lösungen geätzt, was gleichgroße, zylinderförmige blinde Poren in der Polymerschicht erzeugt. Dieses Verfahren wird zum Erzeugen von Vorratsschichten von Polymeren, wie beispielsweise Polycarbonat oder Poylester, mit gleichförmigen in beide Seiten geätzten Poren verwendet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann eine dünne nichtporöse Verstärkungsschicht auf eine Seite aufgebracht werden, was einen asymmetrischen Film mit Porenöffnungen lediglich zur Vorderfläche erzeugt. Die Poren wirken als Reservoirs für Biopolymermedikamente, welche durch Eintauchen des Films in eine Lösung des Medikaments bei reduziertem Druck gefüllt werden. Die Medikamentlösung wird dann getrocknet und einzelne Partikel werden aus der Polymervorratsschicht unter Verwendung einer Mikro-Stanzeinrichtung geschnitten.
Bei einem allgemeinen Ausführungsbeispiel werden die Partikel im Mikrometerbereich aus einem Material hergestellt, das gestaltet ist, in dem Magen-Darm-Trakt zu erodieren. Beispielsweise können die Partikel aus Metallen wie beispielsweise Eisen, Titan, Gold, Silber, Platin, Kupfer, und Legierungen und Oxiden davon gebildet sein. Für diese Erfindung sind die Partikel vorzugsweise aus einem biologisch abbaubaren Polymermaterial gebildet.
Der Strukturabschnitt oder die Substratschicht (d.h. die Mikrostruktur) der erfindungsgemäßen Partikel können im Mikrometermaßstab unter Verwendung eines beliebigen Herstellungsverfahrens im Mikrometerbereich, wie beispielsweise der Track-Ätzung (PCTE) von Polymerrollen, was detailliert im Beispiel B dargelegt ist, oder den detailliert nachfolgend beschriebenen Fotolithographie- und Fotoablationsverfahren hergestellt werden. Es ist ersichtlich, dass die Partikel ebenfalls unter Verwendung von anderen Verfahren im Mikrometerbereich hergestellt werden können, die dem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise Röntgenstrahlen- oder Elektronenstrahllithographie. Elektronenstrahllithographie wurde zum Herstellen von Schaltungswegen im Sub-Mikrometerbereich verwendet (beispielsweise Ballantyne, et al. J. Vac. Sci. Technol. 10:1094(1973)), und kann (beispielsweise in Verbindung mit der Nahfeld-Abtastmikroskopie) zum Erzeugen und Abbilden von Mustern im Nanometerbereich verwendet werden (siehe beispielsweise INTRODUCTION TO MICROLITHOGRAPHY, Thompson, et al., Eds., ACS Symposium Series, Washington D.C. (1983)).
4A–4H veranschaulichen die Schritte beim Bilden eines scheibenförmigen Partikels 400 mit Reservoirs (4E) durch Fotolithographietechniken. Wie dargestellt umfasst die Struktur eine Polymerschicht, welche eine planare Fläche 402 bildet. Die Polymerfläche wird gemäß üblichen Verfahren zum Abscheiden von Metallschichten, wie beispielsweise chemische Abscheidung aus der Gasphase, Sputtering und ähnliche, und/oder Verfahren zum Erzeugen von dünnem Polymerschichtmaterial gebildet.
Bei einem ersten Schritt des Verfahrens wird die Polymerschicht an einer Opferschicht 404, wie beispielsweise einem phosphordotierten Silizium, befestigt oder anderweitig angebunden, welche wiederum auf einen üblichen Silizium-Wafer 406 aufgebracht wird. Die Oberseite der Polymerschicht wird durch chemische Abscheidung aus der Dampfphase mit einer fotoresistenten Schicht 408 beschichtet. Geeignete negativ- oder positivresistente Materialien sind bekannt, beispielsweise INTRODUCTION TO MICROLITHOGRAPHY, Thompson, et al., Eds., ACS Symposium Series, Washington D.C. (1983). Weitere Details über bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Einrichtungen verwendbaren Herstellungsverfahren im Mikrometerbereich sind beispielsweise beschrieben in den PCT-Publikationen WO 95/24261 , WO 95/24472 und WO 95/24736 .
Die beschichtete Polymerschicht wird durch eine Fotomaske 410 mit einer Serie von kreisförmigen Öffnungen, wie beispielsweise Öffnung 412, die in der Größe der gewünschten Größe der Partikel entsprechen, bestrahlt. Verfahren zum Ausbilden von Fotomasken mit gewünschten Fotomaskenmustern sind bekannt.
Bei dem unter Bezugnahme auf die 4A–4D beschriebenen Ausführungsbeispiel ist das Fotoresist ein negativer Fotolack, was bedeutet, dass die Aussetzung des Fotolackes gegenüber einer ausgewählten Wellenlänge, beispielsweise UV-Licht, eine chemische Veränderung (angedeutet durch Kreuzschraffur) erzeugt, die den veränderten Fotolack gegenüber einer Ätzung durch ein geeignetes Ätzmittel resistent macht. Die Erscheinung der beschichteten Polymerschicht nach der Fotomaskenbestrahlung mit UV-Licht ist in 3C wiedergegeben. Wie es zu sehen ist, ist die Polymerschicht 402 nun mit einer Mehr zahl von diskreten scheibenförmigen Fotolackelementen überzogen, wie beispielsweise Elemente 408, die in der Größe den Abmessungen der gewünschten Partikel entsprechen.
Die Polymerschicht wird nun mit einem Ätzmaterial behandelt, das die Auflösung des Polymers bei den ausgesetzten Bereichen der Polymerschicht bewirkt. Im Falle einer Metallschicht kann das Ätzmittel eine geeignete Säurelösung sein. In dem Falle einer laminierten biologisch abbaubaren Polymerschicht kann das Ätzmittel eine Enzymlösung, eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert, der zum Aufbrechen des Polymers geeignet ist, oder ein organisches Lösungsmittel, dass den speziellen Polymer auflöst, sein. Die Polymerschicht weist nach der vollständigen Ätzung die Erscheinung gemäß 4C auf, welche eine Serie von scheibenförmigen mit Fotolack beschichteten Elementen auf der Opferschicht darstellt. Bei den abschließenden Herstellungsschritten wird der Fotolack durch eine geeignete chemische Behandlung entfernt (4D).
4E–4H veranschaulichen ein weiteres Fotolithographieverfahren, welches zum Erzeugen von scheibenförmigen Partikeln mit Poren oder Reservoirs, wie beispielsweise bei 400 gezeigt, verwendet werden kann. Bei diesem Verfahren wird die geätzte Polymer/Opferschicht-Struktur oder das Substrat, gezeigt in 4D, ferner mit einem positiven Fotolackmaterial 414 beschichtet, wie es in 4E gezeigt ist. Der beschichtete Polymer wird dann durch eine Fotomaske 416 mit einer Serie von kreisförmigen Öffnungen, wie beispielsweise Öffnung 418, bestrahlt, deren Durchmesser dem gewünschten „Innen"-Durchmesser der Reservoirs entsprechen. Die Maske wird, wie gezeigt, an dem Substrat ausgerichtet, so dass die Maskenöffnungen mit den bereits ausgeformten Scheiben in dem Substrat fluchten.
Die Bestrahlung des Substrat durch die Fotomaske bewirkt foto-induzierte Veränderungen in dem Fotolack (angedeutet durch Kreuz-Punkt-Muster), was die bestrahlten Bereiche anfällig gegenüber einem ausgewählten Ätzmittel macht. Die Erscheinung des beschichteten Laminats nach der Fotomaskenbestrahlung mit UV-Licht ist in 4F gezeigt. Wie es zu sehen ist, ist die Polymerschicht 402 nun mit einer Mehrzahl von diskreten scheibenförmigen positiven Fotolackelementen bedeckt, wie beispielsweise Element 420, welche in ihrer Größe den planaren Abmessungen der gewünschten Reservoirs entsprechen. Die Polymerschicht wird nun mit einem geeigneten zweiten Ätzmaterial behandelt. Das Timing des Ätzschrittes wird so gewählt, dass die Schicht lediglich teilweise geätzt wird, was in der Schicht blinde Poren erzeugt. Die Erscheinung des Polymers nach einer solchen Ätzung ist in 4G gezeigt. Wie es zu sehen ist, hat diese Behandlung zylindrische Poren, wie beispielsweise Öffnung 430, in dem Zentrum jeder Mikrostruktur 400 in dem Substrat erzeugt. Eine Entfernung der Opferschicht erzeugt die freien Partikel 400, was in 4H gezeigt ist.
Es ist ersichtlich, dass die wie soeben beschrieben gebildeten Partikel zum Erzeugen anderer gewünschter Oberflächenmerkmale oder Schichten mit üblichen Fotolithographie-Techniken weiter behandelt werden können. Darüber hinaus können Reservoirs oder Poren mit einem Material, dass sich von dem Material der Mikrostruktur unterscheidet, gemäß bekannten Verfahren gefüllt werden. Beispielsweise können solche Reservoirs mit einem ausgewählten therapeutischen Protein, wie beispielsweise Interferon, Insulin, verschiedenen Proteasen, luteinisierendem Hormon und seinen Analogons und ähnlichem gefüllt werden.
Bei einem anderen allgemeinen Verfahren werden die Partikel aus einem Substrat durch Fotoablationstechniken mit einem Excimer-Laser gebildet. Verfahren der Laser-Mikrobearbeitung oder Trockenätzen wurden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5,368,430 , 4,994,639 , 5,018,164 , 4,478,677 , 5,236,551 und 5,313,043 beschrieben. Dieses Verfahren ist am Besten für ein polymerisches Substrat geeignet, und zwar aufgrund der Einfachheit, mit welcher ein Laserstrahl Polymerstrukturen durch Lichtimpulse abtragen kann. Erfindungsgemäße Partikel, wie beispielsweise 504 in 5A veranschaulicht, können ebenfalls durch Schneiden oder „Stanzen" einzelner Partikel von einer Vielzahl von Polymervorratsschichten mit Track-geätzten Poren erhalten werden. Solche polymeren Vorratsschichten aus Polycarbonat und Polyester sind kommerziell verfügbar. Die Poren sind gleichförmige, zylindrische blinde Taschen oder Reservoirs auf beiden Seiten, wie beispielsweise Poren 502 in 5A. Ein nichtporöses Trägermaterial 128 kann auf eine Seite der Schicht aufgebracht werden, was eine asymmetrische Struktur erzeugt, bei welcher sich die Poren lediglich zu einer Seite öffnen. Reaktive chemische Gruppen, wie beispielsweise Aminofunktionen 510 in 5B, können auf die Seite der Schicht aufgebracht werden, zu welcher sich die Poren öffnen.
II. Anwendungen
Erfindungsgemäße Partikel und Zusammensetzungen können einem Probanden verabreicht werden, der einen oralen therapeutischen Eingriff benötigt. Wie es oberhalb beschrieben ist, sind erfindungsgemäße Partikel insbesondere nützlich bei der Zuführung von schlecht absorbiertem Protein, Peptid, Oligonucleotid und anderen biopolymeren Medikamenten.
III. Beispiele
A. Im Mikrometerbereich hergestellte Partikel für die orale Applikation von EPO
4A–4H veranschaulichen die Schritte beim Bilden eines scheibenförmigen Partikels durch Fotolithographie-Techniken an einem üblichen 4''Typ-Einkristall-Silizium-Wafer (SC). 100 nm Siliziumoxid werden thermisch bei 1000°C unter „nassen" Bedingungen auf dem SC-Siliziumsubstrat gezüchtet, um eine (nicht gezeigte) Säurestoppschicht zu bilden. Eine Opferschicht aus polykristallinem Silizium (Poly; 1830 nm) wird auf der Säurestoppschicht durch chemische Abscheidung aus der Dampfphase bei geringem Druck (LP-CVD) in einem Tylan-Ofen (605°C, 300 mTorr, 100,0 sccm SiH₄) abgeschieden und der Wafer wird für eine Stunde bei 1000°C ausgeheizt, um verbliebene Spannungen zu entfernen. Eine 900 nm LTO-Schicht wird auf dem Opfer-Poly durch LP-CVD in einem Tylan-Ofen (450°C, 300 mTorr, 60,0 sccm SiH₄, 90,0 sccm O₂, 0,4 sccm PH₃) zum Ausbilden der Mikropartikelschicht abgeschieden und wiederum wird der Wafer für eine Stunde bei 1000°C zum Verdichten der LTO ausgeheizt. Die Wafer werden auf der LTO-Oberfläche durch UV-Fotolithographie mit einem GCA 6200 DSW Wafer Stepper (GCA MANN Products) gemustert, um ein Fotolack(PR)-Muster von kreisförmigen Bereichen von 100 bis 200 Mikrometer im Durchmesser zu erhalten. Der Wafer wird dann ausgehärtet. Die ausgesetzten Bereiche der LTO auf der PR-gemusterten LTO-Oberfläche werden in einem LAM Plasmaätzer (850W @ 0,38 cm Lücke, 2,8 Torr, 120 sccm He, 30,0 sccm CHF₃, 90,0 sccm CF₄) geätzt. Verbleibender Fotolack wird in einem Pirhana (5 Teile 18 M H₂SO₄, 1 Teil 30%iges H₂O₂) entfernt, um einen Wafer mit separaten an der unterliegenden Poly-Schicht befestigten Mikropartikeln zu erhalten.
Die verbleibenden LTO-Partikel werden mit einer zweiten positiven Fotolackschicht beschichtet und ein zweites Mal durch eine Fotomaske mit einem feineren Muster von kreisförmigen Öffnungen UV-Licht ausgesetzt. Die Durchmesser der Öffnungen und die Dichte der Öffnungen innerhalb der Fotomaske werden ausgewählt, um geeignete Poren oder Reservoirs mit einem Durchmesser von 10 bis 20 Mikrometer in den LTO-Partikeln zu erhalten. Die ausgesetzte Schicht wird dann mit einem zweiten Ätzmaterial behandelt, das den Polymer bei den ausgesetzten Bereichen teilweise auflöst, was eine Mehrzahl von zylinder- oder kegelförmigen Poren oder Reservoirs in jedem Partikel ergibt. Wichtig ist, dass die Bedingungen so justiert werden, dass die Schicht bis auf eine gewünschte Tiefe geätzt wird, aber nicht vollständig durch die Polymerschicht. Im Falle einer Metallschicht kann das Ätzmittel eine geeignete Säurelösung sein. In dem Falle einer biologisch abbaubaren oder einer biokompatiblen Polymerschicht kann das Ätzmittel eine Enzymlösung, eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert, der zum Aufbrechen des Polymers geeignet ist, oder ein organisches Lösungsmittel sein, welches den jeweiligen Polymer auflöst.
Anschließend wird die obere Fläche der Partikel chemisch modifiziert, um reaktive chemische Gruppen, wie beispielsweise primäre Amino- oder Thiol-Gruppen, zu erhalten. Ein bevorzug tes Verfahren zum Einführen solcher Gruppen in die ersten paar molekularen Schichten des Polymermaterials ist die nachfolgend für Polycarbonatrollen beschriebene Gasplasmabehandlung.
Die Opfer-Poly-Schicht wird dann durch eine Nassätzung in 6M KOH bei 80°C (1–2 Minuten) entfernt, um die Partikel in die Lösung freizusetzen. Nachdem die Partikel freigesetzt wurden, wird der pH-Wert sofort auf unter 8 reduziert und die Partikel werden in neutralem H₂O gelagert (spezifischer Widerstand > 17,8 Mohms/cm). Die Partikel werden in PBS suspendiert und die Schleimhaut anhaftenden Liganden werden über diese reaktiven chemischen Gruppen unter Verwendung der gleichen Verfahren, wie sie unterhalb beschrieben werden, aufgepfropft.
Die Lösung mit dem therapeutischen Peptid oder Protein wird bei diesem Punkt des Verfahrens in die Poren gefüllt. Die Partikel werden gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, auf einem Filter gesammelt und bei reduziertem Druck getrocknet. Die Partikel werden wieder in einer entgasten Lösung von EPO zusammen mit Trägerstoffen suspendiert, wie es detailliert im nachfolgenden Beispiel B beschrieben ist. Die Suspension wird vermindertem Druck ausgesetzt, um sicherzustellen, dass eingeschlossene Luft aus den Poren in den Partikeln entfernt wird. Die Partikel werden vollständig in die Lösung eingetaucht und der Druck wird geringfügig über Atmosphärendruck erhöht, um sicherzustellen, dass die Lösung in sämtliche der Poren eintritt. Die Partikel werden wiederum auf einem Filter gesammelt und unter Verwendung einer der drei detailliert nachfolgend (als Beispiel B) beschriebenen Verfahren getrocknet.
B. Polycarbonatrollen mit PCTE-Mirkoreservoirs für orale Applikation von EPO
Rollen mit 50–75 μm dickem Track-geätztem Polycarbonat-Polymerschichtmaterial (PCTE) wird aus kommerziellen Quellen, wie beispielsweise Osmonics Laboratory and Specialty Products Group (111 Lindberg Avenue, Livermore, CA 94550) erhalten. Die spezifische Porendichte beträgt 1–5 × 10⁵ Poren/cm², der Porendurchmesser beträgt 10–20 μm und die Porentiefe beträgt 12–25 μm. PCTE wird in einem Verfahren mit zwei Schritten hergestellt. Bei dem ersten wird ein 50–75 μm dicker Polycarbonatfilm gebündelten Hochenergiepartikeln (40 mev) ausgesetzt, die von einer Plutoniumquelle ausgestrahlt werden. Die Partikel dringen ungefähr 12–25 μm in beide Seiten des Films ein und hinterlassen sensibilisierte Spuren entlang ihres Weges. Die Anzahl von Spuren bzw. Tracks pro Quadratzentimeter hängt von der Zeitdauer ab, welche der Film in dem Reaktor ist. In diesem Fall wird die Zeit derart eingestellt, eine Porendichte von ungefähr 1–5 × 10⁵ Poren/cm² zu erzeugen. Bei dem zweiten Schritt werden die von den Partikeln hinterlassenen Spuren zu gleichförmigen blinden zylindrischen Poren oder Reservoirs vorzugsweise geätzt, und zwar durch Behandlung mit einer stark alkalischen Lösung wie beispielsweise NaOH. Die Temperatur, Stärke (Molarität) der Ätzlösung und die Zeit werden derart eingestellt, dass Poren mit einem Durchmesser von ungefähr 10–20 μm und einer Tiefe von 12–25 μm erhalten werden. Ein Laminatträger kann auf eine Seite der Polycarbonatschichten aufgebracht werden.
Aufpfropfen von primären Amingruppen auf eine Seite der Polycarbonatschichten
Zum Einführen von reaktiven primären Aminogruppen auf einer Seite der Polycarbonatschichten wird eine Glimmentladungs- oder Gasplasmatechnik verwendet. Eine Oberflächenmodifikation mit Gasplasma wird in einer Vakuumkammer durchgeführt, und zwar in der Gegenwart von Ammoniumdampf, und wurde zum Modifizieren von Kunststoff- und Polymeroberflächen verwendet (Kany et al., Biomaterials 18(6):1099–107;1997 und Siphia, Biomater Artif Cells Artif Organs 18(3)37–46;1990 und Benedict und Williams, Biomater Med Devices Artif Organs 7(4):477–93;1979 und Liu et al., J Biomed Mater Sci 27(7): 909–15;1993). Zum Maximieren der Effizienz kann eine kontinuierliche Air-to-Air Reel-to-Reel Filmbearbeitungsmaschine verwendet werden. Eine derartige Bearbeitungsausrüstung ist auf Vertragsbasis bei MetroLine, Inc. (251 Corporate Terrace Corona, CA 91719) verfügbar. Bearbeitungsgeschwindigkeiten bis zu 15 Fuß pro Sekun de können erreicht werden und die Kosten der Bearbeitung signifakt vermindern. Bis zu sechs parallele Linien, oder Filme bis zu einer Breite von 24 Inch, sind einfach erreichbar.
Gasplasma ist ionisiertes Gas, der vierte Aggregatzustand. Ein Plasma wird gebildet, wenn ein Gas, in diesem Fall Ammoniak, einer Energie, üblicherweise einem elektrischen Feld, ausgesetzt wird. Kalte Gasplasmareaktionen werden in einer Vakuumkammer ausgeführt, gebaut entweder aus Pyrex, Quarz oder Aluminium, und hat entweder eine interne oder externe Elektrodenkonfiguration. Gase mit geringem Druck werden dann unter Verwendung einer Radiofrequenz(RF)-Energiequelle bei 13,56 MHz ionisiert. Die RF-Energie entfernt die Elektroden von den Gasspezies, was freie Elektronen, Ionen und angeregte Moleküle erzeugt. Wenn die angeregten Moleküle mit den Elektronen rekombinieren, werden Photonen freigesetzt, die das „Glühen" erzeugen, was mit Gasplasmen verbunden ist. Jeder Gastyp „glüht" mit einer spezifischen Farbe. Sobald die RF-Energie abgeschaltet wird, rekombinieren die Gasmoleküle und bilden stabile Moleküle und werden aus der Kammer entfernt.
Die hier verwendeten Oberflächenmodifikationen mit Gasplasma, die in die Kategorien molekularer Modifikationen fallen (oft bezeichnet als Ätzen oder molekulare Modifikation einer Oberfläche), ergeben eine neue chemische Oberfläche, ohne tatsächlich irgendein zusätzliches Material abzuscheiden.
Es gibt eine Anzahl von kritischen Parametern, welche während des Plasmabehandlungszyklus gesteuert werden. Jegliche Veränderung dieser Parameter wird das Ergebnis der Modifikation beeinflussen. Sie umfassen: Gastyp, Energie, Druck, Fluss und natürlich Zeit.
C. Kammer- und Halterungs-Konfiguration
Verschiedene andere Faktoren, wie beispielsweise Umgebungsbedingungen, relative Luftfeuchtigkeit während des Komponentengießens, Oberflächenverunreinigungen der Substrate oder Polymervariationen zwischen verschiedenen Lots, können die Behandlung beeinflussen. Eine molekulare Modifikation verändert die chemische Struktur der Oberfläche eines organischen Mate rials, in diesem Fall Polycarbonat. Ammoniakgas ionisiert unter dem Einfluss der elektrischen Entladung. Während des Ionisierungszyklusses sich mit hohen Geschwindigkeiten bewegende Moleküle schlagen auf der Oberfläche des Polycarbonat ein und verursachen eine Fragmentierung der Polycarbonat-Polymerkette und bilden reaktive Spezies wie beispielsweise Radikale. Einige der ionisierten Ammoniakmoleküle binden sich dann selbst an die Substratoberfläche, wodurch eine Schicht von kovalent gebundenen primären Aminogruppen entsteht.
Eine Modifikation durch Entladung eines Ammoniakplasmas beeinflusst 25 bis 250 Angström der Substratoberfläche und ändert somit nicht die Bulk-Eigenschaften des unterliegenden Polymersubstrats.
Reaktive Aminogruppen können ferner unter Verwendung von Glühentladungstechniken in der Gegenwart von Alkylamindämpfen, wie beispielsweise Butylamin (Tseng und Edelmann, J Biomed Mater Res 42(2):188–98;1998) und Ethylendiamin (Denizli et al., J Biomater Sci Polym Ed 10(3):305–18;1999), in Polymeroberflächen eingebracht werden.
Eine Glimmentladungsbehandlung im Radiofrequenzbereich in der Gegenwart von Wasser- oder H₂O₂-Dampf oder eine Glimmentladung in Luft (O₂) kann ferner zum Einführen reaktiver Hydroxyl-Gruppen in Polymeroberflächen verwendet werden (Patterson, et al., ASAIO 41(3):M625–9;1995 und Kang et al., Biomaterials 17(8):841–7;1996 und Vargo et al., J Biomed Mater Res 29(6):767–78;1995 und Ozden et al., Dent Mater 13(3):174–8;1997). Zum Verbinden der Amino-haltigen Proteinliganden mit der OH-modifizierten Polymeroberfläche können wasserlösliche Kondensationsmittel wie beispielsweise Carbodiiamid verwendet werden. Das Polycarbonat kann durch Einführung von reaktiven Doppelbindungen durch Behandlung mit Glycidylacrylat modifiziert werden (Karmath und Park, J Appl Biomater 5(2):163–73;1994).
Es sei angemerkt, dass andere Oberflächenmodifikationstechniken, wie beispielsweise Propfpolymerization durch h-Strahlung, zum Einführen reaktiver Gruppen auf die Vorderseite der Partikel verwendet werden können (siehe beispielsweise I kadal, Biomaterials 15(10):725–36;1994 und Amiji und Park, J Biomater Sci Polym Ed 4(3):217–34;1993 und Kamath und Park, J Appl Biomater 5(2):163–73;1994).
D. Chemisches Anbinden von Lektinen an Amino-modifizierte Polycarbonatoberflächen
7 veranschaulicht das System der fortlaufenden Herstellung von erfindungsgemäßen Partikeln. Es wird auf 7A Bezug genommen. Die Polycarbonatvorratsrolle 710 mit Poren oder Reservoirs 712 mit einem Durchmesser von 10–20 μm und oberflächenreaktiven Aminogruppen 714 (kommerziell erhalten von Osmonics/MetroLine, siehe oben) wird auf einem mit Führungswalzen, wie beispielsweise 716, auf einem Band bewegt. Die Schicht bewegt sich durch 718 und wird in eine Lösung von SMCC oder ein ähnliches heterobifunktionales Reagenz 720 getaucht (Pierce Chemical Company, Rockford, II 61105), wodurch Thiol-reaktive Maleimid-Gruppen auf der Oberseite des Polycarbonats 712 eingeführt werden.
Die Reaktion ist so gut wie stoichiometrisch (6). Heterobifunktionale Reagenzien mit erweiterten Spacer-Armen können ferner zum Verbessern der Kopplungseffizienzen durch Verminderung der sterischen Hinderung verwendet werden (Bienarz et al., Bioconjugate Chem 7:88–95;1996). Wenn sich die Schicht aus der Wanne bewegt, verbleibt eine gewisse Menge Lösung in den Poren 724. Die Schicht bewegt sich dann in eine Vakuumkammer 726. Wenn das Vakuum angelegt wird, bewegt sich Wasserdampf aus der Kammer 728 und wird kondensiert (nicht gezeigt). Der Druck innerhalb der Vakuumkammer 726 kann wahlweise vermindert und dann erhöht werden, um sicherzustellen, dass sämtliche eingefangene Luft aus den Poren entfernt wird. Innerhalb der Vakuumkammer wird die Schicht durch Besprühen der Schicht über eine Düse 730 mit Wasser 732 gespült, wobei das Wasser in einem Ableitbereich 734 gesammelt und durch eine Ableitung 736 entfernt wird. Die Schicht bewegt sich anschließend in eine Vakuumkammer 738. Es wird ein hohes Vakuum angelegt und in den Poren 740 verbliebenes Wasser verdampft, und Wasserdampf verlässt die Kammer 742. Die Poren sind nun tro cken 744. Die Thiol-reaktive Maleimid-Gruppen umfassende Schicht bewegt sich 746 zu dem Ligand-Modifikationsmodul (7B).
Es wird auf 7B Bezug genommen. Die Polycarbonatvorratsrolle 710 mit Poren oder Reservoirs 712 mit einem Durchmesser von 10–20 μm und den oberhalb eingeführten Thiolreaktiven Maleimid-Oberflächengruppen wird in einer Reel-to-Reel-Konfiguration angeordnet, so dass sich die Polycarbonatschicht auf einem Band bewegt, wobei Führungsrollen, wie beispielsweise 716, bewirken, dass es in die Wanne 750 eintaucht. Innerhalb der Wanne wird die Schicht in eine hochreine Lösung mit Weizenkeim-Agglutinin oder Lycopersicon esculentum (Tomate)-Lektin 752 getaucht. Beide Lektine wurden als lyophilizierte Pulver von der Sigma Chemical Company (St. Louis, MO 63178) erhalten. Eine Lösung von 20 mg jedes Pulvers wird mit 1 ml einer Phosphat-gepufferten isotonischen Salzlösung (PBS) erhalten.
Vor der Anordnung in der Wanne werden beide Lektine unter Verwendung von SPDP, folgend dem Verfahren von Carlsson et al. (Biochem. J 173:723–37;1978), thioliert. Die Bedingungen werden so eingestellt, 1,5-6-SH-Gruppen pro Lektin-Molekül nach milder Reduktion zu erhalten. Das thiolierte Lektin wird chemisch an die Thiol-reaktiven Maleimid-Gruppen 754 (6) gebunden. Die Geschwindigkeit des Fortschreitens und die Temperatur werden derart eingestellt, dass ein adäquates Koppeln des Thiol-enthaltenden Lektins an das Thiol-reaktive Polymer sichergestellt ist, während sich der Polymerfilm durch die Wanne bewegt. Die Bewegung der Polycarbonatschicht kann angehalten werden, um dem untergetauchten Segment eine ausreichende Zeit für die Lektin-Kopplung zur Verfügung zu stellen. Wenn sich die Schicht aus der Wanne bewegt, verbleibt die Lösung in den Poren 756.
Die Polycarbonatschicht wird dann entweder durch Führen durch eine zweite Wanne mit destilliertem Wasser (nicht gezeigt) oder Besprühen mit destilliertem Wasser gewaschen. Im Falle des Waschens durch Besprühen wird die Schicht in eine Vakuumkammer 758 geführt. Wenn das Vakuum angelegt ist, wird Wasserdampf aus der Kammer 760 geführt und kondensiert (nicht gezeigt). Innerhalb der Vakuumkammer wird die Schicht durch Besprühen der Schicht aus einer Düse 762 mit Wasser gewaschen, welches in einem Ableitbereich 766 gesammelt und durch eine Ableitung 768 entfernt wird. Nach dem Waschen wird die Schicht dann in eine Vakuumkammer 770 geführt. Innerhalb dieser Kammer wird der Film sanft getrocknet, um sicherzustellen, dass die Poren von sämtlichem Fluid befreit sind. In dem Falle einer Gefriertrocknung wird ein flacher Wärmeaustauscher in gutem thermischem Kontakt (direkt oberhalb) zu dem Polycarbonatfilm angeordnet. Ein flüssiges Kältemittel bei Temperaturen zwischen –20°C und –60°C (wie beispielsweise Freon oder eine kalte Flüssigkeit, wie beispielsweise flüssiger Stickstoff) wird durch den Wärmeaustauscher geführt, um jegliches auf dem Film oder innerhalb der Poren verbliebene Wasser zu gefrieren. Der Druck wird vermindert, bis das gesamte Wasser sublimiert.
Bei dem in 7B gezeigten Beispiel wird das Trocknen durch Verdampfen des verbliebenen Wassers bei vermindertem Druck in einer Vakuumkammer 770 oder durch Führen eines Stromes von warmer Luft oder Inertgas, wie beispielsweise Stickstoff, über die Oberfläche des Filmes (nicht gezeigt) oder durch Gefriertrocknen wie oberhalb erwähnt erreicht. In dem Fall der hier beispielhaft dargelegten Vakuumtrocknung wird ein hohes Vakuum angelegt und innerhalb der Poren 772 verbliebenes Wasser verdampft, und Wasserdampf wird aus der Kammer 774 geführt. Die Poren sind nun trocken 776. Die Schicht mit dem chemisch auf die Oberfläche aufgepfropften Lektin wird in das Abfüllmodul (7C) geführt 778.
E. Befüllen der Reservoirs mit EPO; Mischen von EPO mit Trägerstoffen, welche eine verzögerte Freisetzung aus Mikro-Reservoirs bedingen
Eine Lösung von 50 mg/ml menschlichem rekombinanten Erythropoietin (EPO, 80 000 Einheiten pro Milligramm, Sigma Chemical Company) wird in PBS hergestellt. Eine Anzahl von wasserlöslichen Trägerstoffen können dieser Lösung zugefügt werden, um die Auflösung nach Trocknung zu verzögern. Diese umfassen Polymere, Dextrane, Maltodextrine, Gelatinen, Disintegranten, wie beispielsweise Explotab, Polyplasdone, Amberlit IRP 88, Mais- oder Kartoffelstärke und Elcema P100.
F. Befüllen von Reservoirs mit der EPO/Trägerstoff-Lösung
Es wird Bezug genommen auf 7C. Eine Polycarbonatvorratsrolle 710 mit Poren 712 und wie oben eingeführten chemisch aufgepfropften Lektin-Gruppen 780 wird entlang eines mit Führungsrollen, wie beispielsweise 716, ausgestatteten Bandes geführt. Eine entgaste Lösung von EPO/Trägerstoffen 784 wird in einer versiegelten Kammer 782 in einer Wanne angeordnet. Segmente der Polycarbonatvorratsrolle (welche mit Weizenkeim-Agglutinin, Tomaten-Lektin oder an einem anderen geeigneten Schleimhaut anhaftenden Mittel modifiziert wurden) werden auf Rollen in die Kammer geführt und in der Wanne untergetaucht. Zum Entfernen jeglicher eingefangener Luft innerhalb der Reservoirs bei den untergetauchten Segmenten des Polycarbonatfilms wird der Druck in der Kammer reduziert 786, und dann geringfügig über Atmosphärendruck angehoben. Dieses Verfahren wird wiederholt, wenn neue Segmente der Vorratsrolle durch die Wanne bewegt werden. Wenn der Film die Wanne verlässt, schabt ein Gummiblatt sämtliche überschüssige EPO-Lösung ab und führt sie in die Wanne zurück. Wahlweise wird ein rascher Strom von Druckluft (oder einem Inertgas wie beispielsweise Stickstoff) über der Oberfläche des Filmes erzeugt, wenn er die Wanne verlässt, um sämtlichen Überschuss von EPO-Lösung in eine Sammelleitung zu zwingen, die sie in die Wanne zurückführt (nicht gezeigt).
G. Mischen einer EPO/Trägerstoff-Lösung mit Permeations-Enhancern und/oder Peptidase-Inhibitoren
EPO ist ein relativ großes Polypeptid und als solches ist sein intrinsisches Absorptionspotential durch die Schleimhaut des Dünn- und Dickdarms minimal und somit ist die orale Bioverfügbarkeit gering. Aus diesem Grunde ist es notwendig, Permeations-Enhancer und/oder Peptidase-Inhibitoren „on-board" des Zuführungspartikels aufzunehmen, die zusammen mit dem EPO freigesetzt werden sollen. Von sowohl solchen Enhancern als auch Enzym-Inhibitoren ist bekannt, dass sie die Peptid- und Proteinabsorption auf eine dosisabhängige Weise verbessern.
In diesem Fall werden geeignete wasserlösliche Permeations-Enhancer und/oder Peptidase-Inhibitoren mit der EPO/Trägerstoff-Lösung gemischt und in die Reservoirs des Polycarbonatfilms gefüllt, wie es oberhalb beschrieben ist. Die Freisetzung des Enhancers und/oder der Peptidase-Inhibitoren aus den Reservoirs in Verbindung mit dem Medikament vereinfacht die Bewegung des EPO durch die Darmepithel in vivo.
H. Trocknung
Nach Einfüllen der EPO/Trägerstoff-Lösung (mit oder ohne Permeations-Enhancer und/oder Peptidase-Inhibitor-Lösung) in die Reservoirs des mit dem Tomaten-Lektin oder Weizenkeim-Agglutinin modifizierten Polycarbonatfilms wird ein Trocknen durch eine (oder eine Kombination) der drei Verfahren erreicht. Wasser wird durch Verdampfen unter vermindertem Druck in einer Vakuumkammer 788 oder durch Führen eines Stromes warmer Luft oder eines Inertgases (wie beispielsweise Stickstoff) über die Oberfläche des Films (nicht gezeigt) oder durch Gefriertrocknung entfernt. Im Falle der Gefriertrocknung wird ein flacher Wärmeaustauscher 792 in gutem thermischen Kontakt (direkt über) dem Polycarbonatfilm angeordnet. Ein Kältemittelfluid wird bei Temperaturen von –20°C bis –60°C (wie beispielsweise Freon oder eine kalte Flüssigkeit, wie beispielsweise flüssiger Stickstoff) durch den Wärmetauscher geführt, strömt in Öffnung 724 und fließt aus der Öffnung 796, um sämtliche auf dem Film oder in den Poren 798 verbliebenes Wasser zu gefrieren. Der Druck wird vermindert, bis das gesamte Wasser sublimiert 799.
I. Herstellung einer mikroskopischen Scheibe von dem Polycarbonatschichtvorrat unter Verwendung einer „Scheiben-Stanz"-Vorrichtung im Mikrometerbereich
1. Herstellung einer „Scheiben-Stanz"-Vorrichtung im Mikrometerbereich
8 zeigt ein Diagramm einer „Scheiben-Stanz"-Vorrichtung im Mikrometerbereich, welche gestaltet ist, wie ein mikroskopischer Papierlocher zu arbeiten. Der medikamentgefüllte Polycarbonatfilm wird entlang Führungsrollen in die Vorrichtung geführt und unterhalb einem zweidimensionalen Array von vorstehenden zylindrischen Stäben mit einem Durchmesser von 100 μm–1 mm und einer Länge von ungefähr 10–100 mm ausgerichtet. Unterhalb der Schicht ist ein Array von zylindrischen Öffnungen angeordnet, wobei die Öffnungen jeweils gestaltet sind, eine einzelne Stange aufzunehmen, wenn sie gesenkt ist. Die Aufnahmeöffnungen werden derart hergestellt, dass sie mit den Stangen so eng wie möglich zusammenpassen und sind unten geöffnet. Unterhalb der Öffnungen ist ein Sammeltrichter.
2. Kontinuierliches Stanzen von 200 μm EPO-gefüllten Scheiben aus einem Polycarbonatschichtvorrat
Die Polycarbonatschicht 800 mit mit EPO-gefüllten Poren wird unter Verwendung einer mit Führungsstäben 808 zum Sicherstellen einer präzisen Ausrichtung ausgestatteten Presse 806 in einer schnellen Abwärtsbewegung in die Stanzanordnung geführt und das Stangen-Array 802 wird in die Öffnungen des Aufnahme-Arrays 804 herabgesenkt. Das System ist vorzugsweise mit einem pneumatischen Kolben 808 zum Bereitstellen der Abwärtsbewegung während der Druckbeaufschlagung 810 und einem Satz von Widerstandsfedern 812 zum Zurückziehen der Stangenanordnung aufwärts, wenn die Druckbeaufschlagung des Kolbens aussetzt, ausgestattet (gezeigt in 8). Die Abwärtsbewegung der Stangen stanzt scheibenförmige Partikel aus der Polycarbonatschicht 814. Der Ausschnitt veranschaulicht einen einzelnen Partikel 816 mit an der Oberseite befestigten Liganden und mit mit einer trockenen EPO/Trägerstoff-Mischung gefüllten Poren. Nachdem die Stangenanordnung zurückgezogen ist, werden die Partikel, welche aus den offenen Enden der Öffnungen fallen, unter Verwendung des Aufnahmetrichters 822 gesammelt. Da die Partikel klein und trocken sind, können die Seiten des Trichters in Vibration versetzt werden, um eine Abwärtsbewegung der Partikel in dem Trichter in ein Sammelgefäß zu vereinfachen. Wahlweise kann ein Luftstrom verwendet werden, um die Partikel aus den Öffnungen hinab in den Trichter und in das Aufnahmegefäß zu treiben. Der Vorgang wird kontinuierlich ausgeführt, indem das Fortbewegen der Polycarbonatschicht während der Abwärtsbewegung des Stangen-Arrays wiederholt wird.
3. Einfüllen von medikamentbefüllten Partikeln in magensaftresistente Kapseln und Verabreichung

Die trockenen EPO-gefüllten Partikel, gesammelt wie oben, werden gewogen, mit einem entsprechenden Füllpulver (wie beispielsweise pulverisierte Laktose oder mikrokristallinem Zellulosezucker) gemischt, in entsprechende Unit-Dosen geteilt und in übliche magensaftresistente Kapseln gefüllt. Es wird die orale Route verwendet, um Patienten, die an einer Anämie leiden, die Kapseln mit entsprechenden Dosen und Zeitplänen zu verabreichen.

Tabelle 1: Schleimhaut anhaftende Liganden
Ligand	Bindungsspezifität
Pflanzen-Lektine
Weizenkeim-Agglutinin	(D-glcNAc)₂
Tomaten-Lektin	(D-glcNAc)₄
Ulex europaeus-Agglutin-I und -II	(-L-Fucose
Ulex europaeus-Agglutinin II	(D-glcNAc)₂
Phaseoulus vulgaris-Agglutinin	Galaktose/NAcGal
Lotus tetragonologus (Asparagus pea-Lektin	(-L-Fucose
Vitamine
Vitamin B₁₂	Entsprechender Rezeptor
Riboflavin	Entsprechender Rezeptor
Folsäure	Entsprechender Rezeptor
Transferrin	Entsprechender Rezeptor
Polymermaterialien
Tragant
Carbopole (Polycarbophil)
Polyacrylsäure und verwandte Substanzen	Muzin/Zell-Oberflächen-Glykoproteine
Natriumcarboxymethylzellulose	keine spezifische Bindung
Polyethylenoxid
Poly(methylvinylether-co-maleinsäureanhydrid)
Natriumalginat
Methylzellulose
Polyacrylsäure und Polycarbophil
Bakterielle/Virale Invasionsfaktoren
Escherichia coli-Typ-1-Fimbrien	Galaktoproteine/Ganglioside
Mycoplasma gallisepticum-Lektin	Sialinsäure
B-Untereinheit von Choleratoxin	Ganglioside

Tabelle 2: Bevorzugte Penetrations-Enhancer
Enhancer-Klasse	Spezielle Beispiele
Gallensalze	Glyo-Deoxycholat Taruro-Deoxycholat Taruro-Deoxycholat Tauro-Chenodeoxycholat Glyco-Chenodexycholat Taurocholat Glycocholat Glycoursocholat Tauroursocholat Dexoycolat Chenodeoxycholat Cholat Ursocholat
Nichtionische oberflächenaktive Stoffe	Polyoxyethylenether (POE) (beispielsweise Brij, Texa) Alkylphenoxy-POEs (Triton, Igepal, Surfonic)
Anionische oberflächenaktive Substanzen	Natriumdodecylsulfat Dioctylnatriumsulfosuccinat
Lecithine	Lysolecithin
Glyceride mit mittlerer Kettenlänge	Mono-, Di- oder Triglyceride von C8, C10 oder C12-Fettsäuren
Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge	Natriumcaprylat Natriumcaprat Natriumlaurat
Salicylate	Natriumsalicylat
Acrylcarnitine	Decylcarnitin Laurylcarnitin Myristoylcarnitin
Acylcholine	Laurycholin Palmitoylcholin
Acylaminosäuren	N-Laurylphenylglycin N-Palmitylglycin
Kalziumchelatoren	Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Peptide	PZ-Peptid Zonula-occludentes Toxin (ZOT)

Tabelle 3: Injizierbare pharmakologisch aktive Bio-Polymere
Mittel	Krankheit oder körperlicher Zustand
Erythropoietin	Anämie
Menschliches Wachstumshormon	Zwergwuchs, kleine Statur
Granulocyt-Kolonie-stimulierender Faktor	Chemotherapie-induzierter Neutrophilenmangel
Interferon (αβγτ)	Hepatitis
Interleukine	Krebs
Vasopressin	Diabetes Insipidus
Wachstumshormon Freisetzungshormon	Zwergwuchs, kleine Statur
Relaxin	Systemische und diffuse Sklerose
Somatostatin	Acromegalie
Antikörper für Tumor Nekrosis Faktor	Entzündung
Insulin	Diabetes
Atrialer natriuretischer Faktor	Natriumungleichgewicht
Glukagon	Hypoglykämie
Desmopressin	Diabetes Insipidus, Hemophilie
Calcitonin	Osteoporose
Oligonucleotide (antisense)	Krebs, Infektionserkrankungen, Entzündungserkrankungen
LHRH-Analogons (Leuprolid, Nafarelin, Goserelin, Deslorelin, Historelin, Buser und ähnliches)	Prostatakrebs

Tabelle 4: Trägerstoffe und Plug-Materialien für die Verwendung bei einer verzögerten Freisetzung von Biopolymer
Material	Erosionsmechanismus
Gelatine	wasserlöslich
Polyethylenglykol	wasserlöslich
Fettsäuren und Triglyceride	wärmelöslich
Polyvinylpyrolidon	wasserlöslich
Stärke	wasserlöslich
Zelluloseether (beispielsweise HPMC)	wasserlöslich
Hydrocolloidale Gummis und Schleime (beispielsweise Gummi Arabium, Guar-Gummi, Tragantgummi)	wasserlöslich
Wachse (beispielsweise Carnuba, Bienen)	wärmelöslich
Polyacrylsäurederivate und -ester	Wasserlöslich und löslich durch pH
Schellack	Löslich durch pH
Zelluloseacetatphthalat	Löslich durch pH
Carboxymethylzellulose	wasserlöslich

Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden vollständiger verständlich, wenn die folgende detaillierte Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen gelesen wird.

Claims

Ein Partikel zur Verwendung bei einer oralen Applikation eines biopolymeren Medikamentes, wie beispielsweise ein Polypeptid, Protein oder Polynukleinsäure, an einen Probanden, aufweisend: ein Substrat mit einer Stirnfläche und einer Rückenfläche, welches zumindest ein Reservoir definiert, welches sich zur Stirnfläche öffnet, ein in dem zumindest einen Reservoir in freisetzbarer Form enthaltenes Biopolymer-Mittel, gekennzeichnet durch ein an einer Schleimhaut anhaftendes Mittel auf der Stirnfläche zum Anheften des Partikels an die Darmschleimhaut, wobei das aus dem Reservoir freigesetzte Medikament direkt dem Bereich der Darmschleimhaut dargeboten wird, bei welchem der Partikel angeheftet ist, und wobei das an einer Schleimhaut anhaftende Mittel ein Pflanzenlektin ist, das an die Darmschleimhaut anbindet.
Der Partikel nach Anspruch 1, wobei das Biopolymer-Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GM-CSF, Interferonen, Interleukinen, Vasopressin, Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor, Relaxin, Somatostatin, Antikörpern, Insulin, atrialem naturetischem Faktor, Glukagon, Desmopressin, Kalzitonin, verschiedenen angiogenen Wachstumsfaktoren wie beispielsweise VEGF, LHRH-Analogen, Peptid-Antigenen, Vakzinen und Antisense-Oligonukleotiden und Oligonukleotid.
Der Partikel nach Anspruch 1, wobei das an der Schleimhaut anhaftende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Weizenkeim-Agglutinin, Tomaten-Lektin, Ulex europaeus-Agglutinis-I und -II, Phaseolus vulgaris-Agglutinin und Asparagus Pea-Lektin (Lotus tetragonologus).
Der Partikel nach Anspruch 1 mit einer scheibenartigen Form, einem Durchmesser in dem Bereich von 100 μm bis 1 mm und einer Partikeldichte von 1,00 ± 0,05 g/cm³.
Der Partikel nach Anspruch 1, wobei zumindest ein Reservoir einen Permeations-Enhancer enthält.
Der Partikel nach Anspruch 5, wobei das Biopolymer-Mittel und der Permeations-Enhancer in separaten Reservoirs enthalten sind.
Der Partikel nach Anspruch 1, wobei zumindest ein Reservoir einen Peptidase-Inhibitor aufweist.
Der Partikel nach Anspruch 1, wobei das das Biopolymer-Mittel enthaltende Reservoir ferner einen Füllstoff enthält, der zum Verzögern der Auflösung/Freisetzung des Mittels aus dem Reservoir gestaltet ist.
Der Partikel nach Anspruch 8, wobei der Füllstoff gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gelatine, Polyethylenglykol, Fettsäuren und Triglyceriden, Polyvinyl-Pyrrolidon, Stärke, Zelluloseethern (beispielsweise HPMC), hydrokolloidalen Gummis und Muzilagos (beispielsweise Gummi arabicum, Guargummi, Tragantgummi), wachsen (beispielsweise Carnuba, Bienen), Polyacrylsäurederivaten und Estern, Schellak, Zelluloseacetat, Phthalat- und Carboxymethylzellulose.
Der Partikel nach Anspruch 1, wobei das Substrat aus Polycarbonat oder Polyester gebildet ist.
Der Partikel nach Anspruch 1, welcher ferner eine an der Rückenfläche des Partikels befestigte nicht poröse Laminatunterlage umfasst.
Eine Zusammensetzung zur oralen Applikation, aufweisend eine Mehrzahl von Wirkstoffabgabe-Partikeln nach Anspruch 1.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 12, welche ferner ein darmlösliches Beschichtungsmaterial aufweist, welches die Partikel verkapselt und welches, nach oraler Applikation, effektiv bzw. in Takt bleibt, während es die Umgebung der Speiseröhre und des Magens mit geringem pH-Wert passiert, und welches sich in der Umgebung des Darmhohlraums mit höherem pH-Wert auflöst, wobei die Partikel freigesetzt werden.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das darmlösliche bzw. magensaftresistente Beschichtungsmaterial sich bei einem pH-Wert in dem Bereich von 6,0 bis 6,8 auflöst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das darmlösliche Beschichtungsmaterial Eudragit L100 oder 5100 ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das darmlösliche Beschichtungsmaterial ein Chronset^®-System mit vorgewählter Freisetzungszeit ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Chroset^®-System gestaltet ist, die Partikelsuspension in den mittleren Bereichen des Dünndarms freizusetzen.
Ein Mikrostruktur-Herstellungsverfahren zum Erzeugen einer Mehrzahl von Partikeln nach Anspruch 1, aufweisend: Aussetzen einer Schicht eines partikelbildenden Materials einer fotoablativen Lichtquelle durch eine Fotomaske, durch das Aussetzen Bilden eines retikularen Gittermusters auf der Schicht entsprechend der gewünschten Partikelgröße und Form, und Fortsetzen der Aussetzung bis die gewünschten Partikel gebildet sind.
Das Verfahren nach Anspruch 18, wobei eine Fläche der Schicht, die der Stirnfläche der Partikel entspricht, durch eine Plasma (Glimm) Entladung mit einer Schicht von reaktiven Amino- oder Thiolgruppen überzogen wird.
Das Verfahren nach Anspruch 19, welches ferner umfasst ein Verbinden von an einer Schleimhaut anhaftenden Liganden an besagte eine Schichtoberfläche.