DE60034957T2

DE60034957T2 - Zusammensetungen und verfahren zur modulation von apoptose in cellen, die proteine der bc1-2-familie exprimieren

Info

Publication number: DE60034957T2
Application number: DE60034957T
Authority: DE
Inventors: David M. Seattle HOCKENBERY; Julian A. Seattle SIMON; Shie-Pon Issaquah TZUNG
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Current assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2020-08-19
Also published as: DE60034957D1; EP1218368B1; WO2001014365A1; EP1218368A4; AU781272B2; CA2382465C; ES2287029T3; ATE362925T1; AU7063400A; EP1218368A1; JP2003507474A; US20090203770A1; CA2382465A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle bei der Vermittlung der Apoptose in einer Vielzahl von apoptotischen Modellen (Kroemer et al., Immunol. Today 18: 44–51 (1997); Zamzami et al., J. Exp. Med. 183: 1533–44 (1996); Zamzami et al., J. Exp. Med. 182: 367–77 (1995)). Zellen, die induziert wurden die Apoptose zu durchlaufen, zeigen eine zeitige Störung des mitochondrialen Transmembranpotentials (ΔΨ_m), welches anderen Änderungen der Apoptose, beispielsweise der nuklearen Fragmentation und der Freisetzung von Phosphatidylserin an der äußeren Plasmamembran, vorausgeht. In einem zellfreien wiederhergestellten System induzieren isolierte Mitochondrien oder freigegebene mitochondriale Produkte die nukleare Apoptose (Liu et al.; Cell 86: 147–57 (1996); Newmeyer et al., Cell 79: 353–64 (1994)).
Frühere Experimente wiesen darauf hin, dass in den präapoptotischen ΔΨm Verlusten die Öffnung der mitochondrialen permeablen Transitions(PT)-Poren involviert ist, welche hochleitfähige Kanäle an der inneren mitochondrialen Membran sind und den mitochondrialen Megakanälen entsprechen, die mittels elektrophysiologischer Untersuchungen gefunden wurden (Kroemer et al., supra; Zamzami et al., (1996) supra; Bernardi et al., Biochim. et Biophys. Acta 1275: 5–9 (1996); Zoratti et al., Biochim. et Biophys. Acta 1241: 139–76 (1995); Petit et al., FEBS Letters 396: 7–13 (1996)). In der Tat ist die Induktion der PT ausreichend, um das volle Spektrum der mit der Apoptose verbundenen Änderungen hervorzurufen. Umgekehrt tun Mittel, welche vor der Öffnung der PT-Poren schützen, beispielsweise bongkrekische Säure, die Apoptose mildern (Kroemer et al., Immunol. Today 18: 44–51 (1997); Zamzami et al., J. Exp. Med. 183: 1533–44 (1996); Zamzami et al., FEBS Letters 384: 53–57 (1996)).
Die Mitglieder der evolutionär konservierten Bcl-2-Familie sind wichtige Regulatoren des apoptotischen Zelltodes und -überlebens. Die Proteine Bcl-2, Bcl-X_L, Bcl-w, A1 und Mcl-1 sind Todesantagonisten, während Bax, Bak, Bad, Bcl-xs, Bid und Bik Todesagonisten sind (Kroemer et al., Nature Med. 6: 614–20 (1997)). Die Proteine der Bcl-2-Familie finden sich überwiegend in der äußeren mitochondrialen Membran, werden aber auch in der Kernmembran und dem endoplasmatischen Retikulum gefunden (Kroemer et al., supra).
Unter den Proteinen der Bcl-2-Familie finden sich verschiedene konservierte Aminosäuremotive, BH1–BH4. Die proapoptotischen Mitglieder der Familie Bax und Bad weisen eine BH3-Domäne auf, welche ausreichend ist, um den Zelltod zu induzieren (Chittenden et al., EMBO J. 14: 5589–96 (1995); Hunter et al., J. Biol. Chem. 271: 8521–24 (1996)). Interessanterweise ist die BH3-Domäne in den antiapoptotischen Proteinen Bcl-2 und Bcl-x_L konserviert. Kürzlich wurde berichtet, dass die Spaltung von Bcl-x_L und Bcl-2 in der Loop-Domäne die N-terminale BH4-Domäne entfernt und Bcl-x_L und Bcl-2 in ein potentes pro-tödliches Molekül umwandelt (Cheng et al., Science 278: 1966–68 (1997); Clem et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 554–59 (1998)).
Kernmagnetische Resonanzstrukturanalyse eines Komplexes von Bcl-x_L und einem Peptid mit 16 Resten, umfassend die Bak BH3-Domäne, zeigte, dass die BH3-Peptide in einer amphipatischen alpha-helikalen Konfiguration an die hydrophobe Tasche, gebildet durch die BH1-, BH2- und BH3-Domänen des Bcl-x_L, mit hoher Affinität binden (Sattler et al., Science 275: 983–86 (1997)). Es wird angenommen, dass das Leucin in Position 1 der BH3-Kerndomäne und die Asparaginsaure in Position 6 die kritischen Reste für beides, die Heterodimerisierung und die Induktion der Apoptose, sind. Weiterer Beleg für diese Schlussfolgerung ist, dass eine Vielzahl an „BH3 nur" Todespromotoren identifiziert wurden, welche keine Ähnlichkeit zu Bcl-2 über ihre BH3-Domänenhomologie hinaus aufweisen (Kelekar et al, Trends Cell Biol. 8: 324–30 (1998)). Dies schließt Bik, Bim, Hrk, Bad, Blk und Bid ein, welche nicht homodimerisieren können, sich jedoch auf die Bindung an antiapoptotische Proteine wie beispielsweise Bcl-2 stützen können, um den Zelltod zu induzieren.
Die genauen Mechanismen, durch die Bcl-2 vor der Apoptose schützt, bleiben schwer zu fassen. In Anbetracht der Bedeutung der Mitochondrien bei der Apoptose und der mitochondrialen Lokalisation von Bcl-2 scheint es, dass ein Hauptschauplatz, wo Bcl-2 die apoptotischen Signale unterbricht, auf dem Niveau der Mitochondrien liegt. Es wurde gezeigt, dass Bcl-2 die Apoptose unterdrückt, indem es vor der mitochondrialen Permeabilitätstransition schützt und ΔΨm stabilisiert (Zamzami et al., J. Exp. Med. 183: 1533–44 (1996)). In Abwesenheit von Bcl-2 werden apoptogenesische Faktoren wie Cytochrom c und der apoptoseinduzierende Faktor (AIF) in Antwort auf apoptotische Auslöser von den Mitochondrien freigesetzt (Susin et al., J. Exp. Med. 184: 1331–41 (1996); Kluck et al., Science 275: 1132–36 (1997)). Diese Freisetzung ihrerseits führt zu einer sequentiellen Kaspaseaktivierung und resultiert in Kern- und Membranänderungen, die mit der Apoptose verbunden sind.
Die Mitglieder der Bcl-2-Familie entfalten eine bestimmte gewebespezifische Expression. In der Leber von erwachsenen Menschen ist die Bcl-2-Expression auf die Gallengangzellen beschränkt (Charlotte et al., Am. J. Pathol. 144: 460–65 (1994)) und fehlt sowohl in normalen als auch malignen Hepatocyten. Im Unterschied dazu kann die Expression von Bcl-x_L RNA und Protein in erwachsenen im Ruhezustand befindlichen Hepatocyten detektiert werden und diese erhöht sich um das vier- bis fünffache während der G1-Phase von sich regenerierenden Hepatocyten (Tzung et al., Am. J. Pathol. 150: 1985–95 (1997)). Eine erhöhte Bcl-x_L-Expression wurde ebenfalls in Hepatoma-Zelllinien, wie zum Beispiel HepG2, beobachtet.
Es wird angenommen, dass einige Krankheiten in Zusammenhang mit der Herunterregulierung der Apoptose in den betroffenen Zellen in Zusammenhang stehen. So können zum Beispiel Neoplasien, zumindest teilweise, aus einem apoptoseresistenten Status resultieren, bei dem die Zellproliferationssignale in unangemessener Weise die Zelltodessignale übertreffen. Des weiteren parasitieren einige DNA-Viren, beispielsweise der Epstein-Barr-Virus, der afrikanische Schweinefiebervirus und der Adenovirus, die Wirtszellenmaschinerie dazu, ihre eigene Replikation zu betreiben, während zur selben Zeit die Apoptose dahingehend beeinflusst wird, dass der Zelltod unterdrückt wird, was der Zielzelle erlaubt, den Virus zu reproduzieren. Darüber hinaus können eine Vielzahl von Krankheiten, beispielsweise lymphoproliferative Krankheiten, Krebs (einschließlich arzneimittelresistenter Krebs), Arthritis, Entzündungen, Autoimmunkrankheiten und Ähnliches, das Ergebnis einer Herunterregulierung der Zelltodessignale sein. Bei solchen Krankheiten wäre es wünschenswert, den apoptotischen Mechanismus zu unterstützen.
Die meisten derzeit zur Verfügung stehenden krebschemotherapeutischen Mittel zielen auf die zelluläre DNA ab und induzieren die Apoptose in Tumorzellen (Fisher et al, Cell 78: 539–42 (1994)). Als wichtige Art der Arzneimittelresistenz zeichnet sich eine sich verringernde Sensitivität in Bezug auf die Apoptoseinduktion ab. Im besonderen verleiht die Überexpression von Bcl-2 und Bcl-x_L eine Resistenz in Bezug auf eine Vielzahl chemotherapeutischer Mittel, einschließlich der alkylierenden Mittel, antimetabolischen Mittel, Topoisomerase-Inhibitoren, Inhibitoren für Microtubulie und antikrebs antibiotische Mittel, und kann einen Mechanismus klinischer Chemoresistenz in verschiedenen Tumoren erzeugen (Minn et al., Blood 86: 1903–10 (1995); Decaudin et al., Cancer Res. 57: 62–67 (1997)).
Weder Bcl-2 noch Bcl-x_L schützt jedoch die Zellen vor jeglichem apoptotischen Induktionsmittel. So stellt beispielsweise die Überexpression von Bcl-2 nur geringen Schutz gegen den Thy-1-induzierten Thymocytentod und die Fas-induzierte Apoptose bereit (Hueber et al., J. Exp. Med. 179: 785–96 (1994); Memon et al., J. Immunol. 15: 4644–52 (1995)). Auf dem mitochondrialen Niveau unterdrückt die Bcl-2-Überexpression in der äußeren mitochondrialen Membran die PT-Poreninduktion durch t-Butylhydroperoxid, Protonophore und Atractyloside, jedoch nicht durch Kalziumione, Diamide oder Kaspase 1 (Zamzami et al., J. Exp. Med. 183: 1533–44 (1996); Susin et al., J. Exp. Med. 186: 25–37 (1997)). Somit kann eine Klasse der mitochondrial-aktiven Mittel direkt die mitochondriale Apoptosemaschinerie beeinflussen, während sie den Ort der Bcl-2-Funktion und den Schutz, der durch die Bcl-2-Familienmitglieder offeriert wird, umgeht. Ein Mittel dieses Typs könnte potentiell nützlich sein, um die Mehrfacharzneimittelresistenz, die durch Bcl-2 oder Bel-X_L verliehen wird, zu überwinden und wird dringend im Stand der Technik benötigt.
Die Antimycine bilden eine andere Klasse der mitochondrial aktiven Mittel. Die Antimycine umfassen üblicherweise einen N-Formylaminsalicylatrest, der an ein Dilactonring mittels einer Amidbindung gebunden ist. Die Antimycine unterscheiden sich in den hydrophobischen R-Gruppen, die an den Dilactonring gegenüber der Amidbindung befestigt sind (siehe z.B., Rieske, Pharm. Ther. 11: 415–20 (1980)). So hat beispielsweise Antimycin A₁ eine Hexylgruppe in Position 2 des Dilactonringes, während Antimycin A₃ eine Butylgruppe in dieser Position aufweist. Es wurde umfangreiche Literatur über das Verhältnis der Strukturaktivität der Antimycine in Bezug auf die Unterdrückung von Cytochrom bc₁ publiziert (Miyoshi et al., Biochim. Biophys. Acta 1229: 149–54 (1995); Tokutake et al., Biochim. Biophys. Acta 1142: 262–68 (1993); Tokutake et al., Biochim. Biophys. Acta 1185: 271–78 (1994)). Die publizierte Struktur des Cytochrom bc₁-Komplexes mit gebundenem Antimycin A₁ machte deutlich, dass das Antimycin A₁ eine Position an dem Qi-Ubiquinon Bindungsite des Cytochroms b besetzt (Xia et al., Proc. Nat. Adac. Sci. USA 94: 11399–404 (1997)). Die Antimycine unterdrücken üblicherweise die mitochondriale Atmung, was darauf hinweist, dass die Unterschiede in den hydrophoben R-Gruppen an dem Dilactonring nicht kritisch für die Cytochrom b-Bindung sind. Mutagnese und Strukturaktivitätsuntersuchungen des Antimycin A zeigten, dass die Cytochrom bc₁-inhibitorische Aktivität stark von dem N-Formylaminsalicylsäurerest abhängig ist (Tokutake et al., (1994), supra). Sowohl die Methylierung der phenolischen Hydroxylgruppe als auch die Modifikation der N-Formylamingruppe reduziert signifikant die Fähigkeit des Antimycins A, an Cytochrom bc₁ zu binden und dies zu inhibieren. Die Methylierung des phenolischen Hydroxyls mindert die inhibitorische Aktivität um 2,5 logs. Die Substitution der Formylamingruppe durch Acetylamin und Propylamingruppen an der 3-Position reduziert die Cytochrom bc₁-Aktivität entsprechend um 1,2 und 2,4 logs. Somit wird der N-Formylaminsalicylatrest im Allgemeinen als wichtig für die Bindung der Antimycine an Cytochrom b betrachtet.
Für die beiden Antimycine A₁ und A₃ wurde kürzlich entdeckt, dass sie die Aktivität der antiapoptotischen Proteine der Bcl-2-Familienmitglieder Bcl-2 oder Bel-X_L inhibieren. Somit sind diese Moleküle potentiell geeignete Verbindungen für das medizinische Fach und Patienten, welche an proliferativen Krankheiten und anderen Krankheiten leiden, bei denen die Apoptose in unangepasster Weise reguliert ist. Die Antimycine sind jedoch toxisch, da sie ebenfalls die mitochondriale Atmung inhibieren. Es besteht somit ein entscheidender Bedarf an Derivaten der Antimycine, die effektiv Apoptose in Zellen, bei denen die Apoptose unangemessen reguliert ist, induzieren, während sie gleichzeitig eine reduzierte Inhibierung der mitochondrialen Atmung aufweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und basiert auf der überraschenden Entdeckung, dass die Antimycine die Aktivität der Proteine der antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder, beispielsweise Bcl-2 oder Bcl-x_L, inhibieren können. Die Erfindung basiert des Weiteren auf der Entdeckung, dass die mitochondriale Atmungsinhibierungsaktivität der Antimycine von der Inhibierung der Proteine der Bcl-2-Familienmitglieder separiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Mitteln, umfassend Derivate der Antimycine, welche die Apoptose durch Bindung an ein Protein der Bcl-2-Familienmitglieder modulieren, bereit, für die Herstellung eines Medikaments wie in Anspruch 1 definiert. Die Mittel zeigen eine reduzierte Bindung an Cytochrom B (oder den Cytochrom bc₁-Komplex, der nachfolgend als „Cytochrom B" bezeichnet wird) im Vergleich zu nicht-derivatisierten Antimycinen. In einer Ausführungsform induziert das Mittel vorzugsweise die Apoptose in Zellen, welche ein Protein der antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder überexprimieren. In einer anderen Ausführungsform ist das Mittel im Wesentlichen für die Zellen nicht toxisch, die das Protein der antiapoptotischen Bcl-Familienmitglieder nicht überexprimieren. Das Mittel inhibiert üblicherweise die Aktivität eines Proteins der antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder durch die Bindung an die hydrophobe Tasche, die durch die BH1-, BH2- und BH3-Domänen des Proteins gebildet wird.
Die Mittel umfassen Derivate eines Antimycins oder eines Teils davon, beispielsweise die chemische Modifikati on des Dilactonrestes (das heißt des 4,9-dioxo-1,5-dioxanan-7-yl Esterrestes). In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Antimycinderivate mindestens zwei chemische Modifikationen. Die Modifikation verringert die Affinität des Antimycinderivates in Bezug auf Cytochrom B und erhöht die Affinität des Antimycinderivates in Bezug auf ein Protein der Bcl-2-Familienmitglieder.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen bereit, die das Mittel für die Behandlung eines Subjektes umfassen, bei denen eine Zelle ein Protein der antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder überexprimiert. Solche Zusammensetzungen sind nützlich für die Behandlung von Krankheiten, die mit Apoptose in Verbindung stehen, wie in Anspruch definiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt ein allgemeines Schema für die chemische Synthese des Antimycin A₃ und für die Synthesen von Derivaten von Antimycinen dar.
BESCHREIBUNG VON SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Vor der genaueren Schilderung der Erfindung im Detail ist es für ein weiteres Verständnis der Erfindung hilfreich, zunächst später hier verwendete bestimmte Begriffe näher zu definieren.
Definitionen:
Der Begriff „Apoptose" bezieht sich auf ein reguliertes Netzwerk biochemischer Ereignisse, welche zu einer selektiven Form des Zellselbstmordes führen, und ist durch leicht erkennbare morphologische und biochemikalische Phänomene charakterisiert, beispielsweise die Fragmentierung der Deoxiribonukleinsäure (DNA), die Kondensation des Chromatins, welche mit der Nukleaseaktivität verbunden sein kann oder auch nicht, der Chromosomenmigration, der Margination der Zellkerne, der Bildung von Apoptosekörpern, dem mitochondrialen Anschwellen, der Aufweitung der mitochondrialen Christae, der Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätstransitionsporen und/oder dem Verlust des mitochondrialen Protonengradienten.
Der Begriff „Antimycine" bezieht sich auf die Antimycine A₀(a–d), A₁, A₂, A₃, A₄, A₅, A₆, Kitamycin A und B, Urauchimycin B, Deisovalerylblastomycin und Dehexyl-Deisovaleryloxyantimycin A. Die Antimycine werden üblicherweise durch die folgende Formel I dargestellt und weisen die absolute Konfiguration [2R, 3R, 4S, 7S, 8R] auf:

Die Gruppen an den Positionen R1 und R2 weichen wie folgt voneinander ab: Tabelle 1

Name	R1	R2
Antimycin A_0(a)	Hexyl	Hexansäure
Antimycin A_0(b)	Butyl	Heptansäure
Antimycin A_0(c)	Octyl	Buttersäure
Antimycin A_0(d)	Heptyl	Isovalerinsäure
Antimycin A₁	Hexyl	Isovalerinsäure
Antimycin A₂	Hexyl	Buttersäure
Antimycin A₃	Butyl	Isovalerinsäure
Antimycin A₄	Butyl	Buttersäure
Antimycin A₅	Ethyl	Isovalerinsäure
Antimycin A₆	Ethyl	Buttersäure
Kitamycin A	Hexyl	Hydroxyl
Kitamycin B	Isohexyl	Hydroxyl
Urauchimycin B	Isohexyl	Hydroxyl
Deisovalerylblastomycin	Butyl	Hydroxyl
Dehexyl-Deisovalerylblastomycin	Wasserstoff	Wasserstoff

Der Begriff „Derivat des Antimycins" bezieht sich auf eine chemische Modifikation eines Antimycins, durch welche ein oder mehrere Atome eines Antimycins entfernt oder substituiert oder neue Atome hinzugefügt wurden. Ein „Derivat des Antimycins" schließt des weiteren Teile eines Antimycins, genauso wie dessen chemische Modifikationen, und chirale Varianten eines Antimycins ein.
Der Begriff „Mittel" wird hier verwendet, um einen chemischen Stoff, eine Mischung chemischer Stoffe, Salze und deren Solvate und Ähnliches zu bezeichnen, welche in der Lage sind, die biologische Aktivität eines Proteins der Bcl-2-Familienmitglieder zu modulieren. Ein Mittel umfasst üblicherweise ein Derivat des Antimycins.
Der Begriff die Apoptose „vorzugsweise induzierend" bezieht sich auf eine mindestens fünffach stärkere Stimulierung der Apoptose bei einer gegebenen Konzentration eines Mittels in Zellen, welche ein Protein der Bcl-2-Familienmitglieder überexprimiert, im Vergleich zu Zellen, welche ein Protein der Bcl-2-Familienmitglieder nicht überexprimieren (z.B. ein fünffach größeren LD₅₀ oder IC₅₀).
Der Begriff „im Wesentlichen nicht toxisch" bezieht sich auf ein Mittel, welches die Apoptose in mindestens 50% der Zellen, welche ein Protein der Bcl-2-Familienmitglieder überexprimieren, induziert, jedoch nicht die Apoptose in mehr als 5% induziert, weiter vorzugsweise weniger als 1% der Zellen, welche ein Protein der Bcl-2-Familienmitglieder nicht überexprimieren.
Der Begriff „Protein(e) der Bcl-2-Familienmitglieder" bezieht sich auf eine evolutionär konservierte Familie von Proteinen, die dadurch charakterisiert ist, dass sie eine oder mehrere Aminosäurehomologiedomänen, BH1, BH2, BH3 und/oder BH4, aufweist. Die Proteine der Bcl-2-Familienmitglieder schließen Bcl-2, Bcl-x_L, Bcl-w, A1, Mcl-1, Bax, Bak, Bad, Bcl-xs und Bid ein. Die „Proteine der Bcl-2-Familienmitglieder" schließen des Weiteren solche Proteine oder deren biologisch aktive Fragmente ein, welche mindestens 70% Ähnlichkeit in der Aminosäuresequenz zu einem Protein der Bcl-2-Familienmitglieder aufweisen.
Der Begriff „Protein der antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder" bezieht sich auf Bcl-2, Bcl-x_L, Bcl-w, A1, Mcl-1 und andere Proteine, die dadurch charakterisiert sind, dass sie eine oder mehrere Aminosäurehomologiedomänen, BH1, BH2, BH3 und/oder BH4 aufweisen, und welche das Überleben der Zelle durch die Minderung oder Inhibierung der Apoptose unterstützen. Die „Proteine der antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder" schließen des Weiteren solche Proteine oder deren biologisch aktive Fragmente ein, welche mindestens eine 70% Ähnlichkeit in der Aminosäuresequenz zu einem antiapoptotischen Protein der Bcl-2-Familienmitglieder aufweisen.
Der Begriff „biologisch aktiv" oder „biologische Aktivität" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Moleküls, die Apoptose zu modulieren, beispielsweise durch Bindung an ein Protein der Bcl-2-Familienmitglieder. Ein biologisch aktives Molekül kann die Apoptose durch die Verursachung einer Änderung in dem mitochondrialen Protonengradienten, durch Verursachung der Änderung in mitochondrialen Schwellen oder Änderung der morphologischen Eigenschaften der Mitochondrien durch Beeinflussung der Freisetzung eines Reportermoleküls, wie beispielsweise Rhodamin 123 oder Calcein, durch ein von Mitochondrien oder Vesikeln umfasstes porenbildendes Protein der antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder oder durch Verursachung irgendeiner anderen morphologischen Veränderung, die mit der Apoptose verbunden ist, modulieren.
Derivate des Antimycins können durch chemische Modifikation eines Antimycins nach üblichen chemischen Methoden hergestellt werden. So kann beispielsweise die Hydroxylgruppe an dem Salicylatrest des Antimycins A₃ unter Ver wendung eines primären Alkylhalides oder Diazomethanes modifiziert werden, um ein 2-Alkoxyetherantimycinderivat (z.B. 2-Methoxyetherantimycin A₃) zu bilden. Ein Antimycin kann ebenfalls durch Acetylierung modifiziert werden.
Alternativ können Antimycinderivate mittels de novo („total") chemischer Synthese hergestellt werden. Beispielsweise haben sich Shimano et al. (Tetrahedron 54: 12745–74 (1998) ein total synthetisches Verfahren für die betreffenden antifungalen Dilactone UK-2A und UK-3A ausgedacht. Diese totale Synthese kann für die Herstellung von Antimycinderivaten verwendet werden. Entsprechend dieses Verfahrens kann Antimycin A₃ geformt werden, umfassend die drei strukturellen Einheiten: N-Formyl-3-aminosalicylsäure, L-Threonin und den Dilactonrest (siehe die entsprechenden Formeln III–V).
Antimycin A₃ kann durch die Verbindung dieser strukturellen Einheiten synthetisiert werden. Derivate eines oder mehrerer dieser strukturellen Einheiten können chemisch verbunden werden, um Antimycinderivate zu bilden.
Bibliotheken von Antimycinderivaten können ebenfalls durch rationales Design hergestellt werden (siehe hauptsächlich Cho et al., Pac. Symp. Biocompat. 305–16 (1998); Sun et al., J. Comput. Aided Mol. Des. 12: 597–604 (1998)). Beispielsweise können Bibliotheken an Antimycinderivaten durch Synthesen kombinatorischer chemischer Bibliotheken hergestellt werden (siehe hauptsächlich DeWitt et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909–13 (1993); internationale Patentpublikation WO 94/08051 ; Baum, Chem. & Eng. Newes, 72: 20–25 (1994); Burbaum etal., Proc. Nat. Acad. SCT. USA 92: 6027–31 (1995); Baum etal., J. Am. Chem. Soc. 117: 5588–89 (1995); Nestler et al., J. Org. Chem. 59: 4723–24 (1994); Borehardt et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 373–74 (1994); Ohlmeyer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 10922–26 (1993); und Longman, Windhover's In Vivo The Business & Medicine Report 12: 23–31 (1994)).
Die folgenden Artikel beschreiben Verfahren für die Selektion von Startermolekülen und/oder Kriterien für deren Auswahl: Martin et al., J. Med. Chem. 38: 1431–36 (1995); Domine et al., J. Med. Chem. 37: 973–80 (1994); Abraham et al., J. Pharm. Sci. 83: 1085–100 (1994).
Eine "kombinatorische Bibliothek" ist eine Kollektion von Stoffen, bei denen die in der Kollektion enthaltenen Stoffe aus einer oder mehreren Arten von Untereinheiten bestehen. Die Untereinheiten können aus natürlichen oder nicht natürlichen Resten ausgewählt sein, einschließlich der Diene, der Benzenzusammensetzungen, der Cycloalkane, der Lactone, der Dilactone, der Aminosäuren, der Alkane und Ähnlichem. Die Stoffe der kombinatorischen Bibliothek unterscheiden sich auf die eine oder mehrere Arten in Bezug auf die Anzahl, die Anordnung, die Art oder die Arten der Modifikationen, die eine oder mehrere der Untereinheiten, die in den Stoffen vorliegen, erhalten haben. Alternativ kann sich eine kombinatorische Bibliothek auf eine Kollektion von „Kernmolekülen" beziehen, welche sich in Bezug auf die Anzahl, die Art oder Position der R-Gruppen unterscheiden, welche sie aufweisen, und/oder der Identität der Moleküle, die das Kernmolekül bilden. Die Kollektion der Stoffe wird auf systematische Art hergestellt. Jegliches Verfahren der systematischen Herstellung einer Kollektion von Stoffen, die sich voneinander in einem oder mehreren der oben genannten Wege unterscheiden, ist eine kombinatorische Bibliothek.
Eine kombinatorische Bibliothek kann auf einer festen Unterlage aus einem oder mehreren Festphasenbindungsharzstartmaterialien synthetisiert werden. Die Bibliothek kann fünf (5) oder mehr, vorzugsweise zehn (10) oder mehr organische Moleküle, die sich voneinander unterscheiden, enthalten (das heißt fünf (5) verschiedene Moleküle und nicht fünf (5) Kopien des gleichen Moleküls). Jedes dieser verschiedenen Moleküle (verschiedene Basisstrukturen und/oder verschiedene Substitutenten) liegen in einer solchen Menge vor, dass ihre Anwesenheit durch irgendein Mittel bestimmt werden kann (z.B. kann es isoliert, analysiert, mit einem Bindungspartner oder einer geeigneten Probe festgestellt werden). Die tatsächlichen Mengen jedes benötigten Moleküls, so dass seine Anwesenheit festgestellt werden kann, können durch die tatsächlich verwendeten Ver fahren variieren und sich mit Fortschreiten der Technologien für die Isolierung, Detektion und Analyse ändern. Wenn die Moleküle in im Wesentlichen gleichen molaren Mengen vorliegen, so kann eine Menge von 100 Picomol oder mehr festgestellt werden. Bevorzugte Bibliotheken umfassen im Wesentlichen gleiche molare Mengen von jedem der gewünschten Reaktionsprodukte und schließen nicht relativ große oder kleine Mengen jeglicher gegebener Moleküle ein, so dass die Anwesenheit solcher Moleküle in jeglichem Assay dominiert oder vollständig unterdrückt ist.
Kombinatorische Bibliotheken werden im Allgemeinen durch Derivatisierung einer Startverbindung auf einer Festphasenunterlage (z.B. ein Kügelchen) hergestellt. Üblicherweise ist an der Festphase ein kommerziell erhältliches Harz, beispielsweise ein Rink- oder Merrifield-Harz befestigt. Nach der Befestigung der Startverbindung werden die Substituenten an der Startverbindung befestigt. Beispielsweise kann eine Benzenverbindung an eine Unterlage mittels eines Rink-Harzes gebunden werden. Der Benzenring reagiert gleichzeitig mit einem Amid, beispielsweise einem N-Formylamin, N-Acetylamin, N-Propionylamin und Ähnlichem. Alternativ kann die Startzusammensetzung den Dilactonrest, oder eine Vorstufe davon, aufweisen. Die Substituenten werden zu der Startzusammensetzung hinzugefügt und können durch die Bereitstellung einer Mischung von Reaktionsmitteln, welche die Substituenten enthalten, variieren. Beispiele für geeignete Substituenten schließen die nachfolgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein:

(1) Kohlenwasserstoffsubstituenten, das heißt aliphatische (z.B. Alkyl oder Alkenyl), alicyclische (z.B. Cycloalkyl, Cycloalkenyl) Substituenten, aromatische, aliphatische und alicyclische substituierte aromatische Kerne und Ähnliches, genauso wie cyclische Substituenten;
(2) substituierte Kohlenwasserstoffsubstituenten, das heißt solche Substituenten, die nicht Kohlenwasserstoffradikale, welche nicht den überwiegenden Kohlenwasserstoffsubstituenten ändern, enthalten; den Fachleuten des Standes der Technik sind solche Radikale bekannt (z.B. Halo (insbesondere Chlor und Fluor), Alkoxy, Mercapto, Alkylmercapto, Nitro, Nitroso, Sulfoxy und Ähnliches);
(3) Heterosubstituenten, das heißt Substituenten, welche, obwohl sie überwiegend Hydrocarbylcharakter haben, weitere Atome, die nicht Kohlenstoffatome sind, enthalten. Geeignete Heteroatome sind den Fachleuten des Standes der Technik bekannt und schließen beispielsweise Schwefel, Sauerstoff, Stickstoff und solche Substituenten wie Pyridyl, Furanyl, Thiophenyl, Imidazolyl und Ähnliches ein. Heteroatome, und typischerweise nicht mehr als eins, liegen für jedes Kohlenstoffatom in dem kohlenwasserstoffbasierten Substituenten vor. Alternativ können keine solcher Radikale oder Heteroatome in dem kohlenwasserstoffbasierten Substituenten vorliegen und es ist somit ein reiner Kohlenwasserstoff.

In einer Ausführungsform wird eine kombinatorische Bibliothek von Antimycinderivaten hergestellt. Zum Beispiel kann das Ausgangsmaterial ein Vorgänger des Dilactonrestes sein. Eine kombinatorische Bibliothek der Dilactone wird unter Verwendung der Shimano-Synthese (infra) synthetisiert, indem die in jedem Schritt der Synthese hinzugefügten Substituenten variiert werden. Wahlweise können nach der Lactonisierung die Threonin- und Salicylsäurereste oder deren Derivate der Bibliothek zugefügt werden.
Methoden der Herstellung kombinatorischer Bibliotheken sind im Stand der Technik bekannt und schließen die folgenden ein: US Patente Nr. 5,958,792 ; 5,807,683 ; 6,004,617 ; 6,077,954 .
Die Mittel der vorliegenden Erfindung sind nützlich für die Behandlung von Zellen, in denen die Zelltodsignale herunterreguliert sind und die betroffene Zelle einen unangemessenen verminderten Hang zum Zelltod aufweist, welches hier bezeichnet wird als sich in einem „verringerten apoptotischen Stadium" befindend. Die Erfindung stellt des weiteren Medikamente für die Verabreichung an ein Subjekt in einer therapeutisch effektiven Menge eines Mittels bereit, um eine mit Apoptose in Verbindung stehende Krankheit zu behandeln, wobei es gewünscht ist, dass die Apoptose in bestimmten Zelltypen, z.B. virusinfizierten Zellen oder autoantikörperexprimierenden Zellen, induziert wird. Üblicherweise werden die Mittel vor der Verabreichung im Wesentlichen gereinigt. Das Subjekt kann ein Tier sein, einschließlich Kühe, Schweine, Pferde, Hühner, Katzen, Hunde und Ähnliches ohne auf diese beschränkt zu sein, und ist typischerweise ein Säugetier und in einer besonderen Ausführungsform der Mensch. In einer anderen spezifischen Ausführungsform ist ein nicht menschliches Säugetier das Subjekt.
Verschiedene Verabreichungssysteme sind bekannt und können zur Verabreichung des Mittels verwendet werden, wie z.B. die Verkapselung in Liposomen, Micropartikeln, Microkapseln, rekombinante Zellen, die in der Lage sind, das Mittel zu exprimieren, rezeptorvermittelte Endocytose (sie he z.B. Wu und Wu, J. Biol. Che. 262: 4429–32 (1987)) und Ähnliches. Die Mittel, die als therapeutische oder pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden, werden mittels jeglicher geeigneter Verabreichungsart, die dem Fachmann bekannt ist, verabreicht, einschließlich beispielsweise der intravenösen, subcutanen, intramuskulären, intradermalen, transdermalen, intrathekalen, intracerebralen, intraperitonealen, epiduralen und oralen Verbreichung. Die Verabreichung kann entweder sehr schnell, wie durch eine Injektion, oder über einen Zeitraum, wie durch eine langsame Infusion, oder Verabreichung von sich langsam freisetzenden Formulierungen erfolgen. Für die Behandlung von Geweben in dem zentralen Nervensystem kann die Verbreichung durch eine Injektion oder Infusion in die zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) erfolgen. Wenn es vorgesehen ist, dass das Mittel an Zellen des zentralen Nervensystems verabreicht wird, kann die Verabreichung mit einem oder mehreren anderen Komponenten erfolgen, die in der Lage sind, die Penetration des Mittels durch die Blut-Hirn-Barriere zu unterstützen. Des Weiteren kann es gewünscht sein, das Mittel in das Zielgewebe mittels jeglicher geeigneter Art, einschließlich der intravenösen und intrathekalen Injektion, einzuführen. Ebenfalls kann die pulmonale Verabreichung verwendet werden, beispielsweise unter Verwendung eines Inhalators oder Zerstäubers und der Formulierung des Mittels mit einem Zerstäubungsmittel.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenfalls oral oder in jeglicher oralakzeptablen Dosierungsform verabreicht werden, einschließlich Kapseln, Tabletten, Kapletten, Pastillen, wässrigen Suspensionen oder Lösungen, ohne auf diese beschränkt zu sein. Im Falle von Tabletten für die orale Verwendung können Trägerstoffe, wie sie übli cherweise verwendet werden, einschließlich Lactose und Maisstärke, verwendet werden. Üblicherweise werden auch Gleitmittel, wie z.B. Magnesiumstearat, hinzugefügt. Für die orale Verabreichung in Kapselform schließen geeignete Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke ein. Wenn wässrige Suspensionen erforderlich sind, kann das Mittel mit emulgierenden und suspendierenden Hilfsmitteln kombiniert werden. Wenn erwünscht, können ebenfalls verschiedene Süßmittel, Aromastoffe oder Farbstoffe verwendet werden.
In einer spezifischen Ausführungsform kann es gewünscht sein, das Mittel lokal in ein zu behandelndes Gebiet oder Bereich zu verabreichen; diese Verabreichung kann beispielsweise erreicht werden, ohne darauf beschränkt zu sein, durch eine lokale Infusion während einer Operation, topischen Anwendung (z.B. in Verbindung mit einem Wundverband nach dem chirurgischen Eingriff), durch Injektion mittels eines Katheters, mittels eines Zäpfchens oder mittels eines Implantats, wobei das Implantat aus einem porösen, nicht porösen oder gelatineartigen Material, einschließlich Membranen, wie beispielsweise silastische Membrane oder Fasern, besteht. In einer Ausführungsform kann die Verabreichung durch direkte Injektion an den Ort (oder früheren Ort) eines malignen Tumors oder neoplastischen oder präneoplastischen Gewebes erfolgen.
In einer anderen Ausführungsform kann das Mittel in einem Vesikel, insbesondere einem Liposom verabreicht werden (siehe z.B. Langer, Science 249: 1527–33 (1990); Treat et al., In Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein und Fidler (eds.), Liss, New York, Seiten 353–65 (1989); Lopez-Berestein, supra, Seiten 317–27).
In einer noch anderen Ausführungsform kann das Mittel in einem kontrollierten Abgabesystem verabreicht werden. In einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden (siehe z.B. Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)). In einer anderen Ausführungsform kann polymeres Material verwendet werden (siehe z.B. Medical Applications of Controlled Release, Langer und Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability. Drug Product Design and Performance, Smolen und Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger und Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); siehe ebenfalls Levy et al., Science 228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105 (1989)). In noch einer anderen Ausführungsform kann ein kontrolliertes Abgabesystem in Nähe des therapeutischen Ziels angeordnet werden, wodurch nur ein Teil der systemischen Dosis erforderlich ist (siehe z.B. Goodson, Medical Applications of Controlled Release, supra, Vol. 2, Seiten 115–138 (1984)). Weitere kontrolliert abgebende Systeme werden beispielsweise in dem Übersichtsartikel von Langer diskutiert (Science 249: 1527–33 (1990)).
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung pharmazeutischer Zusammensetzungen bereit. Solche Zusammensetzungen umfassen einen therapeutisch effektiven Anteil eines Mittels und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Der Begriff „pharmazeutisch akzeptabel" bedeutet, freigegeben durch eine Regulationsbehörde der föderalen o der Staatsregierung oder gelistet in dem US-Arzneibuch oder einem anderen im Allgemeinen anerkannten Arzneibuch zur Verwendung bei Tieren, und insbesondere bei Menschen. Der Begriff „Träger" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel, Hilfsstoff (Adjuvant), Bindemittel, Stabilisator oder Vehikel, mit dem das Mittel für die Verabreichung formuliert ist. Pharmazeutische Träger können sterile Flüssigkeiten, wie z.B. Wasser und öle, einschließlich solcher aus Petroleum, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, wie z.B. Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und Ähnliches, sein. Wasser ist ein typischer Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Ebenfalls können Salzlösungen und wässrige Dextrose und Glycerollösungen als flüssige Träger, insbesondere für injizierbare Lösungen, verwendet werden. Geeignete pharmazeutische Bindemittel schließen Stärke, Glukose, Lactose, Sukrose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Kieselsäuregel, Natriumstearat, Glycerolmonostearat, Kalk, Natriumchlorid, getrocknete entrahmte Milch, Glycerol, Propylenglycol, Wasser, Ethanol und Ähnliches ein. Die Zusammensetzungen können auf Wunsch ebenfalls minimale Anteile an Netzmitteln oder emulgierenden Mitteln, oder pH-Puffermittel enthalten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in der Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pudern, Formulierungen, die über einen längeren Zeitraum freigegeben werden, und Ähnlichem vorliegen. Die Zusammensetzung kann als Zäpfchen mit traditionellen Bindemitteln und Trägern wie z.B. Triglyceriden, formuliert sein.
Orale Formulierungen können Standardträger einschließen, wie z.B. pharmazeutische Sorten von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellu lose, Magnesiumkarbonat und Ähnliches. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences von E.W. Martin beschrieben. Solche Zusammensetzungen enthalten einen therapeutisch wirksamen Anteil eines Mittels, üblicherweise in gereinigter Form, zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers, um eine geeignete Formulierung zur Verabreichung an das Subjekt bereitzustellen. Die Formulierung sollte zu der Verabreichungsart passen.
In einer Ausführungsform ist das Mittel in Übereinstimmung mit den Routineverfahren als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die für die intravenöse Verabreichung an menschliche Organismen angepasst ist. Üblicherweise sind Zusammensetzungen für die intravenöse Verabreichung Lösungen in sterilem isotonischem wässrigem Puffer. Wo es notwendig ist, kann die Zusammensetzung ein Lösungsmittel und ein lokales Anästhetikum enthalten, um den Schmerz an dem Injektionsort zu mildern. Üblicherweise werden die Inhaltsstoffe entweder separat, oder zusammengemischt in einer Einheitsdosisform verabreicht. Beispielsweise als ein gefriergetrocknetes Pulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch verschlossenen Container, z.B. als eine Ampulle oder Portionspackung, die die Menge des aktiven Mittels anzeigt. Wenn die Zusammensetzung durch eine Infusion verabreicht werden soll, so kann es in Infusionsflaschen abgegeben werden, welche eine sterile pharmazeutische Stufe von Wasser oder Saline enthalten. Wo die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht werden soll, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser für die Injektion oder Saline bereitgestellt werden, so dass die Inhaltsstoffe vor der Verabreichung gemischt werden können.
Die Mittel können neutral oder als Salzform formuliert sein. Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen solche ein, die mit freien Aminogruppen gebildet werden, wie solche, die von Hydrochlor-, Phosphor-, Essig-, Oxal-, Tartarsäure und Ähnlichem abgeleitet sind, und solche, die mit freien Carboxylgruppen gebildet werden, wie solche, die von Natrium, Kalium, Ammonium, Kalzium, Eisenhydroxiden, Isopropylaminen, Triethylaminen, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und Ähnlichem abgeleitet sind.
Die Menge des Mittels, welches mit dem Träger kombiniert wird, um eine Einzeldosisform zu produzieren, variiert in Abhängigkeit von der Art des Mittels und der Zusammensetzung der Dosisform. Es sollte jedoch verständlich sein, dass eine spezifische Dosis und ein spezifisches Behandlungsregime für jeden einzelnen Patienten oder jegliches einzelne Krankheitsstadium von einer Vielzahl von Faktoren abhängig ist, einschließlich dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitsstatus, dem Geschlecht, der Ernährung, der Verabreichungszeit, der Ausscheidungsrate, der Arzneimittelkombination, der Einschätzung durch den behandelnden Arzt und dem Grad der speziell zu behandelnden Krankheit. Die Menge des aktiven Mittels hängt ebenfalls von der spezifischen Aktivität des Mittels und der Frage ab, ob das Mittel mit irgendeinem anderen therapeutischen oder prophylaktischen Inhaltsstoff zusammen verabreicht wird. Dosierungsstufen zwischen etwa 0,001 und etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag, typischerweise zwischen etwa 0,1 und etwa 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag des aktiven Mittels sind sinnvoll.
Das Medikament kann in der Form einer pharmazeutischen Packung oder eines Kits vorliegen, die bzw. der ein oder mehrere Container, gefüllt mit einem oder mehreren der Inhaltsstoffe der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt ist bzw. sind. Optional kann diesem/diesen Container/Containern eine Notiz beigefügt sein, in einer Form, die durch eine staatliche Behörde, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von pharmazeutischen oder biologischen Produkten reguliert, vorgeschrieben ist, wobei die Notiz die Zulassung, die Verwendung oder den Verkauf für die Verabreichung am Menschen durch die Agentur wiedergibt.
Die nachfolgend zur Verfügung gestellten Beispiele dienen lediglich der Illustration verschiedener Aspekte der Erfindung und sind nicht für die Erfindung in irgendeiner Weise beschränkend auszulegen.
BEISPIEL 1
Untersuchungen der zellulären Atmung, der ATP-Niveaus und der reaktiven Sauerstoffspezien in Antimycin-A- behandelten Zelllinien wiesen im starken Maße darauf hin, dass die beobachteten Unterschiede in der Zellüberlebensrate nicht durch bekannte Effekte von Antimycin A in Bezug auf den mitochondrialen Elektronentransfer oder die oxidativen Phosporelierung erklärt werden können. Um endgültig die Frage zu klären, welche Aktivitäten des Antimycin A in den selektiven Zelltod von Zellen involviert sind, welche Bcl-X_L überexprimieren, wurde das Struktur-Aktivitäts-Verhältnis von Antimycin A₃ als Inhibitor der Bcl-x_L Porenaktivität untersucht.
In diesem Beispiel wurden zwei Derivate des Antimycin A₃ hergestellt, Antimycin A₃ Methylether (2- Methoxyetherantimycin A₃) und Phenacyletherantimycin A₃ (Vergleichsbeispiel). Die Struktur von Antimycin A₃ wurde oben gezeigt (Formel (I), wo R₁ eine Butylgruppe ist). (Siehe ebenfalls van Tamelen et al., J. Am. Chem. Soc. 83: 1639 (1961)). Antimycin A₃ Methylether hat die folgende Formel (VI) und eine absolute Konfiguration von [2R, 3R, 4S, 7S, 8R]:
Antimycin A₃ Methylether wurde direkt aus Antimycin A₃ auf folgende Art und Weise hergestellt: In Kürze, Antimycin A₃ (14,0 mg) wurde in Ethylether gelöst und ein Strom von Diazomethan durch das Reaktionsgemisch geleitet bis die gelbe Farbe erhalten blieb. Das Reaktionsgemisch wurde mit Essigsäure behandelt bis es farblos wurde. Die Mischung wurde unter verringertem Druck eingetrocknet und in Siliciumgel chromatografiert und ergab 14,3 mg Antimycin A₃ Methylether. Das erhaltene Produkt wurde mittels kernmagnetischer Resonanz, Infrarotspektroskopie und Massenspektroskopie charakterisiert.
Das Phenacyletherderivat des Antimycin A₃ wurde wie folgt hergestellt: Eine Lösung von Antimycin A₃ (5,7 mg, 10,95 mmol) in trockenem Acetonitril wurde mit Phenacylbromid (4,4 mg, 21,9 mmol) und pulverförmigem Kaliumcarbonat (6,0 mg, 43,8 mmol) behandelt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 18 Stunden gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde direkt auf eine Siliciumgelchromatografiesäule aufgetragen. Das Produkt wurde mit 20% Ethylacetat/Hexan eluiert und ergab 5,4 mg (78%) des Produktes als farbloses Öl. Das erhaltene Produkt wurde mittels kernmagnetischer Resonanz, Infrarotspektroskopie und Massenspektroskopie charakterisiert.
BEISPIEL 2
Das in Beispiel 1 hergestellte Antimycin A₃ Methyletherderivat wurde auf seine Wirkung auf dem Apoptosesignalweg in Zellen, die Bcl-x_L überexprimieren, untersucht. Für das Methyletherderivat wurde vorher gezeigt, dass es als Inhibitor des Cytochrom bc1 inaktiv ist (siehe z.B. Miyoshi et al., Biochim. Biophys. Acta 1229: 149–54 (1995); Takotake et al., Biochim. Biophys Acta 1185: 271–78 (1994)). Der Methylether hat ebenfalls einen vernachlässigbaren Effekt auf die zelluläre O₂-Konsumption im Vergleich zu der originalen Antimycin A₃ Zusammensetzung. TABX2S (die Bcl-x_L überexprimieren), TAMH.neo (Kontrolle) und TABX1A (Antisens) Zelllinien wurden mit 2-Methoxyantimycin A₃ behandelt. Diese Zelllinien zeigten als Bild eine bevorzugte Cytotoxizität bei Zellen, die Bcl-x_L überexprimieren, jedoch nicht bei den Kontrollzellen. Dieses Bild war dem der Antimycin A₃ Behandlung von diesen Zelllinien ähnlich, was darauf hinweist, dass die Wirkung dieses Antimycinderivats auf die zelluläre Atmung separat von der auf die Apoptose ist.
Um diese Ergebnisse zu betätigen, wurden ebenfalls Assays mit mitochondrialen Fraktionen jeder der verwendeten Zelllinien unter Verwendung der mitochondrialen Probe JC-1 durchgeführt. Die Mitochondrien der Zellen die Bel-X_L überexprimieren (TABX2S Zellen) waren nach der Zugabe des 2-Methoxyderivats in einer Konzentration von 2 μg/ml stark depolarisiert. Wie für die Ausgangszusammensetzung Antimycin A₃ beobachtet, wurden die Mitochondrien mit normalen Bcl-x_L-Expressionsniveau durch das 2-Methoxyanalog nicht beeinflusst.
Letztendlich konnte für das 2-Methoxyantimycin A₃ Derivat die Bindung an rekombinantes Bcl-2 gezeigt werden. Das 2-Methoxyantimycin A₃ Derivat ist wegen dem zusätzlichen elektrophilen Substituenten an dem Benzenring nicht fluoreszierend. Somit kann die Bindung des 2-Methoxyantimycin A₃ an das Bcl-2 Protein in einem Konkurrenzbindungsassay durch Überwachung der Fluoreszenz des Antimycin A₃ gemessen werden. Für diese Experimente wurde Antimycin A₃ (2 μM) und entweder 2-Methoxyetherantimycin A₃ oder Phenacyletherantimycin A₃ (2 μM) gleichzeitig dem Bcl-2 Polypeptid (3 μM) hinzugefügt und die Einstellung eines Gleichgewichts für 7,5 Minuten bei 22,5°C erlaubt, bevor die Intensität der Fluoreszenz des Antimycin A₃ gemessen wurde. Die Fluoreszenz eines vorgebundenen Antimycin A₃ rekombinanten Bcl-2 Komplexes verringerte sich exponential mit der Zugabe des 2-Methoxyantimycin A₃, was darauf hinweist, dass ein Wettbewerb in Bezug auf den Antimycin A₃ Bindungssite am Bcl-2 stattfindet. Als eine weitere Kontrolle für die Bindungsspezifizität wurde die Wirkung des Phenacyletherderivats des Antimycin A₃ ebenfalls untersucht. Obwohl von ähnlicher Hydrophobizität, so verdrängte das Phenacyletherderivat nicht das Antimycin A₃ vom Bcl-2. Diese Ergebnisse weisen stark darauf hin, dass die zelluläre und mito chondriale Sensitivität in Bezug auf Antimycin A₃ in Bcl-x_L expressierenden Zelllinien das Ergebnis der direkten Bindung von Antimycin A₃ an das Bcl-X_L Protein ist. Des Weiteren inhibierte das 2-Methoxyetherantimycin A₃ Derivat die Bcl-x_L Porenbildung in einem Liposomenpermeabilitätsassay nahezu genauso gut wie Antimycin A₃.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Antimycine zwei strukturelle unterschiedliche Proteinbindungsaktivitäten haben, eine für die Bindung an das Cytochrom bc₁, und die andere für die Bindung an die Proteine der Bcl-2 Familienmitglieder, und dass diese Aktivitäten voneinander getrennt sind.
BEISPIEL 3
Die totale Synthese des Antimycin A₃ wird im wesentlichen wie von Shimano für die in Zusammenhang stehenden Dilactone UK-2A und UK-3A (Shimano, Tetrahedron 54: 12745–74 1998) beschrieben, durchgeführt. In Kürze, Antimycin A₃ besteht aus drei strukturellen Einheiten: einer N-Formyl-3-aminosalicylsäure, L-Threonin und 2-Butyl-3,4-dihydroxypentansäure. Von diesen drei strukturellen Komponenten sind N-formyl-3-aminosalicylsäure und L-Threonin kommerziell erhältlich. Die Dihydroxypentansäure wird in einer vier-Schritt-Reaktionsfolge, beginnend mit Caproylchlorid, hergestellt. Bezugnehmend auf 1 wird Caproylchlorid mit dem Evans Valin-abgeleitetes Oxazolidinon, (R)-4-Isopropyloxazolidin-2-on und n-ButylLi (Schritt a) reagieren gelassen. Das erhaltene Adduct (2) wird durch Aldolkondensation mit einem chiralen Aldehyd, abgeleitet von (S)-(-)-Milschsäure (3) in Anwesenheit von Dibutyl-BOTf und Triethylamin reagieren gelassen (Schritt b). Die 4- Hydroxylgruppe des erhaltenen Adducts (4) wird als ein t-Butyldimethylsilylether (unter Verwendung von TBS Chlorid und DIEA) geschützt, gefolgt von einer Peroxid-vermittelten Hydrolyse (unter Verwendung von Wasserstoffperoxid und Lithiumhydroxid) des chiralen Hilfszusatzes, um die unterschiedlich geschützte dihydroxypentanoische Säure (5) zu ergeben (Schritte c und d). Der unterschiedliche Schutz der beiden sekundären Alkohole erlaubt die Inkorporation von verschiedenen Carboxylsäuren in Position 3 des Lactons. Die Carboxylsäure ist an den N-FMOC-L-Threoninbenzylether mit BOP-Chlorid und DMAP gekoppelt (Schritt e). Die Entfernung der beiden benzylschützenden Gruppen mit H₂ und Pd/O führt zu der Dilactonsecosäure (6) (Schritt f). Die Lactonisierung findet unter Verwendung einer BOP-Cl vermittelten Ester-bildenden Reaktion mit DMAP statt (Schritt g). Diethylamin wird verwendet, um die FMOC schützenden Gruppen zu entfernen, um das Dilacton (7) zu erhalten (Schritt h). Unter Verwendung üblicher Carbodiimidchemie wird die Nformyl-3-aminosalicylsäure an das Dilacton gekoppelt (Schritt i). Im Einzelnen wird das Dilacton mit der Nformyl-3-aminosalicylsäure unter Verwendung von EDCl und HOBT kombiniert, gefolgt von einer Behandlung mit TRAF. Für die abschließende Ausarbeitung der derivatisierten Antimycin A₃ Struktur werden die silylschützenden Gruppen Fluorid-vermittelt entfernt und das gewünschte Säurechlorid (z.B. Isovalerylchlorid und DIEA) angekoppelt (Schritte j und k).
BEISPIEL 4
Für die Herstellung von Derivaten des Antimycin A₃, die in dem Isovaleratrest (das heißt R₂) des Dilactons modifiziert sind, wurde die totale Synthese des Antimycin A₃ (wie in Beispiel 3 beschrieben) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: Nach der Dilactonisierung wurde das Isovalerylchlorid durch ein anderes Acylchlorid, wie z.B. ein Acetylchlorid, Butyrylchlorid und Ähnliches, substituiert.
BEISPIEL 5
Für die Herstellung von Derivaten des Antimycin A₃, bei denen die Butylgruppe (das heißt R₁) an dem Dilacton durch eine andere R-Gruppe substituiert ist, wurde die totale Synthese des Antimycin A₃ (wie in Beispiel 3 beschrieben) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: Das Caproylchlorid von Schritt 1 wurde durch ein anderes Acylchlorid, wie z.B. Propionylchlorid oder ein anderes lineares oder verzweigtes Acylchlorid, substituiert.
SEQUENZLISTE

Claims

Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antimycinderivates zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die mit Apoptose in Zusammenhang stehen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Neoplasien, lymphoproliferativen Zuständen, Krebs und Medikamenten-resistenter Krebs, wobei das Antimycinderivat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antimycin A_0(a), Antimycin A_0(b), Antimycin A_0(c), Antimycin A_0(d), Antimycin A₁, Antimycin A₂, Antimycin A₃, Antimycin A₄, Antimycin A₅, Antimycin A₆, Kitamycin A, Kitamycin B, Urauchimycin B, Deisovalerylblastomycin, Dehexyl-Deisovalerylblastomycin; mit der Maßgabe, dass die Hydroxylgruppe an dem Benzolring ersetzt ist durch eine Methoxygruppe.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antimycinderivat 2-Methoxy Ether Antimycin A oder A₃ ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Medikament zusätzlich einen pharmazeutischen Träger umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das Medikament formuliert ist für intravenöse, subcutane, intramuskuläre, intradermale, transdermale, intrathecale, intracerebrale, intraperitoneale, epidurale oder orale Verabreichung.