DE60030466T2

DE60030466T2 - Aspergillus niger beta-glukosidase gen, protein, sowie verwendungen derselben

Info

Publication number: DE60030466T2
Application number: DE60030466T
Authority: DE
Inventors: Wei Shu; Ira Marton; L. Daniel SIEGEL; Bravdo Ben-Ami; Mara Dekel; Oded Shoseyov
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-11-15
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2020-11-16
Also published as: US20070292930A1; NZ519043A; ES2272333T3; WO2001036586A3; EP1230343A2; CA2392060C; HK1048139B; AU1410301A; EP1230343A4; ATE338109T1; ZA200204463B; HK1048139A1; DE60030466D1; EP1230343B1; WO2001036586A2; IL149698A0; AU784258B2; CA2392060A1; US7223902B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von wenigstens einer Fermentations-Substanz in einem Fermentations-Produkt gemäß den Ansprüchen 1 und 10, ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von wenigstens einer Aroma-Substanz in einem aus einer Pflanze abgeleiteten Produkt gemäß den Ansprüchen 2 und 12, ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von freier Glucose in einem aus einer Pflanze abgeleiteten, Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterial gemäß den Ansprüchen 4 und 15, ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von freier Glucose in einer Pflanze gemäß den Ansprüchen 5 und 17, ein Verfahren für das Herstellen eines Alkohols gemäß den Ansprüchen 6 und 19 sowie ein Verfahren für das Herstellen einer Aroma-verströmenden Pflanze gemäß den Ansprüchen 7 und 21.
Hierin verwendete Abkürzungen schließen folgende eine: BGL1 – β-Glucosidase von Aspergillus niger B1; bgl1 – eine cDNA, die für diese codiert; 2FGlcF – 2-Deoxy-2-Fluoro-β-Glucosylfluorid; DNP – 2,4-Dinitrophenol; DNPGlc – 2,4-Dinitrophenyl-β-D-Glucopyranosid; pNP – p-Nitrophenol; pNPGlc-p-Nitrophenyl-β-D-Glucopyranosid; MUGlc-4-Methylumbeliferyl-β-D-Glucopyranosid; YNB – Hefe-Nitrogen-Base ohne Aminosäuren; und X-Glu-S-Bromo-4-Chloro-3-indplyl-β-D-Glucopyranasid.
β-Glucosidasen (EC 3.2.1.21; β-D-Glucosid-Glucohydralase) spielen mehrere wichtige Rollen in der Biologie, einschließlich des Abbaus von zellullosischer Biomasse durch Pilze und Bakterien, des Abbaus von Glycolipiden in den Lysosomen von Säugetieren und der Spaltung von glucosylierten Flavonoiden in Pflanzen. Aus diesem Grund sind diese Enzyme von großem wirtschaftlichen Interesse, nicht nur als Bestandteile von Zellufase-abbauenden Systemen, sondern auch in der Lebensmittelindustrie (2, 3).
Aspergillus species sind als nützliche Quellen von β-Glucosidasen (4–6) bekannt und Aspergillus niger ist bei weiten der wirksamste Produzent von β-Glucosidase unter den erforschten Mikroorganismen (4). Shoseyov et al. (7) haben bereits eine β-Glucosidase von Aspergillus niger B1 (CMI CC 324626) beschrieben, die bei geringen pH-Werten, sowie bei hohen Ethanolkonzentrationen aktiv ist. Dieses Enzym hydrolisiert wirksam Glycoside von Aromaverbindungen in bestimmten Produkten mit niedrigem pH-Wert, wie etwa Wein und Saft der Passionsfrucht, wodurch deren Aroma verbessert wird (8–12), und ist insbesondere interessant für die Verwendung in der Lebensmittelindustrie, da A. niger als ungiftig gilt (3). Zusätzlich wurde gefunden, dass β-Glucosidase in der enzymatischen Synthese von Glykosiden (13–15) nützlich ist.
Auch weitere β-Glucosidasen von A. niger wurden gereinigt (16–18), jedoch wurden Unterschiede bezüglich ihrer Eigenschaften berichtet, einschließlich der Bereiche der Molekülmasse (116–137 kDa), der isoelektrischen Punkte (pI-Werte von 3,8–4), und der pH-Optima (3,4–4,5). Es wurden wenigstens zwei β-Glucosidasen mit verschiedenen Substrateigenschaften in kommerziellen β-Glucosidase-Zubereitungen von A. niger identifiziert (19). Versuche, diese Unklarheiten durch Klonierung und Expression eines funktionalen β-Glucasidase-Gens von A. niger in S. cerevisiae zu beseitigen wurden kürzlich berichtet (20), jedoch wurde das Protein nicht charakterisiert und die Sequenz nicht veröffentlicht.
Glykosidasen wurden basierend auf Ähnlichkeiten in der Sequenz in Familien eingeteilt, von denen es derzeit etwa 77 verschiedene definierte Familien gibt, die über 2000 verschiedene Enzyme enthalten (21, siehe auch http://afmb.cnrs-mrs.fr/pedro/CAZY/db.html). Mit Ausnahme der Glukosylceramidasen (Familie 30) gehören alle einfachen β-Glucosidasen entweder zur Familie 1 oder 3. Familie 1 enthält Enzyme aus Bakterien, Pflanzen und Säugetieren, einschließlich der 6-Phospho-Glucosidasen und der Thioglucosidasen. Des Weiteren weisen die meisten Enzyme der Familie 1 eine signifikante Galactosidase-Aktivität auf. Familie 3 enthält β-Glucosidasen und Hexosaminidasen fungalen, bakteriellen und pflanzlichen Ursprungs.
Enzyme beider Familie hydrolysieren ihre Substrate mit Nettoretention anomerer Konfiguration, vermutlich über einen doppelten Verdrängungsmechanismus mit zwei Schritten, der zwei wichtige Carbonsäurereste des aktiven Zentrums beinhaltet (zu dem Mechanismus, siehe 22–24). Im ersten Schritt greift eine Carbonsäure (die nukleophile Carbonsäure) das anomere Zentrum des Substrats an, während die andere (der saure/basische Katalysator) den glycosidischen Sauerstoff protoniert, wodurch die Abtrennung des Aglycons unterstützt wird. Die führt zur Bildung eines kovalenten α-Glycosyl-Enzym-Zwischenprodukts. In einem zweiten Schritt wird dieses Zwischenprodukt durch einen allgemeine basenkatalysierten Angriff von Wasser am anomeren Zentrum des Glycosyl-Enzyms hydrolysiert, um das β-Glucose-Produkt freizusetzen und freies Enzym zu regenieren. Sowohl die Bildung als auch die Hydrolyse des Zwischenprodukts erfolgen über Übergangszustände mit im Wesentlichen der Eigenschaft eines Oxocarbenium-Ions.
In Anbetracht der Tatsache, dass Familie 3 fungale Enzyme mit ähnlicher Masse enthält, einschließlich der von anderen Aspergillus sp., ist es wahrscheinlich dass die β-Glucosidase von Aspergillus niger zu dieser Familie gehört. Es gibt relativ wenig mechanistische Daten über diese Familie: die am besten charakterisierte ist die glycosylierte β-Glucosidase mit 170 kDA von Aspergillus wentii. Durch das Kennzeichnen des aktiven Zentrums mit Conduritol B-Epoxid wurde gezeigt, dass dieses Enzym die Hydrolyse durchführt, mit einer Nettoretention anomerer Konfiguration. Diese Studie hat bewiesen, dass der gekennzeichnete Asparaginsäurerest identisch mit dem durch das langsame Substrat D-Glucal (1, 25) derivatisierte war. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das 2-Deoxyglucasyl-Enzym, das durch Verwendung von D-Glucal erhalten wurde, kinetisch identisch mit dem war, das während der Hydrolyse von PNP-2-Deoxy-β-D-Glucopyranosid (26) war.
Eine weitergehende detaillierte kinetische Analyse des Enzyms wurde von Legler et al. (27) durchgeführt, einschließlich der Messung von Hammett-Beziehungen, kinetischen Isotopeffekten sowie Studien bezüglich der Bindung von potenten reversiblen Inhibitoren, wie etwa Glucanolakton und und Nojirimycin.
Bei der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung wurde das β-Glucosidaseprotein aus Aspergillus niger isoliert, kloniert, sequenziert und in Hefelwirtszellen exprimiert sowie seine enzymatische Funktion charakterisiert. Zusätzlich wurden das Protein sowie das daran gebundene Signalpeptid und optional ein daran gebundenes Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums in transgenen Pflanzen exprimiert und die der Homogenisierung folgende Freisetzung von Aroma-Substanzen daraus überwacht. Das von dem isolierten Gen codierte Ezym weist eine bekannte Nützlichkeit in Pflanzen und/oder Pflanzenprodukten sowie in biotechnologischen Verfahren auf, einschließlich in der Lebensmittelindustrie, auf. Mehrere unerwartete Vorteile wurden entdeckt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Stabilität gegenüber pH-Wert und Temperatur der β-Glucosidase von Aspergillus niger, Notwendigkeit eines Signalpeptids für das Erhalten einer katalytischen Aktivität bei der Expression in Pflanzen. Vorteile für ein endoplasmatisches Retaining-Peptid oder für einen Mangel daran bei der Expression in Pflanzen, abhängig von der Anwendung.
PENTILLA ET AL. 1984; Cloning of aspergillus niger genes in yeast; Expression of the gene coding aspergillus β-glucosidase; MOL. GEN. GENET. 194: 494–499; offenbar die Möglichkeit der Klonierung von Genen von Hyphomyzeten durch die Expression in der Hefe Saccaromyces cerevisiae. Eine Genombank von Aspergillus niger wurde in E. coli hergestellt, wobei ein Cosmid-Shuttle-Vektor von Hefe verwendet wurde und über 10.000 verschiedene Cosmidklone einzeln isoliert wurden. Hefetransformanden mit Aspergillus-DNA wurden auf die Expression der Gene für die sekretierten fungalen Glycoproteine, die β-Glucosidase und die Amylo-Glucosidase und die Expression der fungalen Gene hin untersucht, welche die Hefemutationen ura3 und leu2 komplementieren. Von den fünf erforschten Apergillusarten wurde nur von einer, der β-Glucosidase gefunden, dass sie in Hefe exprimiert wird, und dies auf einem niedrigen Niveau. Dies lässt vermuten, dass es wesentliche Unterschiede zwischen den Genen von Hefe und Hyphomyceten gibt. Iwashita et al 1997, EMBL-Zugangsnummer: AB003470 bezieht sich auf „The bg1A gene of Aspergilus kawachii, which encodes both extracellular and cell wall-bound β-glucosidases". BHAT M K ET AL. 1997: Cellulose, degrading enzymes and their potential industrial applications; BIOTECHNOLOGY ADVANCES, 15: 583–620; beschreibt die biologische Umwandlung von Zellulose in lösliche Zucker und Glucose, die durch eine Zellulase genannte Gruppe von Enzymen katalysiert wird. Mikroorganismen einschließlich Pilzen, Bakterien und Aktionmyceten stellen hauptsächlich drei Typen von Zellulasebausteinen – Endo-1,4-β-D-Glucanase; exo-1,4-β-D-Glucanase und β-Glucosidase – jeweils einzeln oder in Form eines Komplexes. In den letzten Jahrzehnten wurden Zellulasen grundlegend besser verstanden; dennoch muss noch viel erforscht werden. Das riesige wirtschaftliche Potential der Zellulasen in einer Vielzahl von Anwendungen bleibt die treibende Kraft für die Forschung auf diesem Gebiet. Dieser Rückblick fasst den derzeitigen Stand des Wissens bezüglich mikrobieller Zellulasen und ihrer Anwendungen ein. DEKKER R F H 1986, 28: 1438–1442 offenbart die Eigenschaften bezüglich kinetischer Hemmung und Stabilität einer Herstellung von kommerzieller β-d-Glucosidase- Zellobiase aus Aspergillus-niger und ihre Nützlichkeit in der Hydrolyse von Lignozellulose, Biotechnologie und Bioengineering. ZHOU S Et AL 1999: Engineering endoglucanase-secreting strains of ethanologenic Klebsiella Oxytoca P2. JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY, 22: 600–607 bezieht sich auf rekombinante Klebsiella oxytoca P2, die als ein Biokatalysator für die gleichzeitige Verzuckerung und Fermentation (SSF) von Zellulose durch chromosomales Integrieren von Genen von Zymomonas mobiles (pdc, adhB), die für den Ethanol-Weg codieren, dienen. Dieser Stamm enthält die native Fähigkeit, Zellobiose zu transportieren und zu metabolisieren, wodurch es nicht mehr erforderlich ist, während der SSF β-Glucosidase zuzuführen. Um die Nützlichkeit dieses Biokatalysators zu erhöhen, wurde nun das celZ-Gen, das für die primäre Endoglucanase von Erwinia chrysanthemi codiert, chromosomal integriert. Dieses Gen wurde in hohen Raten durch das Ersetzen des nativen Promotors durch einen von der DNA von Z, mobils abgeleiteten Surrogatpromotor exprimiert. Unter Zusatz von Out-Genen, die für das Proteinsekretionssystem von E. Chrysanthemi des Typ II codieren wurde mehr als die Hälfte der aktiven Endoglukanase (EGZ) in die extrazelluläre Umgebung ausgesondert. Die beiden aktivsten Stämme, SZ2 (pCPP2006) und SZ6 (pCPP2006) stellten ungefähr 24 000 U L^–1 der Aktivität der CMCase dar, was 5% der Gesamtmenge an zellulärem Protein ist. Rekombinante EGZ entpolymerisierte teilweise säuregequollene Zellulose und ermöglichte die Herstellung von geringen Mengen Ethanol durch SZ6 (pCPP2006) ohne den Zusatz von fungaler Zellulose. Jedoch werden zusätzliche Endoglucanaseaktivitäten erforderlich sein, um die Entpolymerisierung der Zellulose in kleine lösliche Produkte, die wirksam zu Ethanol metabolisiert werden, abzuschließen. SHOSEYOV ET AL 1990; Immobilized endo-β-glucosidase enriches flavor of wine and passion fruit juice, journal of agricultural and food chemistry, 38: 1387–1390, betrifft Endo-β-Glucosidase von Aspergillus niger, die an Acrylperlen sowie zu Zellulosepartikeln von Maisstengeln immobilisiert worden waren. Die Wirksamkeit der Immobilisierung bei einem pH-Wert von 6,5 an den Acrylperlen im Hinblick auf die Aktivität lag höher als an die Zellulose, jedoch nach wie vor niedrig (10%). Jedoch wurde eine höhere Immobilisierung an Zellulose (30%) bei einem pH-Wert von 4,5 erreicht. The thermische Stabilität des Enzyms wurde durch dessen Immobilisierung in beiden Verfahren verbessert. Freie und immobilisierte Endo-β-Glucosidasen wurden verwendet, um Muscat Roy Wein und Saft der Passionsfrucht (pH-Wert 2,45) zu behandeln. GC-MS-Analyse sowie sensorische Analyse zeigten eine signifikante Erhöhung der Geschmacksverbindungen, Monoterpenalkohole an, und Linalooloxide ds des Benzaldehyds ist ein zyanogenes Glykosid, wie aus der Entwicklung des Zyanids nach der enzymatischen Behandlung ersichtlich ist. Das Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus der wenigstens einen Fermentations-Substanz in einem Fermentations-Produkt ist in den Ansprüchen 1 und 10 definiert, ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von wenigstens einer Aroma-Substanz in einem von einer Pflanze abgeleiteten Produkt wird in den Ansprüchen 2 und 12 definiert, ein Verfahren für das Erhöhens eines Niveaus von freier Glucose in einem aus einer Pflanze abgeleiteten, Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterial wird in den Ansprüchen 4 und 15 definiert, ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von freier Glucose in einer Pflanze wird in den Ansprüchen 5 und 17 definiert, ein Verfahren für das Herstellen eines Alkohols wird in den Ansprüchen 6 und 19 definiert, ein Verfahren für das Herstellen einer Aroma-verströmenden Pflanze wird in den Ansprüchen 7 und 21 definiert.
Gemäß weiteren Merkmalen in unten bechriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Polynukleotid wie in SEQ ID NO: 1, 3 dargelegt oder ein Abschnitt davon.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Nukleinsäurekanstrukt ferner wenigstens ein cis-wirksames Kontrollelement für das Regulieren der Expression des Polynukleotides.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen wird die Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt, die aus einer prokaryotischen Zelle und einer eukaryotischen Zelle besteht.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist die prokaryotische Zelle E. coli.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist die eukaryotische Zelle aus der Gruppe ausgewählt, die aus einer Hefezelle, einer Pilzzelle, einer Pflanzenzelle und einer Tierzelle besteht.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist das Polypeptid wie in SEQ ID NO: 2 dargelegt oder ein Abschnitt davon mit der katalytischen Aktivität der β-Glucosidase.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren des Herstellens einer rekombinanten B-Glucosidase bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Einführens eines Nukleinsäurekonstrukts in einer exprimierbaren Form in eine Wirtszelle umfasst, wobei das Nukleinsäurekonstrukt ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid umfasst, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, das für ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert und bevorzugt ferner im Rahmen (in Frame) ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums codiert.
Gemäß weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der untenstehend beschriebenen Erfindung umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Extrahierens des Polypeptids mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase.
Gemäß noch einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren des Herstellens einer rekombinante Zelle, die beta-Glucosidase überexprimiert, bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Einführens eines Nukleinsäurekonstrukts in einer überexprimierbaren Form in eine Wirtszelle umfasst, wobei das Nukleinsäurekonstrukt ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid umfasst, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, das für ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität einer β-Glucosidase codiert und bevorzugt ferner im Rahmen ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Reticulums codiert.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von wenigstens einer Fermentations-Substanz in einem Fermentations-Produkt bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Fermentierens eines Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterials durch eine Hefezelle umfasst, welche ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist und für ein Polypeptid codiert, das die katalytische Aktivität einer β-Glucosidase aufweist und bevorzugt ferner, im Rahmen, für ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid eines Endosplasmatischen Retikulums codiert, wodurch das Niveau der wenigstens einen Fermentations-Substanz in dem Fermentations-Produkt erhöht wird.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von wenigstens einer Fermentations-Substanz in einem Fermentations-Produkt bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Fermentierens eines von einer Pflanze abgeleiteten, Glucose enthaltenden Ausgangsmaterials durch eine Hefezelle umfasst, die ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, wobei die Pflanze ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid überexprimiert, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist und für ein Polypeptid codiert, das die katalytische Aktivität einer β-Glucosidase aufweist und bevorzugt ferner im Rahmen für ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid des endosplasmatischen Retikulums codiert, wodurch das Niveau der wenigstens einen Fermentations-Substanz in dem Fermentations-Produkt erhöht wird.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von wenigstens einer Aroma-Substanz in einem von einer Pflanze abgeleiteten Produkt bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Inkubierens eines von einer Pflanze abgeleiteten, Glucose enthaltenden Ausgangsmaterials mit einer Hefezelle umfasst, die ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist und ferner für ein Polypeptid codiert, das die katalytische Aktivität einer β-Glucosidase aufweist und bevorzugt ferner im Rahmen für ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid eines endosplasmatischen Retikulums codiert, wodurch das Niveau der wenigstens einen Aroma-Substanz in dem von der Pflanze abgeleiteten Produkt erhöht wird.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von wenigstens einer Aroma-Substanz in einem von einer Pflanze abgeleiteten Produkt bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Inkubierens eines von einer Pflanze abgeleiteten, Glucose enthaltenden Ausgangsmaterials mit einer Hefezelle umfasst, wobei die Pflanze ein Nukleinsäurekanstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist und ferner für ein Polypeptid codiert, das eine katalytische Aktivität der β-Glucosidase aufweist und bevorzugt ferner im Rahmen für ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid des endosplasmatischen Retikulums codiert, wodurch das Niveau der wenigstens einen Aroma-Substanz in dem von der Pflanze abgeleiteten Produkt erhöht wird.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist das von der Pflanze abgeleitete Produkt ein Fermentations-Produkt, wie etwa, jedoch nicht beschränkt auf, ein alkoholisches Getränk.
Gemäß noch einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von freier Glucose in einem Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterial bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Fermentierens eines Glucose enthaltenden Ausgangsmaterials durch eine Zelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist und bevorzugt ferner für ein Polypeptid codiert, das eine katalytische Aktivität der β-Glucosidase aufweist und bevorzugt ferner im Rahmen für ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid eines endosplasmatischen Retikulums codiert, wodurch das Niveau der freien Glucose in dem Glucose-enthaltenden Ausgangsmaterial erhöht wird.
Gemäß noch einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von freier Glucose in einem von einer Pflanze abgeleiteten, Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterial bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Fermentierens des von der Pflanze abgeleiteten, Glucose enthaltenden Ausgangsmaterials durch eine Zelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist und für ein Polypeptid codiert, das die katalytische Aktivität einer β-Glucosidase aufweist und bevorzugt ferner im Rahmen für ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid eines endosplasmatischen Retikulums codiert, wodurch das Niveau der freien Glucose in der Pflanze erhöht wird.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von freier Glucose in einer Pflanze bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Überexprimierens eines Nukleinsäurekonstrukts in der Pflanze das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, das für ein Polypeptid codiert, das die katalytische Aktivität einer β-Glucosidase aufweist und bevorzugt ferner im Rahmen für ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid des endosplasmatischen Retikulums codiert, wodurch das Niveau der freien Glucose in der Pflanze erhöht wird.
Gemäß noch einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Herstellen eines Alkohols bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Fermentierens eines Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterials durch eine Zelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, umfasst, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, das für ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert und bevorzugt ferner im Rahmen für ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid eines endoplasmatischen Reticulums codiert, sowie das Extrahieren des Alkohols daraus.
Gemäß noch einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Herstellen eines Alkohols bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Fermentierens eines Glucose enthaltenden, aus einer Pflanze abgeleiteten Ausgangsmaterials der Fermentierung durch eine Zelle umfasst, wobei die Pflanze ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid enthält, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, das für ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität einer β-Glucosidase codiert und bevorzugt ferner im Rahmen ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid eines endoplasmatischen Retikulums codiert, sowie das Extrahieren des Alkohols daraus.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Herstellen einer Aroma-verströmenden Pflanze bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Überexprimierens eines Nukleinsäurekonstrukts in der Pflanze umfasst, das ein genomisches, komplementäres der zusammengesetztes Polynukleotid einschließt und bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, das für ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität einer β-Glucosidase codiert und bevorzugt ferner im Rahmen für ein Signalpeptid und ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums codiert, wodurch die Aromaverströmung aus der Pflanze erhöht wird.
Gemäß weiteren Merkmalen in unten bechriebenen Ausführungsformen der Erfindung ist wird das Überexprimieren des Nukleinsäurekonstrukts in einer Gewebe-spezifischen Art durchgeführt wird.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist das Überexprimieren des Nukleinsäurekonstrukts auf wenigstens ein Gewebe beschränkt das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Blüte, Frucht, Samen, Wurzel, Stamm, Pollen und Blätter besteht.
Die vorliegende Erfindung bekämpft erfolgreich die Nachteile der derzeit bekannten Konfigurationen durch das Bereitstellen eines Polypeptids mit der enzymatischen Aktivität der β-Glucosidase, eines Polynukleotides, das für das Polypeptid codiert, eines Nukleinsäurekonstrukts, das das Polynukleotid trägt, transformierte oder infizierte Zellen, wie etwa Hefezellen und Organismen, die das Polynukleotid exprimieren sowie verschiedene Verwendungen des Polypeptids, des Polynukleotids, der Zellen und/oder Organismen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Herstellen eines rekombinanten Polypeptids mit der enzymatischen Aktivität der β-Glucosidase, das Erhöhen des Niveaus von Aroma-Verbindungen in alkoholischen Getränken sowie weiteren Fermentationsprodukten von Pflanzenmaterial, das Hydrolysieren und somit Erhöhen des Niveaus einer fermentierbaren und/oder freien Glucose, um die Herstellung eines Fermentations-Produkts zu erhöhen, wie etwa Ehtanol aus Pflanzenmaterial, das Erhöhen des aus einer Pflanze oder einem Pflanzeprodukt freigesetzten Aromas und die Hydrolyse oder Transglycosylierung von Glycosiden.
Die Erfindung wird hierin lediglich exemplarisch im Zusammenhang mit den angehängten Zeichnungen beschrieben. Es wird nun insbesondere detailliert Bezug auf die Zeichnungen genommen und hervorgehoben, dass die gezeigten Details nur exemplarisch gezeigt werden und der Veranschaulichung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dienen und dazu dienen sollen, die sinnvolste und am besten verständliche Beschreibung der Grundlagen und grundlegenden Aspekte der Erfindung bereitzustellen. In dieser Hinsicht werden strukturelle Details der Erfindung nur soweit gezeigt, wie dies für ein grundlegendes Verständnis der Erfindung notwendig ist, wobei die Beschreibung zusammen mit den Zeichnungen für den Fachmann ersichtlich macht, wie die Erfindung auf verschieden Arten in die Praxis umgesetzt werden kann.
Es zeigen:
1a–c zeigen Plasmidkarten, die als Expressionsvektoren für cDNA von bgl1 verwendet werden. 1a – E. coli Expressionsvektor, der bgl1 cDNA enthält, eingesetzt in NcoI/BamHI-Stellen von pET3d. 1b – S. cerevisiae-Expressionsvektor, der cDNA von bgl1 enthält, in HindIII/BamHI-Stellen des pYES2-bgl1-Plasmids eingesetzt. 1c – P. pastoris – Expressionsvektor, der cDNA von bgl1 enthält, in EcoRII/BamHI-Stellen von pHIL-S1 eingesetzt.
2a–b zeigen SDS-PAGE-Analyse von aktiven Proteinproben, die aus Mono-Q-Säulen eluiert und mit Caomassie-Blau gefärbt wurden (2a) oder β-Giucosidase-Zymogram (2b) unter Verwendung von MUGlc als Substrat. Lanes (für 2a und 2b): 1 – elektroeluiertes Band von BGL1 aus präparativen PAGE-SDS-Gelstäben; 2, 3, 4, 5-Aceton-Niederschläge aus der Mono-Q-Trennung von BGL1.
3 zeigt SDS-PAGE-Analyse von gereinigter β-Glucosidase durch Mono-Q und Resource-S. Lanes: 1 – roh (27,5 μg Protein); 2 – aktive Fraktion nach Mono-Q (7 μg Protein); und 3 – aktive Fraktion nach Resource-S (10 μg Protein).
4 zeigt SDS-PAGE-Analyse von durch N-Glycosidase-F deglycosylierter β-Glucosidase: Lanes: 1 – Molekülmassemarker; 2 – native β-Glucosidase; und 3 – deglycosyliertes Protein.
5a zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen von bgl1. Aminosäuresequenzen, die durch Edman-Abbau bestimmt wurden, sind unterstrichen. DNA-Sequenzen von Introns sind unterstrichen. Signalpeptid ist kursiv geschrieben.
5b zeigt die Organisation des Gens bgl1. Exone (E1-7) werden durch ausgemalte Kästchen angezeigt, Introns durch durchgezogene Linien, Restriktionsbindungsstellen und der Stopcodon durch Pfeile.
6a zeigt eine Western-Blot-Analyse von rekombinantem, in S. cerevisiae exprimierten BGL1. Lanes: 1 – natives BGL1 (positive Kontrolle); 2 – Gesamtproteinextrakt von S. cerevisiae, der rekombinantes BGL1 exprimiert; 3 – Gesamtproteinextrakt von S. cerevisiae ohne den bgl1-Expressionsvektor (negative Kontrolle).
6b zeigt eine Western-Blot-Analyse von rekombinanten, von P, pastoris abgesonderten BGL1. Lanes: 1 – Molekülmassemarker; 2 – Rückstand des Mediums von P. pastoris das rekombinantes BGL1 exprimiert; 3 – Rückstand des Mediums von P. pastoris-Wirt ohne den Vektor (negative Kontrolle).
7 zeigt Protonen-NMR-Spektren, die den stereochemischen Verlauf von pNPGlc-Hydrolyse durch β-Glucosidase von A. niger veranschaulichen. Für den anomeren Protonenbereich des Substrats zu verschiedenen Zeitpunkten relativ zu der Hinzufügung des Enzyms.
8 zeigt die Inaktivierung von rekombinanten BGL1 durch 2FglcF. Reines Enzym wurde bei verschiedenen Konzentrationen des Inaktivators inkubiert und restliche Enzymaktivität wurde zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Restaktivität wird semilogarithmisch abhängig von der Zeit bei angezeigten Konzentrationen des Inaktivators dargestellt.
9 zeigt die Reaktivierung von rekombinantem BGL1 2-Deoxy-2-Fluoroglucosyl durch Linamarin. Die Aktivität wird gegenüber der Inkubationszeit in Gegenwart der angezeigten Konzentrationen von Linamarin aufgetragen.
10 zeigt die Stabilität von rekombinanter β-Glucosidase von A, niger bei verschiedenen Temperaturen. Die Aktivität wird berechnet als Prozent einer rekombinanten Enzymlösung, die bei 4°C aufbewahrt wird.
11a–c zeigen schematische Darstellungen von Expressionskassetten, die für die Expression von β-Glucosidase von A. niger in Tabakpflanzen verwendet werden.
11a – eine Kassette, die für BGL1 ohne ein Signalpeptid codiert (siehe SEQ ID NO: 13 für die Nukleotidsequenz und SEQ ID NO 14 für die Aminosäuresequenz;
11b – eine Kassette, die für ein BGL1, das mit einem Cel1-Signalpeptid für die Absonderung in das Apoplast verbunden ist (siehe SEQ ID NO: 15 für die Nukleotidsequenz und SEQ ID NO:16 für die Aminosäuresequenz) codiert und
11c – eine Kassette für das Codieren eines BGL1, das mit einem Signalpeptid von Cel1 wie in 11b verbunden ist und zusätzlich zu HDEL (SEQ ID NO: 17) ER-Retaining-Peptid an dem C-terminalen Ende für die Akkumulation in dem ER (siehe, SEQ ID NO: 18 für die Nukleotidsequenz und SEQ ID NO: 19 für die Aminosäuresequenz).
12 zeigt Ergebnisse von PCR-Amplifikation von cDNA von bgl1, welche die Anwesenheit von cDNA von bgl1 in transgenen Plfanzen anzeigt. CB10 und CB1 – transgene Pflanzen, die mit bgl1 und Cel1-Signalpeptid ohne HDEL-ER-Retaining-Peptid transformiert wurden. CBT3, CBT8 und CBT15 – verschiedene transgene Linien, die mit bgl1, cel1-Signalpeptid und HDEL transformiert wurden. B1 – eine transgene Pflanze, die mit bgl1 transformiert wurde. 1 kb – 1 kb DNA-Marker. WT-Wildtyp von nicht transgener Pflanze. pETB1 – bgl1 Plasmid-DNA.
CB13a–b zeigen Western-Blot-Analysen von transgenen Pflanzen, die BGL1 ohne Signalpeptid (13a) und BGL1 mit Cel1-Signalpeptid (13b) mit und ohne HDEL-ER-Retaining-Peptid zeigt. Eine Gluco-gereinigte β-Glucosidase von A. niger. WT-nicht transgene Kontrollpflanze. B1, B15, B16, B20, B27, B33 und B34 – verschieden transgene Zelllinien, die mit bgl1 transformiert wurden. CBT1, CBT3, CBT7 und CBT8 – verschiedene transgene Linien, die mit bgl1, Cel1 Signalpeptid und HDEL transformiert wurden. CB10 und CB12 – transgene Pflanzen, die mit bgl1 und Cel1-Signalpeptid ohne HDEL-ER-Retaining-Peptid transformiert wurden.
14 zeigt eine Gelaktivitätsanalyse von mit MuGlu inkubierten Extrakten aus transgenen Tabakpflanzen in SDS-PAGE. WT – nicht transgene Kontrollpflanze. CB10 und CB11 – zwei unabhängige Linien von transgenen Pflanzen, die mit Cel1-Signalpeptid verbundenes BGL1 exprimieren (ohne HDEL). CBT3, CBT8 und CBT15 – unabhängige Linien von transgenen Pflanzen, die mit Cel1-Signalpeptid verbundenes BGL1 am N-terminalen Ende und HDEL-ER-Retaining-Peptid am C-terminalen Ende exprimieren. B1 und B34 – transgene Pflanze, die BGL1 ohne Signalpeptid oder HDEL-ER-Retaining-Peptid exprimieren, und die positiv für BGL1-Protein bei der Western-Blot-Analyse waren. An Glu – native β-Glucosidase aus A. niger als Kontrolle.
15 zeigt das Niveau von BGL1-Aktivität in verschiedenen transgenen Pflanzen. WT – nicht transgene Kontrollpflanze. B1 und B21 – transgene Pflanzen, die BGL1 ohne Signalpeptid oder HDEL-ER-Retaining-Peptid exprimieren und die positiv für BGL1-Protein bei der Western-Blot-Analyse waren. CBT8, CBT21, CBT0 und CBT15 – unabhängige Linien von transgenen Pflanzen, die mit Cel1-Signalpeptid verbundenes BGL1 am N-terminalen Ende und HDEL-ER-Retaining-Peptid am C-terminalen Ende exprimieren. CB12, CB13, CB14 und CB15 – vier unabhängige Linien von transgenen Pflanzen, die mit Cel1-Signalpeptid verbundenes BGL1 exprimieren (ohne HDEL).
Die Grundsätze und der Ablauf der vorliegenden Erfindung können unter Bezugnahme auf die Zeichnungen und begleitenden Beschreibungen besser verstanden werden.
Bevor wenigstens eine Ausführungsform der Erfindung detailliert beschrieben wird, gilt zu beachten, dass die Erfindung in ihrer Anwendung nicht auf die Details der in der folgenden Beschreibung dargelegten Bestandteile oder in den folgenden Beispielen exemplarisch dargestellten Bestandteile beschränkt ist. Die Erfindung ist geeignet für weitere Ausführungsformen oder dafür, auf verschiedene Arten ausgeführt oder durchgeführt zu werden. Es gilt auch zu beachten, dass die hier verwendeten Fachbegriffe und die Terminologie dem Zweck der Beschreibung dienen und nicht als einschränkend betrachtet werden.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Nukleinsäure bereitgestellt, die ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid umfasst, das für ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität einer β-Glucosidase codiert. Bevorzugt wird das Polynukleotid von Aspergillus niger abgeleitet, jedoch sind auch andere Quellen anwendbar. Dies schließt alle isolierten Polynukleotide ein, die für Polypeptide mit der katalytischen Aktivität von β-Glucusidase codieren. Derartige Polynukleotide und Polypeptide, die durch ihre GenBank Accession Numbers gekennzeichnet werden, sind in der unten stehenden Tabelle 1 aufgelistet und können sämtlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Tabelle 1 Zugangsnummern von cDNA und ihrer codierten β-Glucosidasen (EC3.2.1.21)
Der Begriff „isoliert" wie er in der Beschreibung und in dem folgenden Teil mit den Ansprüche verwendet wird, bezieht sich auf eine biologischen Verbindung (wie etwa eine Nukleinsäure oder ein Protein oder eine Organelle) die im Wesentlichen von anderen biologischen Bestandteilen abgetrennt oder von diesen gereinigt wurde in der Zelle des Organismus in dem der Bestandteil in der Natur vorkommt, d. h. weitere chromosomale und extrachromosomale DNA und RNA, Proteine und Qrganellen. Nukleinsäuren und Proteine, die „isoliert" wurden, schließen Nukleinsäuren und Proteine ein, die mit normalen Reinigungsverfahren gereinigt wurden. Der Begriff bezieht sich auch auf Nukleinsäuren und Proteine, die durch rekombinante Expression in Wirtszellen sowie chemisch synthethisierten Nukleinsäuren hergestellt wurden.
Die Begriffe "Polynukleotid" und „Polynukleotidsequenz" wie hierin und in dem folgenden Abschnitt mit den Ansprüchen verwendet, können austauschbar verwendet werden und beziehen sich auf eine Nukleotidsequenz, die DNA oder RNA die zum Beispiel genomischen oder synthetischen Ursprungs sein kann, die als Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen kann und die den Sense- oder den Antisensestrang darstellen kann. In ähnlicher Weise werden die Begriffe „Polypeptid" und „Polypeptidsequenz" austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine Aminosäuresequenz mit beliebiger Länge.
Der Ausdruck „komplementäre Polynukleotidsequenz" wie in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt mit den Ansprüchen verwendet, schließt Sequenzen ein, die ursprünglich aus der reversen Transkription von Messenger-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase oder jeder beliebigen RNA-abhängigen DNA-Polymerase stammen. Derartige Sequenzen können anschließend in vivo oder in vitro unter Verwendung einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase verstärkt werden.
Der Ausdruck „genomische Polynukleotidsequenz" wie in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt mit den Ansprüchen verwendet schließt Sequenzen ein, die ursprünglich von einem Chromosom abgeleitet wurden und stellen einen zusammenhängenden Abschnitt eines Chromosoms dar.
Der Ausdruck „zusammengesetzte Polynukleotidsequenz" wie in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt mit den Ansprüchen verwendet, schließt Sequenzen ein, die wenigstens teilweise komplementär und wenigstens teilweise genomisch sind. Eine zusammengesetzte Sequenz kann mehrere exonale Sequenzen einschließen, die für das Polypeptid mit der katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codieren sollen, sowie mehrere intronische Sequenzen, die dazwischen angeordnet sind. Die intronischen Sequenzen können aus jeder beliebigen Quelle stammen, einschließlich anderer Gene und schließen typischerweise konservierte Splicing- Signalsequenzen ein. Derartige intronische Sequenzen können ferner cis-wirksame, Expressions-regulierende Elemente einschließen, wie untenstehend beschrieben.
Der Ausdruck "mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase" wie in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt mit den Ansprüchen verwendet bezieht sich auf eine Polypeptidsequenz, ein Protein oder Fragmente davon, die geeignet sind, als Katalysatoren für eine chemische Reaktion zu dienen, welche die Hydrolyse von O-glycosidischen Bindung von Glucosiden beinhaltet; wobei das Ergebnis die Freisetzung von einem oder mehr β-D-Glucoserest(en) oder ein Aglycon zusätzlich zu dem β-D-Glucoserest sein kann. Insbesondere wird die Hydrolyse durch Retaining-Enzym durchgeführt, während die β-Konfiguration des anomeren Zentrums der Kohlenwasserstoffs beibehalten wird. β-Glucoside haben eine breite spezifische Wirksamkeit, somit hydrolysieren einige Beispiel auch eines aller mehr aus den folgenden: β-D-Galactoside, a-L-Arabinoside, β-D-Xyloside, und β-D-Fucoside.
Der Begriff „Katalysator" wie hier verwendet bezieht sich auf eine Substanz, die eine chemische Reaktion beschleunigt, dabei aber nicht verbraucht oder dauerhaft verändert wird.
Der Begriff „Glucosid" wie hier verwendet bezieht sich auf eine Verbindung aus wenigstens zwei Momomeren, von denen wenigstens eines eine Glucose ist, die eine Glycosidbindung einschließt. Beispiele für Glucoside schließen folgendes ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: Zuckergerüste (Backbones) mit Glucose, wie etwa Diglucose-Zellobiose, und das Glucosepolymer, nämlich Zellulose.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen codiert das Polynukleotid gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung für ein Polypeptid wie in SEQ ID NO: 2 dargelegt oder einen Abschnitt davon, der die katalytische Aktivität einer β-Glucosidase beibehält.
Alternativ oder zusätzlich ist das Polynukleotid gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung so wie in SEQ ID NO: 1, 3 dargelegt oder ein Abschnitt davon, der Abschnitt codiert für ein Polypeptid, das die katalytische Aktivität einer β-Gluosidase beibehält.
In einem umfassenderen Aspekt codieren die Polynukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung für ein Polypeptid das wenigstens zu 75%, wenigstens zu 80%, wenigstens zu 85%, wenigstens zu 90%, wenigstens zu 95% oder mehr, das heißt, 95%–100% homolog zu SEQ ID NO:2 wie unter Verwendung der BestFit-Software des Wisconsin-Analysepakets mit dem Algorithmus von Smith und Waterman bestimmt, ist, wobei die Strafpunkte für das Erzeugen eines Gap 8 (gap creation penalty) betragen und die Strafpunkte für das Verlängern eines Gap 2 (gap extension penalty) beträgt.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen codieren die Polynukleotide gemäß dem weiter gefassten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid wie in SEQ ID NOs: 1 oder 3 dargelegt oder einen Abschnitt davon, der die Aktivität beibehält.
Alternativ oder zusätzlich können die Polynukleotide gemäß diesem weiter gefassten Aspekt der vorliegenden Erfindung mit SEQ ID NOs 1 oder 3 hybridisiert werden.
Die Hybridisierung von langen Nukleinsäuren (z. B. über 200 bp Länge) erfolgt gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung durch stringente oder moderate Hybridisierung, wobei die stringente Hybridisierung durch eine Hybridisationslösung durchgeführt wird, die 10% Dextransulfat, 1 M NaCl, 1% SDS und 5 × 10⁶ cpm ³²p markierten Tester enthält, bei 65°C, mit einer abschließenden Waschlösung von 0,2 × SSC und 0,1% SDS und abschließender Wäsche bei 65°C; während eine moderate Hybridisierung mit einer Hybridisationslösung durchgeführt wird, die 10% Dextransulfat, 1 M NaCl, 1% SDS und 5 × 10⁶ cpm ³²p markierten Tester enthält, bei 65°C, mit einer abschließenden Waschlösung von 1 × SSC und 0,1% SDS und abschließender Wäsche bei 50°C.
Weiterhin sind alternativ oder zusätzlich die Polynukleotide gemäß diesem weiter gefassten Aspekt der vorliegenden Erfindung bevorzugt wenigstens zu 70%, wenigstens zu 75%, wenigstens zu 80%, wenigstens zu 85%, wenigstens zu 90%, wenigstens zu 95% oder mehr, das heißt, 95%–100%, identisch mit SEQ ID NOs: 1 oder 3, wie unter Verwendung der BestFit-Software des Wisconsin-Sequenzanalyse-Pakets unter Verwendung des Algorithmus von Smith und Waterman bestimmt wurde, wobei das Gap-Gewicht 50 entspricht, das Längengewicht 3 entspricht, die mittlere Übereinstimmung 10 entspricht und die mittlere Inkongruenz (mismatch) –9 entspricht.
Somit umfasst dieser weiter gefasste Aspekt der vorliegenden Erfindung (i) Polynukleotide, wie in SEQ ID Nos: 1 oder 3 dargelegt; (ii) Fragmente davon; (iii) damit hybridisierbare Sequenzen; (iv) dazu homologe Sequenzen; (v) Sequenzen, die für ähnliche Polypeptide mit unterschiedlicher Codon-Verwendung codieren; (vi) veränderte Sequenzen, die durch Mutationen charakterisiert sind, wie etwa Deletion, Insertion oder Substitution von einem oder mehr entweder natürlich vorkommenden oder synthetischen, zufällig oder gezielt eingeführten Nukleotiden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Nukleinsäurekonstrukt bereitgestellt, das die hier beschriebene isolierte Nukleinsäure umfasst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäurekonstrukt gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung ferner wenigstens ein cis-wirksames Kontrollelement (regulatorisches Element) für das Regulieren der Expression der isolierten Nukleinsäure. Derartige cis-wirksame regulatorische Elemente schließen zum Beispiel Promotoren ein, von denen bekannt ist, dass sie Sequenzelemente sind, die für die Transkription benötigt werden, da sie dazu dienen DNA-abhängige RNA-Polymerase zu binden, die stromabwärts liegende Sequenzen davon transkribiert. Weitere Details bezüglich verschiedener Regulationselemente werden untenstehend beschrieben.
Die hier beschriebene isolierte Nukleinsäure ein grundlegendes Element der Erfindung ist, ist jedoch modular und kann für verschiedene Zwecke verwendet werden. Der in Verbindung mit dieser Erfindung verwendete Promotor der Wahl ist von zweitrangiger Bedeutung und umfasst jeden beliebigen geeigneten Promotor. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass es dennoch notwendig ist, sicherzustellen, dass die Stelle(n) für den Beginn der Transkription sich stromaufwärts an einem offenen Leserahmen befinden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der gewählte Promotor ein Element, das in den jeweiligen Wirtszellen von Interesse aktiv ist. Diese Elemente können aus transkriptionalen Regulatoren ausgewählt werden, die die Transkription von Genen aktivieren, die grundlegend für das Überleben dieser Zellen unter Stress oder Hunger sind, einschließlich der Hitzeschockproteine.
Ein Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung schließt bevorzugt ferner einen geeigneten auswählbaren Marker ein. In einer bevorzugteren Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung schließt das Konstrukt ferner einen Reptikationsanfang ein. in einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Konstrukt ein Shuttlevektor, der sich sowohl in E. coli verbreiten kann (wobei das Konstrukt) einen geeigneten auswählbaren Marker und Replikationsanfang umfasst) und kompatibel für die Verbreitung in Zellen oder die Integration in dem Genom eines Organismus der Wahl, wie etwa einer Pflanze, sein kann. Das Konstrukt gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel ein Plasmid, ein Bacmid, ein Phagemid, ein Cosmid, eine Phage, ein Virus oder ein künstliches Chromosom sein.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Protein, das ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität einer β-Glucasidase umfasst, bereitgestellt. Das Polypeptid wird bevorzugt von einem Aspergillus niger abgeleitet und schließt bevorzugt ein Signalpeptid und optional ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums ein.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen ist das Polynukleotid gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wie in SEQ ID NO:2 dargelegt oder ein Abschnitt davon, der eine katalytische Aktivität der β-Glucosidase enthält.
SEQ ID NO:2 of β-Glucosidase von A. niger ist ähnlich der Aminosäuresequenz der β-Glucosidase von A. kawachii. Jedoch ist letztere relativ instabil im Gegensatz zu ersterer, das in großen Temperaturbereichen und bei pH-Behandlung in hohem Maße stabil ist, und weist somit bestimmte Nachteile, wodurch es nicht für das Ziel der vorliegenden Erfindung nicht möglich oder weniger vorteilhaft wird, wie weiter unten noch detaillierter beschrieben wird.
Kürzlich haben Iwashita und Mitarbeiter die Sequenz einer β-Glucosidase (GenBank/EMBL AB003470), die aus einem Stamm von Aspergillus kawachii erhalten wurde, veröffentlicht: IF04308. Vergleich zwischen den Sequenzen von β-Glucosidase von Aspergillus kawachii und β-Glucosidase von A. niger zeigte 98%ige Homologie zwischen den beiden.
Enzyme der beiden Aspergillus sp. enthalten sieben Cysteinreste und eine identische Anzahl von Glycosylierungsstellen, unterscheiden sich jedoch in ihrem Glycosylierungsgrad (35).
Die physikalischen und kinetischen Eigenschaften von drei β-Glucosidasen von Aspergillus kawachii wurden beschrieben (35) und es wurde gezeigt, dass die drei Produkte desselben Gens sind, die sich voneinander nur in ihrem Glycosylierungsgrad unterscheiden. Die beiden gereinigten β-Glucosidasen von A. kawachii wurden vollständig inaktiviert, sogar bei mittleren pH-Werten und Temperaturen. In einer genauen Unterscheidung wurde während des Untersuchens der Stabilität der rekombinanten β-Glucosidase von A. niger gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die identisch mit den von Iwashita et al. und wie untenstehend in dem Beispielteil beschrieben sind, wurde festgestellt, dass das Enzym in hohem Maße stabil ist und einen Großteil der enzymatischen Aktivität enthält, auch noch nach einer Stunde Inkubation bei 60°C (68% Aktivität, wie durch die Prozent der Aktivität eines Enzyms bei 4°C definiert).
Somit zeigt unerwartet trotz der Ähnlichkeit zwischen den β-Glucosidasen von A. kawachii und A. niger das Enzym von A. niger signifikant höhere Stabilität gegenüber Wärme und pH-Werten.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die ein Nukleinsäurekonstrukt wie hierin beschrieben umfasst. Der Begriff „Wirtszelle" bezieht sich auf einen Empfänger einer heterologen Nukleinsäure, wobei die Wirtszelle entweder eine prokaryotische Zelle, wie etwa E. coli oder eine eukaryotische Zelle wie etwa eine Hefezelle, eine Hyphomyzetenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Tierzelle sein kann. Beispiele für eine Hefezelle schließen schließen Picha sp. wie etwa P. pastoris, und Saccharomyces sp. wie etwa S. cervisiae. ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Der Begriff "heterolog" wie hier und in dem folgenden Abschnitt mit den Ansprüchen verwendet, bezieht sich bei Verwendung im Zusammenhang mit einer Nukleinsäuresequenz oder einem in einer Pflanze gefundenen Protein, von Pflanzen abgeleitete Pflanzenzellen oder Gewebe oder alternativ in einer eukaryotischen Zelle, wie etwa Hefezelle oder einer prokaryotischen Zelle wie etwa Bakterien, auf Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die typischerweise nicht natürlich in der Pflanze, dem aus der Pflanze abgeleiteten Gewebe oder den Pflanzenzellen vorkommen, oder alternativ auf die eukaryotische Zelle, wie etwa Hefezelle oder die prokaryotische Zelle, wie etwa eine Bakterienzelle. Austauschbar werden Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die üblicherweise nicht natürlich in der Pflanze, dem von der Pflanze abgeleiteten Gewebe oder den Pflanzenzellen oder alternativ, nicht natürlich in der eukaryotischen Zelle, wie etwa einer Hefezelle oder der prokaryotischen Zelle, wie etwa Bakterien, vorkommen, jeweils als „rekombinante Nukleinsäure" und „rekombinantes Protein" bezeichnet. Somit ist eine rekombinante Nukleinsäure eine Nukleinsäure, die nicht natürlicherweise vorkommt oder weist eine Sequenz auf, die durch eine künstliche Kombination von zwei in anderer Weise getrennten Segmentsequenzen hergestellt wurde. Diese künstliche Kombination wird oft durch chemische Synthese durchgeführt oder üblicher, durch die künstliche Manipulierung von isolierten Segmenten von Nukleinsäuren, z. B. durch Methoden der Gentechnik.
Der Begriff "eukaryotische Zelle" wie in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt über die Ansprüche verwendet, bezieht sich auf eine Zelle, die ein Diploid-Genom in wenigstens einem Abschnitt ihres Lebenszyklus enthält, mit membrangebundenem Nukleus mit Chromosomen aus DNA, mit Zellteilung, die eine Art von Mitose beinhalten, in der Spindeln involviert sind. Der eukaryotische Zelltyp kennzeichnet das Reich der Protoctista, Fungi, Plantae und Animalia.
Der Begriff „prokaryotische Zelle" wie in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt mit den Ansprüchen verwendet, bezieht sich auf verschiedene Bakterien und blaugrüne Algen, die durch die Tatsache gekennzeichnet sind, dass kein Zellkern, keine mitotischen Fähigkeiten und komplexe Organellen vorliegen, welche das übergeordnete Reich der Eukaryoten kennzeichnen. Beispiele für prokaryotische Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung, jedoch nicht auf diese beschränkt, sind Bakterien, wie etwa E. coli.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Organismus bereitgestellt, der ein Nukleinsäurekonstrukt wie hier beschrieben, bereitstellt, wie etwa, jedoch nicht darauf beschränkt, eine Pflanze. Ein derartiger Organismus kann transformiert oder viral infiziert sein.
Wie hier verwendet bezieht sich der Ausdruck "transformiert" und seine Ableitungen wie etwa Transformation, transformierend und transformieren, auf den Prozess des Einführens heterologer Nukleinsäuresequenzen in eine Zelle oder einen Organismus, wobei die Nukleinsäuresequenzen an die Nachkommen weitergegeben werden können. Der Begriff heißt dann zum Beispiel „genetisch verändert", „transgen" und „transfiziert" und kann hier verwendet werden, um die vorliegende Erfindung weitergehend zu beschreiben und/oder zu beanspruchen. Der Begriff bezieht sich sowohl auf die Einführung einer heterologen Nukleinsäuresequenz in das Genom eines Organismus und/oder in das Genom einer Nukleinsäure enthaltenden Organelle davon, wie etwa in ein Genom eines Chloroplasten oder Mitochondriums.
Der Begriff „virusinfiziert" wie hier verwendet schließt Infizierung durch ein Virus, das eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, ein. Eine derartige Infizierung führt üblicherweise zu einer vorübergehenden Expression der Nukleinsäuresequenz, wobei die Nukleinsäuresequenz üblicherweise nicht in ein Genom intergriert ist und deshalb nicht an die Nachkommen weiterverbreitet werden kann, außer wenn auch eine Infizierung der Nachkommen erfolgt ist.
Es gibt verschiedene Verfahren für das Einbringen von Fremdgenen sowohl in monokotyle als auch dicotyle Pflanzen (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42: 205–225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338: 274–276). Die grundlegenden Verfahren, wie stabile Integration von exogener DNA in genomische DNA von Pflanzen integriert wird, schließen zwei Hauptansätze ein:

(i) Agrobacterium-vermittelter Gentransfer: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38: 467–486; Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Bd. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., und Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) S. 2–25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. und Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) S. 93–112.
(ii) direkte DNA-Aufnahme: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cel1 Genetics of Plants, Bd. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., und Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) S. 52–68; einschließlich Verfahren für die direkte Aufnahme von DNA in Protoplasten, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6: 1072–1074. durch kurzen Stromschlag an Pflanzenzellen induzierte DNA-Aufnahme: Zhang et al, Plant Cell Rep. (1988) 7 379–384. Fromm et al. Nature (1986) 319: 791–793. DNA-Injizierung in Pflanzenzellen oder Gewebe durch Partikelbeschuss, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6: 559–563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6: 923–926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79: 206–209; durch die Verwendung von Micropipettensystemen: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75: 30–36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79: 213–217; oder durch die direkte Inkubation von DNA mit keimendem Blütenstaub, DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. und Mantell, S. H. und Daniels, W. Longman, London, (1985) S. 197–209; und Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 715–719.

Das Agrobacterium-System schließt die Verwendung von Plasmidvektoren ein, die definierte DNA-Segmente enthalten, die in die DNA des Pflanzengenoms integriert werden. Verfahren der Inokulation des Pflanzengewebes unterscheiden sich je nach Pflanzenspezies und dem Delivery-System von Agrobacterium. Ein weltverbreiteter Ansatz ist das Leaf-Disc-Verfahren, das mit jedem beliebigen Gewebeimplantat durchgeführt werden kann, das eine gute Quelle für die Initiierung der Differenzierung von Pflanzen bereitstellt. Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) S. 1–9. Ein zusätzlicher Ansatz verwendet das Delivery-System des Agrobacterium in Kombination mit Vakuumfiltration. Das Agrobacterium-System ist besonders nützlich bei der Erzeugung von transgenen dicotylen Pflanzen.
Es gibt verschiedene Verfahren des direkten DNA-Transfers in Pflanzenzellen. Bei der Elektroporation werden die Protoplasten kurz einem starken elektrischen Feld ausgesetzt. Bei der Mikroinjektion wird die DNA direkt mechanisch in die Zellen unter Verwendung von sehr kleinen Mikropipetten injiziert. Bei dem Beschuss mit Mikropartikeln wird die DNA auf Mikroprojektile wie etwa Magnesiumsulfatkristalle aller Wolframpartikel absorbiert, und die Mikroprojektile werden physikalisch in Zellen oder Pflanzengewebe hinein beschleunigt.
Folgende Verbreitung der Transformationspflanze wird durchgeführt. Die am häufigsten eingesetzte Verbreitungsart für Pflanzen ist die Verbreitung durch Samen. Regeneration durch Verbreitung hat jedoch den Nachteil, dass aufgrund von Heterozygotie der Bestand nicht uniform ist, da die Samen von Pflanzen mit den genetischen Variationen gemäß den Mendelschen Regeln erzeugt werden. Grundsätzlich ist jeder Samen genetisch verschieden, und es werden sich aus ihm spezifische Pflanzen entwickeln. Aus diesem Grund ist bevorzugt, dass die transformierte Pflanze derart hergestellt werden kann, dass die regenerierte Plfanze identisches Aussehen und identische Eigenschaften wie die transgene Pflanze der Elterngeneration hat. Aus diesem Grund wird bevorzugt, dass die transformierte Pflanze durch Mikropropagation regeneriert wird, wodurch eine schnelle, konsistente Reproduktion der transformierten Pflanzen bereitgestellt wird.
Mikropropagation ist ein Prozess des Züchtens einer neuen Generation von Pflanzen aus einem einzelnen Gewebestück, das aus einer ausgewählten Pflanze der Elterngeneration oder der Sorte herausgeschnitten wurde. Dieser Prozess ermöglicht die Massenreproduktion von Pflanzen mit dem bevorzugten Gewebe, welches das Protein exprimiert. Die Pflanzen der neuen Generation, die hergestellt werden, sind genetisch mit der ursprünglichen Pflanze identisch und weisen alle Eigenschaften derselben auf. Die Mikropropagation ermöglicht die Massenproduktion von Qualitätspflanzenmaterial in einem kurzen Zeitraum und bietet eine schnelle Vervielfältigung von ausgewählten Sorten bei gleichzeitiger Bewahrung der Eigenschaften der ursprünglichen transgenen oder transformierten Pflanze. Die Vorteile des Klonierens von Pflanzen sind die Geschwindigkeit der Pflanzenvervielfältigung und die Qualität und Uniformität der hergestellten Pflanzen.
Mikropropagation ist ein Verfahren mit mehreren Schritten, das eine Änderung des Kulturmediums oder der Wachstumsbedingungen von einem Schritt zum nächsten erforderlich macht. Somit beinhaltet das Mikropropagationsverfahren vier grundlegende Schritte: Schritt eins, initiales Kultivieren von Gewebe; Schritt zwei, Vervielfältigung von Gewebekultur; Schritt drei, Differenzierung und Pflanzenbildung; und Schritt vier, Anbau im Gewächshaus und Heranwachsen. In Schritt eins, dem initialen Kultivieren von Gewebe, wird die Gewebekultur eingerichtet und als frei von Verunreinigungen zertifiziert. In Schritt zwei wird die initiale Gewebekultur vervielfältigt, bis eine ausreichende Zahl von Gewebeproben hergestellt wurde, um die Zielvorgaben der Produktion zu erfüllen. In Schritt drei werden die in Schritt zwei gezüchteteten Gewebeproben geteilt und wachsen zu einzelnen Pflänzchen heran. In Schritt vier werden die transformierten Pflänzchen in ein Gewächshaus gebracht, um heranzuwachsen, wobei die Pflanzen schrittweise dem Licht ausgesetzt werden, so dass sie in der natürlichen Umgebung wachsen können.
Sequenzen, die geeignet sind für das Ermöglichen der Integration der heterologen Sequenz in das Pflanzengenom werden empfohlen. Diese können Transposon-Sequenzen und ähnliches für die homologe Rekombination sowie Ti-Sequenzen einschließen, die das zufällige Einfügen einer heterologen Expressionskassette in ein Pflanzengenom ermöglichen.
Geeignete Prokaryoten-Marker, die ausgewählt werden können schließen Resistenz gegenüber Antibiotika wie etwa Ampicillin oder Tetrazyklin ein. Weitere DNA-Sequenzen, die für zusätzliche Funktionen codieren, können auch in dem Vektor vorliegen, wie im Stand der Technik bekannt.
Die Konstrukte der vorliegenden Erfindung schließen eine Expressionskassette für die Expression des Proteins von Interesse ein. Normalerweise gibt es nur eine Expressionskassette, auch wenn zwei oder mehr möglich sind. Die rekombinante Expressionskassette enthält zusätzlich zu der heterologen Sequenz eines oder mehr der folgenden Sequenzelemente, eine Promotor-Region, untranslatierte 5'-Sequenzen von Pflanzen, die regulatorische Elemente einschließen, einen Startcodon, abhängig davon, ob das Strukturgen einen solchen aufweist oder nicht, und eine Transkriptions- und Translations-Terminationssequenz. Eindeutige Bindungsstellen für Restriktionsenzyme an den 5'- und 3'-Enden der Kassette ermöglichen eine einfache Einfügung in einen vorher vorhandenen Vektor.
Der Begriff "regulatorisches Element" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die üblicherweise innerhalb einer Expressionskassette eingeschlossen ist und die an der Regulation (d. h., bei der Erhöhung oder Verminderung) der Expression einer codierenden Sequenz davon beteiligt ist. Diese Regulierung kann entweder in dem Schritt der Transkription oder der Translation durchgeführt werden. Beispiele für regulatorische Elemente schließen Enhancer, Suppressoren oder Transkriptionsterminatoren ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Promotor" auf eine Nukleotidsequenz, welche die Genexpression in den Zellen leiten kann. Ein derartiger Promotor kann von einer Pflanze, einem Pflanzenvirus oder von jedem beliebigen weiteren Organismus einschließlich Bakterien und Tieren abgeleitet sein.
Ein Pflanzen-Promotor kann ein konstitutiver Promotor sein, wie etwa, jedoch nicht beschränkt auf die folgenden: CaMV35S- und CaMV19S-Promotor, FMV34S-Promotor, Sugarcane-Bacilliform-Badnavirus-Promotor, CsVMV-Promotor, Arabidopsis ACT2/ACT8 Actin-Promotor, Arabidopsis ubiquitin UBQ1 Promotor, Barley-Leaf-Thionin BTH6 Promotor, and Rice-Actin-Promotor.
Der Promotor kann alternativ ein Gewebe-spezifischer Promotor sein. Beispiele für Planzengewebe-spezifische Promotoren schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein: Bean Phaseolin Storage Protein Promoter, DLEC-Promotor, PNSβ-Promoter, Zein-Stprotein-Promotor, Conglutin-Gamma-Promotor von Sojabohne, AT2S1-Gen-Promotor, ACT11-Actin Promotor von Arabidopsis, napA Promotor von Brassica napus, Potato Patatin Gen-Promotor und der Tob-Promotor.
Der Promotor kann auch ein Promotor sein, der in einem spezifischen Entwicklungsstadium eines Lebenszyklus der Pflanze aktiv ist, zum Beispiel ein Promotor, der in der späten Embryogenese aktiv ist, wie etwa: Der LEA-Promotor, der Endosperm-spezifische Expressionspromotor (der Samenspeicher Prolamin aus Reis wird in Tabaksamen in dem Entwicklungsstadium ungefähr 20 Tage nach der Blüte exprimiert), oder der das FbL2A-Gen steuernde Promotor während des Stadiums der Synthese der Faserwand.
Im Falle eines Gewebe-spezifischen Promotors wird sichergestellt, dass das heterologe Protein nur in dem gewünschten Gewebe exprimiert wird, zum Beispiel nur in der Blüte, der Frucht, der Wurzel, dem Samen, etc.
Sowohl die Gewebe-spezifischen als auch die nicht-spezifischen Promotoren können konstitutiv sein, d. h. können kontinuierliche Expression des heterologen Proteins verursachen.
Der Promotor kann auch ein induzierbarer Promotor sein, d. h. ein Promotor, der in Anwesenheit eines induzierenden Agens aktiviert wird und nur durch diese Aktivierung die Expression des heterologen Proteins verursacht. Ein induzierendes Agens kann zum Beispiel Licht, Chemikalien, Austrocknung, hoher Salzgehalt, osmotischer Schock, oxidierende Bedingungen oder bei Pathogenität und schließen folgendes ein, ohne darauf beschränkt zu sein: den lichtinduzierbaren Promotor, der von dem rbcS-Gen der Bohne abgeleitet ist, der Promotor von dem alfalfa rbcS-Gen der Luzerne, die Promotoren DRE, MYC und MYB, die bei Trockenheit aktiv sind, die Promotoren INT, INPS, prxEa, Ha hsp17.7G4 und RD21, die bei hohem Salzgehalt und osmotischem Stress aktiv sind, die Promotoren hsr303J und str246C, die bei pathogenemStress aktiv sind, das Kupfer-kontrollierbare Genexpressionssystem und das steroid-induzierbare Gensystem.
Alternativ kann ein induzierendes Agens ein endogenes Agens sein, das normalerweise nur in bestimmten Geweben der Pflanze vorliegt oder nur zu bestimmten Zeitpunkten des Lebenszyklus der Pflanze hergestellt wird, wie etwa Ethylen oder Steroide. Unter Verwendung eines derartigen endogenen Gewebe-spezifischen induzierenden Agens ist es möglich, die Expression von derartigen induzierbaren Promotoren nur in diesen spezifischen Geweben zu steuern. Unter Verwendung eines induzierenden Agens, das während einer spezifischen Periode des Lebenszyklus hergestellt wurde, ist es möglich, die Expression von einem induzierbaren Promotor bis zu der spezifischen Phase in dem Lebenszyklus, in dem das induzierende Agens hergestellt wurde, zu steuern.
Von Bakterien und Hefe abgeleitete Promotoren sind im Stand der Technik bekannt.
Viren sind eine einzigartige Klasse von infektiösen Agentien, deren kennzeichnende Merkmale ihre einfache Organisationsform und ihr Replikationsmechanismus sind. Ein vollständiger viraler Partikel oder Virion kann hauptsächlich betrachtet werden als ein Block von genetischem Material (entweder DNA oder RNA), der geeignet zur autonomen Replikation ist und der von einer Proteinhülle und manchmal von einer zusätzlichen membranartigen Hülle umgeben ist, wie etwa im Falle von α-Virusen. Die Hülle schützt den Virus gegenüber der Umgebung und dient als Vehikel für die Übertragung von einer Wirtszelle in eine andere.
Viren, die nützlich für die Transformation von Pflanzenwirtszellen sind schließen CaV, TMV und BV ein. Transformation von Pflanzen unter Verwendung von Pflanzenviren wird in U.S. Pat. Nr. 4,855,237 (BGV), EP-A 67,553 (TMV), in der veröffentlichten japanischen Anmeldung Nr. 63–14693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV) und Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, S. 172–189 ff. (1988). Pseudoviruspartikel für die Verwendung für die Expression von Fremd-DNA in vielen Wirtszellen, einschließlich Pflanzen, werden in WO 87/06261 beschrieben.
Konstruktion von Planzen-RNA-Viren für die Einführung und Expression von nicht-viralen Fremdgenen in Pflanzen wird durch die obigen Quellen sowie von Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172: 285–292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6: 307–311; French et al. Science (1986) 231: 1294–1297; und Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269: 73–76 gezeigt.
Wenn das Virus ein DNA-Virus ist, dann kann die Konstruktion an dem Virus selbst vorgenommen werden. Alternativ kann das Virus zuerst in ein bakterielles Plasmid geklont werden, um das Konstruieren des erwünschten viralen Vektors mit der Fremd-DNA zu erleichtern. Das Virus kann dann aus dem Plasmid ausgeschnitten werden. Wenn das Virus ein DNA-Virus ist, kann eine bakterielle Replikationsstartstelle an die virale DNA angehängt werden, die dann durch die Bakterien repliziert wird. Transkription und Translation dieser DNA stellen das Hüllenprotein her, das die virale DNA enkapsidiert. Wenn das Virus ein RNA-Virus ist, dann wird das Virus im Allgemeinen als eine cDNA geklont und in ein Plasmid eingesetzt. Das Plasmid wird dann verwendet, um sämtliche Konstruktionen herzustellen. Das RNA-Virus wird dann durch das Transkribieren der viralen Sequenz des Plasmids und die Translation der viralen Gene hergestellt, um das Hüllenproteine oder die Hüllenproteine herzustellen, das/die die virale DNA enkapsidieren.
Konstruktion von Pflanzen-RNA-Viren für das Einführen und die Expression von nicht-viralen Fremdgenen in Pflanzen wird durch die obigen Quellen sowie in US-Pat. Nr. 5,316,931 gezeigt.
In einer Ausführungsform wird eine virale Nukleinsäure einer Pflanze bereitgestellt, in der die codierende Sequenz des nativen Hüllenproteins aus einer viralen Nukleinsäure, einer codierenden Sequenz eines nicht-nativen Hüllenproteins einer Pflanze und einem Nicht-Promotor entfernt wurde, vorzugsweise wurde der subgnenomische Promotor der codierenden Sequenz des nicht-nativen Hüllenproteins, die geeignet ist zur Expression in dem Pflanzenwirt ist, der die virale Nukleinsäure der rekombinanten Pflanze verpackt und eine systemische Infizierung des Wirts durch die virale Nukleinsäure der rekombinanten Pflanze sicherstellt eingesetzt Alternativ kann das Gen des Hüllenproteins durch Einsetzen der nicht-nativen Nukleinsäuresequenz inaktiviert werden, wodurch ein Protein hergestellt wird. Die virale Nukleinsäure der rekombinanten Pflanze kann einen oder mehr zusätzliche nicht-native subgenomische Promotoren enthalten. Jeder nicht-native subgenomische Promoter ist geeignet, benachbarte Gene oder Nukleinsäuresequenzen in dem Pflanzenwirt zu transkribieren oder zu exprimieren und ungeeignet zur Rekombination miteinander und mit nativen subgenomischen Promotoren. Nicht-native (Fremd-)Nukleinsäuresequenzen können neben dem viralen subgenomischen Promotor der rekombinanten Pflanze oder den nativen oder nicht-nativen viralen subgenomischen Promotor einer Pflanze eingesetzt werden, falls mehr als eine Nukleinsäuresequenz eingeschlossen ist. Die nicht-nativen Nukleinsäuresequenzen werden in der Wirtspflanze gesteuert von dem subgenomischen Promotor transkribiert oder exprimiert, um die erwünschten Produkte herzustellen.
In einer zweiten Ausführungsform wird eine virale Nukleinsäure der rekombinanten Pflanze wie in der ersten Ausführungsform bereitgestellt, außer dass die Codierungssequenz des nativen Hüllproteins neben einem der subgenomischen Promotoren der nicht-nativen Hüllproteine anstatt einer Codierungssequenz eines nicht-nativen Hüllproteins angeordnet ist.
In einer dritten Ausführungsform wird eine virale Nukleinsäure einer rekombinanten Pflanze bereitgestellt, in der das Gen für das native Hüllprotein neben seinem subgenomischen Promotor angeordnet ist und einer oder mehr nicht-native subgenomische Promotoren wurden in die virale Nukleinsäure eingesetzt. Die eingesetzten, nicht-nativen subgenomischen Promotoren sind geeignet für das transkribieren oder Exprimieren von benachbarten Genen in einem Pflanzenwirt und sind ungeeignet, miteinander und mit nativen subgenomischen Promotoren zu rekombinieren. Nicht-native Nukleinsäuresequenzen können neben den nicht-nativen subgenomischen viralen Promotoren der Pflanze eingesetzt werden, so dass diese Sequenzen in dem Pflanzenwirt gesteuert von dem subgenomischen Promotor transkribiert oder exprimiert werden, um das gewünschte Produkt herzustellen.
In einer vierten Ausführungsform wird eine virale Nukleinsäure einer rekombinanten Pflanze wie in der dritten Ausführungsform bereitgestellt, außer dass die codierende Sequenz des nativen Hüllenproteins durch eine codierende Sequenz eines nicht-nativen Hüllenproteins ersetzt wird.
Die viralen Vektoren werden von den von der viralen Nukleinsäure der rekombinanten Pflanze codierten Hüllenproteinen enkapsidiert, um den rekombinanten Pflanzenvirus herzustellen. Die virale Nukleinsäure der rekombinanten Pflanze oder das Virus der rekombinanten Pflanze werden verwendet, um geeignete Wirtspflanzen zu infizieren. Die virale Nukleinsäure der rekombinanten Pflanze ist geeignet für die Replikation in dem Wirt, zur systemischen Verbreitung in dem Wirt und zur Transkription oder Expression von einem oder mehreren Fremdgen(en) in dem Wirt, um das erwünschte Protein herzustellen.
In vielen Fällen ist erwünscht, die Expression eines rekombinanten Proteins gezielt durchzuführen. Dies kann innerhalb einer Zellorganelle oder außerhalb der Zelle sein.
Dies kann erreicht werden, wie im Stand der Technik bekannt, durch geeignete Signalpeptide, die mit dem Ziel-Polypeptid bevorzugt am N-terminalen Ende verbunden werden.
Somit bezieht sich der Begriff "Signalpeptid" wie hier und in dem folgenden Abschnitt mit den Patentansprüchen verwendet, auf eine Abfolge von Aminosäuren, die wirksam ist für das gezielte Einführen eines in einer Zelle exprimierten Proteins an eine Ziel-Stelle. Verschieden, im Stand der Technik bekannte, Signalpeptide, sind wirksam für die Sekretion eines Proteins aus Bakterien-, Hefe-, Pflanzen- und Tierzellen.
Es gilt zu beachten, dass in dieser Hinsicht die Signalpeptide die Aufgabe der Translokation des hergestellten Proteins in der Membran des endoplasmatischen Retikulums erfüllen. In ähnlicher Weise stoppen Transmembran-Segmente die Translokation und stellen eine Verankerung des Proteins an der Plasma-Membran bereit, siehe, Johnson et al. The Plant Cell (1990) 2: 525–532; Sauer et al. EMBO J. (1990) 9: 3045–3050; Mueckler et al. Science (1985) 229: 941–945. Mitochondriale, nukleare, chloroplastische oder vakuloare Signale führen das exprimierte Protein korrekt in die entsprechende Organelle durch den sekretorischen Weg, siehe Von Heijne, Eur. J. Biochem. (1983) 133: 17–21; Yon Heijne, J. Mol. Biol. (1986) 189 239–242; Iturriaga et al. The Plant Cell (1989) 1: 381–390; McKnight of al., Nucl. Acid Res. (1990) 18: 4939–4943; Matsuoka und Nakamura, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 834–838. Ein kürzlich veröffentliches Buch von Cunnigham und Porter (Recombinant proteins from plants, Eds. C. Cunningham and A. J. R. Porter, 1998 Humana Press Totowa, N. J.) beschreibt Verfahren für die Herstellung von rekombinanten Proteinen in Pflanzen und Verfahren für das gezielte Einführen der Proteine in verschiedene Kompartimente in der Pflanzenzelle. Insbesondere beschreiben zwei Kapitel darin (14 und 15) verschiedene Verfahren, um Sequenzen gezielt einzuführen, was zu einer Akkumulierung von rekombinanten Proteinen in Kompartimenten wie etwa ER, Vakuole, Plastid, Nukleus und Zytoplasma führt. Das Buch von Cunningham und Porter ist durch die Bezugnahme darauf hier inkorporiert. Derzeit ist die bevorzugte Stelle für die Akkumulierung des Fusionsproteins gemäß der vorliegenden Erfindung das ER unter Verwendung eines Signalpeptids wie etwa Cel1 oder das Reis-Amylase-Signalpeptid am N-terminalen Ende und ein ER-Retaininging-Peptid (HDEL, SEQ ID NO: 17; or KDEL, SEQ ID NO: 24) am C-terminalen Ende.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Herstellen einer rekombinanten β-Glucosidase bereitgestellt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird durchgeführt durch das Einführen eines Nukleinsäurekonstrukts in einer exprimierbaren oder überexprimierbaren Form in eine Wirtszelle. Das Nukleinsäurekonstrukt schließt ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid ein, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist und ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität einer β-Glucosidase codiert. Das Polynukleotid schließt bevorzugt ferner ein Signalpeptid ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist. Noch bevorzugter schließt das Polynukleotid ferner ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist.
Der Begriff "Einführen" wie hier verwendet bezieht sich sowohl auf das Transformieren als auch das virale Infizieren, so wie diese Begriffe oben definiert sind. Die Begriffe „exprimierbare Form" und „überexprimierbare Form" beziehen sich auf eine rekombinante Form, welche die erforderlichen regulatorischen Elemente einschließt, um die Expression oder Überexpression eines codierenden Bereichs zu erreichen, wie oben detailliert ausgeführt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptid mit der katalytischen Aktivität der β-Glucosidase aus der exprimierenden Wirtszelle extrahiert, nachdem eine ausreichende Expression festgestellt wurde.
Somit stellen Wirtszellen, die das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung exprimieren, eine sofortige, einfache und unbegrenzte Quelle des Polypeptids bereit.
Jede beliebige Anzahl von bekannten flüssigen oder festen Kulturmedien kann für das geeignete Kultivieren von Wirtszellen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, auch wenn das Wachstum auf flüssigem Medium bevorzugt wird, da die Sekretion des Polypeptids in das Medium zu einer Vereinfachung der Gewinnung des Polypeptids führt. Wie oben näher beschrieben, kann eine derartige Sekretion durch die Inkorporation eines geeigneten Signalpeptids erfolgen. Die β-Glucosidase kann aus Zubereitungen von Wirtszellen isoliert oder abgetrennt oder gereinigt werden, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken, wie etwa, Zentrifugationsfiltration, Chromatographie, Elektrophorese und Dialyse, jedoch nicht auf diese beschränkt. Weitere Konzentrierung und/oder Reinigung der β-Glucosidase kann erfolgen durch die Verwendung herkömmlicher Techniken, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Ultrafiltration, ferner Dialyse, Ionaustauschchromatographie, HPLC, Größen-Ausschlusschromatographie, Zellobiose-Sepharose-Affinitätschromatographie und Elektrophorese, wie etwa Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE). Unter Verwendung dieser Techniken kann β-Glucosidase in reiner oder in im Wesentlichen reiner Form gewonnen werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenen Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von wenigstens einer Fermentations-Substanz in einem Fermentationsprodukt bereitgestellt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt durch das Fermentieren eines Glucose enthaltenden Ausgangsmaterials für die Fermentation durch eine Wirtshefezelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, und das ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität der β-Glucasidase codiert, wodurch das Niveau von wenigstens einer Fermentations-Substanz in dem Fermentations-Produkt erhöht wird. Das Polynukleotid schließt bevorzugt ferner ein Signalpeptid ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist. Noch bevorzugter schließt das Polynukleotid ferner ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist.
Gemäß einem alternativen Aspekt der vorliegenen Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von wenigstens einer Fermentations-Substanz in einem Fermentations-Produkt bereitgestellt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt durch das Fermentieren eines von einer Pflanze abgeleiten, Glucose enthaltenden Ausgangsmaterials für die Fermentation durch eine Hefezelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, und das ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert, wodurch das Niveau von wenigstens einer Fermentations-Substanz in dem Fermentations-Produkt erhöht wird. Das Polynukleotid schließt bevorzugt ferner ein Signalpeptid ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist. Nach bevorzugter schließt das Polynukleotid ferner ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums ein, das in Übereinstimmung mit dem Polypeptid ist.
Der Begriff "Fermentation" wie in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt mit den Ansprüchen verwendet, bezieht sich auf eine chemische Veränderung, die in einer komplexen organischen Verbindung durch Wirkung eines Enzyms induziert wird, wodurch die Substanz in einfachere Verbindungen gespalten wird. Insbesondere schließt der Begriff „Fermentation" die anaerobe Dissimilation von Substraten unter Freisetzung von Energie und reduzierten Verbindungen ein; die Endprodukte davon sind organische Säuren, Alkohole, wie etwa Ethanol, Isopropanol, Butanol, etc. und CO₂. Derartige Produkte werden üblicherweise sekretiert und jedes davon wird hier als „Fermentations-Substanz" bezeichnet, d. h., jedes bekannte Produkt einer Fermentation von entweder mikrobieller Fermentation oder Hefefermentation.
Der Begriff "Fermentations-Produkt" wie in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt mit den Ansprüchen verwendet, bezieht sich auf das resultierende Material eines Fermentations-Verfahrens. Beispiele schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein, Alkohol-enthaltendes Fermentationsmedium und alkoholische Getränke, wie etwa, jedoch nicht auf diese beschränkt, Frucht-basierte, Alkohol-enthaltende Getränke, Weine und Biere.
Die β-Glucosidase ist wirksam für das Hydrolysieren einer Vielzahl von Zellulose-enthaltenden Materialien in Glucose, wenn sie zum Beispiel mit einer β-Glucanase verwendet wird. Die durch die enzymatische Hydrolyse der Zellulose und weiterer Glucose enthaltenden Saccharide hergestellte Glucose kann gewonnen und gelagert werden, oder sie kann anschließend unter Verwendung von herkömmlichen Techniken zu Ethanol fermentiert werden. Viele Verfahren für die Fermentation von aus Zellulose erzeugter Glucose sind bekannt und geeignet für eine Verwendung hierbei. Zusammengefasst wird das die Glucose aus der enzymatischen Reaktion enthaltende Hydrolysat mit einem geeigneten Mikroorganismus in Kontakt gebracht, unter Bedingungen, die wirksam für die Fermentation der Glucose zu Ethanol sind. Diese Fermentation kann getrennt von der enyzmatischen Hydrolyse der Zellulose erfolgen oder nach dieser erfolgen (sequenzielle Verarbeitung), oder die Hydrolyse und die Fermentation können gleichzeitig erfolgen und in demselben Gefäß durchgeführt werden (gleichzeitige Verarbeitung). Details der verschiedenen Fermentationstechniken, Bedingungen und geeigneten Mikroorganismen sind zum Beispiel von Wyman (1994, Bioresource Technol., 50: 3–16) oder Olsson und Hahn-Hagerdal (1996, Enzyme Microbial Technol., 18: 312–331), beschrieben, wobei der Inhalt dieser Quellen durch die Bezugnahme auf dieselben hier inkorporiert ist. Nachdem die Fermentation abgeschlossen ist, kann der Alkohol durch Extraktion gewonnen werden und gegebenenfalls gereinigt werden, z. B. durch Destillation.
Somit wird gemäß noch einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für das Herstellen eines Alkohols bereitgestellt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt durch das Fermentieren eines Glucose enthaltenden Fermentation-Ausgangsmaterials durch eine Zelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, und das ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität der β- Glucosidase codiert, und durch das Extrahieren des Alkohols daraus. Das Polynukleotid schließt bevorzugt ferner ein Signalpeptid ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist. Noch bevorzugter codiert das Polynukleotid ferner für ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums ein, das in Übereinstimmung mit dem Polypeptid ist.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Herstellen eines Alkohols bereitgestellt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt durch das Fermentieren eines aus einer Pflanze abgeleiten, Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterials durch eine Zelle, wobei die Zeile ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, und das ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert und das Extrahieren des Alkohols daraus. Das Polynukleotid codiert bevorzugt ferner für ein Signalpeptid, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist. Noch bevorzugter schließt das Polynukleotid ferner ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums ein, das in Übereinstimmung mit dem Polypeptid ist.
Pflanzen enthalten Aroma- und Geschmacksverbindungen glycosidischer Art, die in ihnen enthaltene Aroma-Eigenschaft kann durch abbauende Enzyme freigesetzt werden, wodurch eine nicht-flüchtige Aromaverbindung in ihre flüchtige Form umgewandelt wird. So wirken zum Beispiel α-L-Arabinofuranosidasen bei der Freisetzung von Aromaverbindungen aus Substraten wie etwa Säften oder Weinen mit, wie in Gunata et al. (European Patent Application No. 332. 281, 1989; and "purification and some properties of an α-L-arabinofuranosidase from A. niger action on grape monoterpenyl arabinofuranosylglucosides. J. Agric. Food Chem. 38: 772–776, 1990) beschrieben. Diese Freisetzung wird zum Beispiel in einem Verfahren mit zwei Schritten erreicht, wobei der erste Schritt die Verwendung einer α-L-Arabinofuranosidase umfasst, um die Freisetzung von Arabinoseresten aus Monoterpenyl-α-L-Arabinofuranosyl-Glucosiden, die zum Beispiel in Frucht- oder Gemüsesäften enthalten sind, über die Spaltung der (1→6)-Bindung zwischen einer terminalen Arabinofuranosyleinheit und der zentralen Glucose eines Monterpeny-α-L-Arabinofuranosylglucosids zu katalysieren. Die α-L-Arabinofuranosidase liegt bevorzugt in einer gereinigten Form vor, um den unerwünschten Abbau von anderen Inhaltsstoffen des Saftes zu verhindern, der dessen Endqualität gefährden könnte. In dem zweiten Schritt wird β-Glucosidase benötigt, um das freie Terpenol aus dem resultierenden dearabinosylierten Monoterpenyl-Glucosid zu gewinnen. Gegebenenfalls können beide Reaktionsschritte in demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden, ohne dass das Zwischenprodukt isoliert werden muss (Gunata et al. (1989), supra). Somit ist beta-Glucosidase ein wichtiger Teilnehmer, wenn die Freisetzung dieser Aroma-Verbindungen für das Verbessern des Geschmacks des Saftes oder Weins gewünscht wird. Des Weiteren stellt beim Wein die Steuerung der Freisetzung von Aromaverbindungen Weine mit einem konsistenteren Geschmack bereit, wodurch die unerwünschten Auswirkungen von „Jahren mit schlechter Weinernte" („poor vintage years") reduziert oder eliminiert werden. Zusätzliche Informationen sind enthalten in: "Cloning and expression of DNA molecules encoding arabinan degrading enzyme of fungal origin", U.S. Pat. Nr. 5,863,783; Y. Gueguen, of al. "A Very Efficient β-Glucosidase Gatalyst for the Hydrolysis of Flavor Precursors of Wines and Fruit Juices", J. Agric. Food Chem. 44: 2336–2340, 1996, die hier durch die Bezugnahme inkorporiert sind.
Somit wird gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von wenigstens einer Aroma-Substanz in einem von einer Pflanze abgeleiteten Produkt, wie etwa einem alkoholischen Getränk, jedoch nicht auf dieses beschränkt, bereitgestellt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt durch das Inkubieren eines Glucose enthaltenden Pflanzen-Ausgangsmaterials mit einer Hefezelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, und das ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert, wodurch das Niveau der wenigstens einen Aroma-Substanz in dem von der Pflanze abgeleiteten Produkt erhöht wird. Das Polynukleotid schließt bevorzugt ferner ein Signalpeptid ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist. Noch bevorzugter schließt das Polynukleotid ferner ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums ein, das in Übereinstimmung mit dem Polypeptid ist.
Bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung in die Praxis wurde entdeckt, dass das Expressionskonstrukt ein Signalpeptid enthalten sollte, um die Aktivität einer β-Glucosidase in einer transgenen Pflanze zu erhalten. Zusätzlich wurde gefunden, dass das Beibehalten des Enzyms in dem endoplasmatischen Retikulum zu einer höheren Freisetzung von Aroma-Verbindungen nach der Homogenisierung und Inkubation führt. Es wird angenommen, dass die Kompartimentierung des Enzyms in zum Beispiel dem ER verhindert, dass es mit dessen Substraten reagiert, die hauptsächlich außerhalb der Zellen sind, so dass eine derartige Wechselwirkung nach der Homogenisierung eingeschränkt werden. In der Tat führte das gezielte Führen des Enzyms zu dem Apoplasten zu einer erhöhten Aroma-Freisetzung in vivo. Somit kann in Abhängigkeit von der jeweiligen Anwendung gewählt werden, ob in dem Konstrukt ein Retaining-Peptid des endosplasmatischen Retikulums eingeschlossen werden soll oder nicht.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von wenigstens einer Aroma-Substanz in einem von einer Pflanze abgeleiteten Produkt, wie etwa in einem alkoholischen Getränk, jedoch nicht auf dieses beschränkt, bereitgestellt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt durch das Inkubieren eines Glucose enthaltenden Pflanzen-Ausgangsmaterials mit einer Hefezelle, wobei die Pflanze ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, und das für ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert, wodurch das Niveau der wenigstens einen Aroma-Substanz in dem von der Pflanze abgeleiteten Produkt erhöht wird. Das Polynukleotid schließt bevorzugt ferner ein Signalpeptid ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist. Noch bevorzugter schließt das Polynukleotid ferner ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist.
Der Begriff „Glucose enthaltendes Ausgangsmaterial" wie hier in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt mit den Ansprüchen verwendet, bezieht sich auf jede beliebige Energiequelle, in Form von Glucose-enthaltenden Verbindungen, die verschieden von freier Glucose sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, zerkleinertes, gemahlenes, in Würfel geschnittenes oder extrahiertes Pflanzenmaterial, Pflanzen oder Teile davon, wie etwa Früchte, Beispiele dafür sind tropische Früchte und Trauben.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Herstellen einer Aroma-verströmenden Pflanze bereitgestellt. Der Begriff „Aroma-verströmende Pflanze" wie hier in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt verwendet bezieht sich im Wesentlichen auf jeden Teil einer Pflanze, in dem flüchtige Verbindungen durch die katalytische Aktivität des Polypeptids der β-Glucosidase der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, wobei die Freisetzung der flüchtigen Verbindungen daraus von dem olfaktorischen System eines Organismus, wie etwa eines Menschen, wahrgenommen wird.
Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt durch das Überexprimieren eines Nukleinsäurekonstrukts in der Pflanze, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das von Aspergillus niger abgeleitet ist, das ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert, wodurch die Aroma-verströmung aus der Pflanze erhöht wird. Eine derartige Überexprimierung erfolgt bevorzugt in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise durch, zum Beispiel, das Verwenden eines Gewebe-spezifischen Promotors, wie hierin oben beschrieben, um dadurch ein heterologes Protein in einem ausgewählten Abschnitt der Pflanze zu überexprimieren. Das Gewebe, in dem eine derartige Überexprimierung erfolgt, wird je nach Verfügbarkeit von Glucose-enthaltenden, nicht-flüchtigen Aroma-Substraten darin ausgewählt. Somit verursacht eine derartige Überexprimierung die Freisetzung eines flüchtigen und Aroma-verströmenden Bestandteils des Substrats. Somit ist gemäß bevorzugten Ausführungsformen das Überexprimieren des Nukleinsäurekonstrukts beschränkt auf wenigstens ein Gewebe, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Blüten, Frucht, Samen, Wurzel, Stamm, Pollen und Blättern besteht.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von freier Glucose in einem Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterial bereitgestellt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt durch das Fermentieren des Glucose enthaltenden Ausgangsmaterials für die Fermentation durch eine Zelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, und das ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert, wodurch das Niveau der freien Glucose in dem Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterial erhöht wird. Das Polynukleotid schließt bevorzugt ferner ein Signalpeptid ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist. Noch bevorzugter schließt das Polynukleotid ferner ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von freier Glucose in einem von einer Pflanze abgeleiteten, Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterial bereitgestellt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt durch das Fermentieren des von der Pflanze abgeleiteten, Glucose enthaltenden Fermentation-Ausgangsmaterials für die durch eine Zelle, wobei die Pflanze ein Nukleinsäurekonstrukt überexprimiert, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergillus niger abgeleitet ist, und das ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert, wodurch das Niveau der freien Glucose in der Pflanze erhöht wird. Das Polynukleotid schließt bevorzugt ferner ein Signalpeptid ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist. Noch bevorzugter schließt das Polynukleotid ferner ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist.
Der Ausdruck „freie Glukose" wie hier in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt mit den Ansprüchen verwendet, bezieht sich auf Glukose-Reste in Form eines Monosaccarids, dessen Niveaus durch die katalytische Aktivität der β-Glucosidase erhöht werden.
Der Begriff „Glucose enthaltendes Ausgangsmaterial für die Fermentation" wie hier in der Beschreibung und in dem folgenden Abschnitt mit den Patentansprüchen verwendet, bezieht sich auf jede beliebige Energiequelle, in Form von Glucose-enthaltenden Verbindungen, die verschieden von freier Glucose sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, zerkleinertse, gemahlenes, in Würfel geschnittenes oder extrahiertes Pflanzenmaterial, Pflanzen oder Teile davon, die in industriellen Fermentations-Verfahren verwendet werden.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Erhöhen eines Niveaus von extrazellulärer oder intrazellulärer freier Glucose in einer Pflanze bereitgestellt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt durch das Überexprimieren eines Nukleinsäurekonstrukts in der Pflanze, das ein genomisches, komplementäres oder zusammengesetztes Polynukleotid einschließt, das bevorzugt von Aspergilllus niger abgeleitet ist, und das ein Polypeptid mit der katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert, wodurch das Niveau der freien Glucose in der Pflanze erhöht wird. Dadurch können süßere Früchte hergestellt werden. Das Polynukleotid schließt bevorzugt ferner ein Signalpeptid ein, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist. Noch bevorzugter schließt das Polynukleotid ferner ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums ein, das in Übereinstimmung mit dem Polypeptid ist.
Glycosidasen, einschließlich β-Glucosidase, katalysieren Reaktionen, welche die Hydrolyse von O-glycosidischen Bindungen von Glycosiden beinhalten, und synthetisieren Oligosaccaride wenn die Reaktion in umgekehrter als der normalen Richtung durchgeführt wird, ein Ergebnis, das zum Beispiel durch auf bestimmte Stellen gerichtete Mutagenese und Km-Umkehrung (Km reversal) erreicht wird. Wie in dem obigen Abschnitt über den technischen Hintergrund beschriben, schließt der Mechanismus der Hydrolyse-Reaktion von Glycosiden zwei katalytische Schritte ein, von denen der zweite einen basenkatalysierten H₂O-Angriff einschließt, der zu einer Regeneration des Enzyms führt, sowie zur Freisetzung eines Saccharid-Rests. Somit kann zusätzlich die Synthese des Oligosaccarids erreicht werden durch das Hinzufügen eines zweiten Saccarids zu der Reaktionsmischung, das mit dem H₂O-Molekül konkurriert, und an seiner Stelle mit dem ersten Saccarid in einer als Transglycosylierungs-Reaktion bekannten Reaktion reagiert. Somit haben diese Enzyme das Potential, die Herstellung von vielen verschiedenen Produkten unter Verwendung kostengünstiger Substrate zu katalysieren, da Glycosidasen allgemein verfügbar und einfach im Umgang sind. Für weitere Details, siehe U.S. Pat. Nr. 5,716,812, das hier durch die Bezugnahme inkorporiert ist.
Somit wird gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für das Synthetisieren von Oligosaccariden bereitgestellt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt durch das Mischen eines Polypeptids mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase mit ersten und zweiten Saccharid-Molekülen, um dadurch die ersten und zweiten Saccharid-Moleküle zu einem Oligosaccharid zu verbinden.
Zusätzliche Gegenstände, Vorteile und neuartige Merkmale der vorliegenden Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann durch die Betrachtung der folgenden Beispiele ersichtlich, die nicht als einschränkend verstanden werden sollen. Zusätzlich wird die experimentelle Umsetzung durch verschiedene Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben und wie in dem untenstehenden Abschnitt mit den Ansprüchen beansprucht, in den folgenden Beispielen beschrieben.
BEISPIELE
Es wird nun Bezug genommen auf die folgenden Beispiele, die zusammen mit den obigen Beschreibungen die Erfindung in einer nicht-einschränkenden Art und Weiss veranschaulichen.
Im Allgemeinen schließen die hierin verwendete Nomenklatur und die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Laborverfahren molekulare, biochemische, mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken ein. Derartige Techniken sind in der Literatur genau beschrieben. Siehe, zum Beispiel "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Bände 1–111 Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al.,"Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Bd. 1–4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); Methoden wie dargelegt in U.S. Pat. Nr. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 und 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Bände 1–111 Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in" Volumes I–III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (achte Auflage), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell und Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman und Co., New York (1980); verfügbare Immunoassays werden ausführlich beschrieben in der wissenschaftlichen und Patentliteratur, siehe zum Beispiel, U.S. Pat. Nr. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 und 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., und Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., und Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. i., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) und "Methods in Enzymology" Bd. 1–317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Application", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); die alle hier durch die Bezugnahme inkorporiert sind als wären sie hier vollständig beschrieben. Weitere allgemeine Quellen werden in diesem Dokument bereitgestellt. Die darin beschriebenen Verfahren sind in der Technik bekannt und werden für das leichtere Verständnis des Lesers bereitgestellt. Sämtliche darin enthaltene Informationen sind hierin durch Bezugnahme inkorporiert.
MATERIALIEN UND EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Reinigung von β-Glucosidase von A. niger:
Eine Rohzubereitung von β-Glucosidase von A. niger B1 (CMI CC 324626) wurde bei Shaligal Ltd. (Tel-Aviv, Israel) erworben. Eine Probe (10 ml) des rohen Enzyms (140 Einheiten/ml) wurde zunächst durch eine 50 kDA Ausschlussmembran (cut-off membrane) von Amicon (Amicon Corp., Danvers, MA) gefiltert, mit 20 mM Zitratpuffer mit pH = 5. Die Proteine wurden dann auf einer FPLC mit einer Mono-Q RH 5/5-Säule (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) getrennt und mit demselben Puffer ausgeglichen. Das Enzym wurde mit einem linearen Gradient von 0 bis 350 mM NaCl eluiert. Aktive Fraktionen (siehe unten, Enzym-Assays) wurden überwacht und vereinigt (zwischen 80–110 mM NaCl). Das teilweise gereinigte Enzyme wurde gegen 20 mM Zitratpuffer pH = 3,5 dialysiert, angelegt an eine Resource-S Säule, ausgeglichen mit demselben Puffer und mit einem Gradient von 0–1 M NaCl eluiert. Das gereinigte Enzyme (eluiert bei 155 mM NaCl) wurde durch Ultrafiltration konzentriert (50 kDa Ausschlussmembran, Amicon).
Enzym-Assays:
B-Glucosidase-Enzymaktivität wurde unter Verwendung eines Plattenassays wie folgt überwacht: 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucopyranosid (MuGlc, Sigma Chemical Inc. St. Louis, Missouri) mit einer Endkonzentration von 0,5 mM wurde in PC-Puffer (50 mM Phosphat, 12 mM Zitronensäure, pH = 3,4) bei 45°C gelöst. Die Lösung wurde mit 3% Agar in Wasser vermischt, vorher gekocht und dann auf 45°C gekühlt. Die resultierende Lösung (20 ml) wurde in eine Petrischale gegossen und nach der Verfestigung wurden 10 μl Enzymproben tropfenförmig aufgetragen. Die Platte wurde bei 50°C eine Stunde lang inkubiert und dann mit langwelligem UV-Licht beleuchtet. Eine intensive Fluoreszenz zeigte die Aktivität der β-Glucosidase an.
Nachweis von β-Glucosidase in Polyacrylamidgelen wurde durchgeführt durch das Auswaschen des SDS-Polyacrylamidgels mit 1:1 Isopropanol:PC-Puffer, um das SDS zu entfernen und das Enzym zu renaturieren. Das Gel wurde einmal in PC-Puffer gewaschen und in einer dünnen Schicht einer Lösung von 0,5 mM MUGIT inkubiert. Nach der Inkubation bei 50 °C während einer Stunde wurde das aktive Proteinband durch UV-Licht sichtbar gemacht.
Quantitative Assays wurden unter Verwendung von pNPGlc als Substrat gemäß Shoseyov (7) durchgeführt.
Bestimmung der thermischen Beständigkeit von β-Glucosidase von A. niger:
Rekombinantes Enzym (40 μg/ml) wurde in 20 mM Zitratphosphatpuffer gelöst, pH = 5. Jede geprüfte Probe (8 μl) wurde mit 15 μl Mineralöl bdeckt. Die Aktivität wurde durch den Standard-pNPGic-Assay (7) bestimmt.
Deglycosylierung von β-Glucosidase von A. niger durch N-Glycosidase-F:
Eine Reaktionsmischung von N-Glycosidase-F (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland), enthaltend 0,125 μg reine β-Glucosidase (vorher durch Kochen während 3 Minuten in 1% SDS und 5% P-Mercaptoethanol denaturiert), 0,2 Einheiten der N-Glycosidase-F, Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH = 7,5), EDTA (25 mM), 1% Triton X-100 und 0,02% Natriumazid, mit einem Gesamtvolumen von 12,5 μl, wurde 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde Hinzufügen von PAGE-Probenapplikationspuffer beendet, es folgte Kochen während 3 Minuten.
Proteolyse und N-terminale Sequenzen von β-Glucosidase von A. niger B1:
Teilweise enzymatische Proteolyse mit Protease von Staphylococcus aureus V8 wurde durchgeführt wie von Cleveland (28) beschrieben. Zusammengefasst wurde FPLC-gereinigte β-Glucosidase (5 μg) durch Acetonfällung konzentriert. Das Protein wurde auf einer 10%igen präparativen SDS-PAGE getrennt. Das Gel wurde mit Coamassieblau gefärbt, entfärbt und mit kaltem Wasser gewaschen und das β-Glucosidase-Proteinband wurde ausgeschnitten. Die resultierende Gelscheibe wurde auf einen zweiten SDS-PAGE-Gel angelegt (15% Acrylamid) und es wurde Protease V8 aus Staphylococcus aurous darüber gelegt. Verdau wurde innerhalb des gestapelten Gels durch das Ausschalten des Stroms während 30 min durchgeführt. Als der blaue Bromophenolfarbstoff sich dem Boden des gestapelten Gels näherte wurde der Strom wieder eingeschaltet. Die elektrophoresierten Spaltungsprodukte wurden an PVDF-Membranen einem Elektroblot unterzogen. Das native Protein wurde parallel an PVDF übertragen. Die N-terminate Sequenz des nativen Proteins und zwei aus der Vielzahl der Spaltungsprodukte wurden durch Abbau nach Edman unter Verwendung eines Gasphasenprotein-Sequenzierers (Applied Biosystems model 475A microsequencer) analysiert.
Klonieren von cDNA von bgl1 und genomischem Gen:
Vollständige RNA-Isolierung: RNA wurde vollständig aus Aspergillus niger B1 wie folgt isoliert: A. niger B1 wurde in Flüssigkultur gezüchtet, das aus Mineralmedium (NH₄)₂SO₄ × 3H₂O (0,5 g/l), KH₂PO₄ (0,2 g/l), MgSO₄ (0,2 g/l), CaCl₂ × H₂O (0,1 g/l), FeSO₄ × 6H₂O (0,001 g/l), ZnSO₄ × 7H₂O (0,001 g/l), und 2 mM Zitronensäure, bei pH = 3,5 mit 1% w/v Kleie als Kohlenstoffquelle bestand. Das Medium wurde autoclaviert, gekühlt und mit A. niger B1 inokuliert (106 Sporen/ml). Nasenkolben wurden mit konstantem Schütteln (200 U/min) bei 37°C verwendet. Die Aktivität der β-Glucosidase wurde überwacht, indem 5 μl Wachstumsmedium auf 1%ige Agarplatten, die 0,5 mM MUGlc enthielten, wie oben beschrieben, gegeben wurden. Die Aktivität wurde nach 15-stündiger Inkubation nachgewiesen. Das Myzel wurde nach einer Wachstumsdauer von 24 Stunden geernet und das Medium wurde durch Filtern durch GFA-Glass-Mikrofasern (Whatman Inter. Ltd., Maidstone, England) entfernt. Das Myzel wurde dann mit flüssigem Stickstoff gefroren und mit Mörser und Pistill zu feinem Pulver gemahlen. Die Gesamt-RNA wurde aus diesem Pulver durch das Guanidin-Thiocyantat (TriReagent^TM) Verfahren (Molecular Research Center, Inc.) hergestellt.
reverse RNA-Transkriptionsreaktion: cDNA wurde durch das reverse Transkribieren der Gesamt-RNA (10 μg) unter Verwendung des Stragene-RT-PCR-Kits (Stratagene, La Jolla, CA) erhalten. Die Reaktionsmischung (50 μl) bestand zusätzlich aus: Oligo-dT18 (1 μg), RNase-Block-Ribonuklease-Hemmer (20 Einheiten), 1 × Puffer (50 mM Tris-HCl, pH = 8,3, 75 mM KC1, 10 mM DTT, 3 mM MgCl₂), dNTPs (jeweils 500 μM) und reverser Transkriptase (300 Einheiten). Die Gesamt-RNA wurde zunächst bei 70°C denaturiert, auf Raumtemperatur abgekühlt (für das Annealing der Primer) und zu der Reaktionsmischung hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde lang bei 37°C inkubiert, es folgte Erwärmen (95°C, 5 Minuten) und bei –70°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
DNA-Amplifizierung: Degenerierte Primer für die DNA-Ampflifikationsreaktion durch PCR-Verfahren wurden nach der V8-Proteolyse synthetisiert, basierend auf einem Teil der N-terminaien Aminosäuresequenz und einer internen Sequenz, wie durch den Abbau nach Edman bestimmt (untenstehend; experimentelle Ergebnisse). Die Teilsequenz der von N-terminalen abgeleiteteten Aminosäuresequenz der β-Glucosidase war Ser-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Pro (SEQ ID NO: 4), und brachte den folgenden Primer ein: 5'-(C/G)(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)TA(C/T)TA(C/T)CC-3' (SEQ ID NO: 5). Die Teilsequenz der Aminosäuresequenz des internen Spaltungsprodukts E2 war Gln-Pro-Ile-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly (SEQ ID NO: 6) und brachte den folgenden Primer ein: 5'-TCCIGC(T/G/C/A)GG(TG/C/A)A(G/A)(T/G/A)AT(T/G/C/A)GG(TIC)TG-3' (SEQ ID NO: 7).
Die Reaktionsmischung für die DNA-Amplifikation (25 μl) enthielt: Reaktionsprodukt der reversen Transkriptase (1 μl), 10 × PCR-Puffer (2,5 μl, Promega Corp., Madison, WI), dNTPs (jeweils 250 μM), MgCl₂ (2,0 mM), degenerierte Primer (jeweils 250 pmol), DNA-Polymerase (3 Einheiten, Stratagene, La Jolla, CA) und mit Mineralöl überlegt (25 μl). Die Reaktion wurde in einem automatischen Heizblock (Programmable thermal controller-MJ Research, Inc.) durchgeführt. Die Bedingungen des PCR-Zyklus waren Denaturierung während 30 Sekunden bei 94°C, Annealing während 60 Sekunden bei 50°C und 150 Sekunden Verlängerung bei 72°C, 36 mal wiederholt.
Das resultierende amplifizierte Produkt wurde auf einem 1,2% (w/v) Agarose/TBE-Gel elektrophoresiert, was zu einem 2,2 kb cDNA-Gen-Fragment führte, welches weiter unter Verwendung des Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert wurde und direkt in die einzelne 3'-T-PCR-Insertionsstelle des pGEM-T-Klonierungsvektors (Promega Corp., Madison, WI) hinein kloniert wurde.
Sondenherstellung: Die 2,2 kb partielle cDNA wurde mit PstI verdaut, um eine 1,2 kb DNA-Fragmentsonde herzustellen. Eine Probe (25 ng) wurde mit [³²P]dCTP unter Verwendung des Random Sequence Nanonucleotid-Rediprime DNA-Labeling System (Amersham Pharmacia Biotech AB, Buckinghamshire, England) markiert.
Herstellung der genomischen DNA-Plasmid-Bibliothek: Eine genomische Bibliothek von A, niger B1 wurde in dem pYEAUra3 Hefe/E. coli Shuttle-Vektor (Clontech Lab. Inc. Palo Alto, CA) erstellt. A. niger B1 wurde in flüssigem Kulturmedium wie oben beschrieben gezüchtet, das Myzel wurde nach 48 Stunden Wachstum geerntet, in flüssigem Stickstoff gefroren und gemahlen. Das gemahlene Myzel wurde verwendet, um genomische DNA mittels des CTAB-Verfahrens von Murray und Thompson (29) herzustellen. Die Bibliothek wurde mit Hilfe von teilweise abgebauter genomischer Sau3A-DNA erstellt und in die BamHI-Stelle des pYEUra3-Hefeshuttle-Vektors (Clontech Lab. Inc. Palo Alto, CA) hineinkloniert. pYEAUra3-Shuttlevektor von Hefe/E. coli wurde mit BamHI abgebaut und mit CIP dephosphoryliert, um eine Selbst-Ligation zu verhindern. Die teilweise abgebaute genomische DNA wurde mit T4-Ligase in den Shuttlevektor hineinkloniert und verwendet, um elektrokompetente TOP 10-Zellen von E. coli zu transformieren, die dann auf LG-Agar enthaltendes Ampicillin (50 μg/ml) gegeben wurden. Insgesamt wurden 4 × 10⁴ Kolonien auf LB-Agar-Platten gezüchtet, auf Hybond-N-Membranen getrofft (Amersham Pharmacia Biotech AB, Buckinghamshire, England) und unter Verwendung der obigen 1,2 kb Sonde untersucht. Positive Klone wurden in pUC 18 subkloniert und sequenziert (Biological Services, The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel).
Expression von bgl1 in E. coli:
Zwei spezifische Primer wurden je nach 5' und 3'-Sequenzen ausgebildet, entsprechend dem N-terminalen und dem C-terminalen Bereich des reifen Proteins: Sense-Primer: 5'-'(SEQ ID NO: 8). Antisense-Primer: 5'-AAAGGATCCTTAGTGAACAGTAGGCAGAGACGC-3' (SEQ ID NO: 9). Die isolierte cDNA wurde mit NcoI und BamHI verdaut und in einen pET3d-Expressionsvektor hinein kloniert (1A, Novagen Inc., Madison, WI) Positive E. coli BL21 (DE3) pLysS-Kolonien, welche die cDNA von bgl1 enthielten, wurden durch Enzymrestriktion und Sequenzanalyse bestätigt. Rekombinantes BGL1 wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers exprimiert.
Expresion von cDNA von bgl1 in Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris:
Der pYES2-Vektor (Invitrogen Inc., San Diego, CA) wurde verwendet, um das bgl1-cDNA-Gen erfolgreich in das HindIII/BamHI von pYES2-bgl1-Plasmid (1b) hineinzuklonieren, und um Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung des Lithium-Acetat-Verfahrens (30) zu transformieren. Das BGL1 wurde durch das Induzieren des Gal1-Promotors gemäß dem Protokoll des Herstellers exprimiert. Stamm INVSc2 (MATa, his3-D200, ura3-167) von Saccharomyces cerevisiae wurde als Wirt verwendet. Stamm GS115 (his4 Mutante) von Pichia pastoris wurde als Wirt für Shuttle- und Expressionsvektorplasmid pHIL-SI (Invitrogen Inc., San Diego, CA) verwendet. Die bgl1-cDNA wurde in die EcoRS/BamHI-Stellen von pHIL-SI hineinkloniert, was den pHIL-SI-bgl1-Expressions- und Sekretionsvektor (1c) ergab. Expression in P. pastoris wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Screening von β-Glucosidase exprimierenden Klonen wurde durch top-Agar, enthaltend, 50 mg X-Glc, 30 ml Methanol und 1% Agar pro Liter ermöglicht. Blaufärbung zeigte eine Kolonie an, die aktive β-Glucosidase produzierte.
Western-Biot-Analyse:
Antikörper wurden aus Kaninchenserum 36 Tage nach einer zweiten Injektion von 100 μg gereinigtem Protein und Hilfsstoff (AniLab Biological Services, Tal-Sachar, Israel) hergestellt. Der hochmolekulare Ladder (high molecular weight ladder) war von Sigma Chemical Inc. St. Louis, Missouri. Die Bedingungen des Western Blot waren wie in Quelle 35 beschrieben.
Bestimmung des stereochemischen Verlaufs der Hydrolyse:
Das Verfahren war grundsätzlich wie von Wong et al. (31) beschrieben. PNPGlc (10 μmols) wurde in 0,5 ml von 25 mM Azetatpuffer pH = 3,5 in D₂O in einem NMR- Rohr gelöst. β-Glucosidase wund lyophilisiert und erneut in 100 μl D₂O (35 Einheiten/ml) gelöst. Das 1H-NMR-Spektrum des Substrats wurde aufgezeichnet, Enzym hinzugegeben (10 μl) und die Spektren bei 25°C wurden in bestimmten Zeitabständen mit einem Bruker AMX400 aufgezeichnet.
Inaktivierungs- und Reaktivierungsstudien:
Reines β-Glucosidase-Enzym von A, niger (0,47 mg/ml) wurde in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von 2-Deoxy-2-fluoro-β-glucosyl-Fluorid (2FGlcF, 0,5–6 mM) in 30 mM Zitratpuffer pH = 4,8 bei 50°C inkubiert. Restliche Enzymaktivität wurde zu verschiedenen Zeitpunkten durch Hinzufügen eines Aliquots 10 μl) der Inaktivierungsmischung, zu einer Zitratpuffer enthaltenden Lösung (30 mM, pH = 4,8), BSA (8 μg) und 2,4-Dinitrophenyl β-D-Glucopyranosid (DNPGlc, 0,625 mM, 830 μl) bestimmt. Freisetzung von DNP wurde spektrophotometrisch durch das Messen des Absorptionsvermögens bei 400 nm eine Minute nach dem Hinzufügen des Substrats bestimmt.
Reaktivierungsraten wurden wie folgt bestimmt: reine β-Glucosidase von A. niger (0,34 mg/ml) wurde mit 2FGlcF (5 mM) 15 min lang preinkubiert, wonach der Überschuss des Inaktivators durch Zentrifugalkonzentratoren mit einem Ausschluss von 20 kDA molekularer Nennmasse (Sartorius Inc., Goettingen, Deutschland) diafilitriert wurde. Proben des gereinigten, inaktivierten Enzmys wurde in Gegenwart von Linamarin (0–16 mM) in Zitratpuffer (30 mM, pH = 4,8) bei 50°C während 0, 10, 20 und 30 Minuten inkubiert, und die Aktivität jeder Probe wurde unter Verwendung von p-Nitrophenyl-β-Glucopyranosid (pNPGlc) als Substrat bestimmt.
Expression von cDNA von bgl1 in Tabakpflanzen:
genetische Konstrukte:
cDNA von Bgl1 wurde in pETBI (37) kloniert. pJD330 und pBINPlus (38) wurden jeweils als ein Zwischenprodukt und als binärer Vektor verwendet. Cel1 Signalsequenz sowie 35S-plus Ω-Fragment wurden aus pB21 gewonnen, modifiziertes pBluescript SK (39). Nicotiana tabacum cv. Samson wurde als eine Modellpflanze für die Gentransformation verwendet. Drei Genkonstrukte wurden verwendet (11a–c): (i) bgl1 ohne Signalpeptid, das der zytplasmatischen Expression diente (11a, Plasmid pJDB1); (ii) bgl1 einschließlich eines cel1 Signalpeptids am N-terminalen Ende für die Sekretion in den Apoplasten (11b, Plasmid pJDCB1); und (iii) bgl1 einschließlich des cel1 Signalpeptids und dem KDEL (SEQ ID NO: 24) ER-Retaining-Peptid am C-terminalen Ende für die Akkumulierung in dem ER (11c, Plasmid pJDCBIT).
Zu diesem Zweck wurd bgl1 cDNA (2,5 kb) aus pETBI (37) mit NcoI und BamHI freigesetzt und in pJD330 zwischen dem 35S-Promotor-Q-Fragment und dem nos-Terminator eingesetzt, wodurch das gus-Gen eliminiert wird, was zu dem Plasmid pJDBI führt. Retaining-Signall-Tetrapepüd HDEL (SEQ ID NO: 17) des Endoplasmatischen Retikulums wurde synthetisiert und mit bgl1 am C-terminalen Ende in pJDB1 durch eine Fidelity-PCR-Reaktion (fidelity PCR reaction) mit dem folgenden Primerpaar verbunden: Vorwärtsprimer (23-mer), beginnend bei Nukleotid 1248 von bgl1 cDNA 5'-(1248)-CAGTGACCGTGGATGCGACAATG-(1270')-3' (SEQ ID NO: 20); Rückwärtsprimer (40mer), beginned bei Nukleotid 2506 von cDNa von bgl1, die auch für das HDEL-Peptid (SEQ ID NO: 17) 5'-(2506)-AGAGACGGATGACAAGTACTACTTGAAATTGGGCCCAAAA-3' (SEQ ID RIO: 21) codiert. Für pJDCBIT (35S Ω + CelI + bglI + HDEL) wurde das 35S Ω Fragment von pJDBI durch ein von pB21 mit BamHI und XbaI verdautes 35S Ω + cel1 Fragment ersetzt. Für pJDCBI (35S Ω + Cel1 + bgl1) wurde das 35S Ω und cel1 sowie einen Teil von bgl1 enthaltendem Fragment aus pJDCBIT mit HindIII und NruI ausgeschnitten und mit dem Vektor von pJDB1 verbunden, der mit demselben Paar von Restriktionsenzymen verdaut wurde. Die Nukleotidsequenz aller genetischen Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzieren bestätigt.
Genkassetten in den Zwischenvektoren von pJDB1, pJDCB1 und pJDCBIT wurden weiter mit HindIII und EcoRI isoliert und in mehrere Klonierungsstellen des binären Vektors pBINPlus eingesetzt. Disarmed Agrobacterium LB4404 wurde mit bgl1 Genkassetten enthaltendem pBINPlus transformiert.
Transformation von Tabakpflanzen:
Die jungen Blätter von in vitro gezüchteten Pflänzchen wurden ausgeschnitten und in 0,5 cm² große Stücke geschnitten und dann für 5 Minuten in einer über Nacht gezüchtete Kultur von Agrobacierium getaucht. Nach dem Blotten mit sterilem Whatman-Filterpapier wurden die infizierten Blätter 2 Tage lang zusammen mit Agrobacterium auf MS-Medium plus 2,0 mg/L Zeatin und 0,1 mg/L IAA sowie 0,35% (w/v) Phytagel gezüchtet und dann auf dasselbe Medium, jedoch mit 300 mg/L Kanamycin und 300 mg/L Carbenicillin, übertragen. Regenerate wurden dann auf das Wurzelmedium übertragen, das nur MS-Salze, Vitamine und dieselben Antibiotika enthielt.
Verwurzelte Pflanzen wurden nach dem PCR-Screening in das Gewächshaus gebracht.
Sreening für transgene Pflanzen:
DNA und Pflanzenprotein wurden gemäß Nagy et al. (40) extrahiert. PCR-Überprüfung der Insertion des Gens in das Pflanzengenom erfolgt mit dem folgenden Paar von Primern, die das DNA-Fragment von Position 1248 bis zum Ende von bgl1 abdecken. 5'-CAGTGACCGTGGATGCGACAATG-3' (SEQ ID NO: 22) und 5'-AAAGGATCCTTAGTGAACAGTAGGCAGAGACGC-3' (SEQ ID NO: 23).
Identifizieren von transgenen Pflanzen, die BGL1-Protein und Aktivität exprimieren:
Western-Blot (40) und Färben der Aktivität mit Gel durch SDS-PAGE (37) wurden verwendet, um die erfolgreichen transgenen Linien anzuzeigen, unter Verwendung des gereinigten BGL1-Proteins von A. niger als positive Kontrolle und einer nicht-transgenen Pflanze als negative Kontrolle.
SPMI-GC/MS-Analyse: Die Wirkung von bgl1 auf die Entwicklung und Zusammensetzung von Geschmacksvergindungen wurde untersucht. Frische Blätter von transgenen Pflanzen und Wildtyp-Kontrollpflanzen wurden ausgeschnitten und in flüssigem Stickstoff gemahlen. Eiskalter Extraktionspuffer enthaltend 10 mM EDTA, 4 mM DTT in 50 mM Phosphatpuffer, pH 4,3, wurde in einem Verhältnis von 1:3 w/w hinzugefügt. Die Mischung wurde dann 0,5 Stunde geschüttelt. 0,75 ml Überstand von jeder der zentrifugierten Mischungen wurde in ein Glasfläschchen gegeben. Sämtliche Vorgänge wurden bei 4°C durchgeführt. Nach 9 Stunden Inkubation bei 37°C, wurden die flüchtigen Anteile in dem Gläschen nach Clark et al. (41) unter Verwendung eines Saturn Varian 3800 SPMI-GC-MS-Geräts, ausgestattet mit einer DB-5 Kapillarsäule, analysiert. Die Temperatur der splitlosen Injektionen betrug 250°C und die Übertragungslinie wurde bei 280°C gehalten. Helium wurde als Trägergas verwendet. Der Ofen wurde wie folgt programmiert: 1 Minute bei 40°C mit stufenweisem Erhitzen auf 250°C bei einer Rate von 5°C/Minute.
VERSUCHSERGEBNISSE
Reinigung von Wildtyp β-Glucosidase von A. niger:
Ein Enzympräparat von β-Glucosidase von A. niger wurde durch Mono-Q FPLC gereinigt. Aktive Proteinproben, die aus der Mono-Q-Säule eluiert wurden, wurden auf einem 10% SDS-PAGE-Gel getrennt, mit Caomassieblaugefärbt und in Gegenwart von MUGlc inkubiert, um die Aktivität des Enzyms zu zeigen. In diesem Stadium der Reinigung konnte ein deutliches Band mit einer offensichtlichen Molekularmasse von ungefähr 160 kDa und der Aktivität von β-Glucosidase erkannt werden (2b, Lanes 1–5: 1 – elektroeluiertes Band von BGL1 aus präparativen PAGE-SDS-Gelstäben; 2-5-Aceton-Niederschläge der Trennung von BGL1 mit Mono-Q). Jedoch wurde gezeigt, dass die sichtbare Masse des denaturierten Enzyms (10 Minuten lang in Anwesenheit von β-Mercaptoethanol) 120 kDa auf 10%igem SDS-PAGE (2a) beträgt. Das als BGL1 bezeichnete Enzym wurde weiter bis zur Homogenität auf einer Resource-S-Säule (3) gereinigt. Deglycosylierung von β-Glucosidase von A. niger erfolgte durch N-Glycosidase-F. Wie in 4 gezeigt, zeigte die SDS-PAGE-Analyse an, dass ungefähr 20 kDa der β-Glucosidase von A. niger auf N-verbundene Kohlenhydrate zurückzuführen sind.
Proteolyse und N-terminale Sequenzen von BGL1:
Teilweise enzymatische Proteolyse mit Protease V8 aus Staphylococcus aureus von gereingtem BGL1 wurde durchgeführt. Das unverdaute Protein und die Spaltungsprodukte wurden durch SDS-PAGE getrennt, gefolgt von Elektroblotten auf PVDF-Membranen und Bestimmung der N-terminalen Sequenz des nativen Proteins und zwei Spaltungsprodukten. Erhaltene Aminosäuresequenzen waren wie folgt:
N-terminales natives Protein: Asp-Glu-Leu-Ala-Tyr-Ser-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Pro-Ser-Pro-Trp-Ala-Asn-Gly-Gln-Gly-Asp (SEQ ID NO: 10). Der unterstrichene Abschnitt stellt SEQ ID NO: 4 dar.
Internes Spaltungsprodukt – E1 Polypeptid: Val-Leu-Lys-His-Lys-Asn-Gly-Val-Phe-Thr-Ala-Thr-Asp-Asn-Trp-Ala-Ile-Asp-Gln-Ile-Glu-Ala-Leu-Ala-Lys (SEQ ID NO: 11).
Internes Spaltungsprodukt – E2 Polypeptid: Gly-Ala-Thr-Asp-Gly-Ser-Ala-Gln-Pro-Ile- Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Asn-Pro (SEQ ID NO: 12). Der unterstrichene Abschnitt stellt SEQ ID NO: 6 dar.
FastA-Analyse (32) zeigte an, dass die N-terminale Sequenz sowie die internen Sequenzen eine Ähnlichkeit mit Sequenzen von β-Glucosidase aus der Hefe Saccharomycopsis fihuligera, die zu der Familie 3 der Glycosyl-Hydrolasen gehört, aufweisen.
Isolierung und Charakterisierung von cDNA von bglI und genomischer DNA:
Um das β-Glucosidasegen von A. niger zu klonieren, wurden degenerierte Primer gemäß der Sequenz der Verdaufragmente des Polypeptids ausgestaltet. Diese Olignukleotide wurden verwendet, um ein cDNA-Fragment des β-Glucosidasegens durch RT-PCR zu amplifizieren. Eine 1,2 kB Sonde wurde aus dem resultierenden 2,2 kb-Amplifizierungsproduki ausgeschnitten und wurde verwendet, um eine genomische Bibliothek zu screenen, die in pYEUra3 Hefe/E. coli Shuttle-Vektor errichtet wurde. Positive Klone wurden erfolgreich subkloniert und sequenziert, was zu einer vollen Länge einer genomischen Sequenz bgl1 führt (SEQ ID NO: 3, 5a). Amplifikationsprimer wurden dann gemäß der genomischen DNA-Sequenz erzeugt, entsprechend dem N- und C-terminaien Ende des reifen Proteins. RT-PCR wurde danach verwendet, um die gesamte Länge der cDNA-Sequenz der β-Glucosidase (SEQ ID NO: 1, 5a, GenBank Accession Nr. AJ132386) zu ampflifizieren. Die cDNA-Sequenz passte perfekt zu der DNA-Sequnez der kombinierten Exone. Es wurde gefunden, dass der offene Leserahmen ein Polypeptid mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 92 kDA codiert. Die Gene schließen 7, von 6 Introns unterbrochene, Exons ein (5b). Analyse der DNA-Sequenz stromaufwärts von der Sequenz, die das reife Protein codiert, zeigte eine vermeintliche Leadersequenz, die von einem 82 bp-Intron unterbrochen wurde.
Herstellung von rBGL1 in E. coli:
Rekombinantes BGL1 wurde in E. coli überexprimiert. Keine offensichtliche β-Glucosidaseaktivität konnte in den E. coli-Extrakten nachgewiesen werden, jedoch zeigte die SDS-PAGE-Analyse ein relativ intensives Proteinband, das in der erwarteteten Molekülmasse exprimiert wurde. Western-Blot-Analyse unter Verwendung von polyklonalen, anti-nativen Kaninchen BGL1-Antikörpern (AniLab Biological Services, Tal-Sachar, Israel) identifizierte das 90 kDA-Proteinband (nicht gezeigt) als positiv. Weitere Analyse zeigte, dass das Protein in Inklusionskörpern akkumuliert war. Mehrere Refolding-Experimente wurden durchgeführt, jedoch scheiterten diese Versuche, ein aktives Protein aus E. coli herzustellen (nicht gezeigt).
Expression von rekombinanten BGL1 in S. cerevisiae und P. pastoris:
Rekombinantes BGL1 wurde erfolgreich sowohl in S. cerevisiae und P. pastoris exprimiert. In S. cerevisiae wurde ein relativ niedriges Expressionsniveau gefunden. Das rekombinante Protein wurde durch eine Western-Blot-Analyse nachgewiesen (6a). Der Gesamtproteinextrakt von S. cerevisiae, das cDNA von bgl1 exprimierte, hatte eine Aktivität von β-Glucosidase von 1,9 Einheiten/mg Protein. in der nur mit Vektor unter denselben Assay-Bedingungen transformierten Kontroll-S. cerevisiae wurde keine β-Glucosidaseaktivität entdeckt. Jedoch konnte kein der rekombinanten BGL1 entsprechendes Proteinband durch Coomassie-Blaufärbung nachgewisen werden. Mit bgl1 transformiertes P. pastoris sekretierte relativ hohe Niveaus von rekombinantem BGL1 in das Medium (ungefähr 0,5 g/l), was ein fast reines Protein in dem Kulturüberstand zu sein schien (6b). Dieses rekombinante Enzym war in hohem Maße aktiv (124 Einheiten/mg Protein) und brachte ahne weitere Reinigung eine spezifische Aktivität ähnlich der des reinen nativen Enzyms ein.
IH-NMR-Bestimmung des stereochemischen Ergebnisses:
1H-NMR-Spektren einer Reaktionsmischung enthaltend pNPGlc und BGL1 zeigten, dass das β-Anomer von Glucose zuerst gebildet wurde (H-1 = 4,95 ppm), mit verschobenem Auftreten des A-Anomers (H-1 5,59 ppm), die Folge einer Mutarotation (7). BGL1 ist aus diesem Grund tatsächlich eine Retaining-Glycosidase, wie für weitere Familienmitglieder beobachtet wurde (33, 34).
Inaktivierung und Reaktivierung von β-Glucosidase von A. niger:
Enzym wurde in Gegenwart von verschiedener Konzentration von 2FGlcF inkubiert und die restliche Enzymaktivität wurde zu verschiedenen Zeitpunkten überwacht.
Enzymaktivität sank in einer zeitabhängigen Art und Weise, gemäß Pseudo-Kinetik erster Ordnung, welche die Bestimmung von Pseude-Ratenkonstanten erster Ordnung ermöglichte: K_i = 4,5 min^–1 und K_l = 35,4 mM, für die Inaktivierung bei jeder Inaktivator-Konzentration (0; 0,5; 1; 2; 4, und 6 mM, 8).
Raten der Reaktivierung von 2-Deoxy-2-Fluoroglucosyl-BGL1 wurden in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von Linamarin durch das Überwachen des Wiederanstiegs der Aktivität nach 0, 10, 20 und 30 Minuten (9) bestimmt. Das Wiederansteigen der Aktivität folgte einem Prozess erster Ordnung bei jeder Linamarin-Konzentration.
Thermische Beständigkeit von β-Glucosidase von A. niger:
Thermische Stabilität des rekombinanten Enzyms wurde bei verschiedenen Temperaturen evaluiert, dargestellt als Prozent der Enzymaktivität relativ zu einer bei 4°C aufbewahrten Enzymlösung. Die erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 2 zusammengefasst und in 10 veranschaulicht. Das gereinigte Enzym zeigt hohe thermische Beständigkeit, da der Großteil (über 50%) der Aktivität bei einer Temperatur im Bereich von 4–60°C liegt. Tabelle 2
Expression von BGL1 in Tabakpflanzen: Agrobacterium-vermittelte Leaf-Disc-Transformation führte zu transgenen Tabakpflanzen wie durch PCR (12) für die Anwesenheit des Transgens, Western-Blotting (13a–b) für die Anwesenheit des Proteins, und Aktivitätsassays (14 und 15) für die Anwesenheit von Proteinaktivität bewiesen. Untenstehende Tabelle 3 fasst die Ergebnisse zusammen.
Tabelle 3
Von den 29 PCR-positiven Regeneraten, die mit BGL1 cDNA transformiert wurden, das kein Signalpeptid codierte, konnten nur 4 in dem BGL1-Protein über Western-Blotting nachgewiesen werden, jedoch war keine BGL1-Aktivität in einem von ihnen messbar. Es wurde gefunden. dass das BGL1 in seiner Molekülmasse im Vergleich zur β-Glucosidase des Wildtyps von A. niger kleiner ist, sowie zu einem verarbeiteten rekombinanten BGL1, das ein Signalpeptid enthält. Seine offensichtliche Größe von ungefähr 95 kDa ist sehr nahe an 92 kDA, was der berechneten Molekülmasse der β-Glucosidasse des unglycosyslierten A. niger entspricht. Dieses Ergebnis fällt mit der Tatsache zusammen, dass ein Protein mit keinem Signalpeptid aus den Ribosomen freigesetzt werden und in dem Zytoplasten (42) unglycosyliert bleiben, weil Proteinglycosylierung im Lumen des endoplasmatischen Reticulums (43) erfolgt.
Von den 9 positiven PCR-Regeneraten die mit einer cDNA transformiert wurden, die für das BGL1 und das Cel1 Signalpeptid und zusätzlich für das HDEL-ER-Retaining Peptid codiert, exprimierten alle Pflanzen nachweisbare Mengen von BGL1-Protein und -Aktivität.
Von den 23 positiven PCR-Regeneraten die mit einer cDNA transformiert wurden, die für das BGL1 und das Cel1 Singalpeptid, jedoch nicht für das HDEL-ER-Retaining-Peptid codiert, exprimierten alle Pflanzen nachweisbare Mengen von BGL1-Protein und -Aktivität.
Die Wirkung von BGL1 auf die Entwicklung des Geschmacksverbindung von die Zusammensetzung in transgenen Tabakpflanzen:
Extrakte von transgenen Pflanzen (CB14 und CBT21 die ähnliche BGL1-Aktivität enthalten, siehe 15) wurden während 9 Stunden bei 37°C inkubiert und Geschmacksverbindungen wurden durch SPMI-GC/MS analysiert. Die unten in Tabelle 4 zusammengefassten Beispiele zeigen dass mit der Ausnahme von Oleylalkohol die Konzentration von verschiedenen Geschmackskomponenten in transgenen Pflanzen, die aktives BGL1 exprimieren im Vergleich zur Kontrolle erhöht wird. Des Weiteren scheint es, dass die Kompartimentierung von BGL1 in dem ER (oder für diesen Zweck jede weitere subzelluläre Organelle) anstatt der Sekretion in den Apoplasten zu einer erhöhten Freisetzung von Geschmackverbindungen führt. Es scheint, dass dies von der Tatsache herrührt, dass viele Geschmacksverbindungen sich in dem Apoplasten befinden, und somit Sekretion von BGL1 in den Apoplasten in vivo Freisetzung von Geschmacksverbindungen verursacht, während die Kompartimentierung von BGL1 nur in dem Falle der Zerstörung und der Dekompartimentalisierung von Zellen zur Freisetzung von Geschmacksverbindungen führt. Tabelle 4

CB14 – transgene Pflanze, die Cel1 Signalpeptid enthält + BGL1; CBT21 – transgene Pflanze, die Cel1 Signalpeptid + BGL1 + HDEL-ER-Retaining-Peptid enthält. a–"-" bedeutet keine signifikante Differenz in der Konzentration im Vergleich zum Wildtyp. c-"––„ bedeutet eine signifante Abnahme verglichen mit dem Wildtyp. d-"++" bedeutet signifikante Zunahme mit einem entsprechenden Kennzeichen „+". ? – unbekannte Verbindung.

Obwohl die Erfindung in Verbindung mit bestimmten Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist ersichtlich, dass viele Alternativen, Modifikationen und Variationen dem Fachmann ersichtlich sind. Dementsprechend wird beabsichtigt, alle Alternativen, Modifikationen und Variationen, die unter das Wesen und den breiten Schutzumfang der angehängten Ansprüche fallen, zu umfassen. Sämtliche Veröffentlichungen, Patente, Patentanmeldungen und durch GenBank-Accession Number gekennzeichnete Sequenzen, die in dieser Beschreibung erwähnt sind, sind hier durch die Bezugnahme darauf in ihrer Gesamtheit inkorporiert, in demselben Maße als wenn jede einzelne Veröffentlichung, Patent, Patentanmeldung oder Sequenz insbesondere oder einzeln hier durch die Bezugnahme inkorporiert wäre. Zusätzlich soll ein Zitat oder Identifikation einer Quelle in dieser Anmeldung nicht aufgefasst werden als Eingeständnis, dass eine derartige Referenz als Stand der Technik der vorliegenden Erfindung vorliegt.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren zur Erhöhung eines Niveaus von mindestens einer Fermentations-Substanz in einem Fermentations-Produkt, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Fermentieren einer aus einer Pflanze abgeleiteten Glucose, enthaltend Fermentations-Ausgangsmaterial durch eine Hefezelle, wobei die Pflanze ein Nukleinsäure-Konstrukt überexprimiert, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codiert, wie in SEQ ID NO:2 dargelegt, wobei das Polypeptid eine katalytische Aktivität der β-Glucosidase aufweist, wodurch das Niveau der mindestens einen Fermentations-Substanz in dem Fermentations-Produkt erhöht wird.
Ein Verfahren zur Erhöhung eines Niveaus von mindestens einer Aroma-Substanz in einem aus einer Pflanze abgeleiteten Produkt, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Inkubieren eines Glucose enthaltenden Pflanzen-Ausgangsmaterials mit einer Hefezelle, wobei die Pflanze ein Nukleinsäure-Konstrukt überexprimiert, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codiert, wie in SEQ ID NO:2 dargelegt, wobei das Polypeptid eine katalytische Aktivität der β-Glucosidase aufweist, wodurch das Niveau der mindestens einen Aroma-Substanz in dem aus einer Pflanze abgeleiteten Produkt erhöht wird.
Das Verfahren aus Anspruch 2, wobei das aus einer Pflanze abgeleitete Produkt ein Fermentations-Produkt ist.
Ein Verfahren zur Erhöhung eines Niveaus von freier Glucose in einem aus einer Pflanze abgeleiteten Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterial, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Fermentieren des aus einer Pflanze abgeleiteten Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterials durch eine Zelle, wobei die Pflanze ein Nukleinsäure-Konstrukt überexprimiert, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codierte, wie in SEQ ID NO:2 dargelegt, wobei das Polypeptid eine katalytische Aktivität der β-Glucosidase aufweist, wodurch das Niveau der freien Glucose in der Pflanze erhöht wird.
Ein Verfahren zur Erhöhung eines Niveaus von freier Glucose in einer Pflanze, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Überexprimieren eines Nukleinsäure-Konstrukts in der Pflanze, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codiert, wie in SEQ ID NO:2 dargelegt, wobei das Polypeptid eine katalytische Aktivität der β-Glucosidase aufweist, wodurch das Niveau der freien Glucose in der Pflanze erhöht wird.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Alkohols, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Fermentieren eines aus einer Pflanze abgeleiteten Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterials durch eine Zelle, wobei die Pflanze ein Nukleinsäure-Konstrukt überexprimiert, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codiert, wie in SEQ ID NO:2 dargelegt, wobei das Polypeptid eine katalytische Aktivität der β-Glucosidase aufweist, und Extrahieren des Alkohols daraus.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Aroma verströmenden Pflanze, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Überexprimieren eines Nukleinsäure-Konstrukts in der Pflanze, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codiert, wie in SEQ ID NO:2 dargelegt, wobei das Polypeptid eine katalytische Aktivität der β-Glucosidase aufweist, wodurch die Aromaverströmung aus der Pflanze erhöht wird.
Das Verfahren aus Anspruch 7, wobei das Überexprimieren des Nukleinsäure-Konstrukts in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise durchgeführt wird.
Das Verfahren aus Anspruch 7, wobei das Überexprimieren des Nukleinsäure-Konstrukts auf mindestens ein Gewebe beschränkt ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Blüte, Frucht, Samen, Wurzel, Stamm, Pollen und Blätter besteht.
Ein Verfahren zur Erhöhung eines Niveaus von mindestens einer Fermentations-Substanz in einem Fermentations-Produkt, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Fermentieren einer aus einer Pflanze abgeleiteten Glucose, enthaltend Fermentations-Ausgangsmaterial durch eine Hefezelle, wobei die Pflanze ein Nukleinsäure-Konstrukt überexprimiert, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert und ferner für ein Signalpeptid codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist, wodurch das Niveau der mindestens einen Fermentations-Substanz in dem Fermentations-Produkt erhöht wird.
Das Verfahren aus Anspruch 10, wobei das Polynukleotid ferner für ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist.
Ein Verfahren zur Erhöhung eines Niveaus von mindestens einer Aroma-Substanz in einem aus einer Pflanze abgeleiteten Produkt, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Inkubieren eines Glucose enthaltenden Pflanzen-Ausgangsmaterials mit einer Hefezelle, wobei die Pflanze ein Nukleinsäure-Konstrukt überexprimiert, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert und ferner für ein Signalpeptid codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist, wodurch das Niveau der mindestens einen Aroma-Substanz in dem aus einer Pflanze abgeleiteten Produkt erhöht wird.
Das Verfahren aus Anspruch 12, wobei das Polynukleotid ferner für ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist.
Das Verfahren aus Anspruch 12, wobei das aus einer Pflanze abgeleitete Produkt ein Fermentations-Produkt ist.
Ein Verfahren zur Erhöhung eines Niveaus von freier Glucose in einem aus einer Pflanze abgeleiteten Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterial, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Fermentieren des aus einer Pflanze abgeleiteten Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterials durch eine Zelle, wobei die Pflanze ein Nukleinsäure-Konstrukt überexprimiert, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert und ferner für ein Signalpeptid codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist, wodurch das Niveau der freien Glucose in der Pflanze erhöht wird.
Das Verfahren aus Anspruch 15, wobei das Polynukleotid ferner für ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist.
Ein Verfahren zur Erhöhung eines Niveaus von freier Glucose in einer Pflanze, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Überexprimieren eines Nukleinsäure-Konstrukts in der Pflanze, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert und ferner für ein Signalpeptid codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist, wodurch das Niveau der freien Glucose in der Pflanze erhöht wird.
Das Verfahren aus Anspruch 17, wobei das Polynukleotid ferner für ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Alkohols, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Fermentieren eines aus einer Pflanze abgeleiteten Glucose enthaltenden Fermentations-Ausgangsmaterials durch eine Zelle, wobei die Pflanze ein Nukleinsäure-Konstrukt überexprimiert, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert und ferner für ein Signalpeptid codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist, und Extrahieren des Alkohols daraus.
Das Verfahren aus Anspruch 19, wobei das Polynukleotid ferner für ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Aroma verströmenden Pflanze, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Überexprimieren eines Nukleinsäure-Konstrukts in der Pflanze, einschließlich eines genomischen, komplementären oder zusammengesetzten Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität der β-Glucosidase codiert und ferner für ein Signalpeptid codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist, wodurch die Aromaverströmung aus der Pflanze erhöht wird.
Das Verfahren aus Anspruch 21, wobei das Polynukleotid ferner für ein Retaining-Peptid des endoplasmatischen Retikulums codiert, das mit dem Polypeptid in Übereinstimmung ist.
Das Verfahren aus Anspruch 21, wobei das Überexprimieren des Nukleinsäure-Konstrukts in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise durchgeführt wird.
Das Verfahren aus Anspruch 21, wobei das Überexprimieren des Nukleinsäure-Konstrukts auf mindestens ein Gewebe beschränkt ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Blüte, Frucht, Samen, Wurzel, Stamm, Pollen und Blätter besteht.