DE60031279T2

DE60031279T2 - Humane monoklonale antikörper gegen prostata spezifisches membranantigen

Info

Publication number: DE60031279T2
Application number: DE60031279T
Authority: DE
Inventors: Yashwant Audubon DEO; Robert Frenchtown GRAZIANO; Debra Livermore HUDSON; William T. Redmond TINO; H. Eric Bothell HOLMES
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1999-07-29
Filing date: 2000-07-26
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2020-07-27
Also published as: JP2003508029A; DK1210374T3; IL147638A0; CN100400547C; HK1049015B; CA2380783C; NZ517331A; HK1049015A1; CA2380783A1; MXPA02000961A; AU6374500A; EP1210374B1; EP1210374A1; KR20020047099A; WO2001009192A1; DE60031279D1; AU783356B2; KR100733933B1; ES2277846T3; WO2001009192A9

Description

Prostata-Krebs ist ein weit verbreiteter Krebs und eine maßgebliche Ursache für Morbidität und Mortalität unter Männern. Behandlungen für Prostata-Krebs schließen Chirurgie, Hormone, Bestrahlung und Chemotherapie ein. Es gibt kaum eine effektive Behandlung für eine metastasenbildende Prostata-Erkrankung, so dass daher die Identifizierung von Genen und/oder Genprodukten, die genaue diagnostische und prognostische Marker als auch Ziele bzw. Targets für die Therapie darstellen, bedeutsam ist. Prostata spezifisches Antigen (PSA) stellt einen derartigen Krebs-Marker dar, dessen Werte bei der klinischen Diagnose und dem Einstufen von Prostata-Krebs nützlich ist. Mit PSA kann jedoch in dem Bereich von 4–10 ng/ml nicht eine gutartige Prostata-Hyperplasie (BPH) von einer Prostatitis oder einem Prostata-Krebs unterschieden werden, was folglich eine zytologische und/oder histologische Beurteilung notwendig macht, um die genaue Diagnose zu bestätigen (9).
Prostata spezifisches Membran-Antigen (PSMA) ist ein 750 Aminosäuren umfassendes, Typ II Transmembran Glykoprotein von ungefähr 110 kD, das 54% Homologie zu dem Transferrin-Rezeptor aufweist. PSM' stellt eine alternativ gespleißte Form von PSMA dar, die in dem Zytoplasma angeordnet vorliegt. PSMA weist 3 strukturelle Domänen auf, einschließlich einer 19 Aminosäuren umfassenden intrazellulären Domäne, einer 24 Aminosäuren umfassenden Transmembran-Domäne und einer 707 Aminosäuren umfassenden extrazellulären Domäne. Das PSMA-Protein zeigt Neurocarboxypeptidase und Folat-Hydrolase Aktivität, und kann somit mit der neuroendokrinen Regulation eines Prostatawachstums und einer Differenzierung (7) in Beziehung stehen.
Untersuchungen der PSMA-Expression zeigte, dass es einen neuen Marker darstellt, der hauptsächlich durch Epithelzellen der Prostata exprimiert wird. Weiterhin wird die Expression von PSMA bei Prostata-Krebs erhöht, insbesondere bei schwach differenzierten, metastasenbildenden und Hormon unempfindlichen Karzinomen (8, 11). PSMA stellt daher ein wertvolles diagnostisches, prognostisches und therapeutisches Ziel bei Prostata-Krebs dar. Gering gradige Expression von PSMA wurde ebenfalls in Geweben außerhalb der Prostata, wie beispielsweise dem Dünndarm, der Speicheldrüse, der Duodenalmukosa, den proximalen Nierentubuli und dem Gehirn (11) beobachtet.
PSMA im Gehirn steht mit der Umsetzung des Neurotransmitters NAAG zu HAA und freiem Glutamat in Beziehung, das bei der Pathogenese neurologischer Erkrankungen wie beispielsweise multipler Sklerose, amyotropher Lateralsklerose, Alzheimer-Erkrankung und Schizophrenie (12) von Bedeutung sein kann. Die PSMA-Expression wird ebenfalls in Endothelzellen von Kapillargefäßen in peritumoralen und endotumoralen Bereichen bestimmter bösartiger Erkrankungen, einschließlich Nierenzellkarzinomen und Kolonkarzinomen, jedoch nicht in Blutgefäßen von normalem Gewebe beobachtet, was nahe legt, dass dessen Expression ebenfalls mit einer Tumorangiogenese (11) in Beziehung steht.
Die WO 97/35616 beschreibt monoklonale Antikörper, die an die extrazelluläre Domäne von Prostata spezifischem Membran-Antigen (PSMA) binden und Verfahren zur Verwendung derartiger Antikörper bei der Diagnose und Behandlung von Krebs. Vaughan, T. J. et al., Nature Biotechnology 16(6) (1998), 535–539 und Brüggemann, M. and Neuberger, M. S., Immunology Today 17(8) (1996), 391–397 beschreiben Strategien zur Herstellung von menschlichen Antikörpern in transgenen Mäusen.
Curnow, R. T., Cancer Immunology and Immunotherapy 45 (1997), 210–215 beschreibt die Verwendung von eine gegen CD64 gerichtete Immuntherapie bei der Behandlung von Krebs. Curnow verwendete bispezifische humanisierte Antikörper MDX-447 (humanisiertes Fab Anti-CD64 × humanisiertes Fab Anti-EGFR) und MDX-H210 (humanisiertes Fab Anti-CD64 × Fab Anti-HER2/neu).
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte menschliche monoklonale Antikörper bereit, die spezifisch an menschliches Prostata spezifisches Membran-Antigen (PSMA) mit einer Affinitätskonstanten von mindestens 10⁷ M^–1 binden, als auch Zusammensetzungen die einen oder eine Kombination derartiger Antikörper umfassen. Der menschliche Antikörper ist durch eine Bindung an PSMA mit einer Affinitätskonstanten von mindestens 10⁷ M^–1 gekennzeichnet, und weist die Fähigkeit auf eine Zytolyse einer PSMA (in vitro) exprimierenden Zelle in der Gegenwart von menschlichen Effektorzellen (beispielsweise polymorphkernigen Zellen, Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen) mit einer Konzentration von 10 μg/ml oder weniger zu vermitteln und kann eine Zytolyse von PSMA-exprimierenden Zellen durch menschliche Effektorzellen mit einer IC⁵⁰ von 1 × 10^–7 oder weniger in vitro vermitteln. Demgemäß können die erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörper als diagnostisches oder therapeutisches Mittel in vivo und in vitro verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen isolierten menschlichen Antikörper umfassen verschiedene Isotypen von Antikörpern, wie beispielsweise IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD und IgE. Gewöhnlich umfassen sie IgG1 (beispielsweise IgG1k) und IgM Isotypen. Die Antikörper können die volle Länge (beispielsweise einen IgG1 oder IgG4 Antikörper) umfassen. In einer Ausführungsform sind die menschlichen Antikörper rekombinante menschliche Antikörper. In einer anderen Ausführungsform werden die menschlichen Antikörper durch ein Hybridom hergestellt, dass eine B-Zelle umfasst, die von einem transgenen nicht-menschlichen Tier, beispielsweise einer transgenen Maus erhalten wurde, die ein Genom aufweist, das ein in eine immortalisierte Zelle fusioniertes Transgen einer menschlichen schweren Kette und ein Transgen einer leichten Kette umfasst. Die Antikörper können durch die hier bezeichneten Hybridome 4A3, 7F12, 8A11, 16F9 und 8C12 hergestellt werden.
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen menschlichen anti-PSMA Antikörper durch eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften ausgezeichnet sein:

a) Spezifität für das PSMA;
b) einer Bindungsaffinität für PSMA mit einer Affinitätskonstante von mindestens ungefähr 10⁷ M^–1, vorzugsweise ungefähr 10⁹ M^–1 und noch bevorzugter ungefähr 10¹⁰ M^–1 bis 10¹¹ M^–1 oder höher;
c) einer Assoziationskonstante (K_assoc) für PSMA von mindestens ungefähr 10³, noch bevorzugter ungefähr 10⁴ und am meisten bevorzugt ungefähr 10⁵ M^–1S^–1;
d) einer Dissoziationskonstante (K_dis) für PSMA von ungefähr 10^–3 s^–1, vorzugsweise ungefähr 10^–4 s^–1, noch bevorzugter 10^–5 s^–1 und am meisten bevorzugt 10^–6 s^–1;
e) die Fähigkeit eine PSMA-exprimierende Zelle zu opsonisieren; oder
f) die Fähigkeit ein Wachstum zu hemmen und/oder eine Phagozytose und ein Abtöten von PSMA-exprimierenden Zellen (beispielsweise einer Tumorzelle) in der Gegenwart menschlicher Effektorzellen mit einer Konzentration von ungefähr 10 μg/ml oder weniger (beispielsweise in vitro) zu vermitteln.

Beispiele von Tumorzellen, auf die mit den erfindungsgemäßen menschlichen Antikörper gezielt (getargetet) werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein Prostata- Nieren- und Kolon-Tumorzellen.
Die erfindungsgemäßen isolierten menschlichen Antikörper binden an PSMA-Antigen mit einer Affinitätskonstante von mindestens 10⁷ M^–1, vorzugsweise etwa 10⁸ M^–1, noch be vorzugter ungefähr 10⁹ M^–1 und am meisten bevorzugt ungefähr 10¹⁰ bis 10¹¹ M^–1 oder stärker, und können ein Wachstum hemmen und/oder eine Phagozytose und ein Abtöten von PSMA-exprimierenden Zellen durch menschliche Effektorzellen, beispielsweise polymorphkernigen Zellen (PMNs), Monozyten und Makrophagen mit einer IC₅₀ von ungefähr 1 × 10^–7 M oder weniger, oder bei einer Konzentration von ungefähr 10 μg/ml oder weniger in vitro vermitteln.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das die variable Region eines erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörpers kodiert. Demgemäß können rekombinante Expressionsvektoren die erfindungsgemäßen Antikörper kodierenden Nukleinsäuren umfassen, Wirtszellen können mit derartigen Vektoren transfiziert und die erfindungsgemäßen Antikörper können durch Züchten dieser Wirtszellen hergestellt werden.
Isolierte B-Zellen eines transgenen nicht-menschlichen Tieres, beispielsweise eine transgene Maus, die verschiedene Isotypen (beispielsweise IgG, IgA und/oder IgM) von spezifisch an PSMA bindende menschliche monoklonale Antikörper exprimieren kann, kann erhalten werden. Vorzugsweise werden die isolierten B-Zellen von einem transgenen nicht-menschlichen Tier, beispielsweise einer transgenen Maus erhalten, die mit einer gereinigten oder angereicherten Präparation von PSMA-Antigen und/oder das PSMA-exprimierenden Zellen immunisiert wurden. Vorzugsweise weist das transgene nicht-menschliche Tier, beispielsweise eine transgene Maus, ein Genom auf, das ein menschliches schwere Ketten Transgen und ein menschliches leicht Kette Transgen umfasst. Die isolierten B-Zellen werden anschließend immortalisiert, um eine Quelle (beispielsweise ein Hybridom) von menschlichen monoklonalen Antikörpern gegen PSMA bereitzustellen.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Hybridom bereit, das menschliche monoklonale Antikörper herstellen kann, die spezifisch an PSMA binden. In einer Ausführungsform umfasst das Hybridom eine B-Zelle, die von einem transgenen nicht-menschlichen Tier, beispielsweise einer transgenen Maus, erhalten wurde, mit einem Genom, das ein in eine immortalisierte Zelle fusioniertes menschliches schwere Ketten Transgen und ein menschliches leichte Ketten Transgen umfasst. Das transgene nicht-menschliche Tier kann mit einer gereinigten oder angereicherten Präparation von PSMA-Antigen und/oder PSMA-exprimierenden Zellen immunisiert werden, um Antikörper bildende Hybridome zu erzeugen. Insbesondere umfassen die Hybridome 4A3, 7F12, 8A11, 16F9 und 8C12.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein transgenes, nicht-menschliche Tier, beispielsweise eine transgene Maus (ebenfalls hier als ein "HuMab" bezeichnet), mit einem ein menschliches schwere Ketten Transgen und einem ein menschliches leichte Ketten Transgen umfassendes Genom bereit, das einen menschlichen monoklonalen Antikörper, der wie hier definiert an PSMA spezifisch bindet, exprimiert. In einer besonderen Ausführungsform ist das transgene nicht-menschliche Tier eine transgene Maus. Das transgene nicht-menschliche Tier kann mit einer gereinigten oder angereicherten Präparation von PSMA-Antigen und/oder PSMA-exprimierenden Zellen immunisiert werden. Vorzugsweise kann das transgene nicht-menschliche Tier, beispielsweise die transgene Maus, mehrere Isotypen gegen PSMA (beispielsweise IgG, IgA und/oder IgM) gerichteter menschlicher monoklonaler Antikörper durch Ausführen einer V-D-J Rekombination und einem Isotypen-Umschaltung (Isotypen-Switching) herstellen. Eine Isotypen-Umschaltung kann beispielsweise durch klassisches oder nicht-klassisches Isotypen-Umschalten erfolgen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Herstellen menschlicher monoklonaler Antikörper bereit, die wie hier definiert mit PSMA spezifisch reagieren. Das Verfahren umfasst, Immunisieren eines transgenen nicht-menschlichen Tieres, beispielsweise einer transgenen Maus, die ein Genom aufweist, das ein menschliches schwere Ketten Transgen und ein menschliches leichte Ketten Transgen umfasst, mit einer gereinigten oder angereicherten Präparation von PSMA-Antigen und/oder PSMA-exprimierenden Zellen. B-Zellen (beispielsweise B-Zellen aus der Milz) des Tieres werden anschließend erhalten und mit Myelomzellen fusioniert, um immortalisierte Hybridomzellen zu bilden, die die menschlichen monoklonalen Antikörper gegen PSMA sezernieren.
Die erfindungsgemäßen isolierten menschlichen monoklonalen anti-PSMA Antikörper oder Antigen bindende Bereiche davon können derivatisiert oder mit einem anderen funktionellen Moleküle, beispielsweise einem anderen Peptid oder Protein (beispielsweise ein Fab'-Fragment) verbunden werden. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßer Antikörper oder Antigen bindender Bereich an einen oder mehrere andere Moleküleinheiten bzw. Entitäten, wie beispielsweise einen anderen Antikörper (beispielsweise einen bispezifischen oder mehrfach-spezifischen Antikörper) funktionell gebunden werden (beispielsweise durch chemische Kopplung, genetische Fusion, nicht kovalente Assoziation oder anderweitig). Dementsprechend fördert eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform ein bispezifisches oder mehrfach-spezifisches Molekül, das mindestens eine erste Bindungsspezifität für PSMA, d.h. einen wie hier definierten menschlichen monoklonalen Antiköper und eine zweite Bindungsspezifität für einen Fc-Rezeptor, wie beispielsweise einen menschlichen FcγRI oder einen Fcα-Rezeptor, umfasst.
Erfindungsgemäße mehrfach-spezifische Moleküle umfassen ebenfalls tri-spezifische, tetra-spezifische und andere mehrfach-spezifische Moleküle. In einer Ausführungsform umfasst das mehrfach-spezifische Molekül einen Anti-Verstärkungs- bzw. Enhancement-Faktor (EF) Bereich, beispielsweise ein Molekül, das an ein mit zytotoxischer Aktivität in Beziehung stehendes Oberflächenprotein bindet.
In einer besonderen Ausführungsform umfassen erfindungsgemäße bispezifische und mehfach-spezifische Moleküle mindestens einen Antikörper, oder ein Fragment davon (beispielsweise ein Fab, Fab', F(ab')₂, F_v, oder ein Einzel-Ketten F_v). In einer besonderen Ausführungsform liegt der Antikörper oder das Fragment davon als ein vollständiger menschlicher Antikörper oder als ein Bereich davon vor, oder als ein "chimärer" oder ein "humanisierter" Antikörper oder ein Bereich davon (weist beispielsweise eine variable Region auf oder mindestens eine Complementarity Determining Region (CDR), die von einem nicht-menschlichen Antikörper (beispielsweise Maus) abgeleitet ist, wobei der/die verbleibende(n) Bereich(e) im Ursprung menschlich sind).
In einer Ausführungsform bindet der mindestens eine Antikörper oder das Fragment davon von dem bispezifischen oder multispezifischen (mehrfach-spezifischen) Molekül an einen Fc-Rezeptor, wie beispielsweise einen menschlichen IgG-Rezeptor, beispielsweise einen Fc-gamma Rezeptor (FcγR), wie beispielsweise FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16). Ein bevorzugter Fcγ-Rezeptor ist der Fcγ-Rezeptor FcγRI mit hoher Affinität. Andere Fc-Rezeptoren, wie beispielsweise menschliche IgA-Rezeptoren (beispielsweise FcαRI) können ebenfalls getroffen werden. Der Fc-Rezeptor ist vorzugsweise an der Oberfläche einer Effektorzelle, beispielsweise einem Monozyten, Makrophagen oder einer aktivierten polymorphkernigen Zelle, angeordnet. In einer bevorzugten Ausführungsform binden die bispezifischen oder mehrfach-spezifischen Moleküle an einem Ort bzw. Stelle an einen Fc-Rezeptor, der von der Immunglobulin Fc- (beispielsweise IgG oder IgA) Bindungsstelle des Rezeptors verschieden ist. Die Bindung der bispezifischen und mehrfach-spezifischen Moleküle wird daher nicht durch physiologische Pegel von Immunglobulinen blockiert.
In einer anderen Ausführungsform fördert die vorliegende Erfindung einen menschlichen anti-PSMA Antikörper, oder ein Fragment davon, der/das an eine therapeutische Komponente, beispielsweise ein zytotoxisches Arzneimittel, ein enzymatisch aktives Toxin, oder ein Fragment davon, ein Radioisotop, oder ein Anti-Krebs-Arzneimittel aus einem kleinen Molekül, konjugiert vorliegt.
Es können Ziel-spezifische (für das Ziel spezifische) Effektorzellen bereitgestellt werden, die eine Fc-Rezeptor exprimierende Effektorzelle, beispielsweise einen Makrophagen oder eine aktivierte PMN-Zelle und ein erfindungsgemäße bispezifisches oder mehrfach-spezifisches Molekül umfassen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, beispielsweise pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzungen bereit, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger und mindestens einen erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörper umfassen, der spezifisch an PSMA bindet. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung eine Kombination der menschlichen Antikörper oder der Antigen bindenden Bereiche davon, vorzugsweise jeden, der an ein unterschiedliches Epitop bindet. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die beispielsweise einen menschlichen monoklonalen Antikörper, der in Gegenwart von Effektorzellen ein hoch effektives Abtöten von Target-Zellen (Zielzellen) vermittelt, kann mit einem anderen monoklonalen Antikörper kombiniert werden, der das Wachstum von PSMA-exprimierenden Zellen hemmt. Die Kombination stellt somit mehrere zugeschnittene bzw. maßgeschneiderte Therapien bereit, um den maximalen therapeutischen Nutzen bereitzustellen. Zusammensetzungen, beispielsweise pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Kombination von mindestens einem erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörper und mindestens einem erfindungsgemäßen bispezifischen oder mehrfach-spezifischen Molekül umfassen, liegen ebenfalls innerhalb dem Umfang der Erfindung.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein ex vivo Verfahren zur Hemmung der Vermehrung und/oder Differenzierung einer PSMA-exprimierenden Zelle bereit, indem das Wachstum gehemmt wird und/oder indem eine Phagozytose und/oder ein Ab töten von Target-Zellen (Zielzellen) durch menschliche Effektorzellen, wie beispielsweise menschliche polymorphkernige Zellen (PMNs), Monozyten, Makrophagen unter Verwendung eines Antikörpers oder eines erfindungsgemäßen bispezifischen oder mehrfach-spezifischen Antikörpers induziert wird. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren, in vitro Inkontaktbringen einer PSMA-exprimierenden Zelle mit einem oder einer Kombination von erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörpern, oder einem Antigen bindenden Bereich davon in der Gegenwart einer menschlichen Effektorzelle. Das Verfahren kann in Kultur, beispielsweise in vitro oder ex vivo (beispielsweise Kulturen umfassend PSMA-exprimierende Zellen und Effektorzellen) ausgeführt werden. Beispielsweise können eine PSMA-exprimierende Zellen beinhaltende Probe und Effektorzellen in vitro kultiviert und mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, oder einem erfindungsgemäßen bispezifischen oder multispezifischen Molekül kombiniert werden.
Für beispielhafte Zwecke können in vivo Verfahren, der Antikörper oder ein Antigen bindender Bereich davon (oder ein erfindungsgemäßes bispezifisches oder mehrfach-spezifisches Molekül) einem menschlichen Wesen bzw. Subjekt verabreicht werden, das an einer mit PSMA in Beziehung stehenden Erkrankung, wie Krebsen bzw. Karzinomen der Prostata, Niere und Kolon leidet, so dass Wachstumshemmung, Phagozytose und/oder Abtöten von PSMA-exprimierenden Zellen induziert wird. Das Wesen kann zusätzlich mit einem Mittel behandelt werden, das die Expression oder Aktivität von Fc-Rezeptoren, beispielsweise einen Fcα-Rezeptor oder einen Fcγ-Rezeptor, moduliert, beispielsweise erhöht oder hemmt, indem das Wesen beispielsweise mit einem Zytokin behandelt wird. Bevorzugte Zytokine zur Verabreichung während der Behandlung mit dem bispezifischen oder mehrfach-spezifischen Molekül, umfassen Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen Kolonie stimulierender Faktor (GM-CSF), Interferon-γ (IFN-γ) und Tumor-Nekrose Faktor (TNF).
Zusammensetzungen von erfindungsgemäßen isolierten menschlichen monoklonalen Antikörpern können ebenfalls in Kombination mit anderen bekannten Therapien, beispielsweise einer Anti-Krebs-Therapie, verabreicht werden. Die Erfindung stellt somit eine Verwendung eines hier beschriebenen menschlichen monoklonalen Antikörpers oder bispezifischen oder mehrfach-spezifischen Moleküls zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung von kanzerogenen Erkrankungen bereit. Derartige Erkrankun gen umfassen Krebs der Prostata, Niere und des Kolons.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem in vitro die Gegenwart von PSMA-Antigen in einer Probe, beispielsweise zur Diagnose einer mit PSMA in Beziehung stehenden Erkrankung, nachgewiesen bzw. festgestellt wird. In einer Ausführungsform wird dies durch Inkontaktbringen einer zu untersuchenden Probe, gemeinsam mit einer Kontrollprobe, mit einem erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörper, oder einem bispezifischen oder mehrfach-spezifischen Molekül unter Bedingungen erreicht, die eine Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und dem PSMA ermöglichen. Es wird dann eine Komplexbildung in beiden Proben festgestellt (beispielsweise unter Verwendung eines ELISA), wobei eine beliebige statistisch signifikante Differenz bei der Bildung von Komplexen zwischen den Proben darauf hinweist, dass PSMA-Antigen in der Test-Probe vorhanden ist.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen offenbar werden.
1 zeigt ein schematisches Diagramm der gezielten Insertion einer Neo-Kassette in die SmaI-Stelle des μ-Exons. Tafel A zeigt die genomische Struktur des μ Lokus, wobei die gefüllten Boxen die μ-Exons darstellen. Tafel B ist ein schematisches Diagramm des CmD-Targeting Vektors. Tafel C zeigt den targeted μ-Lokus (den Lokus μ, auf den gezielt wurde), in den die Neo-Kassette in μl eingefügt wurde.
2 ist eine schematische Beschreibung der Herstellung von IgG1k menschlichen monoklonalen Antikörpern (HuMabs) gegen PSMA, Her2/neu und CD89 (FcαR) durch Immunisieren transgener Mäuse.
3 zeigt ein vollständiges menschliches bispezifisches Molekül, 14.1 × 8C12, das an CD89 (FcαR) und an PSMA bindet. Das Molekül beinhaltet ein Anti-CD89 Fab' Antikörperfragment (abgeleitet von dem menschlichen monoklonalen Anti-CD89Antikörper, 14.1), das durch eine Disulfidbindung an ein Anti-PSMA Fab' Antikörperfragment (abgeleitet von dem menschlichen monoklonalen anti-PSMA Antikörper, 8C12) chemisch gekoppelt ist.
4 zeigt die Reaktivität von menschlichen monoklonalen anti-PSMA Antikörpern mit Membranfraktionen von menschlichem Prostata Adenokarzinom LNCaP und PC3 Zellen, wie sie durch ELISA festgestellt wurde. Das Hintergrundsabsorptionsvermögen bei 405 nm betrug 0,05.
5 zeigt, wie durch Durchflusszytometrieanalyse festgestellt, die Bindung von menschlichen anti-PSMA Antikörpern an LNCaP und PC3 Tumorzellen. Grünes Histogramm Bindung an LNCaP-Zellen; Rosa Histogramm Bindung an PC3-Zellen; Violettes Histogramm irrelevantes menschlichen IgG1. Tafel A, Antikörper 4A3; Tafel B, Antikörper 7F12; Tafel C, Antikörper 8A11, Tafel D, Antikörper 8C12, Tafel E, Antikörper 16F9.
6 stellt eine graphische Darstellung dar, die eine in 3 gezeigte Bindung des bispezifischen Moleküls 14.1 × 8C12 an PSMA-exprimierende LNCaP-Zellen als eine Funktion der Konzentration des bispezifischen Moleküls zeigt.
7 stellt eine graphische Darstellung dar, die eine in 3 gezeigte Bindung des bispezifischen Moleküls 14.1 × 8C12 an CD89 exprimierende U937-Zellen als ein Funktion der Konzentration des bispezifischen Moleküls zeigt.
8 zeigt eine Immunpräzipitation von PSMA aus Detergenslysaten von LNCaP-Zellen unter Verwendung spezifischer menschlicher anti-PSMA Antikörper. Spur 1, LNCaP-Zelllysat; Spur 2 bis Spur 7, Immunpräzipitation mit den folgenden Antikörpern: irrelevanter menschlicher IgG1, 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 beziehungsweise 16F9. Es wurden durch SDS-Gel Elektrophorese und Western-Blot die Immunkomplexe unter Verwendung des Maus anti-PSMA Antikörpers 4D8 analysiert.
9 zeigt die Wirkung einer Hitzedenaturierung von isoliertem PSMA auf die Bindung durch menschliche anti-PSMA Antikörper.
10 zeigt eine vergleichende Bindungsanalyse der menschlichen anti-PSMA Antikörper, wie sie durch Durchflusszytometrie erfasst wurden. Eine Vorbehandlung wurde mit den folgenden Antikörpern durchgeführt: Irrelevantes menschlichen IgG1 (solides violettes Histogramm); 4A3 (gelbes Histogramm); 7F12 (Grünes Histogramm); 8A11 (Blaues Histogramm); 8C12 (Rosa Histogramm) und 16F9 (orangenes Histogramm). Tafel A, FITC A43; Tafel B, FITC 7F12; Tafel C, FITC 8A11 und Tafel D, FITC 8C12.
11 zeigt eine vergleichende Bindungsanalyse von menschlichen anti-PSMA Antikörpern gegenüber Konformations-spezifischen anti-PSMA Antikörpern der Maus, wie sie durch Durchflusszytometrie erfasst wurde. Eine Vorbehandlung wurde mit den folgenden Antikörpern ausgeführt: Irrelevantes menschliches IgG1 (solides violettes Histogramm); 4A3 (gelbes Histogramm); 7F12 (grünes Histogramm); 8A11 (blaues Histogramm); 812 (rosa Histogramm) und 16F9 (orangenes Histogramm). Tafel A, FITC 1G9; Tafel B, FITC 3C6 und Tafel C, FITC 4D4.
12, Tafel A ist eine graphische Darstellung, die eine Monozyten vermittelte Antikörper abhängige Zell-Zytotoxizität (ADCC) von PSMA-exprimierenden Zellen über das in 3 gezeigte 14.1 × 8C12 bispezifische Molekül als eine Funktion der Konzentration des bispezifischen Moleküls zeigt. Ergebnisse wurden als Prozentsatz spezifischer Zell-Lyse ohne Zusatz eines Hemmstoffs erfasst; 50 μg/ml freier anti-FcRαR (14.1) F(ab')₂ und 50 μg/ml freier FcγRI (H22) F(ab')₂; Tafel B ist eine graphische Darstellung, die eine Monozyten vermittelte Antikörper abhängige Zell-Zytotoxizität (ADCC) von LNCaP-Zellen über das bispezifische Molekül 14A8 × 8C12 und den monoklonalen Antikörper 8C12 mit einem Effektor:Target-Verhältnis von 100:1; Tafel C ist eine graphische Darstellung, die eine Monozyten vermittelte Antikörper abhängige Zell-Zytotoxizität (ADCC) von LNCaP-Zellen über das bispezifische Molekül in Abwesenheit von Hemmstoff oder in der Gegenwart von überschüssigen Mengen von 14A8 F(ab')₂ oder H22 F(ab')₂, und bei einem Effektor:Target-Verhältnis von 100:1 zeigt.
13. Tafel A ist eine graphische Darstellung, die eine Neutrophilen vermittelte Antikörper abhängige Zell-Zytotoxizität (ADCC) von PSMA-exprimierenden Zellen über das in 3 gezeigte bispezifische Molekül 14.1 × 8C12, als eine Funktion der Konzentration des bispezifischen Moleküls, zeigt. Ergebnisse wurden als Prozent einer spezifischen Zell-Lyse unter Verwendung keines zugegebenen Hemmstoffs erfasst, 25 μg/ml freier anti-FcRαR (14.1) F(ab')₂ und 25 μg/ml freier anti-FcγRI (H22) F(ab')₂; Tafel B ist eine graphische Darstellung, die eine Neutrophilen vermittelte Antikörper abhängigen Zell-Zytotoxizität (ADCC) von LNCaP-Zellen über das bispezifische Molekül 14A8 × 8C12 in der Abwesenheit von Hemmstoff, oder in der Gegenwart überschüssiger Mengen von 14A8 F(ab')₂ oder H22 F(ab')₂ und mit einem Effektor:Target Verhältnis von 200:1 zeigt.
14. Tafel A ist eine graphische Darstellung, die eine Gesamt-Blut vermittelte Antikörper abhängige Zell-Zytotoxizität (ADCC) von PSMA-exprimierenden Zellen über das in 3 gezeigte bispezifische Molekül 14.1 × 8C12 als eine Funktion der Konzentration des bispezifischen Moleküls zeigt. Ergebnisse wurden als Prozent einer spezifischen Zelllyse unter Verwendung keines zugegebenen Hemmstoffs erfasst, 25 μg/ml freier anti-FcRαR/14.1) F(ab')₂ und 25 μg/ml freier anti-FcγRI (H22) F(ab')₂; Tafel B ist eine graphische Darstellung, die eine Gesamt-Blut vermittelte Antikörper abhängige Zell-Zytotoxizität (ADCC) von LNCaP-Zellen über das bispezifische Molekül 14.A8 × 8C12 in der Abwesenheit von Hemmstoff oder in der Gegenwart überschüssiger Mengen von 14A8 F(ab')₂ oder H22 F(ab')₂ zeigt.
15 ist eine graphische Darstellung, die eine bispezifische Molekül (14.1 × 8c12) vermittelte Phagozytose von PSMA-exprimierenden (LNCaP) Zellen durch von Monozyten abgeleiteten Makrophagen (MDM) (Kreise) zeigt. Ergebnisse wurden als Prozent einer Phagozytose sowohl in der Gegenwart als auch der Abwesenheit überschüssigen 14.1 Antikörpers als ein Hemmstoff (Quadrate) und H22 Antikörper als eine Kontrolle (Diamanten) erfasst.
16 ist eine graphische Darstellung, die eine bispezifische Molekül vermittelte Phagozytose und eine Antikörper (8C12) vermittelte Phagozytose von LnCAP Tumorzellen durch von Monozyten abgeleiteten Makrophagen (MDM) zeigt.
17 ist eine graphische Darstellung, die eine bispezifische Molekül (14.1 × 8C12) vermittelte Phagozytose von LnCAP Tumorzellen durch von Monozyten abgeleiteten Makrophagen (MDM) (Kreise) zeigt. Der Einsatz ist eine graphische Darstellung, die eine durch das bispezifische Molekül (1 μg/ml) vermittelte Phagozytose in der Gegenwart von überschüssigem 14A8 F(ab')₂ oder H22 F(ab')₂ zeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt neue, auf Antikörper basierende Therapien zur Behandlung und Diagnose von Erkrankungen bereit, die durch Expression, insbesondere Überexpression von Prostata spezifischem Membran-Antigen (hier als "PSMA" bezeichnet) und/oder verwandten Molekülen ausgezeichnet sind. In erfindungsgemäßen Therapien werden isolierte menschliche monoklonale Antikörper, oder Antigen bindende Bereiche davon verwendet, die an ein auf PSMA vorhandenes Epitop binden. In einer Ausführungsform werden die menschlichen Antikörper in einem nicht-menschlichen transgenen Tier, beispielsweise einer transgenen Maus hergestellt, das mehrere Isotypen menschlicher monoklonaler Antikörper gegen PSMA (beispielsweise IgG, IgA und/oder IgM) durch Ausführen einer V-D-J Rekombination und eines Isotypen-Switching bzw. Klassenwechsels herstellen kann. Demgemäß umfassen verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsformen Antikörper und pharmazeutische Zusammensetzungen davon, als auch nicht-menschliche transgene Tiere, und B-Zellen und Hybridome zur Herstellung derartiger monoklonaler Antikörper. Verfahren einer Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper, um eine PSMA-exprimierende Zelle oder einen verwandten kreuzreagierenden Wachstum-Faktor-Rezeptor zu erfassen oder Wachstum, Differenzierung und/oder Motilität einer PSMA-exprimierenden Zelle in vitro zu hemmen sind ebenfalls durch die Erfindung umfasst.
Um die vorliegende Erfindung leichter verstehen zu können, werden zuerst bestimmte Begriffe definiert. Zusätzlich Definitionen werden durch die ausführliche Beschreibung dargelegt.
Der Begriff "Prostata spezifisches Membran-Antigen", "PSMA" und "PSMA-Antigen" werden hier untereinander austauschbar verwendet, und umfassen Varianten, Isoformen und Spezies-Homologe von menschlichem PSMA. In einer bevorzugten Ausführungsform hemmt die Bindung eines erfindungsgemäßen Antikörpers an das PSMA-Antigen das Wachstum von PSMA-exprimierenden Zellen (beispielsweise einer Tumorzelle). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform vermittelt die Bindung eines erfindungsgemäßen Antikörpers an das PSMA-Antigen eine Effektorzell-Phagozytose und/oder ein Abtöten von PSMA-exprimierenden Zellen.
Der wie hier verwendete Begriff "Antikörper" betrifft ein Glycoprotein, das mindestens zwei schwere (H) Ketten und zwei leichte (L) Ketten durch Disulfidbrücken verbunden umfasst. Jede schwere Kette umfasst eine variable Region der schweren Kette (hier als HCVR abgekürzt) und eine konstante Region der schweren Kette. Der konstante Bereich der schweren Kette umfasst drei Domänen CH1, CH2 und CH3. Jede leichte Kette umfasst eine variable Region der Leichten-Kette (hier als LCVR oder VL angekürzt) und konstante Region der Leichten-Kette. Die konstante Region der Leichten-Kette umfasst eine Domäne CL. Die VH und VL Regionen können weiter in Regionen einer Hypervariabilität unterteilt werden, die als Complementarity Determining Regions/Komplement bestimmender Bereich (CDR) bezeichnet werden, die mit mehr konservierten Regionen durchsetzt sind, die als Gerüstregionen (FR) bezeichnet werden. Jede VH und VL ist aus drei CDRs und vier FRs zusammengesetzt, die vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus in der folgenden Ordnung angeordnet sind: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten weisen eine Bindungs-Domäne auf, die mit einem Antigen wechselwirkt. Die konstanten Regionen der Antikörper können die Bindung des Immunglobulins an Wirtsgewebe oder Faktoren, einschließlich verschiedner Zellen des Immunsystem (beispielsweise Effektorzellen) und dem ersten Komplement (C1q) des klassischen Komplementsystems vermitteln.
Der wie hier verwendete Begriff "Antigenbindungs-Bereich/Stelle" eines Antikörpers (oder einfach "Antikörperbereich" bezieht sich auf ein oder mehrere Fragmente eines Antikörpers, die die Fähigkeit beibehalten an ein Antigen (beispielsweise PSMA) spezifisch zu binden. Es wurde gezeigt, dass die Antigenbindungs-Funktion eines Antikörpers durch Fragmente eines Voll-Längen Antikörpers ausgeführt werden kann. Beispiele von Bindungsfragmenten, die von dem Begriff "Antigenbindungs-Bereich" eines Antikörpers umfasst werden, schließen (i) ein Fab-Fragment ein, ein monovalentes Fragment, das aus den V_L, V_H, C_L und C_H1-Domänen besteht, (ii) ein F(ab')₂ Fragment, ein bivalentes Fragment, das zwei Fab Fragmente umfasst, die an der Hinge-Region (Gelenkbereich) durch eine Disulfidbrücke verbunden sind; (iii) ein Fd-Fragment, das aus den VH und CH1 Domänen besteht; (iv) ein Fv-Fragment, das aus den VL und VH Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht, (v) ein dAb-Fragment (Ward et al., Nature 341 (1989), 544–546), das aus einer V_H-Domäne besteht, und (vi) eine isolierte Complementarity Determining Region (CDR). Weiterhin können, obwohl die zwei Domänen des Fv Fragments, V_L und V_H, durch getrennte Gene kodiert werden, unter Verwendung rekombinanter Verfahren, durch einen synthetischen Linker verbunden werden, der ihnen ermöglicht als eine einzelne Proteinkette hergestellt zu werden, in der sich die V_L und V_H Regionen paaren, um monovalente Moleküle zu bilden (bekannt als Einzel-Kette Fv 8scFv); siehe beispielsweise Bird et al., Science 242 (1988), 423–426; und Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5879–5883). Derartige Einzel-Ketten Antikörper sind ebenfalls vorgesehen von dem Begriff "Antigenbindungs-Bereich" umfasst zu werden. Diese Antikörperfragmente werden unter Verwendung dem Fachmann bekannten herkömmlichen Techniken erhalten, wobei die Fragmente auf die gleiche Weise wie intakte Antikörper auf Nützlichkeit durchmustert werden.
Der Begriff "bispezifisches Molekül" soll ein beliebiges Mittel, beispielsweise ein Protein, ein Peptid, oder einen Protein- oder Peptidkomplex einschließen, das zwei unterschiedliche Bindungsspezifitäten aufweist, die (a) an ein Zelloberflächen-Antigen und (b) an einen Fc-Rezeptor auf der Oberfläche einer Effektorzelle binden oder damit wechselwirken. Der Begriff "mehrfach-spezifisches Molekül" oder "hetero-spezifisches Molekül" soll ein beliebiges Mittel, beispielsweise ein Protein, ein Peptid, oder einen Protein- oder Peptidkomplex einschließen, der mehr als zwei unterschiedliche Bindungsspezifitäten aufweist, die (a) an ein Zelloberflächen-Antigen, (b) an einen Fc-Rezeptor auf der Oberfläche einer Effektorzelle, und (c) mindestens ein andere Komponente binden oder damit wechselwirken. Demgemäß umfasst die Erfindung, ist jedoch nicht auf bispezifische, trispezifische, tetraspezifische oder andere mehrfach-spezifische Moleküle beschränkt, die auf Zelloberflächen-Antigene, wie beispielsweise PSMA, und auf Fc-Rezeptoren auf Effektorzellen gerichtet sind. Der Begriff "bispezifische Antikörper" umfasst weiterhin Diabodies. Diabodies sind bivalente, bispezifische Antikörper, bei denen die VH und VL Domänen an einer einzelnen Polypeptidkette exprimiert sind, wobei jedoch ein Linker verwendet wird, der zu kurz ist, um ein Paaren zwischen den zwei Domänen an der gleichen Kette zu ermöglichen, wodurch die Domänen gezwungen werden sich mit komplementären Domänen anderer Ketten zu paaren und zwei Antigen-Bindungs-Stellen (siehe beispielsweise Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 6444–6448; Poljak, R. J., et al., Structure 2 (1994), 1121–1123).
Der Begriff "Hetero-Antikörper" bezieht sich, wie hier verwendet, auf zwei oder mehrere Antikörper, Antikörper bindende Fragmente (beispielsweise Fab), Derivate davon, oder miteinander verbundene Antigenbindungs-Bereiche, die mindestens zwei unterschiedliche Spezifitäten aufweisen. Diese unterschiedlichen Spezifitäten umfassen eine Bindungsspezifität für einen Fc-Rezeptor auf einer Effektorzelle, und eine Bindungsspezifität für ein Antigen oder Epitop auf einer Zielzelle, beispielsweise einer Tumorzelle. Der Begriff "menschlicher Antikörper" ist, wie hier verwendet, vorgesehen Antikörper zu umfassen, die variable und konstante Regionen aufweisen, die von menschlichen Keimbahnsequenzen von Immunglobulinen abgeleitet sind. Die erfindungsgemäßen menschlichen Antikörper können Aminosäurereste umfassen, die nicht durch menschliche Keimbahnsequenzen der Immunglobuline (beispielsweise durch Zufall oder Orts spezifische Mutagenese in vitro oder durch somatische Mutation in vivo eingeführte Mutationen) kodiert werden. Der wie hier verwendete Begriff "menschlicher Antikörper" ist jedoch nicht dazu vorgesehen Antikörper zu umfassen, in denen von der Keimbahn anderer Säugerspezies, wie beispielsweise einer Maus, abgeleitete CDR Sequenzen auf menschliche Gerüstsequenzen übertragen wurden.
Der wie hier verwendete Begriff "monoklonaler Antikörper" oder "monoklonale Antikörper-Zusammensetzung" bezieht sich auf eine Präparation von Antikörper-Molekülen von individuellen molekularen Zusammensetzung. Eine monoklonale Antikörper-Zusammensetzung zeigt eine einzige Bindungsspezifität und Affinität für ein bestimmtes Epitop. Demgemäß bezieht sich der Begriff "menschlicher monoklonaler Antikörper" auf eine einzige Bindungsspezifität zeigende Antikörper, welche variable und konstante Regionen von menschlichen Keimbahnsequenzen von Immunglobulinen aufweisen. In einer Ausführungsform werden die menschlichen monoklonalen Antikörper durch ein Hybridom hergestellt, das eine B-Zelle umfasst, die von einem transgenen nicht-menschliche Tier, beispielsweise einer transgenen Maus erhalten wurde, die ein Genom aufweist, das ein menschliches Transgen der schweren Kette und ein Transgen der leichten Kette fusioniert an eine immortalisierte Zelle aufweist.
Der, wie hier verwendete Begriff "rekombinanter menschlicher Antikörper" soll alle menschlichen Antikörper umfassen, die durch rekombinante Mittel hergestellt bzw. präpariert, exprimiert, erzeugt oder isoliert werden, wie beispielsweise von einem Tier (beispielsweise einer Maus) isolierte Antikörper, das für menschliche Immunglobulingene (weiter in Abschnitt I nachfolgend beschrieben) transgen ist, Antikörper, die unter Verwendung eines in eine Wirtszelle transfizierten rekombinanten Expressionsvektors exprimiert werden, Antikörper, die von einer rekombinanten, kombinatorischen menschlichen Antikörperbibliothek isoliert werden, oder Antikörper, die durch ein beliebiges anderes Mittel, das Splicing (Spleissen) menschlicher Immunglobulingensequenzen an andere DNA-Sequenzen einschließt, hergestellt, exprimiert, erzeugt oder isoliert werden. Derartige menschliche Antikörper weisen variable und konstante Regionen auf, die von menschlichen Keimbahn Immunglobulinsequenzen abgeleitet sind. In bestimmten Ausführungsform werden jedoch rekombinante menschliche Antikörper einer in vitro Mutagenese (oder, wenn ein für menschliche Ig-Sequenzen transgenes Tier verwendet wird eine in vivo somatische Mutagenese) unterzogen, wobei somit die Aminosäuresequenzen der VH und VL Regionen der rekombinanten Antikörper Sequenzen darstellen, die obwohl von menschlichen Keimbahn VH und VL Sequenzen abgeleitet und dazu/damit ähnlich bzw. verwandt sind, nicht natürlicher Wiese in dem menschlichen Keimbahn Antikörperrepertoire in vivo vorkommen können.
Wie hier verwendet, ist "heterologer Antikörper" in Bezug zu dem transgenen nicht-menschlichen Organismus definiert, der einen derartigen Antikörper herstellt. Dieser Begriff bezieht sich auf einen Antikörper, der eine Aminosäuresequenz oder eine kodierende Nukleinsäure-Sequenz aufweist, die der in einem Organismus aufgefundenen entspricht, welche nicht zu dem transgenen nicht-menschlichen Tier gehört, und im Allgemeinen von einer anderen Spezies als der des transgenen nicht-menschlichen Tiers stammt.
Wie hier verwendet, betrifft ein "heterohybrider Antikörper" einen Antikörper, der eine leichte und eine schwere Kette eines unterschiedlichen Organismusursprungs aufweist. Ein heterohybrider Antikörper ist beispielsweise ein Antikörper, der eine menschliche schwere Kette assoziiert mit einer leichten Kette von Maus aufweist. Beispiele heterohybrider Antikörper umfassen chimäre und humanisierte Antikörper, die vorstehend erwähnt wurden.
Ein wie hier verwendeter "isolierter Antikörper" soll einen Antikörper betreffen, der im Wesentlichen frei von anderen Antikörpern mit unterschiedlichen antigenen Spezifitäten (beispielsweise ein isolierter Antikörper, der PSMA spezifisch bindet, liegt im Wesentlichen frei von Antikörpern vor, die andere Antigene als PSMA spezifisch binden) vorliegt. Ein isolierter Antikörper, der an ein Epitop, eine Isoform oder eine Variante menschlichen PSMA spezifisch bindet, kann jedoch eine Kreuzreaktivität an andere ähnliche Antigene, beispielsweise von anderen Spezies (beispielsweise PSMA Spezieshomologe), aufweisen. Außerdem kann ein isolierter Antikörper im Wesentlichen frei von anderem zellulären Material und/oder Chemikalien vorliegen. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Kombination von "isolierten" monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen Spezifitäten in einer wohl definierten Zusammensetzung kombiniert.
Wie hier verwendet, bezieht sich "spezifische Bindung" auf eine Antikörperbindung an ein bestimmtes Antigen. Gewöhnlich bindet der Antikörper mit einer Affinität von mindestens ungefähr 1 × 10⁷ M^–1, und bindet an das bestimmte Antigen mit einer Affinität, die mindestens doppelt so hoch ist wie dessen Affinität zur Bindung eines nicht spezifischen Antigens (beispielsweise BSA, Casein), das anders ist als das bestimmte Antigen oder ein nahe verwandtes Antigen. Der Ausdruck "ein ein Antigen erkennender Antikörper" und "ein für ein Antigen spezifischer Antikörper" werden hier mit dem Begriff "ein an ein Antigen spezifisch bindender Antikörper" austauschbar verwendet.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "hohe Affinität" einen IgG-Antikörper mit einer Bindungsaffinität von mindestens ungefähr 10⁷ M^–1, vorzugsweise mindestens ungefähr 10⁹ M^–1, noch bevorzugter mindestens ungefähr 10¹⁰ M^–1, 10¹¹ M^–1, 10¹² M^–1 oder größer, beispielsweise bis zu 10¹³ M^–1 oder mehr. Die Bindung mit "hoher Affinität-" kann jedoch für andere Antikörper-Isotypen variieren. Beispielsweise bezieht sich Bindung mit "hoher Affinität" für einen IgM-Isotyp auf eine Bindungsaffinität von mindestens ungefähr 1 × 10⁷ M^–1.
Der wie hier verwendete Begriff "K_assoc" soll sich auf die Dissoziationskonstante einer bestimmten Antikörper-Antigen Wechselwirkung betreffen.
Wie hier verwendet, bezieht sich "Isotyp" auf die Antikörper-Klasse (beispielsweise IgM oder IgG), die durch konstante Region-Gene der schweren Kette kodiert werden.
Wie hier verwendet bezieht sich "Isotypen-Umschaltung" auf das Phänomen durch das die Klasse oder der Isotyp eines Antikörpers von einer Ig-Klasse zu einer der anderen Ig-Klassen verändert wird.
Wie hier verwendet, bezieht sich "nicht gewechselter Isotyp" auf die Isotypen-Klasse einer schweren Kette, die hergestellt wird, wenn kein Isotypen-Umschaltung stattgefunden hat, wobei das den nicht gewechselten Isotyp kodierende CH-Gen gewöhnlich das erste CH-Gen gleich/sofort/umgehend stromabwärts von dem funktionell umgeordneten VDJ-Gen ist. Isotypen-Umschaltung wurde als klassische und nicht-klassische Isotypen-Umschaltung klassifiziert. Klassische Isotypen-Umschaltung erfolgt durch Rekombinationsereignisse, bei denen mindestens eine Umschaltsequenzregion in dem Transgen einbezogen wird. Nicht-klassiche Isotypen-Umschaltung kann beispielsweise durch homologe Rekombination zwischen menschlichem σ_μ und menschlichem Σ_μ (δ-assoziierter Deletion) erfolgen. Alternative nicht-klassische Umschaltmechanismen, wie beispielsweise intertransgene und/oder interchromosomale Rekombination können unter anderen erfolgen und Isotyp-Switching herbeiführen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Umschalt-Sequenz" auf solche DNA-Sequenzen, die für eine Umschalt-Rekombination verantwortlich sind. Eine "Umschalt-Spender"-Sequenz, gewöhnlich eine μ Umschalt-Region, wird sich 5' (d.h. stromaufwärts) der Konstruktbereich befinden, die während der Umschalt-Rekombination entfernt wird. Der "Umschalt-Akzeptor"-Bereich wird sich zwischen dem zu entfernenden Konstruktbereich und der Ersetzung des konstanten Bereichs (d.h. γ, ε, etc.) befinden. Da es keine spezifische Stelle gibt, an der Rekombination immer stattfindet, werden die Endsequenzen des Konstrukts gewöhnlich nicht vorhersagbar sein.
Wie hier verwendet, wird "Glycosylierungsmuster" als ein Muster von Kohlehydrateinheiten definiert, die an ein Protein, insbesondere an ein Immunglobulin-Protein, kovalent angebracht sind. Ein Glycosylierungsmuster eines heterologen Antikörpers kann derart gekennzeichnet werden, dass es im Wesentlichen ähnlich zu Glycosylierungsmustern ist, die natur gemäß an Antikörpern vorkommen, die durch Spezies des nicht-menschlichen transgenen Tiers hergestellt werden, wenn ein Fachmann das Glycosylierungsmuster des heterologen Antikörpers als dem Glycosylierungsmuster in der Spezies des nicht-menschlichen transgenen Tiers ähnlicher erkennen würde als die Spezies von der die CH-Gene des Transgens abgeleitet wurden.
Der wie hier verwendete Begriff "natürlich vorkommend" bezieht sich, da auf einen Gegenstand angewendet, auf die Tatsache, dass ein Gegenstand in der Natur aufgefunden werden kann. Eine in einem Organismus (einschließlich Viren) beispielsweise vorkommende Polypeptid- oder Nukleinsäure-Sequenz, die von einer Quelle in der Natur isoliert werden kann und die durch den Menschen im Labor nicht absichtlich modifiziert wurde ist natürlich vorkommend.
Der wie hier verwendete Begriff "umgeordnet" bezieht sich auf eine Konfiguration eines Immunglobulin-Lokus einer schweren Kette oder einer leichten Kette, worin ein V-Segment unmittelbar angrenzend an ein V-D-J oder J Segment in einer Konformation positioniert vorliegt, die im Wesentlichen eine vollständige VH beziehungsweise VL Domäne kodiert. Ein umgeordneter Immunglobulin-Genlokus kann durch ein Vergleich mit Keimbahn DNA identifiziert werden, wobei ein umgeordneter Lokus mindestens ein rekombiniertes Heptamer/Nonamer Homologieelement aufweisen wird.
Der wie hier in Bezug auf ein V-Segment verwendete Begriff "nicht umgeordnet" oder "Keimbahnkonfiguration" betifft die Konfiguration, in der das V-Segment nicht rekombiniert ist, um so unmittelbar angrenzend an einem D- oder J-Segement vorzuliegen.
Der wie hier verwendete Begriff "Nukleinsäure-Molekül" soll DNA Moleküle und RNA Moleküle umfassen. Ein Nukleinsäure-Molekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, wobei jedoch doppelsträngige DNA bevorzugt wird.
Der wie hier in Bezug auf PSMA bindende Antikörper oder Antikörperbereiche (beispielsweise VH, VL, CDR3) verwendete Begriff "isoliertes Nukleinsäure-Molekül" ist vorgesehen sich auf ein Nukleinsäure-Molekül zu beziehen, bei dem die den Antikörper oder Antikörperbereich kodierenden Nukleotidsequenzen frei von anderen Nukleotidsequenzen sind, die Antikörper oder Antikörperbereiche kodieren, die andere Antigene als PSMA binden, welche anderen Sequenzen natürlicher Weise die Nukleinsäure in menschlicher genomischer DNA flankieren können.
Der Begriff "wesentliche Homologie" für Nukleinsäuren bedeutet, dass zwei Nukleinsäuren, oder ausgewiesene Sequenzen davon, wenn sie optimal ausgerichtet und verglichen werden, mit geeigneten Nukleotid-Insertionen oder Deletionen, in mindestens ungefähr 80% der Nukleotide, gewöhnlich mindestens ungefähr 90% bis 95% und noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% bis 99,5% der Nukleotide identische sind. Alternativ kann wesentliche Homologie vorliegen, wenn die Segmente unter ausgewählten Hybridisierungsbedingungen an das Komplement des Strangs hybridisieren werden.
Die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der durch die Sequenzen geteilten Anzahl identischer Positionen (d.h. % Homologie = # identische Positionen/gesamte # von Positionen × 100), wobei die Anzahl der Lücken und die Länge jeder Lücke berücksichtigt wird, die für eine optimale Ausrichtung der zwei Sequenzen notwendig sind. Der Vergleich von Sequenzen und die Bestimmung einer prozentualen Identität zwischen zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus, wie in den nachfolgenden nicht beschränkenden Beispielen beschrieben wird, erreicht werden.
Die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleotidsequenzen kann unter Verwendung des GAP Programms in der GCG Software Packet (erhältlich bei http://www.gcg.com), wobei eine NWSgapdna.CMP Matrix und eine Lückengewichtung von 40, 50, 60, 70 oder 80 und eine Längengewichtung von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 verwendet werden. Die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen kann unter Verwendung des Algorithmus von E. Meyers und W. Müller (Comput. Appl. Biosci. 4 (1988), 11–17) bestimmt werden, der unter Verwendung einer Gewichtungsreste-Tabelle, einer Lückenlängen-Strafe bzw. Penalty von 12 und einem Lückenpenalty von 4 in das ALIGN Programm (Version 2.0) eingebaut wurde. Zusätzlich kann die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48 (1970), 444–453) Algorithmus bestimmt werden, der unter Verwendung einer Blossum 62 Matrix oder einer PAM250 Matrix, und einer Lückengewichtung von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und einer Längengewichtung von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 in das GAP Programm in der GCG Software Packet eingebaut wurde.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinsequenzen können weiterhin als eine "Such-Sequenz" verwendet werden, um eine Suche gegenüber öffentlichen Datenbanken auszuführen, um beispielsweiseverwandte Sequenzen zu identifizieren. Derartige Suchen können unter Verwendung der NBLAST und XBLAST Programme (Version 2.0) von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403–410 ausgeführt werden. BLAST Nukleotid-Suchen können mit dem NBLAST Programm ausgeführt werden, Score = 100, Wortlänge = 12, um zu erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Molekülen homologe Nukleotidsequenzen zu erhalten. BLAST Protein-Suchen können mit dem XBLAST Programm mit einem Score = 50, Wortlänge = 3 ausgeführt werden, um zu den erfindungsgemäßen Proteinmolekülen homologe Aminosäuresequenzen zu erhalten. Um auf Ausrichtungen bzw. Alignments mit Lücken zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann, wie bei Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17) (1997), 3389–3402, GAPPED BLAST verwendet werden. Werden BLAST und GAPPED BLAST Programme verwendet, dann können Standardparameter der entsprechenden Programme (beispielsweise XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Die Nukleinsäuren können in ganzen Zellen, in einem Zelllysat oder in einer teilweise gereinigten oder im Wesentlichen reinen Form vorliegen. Ein Nukleinsäure liegt "isoliert" oder im Wesentlichen gereinigt" vor, wenn sie von anderen zellulären Bestandteilen oder anderen Verunreinigungen, beispielsweise anderen Nukleinsäuren oder Proteinen, durch Standardmethoden, einschließlich alkalische/SDS Behandlung, CsCl-Banding, Säulen-Chromatographie, Agarosegel-Elektrophorese und andere im Stand der Technik wohl bekannte gereinigt vorliegt. Siehe F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Zusammensetzungen können, obwohl sie häufig in einer nativen Sequenz (ausgenommen für modifizierte Restriktionsstellen und dergleichen) aus entweder cDNA, genomischer oder Gemischen davon können entsprechend Standardmethoden mutiert werden, um Gensequenzen bereitzustellen. Diese Mutationen können, wie erwünscht, bei kodierenden Sequenzen die Aminosäuresequenz beeinflussen. Insbesondere werden DNA Sequenzen, die im Wesentlichen homolog zu nativen V, D, J, konstanten, Umschaltungen und anderen derartigen hier beschriebenen Sequenzen oder davon abgeleitet sind in Betracht gezogen (wobei "abgeleitet" anzeigt, dass eine Sequenz identisch oder von einer anderen Sequenz modifiziert ist).
Eine Nukleinsäure ist "operativ verbunden", wenn sie in einer funktionellen Beziehung mit einer anderen Nukleinsäuresequenz angeordnet vorliegt. Beispielsweise ist ein Promoter oder Enhancer an eine kodierende Sequenz betriebsbereit verbunden, falls sie die Transkription der Sequenz beeinflusst. In Bezug auf regulatorische Sequenzen der Transkription bedeutet betriebsbereit verbunden, dass die verbundenen DNA Sequenzen angrenzend vorliegen und wo erforderlich, um zwei Protein kodierende Bereiche zu verbinden, angrenzend und im Leseraster vorliegen. Bei Umschalt-Sequenzen bedeutet operativ (betriebsbereit) verbunden, dass die Sequenzen eine Umschalt-Rekombination bewirken können.
Der wie hier verwendete Begriff "Vektor" soll sich auf ein Nukleinsäure-Molekül beziehen, das eine andere Nukleinsäure, mit dem es verbunden wurde, transportieren kann. Ein Typ eines Vektors ist ein "plasmid", das sich auf eine kreisförmige doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA Segmente ligiert sein können. Ein anderer Vektortyp ist ein viraler Vektor, worin zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert sein können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingefügt wurde (beispielsweise weisen bakterielle Vektoren einen bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren auf) autonom replizieren. Andere Vektoren (beispielsweise nicht episomale Säugetiervektoren) können auf Einführen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integrieren und werden dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Bestimmte Vektoren können außerdem die Expression von Genen lenken, an die sie betriebsbereit verbunden sind. Derartige Vektoren werden hier als "rekombinante Expressionsvektoren" (oder einfach "Expressionsvektoren") genannt. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die bei DNA-Rekombinationsverfahren von Nutzen sind häufig in der Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Spezifikation kann "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors darstellt. In der Erfindung ist jedoch vorgesehen derartige andere Formen von Expressionsvektoren, wie beispielsweise virale Vektoren (beispielsweise replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und Adeno assoziierte Viren) einzuschließen, die gleichwertige Funktionen dienen.
Der wie hier verwendete Begriff "rekombinante Wirtszelle" (oder einfach "Wirtszelle") soll sich auf eine Zelle beziehen, in die ein rekombinanter Expressionsvektor eingefügt wurde. Es sollte klar sein, dass derartige Begriffe vorgesehen sind sich nicht lediglich auf eine bestimmte gegenständliche bzw. Subjekt Zelle zu beziehen, sondern auf die Nachkommen einer derartigen Zelle. Da aufgrund von entweder Mutationen oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen in aufeinander folgenden Generationen auftreten können, können derartige Nachkommen in der Tat nicht mit der Elternzelle identisch sein, wobei sie jedoch immer noch von dem Umfang des Begriffs "Wirtszelle" umfasst sind.
Es werden verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsformen in den folgenden Unterabschnitten weiter ausführlich beschrieben werden.
I. Herstellung menschlicher Antikörper gegen PSMA
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper (mAbs) können durch verschiedene Verfahren, einschließlich herkömmlicher monoklonaler Antikörper-Methodologie, beispielsweise dem Standard-Verfahren der somatischen Zell-Hybridisierung von Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495, hergestellt werden. Obwohl die Verfahren der somatischen Zell-Hybridisierung bevorzugt werden, können prinzipiell andere Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, beispielsweise eine Virus oder oncogene Transformation von B-Lymphozyten, angewendet werden.
Das bevorzugte Tiermodell zum Herstellen von Hybridomen ist das Maussystem. Die Herstellung eines Hybridom in der Maus stellt ein sehr gut eingeführtes Verfahren dar. Immunisierungsprotokolle und Verfahren zur Isolation von immunisierten Milzzellen zur Fusion sind in Stand der Technik bekannt. Fusionspartner (beispielsweise Myelomzellen der Maus) und Fusionsverfahren sind ebenfalls bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform können gegen PSMA gerichtete menschliche monoklonalen Antikörper unter Verwendung transgener Mäuse, die nun Teile des menschlichen Immunsystems als die das Maussystems tragen, erzeugt werden. Diese transgenen Mäuse, hier als "HuMAb"-Mäuse bezeichnet, beinhalten einen menschlichen Immunglobulin-Gen Minilocus, der nicht umgeordnete Immunglobulin-Sequenzen der menschlichen schweren (μ und γ) und k leichten Kette kodiert, zusammen mit gerichteten Mutationen, die die endogenen μ- und k-Ketten-Loci (Lonberg, N. et al., Nature 368 (1994), 856–859) inaktivieren. Demgemäß zeigen die Mäuse eine verringerte Expression von Maus IgM oder k, wobei als Antwort auf Immunisierung die eingefügten menschlichen Transgene für die schwere und leichte Kette Klassenumschaltung und somatische Mutation ausführen, um menschliche monoklonale IgGk mit hoher Affinität zu erzeugen (Lonberg, N. et al., supra (1994); rezensiert in Lonberg, N. (1994) Handbokk of Experimental Pharmacology 113: 49–101; Lonberg, N. and Huszar, D. Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 (1995), 65–93; und Harding, F. and Lonberg, N- Ann. N.Y. Acad. Sci. 764 (1995), 535–546). Die Zubereitung von HuMAb Mäusen wird beschrieben, nachfolgend ausführlich in Abschnitt II und in Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20 (1992), 6287–6295; Chen, J. et al., International Immunology 5 (1993), 647–656; Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 3720–3724; Choi et al., Nature Genetics 4 (1993), 117–123; Chen, J. et al., EMBO J 12 (1993), 821–830; Tuaillon et al., J. Immunol. 152 (1994), 2912–2920; Lonberg, N. et al., Nature 368 (6474) (1994), 856–859; Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994), 49–101; Taylor, L. International Immunology 6 (1994), 579–591; Lonberg, N. and Huszar, D. Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 (1995), 65–93; Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci. 764 (1995), 536–546; Fishwild, D. et al. Nature Biotechnology 14 (1996), 845–851. Siehe weiter US-P-5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299 und 5,770,429, alle von Lonberg und Kay und GenPharm International; US-P-5,545,807 von Surai et al.; Internationale Veröffentlichungen WO 98/24884, die am 11 Juni 1998 veröffentlich wurde; WO 94/25585, die am 10. November veröffentlicht wurde; WO 93/1227, die am 24. Juni 1993 veröffentlicht wurde; WO 92/22645, die am 23. Dezember 1992 veröffentlicht wurde; WO 92/03918, die am 19. März veröffentlicht wurde. Alternativ kann die in Beispiel 2 beschriebene transgene Maus HCO12 eingesetzt werden, um menschliche anti-PSMA Antikörper zu erzeugen.
Zur Herstellung voll humaner monoklonaler Antikörper gegen PSMA können HuMab-Mäuse mit einer gereinigten oder angereicherten Zubereitung an PSMA-Antigen und/oder PSMA-exprimierende Zellen immunisiert werden, wie in Lonberg N. et al., Nature 368(6474) (1994), 856–859; Fishwild D. et al., Nature Biotechnology 14 (1996), 845–851 und WO 98/24884 beschrieben. Die Mäuse sind bei der Infusion vorzugsweise 6–16 Wochen alt. So kann beispielsweise eine gereinigte oder angereicherte Zubereitung an PSMA-Antigen (5–20 μg) (beispielsweise gereinigt aus PSMA-exprimierenden LNCaP-Zellen) zur Immunisierung der HuMab-Mäuse intraperitoneal eingesetzt werden. Falls die Immunisierungen unter Verwendung einer gereinigten oder angereicherten Zubereitung an PSMA-Antigen nicht Antikörper ergibt, können die Mäuse auch mit PSMA-exprimierenden Zellen, beispielsweise einer Tumorzelllinie, immunisiert werden, um Immunantworten zu fördern.
Eine gesteigerte Erfahrung mit unterschiedlichen Antigenen zeigte, dass die transgenen HuMab-Mäuse am besten dann antworten, wenn sie anfänglich intraperitoneal (IP) mit Antigen in vollständiges Freund's Adjuvans immunisiert wurden, gefolgt von wöchentlichen IP-Immunisierungen (bis zu insgesamt 6) mit Antigen in unvollständigem Freund's Adjuvans. Die Immunantworten können im Verlauf des Immunisierungs-Protokolls mit Plasma-Proben, die durch retroorbitale Blutungen erhalten wurden, überwacht werden. Das Plasma kann mittels ELISA (wie nachstehend beschrieben) durchgemustert werden, und Mäuse mit ausreichendem Titer an humanem anti-PSMA-Immunglobulin können zur Fusion eingesetzt werden. Die Mäuse können mit Antigen 3 Tage vor deren Opferung und Entfernung der Milz intravenös geboostet werden. Es wird davon ausgegangen, dass für jedes Antigen 2–3 Fusionen erforderlich sein können. Mehrere Mäuse werden mit jedem Antigen immunisiert. So können beispielsweise insgesamt 12 HuMab der Stämme HC07 und HC012 immunisiert werden.
Generierung von Hybridoma, welche humane monoklonale Antikörper gegen PSMA produzieren
Die Maus-Milzzellen können isoliert und mittels PEG mit Maus-Myelomzelllinien gemäß Standard-Protokollen (8, 13) fusioniert werden. Die so erhaltenen Hybridoma werden dann zur Herstellung von Antigen spezifischen Antikörpern durchmustert. So werden beispielsweise Einzelzell-Suspensionen von Milz-Lymphozyten aus immunisierten Mäusen mit 1/6 der Anzahl an P3X63-Ag8.653 nicht sezernierenden Maus-Myelomzellen (ATCC, CRL 1580) mit 50% PEG fusioniert. Die Zellen werden bei 2 × 10⁵ in Flachboden-Mikrotiterplatten ausgebracht, gefolgt von einer zweiwöchigen Inkubation in Selektionsmedium mit 20% fötalem Klonserum, 18% "653" Konditionierungsmedium, 5% Origen (IGEN), 4 mM L-Glutamin, 1 mM L~Glutamine, 1 mM Natriumpyruvat, 5 mM Hepes, 0,055 mM 2-Mercaptoethanol, 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 mg/ml Streptomycin, 50 mg/ml Gentamycin und 1 × HAT (Sigma; das HAT wird 24 Stunden nach der Fusion zugesetzt). Nach 2 Wochen werden die Zellen in Medium gezüchtet, in dem das HAT durch HAT ersetzt wurde. Einzelne Vertiefungen werden dann mittels ELISA auf monoklonale humane anti-PSMA IgM und IgG-Antikörper durchmustert. Sobald substantielles Wachstum der Hybridoma erfolgt, wird das Medium gewöhnlich nach 10–14 Tagen überprüft. Die Antikörper sezernierenden Hybridoma werden erneut ausgebracht, erneut durchmustert, und, wenn für humanes IgG noch positiv, können monoklonale anti-PSMA-Antikörper durch limitierende Verdünnung mindestens zweimal subkloniert werden. Die stabilen Subklone werden dann in vitro gezüchtet, um kleine Antikörper-Mengen in Gewebe-Kulturmedium zur Charakterisierung zu erzeugen.
Charakterisierung der Bindung von monoklonalem humanen Antikörpern an PSMA
Um Bindung der erfindungsgemäßen monoklonalen humanen PSMA-Antikörper zu charakterisieren, können Seren von immunisierten Mäusen, beispielsweise mittels ELISA, untersucht werden. In Kürze, Mikrotiterplatten werden mit gereinigtem PSMA bei 0,25 μg/ml in PBS beschichtet, und dann mit 5% Kälber-Serumalbumin in PBS blockiert. Plasma-Verdünnungen von PSMA-immunisierten Mäusen werden in jede Vertiefung gegeben und für 1–2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten werden mit PBS/Tween gewaschen und dann mit einem humanen Ziegen-anti-Mensch IgG Fc-spezifischen, polyklonalen Reagenz, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen werden die Platten mit pNPP-Substrat (1 mg/ml) entwickelt, und dann bei einem OD von 405–650 analysiert. Vorzugsweise werden Mäuse, die die höchsten Titer entwickeln, für Fusionen eingesetzt.
Ein ELISA-Assay, wie vorstehend beschrieben, kann ebenfalls dazu verwendet werden, nach Hybridomas zu suchen, die eine positive Reaktivität mit PSMA-Immunogen zeigen. Hybridoma, welche stark an PSMA binden, werden subkloniert und weiter charakterisiert. Ein Klon aus jedem Hybridom, welcher die Reaktivität der Elternzellen (mittels ELISA) beibehält, kann zur Herstellung einer Zell-Bank mit 5–10 Gefäßen, die bei –140°C gelagert werden, und zur Antikörper-Aufreinigung eingesetzt werden.
Zur Aufreinigung von humanen anti-PSMA-Antikörpern können bestimmte Hybridome in 2 L Schüttel-Behälter zur Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern gezüchtet werden. Überstände können vor Affinitätschromatographie mit Protein A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) filtriert und konzentriert werden. Eluiertes IgG kann mittels Gelelektropherese und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zur Sicherstellung der Reinheit überprüft werden. Die Pufferlösung kann in PBS getauscht werden, und die Konzentration kann bei einem OD₂₈₀ bei einem Extinktionskoeffizienten von 1,43 bestimmt werden. Die monoklonalen Antikörper können aliquotiert und bei –80°C gelagert werden.
Zur Bestimmung, ob bestimmte humane monoklonale anti-PSMA Antikörper an spezifische Epitope binden, kann jeder Antikörper unter Verwendung im Handel erhältlicher Reagenzien biotinyliert werden (Pierce, Rockford, IL). Vergleichsstudien unter Verwendung nicht-markierter monoklonaler Antikörper und biotinylierter monoklonaler Antikörper kön nen unter Verwendung von mit PSMA beschichteten ELISA-Platten wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden. Bindung von biotinyliertem mAb kann mit einer Streptavidin-akalische Phosphatase Sonde erfasst werden.
Um den Isotyp der gereinigten Antikörper zu bestimmen, können Isotyp-ELISAs durchgeführt werden. Vertiefungen von Mikrotiterplatten können mit 10 μg/ml an anti-Mensch Ig über Nacht bei 4°C beschichtet werden. Nach Blocken mit 5% BSA werden die Platten mit 10 μg/ml monoklonalem Antikörper oder gereinigten Isotypen-Kontrollen bei Umgebungstemperatur für 2 Stunden umgesetzt. Die Vertiefungen können dann mit IgG1 oder humanem IgM-spezifischen, mit alkalischer Phosphatase konjugierten Sonden umgesetzt werden. Die Platten werden wie vorstehend beschrieben entwickelt und beschrieben.
Um eine Bindung der monoklonalen Antikörper bei lebenden, PSMA-exprimierenden Zellen zu zeigen, kann Strömungszytometrie eingesetzt werden. In Kürze, PSMA-exprimierende Zelllinien (bei Standardwachstumsbedingungen gezüchtet) werden mit unterschiedlichen Konzentrationen an monoklonalen Antikörper in PBS, welches 0.1% Tween 80 und 20% Mausserum enthält, gemischt und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Nach Waschen werden die Zellen mit mit Fluorescein markiertem anti-Mensch IgG-Antikörper bei den gleichen Bedingungen wie das primäre Antikörper-Färben umgesetzt. Die Proben können mittels FACSscan-Instrumenten analysiert werden, wobei Licht- und Seiten-Streuungseigenschaften verwendet werden, um auf einzelne Zellen abzustellen. Ein alternativer Assay unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie kann zusätzlich (zusätzlich oder anstelle) des Strömungszytometrie-Assay verwendet werden. Zellen können genau wie vorstehend beschrieben gefärbt und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden. Dieses Verfahren ermöglicht eine Sichtbarmachung einzelner Zellen, kann jedoch je nach der Sensitivität des Antigens eine verringerte Sensitivität aufweisen.
Humane anti-PSMA IgGs können weiter mittels Western-Blotting auf Reaktivität mit PSMA-Antigen untersucht werden. In Kürze, Zellextrakte von PSMA-exprimierenden Zellen können hergestellt und einer Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen werden. Nach Elektrophorese werden die getrennten Antigene auf Nitrocellulosemembrane überführt, mit 20% Mausserum blockiert, und mit den zu untersuchenden monoklonalen Antikörpern untersucht. Eine Bindung von humanem IgG kann unter Verwendung von anti-Mensch IgG alkalischer Phosphatase erfasst und mit BCIP/NBT-Substrat tabletten (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) entwickelt werden.
Phagozytische- und Zellabtötungs-Aktivitäten von humanen monoklonalen Antikörper gegen PSMA
Zusätzlich zur spezifischen Bindung an PSMA können humane monoklonale anti-PSMA-Antikörper können auf deren Fähigkeit Phagozytose und Abtötung von PSMA-exprimierende Zellen zu vermitteln untersucht werden. Die Untersuchung von monoklonaler Antikörper-Aktivität in vitro wird eine anfängliche Durchmusterung vor dem Testen in in vivo-Modellen liefern. In Kürze, polymorphkernige Zellen (PMN) oder andere Effektorzellen aus gesunden Donoren, können mit Ficoll-Hypaque-Dichtezentrifugation, gefolgt von Lyse kontaminierender Erythrozyten gereinigt werden. Gewaschene PMNs können in RPMI, das mit 10% Hitze-deaktiviertem fötalem Kälberserum ergänzt wurde, suspendiert und mit ⁵¹Cr-markierten, PSMA-exprimierenden Zellen bei unterschiedlichen Verhältnissen von Effektorzellen zu Tumorzellen (Effektorzellen:Tumorzellen) vermischt. Gereinigte humane anti-PSMA IgGs können dann in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt werden. Irrelevantes humanes IgG kann als Negativkontrolle verwendet werden. Assays können für 0–120 Minuten bei 37°C durchgeführt werden. Proben können zur Zytolyse durch Erfassen der ⁵¹Cr-Freisetzung in den Kultur-Überstand untersucht werden. Monoklonale anti-PSMA können in Kombinationen miteinander untersucht werden, um zu bestimmen, ob die Zytolyse mit mehreren monoklonalen Antikörpern gesteigert wird.
Humane monoklonalen Antikörper, welche an PSMA binden, können auch in einem in vivo Modell (beispielsweise in Mäusen)untersucht werden, um deren Wirksamkeit bei der Vermittlung der Phagozytose und Abtöten von PSMA-exprimierenden Zellen, beispielsweise Tumorzellen, zu bestimmen. Diese Antikörper können ausgewählt werden, beispielsweise basierend auf den folgenden Kriterien, die nicht exklusiv sein sollen:

1. Binden an PSMA-exprimierenden lebende Zellen;
2. Binden mit hoher Affinität an PSMA;
3. Binden an ein spezifisches Epitop auf PSMA (um die Möglichkeit zu eliminieren, dass monoklonale Antikörper mit komplementären Aktivitäten bei gemeinsamer Verwendung bei der Bindung an das gleiche Epitop konkurrieren);
4. Opsonierung der PSMA-exprimierenenden Zellen;
5. Vermittlung der Wachstumsinhibierung, Phagozytose und/oder dem Abtöten von PSMA-exprimierenden Zellen in Anwesenheit von humanen Effektorzellen.

Bevorzugte erfindungsgemäße humane monoklonale Antikörper erfüllen ein oder mehrere und vorzugsweise alle dieser Kriterien. In einer bestimmten Ausführungsform werden die humanen monoklonalen Antikörper in Kombination verwendet, beispielsweise als eine pharmazeutische Zusammensetzung mit zwei oder mehreren monoklonalen anti-PSMA Antikörpern oder Fragmenten davon. So können beispielsweise humane anti-PSMA Antikörper mit unterschiedlichen, jedoch komplementären Aktivitäten in einer einzigen Therapie kombiniert werden, um einen gewünschten therapeutischen oder diagnostischen Effekt zu erzielen. Eine Darstellung wäre eine Zusammensetzung mit einem humanen monoklonalen anti-PSMA Antikörper, welche hoch effektiv ein Abtöten von Zielzellen in Anwesenheit von Effektorzellen vermitteln, kombiniert mit einem anderen humanen monoklonalen anti-PSMA Antikörper, welcher das Wachstum von PSMA-exprimierenden Zellen inhibieren.
II. Herstellung von transgenen, nicht-menschlichen Tieren, welche humane monoklonale anti-PSMA Antikörper erzeugen
In noch einer anderen Ausführungsform liefert die Erfindung transgene nicht-menschliche Tiere, beispielsweise eine transgene Maus, die humane monoklonale Antikörper exprimieren kann, di spezifisch an PSMA binden, vorzugsweise mit hoher Affinität. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die transgenen nicht-menschlichen Tiere, beispielsweise die transgenen Mäuse (HuMab-Mäuse) ein Genom auf, das ein Transgen der humanen schweren Kette und ein Transgen der leichten Kette umfasst. In einer Ausführungsform wurden die transgenen nicht-menschlichen Tiere, beispielsweise die transgenen Mäuse, mit einer gereinigten oder angereicherten Zubereitung an PSMA-Antigen und/oder PSMA-exprimierenden Zellen immunisiert. Die transgenen, nicht-menschlichen Tiere, beispielsweise die transgenen Mäuse, können mehrere Isotypen von humanen monoklonalen Antikörpern gegen PSMA (beispielsweise IgG, IgA und/oder IgE) durch erzeugen, indem ein V-D-J-Rekombination und Isotypen-Umschaltung abläuft. Eine Isotypen-Umschaltung kann durch beispielsweise klassische oder nicht-klassische Isotypen-Umschaltung erfolgen.
Die Erstellung eines transgenen, nicht-menschlichen Tiers, das auf Stimulierung mit fremden Antigen mit einem heterologen Antikörper-Repertoire reagiert, erfordert, dass die heterologen Immunglobulin-Transgene in dem transgenen Tier über den Weg der B-Zell-Entwicklung korrekt funktionieren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein korrektes Funktionieren eines heterologen Transgens der schweren Kette Isotypen-Umschaltung. Die erfindungsgemäßen Transgene sind daher so aufgebaut, dass sie eine Isotypen-Umschaltung erzeugen und ein oder mehrere der folgenden: (1) Expression in hohem Maße und Zell-spezifisch, (2) funktionale Gen-Umlagerung, (3) Aktivierung von und Antwort auf allelische Exclusion; (4) Expression eines ausreichenden primären Repertoires, (5) Signaltransduction, (6) somatische Hypermutation, und (7) Dominierung des transgenen Antikörper-Lokus während der Immunantwort.
Nicht alle der vorstehenden Kriterien müssen erfüllt werden. So braucht beispielsweise in den Ausführungsformen, in denen die endogenen Immunglobulin-Loci des transgenen Tiers funktionell unterbrochen sind, das Transgen allelische Exclusion nicht aktivieren. Weiter ist in den Ausführungsformen, bei denen das Transgen ein funktionell umgelagertes Immunglobulin-Gen für die schwere und/oder die leichte Kette umfasst, das zweite Kriterium der funktionellen Gen-Umlagerung unnötig, mindestens für das Transgen, das bereits umgelagert ist. Als Hintergrundinformation für molekulare Immunologie, siehe Fundamental Immunology, 2. Ausgabe (1989), Paul William E., Hrsg. Raven Press, N.Y..
In bestimmten Ausführungsformen enthalten die transgenen nicht-menschlichen Tiere, die zur Erzeugung der erfindungsgemäßen, humanen monoklonalen Antikörper verwendet wurden, umgelagerte und nicht-umgelagerte heterologe Immunglobulin-Transgene für die schwere und leichte Kette in der Keimbahnlinie des transgenen Tiers. Jedes der Transgene für die schwere Kette umfasst mindestens ein C_H-Gen. Darüber hinaus kann das Transgen für die schwere Kette funktionelle Isotypen-Umschalt-Sequenzen enthalten, die eine Isotypen-Umschaltung eines heterologen Transgens, das mehrere C_H-Gene in den B-Zellen des transgenen Tiers kodiert, fördern können. Derartige Umschalt-Sequenzen können jene sein, die in dem Immunglobulin-Lokus der Keimbahn der Spezies, welcher als Quelle der transgenen C_H-Gene dienen, natürlich vorkommen, oder derartige Umschaltungs-Sequenzen, die von jenen abgeleitet sind, die in der Spezies vorkommen, das das transgene Konstrukt aufnehmen soll (das transgene Tier). So kann beispielsweise ein humanes transgenes Konstrukt, das zur Herstellung einer transgenen Maus eingesetzt wird, eine Isotypen-Umschaltung mit höherer Frequenz erzeugen, wenn es Umschaltungs-Sequenzen vergleichbar zu jenen aufweist, die in dem Lokus der schwere Kette der Maus natürlich vorkommen, da die Umschaltungs-Sequenzen der Maus wahrscheinlich dahingehend optimiert sind, mit dem Maus-Umschaltungs-Re kombinase-Enzymsystem zu funktionieren, während die humanen Umschaltungs-Sequenzen dies nicht sind. Umschaltungs-Sequenzen können isoliert und mittels herkömmlicher Klonierungsmethoden kloniert werden, oder können de novo aus überlappenden synthetischen Oligonukleotiden synthetisiert werden, die auf der Grundlage veröffentlichter Sequenzinformation die Immunglobulin-Umschaltungsbereich-Sequenzen betreffend erstellt wurden (Mills et al., Nucl. Acids Res. 15 (1991), 7305–7316; Sideras et al., Intl. Immunol. 1 (1989), 631–642).
Für jedes der vorstehenden transgenen Tiere werden funktionell umgelagerte heterologe Immunglobulin-Transgene der schweren und leichten Kette in einem erheblichen Teil der B-Zellen des transgenen Tiers gefunden (mindestens 10%).
Die zur Erzeugung des erfindungsgemäßen transgenen Tiers verwendeten Transgene umfassen ein Transgen der schwere Kette mit einer DNA, welche mindestens ein variables Gensegment, ein Diversitäts-Gensegment, ein Verbindungs-Gensegment und mindestens ein Gensegment für den konstanten Bereich kodiert. Das Immunglobulin-Transgen für die leichte Kette umfasst DNA, welche mindestens ein variables Gensegment, ein Verbindungs-Gensegment und mindestens ein Gensegment für den konstanten Bereich enthält. Die Gensegmente, die die Gensegmente für die schwere Kette und leichte Kette kodieren sind für das transgene, nicht-menschlich Tier heterolog, da sie abgeleitet sind von, oder einer DNA entsprechen, die Immunglobulin-Gensegmente für die schwere und leichte Kette von einer Spezies kodieren, die nicht aus dem transgenen, nicht-menschlichen Tier bestehen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Transgen aufgebaut, so dass die einzelnen Gensegmente nicht-umgelagert sind, d.h. nicht umgelagert, so dass es eine funktionelle leichte oder schwere Kette eines Immunglobulin kodieren. Derartige nicht-umgelagerte Transgene fördern die Rekombination der V, D, und J-Gensegmente (funktionelle Umlagerung) und fördern vorzugsweise eine Inkorporierung von allen oder einem Teil der Gensegmente des D-Bereichs in der so erhaltenen, umgelagerten schwere Kette des Immunglobulins in dem transgenen, nicht-menschlichen Tier, wenn es einem PSMA-Antigen ausgesetzt wird.
In einer alternativen Ausführungsform umfassen die Transgene einen nicht-umgelagerten "Mini-Lokus". Derartige Transgene umfasst gewöhnlich einen erheblichen Teil der C-, D-, und J-Segmente, sowie einen Untersatz an V-Gensegmenten. In derartigen transgenen Konstrukten umfassen die regulatorischen Sequenzen, beispielsweise Promotoren, Enhancer, Klassen-Umschaltungsbereiche, Spleißdonor- und Spleißakzeptor-Sequenzenen für das Prozessieren von RNA, Rekombinationssignale und dergleichen, entsprechende Sequenzen, die von der heterologen Dann abgeleitet sind. Derartige regulatorische Sequenzen können in das Transgen von der gleichen oder einer verwandten Spezies des in der Erfindung verwendeten nicht-menschlichen eingebracht werden. So können beispielsweise humane Immunglobulin-Gensegmente mit einer Immunglobulin-Enhancer-Sequenzen eines Nagers in einem Transgen zur Verwendung in einer transgenen Maus kombiniert werden. Alternativ können synthetische regulatorische Sequenzen in das Transgen inkorporiert werden, wobei derartige regulatorische Sequenzen zu einer funktionellen DNA-Sequenz, die in den Genomen von Säugern natürlich vorkommen, nicht homolog sind. Synthetische regulatorische Sequenzen sind gemäß den Konsensus-Regeln ausgestaltet, wie beispielsweise jene, die die erlaubten Sequenzen einer Spleiß-Akzeptor-Stelle oder ein Promotor-/Enhancer-Motiv darstellen. So umfasst beispielsweise ein Mini-Lokus einen Bereich des genomischen Immunglobulin-Lokus mit mindestens einer internen (d.h. nicht am Ende des Bereichs) Deletion eines unwesentlichen DNA-Bereichs (beispielsweise dazwischenliegende Sequenzen, Intron oder Teil davon) im Vergleich zu dem natürlichen vorkommenden Ig-Locus der Keimbahn.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das zur Erzeugung humaner Antikörper gegen PSMA verwendete transgene Tier mindestens ein, gewöhnlich 2–10 und manchmal 20–50 oder mehr Kopien des in Beispiel 12 der WO 98/24884 beschriebenen Transgens (beispielsweise pHC1 oder pHC2), welches mit einem Tier gekreuzt wird, das eine einzige Kopie eines Transgens einer leichte Kette, wie in den Beispielen 5, 6, 8 oder 14 der WO 98/24884 beschrieben, enthält, wobei die Nachkommen mit dem Tiere gekreuzt werden, denen das J_H fehlt, wie in Beispiel 10 der WO 98/24884 beschrieben ist. Die Tiere werden zur Homozygose für diese drei Eigenschaften gekreuzt. Derartige Tiere weisen den folgenden Genotyp auf: Eine einzige Kopie (pro haploidem Chromosomensatz) eines humanen Mini-Lokus mit nicht-umgelagerter schweren Kette (in Beispiel 12 der WO 98/24884 beschrieben), eine einzige Kopie (pro haploidem Chromosomensatz) eines Konstrukts einer umgelagerten humanen leichten κ-Kette (in Beispiel 14 der WO 98/24884 beschrieben), und eine Deletion in jedem endogenen Maus-Lokus der schweren Kette, die alle funktionellen J_H-Segmente entfernt (in Beispiel 10 der WO 98/24884 beschrieben). Derartige Tiere werden mit Mäusen gekreuzt, die für die Deletion der J_H-Segmente homozygot sind (Beispiel 10 der WO 98/24884), um Nachkommen zu erhalten, die für die J_H-Deletion homozygot und für die Konstrukte für die schwere und leichte Kette hemizygot sind. Den so erhaltenen Tieren werden Antigene injiziert und zur Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern gegen diese Antigene verwendet.
Von einem derartigen Tier isolierte B-Zellen sind hinsichtlich der humanen schweren und leichten Kette monospezifisch, da sie nur eine einzige Kopie eines jeden Gens enthalten. Darüber hinaus werden sie hinsichtlich humaner oder Maus schwerer Ketten monospezifisch sein, da, aufgrund der Deletion, die den J_H-Bereich überspannt, eingebracht wie in Beispiel 9 und 12 der WO 98/24884 beschrieben, beide Kopien des endogenen Maus-Gens der schweren Kette nicht funktionell sind. Weiter wird ein erheblicher Teil der B-Zellen hinsichtlich der humanen oder Maus leichten Ketten aufgrund der Expression einer einzigen Kopie der umgelagerten humanen leichten κ-Kette allelisch oder isotypisch die Umlagerung der endogenen Gene der Maus-κ und -λ-Kette in einem erheblichen Teil der B-Zellen verhindern.
Die transgene Maus der bevorzugten Ausführungsform zeigt eine Immunglobulin-Produktion mit einem erheblichen Repertoire, welches idealerweise im Wesentlichen ähnlich ist zu der einer nativen Maus. So werden beispielsweise in Ausführungsformen, bei denen endogene Ig-Gene inaktiviert wurden, die Gesamt-Immunglobulin-Mengen daher von etwa 0,1 bis 10 mg/ml Serum, vorzugsweise 0,5 bis 5 mg/ml, idealerweise mindestens etwa 1,0 mg/ml. Wurde ein Transgen, welches eine Umlagerung von IgG zu IgM bewirken kann, in die transgene Maus eingebracht wurde, dann ist das Verhältnis von Serum igG zu IgM in der erwachsenen Maus vorzugsweise etwa 10:1. Das Verhältnis IgG zu IgM wird in der nicht-reifen Maus viel tiefer liegen. Im allgemeinen exprimieren mehr als etwa 10%, vorzugsweise 40 bis 80% der Milz- und Lymphknoten-B-Zellen ausschließlich humanes IgG-Protein.
Das Repertoire wird idealerweise das sein, das in der nicht-transgenen Maus auftritt, gewöhnlich mindestens etwa 10% so hoch, vorzugsweise 25 bis 50% oder mehr. Im allgemeinen werden mindestens etwa 1000 unterschiedliche Immunglobuline (vorzugsweise IgG), vorzugsweise 10⁴ bis 10⁶ oder mehr, hergestellt, abhängig vor allem von der Anzahl der unterschiedlichen V, J und D-Bereiche, die in das Maus-Genom eingebracht wurde. Diese Immunglobuline werden gewöhnlich etwa ½ oder mehr der hoch antigenen Proteine, beispielsweise Staphylococcus Protein A, erkennen. Die Immunglobuline zeigen gewöhnlich eine Affinität für bestimmte Antigene von mindestens 10⁷ M^–1, vorzugsweise mindestens etwa 10⁷ M^–1, mehr bevorzugt mindestens etwa 10⁷ M^–1, 10⁷ M^–1, 10⁷ M^–1 oder größer, beispielsweise bis zu 10⁷ M^–1 oder mehr.
In einigen Ausführungsformen kann es bevorzugt sein, Mäuse mit bestimmten Repertoires zu erzeugen, um die Auswahl an V-Genen zu begrenzen, die in der Antikörper-Antwort auf einen bestimmten Antigen-Typ dargestellt sind. Ein Transgen der schweren Kette mit einem bestimmten Repertoire kann beispielsweise humane V_H-Gene umfassen, die vorzugsweise bei Antikörper-Antworten auf bestimmte Antigen-Typen in Menschen eingesetzt werden. Alternativ können einige V_H-Gene von einem bestimmten Repertoire aus verschiedenen Gründen ausgeschlossen werden (sie weisen beispielsweise eine geringe Wahrscheinlichkeit auf, Hochaffinitäts-V-Bereiche für ein bestimmtes Antigen zu kodieren, weisen eine geringe Wahrscheinlichkeit auf, somatische Mutation und Affinitäts-Verbesserung zu durchlaufen, oder sind immunogen gegenüber einigen Menschen). Vor der Umlagerung eines Transgens mit verschiedenen Gensegmenten für die schwere oder leichte Kette, können derartige Gensegmente daher leicht, beispielsweise durch Hybridisierung oder DNA-Sequenzierung, als von einer Spezies eines Organismuses abgeleitet identifiziert werden, die nicht das transgene Tier ist.
Die erfindungsgemäße transgene Maus kann mit einer gereinigten oder angereicherten Zubereitung des PSMA-Antigens und/oder PSMA-exprimierenden Zellen, wie vorstehend beschrieben, immunisiert werden. Die Maus wird B-Zellen herstellen, in denen über eine innerhalb des Transgens ablaufende Umschaltungs-Rekombination (Cis-Umschaltung) eine Umschaltung der Klassen abläuft, und in denen Immunglobuline exprimiert werden, welche mit PSMA reaktiv sind. Die Immunglobuline können Antikörper mit humaner Sequenz sein, worin die Polypeptide der schweren und leichten Kette durch humane Transgen-Sequenzen kodiert werden, welche Sequenzen umfassen können, die von somatischer Mutation und rekombinanten Verbindungen mit einem V-Bereich, sowie Keimbahn-kodierten Sequenzen abgeleitet sind. Diese Immunglobuline mit humaner Sequenz können dahingehend beschrieben werden, dass sie im Wesentlichen identisch sind zu einer Polypeptid-Sequenz, die von einem menschlichen V_L-V_H-Gensegment und einem menschlichen J_L-J_L-Segment kodiert wird, obwohl andere, nicht-Keimbahn-Sequenzen als Ergebnis somatischer Mutation und differenzieller V-J- und V-D-J Rekombinationsverbindungen vorhanden sein können. Im Hinblick auf derartige Antikörper mit humaner Sequenz sind die variablen Regionen jeder Kette gewöhnlich zu mindestens 80% von humanen V, J der Keimbahn kodiert, und im Fall von schweren Ketten von D-Gensequenzen. Häufig werden mindestens 80% der variablen Regionen von humanen Keimbahn-Sequenzen kodiert, welche auf dem Transgen vorhanden sind. Häufig werden 90 oder 95% oder mehr der Sequenzen der variablen Region von humanen Keimbahn-Sequenzen kodiert, welche sich auf dem Transgen befinden. Da jedoch nicht-Keimbahn-Sequenzen durch somatische Mutation und VJ- und VDJ-Verbindungen eingeführt wurden, werden die Antikörper mit humaner Sequenz häufig einige Sequenzen der variablen Region (und weniger häufig Sequenzen der konstanten Region) aufweisen, welche nicht von humanen V-, D-, J-Gensegmenten kodiert werden, wie in dem/den human(en) Transgen(en) in der Keimbahn der Maus gefunden wird. Gewöhnlich werden sich derartige nicht-Keimbahn-Sequenzen (oder einzelne Nukleotidpositionen) in oder nahe CDRs anhäufen, oder in Bereichen, in denen sich somatische Mutationen bekanntermaßen häufen.
Die Antikörper mit humaner Sequenz, welche an das bestimmte Antigen binden, können von einer bestimmten Isotypen-Umschaltung herrühren, so dass humane Antikörper hergestellt werden, welche eine γ-Kette einer humanen Sequenz (wie γ1, γ2, γ2b oder γ3) und einen leichte Kette (wie κ umfassen). Derartige Isotypen-umgeschaltete Antikörper humaner Sequenz enthalten häufig ein oder mehrere somatische Mutationen, gewöhnlich in dem variablen Bereich und häufig in oder innerhalb etwa 10 Reste eines CDR, was ein Ergebnis der Affinitäts-Reifung und Selektion von B-Zellen durch Antigen ist, insbesondere nach einer zweiten (oder nachfolgenden) Antigen-Anregung. Diese Hochaffinitäts-Antikörper humaner Sequenz können Bindungsaffinitäten von mindestens 1 × 10⁹ M^–1, gewöhnlich mindestens 5 × 10⁹ M^–1, häufig mehr als 1 × 10¹⁰ M^–1, und manchmal 5 × 10¹⁰ M^–1 und manchmal 1 × 10¹¹ M^–1 oder mehr aufweisen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die B-Zellen derartiger Mäuse, welche zur Herstellung von Hybridoma eingesetzt werden können, welche humane monoklonale Antikörper exprimieren, die mit hoher Affinität (beispielsweise mehr als 2 × 10⁹ M^–1) an PSMA binden. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden dieses Hybridomas dazu verwendet, eine Zusammensetzung herzustellen, welche ein Immunglobulin mit einer Affinitäts-Konstante (Ka) von mindestens 2 × 10⁹ M^–1 zur Bindung an PSMA umfasst, worin das Immunglobulin umfasst:
eine leichte Kette humaner Sequenz, welche zusammengesetzt ist aus, (1) einer variablen Region einer leichten Kette mit einer Polypeptid-Sequenz, welche im Wesentlichen identisch ist zu der Polypeptid-Sequenz, welche durch ein humanes V_L-Gensegment und ein humanes J_L-Segment kodiert wird, und (2) eine konstante Region einer leichten Kette mit einer Polypeptid-Sequenz, welche im Wesentlichen identisch ist zu der Polypeptid-Sequenz, welche durch ein humanes C_L-Gensegment kodiert wird, und
einer schweren Kette humaner Sequenz, welche zusammengesetzt ist aus, (1) einer variablen Region einer schweren Kette mit einer Polypeptid-Sequenz, welche im Wesentlichen identisch ist zu einer Polypeptid-Sequenz die durch ein V_H-Gensegment kodiert wird, wahlweise einem D-Bereich und einem humanen J_H-Segment, und (2) einer konstanten Region mit einer Polypeptid-Sequenz welche im Wesentlichen identisch ist zu einer Polypeptid-Sequenz, die durch ein humanes C_H-Segment kodiert wird.
Die Entwicklung von humanen monoklonalen Antikörpern mit hoher Affinität von PSMA wird durch ein Verfahren zum Expandieren des Repertoires humaner Gensegmente variabler Region in einer transgenen Maus mit einem Genom erleichtert, welches ein integriertes humanes Immunglobulin-Transgen enthält, wobei das Verfahren umfasst, Einbringen eines V-Gen-Transgens mit V-Region-Gensegmenten in das Genom, welche in dem integrierten humanen Immunglobulin-Transgen nicht vorhanden sind. Häufig ist das V-Region-Transgen ein artifizielles Hefe-Chromosom mit einem Teil eines humanen V_H- oder V_L- (V_K) Gensegment-Array, welches in einem humanen Genom natürlich vorkommen kann oder separat mittels rekombinanter Methoden zusammengespleißt werden kann, welche kaputte oder weggelassene V-Gensegmente beinhalten. Häufig sind meistens fünf oder mehr funktionelle V-Gensegmente auf dem YAC enthalten. In dieser Variation ist es möglich, eine transgene Maus herzustellen, welche durch die V-Repertoire V-Expansions-Methode produziert wurde, worin die Maus einen Immunglobulinkette exprimiert, welche eine Sequenz einer variablen Region umfasst, die durch ein V-Region-Gensegment kodiert wird, welches auf dem V-Region-Transgen enthalten ist, und ein C-Region, welche von dem humanen Ig-Transgen kodiert wird. Mittels des V-Repertoire-Expansionsverfahrens können transgene Mäuse mit mindestens fünf unterschiedlichen V-Genen hergestellt werden sowie Mäuse, mit mindestens 24 V-Genen oder mehr. Einige V-Gensegmente können nicht funktional sein (beispielsweise Pseudogene und dergleichen), wobei dieses Segment zurückgehalten werden oder durch rekombinante Methoden, welche dem Durchschnittsfachmann bekannt sind nach Wunsch selektiv entfernt werden können.
Sobald die Maus-Keimbahnlinie dahingehend modifiziert wurde, dass ein funktionelles YAC mit einem expandierten Segment-Repertoire enthalten ist, welches im Wesentlichen nicht in dem humanen Ig-Transgen mit den J- und C-Segmenten vorhanden ist, kann die Eigenschaft weitergegeben und in einen anderen genetischen Hintergrund eingekreuzt werden, einschließlich einem Hintergrund, bei dem das funktionale YAC mit einem expandierten V-Segment-Repertoire in eine Maus-Keimbahnlinie eingekreuzt wird, welche unterschiedliche humane Ig-Transgene aufweist. Mehrere funktionelle YACs mit einem expandierten V-Segment-Repertoire können in eine Keimbahnlinie eingekreuzt werden, um mit einem humanen Ig-Transgen (oder mehreren humanen Ig-Transgenen) zusammen zu wirken. Obwohl hier als YAC-Transgene bezeichnet, können derartigen Transgenen bei Integration in das Genom im Wesentlichen die Hefesequenzen fehlen, wie Sequenzen, die zur autonomen Replikation in Hefe erforderlich sind. Derartige Sequenzen können wahlweise durch genetische Manipulation (beispielsweise Restriktionsverdau und Puls-Feld-Gelelektrophorese oder andere geeignete Verfahren) entfernt werden, da eine Replikation in Hefe nicht weiter erforderlich ist (d.h. vor Einführung in eine Maus ES-Zelle oder Maus-Prozygote). Verfahren zur Weitergabe der Eigenschaft einer Expression eines Immunglobulins mit humaner Sequenz beinhalten Züchten einer transgenen Maus mit dem (den) humanen Ig-Transgen(en), und wahlweise auch eines funktionellen YAC's mit einem expandierten V-Segment-Repertoire. Sowohl das V_H- als auch das V_L-Gensegment können auf dem YAC vorhanden sein. Die transgene Maus kann in jeden, vom Fachmann gewünschten Hintergrund eingebracht werden, einschließlich einem Hintergrund mit anderen Transgenen, einschließlich Ig-Transgenen und/oder Transgenen, welche andere humane Lymphozyten-Proteine kodieren. Die Erfindung liefert weiter ein Immunglobulin humaner Sequenz mit hoher Affinität, welches von einer transgenen Maus mit einem expandierten V-Region-Repertoire-YAC-Transgen hergestellt wurde. Obwohl das vorstehende eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen transgenen Tiers beschreibt, sind andere Ausführungsformen umfasst, welche in 4 Kategorien klassifiziert wurden:

I. transgene Tiere mit einem Immunglobulin-Transgen einer nicht-umgelagerten schweren und umgelagerten leichten Kette;
II. transgene Tiere mit einem Immunglobulin-Transgen einer nicht-umgelagerten schweren und nicht-umgelagerten leichten Kette;
III. transgene Tiere mit einem Immunglobulin-Transgen einer umgelagerten schweren und nicht-umgelagerten leichten Kette; und
IV. transgene Tiere mit einem Immunglobulin-Transgen einer umgelagerten schweren und umgelagerten leichten Kette.

Von diesen Kategorien transgener Tiere ist die bevorzugte Reihenfolge wie folgt: II > I > III > IV, wobei die endogenen Gene der leichten Kette (oder mindestens das κ-Gen), durch homologe Rekombination (oder einem anderen Verfahren) nicht funktionell gemacht wurde (knock-out) und I > II > III > IV, wobei die Gene der endogenen leichten Kette nicht-funktionell gemacht wurden (ausgeknockt wurden; knock-out) und durch allelische Exklusion dominiert werden müssen.
III. Bispezifische/Multispezifische Moleküle, welche an PSMA binden
In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform können humane monoklonale Antikörper gegen PSMA oder Antigen-bindende Bereiche davon derivatisiert oder an ein anderes funktionelles Molekül gebunden werden, beispielsweise an ein anderes Peptid oder Protein (beispielsweise ein Fab'-Fragment), um ein bispezifisches oder multispezifisches Molekül zu bilden, welches an mehrere Bindungsstellen oder Ziel-Epitope bindet. So kann beispielsweise ein Antikörper oder ein Antigen-bindender Bereich der Erfindung funktionell (beispielsweise durch chemisches Kuppeln, genetische Fusion, nicht-kovalente Assoziation oder auf andere Art und Weise) an ein oder mehrere bindende Moleküle, wie einen anderen Antikörper, ein Antikörper-Fragment, ein Peptid oder ein Bindungs-Mimetikum, gebunden werden.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet daher bispezifische und multispezifische Moleküle, welche mindestens eine erste Bindungsspezifität für PSMA und eine zweite Bindungsspezifität für ein zweites Ziel-Epitop aufweist. In einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung ist das zweite Ziel-Epitop ein Fc-Rezeptor, beispielsweise ein humaner FcγRI (CD64) oder ein humaner Fcα-Rezeptor (CD89). Die Erfindung beinhaltet daher bispezifische und multispezifische Moleküle, welche sowohl an FcγR-, FcαR- oder FcεR-exprimierende Effektorzellen (beispielsweise Monozyten, Makrophagen oder polymorphkernige Zellen (PMNs)) binden als auch an Zielzellen, welche PSMA exprimieren. Diese bispezifi schen und multispezifischen Moleküle leiten PSMA-exprimierende Zellen zu Effektorzellen und lösen, wie die humanen monoklonalen Antikörper der Erfindung, Fc-Rezeptor vermittelte Effektorzell-Aktivitäten aus, wie Phagozytose einer PSMA-exprimierenden Zelle, Antikörper abhängige, Zell-vermittelte Cytotoxizität (ADCC), Cytokin-Freisetzung oder Generierung von Superoxidanionen.
Bispezifische und multispezifische Moleküle der Erfindung können zusätzlich zu einer anti-Fc-Bindungsspezifität und einer anti-PSMA-Bindungsspezifität weiter eine dritte Bindungsspezifität beinhalten. In einer Ausführungsform ist die dritte Bindungsspezifität ein anti-Verstärkungsfaktor(EF)-Bereich, beispielsweise ein Molekül, das an ein Oberflächenprotein bindet, welches an der cytotoxischen Aktivität beteiligt ist, und dadurch die Immunantwort gegen die Zielzelle verstärkt. Dieser "anti-Verstärkungsfaktor-Bereich" kann ein Antikörper, ein funktionelles Antikörper-Fragment oder ein Ligand sein, das ein bestimmtes Molekül bindet, beispielsweise ein Antigen, einen Rezeptor, was zu einer Verstärkung des Effekts der Bindung von Determinanten für den Fc-Rezeptor oder das Ziel-Zellantigen führt. Der "anti-Verstärkungsfaktor-Bereich" kann einen Fc-Rezeptor oder einen Ziel-Zellantigen binden. Alternativ kann der anti-Verstärkungsfaktor-Bereich an eine Einheit binden, welche verschieden ist von der Einheit, an die die erste und zweite Bindungsspezifität bindet. So kann beispielsweise der anti-Verstärkungsfaktor-Bereich eine cytotoxische T-Zelle binden (beispielsweise über CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 oder über eine andere Immunzelle, die zu einer verstärkten Immunantwort gegen die Zielzelle führt.
In einer Ausführungsform umfassen die bispezifischen und multispezifischen Moleküle der Erfindung als eine Bindungsspezifität mindestens einen Antikörper oder einen Antikörper-Fragment davon, einschließlich beispielsweise ein Fab, Fab', F(ab')₂, Fv oder ein Einzelketten-Fv. Der Antikörper kann weiter ein Dimer einer leichten oder schweren Kette sein oder jedes Minimalfragment davon, wie ein Fv oder ein Einzelketten-Konstrukt, wie in Ladner et al., US-P-4,946,778 beschrieben, welches am 07. August 1999 erteilt wurde und dessen Inhalt hier durch in Bezugnahme explizit aufgenommen wird.
In einer Ausführungsform umfassen die bispezifischen und multispezifischen Moleküle der Erfindung eine Bindungsspezifität für FcγR oder FcαR, welches auf der Oberfläche einer Effektorzelle vorhanden sind, und eine zweite Bindungsspezifität für ein Ziel-Zellantigen, beispielsweise PSMA.
In einer Ausführungsform wird die Bindungsspezifität für einen Fc-Rezeptor durch einen humanen monoklonalen Antikörper geliefert, dessen Bindung durch humanes Immunglobulin G (IgG) nicht blockiert wird. Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck "IgG-Rezeptor" jede der acht γ-Ketten-Gene, welche sich auf Chromosom 1 befinden. Diese Gene kodieren insgesamt 12 Transmembran- oder lösliche Rezeptor-Isoformen, welche in drei Fcγ-Rezeptor-Klassen gruppiert werden: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fcγ-Rezeptor ein humaner FcγRI mit hoher Affinität. Der humane FcγRI ist ein 72 kDa Molekül, welches für monomeres IgG eine hohe Affinität aufweist (10⁸–10⁹ M^–1).
Die Herstellung und Charakterisierung dieser bevorzugten monoklonalen Antikörper sind durch Fanger et al. in der PCT-Anmeldung WO 88/00052 und in der US-P-4,954,617 beschrieben. Diese Antikörper binden an ein Epitop von FcγRI, FcγRII oder FcγRIII an einer Stelle, welche verschieden ist von der Fcγ-Bindungsstelle des Rezeptors, wobei deren Bindung durch physiologische Mengen an IgG nicht wesentlich blockiert wird. Spezifische, in diese Erfindung nützliche anti-FcγRI-Antikörper sind mAb22, mAb32, mAb44, mAb62 und mAb197. Das den mAb32 produzierende Hybridom ist von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 9469 erhältlich. Anti-FcγRI-mAb22, F(ab)'₂-Fragmente von mAb22 sind von Medarex Inc. (Annanale N.J.) erhältlich. In anderen Ausführungsformen ist der anti-Fcγ-Rezeptor-Antikörper eine humanisierte Form des monoklonalen Antikörpers 22 (H22). Die Herstellung und Charakterisierung des Antikörpers 22 ist in Graziano, R. F. et al., J. Immunol. 155(10) (1995), 4996–5002 und der PCT/US93/10384 beschrieben. Die den Antikörper H22 produzierende Zelllinie wurde bei der American Type Culture Collection am 4. November 1992 mit der Bezeichnung HA022CL1 hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer CRL 11177.
In noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird die Bindungsspezifität für einen Fc-Rezeptor durch einen Antikörper bereitgestellt, welcher an einen humanen IgA-Rezeptor bindet, beispielsweise einen Fc-α-Rezeptor (FcαRI (CD89)), wobei dessen Bindung vorzugsweise nicht durch humanes Immunglobulin A (IgA) blockiert wird. Der Ausdruck "IgA-Rezeptor" soll das Genprodukt eines α-Gens (FcαRI) umfassen, welches sich auf Chro mosom 19 befindet. Dieses Gen kodiert bekanntermaßen mehrere, alternativ gespleißte Transmembran-Isoformen von 55 bis 110 kDa. FcαRI (CD89) wird auf Monozyten/Makrophagen, Eosinophilen und neutrophilen Granulozyten, jedoch nicht auf Effektorzell-Populationen konstitutiv exprimiert. FcαRI weist eine mittlere Affinität (≈ 5 × 10⁷ M^–1) für IgA 1 und für IgA 2 auf, welche bei Aussetzen an Zytokine wie G-CSF oder GM-CSF (Morton H. C. et al., Critical Reviews in Immunology 16 (1995), 423–440) erhöht ist. Vier monoklonale FcαRI-spezifische Antikörper, welche als A3, A59, A62 und A77 bezeichnet werden und FcαRI ausserhalb der IgA-Liganden Bindungsdomäne binden, wurden beschrieben (Monteiro, R. C. et al., J. Immunol. 148 (1992), 1764).
FcαRI und FcγRI sind bevorzugte Auslöser-Rezeptoren zur Verwendung in der Erfindung, da sie (1) hauptsächlich auf Immun-Effektorzellen (beispielsweise Monozyten, PMNs, Makrophagen und dentritischen Zellen) exprimiert sind, (2) in hohen Mengen (beispielsweise 5.000–100.000 pro Zelle) exprimiert sind, (3) Mediatoren zytotoxischer Aktivitäten (beispielsweise ADCC, Phagozytose) sind, (4) eine verstärkte Antigen-Präsentation von Antigenen vermitteln, einschließlich Selbst-Antigenen, die darauf gerichtet sind.
In anderen Ausführungsformen umfassen bispezifische und multispezifische Moleküle der Erfindung weiter eine Bindungsspezifität, welche ein Zielzell-Antigen, beispielsweise PSMA, erkennt, beispielsweise daran bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindungsspezifität durch einen humanen monoklonalen Antikörper der Erfindung bereitgestellt.
Ein "Effektorzell-spezifischer Antikörper", wie hier verwendet, betrifft einen Antikörper, oder ein funktionelles Antikörper-Fragment das den Fc-Rezeptor von Effektorzellen bindet. Bevorzugte Antikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung binden den Fc-Rezeptor von Effektorzellen an einer Stelle, welche von endogenem Immunglobulin nicht gebunden wird.
Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck "Effektorzelle" eine Immunzelle, die an der Effektorphase einer Immunantwort beteiligt ist, im Gegensatz zu den kognitiven und Aktivierungs-Phasen einer Immunantwort. Beispielhaft genannte Immunzellen umfassen eine Zelle myeloiden oder lymphoiden Ursprungs, beispielsweise Lymphozyten (beispielsweise B-Zellen und T-Zellen einschließlich zytolytischen T-Zellen (CTLs), Killerzellen, natürliche Killerzellen, Makrophagen, Monozyten, Eosinophile, Neutrophile, polymorphkernige/-nukleäre Zellen, Granulozyten, Mastzellen und Basophile. Einige Effektorzellen exprimieren spezifisch Fc-Rezeptoren und bewirken spezifische Immunfunktionen. In bevorzugten Ausführungsformen kann eine Effektorzelle Antikörper abhängige, Zell vermittelte Zytotoxizität (ADCC) induzieren, beispielsweise ein Neutrophil, der ADCC induzieren kann. So sind beispielsweise Monozyten, Makrophagen, die FcR exprimieren, beim spezifischen Abtöten von Zielzellen und Darbieten von Antigenen an andere Komponenten des Immunsystems oder bei der Bindung an Zellen, welche Antigen präsentieren, beteiligt. In anderen Ausführungsformen kann eine Effektorzelle ein Ziel-Antigen, eine Zielzelle oder einen Mikroorganismus phagozytieren. Die Expression eines bestimmten FcR auf einer Effektorzelle kann durch humorale Faktoren, wie Zytokine, reguliert werden. So wurde beispielsweise gefunden, dass die Expression von FcRI durch Interferon Gamma (IFN-γ) hochreguliert wird. Diese erhöhte Expression verstärkt die zytotoxische Aktivität von FcγRI tragenden Zellen gegen Ziele. Eine Effektorzelle kann ein Ziel-Antigen oder eine Zielzelle phagozytieren.
Eine "Zielzelle" soll eine unerwünschte Zelle in einem Subjekt (beispielsweise einem Menschen oder einem Tier) bezeichnen, auf welche mittels einer Zusammensetzung der Erfindung (beispielsweise einem humanen monoklonalen Antikörper, einem bispezifischen oder einem multispezifischen Molekül) abgestellt werden kann. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zielzelle eine Zelle, welche PSMA exprimiert oder überexprimiert. PSMA-exprimierende Zellen umfassen gewöhnlich Tumorzellen, wie Prostata-, Nieren- und Darm-Tumorzellen.
Obwohl humane monoklonale Antikörper bevorzugt sind, sind andere Antikörper, welche in den erfindungsgemäßen bispezifischen oder multispezifischen Molekülen eingesetzt werden können, chimäre, monoklonale Maus- und humanisierte Antikörper.
Chimäre, monoklonale Maus-Mensch Antikörper (d.h. chimäre Antikörper) können durch rekombinante DNA-Techniken, welche im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. So wird beispielsweise ein Gen welches den konstanten Fc-Bereich eines Maus (oder einer anderen Spezies) monoklonalen Antikörper Moleküls kodiert mit Restriktionsenzymen verdaut, um den Bereich zu entfernen, welcher den Maus-Fc Teil kodiert, wobei der equivalente Bereich eines Gens, welche einen konstanten Fc-Bereich kodiert, eingesetzt wird (siehe Robinson et al., Internationale Patentveröffentlichung PCT/US86/02269; Akira et al., Europäische Patentanmeldung 184,187; Taniguchi, M., Europäische Patentanmeldung 171,496; Morrison et al., Europäische Patentanmeldung 173,494; Neuberger et al.; Internationale Anmeldung WO 86/01533; Cabilly et al. US Patent No. 4,816,567; Cabilly et al., Europäische Patentanmeldung 125,023; Better et al., Science 240 (1988), 1041–1043); Liu et al., PNAS 84 (1987), 3439–3443; Liu et al.; J. Immunol. 139 (1987), 3521–3526; Sun et al. PNAS 84 (1987), 214–218; Nishimura et al., Canc. Res. 47 (1987) 999–1005; Wood et al. Nature 314 (1985), 446–449; und Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80 (1988), 1553–1559).
Der chimäre Antikörper kann weiter durch Ersetzen von Sequenzen des variablen Fv-Bereichs, welcher nicht direkt an der Antigen-Bindung beteiligt sind, mit equivalenten Sequenzen von humanen variablen Fv-Bereichen humanisiert werden. Allgemeine Übersichten von humanisierten chimären Antikörpern werden gegeben von Morrison S. L., Science 229 (1985), 1202–1207 und Oi et al., Bio Techniques 4 (1986), 214. Diese Verfahren beinhalten Isolieren, Manipulieren und Exprimieren der Nukleinsäuresequenzen welche alle oder einen Teil der variablen Fv-Bereiche des Immunglobulins von mindestens einer der schweren oder leichten Kette kodieren. Quellen für derartige Nukleinsäuren sind dem Fachmann wohlbekannt und können beispielsweise von 7E3, einem GPII_bIII_a-Antikörper produzierenden Hybridom erhalten werden. Die rekombinante DNA, welche den chimären Antikörper oder ein Fragment davon kodiert, kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert werden. Geeignete humanisierte Antikörper können alternativ durch CDR-Substitutionen hergestellt werden (US-P-5,225,539; Jones et al. Nature 321 (1986), 552–525; Verhoeyan et al. Science 239 (1988), 1534; und Beidler et al. J. Immunol. 141 (1988), 4053–4060.
Alle der CDRs eines bestimmten humanen Antikörpers können mit mindestens einem Teil eines nicht-humanen CDR ersetzt werden, oder nur einige der CDRs können mit nicht-humanen CDRs ersetzt werden. Es ist nur erforderlich die Anzahl an CDRs, welche zur Bindung des humanisierten Antikörpers an den Fc-Rezeptor erforderlich sind, zu ersetzen.
Ein Antikörper kann durch jedes Verfahren humanisiert werden, welches mindestens einen Bereich eines CDRs eines humanen Antikörpers und einen von einem nicht-humanen Antikörper abgeleiteten CDR ersetzen kann. Winter beschreibt ein Verfahren, welches zur Herstellung der humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann (UK Patentanmeldung GB 2188638A , eingereicht am 26. März 1987), dessen Inhalt hier durch Bezugnahme explizit mit aufgenommen ist. Die humanen CDRs können mit nicht-humanen CDRs unter Verwendung von Oligonukleotid-Positions-dirigierter-Mutagenese ersetzt werden, wie in der Internationalen Patentanmeldung WO 94/10332 mit dem Titel Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobin G on Human Mononuclear Phagocytes beschrieben ist.
Ebenfalls im Bereich der Erfindung sind chimäre und humanisierte Antikörper, bei denen spezifische Aminosäuren substituiert, entfernt oder hinzugefügt wurden. So weisen bevorzugte humanisierte Antikörper insbesondere Aminosäuresubstitutionen in dem Gerüstbereich auf, um die Bindung an das Antigen zu verbessern. So können beispielsweise in einem humanisierten Antikörper mit Maus-CDRs Aminosäuren, welche sich in dem humanen Gerüst-Bereich befinden, mit den Aminosäuren ersetzt werden, die sich an den entsprechenden Positionen in dem Maus-Antikörper befinden. Derartige Substitutionen verbessern in einigen Fällen bekanntermaßen die Bindung von humanisierten Antikörpern an das Antigen. Antikörper, bei denen Aminosäuren zugesetzt, entfernt oder substituiert werden, werden hier als modifizierte Antikörper oder veränderte Antikörper bezeichnet.
Der Ausdruck modifizierter Antikörper soll auch Antikörper umfassen, wie monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper und humanisierte Antikörper, welche durch beispielsweise Zufügen, Entfernen oder Substituieren von Bereichen des Antikörpers modifiziert wurden. So kann beispielsweise ein Antikörper durch Entfernen des konstanten Bereichs oder dessen Ersetzen mit einem konstanten Bereich zur Erhöhung der Halbwertszeit, beispielsweise der Serum-Halbwertszeit, der Stabilität oder Affinität des Antikörpers, der Serum-Halbwertszeit, der Stabilität oder Affinität des Antikörpers modifiziert werden. Jede Modifikation ist innerhalb des Bereichs der Erfindung, solange das bispezifische und multispezifische Molekül mindestens einen Antigen-Bindungsbereich aufweist, welcher für ein FcγR spezifisch ist und mindestens eine Effektorfunktion auslöst. Bispezifische und multispezifische Moleküle der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung verschiedener Techniken (siehe beispielsweise D. M. Kranz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 5807), "Polydoma"-Techniken (siehe US-P-4,474,893 von Reading) oder rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden.
So können insbesondere bispezifische und multispezifische Moleküle der vorliegenden Erfindung durch konjugieren der entsprechenden Bindungsspezifitäten, beispielsweise den anti-FcR- und anti-PSMA-Bindungsspezifitäten, unter Verwendung vom im Stand der Technik bekannten Verfahren, welche in den hier gelieferten Beispielen beschrieben werden, hergestellt werden. So kann beispielsweise jede Bindungsspezifität des bispezifischen und multispezifischen Moleküls separat erzeugt und dann aneinander konjugiert werden. Sind die Bindungsspezifitäten Proteine oder Peptide, dann können eine Vielzahl von Kupplungs- oder Vernetzungs-Mittel für eine kovalente Konjugation eingesetzt werden. Beispiele für Vernetzungs-Mittel umfassen Protein A, Carbodiimid, N-Succinimidyl-S-acetyl-thioacetat (SATA), 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzosäure) (DTNB), O-Phenylendimaleimid (OPDM), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) und Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidmethyl)cyclohexan-1-carboxylat (sulfo-SMCC) (siehe beispielsweise Karpovsky et al., J. Exp. Med. 160 (1984), 1686; Liu, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 8648. Andere Verfahren umfassen jene, welche beschrieben wurden von Paulus (Behring Ins. Mitt. 78, (1985), 118–132); Brennan et al. (Science 229 (1985), 81–83) und Glennie et al. (J. Immunol. 139 (1987), 2367–2375). Bevorzugte Konjugationsmittel sind SATA und sulfo-SMCC, welche beide von Pierce Chemical Co. (Rockford IL) erhältlich sind.
Sind die Bindungsspezifitäten Antikörper (beispielsweise zwei humanisierte Antikörper), dann können sie über eine Sulfhydryl-Bindung der C-terminalen Gelenkbereiche der zwei schweren Ketten konjugiert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Gelenkbereich vor der Konjugation modifiziert, so dass er eine ungerade Anzahl an Sulfhydryl-Resten, vorzugsweise eine, aufweist.
Alternativ können beide Bindungsspezifitäten in dem gleichen Vektor kodiert und in der gleichen Wirtszelle exprimiert und angesammelt werden. Dieses Verfahren ist insbesondere dann nützlich, wenn das bispezifische und multispezifische Molekül ein mAb × mAb, mAb × Fab, Fab × F(ab')₂ oder ein Ligand × Fab-Fusionsprotein ist. Ein erfindungsgemäßes bispezifisches und multispezifisches Molekül, beispielsweise ein bispezifisches Molekül kann ein Einzelkettenmolekül sein, wie ein bispezifischer Einzelketten-Antikörper, ein bispezifisches Einzelketten-Molekül mit einem Einzelketten-Antikörper und eine Bindungsdeterminante, oder ein bispezifisches Einzelketten-Molekül mit zwei Bindungsdeterminanten. Bispezifische und multispezifische Moleküle können weiter Einzelkettenmoleküle sein oder können zumindest zwei Einzelkettenmoleküle umfassen. Verfahren zur Herstellung von bi- und multispezifischen Molekülen sind beispielsweise beschrieben in US-P-5,260,203; US-P-5,455,030; US-P-4,881,175; US-P-5,132,405; US-P-5,091,513; US-P-5,476,786; US-P-5,013,653; US-P-5,258,498 und US-P-5,482,858.
Eine Bindung der bispezifischen und multispezifischen Moleküle an deren bestimmte Ziele kann durch einen mit Enzym-verbundenen Immunosorbent-Assay (ELISA); Radioimmunassay (RIA); FACS-Analyse; einen Bioassay (beispielsweise Wachstumsinhibition) oder einen Western Blot-Assay bestätigt werden. Jeder dieser Assays weist im Allgemeinen die Anwesenheit von Protein-Antikörper-Komplexen von bestimmten Interesse nach, indem ein markiertes Reagenz (beispielsweise ein Antikörper) eingesetzt wird, das für den Komplex von Interesse spezifisch ist. So können beispielsweise FcR-Antikörper-Komplexe unter Verwendung von beispielsweise einem mit einem Enzym verbundenen Antikörper oder Antikörper-Fragment erfasst werden, welches die Antikörper-FcR-Komplexe erkennt und spezifisch daran bindet. Alternativ können die Komplexe unter Verwendung jeder der vielen anderen Immunoassays erfasst werden. So kann beispielsweise der Antikörper radioaktiv markiert und in einem Radioimmunassay (RIA) eingesetzt werden (siehe beispielsweise Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March 1986). Das radioaktive Isotop kann durch Mittel, wie die Verwendung eines γ-Zählers oder eines Scintillations-Zählers, oder durch Autoradiographie erfasst werden.
IV. Antikörper Konjugate/Immunotoxine
In einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung einen monoklonalen humanen anti-PSMA-Antikörper oder ein Fragment davon, welcher/welches an eine therapeutische Gruppe, wie ein Zytotoxin, ein Arzneimittel oder ein Radioisotop gebunden ist. Bei Konjugierung an ein Zytotoxin werden diese Antikörper-Konjugate als "Immunotoxine" bezeichnet. Ein Zytotoxin oder zytoxisches Mittel umfasst jedes Mittel, das für Zellen schädlich ist (beispielsweise diese tötet). Beispiele umfassen Taxol, Cytochchalasin B, Gramicidin D, Ethidiumbromid, Emetin, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Colchicin, Doxorubicin, Daunorubicin, Dihydroxyanthracindion, Mitoxantron, Mithramycin, Actinomycin D, 1-Dehydrotestosteron, Glucocorticoid, Procain, Tetracain, Lidocain, Propranolol und Puromycin und Analoge oder Honologe davon.
Therapeutische Mittel umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Antimetaboliten (beispielsweise Methotrexat, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Cytarabin, 5-Fluorouracil decarbazin), alkylierende Mittel (beispielsweise Mechlorethamin, Thioepachlorambucil, Melphalan, Carmustin (BSNU) und Lomustin (CCNU), Cyclothosphamid, Busulfan, Dibrommannitol, Streptozotocin, Mitomycin C und cis-Dichlordiaminplatin(II) (DDP) cisplatin), Anthracykline (beispielsweise Daunorubicin (bis dato Daunomycin) und Doxorubicin) Antibiotika (beispielsweise Dactinomycin (bis dato Actinomycin), Bleomycin, Mithramycin, und Anthramycin (AMC)) und anti-mitotische Mittel (beispielsweise Vincristin und Vinblastin). Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann an ein Radioisotop konjugiert sein, beispielsweise radioaktives Iod, um zytotoxische Radiopharmazeutika zur Behandlung von mit PSMA assoziierten Störungen, wie Krebs, zu behandeln.
Die erfindungsgemäßen Antikörper-Konjugate können eingesetzt werden, um eine bestimmte biologische Antwort zu modifzieren, wobei die Arzneimittel-Gruppe nicht ausgelegt werden soll, auf klassische chemische therapeutische Mittel begrenzt zu sein. Die Arzneimittelgruppe kann beispielsweise ein Protein oder ein Polypeptid sein, welches eine gewünschte biologische Aktivität aufweist. Derartige Proteine umfassen beispielsweise ein enzymatisch aktives Toxin oder ein aktives Fragment davon, wie Abrin, Ricin A, Pseudonomas Exotoxin oder Diphterietoxin, ein Protein wie Tumor-Nekrose-Faktor oder Interferon-γ, oder biologische Antwort-Modifizierungsmittel, wie beispielsweise Lymphokine, Interleukin-1 ("IL-1"), Interleukin-2 ("IL2"), Interleukin-6 ("IL-6"), Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor ("GM-CSF") oder Granulocyten-stimulierender Faktor ("G-CSF") oder andere Wachstumsfaktoren.
Techniken zur Konjugierung derartiger therapeutischen Gruppen an Antikörper sind wohlbekannt, siehe beispielsweise Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al., (Hrsg.), 243–56 (Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug delivery (2. Ausgabe), Robinson et al. (Hrsg.), 623–53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxiy Agents In Cancer Therapy: A Review". In Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (Hrsg.), 475–506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (Hrsg.), 303–16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al. "The Preparation And Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates" Immunol. Rev., 62 (1982), 119–58.
V. Pharmazeutische Zusammensetzungen
In einem weiteren Gesichtspunkt liefert die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein oder eine Kombination von humanen monoklonalen Antikörpern oder Antigen-bindende Bereichen davon, der vorliegenden Erfindung, formuliert zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Zusammensetzung eine Kombination von mehreren (beispielsweise zwei oder mehr) isolierten, humanen Antikörpern oder Antigen-bindenden Bereichen davon der Erfindung. Vorzugsweise bindet jeder der Antikörper oder jeder der Antigen-bindenden Bereiche davon der Zusammensetzung an ein bestimmtes, vorgewähltes Epitop von PSMA.
In einer Ausführungsform werden humane monoklonale anti-PSMA Antikörper mit komplementären Aktivitäten in Kombination, beispielsweise als pharmazeutische Zusammensetzung mit zwei oder mehreren monoklonalen, humanen anti-PSMA-Antikörpern eingesetzt. So kann beispielsweise ein humaner monoklonaler Antikörper, welcher hoch effektiv ein Abtöten von Zielzellen in Anwesenheit von Effektorzellen vermittelt, mit einem anderen humanen monoklonalen Antikörper kombiniert werden, der das Wachstum von PSMA-exprimierenden Zellen inhibiert.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung ein oder eine Kombination von bispezifischen oder multispezifischen Molekülen der Erfindung (beispielsweise solche, welche mindestens eine Bindungsspezifität für einen Fc-Rezeptor und mindestens eine Bindungsspezifität für PSMA enthalten.
Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen können auch in einer Kombinationstherapie, d.h. mit einem anderen Mittel kombiniert, verabreicht werden. Die Kombinationstherapie kann beispielsweise eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit mindestens einem anti-Tumor-Mittel oder einer anderen herkömmlichen Therapie umfassen.
Wie hier verwendet umfasst der Begriff "pharmazeutisch annehmbarer Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und anti-Pilz-Mittel, isotonische und Absorptions-verzögernde Mittel und dergleichen, welche physiologisch kompatibel sind. Der Träger ist vorzugsweise zur intravenösen intramuskulären, intra subkutanen, parenteralen, spinalen oder epidermalen Verabreichung (mittels Injektion oder Infusion) geeignet. In Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg kann die aktive Verbindung, der Antikörper, das bispezifische und multispezifische Molekül, mit einem Material beschichtet werden, um die Verbindung vor der Wirkung von Säuren oder anderen natürlichen Bedingungen, welche die Verbindung inaktivieren können, zu schützen.
Ein "pharmazeutisch annehmbares Salz" betrifft ein Salz, welches die gewünschte biologische Aktivität der eigentlichen Verbindung beibehält, und welches keine unerwünschten toxikologischen Auswirkungen nach sich zieht (siehe beispielsweise Berge, S. M. et al. J. Pharm. Sci. 66 (1977), 1–19). Beispiele derartiger Salze umfassen Säureadditionssalze und Basenadditionssalze. Säureadditionssalze umfassen jene, welche von nicht toxischen anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Bromsäure, Jodsäure, Phosphoriger Säure und dergleichen, sowie von nicht toxischen organischen Säuren, wie aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren, Phenyl-substituierten Alkansäuren, Hydroxylalkansäuren, aromatischen Säuren, aliphatischen Säuren, aromatischen Sulfonsäuren und dergleichen abgeleitet sind. Basenadditionssalze umfassen jene, die von Erdalkalimetallen, wie Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und dergleichen, sowie von nicht toxischen organischen Aminen, wie N,N'-Dibenzylethylendiamin, N-Methylglucamin, Chloroprocain, Cholin, Diethanolamin, Ethylendiamin, Procain und dergleichen.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann durch Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren verabreicht werden. Wie dem Fachmann klar ist, hängt der Verabreichungsweg und die Art der Verabreichung von den gewünschten Ergebnissen ab. Die aktiven Verbindungen können mit Trägern hergestellt werden, welche die Verbindung gegen die schnelle Freisetzung schützen, wie eine gesteuerte Freisetzungsformulierung einschließlich Implantate transdermale Pflaster und mikroeingekapselte Liefersysteme. Bioabbaubare, biokompatible Polymere können eingesetzt werden, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydrid, Polyglycolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Viele Verfahren zur Herstellung derartiger Formulierungen sind patentiert oder dem Fachmann allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson Hrsg., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Um eine erfindungsgemäße Erfindung über bestimmte Verabreichungswege zu verabreichen kann es nötig sein, die Verbindung mit einem Material zur Verhinderung deren Inaktivierung zu beschichten oder diese damit zu verabreichen. So kann beispielsweise die Verbindung an ein Subjekt in einem geeigneten Träger, beispielsweise Liposomen, oder einem Verdünnungsmittel verabreicht werden. Pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel umfassen Kochsalzlösungen und wässrige Pufferlösungen. Liposome umfassen Wasser-in-Öl-in-Wasser CGF-Emulsionen, sowie herkömmlich Liposomen (Strejan et al. J. Neuroimmunol. 7 (1984), 27).
Pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Puffer zur unvorbereiteten Zubereitung von sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik bekannt. Mit der Maßgabe, dass das herkömmliche Medium oder Mittel mit der aktiven Verbindung nicht kompatibel ist, wird die Verwendung davon in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Zusätzliche aktive Verbindungen können in die Zusammensetzungen ebenfalls eingebracht werden.
Therapeutische Zusammensetzungen müssen gewöhnlich bei den Bedingungen der Herstellung und Lagerung steril und stabil sein. Die Zusammensetzung kann als eine Lösung, Mikroemulsion, als ein Liposom, oder als eine andere geordnete Struktur formuliert sein, welche für hohe Arzneimittelkonzentrationen geeignet ist. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersions-Medium mit beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen) und geeignete Gemische davon sein. Die geeignete Fluidität kann beispielsweise durch Verwendung einer Beschichtung wie Lecithin, durch Beibehalten der gewünschten Teilchengröße im Fall einer Dispersion und durch Verwendung von Oberflächen-aktiven Mitteln aufrecht erhalten werden. In vielen Fällen ist es bevorzugt, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker, Polyalkohole wie Mannitol, Sorbitol oder Natriumchlorid, in die Zusammensetzung einzubringen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen können durch Einbringen eines Mittels in die Zusammensetzung erreicht werden, welche die Absorption verzögert, beispielsweise Monostearat-Salze und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Einbringen der aktiven Verbindung in der erforderlichen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem der vorstehend aufgeführten oder mit einer Kombination der Inhaltsstoffe, nach Bedarf, gefolgt von Sterilisations mikrofiltration hergestellt werden. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einbringen der aktiven Verbindung in einen sterilen Träger hergestellt, welcher ein basisches Dispersionsmedium enthält, und die erforderlichen anderen der vorstehend aufgeführten Inhaltsstoffe. Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen, injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Trocknen bei verringertem Druck und Gefriertrocknung (Lyophilisierung), welches ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffes zuzüglich jedes weiteren gewünschten Inhaltsstoffes aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon ergibt.
Die Dosierungen werden eingestellt, um die optimale gewünschte Antwort zu liefern (beispielsweise eine therapeutische Antwort). So kann beispielsweise eine einzige Dosis verabreicht werden, mehrere geteilte Dosen können über die Zeit verabreicht werden oder die Dosis kann proportional reduziert oder gesteigert werden, wie durch die Dringlichkeit der therapeutischen Situation angezeigt ist. Es ist insbesondere vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in Einheitsdosisform zu formulieren, um die Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung zu erleichtern. Eine Einheitsdosisform, wie hier verwendet, betrifft körperlich unterschiedliche Einheiten, welche für die zu behandelnden Subjekte als einheitliche Dosen geeignet sind. Jede Einheit enthält eine bestimmte Menge der aktiven Verbindung, berechnet, um den gewünschten therapeutischen Effekt zu erzielen, zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger. Die Anforderung an die Dosiseinheitsformen der Erfindung werden diktiert und sind direkt abhängig von (a) den bestimmten Eigenschaften der aktiven Verbindung und dem bestimmten therapeutischen Effekt, der erzielt werden soll, und (b) den Beschränkungen, welche in der Technik der Formulierung einer derartigen aktiven Verbindung zur Behandlung der Sensitivität in Individuen inhärent ist.
Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Antioxidantien umfassen: (1) wasserlösliche Antioxidantien, wie Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumbisulfat, Natriummetabisulfit, Natriumsulfid und dergleichen; (2) Öl-lösliche Antioxidantien, wie Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, alpha-Tocopherol und dergleichen; (3) Metall-chelatierende Mittel, wie Zitronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbitol, Weinsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
Für therapeutische Zusammensetzungen umfassen erfindungsgemäße Formulierungen jene, welche für eine orale, nasale, topikale (einschließlich buccal und sublingual), rektale, vaginale und/oder parenterale Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können zweckmäßig in Einheitsdosisform dargeboten werden und können mit jedem in der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Menge an aktivem Inhaltsstoff, welche mit einem Trägermaterial zur Herstellung einer Einheitsdosisform kombiniert werden kann, variiert in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Subjekt und dem bestimmten Verabreichungsmodus. Die Menge an aktivem Inhaltsstoff, welche mit einem Trägermaterial zur Herstellung einer Einheitsdosisform kombiniert werden kann, wird im Allgemeinen die Menge der Zusammensetzung sein, welche einen therapeutischen Effekt hervorruft. Im Allgemeinen, aus 100%, wird diese Menge von etwa 0,01% bis etwa 99% aktiver Inhaltsstoff, vorzugsweise von etwa 0,1% bis etwa 70%, am meisten bevorzugt von etwa 1% bis etwa 30% reichen.
Erfindungsgemäße Formulierungen, welche für eine vaginale Verabreichung geeignet sind, umfassen weiter Pessarien, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Spray-Formulierungen, welche Träger beinhalten, die im Stand der Technik als geeignet bekannt sind. Dosisformen für die topische oder transdermale Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen Pulver, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotions, Gels, Lösungen, Pflaster und Inhalationsstoffe. Die aktive Verbindung kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und mit jeden Konservierungsstoffen oder Puffern oder Treibmittel, welche erforderlich sein können, gemischt werden. Die Ausdrücke "parenterale Verabreichung" und "parenteral verabreicht", wie hier verwendet, bezeichnet Verabreichungswege, welche nicht-enterale und topische Verabreichung sind, gewöhnlich durch Injektion, und beinhalten, ohne Begrenzung, intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intratekale, intrakapsuläre, intraorbitale, in das Herz, intradermale, intraperitonale, transtracheale, subkutane, subkutikuläre, intraartikuläre, subkapsuläre, subarachnoide, intraspinale, epidurale und intrasternale Injektion und Infusion.
Beispiele für geeignete wässrige und nicht-wässrige Träger, welche in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können, umfassen Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Propylen Glykol, Polyethylen Glykol und dergleichen), und geeignete Gemische davon, Gemüseöle, wie Olivenöl und injizierbare organische Esther, wie Ethyloleat. Eine geeignete Fluidität kann durch beispielsweise Verwendung von Beschichtungsmaterialien, wie Lecithin, durch Aufrechterhalten der gewünsch ten Teilchengröße in Fall von Dispersionen, und durch Verwendung von Oberflächenaktiven Mittel aufrechterhalten werden.
Diese Zusammensetzungen können weiter Hilfsmittel, wie Konservierungsstoffe, Benetzungsmittel, Emulgatoren und Dispersionsmittel enthalten. Ein Ausschluß der Anwesenheit von Mikroorganismen kann sichergestellt werden durch vorstehend aufgeführten Sterilisationsverfahren und durch Einbringen unterschiedlicher antibakterieller und anti-fungizider Mittel, beispielsweise Parabin, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen. Es kann weiter erwünscht sein, isotonische Mittel, wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen in die Zusammensetzungen einzubringen. Darüber hinaus kann eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form durch Einschluß von Mitteln herbeigeführt werden, welche die Absorption verzögern, wie Aluminiummonostearat und Gelatine.
Werden die erfindungsgemäßen Erfindungen als Pharmazeutika an Menschen und Tiere verabreicht, dann können sie alleine oder als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden, welche beispielsweise 0,01–99,5% (mehr bevorzugt 0,1–90%) des aktiven Inhaltsstoffes zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
Ohne Berücksichtigung des gewählten Verabreichungsweges werden die erfindungsgemäßen Verbindungen, welche in einer geeigneten hydrierten Form eingesetzt werden können, und/oder die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen in pharmazeutisch annehmbare Dosisformen durch herkömmliche, dem Fachmann bekannte Methoden formuliert.
Die tatsächlichen Dosismengen der aktiven Inhaltsstoffe in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können variiert werden, um eine Menge des aktiven Inhaltsstoffes zu erhalten, welche zur Erreichung der gewünschten therapeutischen Antwort für einen bestimmten Patienten, für die Zusammensetzung und für die Art der Verabreichung wirksam ist, ohne für den Patienten toxisch zu sein. Die gewählte Dosismenge hängt von einer Vielzahl von pharmakokinetischen Faktoren ab, einschließlich der Aktivität der verwendeten bestimmten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, oder des Esters, des Salz oder des Amids davon, des Verabreichungswegs, der Verabreichungszeit, der Exkretionsrate der bestimmten, verwendeten Verbindung, der Dauer der Behandlung, anderen Arzneimitteln, Verbindungen und/oder Materialien, welche zusammen mit den bestimmten Verbindungen verwendet werden, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht, dem Zustand, dem allgemeinen Gesundheitszustand und der Krankheitshistorie des zu behandelnden Patienten und ähnlichen Faktoren, die in der Medizin wohlbekannt sind. Ein Durchschnitts-Arzt oder -Tierarzt kann die wirksame Menge der erforderlichen pharmazeutischen Zusammensetzung leicht bestimmen und verschreiben. So könnte der Arzt oder Tierarzt beispielsweise mit Dosen der in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendeten, erfindungsgemäßen Verbindungen in Mengen starten, welche unter den liegen, die erforderlich sind, um einen gewünschten therapeutischen Effekt zu erzielen, und dann langsam die Dosierung ansteigen lassen, bis der gewünschte Effekt erzielt wird. Im Allgemeinen ist eine geeignete tägliche Dosis einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung die Menge der Verbindung, welche die geringste Dosis ist, die zur Erzeugung eines therapeutischen Effekts wirksam ist. Eine derartige effektive Dosis hängt im Allgemeinen von den vorstehend beschriebenen Faktoren ab. Es ist bevorzugt, das die Verabreichung intravenös, intramuskulär, intraperitonal oder subcutan, vorzugsweise proximal zur Zielstelle verabreicht, erfolgt. Wenn gewünscht, kann die wirksame tägliche Dosis einer therapeutischen Zusammensetzung als zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehrere Unterdosierungen verabreicht werden, welche in geeigneten Intervallen während des Tages, wahlweise in Einheitsdosisformen, separat verabreicht werden. Obwohl eine erfindungsgemäße Verbindung allein verabreicht werden kann ist es bevorzugt, die Verbindung als eine pharmazeutische Formulierung (Zusammensetzung) zu verabreichen.
Therapeutische Zusammensetzungen können mit im Stand er Technik bekannten medizinischen Einrichtungen verabreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine therapeutische Zusammensetzung der Erfindung mit einer nadellosen hypodermischen Injektionseinrichtung verabreicht werden, wie den Einrichtugen, die in den US-P-5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,431, 4,941,880, 4,790,824 oder 4,596,556 offenbart sind. Beispiele wohlbekannter Implantate und Module, welche in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen: US-P-4,487,603, welche eine implantierbare Mikroinfusions-Pumpe zum Verteilen des Arzneimittels in einer gesteuerten Rate offenbart; US-P-4,486,194, welche eine therapeutische Einrichtung zur Verabreichung von Arzneimitteln über die Haut offenbart; US-P-4,447,233, welche eine Arzneimittel-Infusionspumpe zur Lieferung von Arzneimitteln in einer genauen Infusionsrate offenbart; US-P-4,447,224, welche einen implantierbaren Infusionsapparat mit variabler Strömung zur kontinuierlichen Arzneimittellieferung offenbart; US-P-4,439,196, welche ein osmotisches Arzneimittel-Liefersystem mit mehreren Kammerabteilungen offenbart; und US-P-4,475,196, welche ein osmotisches Arzneimittel-Liefersystem offenbart.
Viele andere derartige Implantate, Liefersysteme und Module sind dem Fachmann bekannt.
In bestimmten Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Antikörper noch formuliert werden, um eine geeignete Verteilung in vivo sicher zu stellen. So schließt beispielsweise die Blut-Hirn-Schranke (BBB) viele stark hydrophile Verbindungen aus. Um sicher zu stellen, dass die erfindungsgemäßen therapeutischen Verbindungen die BBB, wenn gewünscht, überschreiten, können sie an beispielsweise in Liposomen formuliert werden. Für Verfahren zur Herstellung von Liposomen, siehe beispielsweise US-P-4,522,811, 5,374,548, und 5,399,331. Die Liposomen können ein oder mehrere Gruppen umfassen, welche selektiv in bestimmte Zellen oder Organe transportiert werden, um eine gezielte Arzneimittellieferung zu fördern (siehe beispielsweise V. V. Ranade, J. Clin. Pharmakol. 29 (1989), 685). Beispielhaft genannte Zielgruppen umfassen Folat oder Biotin (siehe beispielsweise US-P-5,416,016 von Low et al.), Mannoside (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 (1988), 1038), Antikörper (P. G. Bloeman et al., FEBS Lett. 357 (1995), 140; M. Owais et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39 (1995), 180); Oberflächenprotein-A-Rezeptor (Briscoe et al., Am J. Physiol. 1233 (1995), 134) wobei unterschiedliche Spezien davon die erfindungsgemäßen Formulierungen sowie Komponente der erfindungsgemäßen Moleküle enthalten können; p120 (Schreier et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 9090); siehe auch K. Keinanen; M. L. Laukkanen; FEBS Lett. 346 (1994), 123; J. J. Killion; I. J. Fidler Immunomethods 4 (1994), 273. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen therapeutischen Verbindungen in Liposomen formuliert. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfassen die Liposomen eine Zielgruppe. In einer meisten bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen therapeutischen Verbindungen in den Liposomen durch Bolusinjektion zu einer Stelle proximal zum Tumor oder der Infektion geliefert. Diese Zusammensetzung muss in einem Masse fluid sein, so dass eine leichte Verarbeitung in der Spritze existiert. Sie muss daher unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil und gegenüber kontaminierender Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, konserviert sein.
Eine "therapeutisch wirksame Dosis" inhibiert das Tumorwachstum im Vergleich zu nicht behandelten Subjekten vorzugsweise um mindestens etwa 20%, mehr bevorzugt um mindestens etwa 40%, sogar noch mehr bevorzugt um mindestens etwa 60%, und noch mehr bevorzugt um mindestens etwa 80%. Die Fähigkeit einer Verbindung Krebs zu inhibieren kann in einem Tiermodel-System, welches für die Wirksamkeit in humanen Tumoren aussagekräftig ist, evaluiert werden. Alternativ kann diese Eigenschaft einer Zusammensetzung durch Überprüfen der Fähigkeit der Verbindung zur Inhibierung evaluiert werden, wie eine Inhibierung in vitro durch dem Durchschnittsfachmann bekannte Assays. Eine therapeutisch wirksame Menge einer therapeutischen Verbindung kann die Tumorabmessungen verkleinern oder anderweitig Symptome in einem Subjekt erleichtern. Ein Durchschnittsfachmann wäre in der Lage, derartige Mengen aufgrund von Faktoren, wie der Größe des Subjekts, der Schwere der Symptome des Subjekts und der bestimmten Zusammensetzung oder dem gewählten Verabreichungsweg zu bestimmen.
Die Zusammensetzung muss steril und in dem Masse fluid sein, dass die Zusammensetzung über eine Spritze geliefert werden kann. Zusätzlich zu Wasser kann der Träger eine isotonisch gepufferte Kochsalzlösung, Ethanol, Polyol (zum Beispiel, Glycerin, Propylenglycol, und flüssiges Polyethylenglycol, und dergleichen), und geeignete Gemische davon sein. Eine geeignete Fluidität kann beispielsweise durch Verwendung von Beschichtungen, wie Lecitin, durch Aufrechterhalten der gewünschten Teilchengröße im Falle einer Dispersion und durch Verwendung von Oberflächen-aktiven Mitteln aufrechterhalten werden. In vielen Fällen, ist es bevorzugt, in die Zusammensetzung isotonische Mittel, beispielsweise Zucker, Polyalkohol, sowie Mannitol oder Sorbitol, und Natriumchlorid einzubringen. Eine Langzeit-Absorption der injizierten Zusammensetzungen kann durch Einbringen eines Mittel in die Zusammensetzung erreicht werden, welche die Absorption verzögert, beispielsweise Aluminummonosterat oder Gelatine.
Ist die aktive Verbindung, wie vorstehend beschrieben, in geeigneter Weise geschützt, dann kann die Verbindung oral verabreicht werden, beispielsweise mit einem inerten Verdünnungsmittel oder einem assimilierbaren, essbaren Träger.
VI. Verwendung und Verfahren der Erfindung
Die Zusammensetzungen (beispielsweise humane molekulare Antikörper gegen PSMA und Derivate/Konjugate davon) der vorliegenden Erfindung weisen in vitro und in vivo diagnostische und therapeutische Einsatzmöglichkeiten auf. So können diese Moleküle beispielsweise an Zellen in Kulturen verabreicht werden, beispielsweise in vitro oder ex vivo, oder an ein Subjekt, beispielsweise in vivo, um eine Vielzahl von Störungen zu behandeln, zu verhindern oder zu diagnostizieren. Wie hier verwendet, soll der Ausdruck "Subjekt" menschliche und nicht menschliche Tiere umfassen. Bevorzugte menschliche Tiere umfassen einen menschlichen Patienten mit einer Störung, welche durch eine Expression, gewöhnlich eine gestörte Expression, beispielsweise Überexpression) durch PSMA gekennzeichnet ist. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können beispielsweise dazu verwendet werden, ein Subjekt mit einer tumorigenen Störung zu behandeln, beispielsweise einer Störung, die durch die Anwesenheit von PSMA-exprimierenden Tumorzellen gekennzeichnet ist, einschließlich beispielsweise Prostata-, Darm- und Nieren- (Niere) Tumorzellen. Der Ausdruck "nicht-menschliche Tiere" der Erfindung umfasst alle Vertebraten, beispielsweise Säuger und Nicht-Säuger, wie nicht-menschliche Primaten, Schafe, Hund, Kuh, Hühner, Amphibien, Reptilien usw..
Die Zusammensetzungen (beispielsweise humane Antikörper, multispezifische und bispezifische Moleküle) der vorliegenden Erfindung können anfänglich auf deren Bindungsaktivität, welche mit einer therapeutischen oder diagnostizierten Verwendung assoziiert ist, in vitro untersucht werden. So können beispielsweise Zusammensetzungen der Erfindung unter Verwendung der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen ELISA- und strömungszytometrischen Assays untersucht werden. Darüber hinaus kann die Aktivität der Moleküle zum Auslösen von mindestens einer Effektor-vermittelten Effektorzell-Aktivität, einschließlich Zytolyse von PSMA-exprimierenden Zellen untersucht werden. Protokolle zum Untersuchen von Effektorzell-vermittelter Phagozytose sind in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
Die Zusammensetzungen (beispielsweise humane Antikörper, multispezifische und bispezifische Moleküle) der Erfindung weisen einen weiteren Nutzen in der Therapie und Diagnose von mit PSMA-assoziierten Erkrankungen auf. So können beispielsweise die humanen monoklonalen Antikörper, den multispezifischen oder bispezifischen Moleküle verwendet werden, um beispielsweise in vivo oder in vitro ein oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten hervorzurufen. Zum Opsonieren einer PSMA-exprimierenden Zelle; zur Vermittlung von Phagozytose oder Zytolyse einer PSMA-exprimierenden Zelle in Anwesenheit von humanen Effekorzellen; oder um das Wachstum einer PSMA-exprimieren den Zelle zu inhibieren.
In einer bestimmten Ausführungsform werden human Antikörper und Derivate davon in vivo verwendet, um eine Vielzahl von mit PSMA-assoziierten Erkrankungen zu behandeln, zu verhindern oder zu diagnostizieren. Beispiele für mit PSMA-assoziierte Erkrankungen umfassen eine Vielzahl von Krebsarten, wie Prostata-, Nieren- und Darm-Krebs.
Verfahren zur Verabreichung von Zusammensetzungen (beispielsweise humanen Antikörpern, multispezifischen und bispezifischen Molekülen) der Erfindung sind im Stand der Technik bekannt. Geeignete Dosisformen der verwendeten Moleküle hängen vom Alter und Gewicht des Subjekts und dem bestimmten verwendeten Arzneimittel ab. Die Moleküle können an Radionukleide gekoppelt werden, wie 131I, 90Y, 105Rh, usw., wie in Goldenberg, D. M. et al., Cancer Res. 41 (1981), 4354–4360 und in der EP 0 365 997 beschrieben. Die Zusammensetzungen (beispielsweise humane Antikörper, multispezifische und bispezifische Moleküle) der Erfindung können darüber hinaus an anti-infektiöse Mittel gekoppelt werden.
Ziel-spezifische Effektorzellen, beispielsweise Effektorzellen welche mit Zusammensetzungen (beispielsweise humanen Antikörpern, multispezifischen und bispezifischen Molekülen) der Erfindung verknüpft sind, können weiterhin als therapeutische Mittel eingesetzt werden. Effektorzellen zum Zielen können humane Leukozyten sein, wie Makrophagen, Neutrophile oder Monozyten. Andere Zellen beinhalten Eosinophile, natürliche Killerzellen und andere IgG- oder IgA-Rezeptor tragende Zellen. Wenn gewünscht, können die Effektorzellen von dem zu behandelten Subjekt erhalten werden. Die Ziel-spezifischen Effektorzellen können als eine Suspension von Zellen in einer physiologischen annehmbaren Lösung verabreicht werden. Die Anzahl an verabreichten Zellen kann in der Größenordnung von 10⁸–10⁹ liegen, wird jedoch in Abhängigkeit vom therapeutischen Zweck variieren. Im Allgemeinen wird die Menge ausreichend sein, um eine Lokalisierung an der Zielzelle zu erhalten, beispielsweise einer PSMA-exprimierenden Tumorzelle, und um ein Abtöten der Zelle zu bewirken, beispielsweise durch Phagozytose. Die Verabreichungswege können ebenfalls variieren.
Die Therapie mit Ziel-spezifischen Effektorzellen kann zusammen mit anderen Techniken zur Entfernung von Zielzellen durchgeführt werden. So kann beispielsweise eine Anti-Tumortherapie unter Verwendung der Zusammensetzungen (beispielsweise humane Antikörper, multispezifische und bispezifische Moleküle) der Erfindung und/oder unter Verwendung von mit diesen Zusammensetzungen bewaffneten Effektorzellen zusammen mit einer Chemotherapie durchgeführt werden. Darüber hinaus kann eine Kombinations-Immunotherapie verwendet werden, um zwei unterschiedliche zytotoxische Effektor-Populationen auf eine Tumor-Abstoßung zu lenken. So können beispielsweise anti-PSMA-Antikörper, welche an anti-FcγRI oder anti-CD3 gekoppelt wurden, zusammen mit IgG- oder IgA-Rezeptor-spezifischen Mitteln eingesetzt werden.
Bispezifische oder mutispezifische Moleküle der Erfindung können darüber hinaus eingesetzt werden, um FcγR- oder FcαR-Mengen auf Effektorzellen zu modulieren, wie durch Kappen ("Capping") und Eliminieren von Rezeptoren auf der Zelleoberfläche. Gemische von anti-Fc-Rezeptoren können für diesen Zweck ebenfalls eingesetzt werden.
Die Zusammensetzungen (beispielsweise humane Antikörper, multispezifische und bispezifische Moleküle) der Erfindung, welche komplementäre Verbindungsbereiche aufweisen, wie Bereiche von IgG1, -2, oder -3 oder IgM, welches Komplement bindet, können weiter in Anwesenheit von Komplement eingesetzt werden. In einer Ausführungsform kann eine ex vivo Behandlung einer Zellpopulation mit Zielzellen, mit einem Bindungsmittel der Erfindung und geeigneten Effektorzellen, ergänzt werden durch Zugabe von Komplement oder Komplement enthaltendem Serum. Eine Phagozytose von Zielzellen, die mit einem erfindungsgemäßen Bindungsmittel beschichtet sind, kann durch Binden von Komplement-Proteinen verbessert werden. In einer anderen Ausführungsform können mit den Zusammensetzungen (beispielsweise humane Antikörper, multispezifische und bispezifische Moleküle) der Erfindung beschichtete Zielzellen weiter mit Komplement lysiert werden.
Die Zusammensetzungen (beispielsweise humane Antikörper, multispezifische und bispezifische Moleküle) der Erfindung können gemeinsam mit Komplement verabreicht werden. Infolgedessen sind im Bereich der Erfindung Zusammensetzungen welche humane Antikörper, multispezifische oder bispezifische Moleküle und Serum oder Komplement umfassen. Diese Zusammensetzungen sind daher vorteilhaft, da das Komplement in naher Nachbarschaft zu den humanen Antikörpern, den multispezifischen oder bispezifischen Molekülen vorhanden sind. Alternativ können die humanen Antikörper, die multispezifischen oder bispezifischen Molekülen der Erfindung und das Komplement oder das Serum getrennt verabreicht werden.
Ebenfalls im Bereich der Erfindung sind Kits, welche Zusammensetzungen (beispiels weise humane Antikörper, multispezifische oder bispezifische Moleküle) der Erfindung und die Instruktionen zur Verwendung enthalten. Der Kit kann mindestens ein weiteres Reagenz enthalten, wie Komplement, ein oder mehrere weitere humane Antikörper der Erfindung (beispielsweise ein humaner Antikörper mit einer komplementären Aktivität, welcher an ein Epitop im PSMA-Antigen bindet, welches unterschiedlich ist von dem des ersten humanen Antikörpers).
In anderen Ausführungsformen kann das Subjekt weiter mit einem Mittel behandelt werden, das die Expression oder Aktivität von Fcγ- oder Fcα-Rezeptoren moduliert, verstärkt oder inhibiert, indem das Subjekt zum Beispiel mit einem Zytokin behandelt wird. Bevorzugte Zytokine zur Verabreichung während der Behandlung mit dem multispezifischen Molekül umfassen Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Interferon-γ (IFN-γ), und Tumor Nekrose Faktor (TNF).
Die Zusammensetzungen (beispielsweise humane Antikörper, multispezifische oder bispezifische Moleküle) der Erfindung können darüber hinaus eingesetzt werden, um FcγR- oder PSMA-exprimierenden Zielzellen zu leiten, beispielsweise zu Markierung derartiger Zellen. Für einen derartigen Einsatz kann das Bindungsmittel mit einem Molekül verknüpft sein, welches erfaßt werden kann. Die Erfindung liefert demnach Lösungen zur Lokalisierung von Zellen in vivo oder in vitro, welche Fc-Rezeptoren exprimieren, wie FcγR oder PSMA. Der nachweisbare Marker kann beispielsweise ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder eine Enzym-Cofaktor sein.
In einer Ausführungsform liefert die Erfindung Verfahren zur Erfassung der Anwesenheit von PSMA-Antigenen in einer Probe, oder zum Messen der Menge an PSMA-Antigenen, welches umfasst, InKontaktbringen der Probe und einer Kontroll-Probe mit einem humanen monoklonalen Antikörper oder einem Antigen-bindenden Bereich davon, welches spezifisch an PSMA bindet, unter Bedingungen, welche die Bindung eines Komplexes zwischen dem Antikörper, oder dem Bereich davon, und PSMA ermöglicht. Die Bildung eines Komplexes wird dann erfaßt, wobei eine unterschiedliche Komplexbildung zwischen der Probe im Vergleich zur Kontroll-Probe die Anwesenheit von PSMA-Antigen in der Probe anzeigt.
In einer noch weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder der Quantifizierung der Menge an Fc-exprimierenden Zellen in vivo oder in vitro. Das Verfahren umfasst (i) Verabreichen einer Zusammensetzung (beispielsweise eines multispezifischen oder bispezifischen Moleküls) der Erfindung oder eines Fragments davon an ein Subjekt, welches mit einem nachweisbaren Marker konjugiert ist, (ii) Aussetzen des Subjekts an ein Mittel zur Erfassung des nachweisbaren Markers um Bereiche mit Fc-exprimierenden Zellen zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, welche nicht als weiter begrenzend angesehen werden sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Erstellung von auf Cmu zielorientierten Mäusen zur Herstellung von humanen anti-PSMA Antikörpern
Konstruktion eines auf CMD zielorientierten Vektors
Das Plasmid pICEmu enthält ein EcoRI/XhoI-Fragment des Maus schwere Ketten Ig-Lokus, welche das mu-Gen überspannt, welches von einer genomischen Lambda-Phagenbank von Balb/C erhalten wurde (Marcu et al., Cell 22 (1980), 187). Dieses genomische Fragment wurde in die XhoI/EcoRI Stellen des Plasmids pICEMI9H (Marsh et al., Gene 32 (1984), 481–485,) subkloniert. Die in pICEmu enthaltenen Sequenzen der schweren Kette erstrecken sich stromabwärts der EcoRI-Stelle, die 3' des mu intronischen Verstärkers angeordnet ist, bis zur XhoI-Stelle, welche 1 kb stromabwärts des letzten Transmembran-Exon des mu-Gens angeordnet ist. Ein Großteil der mu-Umschaltungs-Wiederholregion wurde jedoch durch Weitergabe in E. coli entfernt.
Der Zielvektor wurde wie folgt erstellt (siehe 1). Ein 1,3 kb HindIII/SmaI-Fragment wurde aus pICEmu herausgeschnitten und in einen HindIII/SmaI verdauten pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert. Dieses pICEmu-Fragment erstreckt sich von der HindIII-Stelle, welche etwa 1 kb 5' von Cmu1 angeordnet ist, zur SmaI-Stelle, welches sich innerhalb Cmu1 befindet. Das so erhaltene Plasmid wurde mit SmaI/SpeI verdaut und das etwa 4 kb große SmaI/XbaI Fragment aus pICEmu, welches sich von der SmaI-Stelle in Cmu1 3' von der XbaI-Stelle gerade stromabwärts des letzten Cmu-Exons befindet, wurde inseriert. Das so erhaltene Plasmid pTAR1 wurde an der SmaI-Stelle linearisiert und eine Neo-Expressions-Kassette wurde inseriert. Diese Kassette besteht aus dem Neo-Gen, welches sich unter der transkriptionellen Steuerung des Maus- Phosphoglycerat-Kinase(pgk)-Promotors (XbaI/TaqI-Fragment; Adra et al., Gene 60 (1987), 65–74) befindet und die pgk-Polyadenylierungsstelle enthält (PvuII/HindIII-Fragment; Boer et al. Biochemical Genetics 28 (1990), 299–308). Diese Kassette wurde aus dem Plasmid pKJI (beschrieben von Tybulewicz et al., Cell 65 (1991), 1153–1163) erhalten, aus dem die Neo-Kassette als ein EcoRI/HindIII-Fragment herausgeschnitten wurde und in einen mit EcoRI/HindIII verdauten pGEM-7Zf(+) subkloniert wurde, um pGEM-7f (KJI) zu bilden. Die Neo-Kassette wurde aus pGEM-7 (KJI) durch EcoRI/SalI-Verdau herausgeschnitten, die Enden wurden glatt gemacht und die Kassette wurde in die SmaI-Stelle des Plasmids pTARI in der entgegengesetzten Richtung der genomischen Cmu-Sequenzen subkloniert. Das so erhaltene Plasmid wurde mit NotI linearisiert und eine Herpes Simplex Virus Thymidinkinase(tk)Kassette wurde inseriert, um eine Anreicherung von ES-Klonen mit homologen Rekombinanten, wie von Mansur et al. Nature 336 (1988), 348–352 beschrieben, zu erhalten. Diese Kassette besteht aus den kodierenden Sequenzen des tk-Gens, welche eingeklammert sind von dem Maus-pgk-Promoter und der Polyadenylierungs-Stelle, wie von Tybulewicz et al. Cell 65 (1991) 1153–1163) beschrieben werden. Der CMD-Zielvektor weist insgesamt etwa 5,3 kb Homologie zu dem Lokus der schweren Kette auf und ist ausgestaltet, ein mutiertes mu-Gen zu erzeugen, in das eine Neo-Expressions-Kassette in der einzigen SmaI-Stelle des ersten Cmu-Exons inseriert wurde. Der Zielvektor wurde mit PvuI vor Elektroporation in ES Zellen linearisiert, welches innerhalb Plasmid Sequenzen schneidet.
Generierung und Analyse von Ziel-ES-Zellen
AB-1 ES Zellen (McMahon. A. P. und Bradley, A., Cell 62 (1990), 1073–1085) wurden auf methodisch inaktiven SNL76/7 Zell Nährstoffschichten (ibid) im Wesentlichen wie beschrieben (Robertson, E. J. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press (1987), 71–112) gezüchtet. Der linearisierte CMD-Zielvektor wurde durch Elektroporation in AB-I Zellen mit den von Hasty et al. (Hasty, P. R. et al., Nature 350 (1991), 246) beschriebenen Verfahren eingebracht. Elektroporierte Zellen wurden in 100 mm Schalen in einer Dichte von 1–2 × 10⁶ Zellen/Schale ausplattiert. Nach 24 Stunden wurden G418 (200 μg/ml aktive Verbindung) und FIAU (5 × 10^–7 M) zu dem Medium zugesetzt, und Stoff-resistente Klone konnten sich über 8–9 Tage entwickeln. Die Klone wurden herausgenommen, trypsinisiert, in zwei Teile aufgeteilt und weiter expandiert. Die Hälfte der von jedem Klon abgeleiteten Zellen wurde dann eingefroren während die andere Hälfte auf homologe Rekombination zwischen Vektor und Zielsequenz untersucht wurde. Eine DNA-Analyse wurde durch Southern Blot-Hybridisierung durchgeführt. DNA wurde aus den Klonen, wie von Laird et al. (Laird. P. W. et al., Nucleic Acids Res., 19 (1991), 4293) beschrieben, isoliert. Isolierte gnomische DNA wurde mit SpeI verdaut und mit einem 915 bp SacI-Fragment, Sonde A (siehe 1), untersucht, welches an eine Sequenz zwischen dem intronischen mu-Verstärker (Enhancer) und dem mu-Umschaltbereich hybridisiert. Die Sonde A erfaßt ein 9,9 kb SpeI-Fragment des Wildtyp-Lokus und eine diagnostische 7,6 kb-Bande von einem mu-Lokus, welcher mit dem CMD-Zielvektor homolog rekombiniert hat (die Neo-Expressions Kassette enthält eine SpeI-Stelle). Von 1132 G418 und FIAU resistenten Klonen, welche mittels Southern-Blot-Analyse gemustert wurden, zeigten 3 7,6 kb SpeI-Bande, welche homologe Rekombination am mu-Lokus anzeigt. Diese 3 Klone wurden mit den Enzymen BglI, BstXI und EcoRI weiter verdaut, um sicher zu stellen, dass sich der Vektor homolog in das mu-Gen inserierte. Bei Hybridisierung mit Sonde A zeigen Southern Blots von Wildtyp-DNA, die mit BglI, BstXI, oder EcoRI verdaut wurde, Fragmente mit 15,7, 7,3 und 12,5 kb, wobei die Anwesenheit eines zielorientierten mu-Allels durch die Fragmente 7,7, 6,6 und 14,3 kb angezeigt wird. Alle drei positiven Klone, welche durch die SpeI-Verdauung erfasst wurden, zeigten die erwarteten BglI, BstXI und EcoRI Restriktions-Fragmente, welche eine Insertion auf der Neo Kassette in das Cmu1-Exon anzeigt.
Generierung von Mäusen mit dem mutierten mu-Gen
Die drei Ziel-ES-Klone welche mit den Nummern 264, 272 und 408 bezeichnet wurden, wurden aufgetaut und in C57BL/6J Blastozysten wie von Bradley beschrieben (Bradley, A. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson hrsg.) Oxford: IRL Press, p. 113–151) injiziert. Injizierte Blastozysten wurden in die Uteri von pseudo-schwangeren Weibchen überführt, um chimäre Mäuse zu erzeugen, welche ein Gemisch von Zellen darstellen die von den eingebrachten ES-Zellen und Wirts-Blastozysten abgeleitet sind. Das Ausmaß der ES-Zell-Verteilung in den Chimären kann durch das Ausmaß von Agouti-Fellfärbung eingeschätzt werden, welche von der ES-Zelllinie auf den schwarzen C57BL/6J Hintergrund abgeleitet ist. Die Klone 272 und 408 brachten nur einen geringen Prozentsatz von Chimäre hervor (d.h. einen geringen Prozentsatz von Agouti-Pigmentierung) wobei Klon 264 männliche Chimäre in einem hohen Prozentsatz hervor brachte. Diese Chimären wurden mit C57BL/6J-Weibchen gekreuzt und Agouti-Nachkommen wurden gezeugt, was die Keimbahn-Übertragung des ES-Zellgenoms anzeigt. Eine Durchmusterung nach dem Ziel-mu-Gen wurde mittels Southern Blot Analyse der mit BglI verdauten DNA von Schwanz-Biopsien durchgeführt (wie vorstehend für die Analyse von ES-Zell-DNA beschrieben). Etwa 50% der Agouti-Nachkommen zeigte eine hybridisierende BglI-Bande von 7,7 kb zusätzlich zu der Wildtyp-Bande von 15,7 kb, was eine Keimbahnübertragung des Ziel-mu-Gens zeigt.
Analyse von Transgenen Mäusen auf funktionelle Inaktivierung des mu-Gens
Um zu bestimmen, ob die Insertion der Neo-Kassette in Cmu1 das Ig-Gen der schweren Kette inaktivierte, wurde eine Chimäre des Klons 264 mit einer Maus gekreuzt, welche für die JHD-Mutation homozygot war, wobei die Expression der schweren Kette als Ergebnis der Deletion der JHD-Genseqeumente inaktiviert wird (Chen et al., Immunol 5 (1993), 647–656). Vier Agouti-Nachkommen wurden gezeugt. Im Alter von einem Monat wurde von diesen Tieren Serum erhalten und mittels ELISA auf die Anwesenheit von Maus-IgM untersucht. Zwei von vier Nachkommen fehlte IgM vollständig (siehe Tabelle 1). Eine Genotypisierung der vier Tiere mittels Southern Blot-Analyse von DNA durch Schwanz-Biopsien durch BglI-Verdau und Hybridisierung mit Sonde A (siehe 1) und mittels StuI-Verdau und Hybridisierung mit einem 475 bp EcoRI/StuI-Fragment (ibid.) zeigte, dass die Tiere, welche kein IgM im Serum aufwiesen jene sind, in denen ein Allel des Lokus der schweren Kette die JHD-Mutation beinhaltet, während das andere Allel die Cmu1-Mutation beinhaltet. Mäuse, welche für JHD-Mutation heterozygot waren, zeigten Wildtyp-Mengen an Serum Ig. Diese Daten zeigen, dass die Cmu1-Mutation die Expression des mu-Gens inaktiviert.
Tabelle 1
Die Tabelle 1 zeigt Serum IgM-Menge, welche mittels ELISA erfasst wurden, für Mäuse, welche die CMD- und die JHD-Mutation tragen (CMD/JHD), für Mäuse, welche für die JHD-Mutation heterozygot sind (+/JHD), für Wildtyp-Mäise (129Sv × C57BL/6J)F1 (+/+) und für Mäuse, denen B-Zellen fehlen und die homozygot für die JHD-Mutation (JHD/JHD) sind.
Beispiel 2: Erzeugung von transgenen HCO12-Mäusen zur Herstellung von humanen anti-PSMA Antikörpern
Das Humane HCO12 Transgen der schweren Kette
Das HCO12-Transgen wurde durch gleichzeitige Injektion des 80 kb-Inserts von pHC2 Taylor et al., Int. Immunol., 6 (1994), 579–591) und dem 25 kb Insert von pVx6 erzeugt. Das Plasmid pVx6 wurde wie nachstehend beschrieben hergestellt.
Ein 8,5 kb HindIII/SalI DNA-Fragment, welches das Humane Keimbahngen VHI-18 (DP-14) zusammen mit etwa 2,5 kb von 5' angrenzenden, und 5 kb von 3' angrenzenden genomischen Sequenzen umfasst, wurde in den Plasmidvektor pSP72 (Promega, Madison, WI) subkloniert, um das Plasmid p343.7.16 zu erzeugen. Ein 7 kb BamHI/HindIII-DNA-Frament, welche das humane Keimbahn-Gen VH5-51 (DP-73) zusammen mit etwa 5 kb von 5' angrenzenden und 1 kb von 3' angrenzenden genomischen Sequenzen umfasst, wurde in den auf den Plasmid pBR322 basierenden Klonierungsvektor pGPIf (Taylor et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), 6287–6295) kloniert, um das Plasmid p25Ifzu erzeugen. Ein neuer, von pGPIf abgeleiteter Klonierungsvektor, pGPIk, wurde mit EcoRV/BamHI verdaut und an ein 10 kb EcoRV/BAmHI DNA-Fragment ligiert, welches das humane Keimbahn-Gen VH3-23 (DP47) zusammen mit etwa 4 kb von 5' angrenzender und 5 kb von 3' angrenzender genomischen Sequenzen umfasst. Das so erhaltene Plasmid p112.2RR, wurde mit BamHI/SalI verdaut und mit dem gereinigten 7 kb BamHI/SalI Insert p25If ligiert. Das so erhaltene Plasmid pVx4 wurde mit XhoI verdaut und mit dem XhoI/SalI Insert von p343.7.16 ligiert.
Ein Klon wurde mit dem Gen VHI-18 erhalten, welches in der gleichen Orientierung vorlag, wie die anderen zwei V-Gene. Dieser Klon, als pVx6 bezeichnet, wurde mit NotI verdaut und das gereinigte 26 kb Insert zusammen mit dem gereinigten 80 kb NotI Insert von pHC2 in einem Molverhältnis von 1:1 in die Pronuklei von einem halben Tag alten (C57BL/6J × DBA/2J)F2 Embryos, wie von Hogan et al. beschrieben (B. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual., 2^nd Edition, 1994, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Plainview NY) injiziert. Drei unanhängige Linien transgener Mäuse, welche Sequenzen von Vx6 und HC2 enthielten, wurden von Mäusen erstellt, die sich aus den injiziierten Embryos entwickelten. Diese Linien wurden (HCO12)14881, (HCO12)15083 und (HCO12)15087 bezeichnet. Jede der drei Linien wurde dann mit Mäusen gekreuzt, welche die CMD-Mutation, welche in Beispiel 1 beschrieben wurde, die JKD-Mutation (Chen et al. EMBO J. 12 (1993), 811–820) und das (KCo5)9272-Transgen (Fishwild et al., Nature Biotechnology 14 (1996), 845–851) enthielten. Die so erhaltenen Mäuse exprimieren humane Immunglobulin Gene der schweren und leichten Kappa-Kette in einem Hintergrund, welcher für die Zerstörung der Maus-Loci für die schweren und leichten Kappa-Kette homozygot ist.
Beispiel 3: Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern und bispezifischen Molekülen gegen PSMA
Humane monoklonale anti-PSMA-Antikörper wurden durch Immunisieren der HCO7- und HCO12-Stämme von HuMAb-Mäusen mit PSMA-Antigen erzeugt, welches von PSMA exprimierenden LNCaP-Zellen gereinigt wurde, und/oder von einer Roh-Membran Zubereitung von LNCaP Zellen.
HCO7 HuMAb-Mäuse wurden wie in den US-P-5,770,429 und 5,545,806 beschrieben erzeugt.
So wurden insbesondere HCO7 und HCO12 Mäuse anfänglich mit Antigenen immunisiert, welche in vollständigem Freund's Adjuvans emulgiert waren. In nachfolgenden Immunisierungen wurden die Antigene mit unvollständigem Freund's Adjuvans vermischt. Schließlich wurde vor der Entnahme der Milz eine intravenöse Verabreichung von Antigenen mit gereinigtem Antigen ohne Adjuvans durchgeführt. Die Mäuse wurden jede 2–3 Wochen immunisiert. Nach der dritten und den folgenden Immunisierungen wurde der humane IgG anti-PSMA Titer mittels ELISA, (wie nachstehend beschrieben) bestimmt. Mäusen, welche eine anti-PSMA IgG-Antwort entwickelt, wurden gereinigtes Antigen i.v. währen drei Tage und auch drei und vier Tage vor der Entnahme der Milz verabreicht. Die Milz der entsprechenden Mäuse wurde entnommen und in einzelne Zellen dispergiert.
Um anti-PSMA-Antikörper herstellende Hybridoma zu erzeugen wurden Milzzellen aus Mäusen, welche im Plasma anti-PSMA Antikörper aufwiesen, mit P3X63-Ag8.653 Zellen (hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 1580, nicht sekretierende Maus-Myelom Zellen) und PEG fusioniert. Nach Auswachsen der Hybridoma (etwa 10–14 Tage) wurde jede, Hybridom enthaltene Vertiefung auf die Herstellung von humanen IgG unter Verwendung eines anti-Mensch IgG-ELISA durchmustert.
Positive Hybridoma wurden durchmustert und auf die folgenden Eigenschaften selektiert: (1) Herstellung von humanen IgG1κ-Antikörpern, (2) Binden an gereinigtes PSMA, und (3) Binden an PSMA-exprimierende Tumorzellen. Eine DNA-Sequenz-Analyse bestätigte, dass die Anti-PSMA-Antikörper durch V(D)J Umlagerungen der humanen Immunoglobulin-Transgene kodiert wurden.
In Kürze, ein auf einem Festphasen-ELISA basierender Assay wurde für die Analyse von humanen anti-PSMA-Antikörper eingesetzt. Über Immunoaffinität gereinigtes PSMA von LNCaP-Zellen wurde auf Maxi-Sorp Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Rochester, NY) beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden dann mit PBS-0,2% Tween-20 gewaschen und mit 5% Kälberserumalbumin in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. In die Vertiefungen wurden die Überstände aus dem anti-PSMA herstellenden Hybridom (50 μl) oder gereinigter Antikörper (1–5 μg/ml in PBS) gegeben und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden mit PBS/Tween wie vorstehend gewaschen und dann mit 50 μl von HRP-konjugiertem Kaninchen-anti-Mensch IgG (1:5000; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurde in jede Vertiefung 100 μl ABTS (150 mg 2,2'-Azino-bis-3-ethylbezthiazolin-6-sulfonsäure in 500 ml 0,1 M Zitronensäure, pH 4.35)/H₂O₂ (10 μl) 30% H₂O₂ pro 10 ml von ABTS Lösung) Chromagen/Substrat-Lösung gegeben, und die Proben wurden mit einem Mikroplatte-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 405 nm gelesen.
Hybridoma, welches humanes IgG produzierten, das bei ELISA an PSMA band, wurden weiter mittels ELISA und Strömungszytometrie auf Isotypen untersucht, welche an PSMA-exprimierenden Tumorzellen binden und auf fehlendes Binden an PSMA-negative Zellen, wie nachstehend beschrieben. Hybridoma mit Überständen, welche diese Eigenschaften aufwiesen, wurden subkloniert und deren Antikörper wurden nach Aufreinigung weiter charakterisiert.
Monoklonale Antikörper wurden aus einem Zellmax Bioreaktor (Cellco, Laguna Hills, CA) unter Verwendung von HyQ-CCMI Medium mit 1 bis 5% Fetaclone (Hyclone, Logan, UT) isoliert und mittels Chromatographie über eine Protein-G-Agarosesäule gemäß den Vorschriften des Herstellers (KPL; Gaithersburg, MD) gereinigt.
Gereinigte monoklonale Antikörper wurden ausgiebig gegen 0,3 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9,5, dialysiert, um diese mit fluoreszierendem Isothiocyanat (FITC) zu markieren. Eine Vorrats-FITC-Lösung wurde durch Auflösen von 1 mg festem FITC in 1 ml DSMO hergestellt. Das Vorrats-FITC wurde unter konstantem Rühren tropfenweise in einer Menge zugesetzt, um 50 μg FITC pro mg Antikörperprotein zu liefern. Nach Zugabe von FITC wurde die Lösung in der Dunkelheit 1–3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Mit FITC markierte Antikörper wurden mittels Gelfiltration auf einer Sephadex G-10 Säule, welche in PBS equilibriert wurde, isoliert.
Mehrere Hybridoma, welche durchmustert wurden, stellten humane IgG1κ-Antikörper her, welche spezifisch an PSMA binden, wie mittels ELISA und Strömungszytometrie (beispielsweise 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 und 16F9) bestimmt. Aus dem Überstand des Hybridoms 8C12 gereinigte monoklonale Antikörper, welche eine starke Bindung an PSMA, wie mittels ELISA erfasst, zeigten wurden mit einer spezifischen Bindungsaffinität von ≥ 10^–9 charakterisiert.
Bispezifische Moleküle, welche als 14.1 × 8C12 (wie in 3 gezeigt) und 14A8 × 8C12 bezeichnet wurden, wurden durch chemische Konjugierung des Fab'₂-Fragments aus dem humanen anti-CD89 Antikörper 14.1 oder einem Subclon des 14.1-Antikörpers, der als 14A8 bezeichnet wurde, und dem humanen anti-PSMA-Antikörper 8C12 über Disulfidbrücken unter Verwendung von Standardvernetzungsverfahren hergestellt.
Beispiel 4: Charakterisierung von humanen monoklonalen Antikörpern gegen PSMA
I. Binden von humanen anti-PSMA-Antikörper an Tumorzellen
Aus Hybridoma-Überständen gereinigte monoklonale Antikörper, welche ein starkes Binden an PSMA, wie mittels ELISA erfasst, zeigten (beispielsweise 4A3, 7F12, 8A11, (C12 und 16F9) wurden weiter auf deren Fähigkeit an Tumorzellen zu binden, welche hohe Mengen an PSMA exprimieren, untersucht.
Die Bindungseigenschaften von humanen, spezifischen anti-PSMA-Antikörpern wurden mittels Festphasen-ELISA unter Verwendung von Plasmamembran-Fraktionen untersucht, welche von LNCaP und PC3-Zellen abgeleitet wurden. Um Zellmembran-Fraktionen von LNCaP und PC3-Zellen herzustellen, wurden die Zellen von Kunststoffschalen abgekratzt, ausgiebig in PBS gewaschen, und in 10 Volumina deionisiertem Wasser resuspendiert und mittels drei Schläge mit einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Die Membranfraktion wurde durch Zentrifugation bei 15.000 × g für 45 Minuten isoliert und das Pellet in PBS resuspendiert. Die Proteinkonzentration des Membranpellets wurde unter Verwendung des Pierce-(Rockford, IL)-BSA-Kits bestimmt.
LNCaP und PC3-Membranfraktionen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen seriell verdünnt und luftgetrocknet. Die Platten wurden mit 5% BSA blockiert und mit 5 μg/ml humanem anti-PSMA-Antikörper in PBS für eine Stunde behandelt, bevor unter Verwendung von Standard-ELISA-Verfahren, wie vorstehend beschrieben, die Erfassung durchgeführt wurde. Die in 4 gezeigten Ergebnisse zeigen, die Ergebnisse für die unabhängigen humanen monoklonalen Antikörper. Diese Antikörper zeigen eine hohe Spezifität für LNCaP-Zellmembranen über einen Bereich von Antigen-Konzentrationen, während es nur geringe oder gar keine Antikörper-Bindung über dem Hintergrund an PC3-Zellen Membranen gab.
Darüber hinaus wurde eine Bindung von humanem anti-PSMA-Antikörper an lebende LNCaP- und PC3-Tumorzellen mittels Strömungszytometrie untersucht. In Kürze, Tumorzellen wurden aus Gewebekultur frisch geerntet und eine Einzelzell-Suspension wurde hergestellt. Etwa 1 Mio. Zellen wurden in PBS mit 0,5% BSA resuspendiert und mit 50–200 μg/ml FITC markierten humanen anti-PSMA-Antikörper für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden zwei Mal mit PSMA 0,1% BSA, 0,01% NaN₃ gewaschen und auf Fluoreszenzfärbung auf einem FACS Calibur-Zytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA) mit der Cellquest Akquisition Software analysiert. Wie in 5 gezeigt, zeigten die humanen PSMA-Antikörper 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 und 16F9 eine starke spezifische Bindung an lebende LNCaP-Zellen, welche PSMA exprimieren. Im Gegensatz dazu wurde bei PC3-Zellen eine negative Färbung verzeichnet, oder, wenn ein Isotypen-passender, irrelevanter humaner Antikörper eingesetzt wurde, bei LNCaP.
Das bispezifische Molekül 14.1 × 8C12 wurde ebenso unter Verwendung vergleichbarer Assays auf die Fähigkeit untersucht, an PSMA-exprimierende LNCaP-Zellen (6) und CD89-exprimierende U937 Zellen (7) zu binden. Wie in den 6 und 7 gezeigt, bindet das bispezifische Molekül ein LNCaP und U937 Zellen in einer Dosis-abhängigen Art und Weise.
II. Bindungsspezifität für humane anti-PSMA-Antikörper
Die Bindungsspezifität für anti-PSMA-Antikörper 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 und 16F9 wurde weiter durch Immunausfällung von Protein-Lysaten aus LNCaP-Zellen untersucht. In Kürze, ein Detergens-Lysat von LNCaP-Zellen wurde durch Zusetzen von PBS mit 1% NP-40 zu LNCaP-Zellen hergestellt, dieses für 1 Stunde inkubiert, gefolgt von Zentrifugation zur Entfernung von teilchenförmigen Material. Das Lysat wurde vorgeklärt, indem 150 μg irrelevantes humanes IgG1 pro ml Lysat zugesetzt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde, gefolgt von der Zugabe von 150 μl gepackten Protein-G-Sepharose Kügelchen pro ml Lysat. Die Überstandfraktion wurde nach Zentrifugation zur Entfernung der Kügelchen eingesetzt.
Aliquots (100 μl) des vorgeklärten LNCaP-Zelllysats wurde mit 5 μg eines einzelnen humanen anti-PSMA-Antikörpers vermischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Kügelchen wurden ausgiebig mit PBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe von SDS-Probenpuffer. Die gebundenen Immunkomplexe wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und auf PVDF-Membranen für Western Blot Analyse überführt. Die Membranen wurden über Nacht in TBS/5% Fett-reduzierter Milch blockiert und mit dem für das lineare Maus PSMA-Sequenz-Epitop spezifischen Antikörper 4D8, 5 μg/ml in TBS für 1 Stunde inkubiert. Blots wurden 5 Mal mit TBS gewaschen, welche 0,5% Tween-20 (TBS-T) enthielten und mit HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus IgG (1:5000) inkubiert. Nach fünf Waschungen mit TBS-T wurden die Blots unter Verwendung des chemilumineszenten LumiGlo Substrat Kits (KPL, Gaithersburg, MD) entwickelt und durch Aussetzen an Röntgenstrahl-Filme sichtbar gemacht. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Die Identitäten von PSMA und PSM', eine alternative Spleißvariante, der die ersten 57 Aminosäureste des N-Terminus fehlt, sind durch die Pfeile angegeben. Spur 1 zeigt einer Western-Blot-Reaktivität von PSMA und PSM', welche in dem LNCaP-Zelllysat vorhanden ist; Spur 2 zeigt die Ergebnisse der Immunausfällung mit einem Isotyp-angepassten (IgG1) irrelevanten Antikörper; die Spuren 3 bis 7 zeigen die Ergebnisse der Immunausfällungen mit den Antikörpern 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 und 16F9. In jedem Fall werden intensive Banden, welche PSMA und PSM' entsprechen, verzeichnet, was zeigt, dass diese Antikörper an der extrazellulären Domäne des Proteins vorhandene Proteinepitope binden, eine Region, welche die Aminosäurereste 44–750 überspannt.
Eine Antikörperbindung an natives und Hitze-denaturiertes PSMA wurde untersucht, um die Bedeutung der Proteinkonformation bei der Bindungsspezifität zu bestimmen. Ein Aliquot von über Immunoaffinität gereinigtem PSMA aus LNCaP-Zellen (40 μg/ml in PBS) wurde durch Kochen für 10 Minuten Hitze-denaturiert und auf Eis gekühlt. Das Hitze-denaturierte PSMA und ein identisches Aliquot von nicht-denaturiertem PSMA wurde 1:4 in PBS verdünnt, in die Vertiefungen einer Maxi-Sorb Platte (Nunc) mit 96 Vertiefungen gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach Beschichten wurden die Platten mit 5% BSA in PBS für 1 Stunde blockiert, in PBS gewaschen, und einem Sandwich ELISA unter Verwendung der humanen anti-PSMA-Antikörper unterworfen. Der monoklonale anti-PSMA-Antikörper 7E11, welcher für ein Epitop aus den ersten 6 Aminosäuren des N-Terminus des Proteins spezifisch ist, wurde als positive Kontrolle eingesetzt. Wie in 9 gezeigt wies eine Hitzedenaturierung keinen Einfluß auf die Bindung des 7E11 Antikörpers auf, was mit dessen Erkennung eines linearen Sequenzepitops übereinstimmt. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen binden die humanen anti-PSMA-Antikörper 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 und 16F9 alle stark an natives gereinigtes PSMA, während eine Hitzedenaturierung von PSMA im wesentlichen Antikörperbindung verhinderte. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine native Proteinkonformation für eine Bindung des humanen anti-PSMA-Antikörpers erforderlich ist. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis ist, dass die Antikörper 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 und 16F9 bei dem Nachweis von PSMA in einer Western-Blot Analyse nicht wirksam waren.
III. Kompetitive Antikörper-Bindungs-Studien
Kompetitive Antikörper-Bindungs-Studien wurden unter Verwendung von Strömungszytometrie-Analyse durchgeführt, um zu bestimmen, ob die einzelnen humanen anti-PSMA-Antikörper auf PSMA an ähnliche oder unterschiedliche Epitope binden. In diesen Experimenten wurde die Fähigkeit von nichts-markierten anti-PSMA-Antikörpern zur Blockierung der Bindung von mit FITC markiertem anti-PSMA-Antikörpern an LNCaP Zellen untersucht. Die Intensität der FITC-Markierung von LNCaP-Zellen wurde durch Strömungzytometrie bestimmt.
Aliquots von etwa 1 Mio. LNCaP-zellen wurden mit 200 μg/ml gereinigtem, humanem anti-PSMA-Antikörper oder irrelevanten humanen IgG1-Antikörper in PBS für 1 Stunde auf Eis vorbehandelt. Die Zellen wurden ausgiebig gewaschen und weiter mit 50 μg/ml FITC-konjugiertem, humanem anti-PSMA-Antikörper (oder in einigen Experimenten mit FITC-konjugiertem Maus-PSMA-spezifischem Antikörper, beispielsweise 1G9, 3C6 und 4D4) für 1 Stunde auf Eis weiter inkubiert. Nach Waschen wurden die Zellen mit 10 μg/ml Propidiumiodid gefärbt und mittels Strömungszytometrie auf einem FACS-Calibur mit der CellQuest Software analysiert.
Wie in 10 gezeigt, wurde eine starke Bindung der mit FITC markierten, humanen anti-PSMA-Antikörper in jedem Fall bei LNCaP-Zellen verzeichnet, welche mit irrelevanten humanen IgG1 vorbehandelt wurden. Im Gegensatz dazu führte eine Vorbehandlung mit einzelnen humanen anti-PSMA-Antikörpern in jedem Fall zu einer erheblichen Inhibierung der nachfolgenden Bindung von mit FITC markierten, humanen anti-PSMA-Antikörpern. Eine leichte Änderung des Ausmaßes der Inhibierung der Bindung wurde mit unterschiedlichen Antikörperpaarungen verzeichnet. So inhibiert beispielsweise 8012 wirksam eine Bindung von 8A11 und 8C12, weist jedoch eine geringere Auswirkung auf 7F12 auf. Zusammenfassend suggerieren diese Daten, dass das kompetitive Bindungsverhalten von 7F12 und 16F9 mit anderen humanen anti-PSMA-Antikörpern sehr ähnlich ist. Insgesamt scheint es, dass die einzelnen humanen anti-PSMA-Antikörper leicht unterschiedliche, jedoch nah beieinander liegende Konformations-Epitope auf PSMA erkennen.
Kompetitive Antikörper-Bindungs-Studien wurden weiter unter Verwendung einer kleinen Gruppe an spezifischen Maus-PSMA-Antikörpern durchgeführt, welche als 1G9, 3C6 und 4D4 bezeichnet wurden, welche auch gegen Konformations-Proteinepitope gerichtet sind, um zu bestimmen, ob die humanen anti-PSMA-Antikörper die gleichen Epitope wie die Maus-Antikörper erkennen. Wie in 11 gezeigt, führte eine Vorbehandlung mit LNCaP-Zellen mit einzelnen humanen anti-PSMA-Antikörpern gefolgt von Markierungen mit entweder FITC-Maus 4D4 und 1G9 zu keiner oder keiner offensichtlichen Inhibierung. Im Gegensatz dazu wurde eine starke Inhibierung der Bindung von FITC-Maus 3C6 durch die humanen anti-PSMA-Antikörper 7F12, 8A11, 8C12 und 16F9 verzeichnet, was anzeigt, dass jeder dieser Antikörper an ein ähnliches oder nahe liegendes Epitop, wie von 3C6 erkannt, bindet. Keine Inhibierung von mit FITC markierten Maus-Konformations-Antikörpern wurde mit dem humanen anti-PSMA-Antikörper 4a3 verzeichnet, was darauf hindeutet, dass dieses an ein Epitop bindet, welches unterschiedlich ist von dem Maus 1G9, 3C6 und 4D4.
Beispiel 5: Aktivität von humanen anti-PSMA-Antikörpern
I. Inhibierung des Wachstums humaner Tumorzellen unter Verwendung von humanen anti-PSMA-Antikörpern und bispezifischen Molekülen.
Anti-PSMA-Antikörper und bispezifische Moleküle, welche, wie vorstehend gezeigt, eine spezifische Bindung an PSMA zeigen, können auf die Fähigkeit zur Inhibierung des Wachstums von PSMA-exprimierenden, humanen Tumorzellen untersucht werden. In Kürze, gereinigte Antikörper können mit den Tumorzellen unter normalen Wachstumsbedingungen inkubiert und die Zelldichte kann durch Kristallviolet-Färbung gemessen werden.
II. Antikörper abhängige, Zell-vermittelte Zytotoxizitäts(ADCC)-Aktivität von humanen anti-PSMA-Antikörpern und bispezifischen Molekülen
Die bispezifischen Moleküle 14.1 × 8C12 (in 3 gezeigt) und 14A8 × 8C12, sowie auch der monoklonale Antikörper 8C12 wurden auf eine polymorphnukleäre, Zellen-vermittelte ADCC-Abtötung von markierten, PSMA-exprimierenden Tumorzellen untersucht. So wurden insbesondere mononukleäre Zellen (Monozyten und Neutrophile) sowie Gesamtblut von gesunden Donoren isoliert und mit ⁵¹CR-markierten, PSMA-exprimierenden Tumorzellen in Anwesenheit des bispezifischen Moleküls 14.1 × 8C12 inkubiert. Nach etwa 4 Stunden wurde der Kulturüberstand von den Vertiefungen geerntet und die Freisetzung von ⁵¹CR auf einem Gamma-Zähler gemessen. Die prozentuale spezifische Lyse wurde gemäß der folgenden Formel bestimmt: (Experimentelle CPM – Zielfreisetzung CPM)/Detergens-Lyse – CPM-Zielfreisetzung CPM) × 100%. Die Ergebnisse, in den 12A, 13A und 14A gezeigt, weisen darauf hin, dass 14.1 × 8C12 einen dosisabhängige Lyse von Tumorzellen durch Monozyten und Neutrophilen bzw. Gesamtblut im Vergleich zu einem Kontroll-Antikörper vermittelt.
Mononukleare Zellen und Gesamtblut wurden weiter mit ⁵¹CR-markierten LNCaP-Tumorzellen in Anwesenheit des bispezifischen Moleküle 14.1 × 8C12 oder dem monoklonalen Antikörper 8C12 (12B, 12C, 13B und 14B) inkubiert. Die LNCaP Zellen wurden mit 100 μCi ⁵¹CR für 1 Stunde bei 37°C (5% CO₂) vor Inkubation mit mononuklearen Zellen und Gesamtblut, zusammen mit unterschiedlichen Konzentrationen an bispezifischem oder monoklonalem Antikörper markiert. Nach Inkubation für 16 Stunden wurde der Überstand geerntet und wie vorstehend beschrieben auf Radioaktivität untersucht.
Monozyten induzierte ADCC
Wie in 12A gezeigt vermittelt das bispezifische Molekül 14.1 × 8C12 eine Zellabtötung von PSMA exprimierenden Tumorzellen durch Monozyten in einer Dosisabhängigen Art und Weise. Die Zugabe von 50 μg/ml von 14.1 Fab'2 blockierte die ADCC der Tumorzellen durch 1 μg/ml des bispezifischen Moleküls 14.1 × 8C12 vollständig, was zeigt, dass das zielorientierte Abtöten der Zellen ausschließlich durch CD89 in den Effektorzellen vermittelt wurde. Wie in 12B gezeigt vermittelte das bispezifische Molekül 14.1 × 8C12 und der monoklonale Antikörper 8C12 weiter eine dosisabhängige Lyse von LNCaP Tumorzellen durch Monozyten. Darüber hinaus inhibierte die Zugabe von überschüssigem 14A8 F(ab)'2 eine ADCC der Tumorzellen durch das bispezifische Molekül 14.1 × 8C12 im Vergleich zu H22 F(ab)'₂ (humanisierter anti-γ-FcγRI) vollständig, was zeigt, dass das zielorientierte Abtöten der Zellen über CD89 vermittelt wurde (siehe 12C).
Neutrophil induzierte ADCC
Wie in 13A gezeigt, vermittelte das bispezifische Molekül 14.1 × 8C12 eine Zellabtötung von PSMA-exprimierenden Tumorzellen durch Neutrophile in einer dosisabhängigen Art und Weise. Die Zugabe von 25 μg/ml von 14.1 Fab'₂ blockierte eine ADCC der Tumorzellen durch das zielorientierte Abtöten der Zellen durch das bispezifische Molekül wesentlich, was zeigt, dass das zielorientierte Abtöten der Zellen spezifisch durch Binden von CD89 an die Effektorzellen vermittelt wurde. Wie in 13B gezeigt, vermittelte das bispezifische Molekül 14.1 × 8C12 auch in einer dosisabhängigen Form die Lyse von LNCaP-Tumorzellen mittels Neutrophiler. Die Zugabe von überschüssigem 14A8 F(ab)'₂ inhibierte eine ADCC der Tumorzellen durch 14.1 × 8C12 im Vergleich zu H22 F(ab)'₂ (humanisierter anti-γ-FcγRI) vollständig, was zeigt, dass das zielorientierte Abtöten der Zellen durch CD89 vermittelt wurde.
Gesamtblut induzierte ADCC
Wie in 14A gezeigt, vermittelte das bispezifische Molekül 14.1 × 8C12 eine Zellabtötung von PSMA-exprimierenden Tumorzellen durch Gesamtblut in einer dosisabhängigen Art und Weise. Die Zugabe von 25 μg/ml von 14.1 Fab'₂ blockierte eine ADCC der Tumorzellen durch das bispezifische Molekül erheblich, was erneut zeigt, dass das zielorientierte Zellabtöten spezifisch durch Binden von CD89 an die Effektorzellen vermittelt wurde. In vergleichbarer Art und Weise vermittelte, wie in 14B gezeigt, das bispezifische Molekül 14A8 × 8C12 weiter eine dosisabhängige Lyse von LNCaP-Tumorzellen durch Gesamtblut. Weiter inhibierte die Zugabe von überschüssigem 14A8F(ab)'₂ eine ADCC der Tumorzellen durch 14A8 × 8C12 im Vergleich zu H22 F(ab)'₂ (humanisierter anti-γ-FcγRI) vollständig, was anzeigt, das zielorientierte Zellabtöten durch CD89 vermittelt wurde.
III. Humane-PSMA-Antikörper und bispezifische Moleküle vermitteln Phagocytose und Abtöten von PSMA-exprimierenden Tumorzellen in Anwesenheit von humanen Effektorzellen
Die bispezifischen Moleküle 14.1 × 8C12 und 14A8 × 8C12, sowie der monoklonale Antikörper 8C12 wurden auf die Fähigkeit zur Vermittlung von Phagocytose von markierten PSMA-exprimierenden Tumorzellen (LNCaP-Zellen) allein, sowie in Anwesenheit von überschüssigem 14.1 (humanem-anti-FcαRI) Fab'₂-Antikörper, oder überschüssigem H22 (humanisierter anti-γ-FcγRI) Fab'-Antikörper als Kontrolle, untersucht. In Kürze, eine durch bispezifische Moleküle vermittelte Phagocytose von LNCaP-Zellen durch Monocyten, welche von Makrophagen (MDM) abgeleitet waren, wurde durch eine Modifikation des von Munn et al., J. Exp. Med. 172 (1990), 231–237, beschriebenen Verfahren untersucht. Monozyten, gereinigt aus Leukopacs (ABI) einer normalen Erwachsenen-Quelle, wurden in Platten mit 24 Vertiefungen (1 × 10⁶/ml) in Makrophagenserum freien Medium (Gibco, Grand Island, NY) welches mit 10% FBS und 10 ng/ml M-CSF ergänzt war, für 7–12 Tage differenziert. Die LNCaP-Zellen wurden mit dem lipophilen roten fluoreszierenden Farbstoff PKH 26 (Sigma, St. Louis, MO) markiert. Die markierten LNCaP-Zellen wurden in die Vertiefung gegeben, welche MDM ohne oder mit dem spezifischen Antikörper (oder Kontroll-Antikörper) enthielten, und bei 37°C für 5–24 Stunden (5% CO₂) inkubiert. MDM und nicht-phagocytierte LNCaP-Zellen wurden mit Trypsin gewonnen und mit einem mit FITC-markierten anti-CD33 mAb (251) und einem anti-CD14 mAb (AML-2-23) für 1 Stunde auf Eis (4°C) gefärbt. Die Zellen wurden gewaschen und mittels des FACScan durch zweifarbige Fluoreszenz analysiert. Die prozentuale Phagocytose wurde als die Anzahl von 2-fach positiven Zielzellen (inkorporiert durch MDM) geteilt durch die Gesamtzahl der Zielzellen × 100% berechnet.
Wie in 15 gezeigt, vermittelte das bispezifische Molekül 14.1 × 8C12 eine erhöhte spezifische Phagocytose von Tumorzellen in einer dosisabhängigen Art und Weise. Die Zugabe von 14.1 Fab'₂ blockierte eine Phagocytose der Tumorzellen durch das bispezifische Molekül erheblich, was erneut zeigte, dass die gezielte Phagocytose spezifisch durch Bindung von CD89 an Effektorzellen vermittelt wurde. In vergleichbarer Art und Weise vermittelte, wie in 16 gezeigt, das bispezifische Molekül 14.1 × 8C12 und der monoklonale Antikörper 8C12 weiter eine Phagocytose von LNCaP-Zellen in einer dosisabhängigen Art und Weise. In 17 ist gezeigt, dass 14.1 × 8C12 Phagocytose von LNCaP-Tumorzellen durch CD89 vermittelt, da dies durch Zugabe von überschüssigen 14A8 F(ab)'₂ im Vergleich zu H22 F(ab)'₂ (humanisierter anti-γ-FcγRI) (siehe Insert 17) inhibiert wurde.
Die vorstehenden Beispiele zeigen die Erzeugung von humanen monoklonalen Antikörpern und bispezifischen Molekülen, welche spezifisch mit hoher Affinität mit PSMA reagieren. Diese Antikörper und bispezifischen Moleküle scheinen native, Konformations-Proteinepitope zu erkennen, welche in der extrazellulären Domäne des Molekül vorhanden sind, im Vergleich zu Epitopen, die durch eine lineare Aminosäuresequenz definiert sind. Darüber hinaus vermitteln die humanen anti-PSMA-Antikörper und bispezifischen Moleküle davon einen Zellabtötung und Phagocytose in Anwesenheit von Effektorzellen gegen humane Tumorzellen die PSMA in hohen Mengen exprimieren. Diese Ergebnisse stützen die Schlußfolgerung, dass die vollständig humanen monoklonalen Antikörper gegen PSMA und Fragmente und bispezifische Moleküle davon der vorliegenden Erfindung zur Diagnose und Behandlung von mit PSMA-assoziierten Störungen nützlich sind.

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Claims

Isolierter, humaner monoklonaler Antikörper, welcher spezifisch an humanes PSMA mit einer Affinitätskonstante von mindestens 10⁷ M^–1 bindet, wobei der Antikörper: (a) die Cytolyse einer PSMA exprimierenden Zelle in Anwesenheit humaner Effektorzellen in einer Konzentration von 10 μg/ml oder weniger in vitro vermitteln kann; und (b) die Cytolyse von PSMA exprimierenden Zellen durch humane Effektorzellen bei einem IC₅₀ von 1 × 10^–7 M oder weniger in vitro vermitteln kann.
Humaner Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper an natives, humanes PSMA, jedoch nicht an Hitze-Denaturiertes humanes PSMA bindet.
Humaner Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper an humanes PSMA mit einer Affinitätskonstante von mindestens 10⁸ M^–1 bindet.
Humaner Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper an humanes PSMA mit einer Affinitätskonstante von mindestens 10⁹ M^–1 bindet.
Humaner Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper das Wachstum von PSMA exprimierenden Tumorzellen um mindestens 40% inhibiert.
Humaner Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper das Wachstum von PSMA exprimierenden Tumorzellen um mindestens 60% inhibiert.
Humaner Antikörper nach Anspruch 1, wobei das PSMA humanes PSMA ist.
Humaner Antikörper nach Anspruch 1, welcher eine IgG1 oder IgG3 schwere Kette umfasst.
Humaner Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper mindestens eine der Eigenschaften aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Assoziationskonstante (K_assoc) von mindestens 10⁴ M^–1S^–1; b) einer Dissoziationskonstante (K_dis) von mindestens 10^–4 s^–1; oder c) der Fähigkeit eine PSMA exprimierende Zelle zu opsonieren.
Humaner Antikörper nach Anspruch 1, welcher ein Antikörper-Fragment oder ein Einzelketten-Antikörper ist.
Humaner Antikörper nach Anspruch 1, wobei die PSMA exprimierende Zelle eine Prostata-Tumorzelle ist.
Humaner Antikörper nach Anspruch 1, hergestellt von einem Hybridom, welches eine B-Zelle umfasst, die aus einem transgenen, nicht-menschlichem Tier erhalten wurde, und ein Genom aufweist, welches ein humanes schwere Ketten-Transgen und ein humanes leichte Ketten-Transgen umfasst, fusioniert mit einer immortalisierten Zelle.
Hybridom, welches eine B-Zelle umfasst, die aus einem transgenen, nicht-menschlichem Tier erhalten wurde, und ein Genom aufweist, welches ein humanes schwere Ketten-Transgen und ein humanes leichte Ketten-Transgen umfasst, fusioniert mit einer immortalisierten Zelle, wobei das Hybridom einen humanen, monoklonalen Antikörper nach einem der vorstehenden Ansprüche herstellt.
Hybridom nach Anspruch 13, welches einen humanen, monoklonalen Antikörper herstellt, der durch humane IgG schwere Ketten- und humane kappa leichte Ketten-Nukleinsäuren codiert wird.
Transgenes, nicht-menschliches Tier, welches einen humanen, monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12 exprimiert, wobei das transgene, nicht-menschliches Tier ein Genom aufweist, welches ein humanes schwere Ketten-Transgen und ein humanes leichte Ketten-Transgen umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines humanen, monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 12, welches umfasst: Immunisieren eines transgenen, nicht-menschlichen Tieres mit einem Genom, welches ein humanes schwere Ketten-Transgen und ein humanes leichte Ketten-Transgen, mit PSMA oder einer PSMA exprimierenden Zelle umfasst, so dass durch B-Zellen des Tieres Antikörper produziert werden; Isolieren von B-Zellen des Tieres; und Fusionieren der B-Zellen mit Myelom-Zellen unter Bildung von immortalisierten Hybridom-Zellen, welche für PSMA spezifische humane, monoklonale Antikörper sezernieren.
Bispezifisches Molekül, welches einen humanen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst, und eine zweite Bindungs-Spezifität für einen Fc-Rezeptor.
Bispezifisches Molekül nach Anspruch 17, wobei der Fc-Rezeptor ein humaner Fcγ-Rezeptor oder ein humaner Fcα-Rezeptor ist.
Bispezifisches Molekül nach Anspruch 17, welches an den Fc-Rezeptor an einer Stelle bindet, welche von der Immunglobulin-Bindungsstelle des Rezeptors verschieden ist.
Bispezifisches Molekül nach Anspruch 17, wobei die zweite Bindungs-Spezifität, welche an einen Fc-Rezeptor bindet, ein humaner, monoklonaler Antikörper ist.
Bispezifisches Molekül nach Anspruch 17, welches eine Einzel-Ketten oder ein Fab'-Fusionsprotein ist.
Multispezifisches Molekül, welches einen humanen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst, eine zweite Bindungs-Spezifität für einen Fc-Rezeptor und eine dritte Bindungs-Spezifität für ein Tumor-Antigen, das nicht PSMA ist.
Multispezifisches Molekül nach Anspruch 22, wobei der Fc-Rezeptor ein humaner Fcγ-Rezeptor oder ein humaner Fcα-Rezeptor ist.
Zusammensetzung, welche einen humanen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder ein Molekül nach einem der Ansprüche 17 bis 23 umfasst, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 24, welche eine Kombination von zwei oder mehreren isolierten humanen Antikörpern umfasst, welche spezifisch an PSMA binden, wobei jeder der Antikörper an ein unterschiedliches Epitop von PSMA bindet.
Zusammensetzung nach Anspruch 24, welche weiter ein chemotherapeutisches Mittel umfasst.
Ex vivo Verfahren zur Inhibierung des Wachstums einer PSMA exprimierenden Zelle, welches umfasst, in Kontakt bringen einer PSMA exprimierenden Zelle mit einem isolierten humanen, monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12, oder einem Molekül nach einem der Ansprüche 17 bis 23, so dass das Wachstum der Zelle inhibiert wird.
Ex vivo Verfahren zur Induzierung der Cytolyse einer PSMA exprimierenden Zelle welches umfasst, in Kontakt bringen einer PSMA exprimierenden Zelle mit einem isolierten humanen, monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12, oder einem Molekül nach einem der Ansprüche 17 bis 23, in Anwesenheit einer Effektorzelle, so dass die Cytolyse der PSMA exprimierenden Zelle abläuft.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei der humane, monoklonale Antikörper an eine Bindungs-Spezifität für einen Fc-Rezeptor konjugiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei der humane, monoklonale Antikörper an ein Cytotoxin konjugiert ist.
Verwendung eines isolierten humanen, monoklonalen Antikörpers, nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder eines Moleküls nach einem der Ansprüche 17 bis 23, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung von Krebs.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei der humane, monoklonale Antikörper an eine Bindungs-Spezifität für einen Fc-Rezeptor konjugiert ist.
Verwendung nach Anspruch 31 oder 32, wobei der humane, monoklonale Antikörper an ein Cytotoxin konjugiert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei der Krebs Prostata Krebs ist.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines PSMA-Antigens oder einer PSMA exprimierenden Zelle in einer Probe, welches umfasst: in Kontakt bringen der Probe und einer Kontroll-Probe mit einem humanen, monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12 unter Bedingungen, welche Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und PSMA ermöglichen; und Nachweisen der Bildung eines Komplexes, wobei ein Unterschied der Komplexbildung zwischen der Probe im Vergleich zu der Kontroll-Probe die Anwesenheit von PSMA in der Probe anzeigt.
Immunotoxin, welches einen humanen, monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12, oder ein Molekül nach einem der Ansprüche 17 bis 23 umfasst, welches an ein cytotoxisches Mittel gebunden ist.