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TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen
und neoplastischen Erkrankungen durch Verabreichung eines oder mehrerer
CD40-Antagonisten an eine Säugetier.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Psoriasis
ist eine der häufigsten
und noch immer nicht aufgeklärten
chronischen, entzündlichen
Hauterkrankungen des Menschen, von der ungefähr 2% der Bevölkerung
betroffen sind. Trotz intensiver Bemühungen zur Entwicklung von
Behandlungen entzieht sich diese Autoimmunerkrankung im Wesentlichen
einer Therapie. Somit besteht ein wichtiges Bedürfnis nach der Identifizierung
von neuen Mitteln und Verfahren zur Behandlung der Psoriasis und
anderer verwandter Autoimmunerkrankungen. Die Verbindungen und Verfahren der
vorliegenden Erfindung erfüllen
diese und andere damit in Verbindung stehende Bedürfnisse.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt in einer Ausführungsform die Verwendung des
monoklonalen Anti-CD40-Antikörpers
5D12 zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur
Behandlung von Psoriasis bereit. Der Antikörper 5D12 ist unter der Zugriffsnummer
ATCC HB 11339 hinterlegt. Die Zusammensetzungen können ferner
einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Stabilisator umfassen,
der für
die Verabreichung in vivo geeignet ist. In einigen Ausführungsformen
können
diese Zusammensetzungen ferner mit zusätzlichen Mitteln kombiniert
werden, die gegen Autoimmunerkrankungen wirksam sind.
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Der
CD40-Antikörper
kann auf eine Vielzahl von Arten verabreicht werden, einschließlich oral,
topisch oder parenteral.
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Es
werden ferner Verfahren offenbart, die entweder ex vivo oder in
vitro durchgeführt
werden können. Beispielsweise
kann ein CD40-Antagonist bei mononukleären Zellen des peripheren Bluts
(PBMC) angewendet werden, die von einem Subjekt isoliert worden
sind, das eine Therapie gegen eine Autoimmunerkrankung benötigt, bevor
die PBMCs in vivo zurückgeführt werden.
Alternativ dazu können
CD40-Antagonisten beispielsweise in vitro in diagnostischen Assays
für die
Wirksamkeit anderer potentieller Therapeutika für Autoimmunerkrankungen Anwendung
finden.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Psoriasis
ist eine T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung, von der angenommen
wird, dass sie sowohl mit genetischen als auch mit umgebungsbedingten
auslösenden
Faktoren, wie beispielsweise bakteriellen Superantigenen, assoziiert
ist. Siehe beispielsweise Valdimarsson, H. et al., Immunol. Today,
16(3):145-9 (März
1995); Boehncke, W.H. et al., Nature, 379(6568):777 (29. Februar
1996); Boehncke, W.H., Trends Microbiol., 4(12):485-9 (Dezember
1996). Die Erkrankung ist durch komplexe Veränderungen verschiedener Zellarten
charakterisiert, einschließlich
Parakeratose, Hyperproliferation und Differenzierung der epidermalen
Keratinozyten, sowie Akanthose, und Zunahme der Epidermisdicke,
die sich aus der Hyperproliferation von Keratinozyten ergibt. Darüber hinaus
weisen Psoriasisläsionen
eine Infiltration von gemischten Leukozyten auf, die sich aus aktivierten
T-Lymphozyten, Neutrophilen innerhalb der Dermis und den epidermalen
Mikroabszessen, auskleidenden Makrophagen und dermalen Mastzellen
zusammensetzen. Schon, M.P., J. Invest. Derm., 112(4):405-410 (1999).
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CD40
ist ein 40 bis 50 kDa Membran-Glykoprotein vom Typ I, das zur TNF-R-Familie
gehört
und konstitutiv auf B-Lymphozyten sowie auf Monozyten, dendritischen
Zellen, Endothelzellen und Epithelzellen exprimiert wird. Siehe
van Konten, C. et al., Int. Arch. Allergy Immunol, 113:393-399 (1997);
Datta, S.K. et al., Arthritis Rheum, 40(10):1735-45 (1997). Der
CD40-Ligand, der abwechselnd als CD40L, gp39 oder CD154 bezeichnet
wird, ist ein 33 kDa-Membran-Glykoprotein vom Typ II, das vornehmlich
transient auf der Oberfläche von
aktivierten CD4+-T-Zellen exprimiert wird.
Datta, siehe oben.
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WO 98/03670 offenbart die
Verwendung von Anti-CD40-Antikörpern
bei der Behandlung der Psoriasis.
US-A-5,667,165 offenbart den CD40-Antikörper 5D12.
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Im
Rahmen der Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben,
wurde herausgefunden, dass CD40-Antagonisten die Schwere der Autoimmunerkrankung
in einem Psoriasis-Tiermodellsystem verringern. Es wurde ferner
herausgefunden, dass CD40-Antagonisten
das Ausmaß der
Angiogenese in den behandelten Läsionen
verringern. Diese Entdeckung legt die Wirksamkeit von CD40-Antagonisten
bei der Behandlung von verschiedenen neoplastischen Erkrankungen
nahe.
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Wie
vorliegend verwendet betrifft der Begriff "Antagonist" im Allgemeinen die Eigenschaft eines
Moleküls,
einer Verbindung oder eines anderen Mittels z.B. die Bindung eines
Moleküls
an ein anderes Molekül
zu stören,
oder die Stimulation einer Zelle durch eine andere Zelle zu stören, entweder
durch sterische Behinderung, Konformationsänderungen oder andere biochemische
Mechanismen. In einer Hinsicht betrifft der Begriff Antagonist die
Eigenschaft eines Mittels, die Bindung eines Rezeptors an seinen
Liganden zu verhindern, z.B. die Bindung von CD40 an CD40L, wodurch
die Aktivierung der entsprechenden B-Zell- oder T-Zellpopulation inhibiert
wird.
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Der
Begriff Antagonist ist nicht auf einen bestimmten spezifischen Wirkungsmechanismus
beschränkt, sondern
betrifft vielmehr in allgemeiner Form die vorliegend definierte
funktionelle Eigenschaft.
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Wirksame
Therapeutika hängen
von der Identifizierung wirksamer Mittel ab, denen eine signifikante Toxizität fehlt.
Verbindungen, die potentiell nützlich
bei der Behandlung von Psoriasis und anderen Autoimmunerkrankungen
sind, können
mit Hilfe zahlreicher Systeme in einem Screening gesucht werden.
Tiermodelle werden verwendet, um diejenigen Verbindungen zu identifizieren,
die therapeutische Aktivität
in vivo sowie ein akzeptables Ausmaß an Wirtstoxizität aufweisen.
Die Modelle beurteilen vorzugsweise die Eigenschaften von Psoriasis,
wie beispielsweise Akanthose und Parakeratose sowie die entzündliche
Infiltration von Lymphozyten. Alternativ dazu sind auch Tiermodelle
zur Identifizierung von Verbindungen nützlich, die bei der Behandlung
von anderen Autoimmunerkrankungen wirksam sind, beispielsweise bei
systemischem Lupus erythematosus, rheumatoider Arthritis und Multipler
Sklerose, oder gegen verschiedene neoplastische Erkrankungen.
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Die
Wirksamkeit eines gegebenen CD40-Antagonisten kann in einem beliebigen,
dem Fachmann bekannten Tiermodellsystem untersucht werden. Tiermodellsysteme
für Autoimmunerkrankungen
werden in Roitt, I. et al., "Autoimmunity
and Autoimmune Disease",
Immunology, Kapitel 28 (1998) beschrieben; Tiermodellsysteme, die
für die
Untersuchung von Psoriasis verfügbar
sind, werden insbesondere in Schon, M.P., siehe oben, beschrieben.
Dem Fachmann wird ersichtlich sein, dass die Auswahl von geeigneten
Tiermodellsystemen von der jeweils zu behandelnden Erkrankung abhängen wird.
Die nachfolgenden Tiermodellsysteme sind somit lediglich als Beispiel
und nicht als Beschränkung
aufgeführt.
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Es
ist im Stand der Technik hinreichend bekannt, dass Autoimmunität in Versuchstieren
durch Injizieren von Autoantigen (d.h. Selbst-Antigen) zusammen
mit Freund'schem
Adjuvans induziert werden kann. Daher kann ein solches Tiermodellsystem
verwendet werden, indem beispielsweise Thyroglobulin injiziert wird, um
eine entzündliche
Erkrankung der Schilddrüse
auszulösen.
Mit einem solchen Modellsystem werden nicht nur Autoantikörper der
Schilddrüse
produziert, sondern die Drüse
wird ferner von mononukleären
Zellen infiltriert, und die azinöse
Architektur zerfällt.
Dieses Tiermodell ist verwendet worden, um den Zustand beim Menschen
nachzustellen, der als Hashimoto-Thyroiditis
bekannt ist. In ähnlicher
Weise können
das basische Myelinprotein oder T-Zellen, welche für das basische
Myelinprotein spezifisch sind, in Mäuse oder Ratten injiziert werden,
um eine autoallergische Enzephalomyelitis auszulösen.
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Alternative
Tiermodellsysteme, die verwendet werden können, um Verbindungen und Behandlungsprotokolle
zu überprüfen, umfassen
Tiere, die spontane Autoimmunerkrankungen zeigen. Beispielsweise
(und nicht als einschränkend
zu verstehen) ist der Fettsucht-Stamm (obese strain, OS) von Hühnern dadurch
gekennzeichnet, dass spontan Autoantikörper auftreten, und dass es
zu einer fortschreitenden Zerstörung
und zu einer chronischen Entzündung
der Schilddrüse
kommt. Das OS-Huhn entspricht der humanen autoimmunen Schilddrüsenerkrankung
dahingehend, dass Läsionen
der Schilddrüse
auftreten, sowie die Produktion von Antikörpern gegen verschiedene Bestandteile
der Schilddrüse.
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Mehrere
Tiermodellsysteme für
Psoriasis sind beschrieben worden, einschließlich die Transplantation von
menschlicher Psoriasis-Haut auf Nacktmäuse, der Asebia (ab/ab)-Mausstamm
oder die transgene HLA-B27 Ratte, sowie die Transplantation von
Haut der Flaky-Skin-Maus auf Nacktmäuse. Nickoloff, B.J. et al.,
Am. J. Path., 146(3):580-588 (1995); Schon, siehe oben.
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Das
Asebia-Mausmodell stellt die epidermale Akanthose, eine erhöhte dermale
Vaskularisierung und die dermale Infiltrate von Makrophagen und
Mastzellen bereit, jedoch enthält
es keine Infiltrate von T-Zellen und Neutrophilen. Nickoloff, siehe
oben. Daher spiegeln die Hautveränderungen
in der ab/ab-Maus nicht jede biologische Eigenschaft von Psoriasisläsionen exakt
wieder.
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Neben
dem oben erwähnten
Tiermodellsystem wird die SCID-Maus verbreitet als ein in vivo-Modell der
Psoriasis verwendet. Ein Standardmaß für die Wirkung im SCID-Modell
ist die Fähigkeit,
die Schwere einer Akanthose oder einer Parakeratose zu verringern,
sowie die Infiltration von mononukleären Zellen in Tieren, denen
Psoriasis-Haut transplantiert wurde, zu verringern. In den vorliegend
beschriebenen Experimenten führen
Antikörperzubereitungen
zu einer wesentlichen Inhibierung der Schwere der Psoriasis in Tieren.
Diese Ergebnisse verweisen darauf, dass die Symptome der Psoriasis
durch Verabreichung von Antikörpern
oder von anderen Substanzen mit antagonistischer Wirkung auf CD40
inhibiert oder vollständig
vermieden werden können.
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In
den vergangenen Jahren ist beobachtet worden, dass Zellen der menschlichen
Haut auf Mäuse
mit schwerer kombinierter Immundefizienz (severe combined immunodeficiency,
SCID) transplantiert werden können,
wobei das Transplantat lange Zeit überlebt. Die SCID-Maus ist
darüber
hinaus für
die Annahme bei der Übertragung
von Bestandteilen des menschlichen Immunsystems zugänglich.
Siehe beispielsweise Boehncke, W.-H. et al., Arch. Dermatol. Res.,
286:325-330 (1994). Die autosomalrezessive Mutation, die für den SCID-Phänotyp in
Mäusen
verantwortlich ist, verhindert Umlagerungen des Antigenrezeptor-Gens, welche zu einem
inhärenten
Defekt von T-Zellen und B-Zellen führen. Botsma, M.J. et al.,
Annu. Rev. Immunol, 9:323-350 (1991).
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Nickoloff
(siehe oben) berichtete, das Haut mit Psoriasis-Plaques (PP), normale menschliche Haut
von gesunden Individuen (NN) und symptomlose Haut aus einem Patienten
mit Psoriasis (PN) auf SCID-Mäuse transplantiert
werden können,
wobei die klinischen, histologischen und immunologischen phänotypischen
Eigenschaften erhalten werden.
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Die
verschiedenen Tiermodelle der Psoriasis sind von M.P. Schon, siehe
oben, zusammenfassend beschrieben worden. Schon hat beschrieben,
dass das Modellsystem für
eine xenogene Hauttransplantation in der SCID-Maus die morphologischen
und pathologischen Eigenschaften von natürlich vorkommender, menschlicher
Psoriasis zeigt. Beispielsweise behält menschliche Psoriasis-Haut,
die auf eine SCID-Maus transplantiert worden ist, den psoriatischen
Phänotyp
bei, wie durch Akanthose und Hyperproliferation belegt wird. Ferner
ist die transplantierte Haut durch eine veränderte Keratinozyten-Differenzierung,
die Induktion von MHC-Klasse II und ICAM-1, eine erhöhte Vaskularisierung,
ein Infiltrat aus T-Zellen und Neutrophilen sowie durch intraepidermale
Mikroabszesse gekennzeichnet. Schon befürwortet somit die SCID-Maus
für Untersuchungen
im Zusammenhang mit Behandlungen, die sich gegen Psoriasis richten,
und merkt insbesondere an, dass die Attraktivität dieses Tiermodells darauf
zurückzuführen ist,
dass es auf wirklichem menschlichem Gewebe basiert.
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Mit
dem Modellsystem für
eine xenogene Hauttransplantation in der SCID-Maus haben Forscher
den relativen Beitrag von verschiedenen Bestandteilen des Immunsystems
zur Ätiologie
und Pathophysiologie der Psoriasis untersucht. Nickoloff (siehe
oben) berichtete im Jahr 1995 von der Gültigkeit des SCID-Maus-Tiermodellsystems
und offenbarte dessen Verwendbarkeit in Untersuchungen, die gestaltet
wurden, um den Mechanismus zu entschlüsseln, welcher den genetischen
und ätiologischen
Abnormalitäten
zugrunde liegt, die mit Psoriasis assoziiert sind, und, um die pathophysiologische
Basis der Erkrankung zu erkunden. Id. Wrone-Smith, T. et al. haben
ferner die Verwendbarkeit des SCID-Tiermodellsystem in mechanistischen
Studien gezeigt, in denen berichtet wurde, dass Psoriasis durch
Immunozyten vermittelt wird, die sich vom Blutkreislauf ableiten,
und dass aktivierte immunkompetente Zellen sekundär die Proliferation
von Keratinozyten und Endothelzellen induzieren. J. Clin. Invest.,
98(8):1878-1887 (1996). Kürzlich
haben Gilhar, A. et al. die Rolle von T-Lymphozyten in der Pathologie
der Psoriasis unter Verwendung des SCID-Maus-Tiermodellsystems untersucht,
J. Invest. Derm., 109(3):283-288 (1997), wobei festgestellt wurde,
dass T-Lymphozyten, welche die Haut infiltrieren, jedoch nicht T-Zellen,
welche sich vom peripheren Blut ableiten, den Psoriasis-Phänotyp der menschlichen
Haut, die auf die SCID-Maus transplantiert wurde, erhielten. Ganz
kürzlich
haben Torres, B.A. et al. das SCID-Mausmodell verwendet, um die
Rolle von bakteriellen und viralen Superantigenen beim Fortschreiten
der Psoriasis zu untersuchen. Cur. Opin. Immunol, 10(4):465-470
(1998).
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Die
CD40-Antagonisten können
die Hochregulierung von Aktivierungsmarkern, z.B. CD25 und CD69, auf
CD4+-T-Zellen in einem Bereich von zwischen
etwa 10 und 30% der Mengen der unbehandelten Kontrollzellen inhibieren.
Darüber
hinaus sind CD40-Antagonisten
im SCID-Maus-Tiermodellsystem für
eine xenogene Transplantation bei der Inhibierung der morphologischen
Eigenschaften der Psoriasis, wie beispielsweise der epidermalen
Verdickung und der Hyperproliferation, d.h. Ankanthose bzw. Parakeratose,
wirksam. Des Weiteren verringerte die Verabreichung der vorliegend
offenbarten CD40-Antagonisten an SCID-Mäuse,
die mit psoriatischen Haut-Transplantaten transplantiert worden
waren, das Ausmaß des
Infiltrats aus mononukleären
Zellen in der oberen Dermis dieser Mäuse wesentlich. Diese Ergebnisse
zeigen, dass die Verabreichung von CD40-Antagonisten im Allgemeinen bei der
Behandlung von etablierten Läsionen
chronischer Psoriasis in der Plaque-Phase wirksam ist. Die vorliegende
Offenbarung zeigt insbesondere, dass der CD40-antagonistische Antikörper 5H7
bei der Behandlung der Psoriasis wirksam ist.
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CD40-Antagonisten
verringern ferner das Ausmaß der
Angiogenese in dem SCID-Maus-Modellsystem für eine xenogene Transplantation,
was darauf verweist, dass diese Moleküle bei der Behandlung von neoplastischen
Erkrankungen wirksam sein könnten.
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Die
vorliegende beschriebenen CD40-Antagonisten können dazu verwendet werden,
weitere Autoimmunerkrankungen zu behandeln, die durch die Interaktion
von CD40 mit seinem Liganden CD40L charakterisiert sind. Wie vorliegend
beschrieben bezeichnet der Begriff "Autoimmunerkrankung" im Allgemeinen diejenigen Erkrankungen,
die durch das Fehlen von einer oder mehrerer B- und/oder T-Zellpopulationen oder Genprodukten
derselben charakterisiert sind, um zwischen eigenen und nicht-eigenen
Antigen-Determinanten zu unterscheiden. Autoimmunerkrankungen sind
oftmals durch die Infiltration der Zielzellen durch entzündliche Lymphoid-Zellen
gekennzeichnet, beispielsweise mononukleäre Phagozyten, Lymphozyten
und Plasmazellen, sowie auch sekundäre Lymphoid-Folikel. Beispielhafte
Autoimmunerkrankungen umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf)
organspezifische Erkrankungen, wie beispielsweise Hashimoto Thyroiditis,
primäres
Myxödem
Thyrotoxikose, perniziöse
Anämie,
Addison-Erkrankung und Insulin-abhängige Diabetes mellitus, sowie
nicht-organspezifische
Erkrankungen, wie beispielsweise systemischer Lupus erythematosus
(SLE), rheumatoide Arthritis (RA), Multiple Sklerose, Dermatomyositis,
Skleroderma und Psoriasis.
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Wie
vorliegende verwendet können
die Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen
einen oder mehrere Antikörper
einsetzen, die einzeln oder in Kombination mit anderen Therapeutika
verwendet werden, um die angestrebte Abnahme der jeweiligen Autoimmunerkrankung
zu erreichen. Die Antikörper
können
aus einem Tier isoliert werden, das den Antikörper entweder als Ergebnis
des direkten Kontaktes mit einem Antigen der Umgebung oder als Ergebnis
einer Immunisierung mit dem Antigen produziert. Alternativ dazu
können
Antikörper
durch rekombinante DNA-Verfahren erzeugt werden, bei denen eines
der hinreichend im Stand der Technik bekannten Antikörper-Expressionssysteme
verwendet wird. Siehe beispielsweise Harlow and Lane, Antibodies:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Solche
Antikörper
können
rekombinante IgGs, Chimäre
Fusionsproteine mit Sequenzen, welche sich von Immunglobulinen herleiten,
oder "humanisierte" Antikörper umfassen,
die alle bei der Behandlung der Psoriasis verwendet werden können. Zusätzlich zu
intakten Molekülen
vollständiger
Länge bezeichnet
der Begriff Antikörper
auch Fragmente derselben (wie beispielsweise scFv, Fv, Fd, Fab,
Fab' und F(ab)'2-Fragmente) oder Multimere
oder Aggregate aus intakten Molekülen und/oder Fragmenten, die
an CD40 binden. Diese Antikörperfragmente
binden das Antigen und können
derivatisiert sein, sodass sie strukturelle Eigenschaften aufzuweisen,
die ihre Beseitigung sowie ihre Aufnahme ermöglichen, beispielsweise durch
Einbau von Galaktoseresten.
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CD40-Antagonisten
können
monoklonale Antikörper
sein, die im Wesentlichen hergestellt werden, wie es in de Boer
et al.,
US-Patent Nr. 5,677,165 (1997)
(de Boer '165) beschrieben
ist. Bei diesem Verfahren wird DNA, die für CD40 oder ein Fragment derselben
kodiert, mittels PCR aus einer Mischung von zellulären cDNAs amplifiziert.
Das PCR-Produkt wird mit einer oder mit mehreren Restriktionsendonukleasen
verdaut, um geeignete Enden zu erzeugen, und in ein Baculovirus-Plasmid
oder in ein anderes Expressionssystem ligiert. Im Falle eines Baculovirus-Expressionssystems
wird das Plasmid, das für
CD40 oder ein Fragment desselben kodiert, z.B. in Sf9-Zellen eingebracht,
um die Herstellung des Proteins zu ermöglichen.
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Es
werden Klone der Sf9-Zellen identifiziert, die CD40 exprimieren,
beispielsweise durch ELISA, wie es in de Boer '165 diskutiert wird, und diese werden
intraperitoneal in BALG/c-Mäuse injiziert,
um die Antikörperproduktion
zu induzieren. Serum wird im Hinblick auf die Produktion von spezifischen
Antikörpern
untersucht, und Milzzellen aus Tieren mit positivem, spezifischem
Antikörpertiter
werden für
die Zellfusionen mit Myelomzellen verwendet, um Hybridom-Klone zu
erzeugen. Überstände, die
von solchen Hybridom-Klonen erhalten werden, werden mittels Fluoreszenz-Zellfärbung von
EBV-transformierten B-Zellen nach monoklonalen Antikörpern untersucht,
welche eine Spezifität
gegen CD40 aufweisen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist der CD40-Antagonist eine humanisierte
Form des monoklonalen Anti-CD40-Antikörpers 5D12. Der Begriff "humanisierter Antikörper" bezeichnet einen
Antikörper,
der von einem nicht-humanen
Antikörper
abgeleitet ist, üblicherweise
ein monoklonaler Antikörper
der Maus. Alternativ dazu kann ein humanisierter Antikörper von
einem chimären
Antikörper
abgeleitet sein, der die Antigen-Bindungseigenschaften des parentalen,
nicht-humanen Antikörpers
beibehält
oder im Wesentlichen beibehält,
der jedoch bei Verabreichung an einen Menschen eine verringerte
Immunogenität
im Vergleich zum parentalen Antikörper aufweist. Der Begriff "chimärer Antikörper" bezeichnet wie vorliegend
verwendet einen Antikörper,
der Sequenzen aus zwei verschiedenen Antikörpern umfasst (siehe beispielsweise
US-Patent Nr. 4,816,567 ), welche üblicherweise
von verschiedenen Spezies stammen. Üblicherweise umfassen Chimäre Antikörper humane
und murine Antikörperfragmente, üblicherweise
konstante Regionen aus dem Menschen und variable Regionen aus der
Maus.
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Humanisierte
Antikörper
können
durch eine Vielzahl von Verfahren erhalten werden, einschließlich beispielsweise:
(1) durch Verwendung der nicht-humanen komplementaritätsbestimmenden
Re gionen (complementarity determining regions, CDRs) mit einem humanen
Grundgerüst
und einer humanen konstanten Region (ein Verfahren, das im Stand
der Technik als "Humanisieren" bezeichnet wird),
oder alternativ dazu (2) durch Transplantieren der gesamten nicht-humanen
variablen Domänen,
wobei diese jedoch mit einer human-ähnlichen Oberfläche "verhüllt" werden, indem die
Oberflächenreste
ersetzt werden (ein Verfahren, das im Stand der Technik als "Veneering" bezeichnet wird).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden humanisierte Antikörper sowohl "humanisierte" als auch durch "Veneering" erzeugte Antikörper umfassen.
Diese Verfahren sind beispielsweise in Jones et al., Nature 321:522-525
(1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851-6855
(1984); Morrison und Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer
et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498
(1991) und Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994), offenbart.
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Der
Begriff "komplementaritätsbestimmende
Region" bezeichnet
Aminosäuresequenzen,
die gemeinsam die Bindungsaffinität und Bindungsspezifität der natürlichen
Fv-Region einer nativen Immunglobulin-Bindungsstelle bestimmen.
Siehe beispielsweise Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-911
(1987); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIH
Publication No. 91-3242 (1991). Der Begriff "konstante Region" bezeichnet den Teil des Antikörpermoleküls, der
die Effektor-Funktionen verleiht. In einer Ausführungsform werden konstante
Regionen der Maus durch humane konstante Regionen ersetzt. Die konstanten
Regionen der vorliegenden, humanisierten Antikörper werden von humanen Immunglobulinen
abgeleitet. Die konstante Region der schweren Kette kann aus einem
beliebigen der fünf
Isotypen gewählt
werden: alpha, delta, epsilon, gamma oder mu.
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Ein
Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern umfasst die Gegenüberstellung
der nicht-humanen Sequenzen der schweren und leichten Kette mit
humanen Sequenzen der schweren und leichten Kette, basierend auf
dieser Gegenüberstellung
das Auswählen
und Ersetzen des nicht-humanen Gerüsts gegen ein humanes Gerüst, die
molekulare Modellierung zur Vorhersage der Konformation der humanisierten
Sequenz, und den Vergleich der Konformation mit dem parentalen Antikörper. Diesem
Verfahren folgt eine wiederholte Rückmutationen von Resten in
der CDR-Region, welche die Struktur dieser CDRs stören, bis
die vorhergesagte Konformation des humanisierten Sequenzmodells
der Konformation der nicht-humanen CDRs des parentalen nicht-humanen
Antikörpers
nahekommt. Solche humanisierten Antikörper können ferner derivatisiert werden,
um die Aufnahme und ihre Beseitigung zu ermöglichen, beispielsweise über Ashwell-Rezeptoren
oder andere Rezeptoren, die Beseitigungsmechanismen vermitteln,
wie beispielsweise durch den Einbau von Galaktoseresten oder anderen
Hexosen. Siehe
US-Patent Nrn.
5,530,101 und
5,585,089 .
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Alternativ
dazu können
humane Antikörper
hergestellt werden, wie es im Wesentlichen von de Boer,
US-Patent Nr. 5,874,082 (1999)
(de Boer '082),
beschrieben wird. Kurz gesagt wird mRNA aus einem Hybridom präpariert,
das einen monoklonalen Anti-CD40-Antikörper exprimiert.
cDNA, die für
die variablen Regionen der schweren und leichten Kette kodiert,
wird unter Verwendung einer RT-PCR amplifiziert, wobei degenerierte
Oligonukleotidprimer verwendet werden. Wie in de Boer '082 offenbart wird,
ist diese RT-PCR-Methode im Stand der Technik hinreichend bekannt,
siehe Myers et al., Biochemistry, 30:7661-7666 (1991) und
US-Patent Nrn. 5,310,652 und
5,407,800 . Die PCR-Produkte werden in
ein Sequenzierungsplasmid kloniert, und ausgehend von diesen Klonen
wird die Nukleotidsequenz der cDNAs der variablen schweren und leichten Kette
bestimmt, wobei ausgehend von dieser Sequenz eine Konsensus-Aminosäuresequenz
für die
variable schwere und leichte Kette erhalten wird.
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Die
abgeleiteten Aminosäuresequenzen
werden verwendet, um Datenbanken nach humanen Antikörpersequenzen
mit einem hohen Grad Sequenzähnlichkeit
zu dem monoklonalen Antikörper
zu durchsuchen (de Boer '082).
Basierend auf der identifizierten homologen humanen Sequenz werden
Mutageneseprimer erstellt und dazu verwendet, die angegebenen Reste
von Maus zu Mensch zu verändern.
Die cDNAs, die für
die humanisierten variablen schweren und leichten Ketten kodieren,
werden ausgehend von einem Baculovirus-Expressionsplasmid exprimiert,
das einen Teil der konstanten Region der schweren Kette von humanem IgG
und die vollständige
humanen konstante leichte Kette umfaßt. Humanisierte schwere und
leichte Ketten werden in Sf9-Infektenzellen
co-exprimiert, und die resultierenden Kulturüberstände werden im Hinblick auf eine
Antikörper-Expression
unter Verwendung eines Westernblots und durch Analyse mittels Fluoreszenz-aktivierter
Zellsortierung (FACS) untersucht (de Boer '082).
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Die
monoklonalen Antikörper
können
ferner unter Verwendung von transgenen Tieren hergestellt werden,
die so verändert
wurden, dass sie humane Immunglobulin-Loci enthalten. Beispielsweise
offenbart
WO 98/24893 transgene
Tiere mit einem humanen IgG-Locus,
wobei die Tiere aufgrund der Inaktivierung von endogenen Loci für die schwere
und leichte Kette keine funktionellen endogenen Immunglobuline produzieren.
WO 91/10741 offenbart darüber hinaus
transgene Säugetier-Wirte,
wobei es sich nicht um Primaten handelt, die in der Lage sind, eine
Immunantwort gegen ein Immunogen zu zeigen, wobei die Antikörper konstante und/oder
variable Regionen aus einem Primaten aufweisen, und wobei die endogenen
Immunglobulin-kodierenden Loci ausgetauscht oder inaktiviert sind.
WO 96/30498 offenbart die
Verwendung des Cre/Lox-Systems, um den Immunglobulin-Locus in einem
Säugetier
zu modifizieren, so dass alle oder ein Teil der konstanten oder
variablen Regionen ersetzt werden, wobei ein modifiziertes Antikörpermolekül erzeugt
wird.
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WO 94/02602 offenbart nicht-humane
Säugetierwirte
mit inaktivierten endogenen Ig-Loci und funktionellen humanen Ig-Loci.
US-Patent Nr. 5,939,598 offenbart
Verfahren zur Herstellung von transgenen Mäusen, wobei den Mäuse endogene
schwere Ketten fehlen, und wobei die Mäuse einen endogenen Immunglobulin-Locus exprimieren,
der ein oder mehrere xenogene konstante Regionen umfasst.
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Unter
Verwendung eines wie oben beschriebenen transgenen Tiers kann eine
Immunantwort gegen ein ausgewähltes
Antigenmolekül
erzeugt werden, in diesem Fall CD40, und die Antikörperproduzierenden Zellen
können
aus dem Tier entfernt werden und dazu verwendet werden, Hybridome
herzustellen, die humane monoklonale Antikörper ausscheiden. Immunisierungsprotokolle,
Hilfsstoffe und Ähnliches
sind im Stand der Technik bekannt und werden beispielsweise bei
der Immunisierung einer transgenen Maus verwendet, wie es in
WO 96/33735 beschrieben
ist. Die monoklonalen Antikörper
können
im Hinblick auf ihre Fähigkeit
untersucht werden, die biologische Aktivität oder die physiologische Wirkung
des entsprechenden Proteins zu inhibieren oder zu neutralisieren.
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Die
CD40-Antagonisten werden als immunspezifisch oder spezifisch bindend
angesehen, wenn sie mit einem Ka an CD40
binden, der größer oder
gleich etwa 104 M-1 ist,
vorzugsweise größer oder
gleich etwa 105 M-1,
noch bevorzugter größer oder
gleich etwa 106 M-1,
und am stärksten
bevorzugt größer oder
gleich etwa 10 M-1. Solche Affinitäten können problemlos
unter Verwendung von herkömmlichen
Verfahren nachgewiesen werden, wie beispielsweise durch Equilibriumdialyse;
durch Verwendung des BIAcore 2000-Geräts unter Beachtung der vom
Hersteller ausgewiesenen allgemeinen Verfahren; durch Radioimmunassay
unter Verwendung von 125I-markiertem CD40;
oder durch andere dem Fachmann bekannte Verfahren.
-
Die
Affinitätsdaten
können
analysiert werden, beispielsweise durch das Verfahren von Scatchard
et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949). Es wird somit offensichtlich
sein, dass bevorzugte CD40-Antagonisten einen hohen Grad an Spezifität für CD40 aufweisen
werden und mit einer wesentlich geringeren Affinität an andere
Moleküle
binden werden.
-
Die
Identifizierung von zusätzlichen
CD40-Antagonisten kann unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens
zur Identifizierung und zum Erhalt von Proteinen, die spezifisch
mit anderen Proteinen oder Polypeptiden Wechselwirken, erreicht
werden, beispielsweise durch ein Zwei-Hybrid-Screeningsystem in
der Hefe, wie beispielsweise dasjenige, das in
US-Patent Nr. 5,283,173 und in
US-Patent Nr. 5,468,614 beschrieben
ist. Für CD40
kodierende cDNA oder ein Fragment davon kann in ein Zwei-Hybrid-Bait-Vektor
kloniert und dazu verwendet werden, eine komplementäre Ziel-Bibliothek
nach einem Protein mit CD40-Bindungsaktivität zu durchsuchen.
-
Wie
vorliegend verwendet umfaßt
der Begriff "Protein" Proteine, Oligopeptide,
Polypeptide, Peptide und Ähnliches.
Darüber
hinaus kann der Begriff Protein auch Fragmente, Multimere oder Aggregate
von intakten Molekülen
und/oder Fragmenten bezeichnen. Proteine können natürlich vorkommend sein, oder
sie können
mittels rekombinanter DNA-Verfahren oder durch chemische und/oder
enzymatische Synthese hergestellt werden. Siehe beispielsweise Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories
(2. Auflage 1989).
-
Neben
Antikörpern
und anderen Proteinen umfassen alternative CD40-Antagonisten kleine
Moleküle, die
ebenfalls bei der Behandlung verschiedener Autoimmunerkrankungen
und/oder neoplastischen Erkrankungen wirksam sind (sie sind jedoch
nicht auf diese beschränkt).
-
Solche
kleinen Moleküle
können
identifiziert werden, indem man ihre Fähigkeit überprüft, an CD40 zu binden und/oder
die Interaktion zwischen CD40 und CD40L zu inhibieren.
-
Verfahren
zur Messung der Bindung von CD40 an kleine Moleküle sind problemlos im Stand
der Technik verfügbar
und umfassen beispielsweise Kompetitionsassays, in denen das kleine
Molekül
mit der Interaktion zwischen CD40 und seinem Liganden (CD40L) oder
einem Anti-CD40-Antikörper
interferiert. Alternativ dazu können
direkte Bindungsassays verwendet werden, um die Interaktion von
kleinen Molekülen
mit CD40 zu messen. Beispielsweise kann ein ELISA-Assay verwendet
werden, in dem CD40 oder eine extrazelluläre Domäne von CD40 an eine unlösliche Matrix,
wie beispielsweise an eine Gewebekulturplatte oder an ein Kügelchen
(bead) adsorbiert wird. Ein markierter CD40L oder ein Anti-CD40-Antikörper wird
hinsichtlich der Bindung an CD40 durch Einbringung des kleinen Moleküls von Interesse
blockiert. Alternativ dazu kann die Bindung eines kleinen Moleküls an CD40
durch einen Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)-Assay bestimmt
werden. In diesem Verfahren werden CD40-exprimierende Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten
Anti-CD40-Antikörper oder
mit einem Anti-CD40-Antikörper
in Gegenwart eines fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers inkubiert. Die Bindung
des kleinen Moleküls
an CD40 kann durch eine Dosis-abhängige Abnahme der Fluoreszenz,
die an die CD40-exprimierenden
Zellen gebunden ist, bestimmt werden. Auf ähnliche Weise kann die direkte
Bindung eines kleinen Moleküls
bestimmt werden, indem man das kleine Molekül markiert, z.B. mittels radioaktiver
Markierung oder durch Fluoreszenzmarkierung, mit immobilisiertem
CD40 oder mit CD40-exprimierenden Zellen inkubiert, und die Radioaktivität oder Fluoreszenz
des gebundenen kleinen Moleküls
bestimmt.
-
CD40-Antagonisten
umfassen (sofern zutreffend) funktionelle Äquivalente.
-
Beispielsweise
können
sich Moleküle
hinsichtlich ihrer Länge,
Struktur, Bestandteile, usw. unterscheiden, wobei sie jedoch eine
oder mehrere der definierten Funktionen beibehalten können. Funktionelle Äquivalente
von Antikörpern,
Antikörperfragmenten
oder Peptiden können
insbesondere mimetische Verbindungen umfassen, d.h. Konstrukte,
die so gestaltet sind, dass sie die geeignete Konfiguration und/oder
Orientierung für
eine Antigen-Bindung nachahmen.
-
CD40-Antagonisten
können
wahlweise durch Zugabe von Seitengruppen usw. modifiziert werden,
z.B. durch aminoterminale Acylierung, carboxyterminale Amidierung
oder durch Kopplung von zusätzlichen
Gruppen an Aminosäureseitenketten.
Antagonisten können
ferner eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen umfassen.
Mit "konservativen
Aminosäuresubstitutionen" sind diejenigen
Veränderungen
der Aminosäuresequenz
gemeint, welche die allgemeine Ladung, hydrophobe Eigenschaften/hydrophile
Eigenschaften und/oder die sterische Dichte (steric bulk) der ausgetauschten
Aminosäure
erhalten. Beispielsweise sind Substitutionen zwischen den folgenden
Gruppen konservativ: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asn/Gln, Ser/Cys/Thr
und Phe/Trp/Tyr. Solche Modifikationen werden die Wirksamkeit des
CD40-Antagonisten nicht wesentlich verringern und können erwünschte Eigenschaften
verleihen, beispielsweise eine erhöhte Halbwertszeit in vivo oder
eine verringerte Toxizität.
-
Nachdem
man mehr als einen CD40-Antagonisten identifiziert hat, der in einem
Tiermodell wirksam ist, kann es ferner von Vorteil sein, zwei oder
mehrere solcher CD40-Antagonisten miteinander zu vermischen, um
eine noch bessere Wirksamkeit gegen Autoimmunerkrankungen bereitzustellen.
Zusammensetzungen, die einen oder mehrere CD40-Antagonisten umfassen,
können
an Personen oder Säugetiere
verabreicht werden, die an einer Autoimmunerkrankung leiden oder
eine Prädisposition
für eine
solche Autoimmunerkrankung aufweisen. Man nimmt an, dass CD40-Antagonisten die
Schwere von Autoimmunerkrankungen minimieren, indem sie die Infiltration
von Zielzellen mit entzündlichen
Lymphoid-Zellen, wie beispielsweise mit mononukleären Phagozyten,
Lymphozyten, Plasmazellen und sekundären Lymphoid-Folikeln, verringern,
und im speziellen Fall der Psoriasis durch Verringerung der Schwere
von Akanthose und Parakeratose.
-
Zusammensetzungen,
die CD40-Antagonisten umfassen, können für die therapeutische Behandlung parenteral,
topisch, oral oder lokal verabreicht werden. Vorzugsweise werden
die Zusammensetzungen oral oder parenteral, d.h. intravenös, intraperitoneal,
intradermal oder intramuskulär
verabreicht. Der CD40-Antagonist
oder die CD40-Antagonisten können
in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht werden, vorzugsweise
in einem wässrigen
Träger.
Eine Vielzahl von wässrigen
Trägern
kann verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4 Salzlösung, 0,3
Glycin und Ähnliche,
und diese können
weitere Proteine für eine
verbesserte Stabilität
umfassen, wie beispielsweise Albumin, Lipoprotein, Globulin usw.,
und sie können milden
chemischen Modifikationen oder Ähnlichem
unterworfen werden.
-
CD40-Antagonisten,
die als therapeutische Mittel für
Autoimmunerkrankungen nützlich
sind, werden oftmals im Wesentlichen frei von anderen natürlich vorkommenden
Immunglobulinen oder anderen biologischen Molekülen zubereitet werden. Bevorzugte
CD40-Antagonisten werden darüber
hinaus bei Verabreichung in ein Säugetier, das von einer Autoimmunerkrankung
betroffen ist, eine minimale Toxizität aufweisen.
-
Die
Zusammensetzungen können
durch herkömmliche
hinreichend bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert werden.
Die resultierenden Lösungen
können
zur Verwendung abgepackt werden oder unter aseptischen Bedingungen
gefiltert und lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Zubereitung
vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen
können
pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen umfassen, soweit dies
erforderlich ist, um sich physiologischen Bedingungen zu nähern, wie beispielsweise
den pH-Wert einstellende Mittel und Puffermittel, die Tonizität einstellende
Mittel und ähnliche, beispielsweise
Natriumacetat, Natriumlaktat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid
und stabilisierende Mittel (z.B. 1 bis 20% Maltose usw.).
-
Die
CD40-Antagonisten können
ferner über
Liposomen verabreicht werden. Liposomen, die Emulsionen, Schaum,
Mizellen, unlösliche
Monolager, Phospholipid-Dispersionen, lamellare Schichten und Ähnliches umfassen,
können
als Vehikel dienen, um die CD40-Antagonisten zielgerichtet zu einem
bestimmten Gewebe zu bringen und, um die Halbwertszeit der Zusammensetzung
zu erhöhen.
Eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von Liposomen sind verfügbar, wie
beispielsweise diejenigen, die in den
US-Patent
Nrn. 4,837,028 und
5,019,369 beschrieben
sind.
-
Die
Konzentration des CD40-Antagonisten in diesen Zusammensetzungen
kann stark variieren, z.B. von weniger als 10 Gew.-%, üblicherweise
mindestens etwa 25 Gew.-%, bis zu 75 Gew.-% oder 90 Gew.-%, und
sie wird in erster Linie durch die Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten, usw.,
gemäß der jeweils
gewählten Verabreichungsart
und der zu behandelnden Autoimmunerkrankung ausgewählt werden.
Gegenwärtige
Verfahren zur Herstellung von oral, topisch oder parenteral verabreichbaren
Zusammensetzungen werden dem Fachmann bekannt oder für diesen
offensichtlich sein, und sie werden beispielsweise ausführlich in
Remington's Pharmaceutical
Science, 19. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995) beschrieben.
-
Die
Bestimmung der wirksamen Menge einer Zusammensetzung zur Behandlung
einer Autoimmunerkrankung in einem Patienten kann durch empirische
Standardverfahren, die im Stand der Technik hinreichend bekannt
sind, erreicht werden. Beispielsweise kann im Falle der Psoriasis
der Rückgang
von Akanthose und Parakeratose sowie auch der Rückgang der Lymphozyteninfiltration
in die Keratinozyten gemessen werden.
-
Die
Zusammensetzungen werden einem Säugetier
verabreicht, das bereits an einer Autoimmunerkrankung leidet oder
eine Prädisposition
für eine
Immunerkrankung aufweist, in einer Menge, die ausreicht, um die
Entwicklung der Autoimmunerkrankung zu verhindern oder zumindest
teilweise zum Stillstand zu bringen. In ähnlicher Weise können die
Zusammensetzungen an ein Säugetier
verabreicht werden, das an einer neoplastischen Erkrankung leidet,
um die Schwere der Erkrankung zu verringern. Eine Menge, die geeignet
ist, um dieses zu erreichen, ist als eine "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Wirksame
Mengen eines CD40-Antagonisten werden variieren, und sie werden
von der Schwere der Erkrankung sowie vom Gewicht und dem allgemeinen
Zustand des zu behandelnden Patienten abhängen; sie werden jedoch im
Allgemeinen von etwa 1 μg/kg
bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht
reichen, wobei üblicherweise
Dosierungen von etwa 20 μg/kg
bis etwa 10 mg/kg pro Anwendung verwendet werden. Die Verabreichung
erfolgt täglich,
wöchentlich oder
weniger regelmäßig, wie
dies in Abhängigkeit
von der Antwort auf die Erkrankung sowie von der Toleranz des Patienten
auf die Therapie erforderlich ist. Dosierungen zur Beibehaltung über einen
anhaltenden Zeitraum können
erforderlich sein, und die Dosierungen können nach Bedarf angepasst
werden.
-
Einzelne
oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können mit
Dosismengen und Dosismustern ausgeführt werden, die vom behandelnden
Arzt ausgewählt
werden. In jedem Fall sollten die Formulierungen eine Menge des
CD40-Antagonisten bereitstellen, die ausreicht, um die Schwere der
Autoimmunerkrankung zu verhindern oder zu minimieren.
-
Die
Zusammensetzungen können
allein oder als zusätzliche
Therapie in Verbindung mit anderen Therapeutika, die im Stand der
Technik zur Behandlung von Psoriasis oder anderen Autoimmunerkrankungen
bekannt sind, verwendet werden.
-
Die
Verfahren können
ferner für
eine ex vivo Therapie oder eine extrakorporale Therapie gegen Autoimmunerkrankungen
verwendet werden, indem die therapeutischen Manipulationen an mononukleären Zellen
des peripheren Bluts (peripheral blond mononuclear cells, PBMC)
außerhalb
des Körpers
durchgeführt werden.
Beispielsweise können
PBMC aus dem Subjekt entfernt werden und mit dem CD40-Antagonisten
behandelt werden. Diese Zellen können
anschließend
dem Subjekt verabreicht werden, um die Aktivierung von CD4+-T-Zellen zu blockieren oder wesentlich
zu verringern. Indem man die Verabreichung des CD40-Antagonisten
außerhalb
des Körpers
des Subjektes durchführt,
können
signifikant höhere
Konzentrationen des CD40-Antagonisten verwendet werden, als bei
einer Verabreichung in vivo toleriert würden. Die Anwendungen der vorliegenden
Verfahren ex vivo können
ferner die Verabreichung von zusätzlichen
Mitteln umfassen, die gemeinsam eine verstärkte therapeutische Aktivität gegen
Autoimmunerkrankungen bereitstellen.
-
Die
Zusammensetzungen können
auch in vitro Anwendung finden. Beispielsweise können CD40-Antagonisten in Screening-Assays
verwendet werden, um die wirksamen Mengen von Therapeutika oder
anderen Behandlungen für
Autoimmunerkrankungen oder neoplastische Erkrankungen festzustellen.
In weiteren Ausführungsformen
können
die Zusammensetzungen beim Erstellen oder beim Screening von verschiedenen potentiellen
Behandlungsmodalitäten,
wie beispielsweise Verfahren zur Behandlung der Psoriasis oder einer anderen
Autoimmunerkrankung, verwendet werden. Somit wird ein diagnostisches
Verfahren zur Feststellung der Wirksamkeit z.B. von Autoimmuntherapeutika
offenbart.
-
Der
Nachweis von Veränderungen
in vitro, die der Umkehr einer Autoimmunerkrankung oder einer neoplastischen
Erkrankung entsprechen, stellt ein Hinweis auf eine Aktivität des für die Behandlung
beabsichtigten CD40-Antagonisten in vivo bereit.
-
Die
folgenden experimentellen Ergebnisse werden zum Zwecke der Veranschaulichung
und nicht zur Einschränkung
bereitgestellt. Lediglich Beispiel 2 veranschaulicht die beanspruchte
Erfindung.
-
BEISPIEL 1
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Verwendung des humanisierten monoklonalen
Maus-Antikörpers
5H7 zur Behandlung der Psoriasis in einem Modellsystem für die xenogene
Transplantation in einer Maus mit schwerem kombinierten Immundefekt
(severe combined immunodeficiency, SCID.
-
SCID
ist eine autosomal-rezessive Mutation in CB-17-Mäusen, die ein Fehlen der Umlagerung
des Antigenrezeptor-Gens verursacht, was zu einem inhärenten Defekt
von T-Zellen und B-Zellen führt.
Boehncke, W.-H., et al, Arch. Dermatol. Res., 286(6):325-30 (1994).
Nickoloff (siehe oben) hat gezeigt, dass das normale Haut (NN);
nicht-läsionale,
prä-psoriatische
Haut (PN); und läsionale
psoriatische Haut (PP) mit hohen Überlebensraten (d.h. >85%) auf SCID-Mäuse transplantiert
werden kann. Nach der Transplantation behalten die normale Haut
und die psoriatische Haut ihre jeweiligen morphologischen Eigenschaften
bei, wobei die prä-psoriatische
Haut um einiges dicker wird. Dieses Tiermodell hat als lebendiges
Modell zur Durchführung
von Untersuchungen mechanistischer Art, die erstellt wurden, um
die genetische/ätiologische
und die pathophysiologische Basis der Psoriasis aufzudecken, große Aufmerksamkeit
erhalten.
-
Die
Wirksamkeit wird im SCID-Mausmodell für die xenogene Transplantation
bestimmt, indem unter anderem eine verringerte Epidermalverdickung,
eine Normalisierung der Keratinisierung, eine erneute Bildung einer
granulären
Schicht sowie eine Verringerung der entzündlichen Infiltration gemessen
wird.
-
Unter
Verwendung des SCID-Maus-Modellsystems für die xenogene Transplantation
wurde nicht betroffene, nicht-läsionale
(PN) und betroffene, läsionale
(PP) menschliche Haut von drei Patienten, die an chronischer Psoriasis
im Plaquestadium litten, nach dem Verfahren von Boehncke, W.-H.,
et al, Arch. Dermatol. Res., siehe oben (Literaturstelle vorliegend
vollständig
eingeschlossen) auf Mäuse
transplantiert. Von jedem menschlichen Spender wurden sechs Transplantate
PN-Haut und sechs Transplantate PP-Haut isoliert und auf insgesamt
12 Mäuse
transplantiert. Den Transplantaten wurde es erlaubt, in einem Zeitraum
von 4 Wochen zu verheilen, bevor die Mäuse in Gruppen von jeweils
drei einem der folgenden Behandlungsprotokollen unterworfen wurden:
(1) Behandlungsgruppe-Mäuse,
denen läsionale
PP-Haut transplantiert worden war, wurden durch intraperitoneale
(i.p.) Injektionen mit dem Antikörper
5H7 mit einer Dosis von 20 mg/kg täglich für 2 Wochen behandelt; (2) Behandlungskontrollgruppe-Mäuse, denen
läsionale
PP-Haut transplantiert worden war, wurden durch i.p. Injektionen
mit dem Isotyp-Antikörper
MsIgG1 behandelt; (3) Präventionsgruppe-Mäuse, denen
nicht-läsionale
PN-Haut transplantiert worden war, wurden durch intradermale (i.d.)
Injektionen mit 2 × 106 mononukleären Zellen des peripheren Bluts
(PBMC) behandelt, die in Gegenwart des Antikörpers 5H7 mit dem Staphylokokken-Superantigen
ex vivo präaktiviert
worden waren, wobei das Verfahren von Wrone-Smith, T. et al. J.
Clint. Invest., 98:1878-1887 (1996) verwendet wurde (Literaturstelle
vorliegend vollständig
eingeschlossen). Nach den PBMC-Injektionen
wurden die Mäuse
der Gruppe (3) ferner durch eine in vivo-Verabreichung des Antikörpers 5H7
behandelt, die wie bei der "Behandlungsgruppe" erfolgte; und (4)
Präventionskontrollgruppe-Mäuse, denen
nicht-läsionale
PN-Haut transplantiert worden war, wurden durch i.d. Injektionen
von 2 × 106 PBMC behandelt, welche wie bei der "Präventionsgruppe" ex vivo mit Staphylokokken-Superantigenen prä-aktiviert
worden waren, gefolgt von der Verabreichung des Antikörpers MsIgG1. Vier Wochen nach der Abschluß der Manipulationen
wurden die Transplantate gesammelt, in Formaldehyd fixiert und für die morphologische
Analyse basierend auf einer routinemäßigen Färbung mit Hämatoxilin und Eosin (H + E)
verwendet.
-
Um
einen Vergleich zwischen den Gruppen zu ermöglichen, wurden die Transplantate
unmittelbar vor Beginn der Manipulationen makroskopisch begutachtet,
und die Gruppen wurden derart sortiert, dass Transplantate mit makroskopischen
Erosionen in eine getrennte Gruppe abgetrennt wurden. Diese vorläufigen Begutachtungen
zeigten, dass der Großteil
der Hauttransplantate keinen Hinweis auf eine Abstoßung zeigten.
-
Die in vitro-Verabreichung von 5H7 inhibiert
die Superantigen-Aktivierung
von PBMCs.
-
Um
das Potential von 5H7 bei der Blockierung der Aktivierung von PBMCs
durch ex vivo-Verabreichung von bakteriellen Superantigenen zu messen,
wurden Aliquots der PBMCs, die in Mäuse injiziert worden waren,
denen PH-Haut transplantiert worden war, durch 2-Farben-Fluoreszenz-aktivierte
Zellsortierung (FACS) analysiert. Die in Tabelle 1 zusammengefassten
Ergebnisse zeigen, dass mit der einzigen Ausnahme einer CD25-Expression in Spender
B, 5H7 die Hochregulierung der Aktivierungsmarker CD25 und CD69
auf CD4
+-T-Zellen auf zwischen 10 bis 30
der Menge von unbehandelten Kontrollzellen inhibiert. Tabelle 1: Wirkung der Superantigen-Aktivierung
von PBMCs in vitro mit und ohne 5H7
| Spender | Antikörper | CD3+CD69+ | CD3+CD25+ | CD4+CD69+ | CD4+CD25+ |
| R | MsIgG1
5H7 | 38,4
33,7 | 13,2
11,3 | 30,5
26,3 | 17,0
14,8 |
| B | MsIgG1
5H7 | 29,6
30,7 | 27,3
10,6 | 25,5
21,0 | 16,0
18,0 |
| W | MsIgG1
5H7 | 21,7
17,6 | 23,9
14,6 | 22,9
15,8 | 22,3
15,5 |
-
Wirkung von 5H7 auf die Behandlung der
Psoriasis in vivo
-
Mäuse, denen
läsionale
PP-Psoriasishaut transplantiert worden war, und die mit dem Isotyp-Kontrollantikörper MsIgG1 behandelt worden waren, zeigten eine Akanthose,
die durch eine verstärkte
Epidermisdicke von ungefähr
190 bis 340 μm
gekennzeichnet war, welche Ergebnis einer dauerhaften Hyperproliferation
der Epidermis war. Mäuse,
denen PP-Haut transplantiert worden war, und die mit MsIgG1 behandelt worden waren, zeigten darüber hinaus
eine Parakeratose, die durch das partielle Fehlen bis hin zum vollständigen Fehlen
einer granulären
Schicht gekennzeichnet war, was die Persistenz einer Veränderung
in Bezug auf den Keratinisierungsprozess zeigt, der bei Psoriasis üblich ist.
Darüber
hinaus wurde ein dichtes mononukleäres Infiltrat beobachtet, das
in der oberen Dermis dieser Mäuse
lokalisiert war.
-
Die
in vivo-Behandlung von Mäusen,
denen PP-Haut transplantiert worden waren, mit 5H7 führte zu einer
messbaren Verringerung der Epidermisdicke, die von 30% in den menschlichen
Spendern W und B bis zu 50% beim menschlichen Spender R reichte.
Eine solche verringerte Epidermisdicke ergab sich aus einer Abnahme
der Epidermis-Hyperproliferation.
-
Die
Wiederherstellung einer granulären
Schicht spiegelte die Normalisierung der Keratinisierungsmuster
wider. Gelegentlich konnte eine reguläre Netz-ähnliche Struktur der cornealen
Schicht beobachtet werden. Darüber
hinaus war das entzündliche
Infiltrat um etwa 50% verringert.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass die 5H7-Verabreichung im SCID-Maus-Modellsystem
bei der Behandlung von etablierten Läsionen von chronischer Psoriasis
im Plaque-Stadium wirksam ist.
-
BEISPIEL 2
-
In
einer zweiten Gruppe von Experimenten wurden Mäuse mit Hauttransplantaten,
wie sie in Beispiel 1 beschrieben worden sind, in vier Behandlungsgruppen
eingeteilt:
- 1. 5D12-Niedrigdosis-Behandlungsgruppe:
2 Wochen nach der Transplantation wurde Anti-CD40-Antikörper alle
2 Tage für
2 Wochen (6 Dosierungen) in einer Dosis von 0,5 mg/kg i.p. injiziert.
2 bis 4 Wochen später
wurden die Transplantate gesammelt.
- 2. 5D12-Hochdosis-Behandlungsgruppe: 2 Wochen nach der Transplantation
wurde Anti-CD40-Antikörper alle
2 Tage für
2 Wochen (6 Dosierungen) in einer Dosis von 5 mg/kg i.p. injiziert.
2 bis 4 Wochen später wurden
die Transplantate gesammelt.
- 3. 5C8 (Anti-CD40L)-Behandlungsgruppe: 2 Wochen nach der Transplantation
wurde Anti-CD40-Antikörper
alle 2 Tage für
2 Wochen (6 Dosierungen) bei einer Dosis von 0,5 mg/kg i.p. injiziert.
2 bis 4 Wochen später
wurden die Transplantate gesammelt.
- 4. Isotyp-Antikörper-Behandlungskontrollgruppe:
Drei läsionale
Transplantate für
die Kontrolle der Antikörperbehandlung
wie oben bei Gruppe 2.
-
Die
Behandlung mit Anti-CD40-Antikörper
führte
zur Verringerung der Epidermisdicke um 30% bis 50% und zur Normalisierung
des Keratinisierungsmusters (Netz-ähnliche Struktur der cornealen
Schicht, Wiederherstellung der granulären Schicht), sowie zu einer
geringfügigen
Verringerung der Entzündung,
die aufgrund der Dichte des Infiltrats (etwa 20% bis 40% Verringerung,
keine Munro-Mikroabszesse) bewertet wurde. Der Anti-CD40L-Antikörper führt zu Ergebnissen,
die denen mit dem Anti-CD40-Antikörper in
diesem Modell ähneln.
Ein verblindeter Beobachter könnte
die Histologien den Behandlungsprotokollen nicht zuordnen, außer bei
der Negativkontrolle.
-
BEISPIEL 3
-
Bewertung des CD40-Antikörpers 5D12
bei geringer und hoher Dosis
-
Dieses
Experiment wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen
Mausmodells durchgeführt,
um die gegen die Psoriasis gerichteten Wirkungen von geringen Dosen
des Anti-CD40-Antikörpers zu quantifizieren.
Die Behandlung mit einer geringen Dosis des Antikörpers 5D12
bestand aus intraperitonealen Injektionen von 0,5 mg/kg 5D12 in
Mäuse,
alle 2 Tage für
2 Wochen. Die Hochdosisbehandlung bestand aus intraperitonealen
Injektionen von 5 mg/kg 5D12 in Mäuse, alle 2 Tage für 2 Wochen.
Für die
5C8-Behandlung wurden intraperitoneale Injektionen von 5 mg/kg 5D12
alle 2 Tage für
2 Wochen durchgeführt.
Die Behandlungskontrollgruppe bestand aus Mäusen, denen 2 Wochen lang ein
Isotyp-Kontrollantikörper
intraperitoneal injiziert wurde.
-
Vier
Wochen nach Abschluß der
Behandlungen wurden die Transplantate gesammelt und entweder in Formaldehyd
fixiert oder schockgefroren. Das fixierte Material wurde für morphologische
Analysen basierend auf einer H + E-Färbung verwendet, und das schockgefrorene
Material wurde für
zusätzliche
immunhistochemische Analysen verwendet. Die Ergebnisse sind nachfolgend
beschrieben.
-
Wirkung der Isotypkontrolle.
-
Läsionale
Psoriasis-Haut, die mit Isotypkontroll-Antikörper behandelt wurde, zeigte
abhängig
vom Spender eine Epidermisdicke von 300 bis 570 mm. Die Ergebnisse
sind in den Tabellen 2 bis 7 gezeigt. Diese Verdickung wird im Vergleich
zu nicht-läsionaler
Epidermis oder im Vergleich zu normaler Epidermis als Akanthose
bezeichnet und ist auf eine anhaltende Hyperproliferation von Keratinozyten
zurückzuführen, welche
ein Kennzeichnen für
eine läsionale
psoriatische Epidermis ist. Die verdickte Epidermis zeigt eine ausgeprägte Verlängerung
der Retezapfen zusammen mit einer Verengung der Epidermis, die den
dermalen Papillen aufliegt, was zu einer Wellenähnlichen epidermo-dermalen
Grenze führt;
dieses Phänomen
wird auch als Papillomatose bezeichnet. Die gestörte Differenzierung von Keratinozyten
ist ebenfalls typisch für
Psoriasis und führt
zu einem partiellen oder vollständigen
Fehlen einer granulären
Schicht, ein Phänomen,
das als Parakeratose bekannt ist.
-
In
der cornealen Schicht konnten Schatten der Zellkerne der Keratinozyten
beobachtet werden, wo diese normalerweise nicht sichtbar sind (Dyskeratose);
der cornealen Schicht selbst fehlte die typische Netz-ähnliche
Struktur, und sie sah stattdessen kompakt aus. Zusätzlich wurde
ein mononukleäres
Infiltrat gesehen, das in der oberen Dermis lokalisiert war. Obgleich
diese Merkmale mehr oder weniger in allen Kontrolltransplantaten
vorhanden waren, zeigten diejenigen Transplan tate, die über einen
Zeitraum von 10 Wochen (im Gegensatz zu 8 Wochen) auf den Mäusen gehalten
wurden eine weniger typische Erscheinung von läsionaler Psoriasis-Haut. Die
oben beschriebenen Eigenschaften waren in einer weniger ausgeprägten. Weise vorhanden
(z.B. war die granuläre
Schicht vollständiger
wiederhergestellt, Abschnitte von Netz-ähnlicher cornealer Schicht
traten auf, und die Abschnitte mit Dyskeratose waren weniger zahlreich).
Diese Ergebnisse legen nahe, dass es trotz des relativ stabilen
Phänotyps über die
Zeit zu einem gewissen Verschwinden der Psoriasis-Eigenschaften
kommt, was möglicherweise
auf eine Remission verweist. Dies würde mit dem natürlichen
Verlauf der Erkrankung einhergehen, der durch einen chronisch-wiederkehrenden
Verlauf gekennzeichnet ist.
-
Wirkung der Behandlung mit dem Antikörper 5D12.
-
Die
Behandlung mit dem Anti-CD40-Antikörper 5D12 in einer Dosis von
5 mg/kg (Hochdosis) führte
zu einer Verringerung der Epidermisdicke, die abhängig von
dem Spender von 20% bis 50% reichte (Tabellen 2 bis 4). Die Wiederherstellung
einer granulären
Schicht spiegelte die Normalisierung der Keratinisierungsmuster
wider, und gelegentlich konnte die reguläre Netzähnliche Struktur der cornealen
Schicht beobachtet werden. Dyskeratotische Stellen konnten nicht
beobachtet werden. Darüber
hinaus war das entzündliche
Infiltrat deutlich verringert.
-
Wenn
Transplantate, die den Antikörper
5D12 in einer Dosis von 0,5 mg/kg (Niedrigdosis) erhalten hatten,
mit denjenigen verglichen wurden, die mit einer hohen Dosis 5D12
behandelt worden waren, konnte ein verblindeter Beobachter diese
Gruppen nicht unterscheiden, was darauf verweist, dass die histologischen
Eigenschaften ähnlich
aussahen. Die Quantifizierung der Epidermisdicke zeigt Auswirkungen,
die mit denjenigen der Hochdosisgruppe (Verringerung um 20 bis 40%
Tabellen 2 bis 4) vergleichbar sind.
-
Bei
einem näheren
Vergleich jedoch erschienen die Auswirkungen in der Hochdosisgruppe
deutlicher ausgeprägt;
insbesondere längere
Abschnitte von Netz-ähnlicher
cornealer Schicht und weniger Dyskeratose.
-
Wirkung der Behandlung mit dem Antikörper 5C8.
-
Die
gegen die Psoriasis gerichteten Wirkungen des Anti-CD40-Liganden-Antikörpers 5C8
wurden bei einer Dosis von 5 mg/ml analysiert. Im Falle der Hochdosis-
und Niedrigdosisbehandlung mit 5D12 konnte eine beträchtliche
Verringerung der Epidermisdicke zusammen mit einer partiellen Wiederherstellung
der normalen Epidermishistologie induziert werden. Von einem verblindeten
Beobachter konnte kein klarer Unterschied in reproduzierbare Weise
zwischen dieser Gruppe und den Transplantaten, die eine der beiden
anderen Behandlungen erhalten hatten, definiert werden (Tabellen
2 bis 4).
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Diese
Ergebnisse bestätigen
und erweitern die Ergebnisse, die in den Beispielen 1 und 2 oben
gezeigt wurden, in denen ein Anti-CD40-Antikörper eine messbare Wirkung
gegen Psoriasis in dem SCID-hu xenogenen Transplantationsmodell
zeigt. Tabelle 2 Wirkung von 5D12 in hoher und niedriger
Dosis
| Transplantatnummer | Spender | Behandlung | Epidermisdicke
(mm) |
| 60 | LS | Isotypkontrolle | 380 |
| 61 | LS | Isotypkontrolle | 340 |
| 62 | LS | Isotypkontrolle | 340 |
| 63 | LS | niedrige
Dosis 5D12 | 290 |
| 64 | LS | niedrige
Dosis 5D12 | 270 |
| 65 | LS | niedrige
Dosis 5D12 | 270 |
| 66 | LS | hohe
Dosis 5D12 | 290 |
| 67 | LS | hohe
Dosis 5D12 | 210 |
| 68 | LS | hohe
Dosis 5D12 | 250 |
| 69 | LS | 5C8 | 270 |
| 70 | LS | 5C8 | 300 |
| 71 | LS | 5C8 | 250 |
Tabelle 3 Wirkung von 5D12 in hoher und niedriger
Dosis
| Transplantatnummer | Spender | Behandlung | Epidermisdicke
(mm) |
| 72 | BA | Isotypkontrolle | 570 |
| 73 | BA | Isotypkontrolle | 420 |
| 74 | BA | Isotypkontrolle | 490 |
| 75 | BA | niedrige
Dosis 5D12 | 380 |
| 76 | BA | niedrige
Dosis 5D12 | 380 |
| 77 | BA | niedrige
Dosis 5D12 | 420 |
| 78 | BA | hohe
Dosis 5D12 | 300 |
| 79 | BA | hohe
Dosis 5D12 | 340 |
| 80 | BA | hohe
Dosis 5D12 | 380 |
| 81 | BA | 5C8 | 340 |
| 82 | BA | 5C8 | 300 |
| 83 | BA | 5C8 | 380 |
Tabelle 4 Wirkung von 5D12 in hoher und niedriger
Dosis
| Transplantatnummer | Spender | Behandlung | Epidermisdicke
(mm) |
| 84 | TR | Isotypkontrolle | 420 |
| 85 | TR | Isotypkontrolle | 300 |
| 86 | TR | Isotypkontrolle | 320 |
| 87 | TR | niedrige
Dosis 5D12 | 340 |
| 88 | TR | niedrige
Dosis 5D12 | 300 |
| 89 | TR | niedrige
Dosis 5D12 | 300 |
| 90 | TR | hohe
Dosis 5D12 | 250 |
| 91 | TR | hohe
Dosis 5D12 | 270 |
| 92 | TR | hohe
Dosis 5D12 | 210 |
| 93 | TR | 5C8 | 290 |
| 94 | TR | 5C8 | 250 |
| 95 | TR | 5C8 | 300 |
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BEISPIEL 4
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Bewertung einer Methotrexat-Behandlung
in Kombination mit 5D12
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Die
Wirkung einer Methotrexat-Behandlung allein oder in Kombination
mit einer Behandlung mit 5D12 in niedriger Dosis (0,5 mg/kg) wurde
bewertet. Ein Protokoll mit ansteigenden Dosen wurde gewählt, das
bei 0,1 mg/kg beginnt, und bei dem die Dosis wöchentlich um 0,05 mg/kg erhöht wird,
bis 0,4 mg/kg erreicht wird. Dieses Schema wurde mit der Verabreichung
des Isotyp-Kontrollantikörpers
oder mit einem 5D12-Behandlungsprotokoll mit niedriger Dosis kombiniert.
Die Behandlung mit der Isotypkontrolle diente als Negativkontrolle,
und die 5D12-Behandlung
bei niedriger Dosis diente als Positivkontrolle.
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Methotrexat
in Kombination mit dem Isotyp-Kontrollantikörper hatte nur geringfügige Auswirkungen auf
die Epidermisdicke, und eine Normalisierung der histologischen Eigenschaften
konnte nicht beobachtet werden (Tabellen 5 bis 7). Somit ist die
alleinige Verabreichung von Methotrexat nach diesem Protokoll kein geeigneter
Ansatz für
die Therapie von läsionaler
Psoriasis-Haut, die auf SCID-Mäuse
transplantiert wurde.
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Bei
Kombination mit einer niedrigen Dosis 5D12 waren die induzierten
Veränderungen
im Vergleich mit der Negativkontrolle denjenigen ähnlich,
die bei der Positivkontrollgruppe beobachtet wurden, welche lediglich
eine geringe Dosis 5D12 erhielt (Tabellen 5 bis 7). Tabelle 5 Wirkung einer niedrigen Dosis 5D12 in
Kombination mit Methotrexat
| Transplantatnummer | Spender | Behandlung | Epidermisdicke
(mm) |
| 140 | KO | Isotypkontrolle | 340 |
| 141 | KO | Isotypkontrolle | 300 |
| 142 | KO | Isotypkontrolle | 320 |
| 143 | KO | niedrige
Dosis 5D12 | 270 |
| 144 | KO | niedrige
Dosis 5D12 | 210 |
| 145 | KO | niedrige
Dosis 5D12 | 210 |
| 146 | KO | MTX
plus Isotyp | 300 |
| 147 | KO | MTX
plus Isotyp | 250 |
| 148 | KO | MTX
plus Isotyp | 270 |
| 149 | KO | MTX
plus 5D12 | 190 |
| 150 | KO | MTX
plus 5D12 | 250 |
| 151 | KO | MTX
plus 5D12 | 210 |
Tabelle 6 Wirkung einer niedrigen Dosis 5D12 in
Kombination mit Methotrexat
| Transplantatnummer | Spender | Behandlung | Epidermisdicke
(mm) |
| 152 | ME | Isotypkontrolle | 460 |
| 153 | ME | Isotypkontrolle | 380 |
| 154 | ME | Isotypkontrolle | 380 |
| 155 | ME | niedrige
Dosis 5D12 | 380 |
| 156 | ME | niedrige
Dosis 5D12 | 300 |
| 157 | ME | niedrige
Dosis 5D12 | 320 |
| 158 | ME | MTX
plus Isotyp | 340 |
| 159 | ME | MTX
plus Isotyp | 320 |
| 160 | ME | MTX
plus Isotyp | 380 |
| 161 | ME | MTX
plus 5D12 | 340 |
| 162 | ME | MTX
plus 5D12 | 320 |
| 163 | ME | MTX
plus 5D12 | 290 |
Tabelle 7 Wirkung einer niedrigen Dosis 5D12 in
Kombination mit Methotrexat
| Transplantatnummer | Spender | Behandlung | Epidermisdicke
(mm) |
| 164 | HU | Isotypkontrolle | 380 |
| 165 | HU | Isotypkontrolle | 420 |
| 166 | HU | Isotypkontrolle | 380 |
| 167 | HU | niedrige
Dosis 5D12 | 250 |
| 168 | HU | niedrige
Dosis 5D12 | 210 |
| 169 | HU | niedrige
Dosis 5D12 | 270 |
| 170 | HU | MTX
plus Isotyp | 290 |
| 171 | HU | MTX
plus Isotyp | 240 |
| 172 | HU | MTX
plus Isotyp | 340 |
| 173 | HU | MTX
plus 5D12 | 210 |
| 174 | HU | MTX
plus 5D12 | 190 |
| 175 | HU | MTX
plus 5D12 | 250 |
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Wie
in den Tabellen 5 bis 7 gezeigt ist, konnte eine Kombination von
5D12 mit Methotrexat keine vorteilhaften Veränderung gegenüber einer
alleinigen Verwendung von 5D12 induzieren. Die Veränderungen,
die in den mit 5D12 behandelten Transplantaten beobachtet wurden,
zeigten wiederum, dass dieser Antikörper eine wirksame Behandlungsmodalität ist. Obwohl
solch geringe Dosen wie 0,5 mg/kg Antikörper wirksam waren, können höhere Dosen,
wie beispielsweise 1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,8
mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,1 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,3 mg/kg, 2,4 mg/kg oder
2,5 mg/kg bevorzugt sein, um die Möglichkeit einer zu geringen
Dosierung zu vermeiden.
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Von
dem oben gesagten wird verständlich
sein, dass obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung
zum Zwecke der Veranschaulichung beschrieben worden sind, zahlreiche
Modifikationen durchgeführt werden
können,
ohne vom Bereich der Erfindung abzuweichen. Demgemäß darf die
Erfindung außer
durch die anliegenden Patentansprüche nicht beschränkt werden.