DE60025241T2

DE60025241T2 - HäMOPOIETINREZEPTOR-PROTEIN, NR12

Info

Publication number: DE60025241T2
Application number: DE60025241T
Authority: DE
Inventors: Masatsugu Niihari-gun Maeda; Noriko Niihari-gun Yaguchi
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-09-27
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2020-09-28
Also published as: US20090029484A1; EP1221482B1; US7045595B2; US7893201B2; US20060106201A1; US20090023660A1; AU7445900A; EP1221482A1; US20070203328A1; US20090111972A1; US20030009018A1; US20090105457A1; US20090105458A1; ES2254224T3; US20090105459A1; EP1221482A4; US7893205B2; WO2001023556A1; DE60025241D1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Hämopoietinrezeptor-Proteine und Gene, die sie codieren, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben.
Hintergrund
Eine große Anzahl an Cytokinen sind als humorale Faktoren, die die Vermehrung/Differenzierung verschiedener Zellen regulieren oder die die Erhaltung, Aktivierung und den Tod differenzierter reifer Zellen regulieren, bekannt. Es gibt spezifische Rezeptoren für diese Cytokine, die basierend auf ihren strukturellen Ähnlichkeiten in mehrere Familien kategorisiert werden (Hilton D. J., in „Guidebook to Cytokines and Their Rezeptors", herausgegeben von Nicola N. A. (A Sambrook & Tooze Publication bei der Oxford University Press), 1994, S. 8–16).
Auf der anderen Seite ist die Homologie der Primärstruktur bei den Cytokinen im Vergleich zu den Ähnlichkeiten ihrer Rezeptoren relativ gering. Es wurde keine signifikante Aminosäure-Homologie beobachtet, nicht einmal bei den Angehörigen der Cytokine, die zur selben Rezeptorfamilie gehören. Dies erklärt die funktionelle Spezifität der jeweiligen Cytokine ebenso wie Ähnlichkeiten unter den zellulären Reaktionen, die durch jedes Cytokin induziert wurden.
Repräsentative Beispiele der vorstehend erwähnten Rezeptorfamilien sind die Tyrosin-Kinase-Rezeptorfamilie, die Hämopoietin-Rezeptorfamilie, die Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Rezeptorfamilie und die transformierender Wachstumsfaktor (TGF)-Rezeptorfamilie. Von verschiedenen Signaltransduktionswegen wurde berichtet, dass sie bei jeder dieser Familien beteiligt sind. Unter diesen Rezeptorfamilien werden insbesondere viele Rezeptoren der Hämopoietin-Rezeptorfamilie in Blutzellen und Immunzellen exprimiert. Hilton et al. (WO 97/12037) zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz des Hämopoietin-Rezeptors NR2. Gemäß WO 97/12037 wurde an zwei NR2-mRNA-Arten des Menschen beobachtet, das sie in einer Reihe von voll entwickelten Geweben in geringer Menge und in fötalen Geweben wie der Lunge und der Leber in höheren Mengen exprimiert wurden. Willsin et al. (WO 97/15663) zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz des Hämopoietin-Rezeptors NR4. Willson et al. offenbaren, dass zwei murine NR4-mRNA-Arten in den meisten Geweben nachgewiesen wurden, im Skelettmuskel jedoch nicht nachweisbar waren. Sie offenbaren weiterhin, dass lösliches IL-13Rα (NR4) IL-13 binden kann.
Liganden der Hämopoietin-Rezeptorfamilie, Cytokine, werden oft hämatopoetische Faktoren oder Interleukine genannt. Einige dieser hämatopoetischen Faktoren oder Interleukine liegen im Blut vor und es wird angenommen, dass sie bei der systemischen humoralen Regulierung von hämatopoetischen oder Immunfunktionen beteiligt sind.
Dies steht der Annahme entgegen, dass Cytokine, die zu anderen Familien gehören, häufig nur bei der topischen Regulierung beteiligt sind. Einige dieser Hämopoietine können als hormonähnliche Faktoren verwendet werden, und repräsentative Peptidhormone wie das Wachstumshormon Prolactin oder Leptin-Rezeptoren gehören auch zur Hämopoietin-Rezeptorfamilie. Auf Grund dieser hormonähnlichen systemischen regulatorischen Merkmale wird angenommen, dass die Verabreichung dieser Hämopoietine bei der Behandlung verschiedener Krankheiten angewendet werden kann. Bei der großen Zahl an bekannten Cytokinen umfassen die, die gegenwärtig klinisch verwendet werden, Erythropoietin, G-CSF, GM-CSF und IL-2. Kombiniert mit IL-11, LIF und IL-12, die zur Zeit für klinische Prüfungen in Betracht gezogen werden, und den vorstehend erwähnten Peptidhormonen wie dem Wachstumshormon und Prolactin kann in Betracht gezogen werden, dass es durch die Suche nach neuen Cytokinen unter den vorstehend erwähnten verschiedenen Rezeptor-Überfamilien, die an Hämopoietin-Rezeptoren binden, möglich ist, ein Cytokin zu finden, das mit einer höheren Wirksamkeit klinisch angewendet werden kann.
Wie vorstehend erwähnt, haben Cytokinrezeptoren unter den Familienangehörigen strukturelle Ähnlichkeiten. Unter Verwendung dieser Ähnlichkeiten zielen viele Untersuchungen darauf ab, neue Rezeptoren zu finden. Insbesondere wurden viele Rezeptoren der Tyrosinkinase-Rezeptorfamilie unter Verwendung ihrer hoch konservierten Sequenz an der katalytischen Stelle bereits cloniert (Matthews W. et al., Cell, 1991, 65 (7) S 1143–52). Im Vergleich dazu haben Hämopoietin-Rezeptoren keine Tyrosinkinase-ähnliche Enzym-Aktivitäts-Domäne in ihren cytoplasmatischen Regionen, und es ist bekannt, dass ihre Signaltransduktionen durch Verbindungen mit anderen Tyrosinkinase-Proteinen, die frei im Cytoplasma vorliegen, vermittelt werden. Obwohl die Stellen auf den Rezeptoren, die an diese cytoplasmatischen Tyrosin-Kinasen, die JAK-Kinasegruppe genannt werden, binden, innerhalb der Familienangehörigen konserviert sind, ist die Homologie nicht sehr hoch (Murakami M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, S 11349–11353). Tatsächlich liegt die Sequenz, die diese Hämopoietin-Rezeptoren am besten charakterisiert, in der extrazellulären Region vor. Insbesondere ist ein Motiv aus fünf Aminosäuren, Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (worin „Xaa" eine willkürliche Aminosäure ist), in beinahe allen Hämopoietin-Rezeptoren konserviert. Somit können neue Rezeptoren durch das Suchen neuer Familienangehöriger unter Verwendung dieser Motiv-Sequenz erhalten werden. In der Tat führten diese Ansätze bereits zur Identifizierung des IL-11-Rezeptors (Robb, L. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271 (23) 13754–13761), des Leptin-Rezeptors (Gainsford T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93 (25) S. 14564–8) und des IL-13-Rezeptors (Hilton D. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93 (1) S 497–501).
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue Hämopoietin-Rezeptorproteine und DNA, die diese Proteine codiert, zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen Vektor zur Verfügung, in den die DNA inseriert wurde, eine Tranformante, die den Vektor beherbergt, und ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine unter Verwendung der Transformante. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zum Durchmustern nach Verbindungen, die an das Protein binden, zur Verfügung.
Ursprünglich versuchten die Erfinder unter Verwendung von Oligonucleotiden, die das Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser-Motiv (WS-Motiv) codieren, als Sonde durch das Plaque-Hybridisierungsverfahren, das RT-PCR-Verfahren usw. einen neuen Rezeptor zu finden. Es war jedoch extrem schwierig, streng nur jene auszuwählen, an die unter den üblichen Hybridisierungsbedingungen alle 15 Nucleotide, die das Motiv codieren, vollständig hybridisieren würden, da das Oligonucleotid „tggag(t/c)nnntggag(t/c)" (worin „n" ein willkürliches Nucleotid ist), das das Motiv codiert, kurz war und nur 15 Basenpaare hatte. Des Weiteren wurden, da der G/C- Gehalt des Oligonucleotids hoch war, höhere Anelierungs-Temperaturbedingungen als üblich benötigt, um streng jene Sequenzen auszuwählen, in denen alle 15 Nucleotide vollständig mit dem Oligonucleotid hybridisierten. Deshalb war die Durchführung der Durchmusterung unter normalen Hybridisierungs-Versuchsbedingungen extrem schwierig.
Um diese Probleme zu lösen, suchten die Erfinder außer der Stelle des vorstehend erwähnten WS-Motivs, das in der Hämopoietin-Rezeptorfamilie konserviert ist, zusätzliche Motive. Die Erfinder fanden heraus, dass ein Rest, entweder Tyrosin oder Histidin, der sich 13 bis 27 Aminosäuren stromaufwärts des WS-Motivs in der extrazellulären Region befindet, in der Rezeptorfamilie noch konserviert war. Des Weiteren führte eine zusätzliche Suche nach Consensus-Sequenzen, die in den 6 Aminosäuren vom vorstehenden Tyr/His-Rest bis zum C-Terminus häufig gefunden werden, zur Identifizierung der folgenden Consensus-Sequenz: (Tyr/His)-Xaa-(Hydrophob/Ala)-(Gln/Arg)-Hydrophob-Arg (im Folgenden als YR-Motiv abgekürzt). Dieses YR-Motiv ist jedoch nicht exakt eine perfekte Consensus-Sequenz, und die Kombination der Nucleotidsequenzen, die das Motiv codieren, ist sehr kompliziert. Deshalb ist es praktisch unmöglich, Oligonucleotide zu synthetisieren und bereitzustellen, die alle Aminosäuresequenzen als Sonden für die Hybridisierung, was ein praktisches Verfahren zur Durchmusterung ist, oder als Primer für die RT-PCR codieren.
Dementsprechend suchten die Erfinder unter Verwendung der vorstehenden beiden Motive als Sonden nach anderen Ansätzen zur praktischen Suche nach neuen Angehörigen der Hämopoietin-Rezeptorfamilie und stellten fest, dass es sinnvoll wäre, unter Verwendung partieller Aminosäuresequenzen bekannter Hämopoietin-Rezeptoren, einschließlich beider Motive als Abfragesequenzen, eine Datenbanksuche durchzuführen. Die Erfinder wiederholten die TblastN-Suche auf der gss- und htgs-Datenbank in GenBank unter Verwendung partieller Aminosäuresequenzen mehrfach bekannter Hämopoietin-Rezeptoren als Abfragesequenzen. Als ein Ergebnis wurden in allen Fällen viele positive Clone, einschließlich bekannter Hämopoietin-Rezeptoren, erhalten. Danach wurde die Nucleotidsequenz um diese Sequenzen herum, die in hohem Maße positiv zu sein schienen, in die Aminosäuresequenz konvertiert. Gene, von denen angenommen wurde, dass sie Angehörige der Rezeptorfamilie codieren, wurden durch BlastX- Suche ausgewählt, bei der die Aminosäuresequenzen (in die die Nucleotidsequenzen der Clone umgewandelt wurden) mit jenen bekannter Hämopoietin-Rezeptoren verglichen wurden. Gemäß der vorstehenden zweistufigen Blast-Suche wurden menschliche Genomsequenzen, die zwei Clone bekannter Hämopoietin-Rezeptor-Gene und einen Clon von neuem Hämopoietin-Rezeptorgen codieren, identifiziert. Nachfolgend wurden, basierend auf den Exon-Sequenzen, die von der erhaltenen Nucleotidsequenz vorhergesagt wurden, spezifische Oligonucleotid-Primer hergestellt. Clone, die der N-terminalen Region und der C-terminalen Region von NR12 entsprachen, wurden durch Durchführen der 5'-RACE- und 3'-RACE-Verfahren unter Verwendung der Primer und der cDNA-Banken von menschlicher fötaler Leber, adultem Thymus und adulter Testis als Matrizen hergestellt. Die vollständige Nucleotid-Sequenz der cDNA voller Länge wurde durch Bestimmen der Nucleotidsequenzen beider Clone und Verbinden der Sequenz an der duplizierten Zentrumsregion gezeigt.
Aus Struktur-Analysen wurden mindestens drei Arten von Transkriptionsprodukten, die von Spleiß-Varianten abgeleitet waren, erkannt. Ein cDNA-Clon dieser Spleiß-Varianten, der 337 Aminosäuren enthält und möglicherweise eine sekretorische Form eines löslichen Rezeptorproteins codiert, wurde NR12.1 genannt; die anderen beiden Clone, die 428 Aminosäuren beziehungsweise 629 Aminosäuren umfassen und von denen jedes eine transmembrane Form eines Rezeptorproteins codiert, wurden N12.2 und NR12.3 genannt. Da die wiederholte Struktur der Cysteinreste, das YR-Motiv, das WS-Motiv und so weiter, die in der extrazellulären Region anderer Familienangehöriger konserviert sind, in der Primärstruktur aller isolierten cDNA-Clone von NR12 gut konserviert waren, wurde in Betracht gezogen, dass diese Clone typische Hämopoietin-Rezeptoren codieren.
Danach wurde RT-PCR unter Verwendung von Primer-Reihen, die für N12.1, N12.2 beziehungsweise N12.3 spezifisch waren, gegen mRNA, die von verschiedenem menschlichem Gewebe abstammte, durchgeführt. Dann wurden Gewebe, die diese Gene exprimieren, gesucht und die Verteilung und das Expressionsmuster der Gene in jedem menschlichen Gewebe wurden analysiert. Schließlich wurden, um die Möglichkeit einer unspezifischen Amplifikation zu verwerten und um die Menge der RT-PCR-Produkte zu quantifizieren, die Produkte der RT-PCR unter Verwendung von cDNA-Fragmenten, die für die jeweiligen Clone spezifisch waren, einem Southern-Blot-Verfahren unterzogen. Das Ergebnis zeigte an, dass diese Clone vor allem in hämatopoetischem Zelllinien-Gewebe und in Immunzelllinien-Gewebe exprimiert werden.
Des Weiteren waren die hier genannten Erfinder durch Durchführen einer PCR-Clonierung bei einer cDNA-Bank von menschlichem Thymus (wobei fünf Clone, die generisch „NR12" genannt wurden, isoliert wurden) bei der Gewinnung zweier Clone (NR12.4 und NR12.5), die vollständige Proteine codierten, die sich in 3 Aminosäuren von NR12.2 beziehungsweise NR12.3 unterschieden, erfolgreich.
Basierend auf den vorstehenden Merkmalen von NR12 wird angenommen, dass NR12 ein neues Hämopoietin-Molekül ist, das mit der Regulierung des Immunsystems oder der Hämatopoese in Verbindung steht. Das Gen, das NR12 codiert, wird beim Durchmustern nach neuen hämatopoetischen Faktoren, die funktionell an den Rezeptor binden können, extrem nützlich sein.
Darüber hinaus waren die hier genannten Erfinder bei der Isolierung genomischer Fragmente von Mäuse-Rezeptor-Homologen durch Durchführen xenogener Kreuz-Hybridisierungs-Clonierung unter Verwendung von cDNA von menschlichem NR12 als Sonde erfolgreich. Es wird erwartet, dass eine weitere Aufklärung der Funktion des Rezeptorproteins in vivo durch die Konstruktion einer Mäusemutante, der das NR12-Gen fehlt, unter Verwendung des Mäuse-Genfragments möglich ist.
In der Konsequenz betrifft die vorliegende Erfindung neue Hämopoietin-Rezeptoren und Gene, die die Rezeptoren codieren, sowie die Verwendung derselben. Genauer stellt die vorliegende Erfindung Folgendes zur Verfügung:

(1) eine DNA, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) einer DANN, codierend ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 und 10;
(b) einer DNA, umfassend die codierende Region der Nucleotidsequenz einer der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 und 9;
(c) einer DNA, codierend ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 und 10, in der zwei bis zehn Aminosäuren durch Substitution, Deletion, Insertion und/oder Addition modifiziert sind, wobei das Protein eine Aktivität als Rezeptor des hämatopoetischen Faktors besitzt; und,
(d) einer DANN, codierend ein Peptid, das ein Teil des Proteins ist, das aus der Aminosäuresequenz eines der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 und 10 besteht, wobei das Peptid eine Aktivität als ein Rezeptor des hämatopoetischen Faktors besitzt;
(2) einen Vektor, in den die in (1) beschriebene DNA eingefügt ist;
(3) eine Transformante, die den in (2) beschriebenen Vektor beherbergt;
(4) ein Verfahren zur Herstellung des Proteins oder Peptids, das von der DNA von (1) codiert wird, umfassend die Schritte: Züchten der Transformante von (3) und Gewinnen des exprimierten Proteins aus der Transformanten oder dem Kulturüberstand;
(5) ein Protein oder Peptid, das von der in (1) beschriebenen DNA codiert wird oder durch das Verfahren von (4) erhältlich ist;
(6) einen Antikörper, der spezifisch mit dem Protein oder Peptid von (5) reagiert;
(7) ein Antisense-Polynucleotid, komplementär zu einer DNA, die mindestens 15 Nucleotide aus einer der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 und 9 umfasst;
(8) ein Verfahren zum Durchmustern nach einer Verbindung, die an das Protein oder Peptid von (5) bindet, umfassend die Schritte:
(a) Inkontaktbringen einer Testprobe mit dem Protein oder Peptid davon;
(b) Nachweis der Bindungsaktivität der Testprobe mit dem Protein oder Peptid davon; und
(c) Auswahl der Verbindung, die an das Protein oder Peptid davon bindet;
(9) ein Arzneimittel, umfassend die DNA von (1), das Protein von (5), den Vektor von (2), den Antikörper von (6) und/oder das Polynucleotid von (7); und
(10) die Verwendung des Proteins von (5) und/oder des Antikörpers von (6) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die mit der Immunität und Hämatopoese in Verbindung stehen.

Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Hämopoietin-Rezeptor „NR12" zur Verfügung. Gemäß den Ergebnissen der Datenbank-Suchen auf GenBank sowie die 5'-RACE- und 3'-RACE-Analyse gelang es den vorliegenden Erfindern schließlich, ein neues Hämopoietin-Rezeptor-Gen NR12 zu identifizieren und zu isolieren. Es wurde herausgefunden, dass mindestens drei Spleißvarianten von NR12 transkribiert werden. Eine dieser Varianten, der cDNA-Clon NR12.1, codiert ein lösliches Rezeptor-ähnliches Protein. Die anderen beiden, von denen vorhergesagt wurde, dass sie transmembrane Rezeptor-Proteine codieren, die cDNA-Clone NR12.2 und NR12.3, codieren ein Protein, von dem angenommen wird, dass es eine intrazelluläre Region hat, die 51 Aminosäuren kurz beziehungsweise 252 Aminosäuren lang ist.
Des Weiteren führten die hier genannten Erfinder eine PCR-Clonierung gegen eine cDNA-Bank von menschlichem Thymus durch, um die fortlaufenden Codierungssequenzen (CDS) voller Länge zu isolieren. Ein Clon, der etwa denselben ORF voller Länge hatte wie NR12.2, wurde NR12.4 genannt, und der, der etwa denselben ORF voller Länge hatte wie NR12.3, wurde NR12.5 genannt.
Die Nucleotid-Sequenz der NR12.1-cDNA ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die cDNA codiert wird, ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt. Die Nucleotid-Sequenz der cDNA von NR12.2 ist in SEQ ID NO: 3 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die cDNA codiert wird, ist in SEQ ID NO: 4 gezeigt. Die Nucleotid-Sequenz der cDNA von NR12.3 ist in SEQ ID NO: 5 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die cDNA codiert wird, ist in SEQ ID NO: 6 gezeigt. Die Nucleotid-Sequenz der cDNA von NR12.4 ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die cDNA codiert wird, ist in SEQ ID NO: 8 gezeigt. Die Nucleotid-Sequenz der cDNA von NR12.5 ist in SEQ ID NO: 9 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die cDNA codiert wird, ist in SEQ ID NO: 10 gezeigt.
Da die extrazellulären Regionen von NR12.1, NR12.2, NR12.3, NR12.4 und NR12.5 beinahe identisch sind, wird angenommen, dass diese Regionen dieselbe tertiäre Struktur haben und deshalb denselben spezifischen Liganden erkennen.
Analysen der Genexpression unter Verwendung von RT-PCR in verschiedenen menschlichen Organen zeigte: starke Expression von NR12 in hämatopoetischen Zelllinien-Geweben und Immunzelllinien-Geweben wie voll entwickelter/m/n Milz, Thymus, Lymphknoten, Knochenmark und peripheren Leukocyten; und Expression in Testis, Leber, Lunge, Niere, Pankreas und im gastrointestinalen Trakt wie Dünndarm und Dickdarm. Zusätzlich wurde die Expression von NR12 auch in der gesamten analysierten mRNA, die von menschlichen fötalen Organen abstammte, beobachtet. Aus dem gezeigten Verteilungsmuster der NR12-Genexpression wurde angenommen, dass NR12 einen neuen Rezeptor des hämatopoetischen Faktors codiert, vor allem weil die Lokalisierung starker Expression in Geweben, von denen angenommen wird, dass sie Immunzelllinien und hämatopoetische Zellen umfassen, nachgewiesen wurde. Des Weiteren legt die Tatsache, dass die NR12-Expression in anderen Geweben als den vorstehend beschriebenen beobachtet wurde, nahe, dass NR12 nicht nur physiologische Funktionen des Immunsystems und des hämatopoetischen Systems in vivo, sondern auch verschiedene andere physiologische Funktionen in vivo regulieren kann.
Die vorstehenden NR12-Proteine sind potenziell für die medizinische Anwendung nützlich. Da NR12.1 in Thymus, peripheren Leukocyten und in der Milz exprimiert wird, wird vorhergesagt, dass es ein Rezeptor für einen unbekannten hämopoetischen Faktor ist. Deshalb sind NR12-Proteine bei der Identifikation des unbekannten hämopoetischen Faktors nützliche Werkzeuge. Sie können ebenfalls verwendet werden, um eine Peptid-Bank oder synthetische chemische Verbindungen zur Isolierung oder Identifikation von Agonisten und Antagonisten zu durchsuchen, die funktional an das NR12-Molekül binden können. Darüber hinaus wird eine klinische Anwendung neuer Moleküle, die an das NR12-Molekül binden, und spezifischer Antikörper, die die Funktion des NR12-Moleküls zur Regulation der Immunantwort oder der Hämatopoese in vivo begrenzen können, durch Forschung nach solchen Molekülen und Antikörpern erwartet.
Es wird erwartet, dass NR12 in einer beschränkten Zellpopulation in den hämatopoetischen Geweben exprimiert wird, und somit sind anti-NR12-Antikörper für die Isolierung solcher Zellpopulationen nützlich. Die isolierten Zellpopulationen können bei der Zelltransplantation verwendet werden. Des Weiteren wird erwartet, dass der anti-NR12-Antikörper für die Diagnose oder Behandlung von Krankheiten wie Leukämie verwendet werden kann.
Auf der anderen Seite können die löslichen Proteine, die die extrazelluläre Domäne von NR12-Protein und die Spleiß-Variante von NR12, NR12.1, umfassen, als Köder-Rezeptor verwendet werden, um den NR12-Liganden zu hemmen. Sie können bei der Behandlung von Krankheiten, bei denen eine Beteiligung von NR12 angenommen wird, wie zum Beispiel Leukämie von Nutzen sein.
Die vorliegende Erfindung umfasst Proteine, die funktionell dem NR12-Protein äquivalent sind. Zum Beispiel sind Homologe von menschlichem NR12-Protein eingeschlossen. Hierein betrifft der Begriff „funktional äquivalent" Proteine, die im Vergleich mit der eines NR12-Proteins eine äquivalente biologische Aktivität haben. Eine solche biologische Aktivität kann die Protein-Aktivität als membrangebundene oder lösliche Form des Rezeptors des hämatopoetischen Faktors umfassen.
Verfahren zur Einführung von Mutationen für die Herstellung von Proteinen, die funktionell mit einem anderen Protein äquivalent sind, sind einem Fachmann wohlbekannt. Zum Beispiel kann ein Fachmann ortsgerichtete Mutagenese (Hashimoto-Gotoh T. et al. (1995), Gene 152, 271–275; Zoller, M. J. und Smith, M. (1983), Methods Enzymol. 100, 468–500; Kramer, W. et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 9441–9456; Kramer W. und Fritz H. J. (1987) Methods Enzymol. 154, 350–367; Kunkel, TA (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488–492; Kunkel (1988), Methods Enzymol. 85, 2763–2766) und Ähnliches verwenden, um eine geeignete Mutation in die Aminosäuresequenz des menschlichen NR12-Proteins einzuführen und ein Protein herzustellen, das funktional zu dem Protein äquivalent ist. Eine Mutation von Aminosäuren kann in der Natur ebenfalls stattfinden. Die Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen Proteine, die die Aminosäuresequenz von menschlichem NR12-Protein haben, in dem ein oder mehrere Aminosäuren mutiert sind, solange die resultierenden Proteine funktional äquivalent zu menschlichem NR12-Protein sind.
Als ein Protein, das zu dem NR12-Protein der Erfindung funktional äquivalent ist, kann folgendes spezifisch erwähnt werden: eines, in dem eine oder zwei, vorzugsweise zwei bis 30, stärker bevorzugt zwei bis 10 Aminosäuren in einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8 oder 10 deletiert sind; eines, in dem eine oder zwei, vorzugsweise zwei bis 30, stärker bevorzugt zwei bis 10 Aminosäuren in eine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 oder 10 eingefügt wurden; eines, in dem eine oder zwei, vorzugsweise zwei bis 30, stärker bevorzugt zwei bis 10 Aminosäuren in einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 oder 10 durch andere Aminosäuren substituiert wurden.
Hinsichtlich des Aminosäurerests, der mutiert werden soll, ist vorzuziehen, dass er in eine andere Aminosäure mutiert wird, die gewährleistet, dass die Eigenschaften der Aminosäure-Seitenkette beibehalten wird. Beispiele für Eigenschaften von Aminosäure-Seitenketten sind folgende: hydrophobe Aminosäuren (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophile Aminosäuren (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) und Aminosäuren, die die folgenden Seitenketten umfassen: eine aliphatische Seitenkette (G, A, V, L, I, P); eine eine Hydroxylgruppe enthaltende Seitenkette (S, T, Y); eine ein Schwefelatom enthaltende Seitenkette (C, M); eine eine Carboxylsäure und ein Amid enthaltende Seitenkette (D, N, E, Q); eine eine Base enthaltende Seitenkette (R, K, H); und eine eine aromatische Gruppe enthaltende Seitenkette (H, F, Y, W) (Die Buchstaben in Klammern zeigen die Einbuchstaben-Codes der Aminosäuren an).
Es ist bekannt, dass ein Protein eine Aminosäuresequenz haben kann, die durch Deletion, Addition und/oder Substitution anderer Aminosäuren von einem oder mehreren Aminosäureresten modifiziert ist und dennoch ihre biologische Aktivität beibehält (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1984), 81, 5662–5666; Zoller, M. J. & Smith, M., Nucleic Acids Research, (1982), 10, 6487–6500; Wang, A. et al., Science, 224, 1431–1433; Dalbadie-MacFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1982), 79, 6409–6413).
Ein Fusionsprotein, das menschliches NR12-Protein umfasst, ist ein Beispiel für ein Protein, in dem ein oder mehrere Aminosäurereste zur Aminosäuresequenz eines menschlichen NR12-Proteins zugesetzt wurde(n) (z.B., SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10). Ein Fusionsprotein wird durch Fusionieren des menschlichen NR12-Proteins mit (einem) anderen Peptid(en) oder Protein(en) hergestellt und ist in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Ein Fusionsprotein kann durch Ligierung einer DNA, die das menschliche NR12-Protein der vorliegenden Erfindung codiert, mit einer DNA, die (ein) andere(s) Peptid(e) oder Protein(e) codiert, im Leserahmen, Einführung der ligierten DNA in einen Expressionsvektor und Expression des Fusionsgens in einem Wirt hergestellt werden. Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können zur Herstellung eines solchen Fusionsgens verwendet werden. Es gibt keine Beschränkung hinsichtlich dem (der) anderen Peptid(e) oder Protein(e), das/die mit dem Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert ist (sind).
Ein anderes (andere) Peptid(e), das (die) mit einem Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert werden soll(en), umfasst (umfassen) bekannte Peptide, zum Beispiel FLAG (Hopp, T. P. et al., Biotechnology (1988) 6, 1204–1210), 6 × His, bestehend aus sechs His (Histidin)-Resten, 10 × His, Influenza-Agglutinin (HA), menschliches c-myc-Fragment, VSV-GP-Fragment, p18HIV-Fragment, T7-Markierung, HSV-Markierung, E-Markierung, SV40T-Antigenfragment, Ick- Markierung, α-Tubulin-Fragment, B-Markierung, Protein C-Fragment und so weiter. Andere Beispiele für Proteine, die mit dem Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert werden sollen, sind GST (Glutathion-S-Transferase), Influenza-Agglutinin (HA), konstante Immunglobulin-Region, β-Galactosidase, MBP (Maltose bindendes Protein) und Ähnliche.
Fusionsproteine können durch Fusionieren im handel erhältlicher DNA, die diese Peptide oder Proteine codiert, mit DNA, die ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, und Exprimieren der fusionierten hergestellten DNA hergestellt werden.
Das Hybridisierungsverfahren (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2. Ausgabe, 9.47–9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) ist dem Fachmann als alternatives Verfahren für die Herstellung eines Proteins, das einem bestimmten Protein funktional äquivalent ist, wohlbekannt. Genauer kann ein Fachmann durch Isolieren von DNA, die eine hohe Homologie mit der gesamten oder einem Teil einer DNA-Sequenz hat, die das menschliche NR12-Protein codiert (z.B. SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9), das allgemeine Verfahren zur Gewinnung eines Proteins verwenden, das einem menschlichen NR12-Protein funktional äquivalent ist. Somit beschreibt die vorliegende Erfindung solche Proteine, die durch DNAs codiert werden, die mit einer DNA hybridisieren, die ein menschliches NR12-Protein oder einen Teil davon codieren und funktional einem menschlichen NR-Protein äquivalent sind. Beispiele umfassen Homologe von menschlichem NR12 bei anderen Säugern (zum Beispiel jene von Affen-, Ratten-, Mäuse-, Kaninchen- und Rindergen). Um eine cDNA mit hoher Homologie zu einer DNA, die ein menschliches NR12-Protein codiert von Tieren zu isolieren, wird bevorzugt, ein hämatopoetisches Zellliniengewebe wie Milz, Thymus, Lymphknoten, Knochenmark und periphere Leukocyten zu verwenden; die Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Stringente Hybridisierungsbedingungen für die Isolierung von DNA, die Proteine codiert, die funktional äquivalent zu einem menschlichen NR12-Protein sind, können geeigneterweise durch einen Fachmann ausgewählt werden, und es können zum Beispiel niedrig stringente Bedingungen gegeben sein. Niedrig stringente Bedingungen sind zum Beispiel 42°C, 2 × SSC und 0,1% SDS und vorzugsweise 50°C, 2 × SSC und 0,1% SDS. Hoch stringente Bedingungen sind stärker bevorzugt und umfassen zum Beispiel 65°C, 2 × SSC und 0,1% SDS. Unter diesen Bedingungen, bei niedrigeren Temperaturen, wird die erhaltene DNA eine geringere Homologie haben. Auf der anderen Seite wird erwartet, dass die Homologie der erhaltenen DNA bei höheren Temperaturen höher sein wird. Es können jedoch verschiedene andere Faktoren als Temperatur, wie die Salzkonzentration, ebenfalls die Stringenz der Hybridisierung beeinflussen, und der Fachmann kann die Faktoren routinemäßig auswählen, um eine ähnliche Stringenz zu erreichen.
An Stelle von Hybridisierung kann das Gen-Amplifikationsverfahren, zum Beispiel das Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Verfahren, unter Verwindung von Primern, die basierend auf der Sequenzinformation einer DNA (z.B. SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9), die menschliches NR12-Protein codiert, synthetisiert sind, verwendet werden, um die Ziel-DNA zu isolieren.
Proteine, die funktional äquivalent zu menschlichem NR12-Protein sind, codiert durch DNA, die durch das vorstehende Hybridisierungsverfahrer oder durch die Gen-Amplifikationsverfahren isoliert wird, haben normalerweise ein hohe Homologie zu der Aminosäuresequenz des menschlichen NR12-Proteins. Die Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen auch Proteine, die funktional äquivalent zu dem menschlichen NR12-Protein sind und die auch eine hohe Homologie mit dem Protein haben, das eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 und 10 umfasst. Hohe Homologie wird normalerweise als eine Homologie von 70% oder mehr, vorzugsweise 80% oder mehr, stärker bevorzugt 90% oder mehr und am stärksten bevorzugt 95% oder mehr definiert. Die Homologie eines Proteins kann durch den Algorithmus in „Wilbur, W. J. und Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726–730" bestimmt werden.
Die Aminosäuresequenz, das Molekulargewicht, der isoelektrische Punkt, die Gegenwart oder Abwesenheit von Zuckerketten und die Form eines Proteins der vorliegenden Erfindung können sich in Abhängigkeit von den nachstehend beschriebenen produzierenden Zellen, dem Wirt oder dem Reinigungsverfahren unterscheiden. Solange das erhaltene Protein jedoch eine äquivalente Funktion zu menschlichem NR12-Protein (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10) hat, ist es in die vorliegende Erfindung eingeschlossen. Zum Beispiel wird, wenn ein Protein der vorliegenden Erfindung in prokaryontischen Zellen wie E. coli exprimiert wird, ein Methioninrest am N-Terminus der Aminosäuresequenz des exprimierten Proteins zugesetzt. Wird ein Protein der vorliegenden Erfindung in eukaryontischen Zellen wie Säugerzellen exprimiert, wird die N-terminale Signalsequenz entfernt. Solche Proteine sind ebenfalls als Proteine der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Zum Beispiel wurde basierend auf dem Verfahren in „Von Heijne, G., Nucleic Acids Research, (1986), 14, 4683–4690" als Ergebnis der Analyse des Proteins der Erfindung angenommen, dass sich die Signalsequenz vom 1. Met zum 23. Gly in den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 und 10 erstreckt. Deshalb umfasst die vorliegende Erfindung ein Protein, das die Sequenz vom 24. Gly bis zum 337. Cys in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 enthält. Ähnlich umfasst die vorliegende Erfindung ein Protein, umfassend die Sequenz vom 24. Gly bis zum 428. Ser in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4. Ähnlich umfasst die vorliegende Erfindung ein Protein, umfassend die Sequenz vom 24. Gly bis zum 629. Lys in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6. Ähnlich umfasst die vorliegende Erfindung ein Protein, umfassend die Sequenz vom 24. Gly bis zum 428. Ser in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 8. Ähnlich umfasst die vorliegende Erfindung ein Protein, umfassend die Sequenz vom 24. Gly bis zum 629. Lys in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, als rekombinantes Protein und auch als natürliches Protein hergestellt werden. Eine rekombinante DNA kann durch Insertion einer DNA, die das Protein der vorliegenden Erfindung codiert (zum Beispiel die DNA, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 umfasst), in einen geeigneten Expressionsvektor, Einführen des Vektors in eine geeignete Wirtszelle und Gewinnen des Extrakts aus der entstandenen Transformante hergestellt werden. Nach Erhalt des Extrakts kann rekombinantes Protein durch Anwendung einer Chromatographie wie Ionenaustausch-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie, Gelfiltration und Ähnliches oder Affinitäts-Chromatographie, wobei Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung immobilisiert werden, oder durch Verwendung einer oder mehrerer dieser Säulen in Kombination gereinigt und hergestellt werden.
Weiterhin kann das exprimierte rekombinante Protein unter Verwendung einer Glutathion-Säule oder einer Nickel-Säule gereinigt werden, wenn ein Protein der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen (zum Beispiel Tierzellen und E. coli) als Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase-Protein oder als ein rekombinantes Protein, das mit multiplen Histidinen versetzt ist, exprimiert wird.
Nach Reinigen des Fusionsproteins ist es ebenfalls möglich, andere Regionen als das Zielprotein durch Schneiden mit Thrombin, Faktor-Xa und Ähnlichem, wie benötigt, auszuschließen.
Ein natürliches Protein kann durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert werden. Zum Beispiel können Gewebeextrakte oder Zellen, die ein Protein der Erfindung exprimieren, mit der nachstehend beschriebenen Affinitätssäule zur Reaktion gebracht werden, an die Antikörper, die an das menschliche NR12-Protein binden, angeheftet sind, um das natürliche Protein zu isolieren. Polyclonale oder monoclonale Antikörper können verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Peptide, die Teil der Proteine der vorliegenden Erfindung sind. Das Peptid besteht aus einer Aminosäure-Sequenz, die für ein Peptid der vorliegenden Erfindung spezifisch ist, und ist aus mindestens 7 Aminosäuren, vorzugsweise aus mehr als 8 Aminosäuren und stärker bevorzugt aus mehr als 9 Aminosäuren zusammengesetzt. Die Peptide können zum Beispiel für die Herstellung von Antikörpern gegen ein Protein der vorliegenden Erfindung nützlich sein; für das Durchmustern von Verbindungen, die an ein Protein der vorliegenden Erfindung binden, oder für die Durchmustern von Beschleunigungsstoffen oder Hemmstoffen eines Proteins der vorliegenden Erfindung. Alternativ können sie als Antagonisten des Liganden eines Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein Peptid, das Teil eines Proteins der vorliegenden Erfindung ist, ist zum Beispiel ein Peptid, bei dem das aktive Zentrum des Proteins aus den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10 besteht. Zusätzlich können die Peptide eine oder mehrere Regionen der hydrophilen Region und der hydrophoben Region umfassen, die durch Hydrophobe Plot-Analyse bestimmt werden. Diese Peptide können die gesamte hydrophile Region oder einen Teil einer hydrophilen Region enthalten oder sie können die gesamte oder einen Teil der hydrophoben Region enthalten. Darüber hinaus sind zum Beispiel lösliche Proteine und Proteine, die extrazelluläre Regionen eines Proteins der Erfindung umfassen, auch in die Erfindung eingeschlossen.
Die Peptide, die Teil des Proteins der Erfindung sind, können durch gentechnologische Verfahren, wohlbekannte Peptid-Synthetisierungsverfahren oder durch Ausschneiden eines Proteins der Erfindung mit einer geeigneten Peptidase hergestellt werden. Zum Beispiel können das Festphasen-Syntheseverfahren oder das Flüssigphasen-Syntheseverfahren als Peptid-Syntheseverfahren verwendet werden.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer DNA, die ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert. Die DNA kann für die Herstellung der vorstehenden Proteine der vorliegenden Erfindung in vivo oder in vitro nützlich sein. Des Weiteren ist es zum Beispiel auch möglich, die DNA bei der Gentherapie und solchen Krankheiten, die von Anomalitäten des Gens, das das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, herrühren, zu verwenden. Die DNA kann in jeder Form bereitgestellt werden, solange sie ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert. Somit kann die DNA eine cDNA sein, die von mRNA, genomischer DNA oder chemisch synthetisierter DNA synthetisiert wird. Des Weiteren kann eine DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, die auf der Degeneration von genetischem Code basiert, eingeschlossen sein, solange sie ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert.
Die DNA der vorliegenden Erfindung kann durch jedes Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, hergestellt werden. Zum Beispiel kann die DNA der vorliegenden Erfindung durch Konstruieren einer cDNA-Bank aus Zellen, die das Protein der vorliegenden Erfindung exprimieren, und durch Durchführen einer Hybridisierung unter Verwendung einer partiellen Sequenz einer DNA der vorliegenden Erfindung (zum Beispiel SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9) als Sonde hergestellt werden. Eine cDNA-Bank kann zum Beispiel gemäß dem Verfahren, das in der Literatur beschrieben wird (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) konstruiert werden, oder eine im Handel erhältliche cDNA-Bank kann verwendet werden. Alternativ kann die DNA durch Gewinnen von RNA von einer Zelle, die ein Protein der vorliegenden Erfindung exprimiert, durch Synthetisieren von Oligo-RNA, basierend auf der Sequenz einer DNA der vorliegenden Erfindung (zum Beispiel SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9), durch Durchführen von PCR unter Verwendung der synthetisierten DNA als Primer und Amplifizieren der cDNA, die ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, hergestellt werden.
Durch Bestimmen der Nucleotidsequenz der erhaltenen cDNA kann die Translationsregion, die durch die cDNA codiert wird, bestimmt werden, und die Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden. Des Weiteren kann genomische DNA durch Durchmustern genomischer DNA-Banken unter Verwendung der erhaltenen cDNA als Sonde isoliert werden.
Genauer kann dies wie folgt durchgeführt werden: zuerst wird mRNA aus Zellen, Geweben oder Organen, die ein Protein der Erfindung exprimieren (zum Beispiel hämatopoetisch-kompetentes Zellliniengewebe wie Milz, Thymus, Lymphknoten, Knochenmark, periphere Leukocyten und immunkompetentes Zellliniengewebe und Ähnliche) isoliert. Um die mRNA zu isolieren, wird zuerst gesamte RNA unter Verwendung wohlbekannter Verfahren, zum Beispiel von den Guanidin-Ultrazentrifugationsverfahren (Chirgwin J. M. et al. Biochemistry 18: 5294–5299 (1979)), dem AGPC-Verfahren (Chomczynski, P. und Sacchi, N., Anal. Biochem. 162: 156–159 (1987)) und Ähnlichem hergestellt. Danach kann mRNA von gesamter mRNA unter Verwendung des mRNA Purification Kit (Pharmacia) und Ähnliche gereinigt werden. Alternativ kann mRNA direkt durch den QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) hergestellt werden.
cDNA kann dann unter Verwendung von reverser Transkriptase von der erhaltenen mRNA synthetisiert werden. cDNA kann unter Verwendung des AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Kogyo), etc. synthetisiert werden. Zusätzlich können die cDNA-Synthese und -Amplifikation gemäß dem 5'-RACE-Verfahren (Frohman, M. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998–9002 (1988); Belyavsky, A. et al. Nucleic Acids Res. 17: 2919–2932 (989)) unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und des 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) auch unter Verwendung des hierin beschriebenen Primers und Ähnliches durchgeführt werden.
Das Ziel-DNA-Fragment wird von dem erhaltenen PCR-Produkt hergestellt und mit einer Vektor-DNA ligiert. Somit wird ein rekombinanter Vektor geschaffen und in E. coli und Ähnliches eingeführt, und Kolonien werden ausgewählt, um den gewünschten rekombinanten Vektor herzustellen. Die Nucleotidsequenz der Ziel-DNA kann durch herkömmliche Verfahren, zum Beispiel Didesoxynucleotid-Ketten-Termination überprüft werden.
Hinsichtlich der DNA der Erfindung kann durch Betrachten der Codon-Verwendungshäufigkeit in dem Wirt, der für die Expression verwendet wird, eine Sequenz mit höherer Expressionseffizienz hergestellt werden (Grantham R. et al. Nucleic Acids Research (1981) 9, r43–74). Die DNA der vorliegenden Erfindung kann auch durch Verwendung im Handel erhältlicher Kits und herkömmlicher Verfahren modifiziert werden. Veranschaulichende Modifikationen umfassen zum Beispiel Spaltung durch Restriktionsenzyme, Insertion synthetischer Oligonucleotide und geeigneter DNA-Fragmente, Anfügen von Linkern, Insertion eines Initiationscodons (ATG) und/oder Stopcodons (TAA, TGA oder TAG) und Ähnliches.
Genauer umfasst die DNA der vorliegenden Erfindung DNA, die die Nucleotidsequenz vom 98. „A" bis zum 1108. „C" von SEQ ID NO: 1; dem 98. "A" bis zum 1381. „C" von SEQ ID NO: 3, vom 98. „A" bis zum 1984. „G" von SEQ ID NO: 5; dem 1. „A" bis zum 1284. „C" von SEQ ID NO: 7; und dem 1. „A" bis zum 1887. „G" von SEQ ID NR: 9 einschließt.
Des Weiteren beschreibt die vorliegende Erfindung DNA, die unter stringenten Bedingungen mit der DNA, die aus einer der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 besteht, hybridisiert, wobei die entstandene DNA ein Protein codiert, das zu dem vorstehend erwähnten Protein der Erfindung funktional äquivalent ist.
Ein Fachmann kann geeigneterweise stringente Bedingungen auswählen und es können zum Beispiel niedrig-stringente Bedingungen vorgegeben werden. Niedrig-stringente Bedingungen sind zum Beispiel 42°C, 2 × SSC und 0,1% SDS und bevorzugt 50°C, 2 × SSC und 0,1% SDS. Stärker bevorzugt sind hoch stringente Bedingungen solche, die zum Beispiel 65°C, 2 × SSC und 0,1% SDS betragen. Unter diesen Bedingungen wird die Homologie der erhaltenen DNA umso höher sein, je höher die Temperatur ist. Die vorstehende hybridisierende DNA ist vorzugsweise eine natürliche DNA wie cDNA und chromosomale DNA.
Darüber hinaus stellt die vorliegenden Erfindung einen Vektor zur Verfügung, der eine DNA der vorliegenden Erfindung als Insertion enthält. Der Vektor der vorliegenden Erfindung kann bei der Erhaltung der DNA der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen oder bei der Herstellung des Proteins der vorliegenden Erfindung nützlich sein.
Wenn die Wirtszelle E. coli ist (wie JM109, DH5α, HB101 und XL1Blue), kann jeder Vektor verwendet werden, so lange er den „ori" für die Amplifikation in E. coli, der die Herstellung im großen Maßstab ermöglicht, und eine Selektionsmarkierung für Transformanten enthält (zum Beispiel ein Wirkstoffresistenzgen, das die Selektion durch einen Wirkstoff wie Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin und Chloramphenicol ermöglicht). Zum Beispiel können Vektoren der M13-Reihe, Vektoren der pUC-Reihe, pBR322, pBluescript, pCR-Script und so weiter verwendet werden. Zum Zweck der Subclonierung oder dem Ausschneiden einer cDNA können pGEM-T, pDIRECT, pT7 und Ähnliches ebenfalls verwendet werden. Um das Protein der vorliegenden Erfindung herzustellen, ist ein Expressionsvektor besonders nützlich. Zum Beispiel muss der Expressionsvektor, wenn das Protein in E. coli exprimiert werden soll, Eigenschaften wie die vorstehend erwähnten haben, um in E. coli amplifiziert zu werden. Zusätzlich muss der Vektor einen Promotor, zum Beispiel den lacZ-Promotor (Ward et al., Nature (1989) 341, 544–546; FASEB J. (1992) 6, 2422–2427), den araB-Promotor (Better et al., Science (1988) 240, 1041–1043), den T7-Promotor und Ähnliche, die das gewünschte Gen in E. coli wirksam exprimieren können, haben, wenn E. coli wie JM109, DH5α, HB101 oder XL1 Blue, als Wirtszelle verwendet wird. Solche Vektoren umfassen pGFX-5X-1 (Pharmacia), „QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP, pET (in diesem Fall ist ein Wirt vorzugsweise BL21, der T7-RNA-Polymerase exprimiert) und so weiter, mit Ausnahme der vorstehend erwähnten.
Vektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, zum Beispiel durch das Calcium-Chlorid-Verfahren oder Elektroporation. Der Vektor kann auch eine Signalsequenz für die Polypeptid-Sekretion enthalten. Die pe1B-Signalsequenz (Lei, S. P. et al. J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) kann verwendet werden, um die Proteine im Periplasma von E. coli herzustellen.
Zum Beispiel kann ein Expressionsvektor für die Herstellung eines Proteins der vorliegenden Erfindung ein vom Säuger abgeleiteter Expressionsvektor (zum Beispiel pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p5322), pEF und pCDM8); ein von einem Insekt abgeleiteter Expressionsvektor (zum Beispiel „Bac-to-BAC baculovirus expression system" (GIBCO) BRL), pBacPAK8); ein von einer Pflanze abgeleiteter Expressionsvektor (zum Beispiel pMH1 und pMH2); ein von einem Tiervirus abgeleiteter Expressionsvektor (zum Beispiel pHSV, pMV und pAdexLcw); ein von einem Retrovirus abgeleiteter Expressionsvektor (zum Beispiel pZIpneo); ein von Hefe abgeleiteter Expressionsvektor (zum Beispiel „Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, und SP-Q01); oder ein von Bacillus subtilis abgeleiteter Expressionsvektor (zum Beispiel pPL608 und pKTH50) außer E. coli sein.
Für die Expression in Tierzellen wie CHO-, COS- und NIH3T3-Zellen muss der Expressionsvektor einen Promotor wie den SV40-Promotor (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), den MMLV-LTR-Promotor, den EF1α-Promotor (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) und den CMV-Promotor haben. Stärker bevorzugt, kann der Vektor ein Marker-Gen für die Selektion von Transformanten (zum Beispiel ein Wirkstoff-Resistenzgen für die Selektion durch einen Wirkstoff wie Neomycin und G418) enthalten. Solche Vektoren umfassen pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOp13 und so weiter.
Des Weiteren können, um eine stabile Genexpression und Amplifikation der Gen-Kopienzahl in der Zelle zu erreichen, CHO-Zellen, die im Stoffwechselweg der Nucleotidsynthese einen Mangel haben, verwendet werden. Die CHO-Zelle wird mit einem Expressionsvektor transfiziert, der das DHFR-Gen umfasst, das den Mangel ausgleicht (zum Beispiel pCHO I), dann kann der Vektor durch Methotrexat (MTX)-Behandlung amplifiziert werden. Für die transiente Genexpression können COS-Zellen, die ein Gen, das das SV40-T-Antigen exprimiert, auf ihrem Chromosom enthalten, verwendet werden, um mit einem Vektor, der den SV40-Replikationsursprung (z.B. pcD) enthält, zu transformieren. Beispiele für Replikationsursprünge, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen jene, die von Polyomavirus, Adenovirus, Rinder-Papillomvirus (BPV) und Ähnlichen abstammen. Darüber hinaus kann der Expressionsvektor ein Aminoglycosid-Transferase (APH)-Gen, Thymidin-Kinase (TK)-Gen, E. coli-Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (Ecogpt)-Gen, Dihydrofolat-Reduktase (dhfr)-Gen und Ähnliche als selektive Markierungen umfassen, um die Genkopien in Wirtszelllinien zu amplifizieren.
Auf der anderen Seite kann die Expression einer DNA der vorliegenden Erfindung in vivo in Tieren zum Beispiel durch Insertion einer DNA der vorliegenden Erfindung in einen geeigneten Vektor und Einführen des Vektors in den Körper unter Verwendung eines Retrovirus, Liposoms, kationischen Liposoms, Adenovirus und so weiter durchgeführt werden. Es ist möglich, diese Verfahren zu verwenden, um eine Gentherapie gegen Krankheiten, die aus Mutationen im NR12-Gen der vorliegenden Erfindung entstehen, durchzuführen. Beispiele für Vektoren, die zu diesem Zweck verwendet werden, umfassen zum Beispiel Adenovirus-Vektoren (zum Beispiel pAdexlcw), Retrovirus-Vektoren (zum Beispiel pZIPneo) und Ähnliche, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Allgemeine Genmanipulationen, zum Beispiel Insertion der DNA der vorliegenden Erfindung in einen Vektor, können unter Verwendung von Standardverfahren (Molecular Cloning, 5.61–5.63) durchgeführt werden. Der Vektor kann durch Verfahren ex vivo oder in vivo an einen lebenden Körper verabreicht werden.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Transformante, die einen Vektor der vorliegenden Erfindung enthält. Die Wirtszelle zur Insertion eines Vektors der Erfindung ist auf keine Weise beschränkt, und es können zum Beispiel E. coli, verschiedene Tierzellen und so weiter verwendet werden. Die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel als Produktionssystem für die Herstellung oder Expression eines Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In vitro- und in vivo-Herstellungssysteme sind als Produktionssystem für die Herstellung von Proteinen bekannt. Produktionssysteme unter Verwendung eukaryontischer Zellen und prokaryontischer Zellen können als die in vitro-Produktionssysteme verwendet werden.
Verwendet man eukaryontische Zellen, sind Produktionssysteme, die zum Beispiel Tierzellen, Pflanzenzellen und Pilzzellen verwenden, als Wirte verfügbar. Beispielhafte Tierzellen, die verwendet werden können, umfassen Säugerzellen wie CHO-(J. Exp. Med. 108: 945 (1995)), COS-, 3T3-, Myelom-, Babyhamster-Nieren-(BHK), HeLa-, Vero-Zellen; Amphibienzellen wie Eizellen von Xenopus (Valle, et al. Nature 291: 338–340 (1981)); und Insektenzellen wie Sf9, Sf21 oder Tn5. Als CHO-Zellen können geeigneterweise vor allem CHO-Zellen, bei denen das DHFR-Gen unzulänglich ist, dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216–4220 (1980)), und CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275 (1968)) verwendet werden. Für die Herstellung im großen Maßstab in Tierzellen können vorzugsweise CHO-Zellen verwendet werden. Der Vektor kann zum Beispiel durch das Calcium-Phosphat-Verfahren, das DEAE-Dextran-Verfahren, Verfahren unter Verwendung des kationischen Liposoms DOTAP (Boehringer Mannheim), das Elektorporationsverfahren, das Lipofektionsverfahren und so weiter in Wirtszellen eingeführt werden.
Von Nicotiana tabacum abstammende Zellen sind als Protein-Herstellungssysteme in Pflanzenzellen wohlbekannt, und diese können als Kalluskultur gezüchtet werden. Als Pilzzellen sind Hefen wie die Gattung Saccharomyces, zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae; filamentöse Pilze wie die Gattung Aspergillus, zum Beispiel Aspergillus niger, bekannt.
Bakterienzellen können als prokaryontisches Produktionssystem verwendet werden. Als Bakterienzellen sind E. coli, zum Beispiel JM109, DH5α, HB101 und Ähnliche, sowie andere wie Bacillus subtilis bekannt.
Proteine können durch Transformieren dieser Zellen mit der Ziel-DNA und Züchten der transformierten Zellen in vitro erhalten werden. Transformanten können gemäß bekannten Verfahren gezüchtet werden. Zum Beispiel können DMEM, MEM, RPMI1640, und IMDM als Kulturmedien für Tierzellen verwendet werden. Gelegentlich kann den vorstehenden Medien fötales Kälberserum (FCS) und ähnliche Serum-Ergänzungen zugesetzt werden; alternativ kann ein serumfreies Kulturmedium verwendet werden. Der pH-Wert des Kulturmediums liegt vorzugsweise bei etwa pH 6 bis 8. Die Züchtung wird normalerweise bei etwa 30 bis 40°C über etwa 15 bis 200 h durchgeführt, und die Veränderungen im Kulturmedium, Belüftung und Rühren werden wie nötig durchgeführt.
Auf der anderen Seite können zum Beispiel Produktionssysteme, bei denen Tiere und Pflanzen verwendet werden, als Protein-Produktionssysteme in vivo vorgegeben werden. Die Ziel-DNA wird in das Tier oder die Pflanze eingeführt, und das Protein wird der Pflanze oder dem Tier hergestellt, und dann wird das Protein gewonnen. Der Begriff „Wirt", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, umfasst solche Tiere und Pflanzen ebenfalls.
Bei der Verwendung von Tieren können Säuger- und Insekten-Produktionssysteme verwendet werden. Als Säuger können Ziegen, Schweine, Schafe, Mäuse und Rinder verwendet werden (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). Alternativ können bei der Verwendung von Säugern auch transgene Tiere verwendet werden.
Zum Beispiel kann die Ziel-DNA als ein Fusionsgen mit einem Gen hergestellt werden, das ein Protein codiert, das intrinsisch in Milch hergestellt wird, wie Ziegen-β-Casein. Danach wird das DNA-Fragment, das das Fusionsgen umfasst, in ein Ziegenembryo injiziert, und dieser Embryo wird in eine weibliche Ziege implantiert.
Das Ziel-Protein kann aus der Milch der transgenen Ziegen, die von der Ziege, die den Embryo erhielt, und ihren Nachkommen hergestellt wurde, gewonnen werden. Um die Menge an Protein-enthaltender Milch zu erhöhen, die von der transgenen Ziege hergestellt wird, können ein geeignetes Hormon oder geeignete Hormone an die transgenen Ziegen verabreicht werden (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology 12: 699–702 (1994)).
Als Insekten können Seidenraupen verwendet werden. Verwendet man Seidenraupen, so werden sie mit Baculoviren infiziert, in die die DNA, die das Ziel-Protein codiert, inseriert wurde, und das gewünschte Protein kann aus Körperflüssigkeiten der Seidenraupe gewonnen werden (Susumu M. et al. Nature 315: 592–594 (1985)).
Verwendet man Pflanzen, kann zum Beispiel Tabak verwendet werden. Im Fall von Tabak wird die DNA, die das Ziel-Protein codiert, in einen Pflanzen-Expressionsvektor, zum Beispiel pMON530, inseriert, und dieser wird in ein Bakterium wie Agrobacterium tumefaciens inseriert. Mit diesem Bakterium wird Tabak, zum Beispiel Nicotiana tabacum, infiziert, und man kann das gewünschte Polypeptid aus den Tabakpflanzen gewinnen (Julian K.–C. Ma et al. Eur. J. Immunol. 24: 131–138 (1994)).
So gewonnene Proteine der vorliegenden Erfindung werden von innerhalb oder außerhalb (z.B. Medium) der Wirtszelle isoliert und können als im Wesentlichen reines homogenes Protein gereinigt werden. Die Trennung und Reinigung des Proteins können unter Verwendung herkömmlicher Trennungs- und Reinigungsverfahren, die zur Reinigung von Proteinen verwendet werden, durchgeführt werden und sind nicht auf ein spezifisches Verfahren beschränkt. Zum Beispiel können Säulenchromatographie, Filter, Ultrafiltration, Salz-Präzipitation, Lösungsmittel-Präzipitation, Lösungsmittel-Extraktion, Destillierung, Immunpräzipitation, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, isoelektrische Punkt-Elektrophorese, Dialyse, Rekristallisierung und Ähnliche passend ausgewählt oder kombiniert werden, um das Protein zu trennen und zu reinigen.
Zum Beispiel können Affinitäts-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration, Umkehrphasen-Chromatographie, Adsorptions-Chromatographie und Ähnliche beispielhaft als Chromatographien genannt werden (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Diese Chromatographien können durch Flüssig-Chromatographie wie HPLC, FPLC und Ähnliche durchgeführt werden. Die vorliegende Erfindung umfasst Proteine, die unter Verwendung solcher Reinigungsverfahren hochgereinigt sind.
Durch Behandlung der Proteine vor oder nach der Reinigung mit geeigneten Protein-Modifikationsenzymen können Proteine willkürlich modifiziert werden oder können Peptide teilweise ausgeschnitten werden. Trypsin, Chymotrypsin, Lysyl-Endopeptidase, Protein-Kinase, Glucosidase und Ähnliche werden als Protein-Modifikationsenzyme verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Antikörper bereit, die auf das Protein der Erfindung spezifisch reagieren. Es gibt hinsichtlich der Form des Antikörpers der Erfindung keine besondere Beschränkung, und die vorliegende Erfindung umfasst polyclonale Antikörper sowie monoclonale Antikörper. Das Antiserum, das durch die Immunisierung von Tieren wie Kaninchen mit einem Protein der Erfindung erhalten wird, sowie polyclonale und monoclonale Antikörper aller Klassen, menschliche Antikörper und humanisierte Antikörper, die durch genetische Rekombination hergestellt werden, sind ebenfalls eingeschlossen.
Ein Protein der Erfindung, das als sensibilisierendes Antigen zur Gewinnung von Antikörpern verwendet wird, wird durch die Tierart, von der es abstammt, nicht beschränkt, ist. jedoch vorzugsweise ein Protein, das von Säugern, zum Beispiel Menschen, Mäusen, oder Ratten, besonders bevorzugt vom Menschen, abstammt. Protein menschlichen Ursprungs kann durch Verwenden der Nucleotidsequenz oder der Aminosäuresequenzen, die hierin offenbart werden, gewonnen werden.
Hierin kann ein intaktes Protein oder sein partielles Peptid als das Antigen für die Immunisierung verwendet werden. Als partielle Peptide der Proteine können zum Beispiel das Amino (N)-terminale Fragment des Proteins und das Carboxy (C)-terminale Fragment bereitgestellt werden. „Antikörper", wie hierin verwendet, bedeutet einen Antikörper, der spezifisch mit dem Protein voller Länger oder Fragmenten des Proteins reagiert.
Ein Gen, das ein Protein der Erfindung oder ein Fragment davon codiert, wird in einen bekannten Expressionsvektor cloniert, und durch Transformieren der Wirtszellen mit dem hierin beschriebenen Vektor wird das gewünschte Protein oder ein Fragment davon unter Verwendung von Standardverfahren von außerhalb oder innerhalb der Wirtszellen gewonnen. Dieses Protein kann als das sensibilisierende Antigen verwendet werden. Auch können Zellen, die das Protein exprimieren, Zelllysate oder ein chemisch synthetisiertes Protein der Erfindung als sensibilisierendes Antigen verwendet werden.
Der Säuger, der durch das sensibilisierende Antigen immunisiert wird, ist nicht beschränkt; es wird jedoch bevorzugt, Tiere durch Betrachten der Kompatibilität mit den parentalen Zellen, die bei der Zellfusion verwendet werden, auszuwählen. Im Allgemeinen werden Tiere, die zu den Rodentia, Lagomorpha und Primaten gehören, verwendet.
Beispiele für Tiere, die zu den Rodentia gehören, die verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Mäuse, Ratten, Hamster und Ähnliche. Beispiele für Tiere, die zu den Lagomorpha gehören, die verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Kaninchen. Beispiele für Tiere, die zu den Primaten gehören, die verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Affen. Beispiele für Affen, die verwendet werden sollen, umfassen die Unterordnung Catarrhini (Altweltaffen), zum Beispiel Macaca fascicularis, Rhesusaffen, Mantelpaviane, Schimpansen und Ähnliche.
Wohlbekannte Verfahren können verwendet werden, um Tiere mit dem sensibilisierenden Antigen zu immunisieren. Das sensibilisierende Antigen wird zum Beispiel intraperitoneal oder subcutan in Säuger injiziert. Genauer wird das sensibilisierende Antigen auf geeignete Weise verdünnt und in physiologischer Kochsalzlösung, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und so weiter suspendiert und, wenn erwünscht, mit einer geeigneten Menge an allgemeinem Adjuvans, zum Beispiel mit vollständigem Freundschem Adjuvans, gemischt. Dann wird die Lösung emulgiert und in den Säuger injiziert. Danach wird das sensibilisierende Antigen, das mit unvollständigem Freundschem Adjuvans auf geeignete Weise vermischt wird, vorzugsweise mehrmals alle 4 bis 21 Tage gegeben. Bei der Immunisierung eines Tieres mit dem sensibilisierenden Antigen kann auch ein geeigneter Träger verwendet werden. Nach der Immunisierung wird der Anstieg des Werts an Serum-Antikörper durch übliche Verfahren nachgewiesen.
Polyclonale Antikörper gegen die Proteine der vorliegenden Erfindung können wie folgt hergestellt werden. Nach der Überprüfung, dass der gewünschte Serum- Antikörperwert erreicht ist, wird Blut von dem Säuger, der mit dem Antigen sensibilisiert wurde, genommen. Von diesem Blut wird Serum unter Verwendung herkömmlicher Verfahren isoliert. Das Serum, das den polyclonalen Antikörper enthält, kann als der polyclonale Antikörper verwendet werden, oder die den polyclonalen Antikörper enthaltende Fraktion kann gemäß den Bedürfnissen weiter von dem Serum isoliert werden. Es kann zum Beispiel eine Fraktion von Antikörpern, die das Protein der Erfindung spezifisch erkennen, durch Verwendung einer Affinitäts-Säule, an die das Protein gekoppelt ist, hergestellt werden. Dann kann die Fraktion durch Verwenden einer Protein A- oder Protein G-Säule weiter gereinigt werden, um Immunglobulin G oder M herzustellen.
Um nach der Überprüfung, dass der gewünschte Serum-Antikörperwert in dem Säuger, der mit dem vorstehend beschriebenen Antigen sensibilisiert wurde, erreicht wurde, monoclonale Antikörper zu erhalten, werden Immunzellen von dem Säuger genommen und für die Zellfusion verwendet. Für diesen Zweck können Splenocyten als bevorzugte Immunzellen erwähnt werden. Als parentale Zellen, die mit den vorstehenden Immunzellen fusioniert werden, werden bevorzugt Säuger-Myelomzellen verwendet. Stärker bevorzugt werden Myelomzellen, die das Merkmal erworben haben, das verwendet werden kann, um Fusionszellen durch Agenzien zu unterscheiden, als parentale Zellen verwendet.
Die Zellfusion zwischen den vorstehenden Immunzellen und Myelomzellen kann gemäß bekannten Verfahren, zum Beispiel dem Verfahren von Milstein et al. (Galfre, G. und Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3–46) durchgeführt werden.
Das Hybridom, das durch die Zellfusion erhalten wurde, wird durch Züchten der Zellen in einem Standard-Selektionsmedium, zum Beispiel HAT-Kulturmedium (Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält) selektiert. Die Züchtung in diesem HAT-Medium wird über einen Zeitraum fortgeführt, der ausreicht, dass andere Zellen (nicht-Fusionszellen) als das Ziel-Hybridom umkommen, üblicherweise wenige Tage bis einige Wochen. Dann wird das übliche beschränkende Verdünnungsverfahren durchgeführt, und es wird auf das Hybridom, das den Ziel-Antikörper herstellt, durchmustert und dieses wird cloniert.
Ein Hybridom, das die menschlichen Ziel-Antikörper herstellt, die die Aktivität haben, an Proteine zu binden, kann durch andere als das vorstehende Verfahren zum Erhalt von Hybridomen durch Immunisieren eines anderen Tiers als des Menschen mit dem Antigen erhalten werden, und zwar durch das Verfahren, menschliche Lymphocyten, zum Beispiel menschliche Lymphocyten, die mit dem EB-Virus infiziert sind, mit Proteinen, Protein exprimierenden Zellen oder Lysaten davon in vitro zu sensibilisieren und die sensibilisierten Lymphocyten mit Myelomzellen zu fusionieren, die vom Menschen abstammen, zum Beispiel U266, und die eine permanente Zellteilungs-Aktivität haben (Ungeprüfte Veröffentlichte Japanische Patentanmeldung (JP-A) Nr. Sho 63-17688).
Die monoclonalen Antikörper, die durch Transplantieren der erhaltenen Hybridome in die Bauchhöhle einer Maus und Extrahieren von Aszites erhalten werden, können zum Beispiel durch Ammoniumsulfat-Präzipitation, Protein A- oder Protein G-Säule, DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie, eine Affinitätssäule, an die das Protein der vorliegenden Erfindung gekoppelt ist, und so weiter gereinigt werden. Ein Antikörper der vorliegenden Erfindung kann für die Reinigung oder den Nachweis eines Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Er kann ebenfalls ein Kandidat für einen Agonist oder Antagonist eines Proteins der vorliegenden Erfindung sein. Des Weiteren ist es möglich, ihn bei der Antikörper-Behandlung für Krankheiten zu verwenden, bei denen das Protein beteiligt ist. Zur Verabreichung an den menschlichen Körper (Antikörper-Behandlung) werden auf Grund ihrer verringerten Immunogenität bevorzugt menschliche Antikörper oder humanisierte Antikörper verwendet.
Ein menschlicher Antikörper gegen ein Protein kann zum Beispiel unter Verwendung von Hybridomen erhalten werden, die durch Fusionieren von Myelomzellen mit Antikörper herstellenden Zellen hergestellt werden, die durch Immunisieren eines transgenen Tieres, das ein Repertoire an menschlichen Antikörpergenen umfasst, mit einem Antigen wie Protein, Protein exprimierenden Zellen oder Lysaten davon erhalten werden (vgl. WO 03918, WO 93-2227, WO 94-02602, WO 94-25585, WO 96-33735 und WO 96-34096).
Anders als durch Herstellen von Antikörpern unter Verwendung von Hybridomen können auch Antikörper produzierende Lymphocyten wie sensibilisierte Lymphocyten, die durch Onkogene immortalisiert sind, verwendet werden.
Solche monoclonalen Antikörper können auch als rekombinante Antikörper, die durch Verwendung des gentechnologischen Verfahrens hergestellt werden, erhalten werden (vgl. zum Beispiel, Borrebaeck C. A. K. und Larrick, J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, veröffentlicht im Vereinigten Königreich durch MACMILLAN PUBLISHERS LTD (1990)). Rekombinante Antikörper werden durch Clonieren der codierenden DNA von Immunzellen wie Hybridome oder Antikörper produzierende sensibilisierte Lymphocyten, durch Einschluss in einen geeigneten Vektor und Einführen dieses Vektors in einen Wirt zur Herstellung des Antikörpers produziert. Die vorliegende Erfindung umfasst solche rekombinanten Antikörper ebenfalls.
Darüber hinaus kann der Antikörper der vorliegenden Erfindung ein Antikörperfragment oder ein modifizierter Antikörper sein, solange er an ein Protein der Erfindung bindet. Zum Beispiel können Fab, F (ab')₂, Fv oder einzelkettiges Fv (scFv), in dem die H-Kette Fv und die L-Kette Fv auf geeignete Weise durch einen Linker verbunden sind (Huston J. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883 (1988) als Antikörper bereitgestellt werden. Genauer werden Antikörperfragmente durch Behandeln von Antikörpern mit Enzymen, zum Beispiel Papain oder Pepsin, erzeugt. Alternativ können sie durch Konstruieren eines Gens, das ein Antikörperfragment codiert, Einführen desselben in einen Expressionsvektor und Exprimieren dieses Vektors in geeignete Wirtszellen erzeugt werden (vgl. zum Beispiel, Co M. S. et al. J. Immunol. (1994) 152, 2968–2976; Better M. und Horwitz A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476–496; Pluckthun, A. und Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497–515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652–663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663–669; Bird, R. E. und Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132–137).
Als modifizierte Antikörper können Antikörper, die an verschiedene Moleküle gebunden sind, wie Polyethylenglycol (PEG) verwendet werden. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung umfassen solche modifizierten Antikörper ebenfalls. Um einen solchen modifizierten Antikörper zu erhalten, werden chemische Modifikationen an dem erhaltenen Antikörper ausgeübt. Diese Verfahren sind bereits etabliert und auf dem Fachgebiet üblich.
Unter Verwendung herkömmlicher Verfahren kann ein Antikörper der vorliegenden Erfindung als chimärer Antikörper, umfassend eine von einem nicht-menschlichen Antikörper abgeleitete variable Region und eine von einem menschlichen Antikörper abgeleitete konstante Region, oder als humanisierter Antikörper erhalten werden, umfassend eine von einem nicht-menschlichen Antikörper abgeleitete Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR), eine von einem menschlichen Antikörper abgeleitete Gerüst-Region (FR) und eine von einem menschlichen Antikörper abgeleitete konstante Region.
So erhaltene Antikörper können zur Uniformität gereinigt werden. Die Trennungs- und Reinigungsverfahren, die in der vorliegenden Erfindung zu Trennung und Reinigung des Antikörpers verwendet werden, können jedes Verfahren sein, das üblicherweise für Proteine verwendet wird. Zum Beispiel können Säulenchromatographie wie Affinitätschromatographie, Filtration, Ultrafiltration, Aussalzen, Dialyse, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung und Andere passend ausgewählt und kombiniert werden, um die Antikörper zu isolieren und zu reinigen (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow und David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988); die Erfindung ist darauf jedoch nicht beschränkt. Die Antikörper-Konzentration des vorstehend erwähnten Antikörpers kann durch Messen der Absorption, oder durch den enzymverbundenen Immunsorptionstest (ELISA) etc. getestet werden.
Die Protein A- oder Protein G-Säule kann für die Aftinitätschromatographie verwendet werden. Die Protein A-Säule kann zum Beispiel Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) etc. sein.
Andere Chromatographie kann ebenfalls verwendet werden, wie zum Beispiel die Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration, Umkehrphasenchromatographie und Adsorptions-Chromatographie (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Hrsg. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Diese können auf Flüssigphasen-Chromatographie wie HPLC, FPLC und so weiter durchgeführt werden.
Beispiele für Verfahren, die die Antigen bindende Aktivität der Antikörper der Erfindung testen, umfassen zum Beispiel die Absorptionsmessung, die enzymverbundene Immunsorptionsbestimmung (ELISA), den Enzym-Immuntest (EIA), den Radioimmuntest (RIA) und/oder die Immunfluoreszenz. Zum Beispiel wird bei der Verwendung von ELISA ein Protein der Erfindung einer Platte, die mit den Antikörpern der vorliegenden Erfindung beschichtet ist, zugesetzt, und dann wird die Ziel-Antikörperprobe, zum Beispiel Kulturüberstände Antikörper produzierender Zellen oder gereinigte Antikörper, zugesetzt. Dann wird sekundärer Antikörper, der den primären Antikörper erkennt und der durch alkalische Phosphatase und solche Enzyme markiert ist, zugesetzt, die Platte wird inkubiert und gewaschen und die Absorption wird, um die Antigen bindende Aktivität zu bestimmen nach Zusetzen eines Enzymsubstrats wie p-Nitrophenyl-Phosphat gemessen. Als das Protein kann ein Proteinfragment, zum Beispiel ein Fragment, das einen C-Terminus umfasst, oder ein Fragment, das einen N-Terminus umfasst, verwendet werden. Um die Aktivität des Antikörpers der Erfindung zu bestimmen, kann BIAcore (Pharmacia) verwendet werden.
Durch Verwendung dieser Verfahren werden der Antikörper der Erfindung und eine Probe, von der man annimmt, dass sie ein Protein der Erfindung enthält, in Kontakt gebracht, und das Protein der Erfindung wird durch Nachweisen oder Testen des Immunkomplexes, der zwischen dem vorstehend erwähnten Antikörper und dem Protein gebildet wird, nachgewiesen oder getestet.
Ein Verfahren zum Nachweis oder Testen eines Proteins der Erfindung unter Verwendung von Proteinen ist in verschiedenen Versuchen nützlich, da es die Proteine spezifisch nachweisen oder testen kann.
Ein anderes Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Antisense-Polynucleotids, das zu einer DNA, die mindestens 15 Nucleotide von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, oder 9 umfasst, komplementär ist.
Hierin wird der Begriff „komplementärer Strang" als ein Strang eines doppelsträngigen Polynucleotids, das aus A:T- und G:C-Basenpaaren zusammengesetzt ist, zu dem anderen Strang definiert. Auch wird „komplementär" so definiert, dass die Stränge nicht nur perfekt innerhalb einer fortlaufenden Region von mindestens 15 Nucleotiden zusammen passen, sondern dass sie auch innerhalb dieser Region eine Homologie von mindestens 70%, vorzugsweise 80%, stärker bevorzugt 90% und am stärksten bevorzugt 95% oder mehr haben. Die Homologie kann unter Verwendung des hierin beschriebenen Algorithmus bestimmt werden.
Sonden und Primer für den Nachweis oder die Amplifikation der DNA, die ein Protein der Erfindung codiert, oder ein Nucleotid oder ein Nucleotid-Derivat für die Suppression der Protein-Expression (wie Antisense-Oligonucleotid und Ribozym) werden in diese Polynucleotide eingeschlossen. Solche Polynucleotide können auch für die Herstellung von DNA-Chips verwendet werden.
Die Antisense-Oligonucleotide, die mit einem Abschnitt der Nucleotid-Sequenzen von einem von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 und 9 hybridisieren, sind auch in die Antisense-Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Diese Antisense-Oligonucleotide sind bevorzugt gegen eine Sequenz gerichtet, die mindestens 15 fortlaufende Nucleotide enthält, die in einer der Nucleotid-Sequenzen von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 und 9 enthalten sind. Stärker bevorzugt ist es das Antisense-Oligonucleotid gegen mindestens 15 fortlaufende Nucleotide, die ein Translations-Startcodon enthalten.
Derivate oder modifizierte Produkte aus Antisense-Oligonucleotiden können als Antisense-Oligonucleotide verwendet werden. Beispiele für solche modifizierten Produkte umfassen zum Beispiel Niederalkylphosphonat-Modifikationen wie den Methylphosphonat-Typ oder den Ethylphosphonat-Typ; Phosphorthioat-Modifikationen; Phosphoramidat-Modifikationen und Ähnliche.
Der Begriff „Antisense-Oligonucleotide", wie hierin verwendet, bedeutet nicht nur die, in denen die Nucleotide, die zu denen, die eine spezifizierte Region einer DNA oder einer mRNA bilden, vollständig komplementär sind, sondern auch die, die an einem oder mehreren Nucleotiden nicht passen, solange die DNA oder mRNA und das Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 spezifisch hybridisieren können.
Die Antisense-Oligonucleotid-Derivate der vorliegenden Erfindung wirken auf Zellen, die ein Protein der Erfindung herstellen, durch Binden an die DNA oder RNA, die das Protein codiert, um seine Transkription oder Translation zu hemmen und um den Abbau der mRNA zu fördern, und haben die Wirkung, dass sie die Funktion des Proteins der Erfindung durch Unterdrücken der Expression des Proteins unterdrücken.
Ein Antisense-Oligonucleotid-Derivat der vorliegenden Erfindung kann durch Vermischen mit einem geeigneten Basen-Material, das gegen die Derivate inaktiv ist, in eine externe Herstellung wie ein Liniment oder einen Umschlag hergestellt werden.
Auch können die Derivate durch Zusetzen von Excipienten, isotonischen Mitteln, solubilisierenden Mitteln, Stabilisatoren, Konservierungsstoff, Schmerzmitteln und Ähnlichen wie benötigt in Tabletten, Puder, Granula, Kapseln, Liposomenkapseln, Injektionen, Lösungen, Nasentropfen, gefriergetrocknete Mittel und Ähnliche formuliert werden. Diese können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren hergestellt werden.
Ein Antisense-Oligonucleotid-Derivat wird an den Patienten durch direkte Verabreichung an die kranke Stelle, durch Injektion in das Blutgefäß und Ähnliches gegeben, so dass es die kranke Stelle erreicht. Ein Antisense-Fixierungs-Medium kann auch verwendet werden, um die Dauerhaftigkeit und die Membran-Permeabilität zu erhöhen. Beispiele sind Liposom, poly-L-Lysin, Lipid, Cholesterin, Lipofectin oder Derivate von ihnen.
Die Dosierung des Antisense-Oligonucleotid-Derivats der vorliegenden Erfindung kann auf geeignete Weise dem Zustand des Patienten entsprechend angeglichen und in gewünschten Mengen verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Dosierungsbereich von 0,1 bis 100 mg/kg, vorzugsweise 0,1 bis 50 mg/kg verabreicht werden.
Das Antisense-Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung ist bei der Hemmung der Expression des Proteins der Erfindung von Nutzen und ist deshalb bei der Unterdrückung der biologischen Aktivität der Proteine der Erfindung von Nutzen. Auch sind Expressionshemmstoffe, umfassend das Antisense-Oligonucleotid der Erfindung, auf Grund ihrer Fähigkeit, die biologische Aktivität der Proteine der Erfindung zu unterdrücken, von Nutzen.
Proteine dieser Erfindung sind beim Durchmustern nach Verbindungen, die an das Protein binden, von Nutzen. Das heißt, die Proteine werden in einem Durchmusterungs-Verfahren nach Verbindungen, die an die Proteine dieser Erfindung binden, verwendet, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Proteine dieser Erfindung mit einer Testprobe, von der man annimmt, dass sie eine Verbindung enthält, die an die Proteine binden kann, und Auswählen der Verbindung mit der Aktivität, an die Proteine der Erfindung zu binden, umfasst.
Proteine dieser Erfindung zur Verwendung beim Durchmustern der Erfindung können rekombinante, natürliche oder partielle Peptide sein. Auch können sie in der Form von Proteinen, die auf der Zelloberfläche oder auf Membranfraktionen exprimiert werden, vorliegen. Testproben zur Verwendung in dem Durchmusterungs-Verfahren der vorliegenden Erfindung sind nicht beschränkt, können jedoch zum Beispiel Zellextrakte, Zellkultur-Überstände, mikrobielle Fermentationsprodukte, Extrakte von Meeresorganismen, Pflanzenextrakte, gereinigte oder teilweise gereinigte Proteine, Peptide, nicht-Peptid-Verbindungen, synthetische niedermolekulare Verbindungen oder natürliche Verbindungen sein. Die Proteine dieser Erfindung können als gereinigtes Protein oder lösliche Proteine, in einer an einen Träger gebundenen Form, als Fusionsproteine mit einem anderen Protein, in einer an einen Träger gebundenen Form, als Fusionsproteine mit einem anderen Protein, in einer Form, die auf der Zelloberfläche exprimiert wird, oder als Membranfraktionen der Probe ausgesetzt werden.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung verschiedener Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, zum Durchmustern nach anderen Proteinen, die an das Zielprotein binden (wie Liganden), verwendet werden. Diese Durchmusterungsverfahren können zum Beispiel durch das Immunpräzipitationsverfahren durchgeführt werden. Genauer kann das Verfahren wie folgt durchgeführt werden. Das Gen, das ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, wird durch Insertion des Gens in einen Expressionsvektor für fremde Genexpression wie pSV2neo, pcDNA I, pCD8 und Ähnliche und Expression des Gens in Tierzellen etc. exprimiert. Alle allgemein verwendeten Promotoren können für die Expression verwendet werden, einschließlich des frühen SV40-Promotors (Rigby in Williamson (Hrsg.), Genetic engineering. Bd. 3. Academic Press, London, S. 83–141 (1982)), des EF-1α-Promotors (Kim et al., Gene 91, S. 217–223 (1990)), des CAG-Promotors (Niwa et al., Gene 108, S. 193–200 (1991)), des RSV-LTR-Promotors (Cullen Methods in Enzymology 152, S. 684–704 (1987)), des SRα-Promotors (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8, S. 466 (1988), des sehr frühen CMV Promotors (Seed und Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, S. 3365–3369 (1987)), des späten SV40-Promotors (Gheysen und Fiers, J. Mol. Appl. Genet. 1, S. 385–394 (1982)), des späten Adenovirus-Promotors (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 9, S. 946 (1989)), des HSV-TK-Promotors und so weiter.
Der Transfer eines fremden Gens in Tierzellen für ihre Expression kann durch jedes der folgenden Verfahren durchgeführt werden, einschließlich des Elektroporations-Verfahrens (Chu, G. et al. Nucl. Acids Res. 15, 1311–1326 (1987)), des Calcium-Phosphat-Verfahrens (Chen, C und Okayama, H. Mol Cell. Biol. 7, 2745–2752 (1987)), des DEAE-Dextran-Verfahrens (Lopata, M. A. et al., Nucl. Acids Res. 12, 5707–5717 (1984); Sussman, D. J. und Milman, G., Mol. Cell. Biol. 4, 1642–1643 (1985)), des Lipofectin-Verfahrens (Derijard, B., Cell 7, 1025–1037 (1994); Lamb, B. T. et al., Nature Genetics 5, 22–30 (1993); Rabindran, S. K. et al., Science 259, 230–234 (1993) und Ähnliche. Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann durch Einführen einer Erkennungsstelle (Epitop) für einen monoclonalen Antikörper, dessen Spezifität festgelegt wurde, in den N- oder C-Terminus des Proteins der vorliegenden Erfindung als ein Fusionsprotein, das die Erkennungsstelle (Epitop) für einen monoclonalen Antikörper hat, exprimiert werden. Für diesen Zweck kann ein im Handel erhältliches Epitop-Antikörper-System verwendet werden (Experimental Medicine 13, 85–90 (1995)). Vektoren, die in der Lage sind, Fusionsproteine mit β-Galactosidase, Maltose bindendem Protein, Glutathion S-Transferase, grünem Fluoreszenzprotein (GFP) und Ähnlichem über die Multi-Clonierungsstelle zu exprimieren, sind im Handel erhältlich.
Um die Veränderung der Eigenschaften eines Proteins dieser Erfindung zu minimieren, die aus der Bildung in ein Fusionsprotein herrührt, kann ein Fusionsprotein durch Einführen eines nur kleinen Epitop-Abschnitts, umfassend mehrere bis zehn Aminosäuren, wie in der Literatur berichtet, hergestellt werden. Zum Beispiel können die Epitope von Polyhistidin (His-tag), Influenza-Aggregat-HA, menschlichem c-myc, FLAG, Vesikuläres Stomatitisvirus-Glycoprotein (VSV-GP), T7-Gen 10-Protein (T7-Markierung), menschliches Herpes simplex-Virus-Glycoprotein (HSV-Markierung), E-Markierung (Epitop auf dem monoclonalen Phagen) und Ähnlichem, und monoclonale Antikörper zur Erkennung dieser Epitope als das Epitop-Antikörper-System zum Durchmustern von Proteinen, die an das Protein der vorliegenden Erfindung binden, verwendet werden (Experimental Medicine 13, 85–90 (1995)).
Bei der Immunpräzipitation werden Immunkomplexe durch Zusetzen dieser Antikörper zu Zelllysat, das unter Verwendung geeigneter Detergentien hergestellt wurde, gebildet. Dieser Immunkomplex besteht aus einem Protein der vorliegenden Erfindung, einem Protein, das in der Lage ist, an das Protein zu binden, und einem Antikörper. Die Immunpräzipitation kann neben Antikörpern gegen die vorstehenden Epitope auch unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein Protein der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. Ein Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel durch Insertion eines Gens, das ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, in einen geeigneten E. coli-Expressionsvektor, um das Gen in E. coli zu exprimieren, Reinigen des exprimierten Proteins und Immunisieren von Kaninchen, Mäusen, Ratten, Ziegen, Hühnern und Ähnlichen mit dem gereinigten Protein hergestellt werden. Der Antikörper kann auch durch Immunisieren der vorstehend beschriebenen Tiere mit Peptiden, die Teil des Proteins der vorliegenden Erfindung sind, hergestellt werden.
Immunkomplexe können zum Beispiel unter Verwendung von Protein A-Sepharose oder, wenn der Antikörper ein Mäuse-IgG-Antikörper ist, von Protein G-Sepharose, präzipitiert werden. Zusätzlich kann der Immunkomplex in dem Fall, dass das Protein der vorliegenden Erfindung als Fusionsprotein mit dem Epitop von zum Beispiel GST und Ähnlichem hergestellt wird, unter Verwendung einer Substanz gebildet werden, die spezifisch an diese Epitope bindet, wie Glutathion-Sepharose 4B und Ähnliche, was dasselbe Ergebnis ergibt wie in dem Fall, dass der Antikörper für das Protein der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Immunpräzipitation kann im Allgemeinen nach oder gemäß zum Beispiel dem Verfahren, das in der Literatur beschrieben wird, durchgeführt werden (Harlow, E. und Lane, D.: Antibodies S. 511–552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)).
SDS-PAGE wird im Allgemeinen zur Analyse immunpräzipitierter Proteine verwendet, und gebundene Proteine können unter Verwendung eines Gels mit geeigneter Konzentration basierend auf dem Molekulargewicht von Proteinen analysiert werden. In diesem Fall kann die Nachweisempfindlichkeit durch Züchten von Zellen in einem Kulturmedium, das mit Radioisotop markiertes ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein enthält, um Proteine innerhalb der Zellen zu markieren, und Nachweis der markierten Proteine verbessert werden, obwohl Proteine, die an ein Protein der vorliegenden Erfindung gebunden sind, im Allgemeinen durch die üblichen Protein färbenden Verfahren wie Coomassie-Färbung und Silberfärbung schwer nachzuweisen sind. Ist das Molekulargewicht des Proteins bestimmt, kann das gewünschte Protein direkt von einem SDS-Polyacrylamid-Gel gereinigt und sequenziert werden.
Zusätzlich kann die Isolierung von Proteinen, die an ein Protein der vorliegenden Erfindung binden, auch unter Verwendung von zum Beispiel der West-Western-Blot-Analyse durchgeführt werden (Skolnik, E. Y. et al., Cell (1991) 65, 83–90). Genauer wird eine cDNA-Bank aus Zellen, Geweben und Organen, in welchen erwartungsgemäss die Proteinbindung an das Protein dieser Erfindung exprimiert wird unter Verwendung von Phagen-Vektoren (wie λgt11 und ZAP) hergestellt, Proteine, die auf LB-Agarose exprimiert werden, werden auf einem Filter fixiert, der dann mit einem gereinigten und markierten Protein der vorliegenden Erfindung zur Reaktion gebracht wird, und Plaques, die Proteine exprimieren, die an das Protein der vorliegenden Erfindung binden, werden durch die Markierung nachgewiesen. Verfahren zur Markierung eines Proteins der Erfindung umfassen Verfahren, die die Bindung von Biotin und Avidin nutzen, Verfahren, die Antikörper, die spezifisch an das Protein der vorliegenden Erfindung binden, oder Peptide oder Polypeptide (zum Beispiel GST, etc.), die mit dem Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert sind, nutzen Verfahren, die Radioisotope und Fluoreszenz verwenden und Ähnliches.
Des Weiteren wird eine andere Ausführungsform des Durchmusterungsverfahrens der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren beispielhaft dargestellt, bei dem das Zwei-Hybridsystem unter Verwendung von Zellen verwendet wird (Fields, S., und Sternglanz, R., Trends Genet. 10, 286–292 (1994); Dalton S., und Treisman R. (1992) „Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element." Cell 68, 597–612; "MATCHMAKER Two-Hybrid System", "Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER One-Hybrid System" (alle von Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene)). Bei dem Zwei-Hybridsystem kann ein Protein dieser Erfindung mit der DNA-bindenden Domäne von SRF oder GAL4 fusioniert und in Hefezellen exprimiert werden. Eine cDNA-Bank wird aus Zellen hergestellt, von denen angenommen wird, dass sie Proteine exprimieren, die an das Protein dieser Erfindung binden, wobei die cDNA-Bank auf eine Weise konstruiert ist, dass die Proteine als Fusionsproteine mit Transkriptions-Aktivierungsregionen von VP16 oder GAL4 exprimiert werden. Die cDNA-Bank wird in die vorstehend erwähnten Hefezellen transfiziert, und dann werden positive Clone nachgewiesen, um die cDNA, die von der Bank abstammt, zu isolieren (d.h. Expression eines Proteins in der Hefezelle, das an das Protein der Erfindung bindet, führt zur Bindung der beiden Proteine und ergibt die Aktivierung des Reportergens, das den Nachweis positiver Clone zulässt). Das Protein, das durch die isolierte cDNA codiert wird, kann durch Einführen der cDNA in E. coli und Exprimieren derselben darin erhalten werden. Somit ist es möglich, Proteine, die an ein Protein dieser Erfindung binden, und Gene herzustellen, die sie codieren. Das Reportergen, das in dem Zwei-Hybrid-Verfahren verwendet werden soll, kann jedes geeignete Gen wie das HIS3-Gen, das Ade2-Gen, das LacZ-Gen, das CAT-Gen, das Luciferase-Gen oder das Plasminogen Aktivator-Inhibitor-Typ 1 (PAT-1)-Gen, sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Das Durchmustern nach Verbindungen, die an ein Protein der vorliegenden Erfindung binden, kann auch unter Verwendung von Affinitäts-Chromatographie durchgeführt werden. Ein Protein der Erfindung wird zum Beispiel auf einem Träger in der Affinitäts-Chromatographie-Säule immobilisiert, auf die eine Testprobe, von der angenommen wird, dass sie ein Protein exprimiert, das an das Protein der Erfindung bindet, aufgetragen wird. Proben können zum Beispiel Zellextrakte, Zelllysate etc. sein. Nach Laden der Testprobe wird die Säule gewaschen, und Proteine, die an das Protein der Erfindung binden, können erhalten werden.
Das erhaltene Protein kann auf seine Aminosäuresequenz hin analysiert werden, um Oligonucleotid-Sonden zu synthetisieren, die dann verwendet werden können, um eine cDNA-Bank zu durchmustern, um eine DNA zu erhalten, die das Protein codiert.
Ein Biosensor, der das Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Phänomen verwendet, kann verwendet werden, um die gebundene Verbindung nachzuweisen oder zu messen. Solche Biosensoren (zum Beispiel BIAcore (Pharmacia)) können unter Verwendung einer kleinen Menge an Protein ohne Notwendigkeit einer Markierung die Beobachtung der Interaktion in Echtzeit ermöglichen. Somit ist es möglich, die Interaktion zwischen dem Protein der Erfindung und Test-Verbindungen unter Verwendung von Biosensoren wie BIAcore festzustellen.
Darüber hinaus können Verbindungen, die an ein Protein der Erfindung (einschließlich Agonisten und Antagonisten) binden, wobei die Verbindungen nicht immer Proteine sind, unter Verwendung verschiedener Verfahren isoliert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Das Protein der Erfindung kann zum Beispiel fixiert und synthetischen Verbindungen, einer Reihe von natürlichen Stoffen oder einer Zufall-Phagenpeptid-Display-Bank ausgesetzt werden, um nach Molekülen zu durchmustern, die an das Protein binden. Alternativ kann ein Durchmustern mit hohem Durchlauf unter Verwendung von kombinatorischen Chemieverfahren durchgeführt werden (Wrighton NC; Farrel FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barret RW; Jolliffe LK; Dower WJ, „Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin", Science (Vereinigte Staaten) 26. Jul., 1996, 273 S. 458–64; Verdine GL., „The combinatorial chemistry of nature." Nature (ENGLAND) 7. Nov. 1996, 384, S. 11–13; Hogan JC Jr., „Directed combinatorial chemistry." Nature (ENGLAND) 7. Nov. 1996, 384, S17-9).
Das Durchmustern eines Liganden, der an ein Protein der Erfindung bindet, kann wie folgt durchgeführt werden. Die extrazelluläre Domäne eines Proteins der Erfindung wird an die intrazelluläre Domäne einschließlich der transmembranen Domäne eines Hämopoietin-Rezeptorproteins, der eine bekannte signalübertragende Fähigkeit hat, zur Herstellung eines chimären Rezeptors fusioniert. Der chimäre Rezeptor kann auf der Zelloberfläche einer geeigneten Zelllinie, vorzugsweise einer Zelllinie, die nur in Gegenwart eines geeigneten proliferativen Wachstumsfaktors (Wachstumsfaktor abhängige Zelllinie) überleben und sich vermehren kann, exprimiert werden. Dann kann die Zelllinie in Medium gezüchtet werden, das mit einem Probenmaterial ergänzt ist, in dem verschiedene Wachstumsfaktoren, Cytokine oder hämopoetische Faktoren exprimiert werden könnten. Gemäß diesem Verfahren kann die vom Wachstumsfaktor abhängige Zelllinie nur überleben und sich vermehren, wenn die Probe einen geeigneten Liganden enthält, der spezifisch an die extrazelluläre Domäne des Proteins der Erfindung bindet. Die bekannten Hämopoietin-Rezeptoren wie der Thrombopoietin-Rezeptor, der Erythropoietin-Rezeptor, der G-CSF-Rezeptor, gp130 und so weiter können verwendet werden. Der Partner zur Konstruktion eines chimären Rezeptors für das Durchmusterungssystem der Erfindung ist nicht auf die vorstehenden Rezeptoren beschränkt, solange seine intrazelluläre Domäne eine Struktur bereitstellt, die für die Signal-Übertragungs-Aktivität notwendig ist. Die Wachstumsfaktor-abhängigen Zelllinien können zum Beispiel IL-3-abhängige Zelllinien wie BaF3 oder FDC-P1 sein.
In einem seltenen Fall kann der Ligand, der spezifisch an ein Protein der Erfindung bindet, kein lösliches Protein, sondern ein membrangebundenes Protein sein. In diesem Fall kann ein Durchmustern unter Verwendung eines Proteins, das nur die extrazelluläre Domäne des Proteins der Erfindung umfasst, oder eines Fusionsproteins, in dem die extrazelluläre Domäne an einen Teil anderer löslicher Proteine angeheftet ist, durchgeführt werden. Solche Proteine werden markiert, bevor sie zum Messen der Bindung mit den Zellen verwendet werden, von denen erwartet wird, dass sie den Liganden exprimieren. Das erste Protein, das nur die extrazelluläre Domäne umfasst, kann ein lösliches Rezeptorprotein, das durch Einführen eines Stop-Codons in die N-terminale Seite der transmembranen Domäne künstlich hergestellt ist, oder ein lösliches Protein wie NR12-1 sein. Das letztere Fusionsprotein kann ein Protein sein, in dem die Fc-Region von Immunglobulin oder FLAG-Peptid an den C-Terminus der extrazellulären Domäne angeheftet ist. Diese markierten löslichen Proteine können auch beim Nachweis durch das vorstehend beschriebene West-Western-Blot-Verfahren von Nutzen sein.
Ein chimäres Protein der extrazellulären Domäne eines Proteins dieser Erfindung und der Fc-Region eines Antikörpers (wie menschlichem IgG-Antikörper) kann unter Verwendung von Protein A-Säule etc. gereinigt werden. Ein solches Antikörper-ähnliches, chimäres Protein behält seine Liganden-bindende Aktivität bei. Somit kann das Protein mit einem Isotop und so weiter passend markiert und für das Durchmustern eines Liganden verwendet werden (Suda, T. et al., Cell, 175, 1169–1178 (1993)). Einige Cytokine wie Moleküle der TNF-Familie liegen vor allem in einer membrangebundenen Form vor, somit können solche Liganden durch Exponieren des Antikörper-ähnlichen, chimären Proteins gegen verschiedene Zellen und Auswählen der Zellen basierend auf der Bindungsaktivität an das Protein isoliert werden. Alternativ können Liganden gemäß demselben Verfahren durch Verwenden von Zellen, in die eine cDNA-Bank eingeführt ist, isoliert werden. Des Weiteren kann das Antikörper-ähnliche, chimäre Protein auch als ein Antagonist verwendet werden.
Die Verbindung, die durch die vorstehende Durchmusterung isoliert wurde, kann ein Kandidat für Wirkstoffe sein, die die Aktivität eines Proteins dieser Erfindung aktivieren oder hemmen. Es ist möglich, solche Verbindungen für die Behandlung der Krankheit anzuwenden, die aus anomaler Expression oder funktioneller Störung eines Proteins der vorliegenden Erfindung entsteht. Die Verbindung, die unter Verwendung des Durchmusterungs-Verfahrens der Erfindung erhalten wird, umfasst Verbindungen, die aus der Modifikation der Verbindung, die die Aktivität hat, an das Protein der Erfindung zu binden, durch Zusetzen, Deletion und/oder Ersetzen eines Teils der Struktur entstehen.
Verwendet man die isolierte Verbindung oder ein Protein der vorliegenden Erfindung (Köder, (lösliche Form)) als Pharmazeutikum für Menschen und andere Säuger, zum Beispiel Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Hühner, Katzen, Hunde, Schafe, Schweine, Rinder, Affen, Mantelpaviane, Schimpansen, kann die isolierte Verbindung direkt verabreicht werden oder sie kann unter Verwendung bekannter pharmazeutischer Herstellungsverfahren in eine Dosierungsform formuliert werden. Die Pharmazeutika können zum Beispiel nach Bedarf oral, als mit Zucker beschichtete Tabletten, Kapseln, Elixiere und Mikrokapseln oder parenteral, in Form von sterilen Injektionenslösungen, Suspensionen mit Wasser oder jeder anderen pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeit genommen werden. Die Verbindungen können zum Beispiel mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Medium, genauer, sterilisiertem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Pflanzenöl, Emulgatoren, Suspensionsmitteln, grenzflächenaktiven Mitteln, Stabilisatoren, Geschmacksmitteln, Excipienten, Vehikeln, Konservierungsmitteln und Bindemitteln in einer Einheitsdosierungsform, die für die allgemein anerkannte Wirkstoff-Verabreichung benötigt wird, vermischt werden. Die Menge an aktivem Bestandteil in diesen Herstellungen macht eine geeignete Dosierung innerhalb des angezeigten Bereichs notwendig.
Beispiele für Additive, die zu Tabletten und Kapseln vermischt werden können, umfassen: Bindemittel wie Gelatine, Maisstärke, Gummi-Tragant und Gummi arabicum; Excipienten wie kristalline Cellulose; Schwellmittel wie Maisstärke, Gelatine und Alginsäure; Schmiermittel wie Magnesieumstearat; und Süßungsmittel wie Saccharose, Lactose oder Saccharin; Geschmacksmittel wie Pfefferminze, Gaultheria adenothrix -Öl und Kirsche. Wenn die Einheits-Dosierungsform eine Kapsel ist, kann ein flüssiger Träger wie Öl ebenfalls in die vorstehenden Bestandteile eingeschlossen werden. Sterile Zusammensetzungen für Injektionen können nach normaler Wirkstoffrealisierung unter Verwendung von Vehikeln wie destilliertem Wasser, das für Injektionen verwendet wird, formuliert werden.
Zum Beispiel können physiologische Kochsalzlösung, Glucose und andere isotonische Flüssigkeiten, einschließlich Adjuvantien wie D-Sorbit, D-Mannose, D-Mannit und Natriumchlorid, als wässrige Lösungen für Injektionen verwendet werden. Diese können in Verbindung mit geeigneten solubilisierenden Mitteln wie Alkohol, genauer Ethanol, Polyalkoholen wie Propylen-Glycol und Polyethylen-Glycol und nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels wie Polysorbat 80 (TM) und HCO-50 verwendet werden.
Sesamöl oder Sojaöl können als ölhaltige Flüssigkeit verwendet werden und können in Verbindung mit Benzylbenzoat oder Benzylalkohol als solubilisierende Mittel verwendet werden; können mit einem Puffer wie einem Phosphatpuffer und einem Natriumacetat-Puffer formuliert werden; und können in Verbindung mit einem Schmerzmittel wie Procain-Hydrochlorid, einem Stabilisator wie Benzylalkohol und Phenol und einem Anti-Oxidationsmittel verwendet werden. Die hergestellte Injektion wird in eine geeignete Ampulle gefüllt.
Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, können verwendet werden, um das Arzneimittel zum Beispiel als intraarterielle, intravenöse, percutane Injektionen und ebenso als intranasale, transbronchiale, intramuskuläre oder orale Verabreichungen an Patienten zu verabreichen. Die Dosierung variiert entsprechend dem Körpergewicht und Alter des Patienten, dem Verabreichungsverfahren und Ähnlichem, der Fachmann kann sie jedoch auf geeignete Weise auswählen. Wenn die Verbindung durch eine DNA codierbar ist, kann die DNA für die Gentherapie in einen Vektor inseriert werden, um die Therapie durchzuführen. Die Dosierung und das Verfahren der Verabreichung variieren gemäß dem Körpergewicht, Alter und den Symptomen eines Patienten, aber der Fachmann kann sie auf geeignete Weise auswählen.
Zum Beispiel kann die Dosierung des Proteins dieser Erfindung (Köder (lösliche Form)) abhängig vom Individuum, dem es verabreicht wird, Zielorgan, Symptom und Verfahren für die Verabreichung variieren. Es kann jedoch einem normalen Erwachsenen (Körpergewicht 60 kg) in einer Dosis von etwa 100 μg bis 10–20 mg pro Tag injiziert werden.
Obwohl es entsprechend den Symptomen einige Unterschiede gibt, liegt zum Beispiel die Dosis einer Verbindung, die an ein Protein der vorliegenden Erfindung bindet, oder einer Verbindung, die die Aktivität eines Proteins dieser Erfindung hemmt, typischerweise bei etwa 0,1 mg bis etwa 100 mg pro Tag, vorzugsweise bei etwa 1,0 mg bis etwa 50 mg pro Tag und stärker bevorzugt bei etwa 1,0 mg bis etwa 20 mg pro Tag, wenn sie oral einem normalen Erwachsenen (Gewicht 60 kg) verabreicht wird.
Wird das Protein parenteral in Form einer Injektion an einem normalen Erwachsenen (Gewicht 60 kg) verabreicht, ist es, obwohl es entsprechend dem Patienten, Zielorgan, den Symptomen und dem Verfahren der Verabreichung einige Unterschiede gibt, praktisch, eine Dosis von etwa 0,01 mg bis etwa 30 mg pro Tag, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 20 mg pro Tag und stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg pro Tag intravenös zu injizieren. Auch ist es im Fall von anderen Tieren möglich, eine Menge zu verabreichen, die auf 60 kg Körpergewicht oder Oberflächenbereich umgerechnet ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die partielle Nucleotidsequenz von AL109843, die in der htgs-Datenbank identifiziert wurde. Die abgeleitete Aminosäuresequenz wird unter der vorhergesagten Exonsequenz gezeigt. Die YR-Motivsequenz und das WS-Motiv, die als das Ziel verwendet wurden, sind eingerahmt.
2 zeigt partielle Aminosäuresequenzen von NR12, die in der Sequenz von AL109843 gefunden wurden, und jene von bekannten Hämopoietin-Rezeptoren, die dazu eine Homologie haben. Identische Aminosäuresequenzen sind eingerahmt und ähnliche Aminosäuresequenzen sind schattiert. Lücken sind unterstrichen. Bekannte Hämopoietin-Rezeptoren sind von oben menschliches gp130, menschliches NR9, menschlicher Prolactin-Rezeptor, menschlicher IL-7-Rezeptor und menschlicher LIF-Rezeptor.
3 zeigt eine Fotografie, die die Ergebnisse der PCR-Analyse darstellt, und zeigt exprimierte Produkte, amplifiziert durch 5'-RACE und 3'-RACE unter Verwendung der Oligonucleotid-Primer, die gegen das vorhergesagte WS-Exon innerhalb der AL109843-Sequenz hergestellt wurden. Spezifische Produkte aus PCR sind mit Pfeilen gezeigt.
4 zeigt die Nucleotidsequenz der NR12.1-cDNA voller Länge, die durch Kombinieren der 5'-RACE- und 3'-RACE-Produkte erhalten wurde. Die abgeleitete Aminosäuresequenz, die durch NR12.1 codiert wird, ist ebenfalls gezeigt. Die Aminosäuresequenz, von der vorhergesagt wurde, dass sie das Sekretionssignal ist, ist unterstrichen. Konservierte Cysteinreste und die Aminosäuresequenzen des YR-Motivs und des WS-Motivs sind eingerahmt.
5 zeigt die Nucleotidsequenz der NR12.2-cDNA voller Länge, die durch Kombinieren der 5'-RACE- und 3'-RACE-Produkte erhalten wurde. Die Aminosäuresequenz, die durch NR12.2 codiert wird, ist ebenfalls gezeigt. Die vorhergesagte Sekretions-Signalsequenz ist unterstrichen. Die vorhergesagte Transmembran-Region ist schattiert. Konservierte Cysteinreste in der extrazellulären Region und Aminosäuresequenzen des YR-Motivs und des WS-Motivs sind eingerahmt.
6 zeigt die Nucleotidsequenz der NR12.3-cDNA voller Länge, die durch Kombinieren der 5'-RACE- und 3'-RACE-Produkte erhalten wurde. Die Aminosäuresequenz, die durch NR12.3 codiert wird, ist ebenfalls gezeigt. Das vorhergesagte Sekretionssignal ist unterstrichen. Konservierte Cysteinreste und die Aminosäuresequenzen des YR-Motivs und des WS-Motivs sind eingerahmt.
7 ist eine Fortsetzung von 6.
8 zeigt Fotografien, die die Ergebnisse der RT-PCR-Analyse der Verteilung der genetischen Expression des NR12 in menschlichen Organen zeigen. Der Pfeil zeigt die Größe des spezifischen PCR-Amplifikationsprodukts von NR12 an.
9 zeigt eine Fotografie, die die Ergebnisse der Quantifizierung der NR12-Genexpression in menschlichen Organen durch Southern Blot-Verfahren darstellt. Der Pfeil zeigt die Größe des spezifischen Signals an nachgewiesenem NR12 an.
10 ist eine schematische Illustration der Struktur des NR12-Fusionsproteins, das von der Expressionsvektor-Konstruktion in der Säugerzelle exprimiert werden soll.
11 zeigt die Nucleotidsequenz der NR12.4-cDNA voller Länge, die durch Kombinieren der 5'-RACE- und 3'-RACE-Produkte erhalten wurde. Die Aminosäuresequenz, die durch NR12.4 codiert wird, ist ebenfalls gezeigt. Das vorhergesagte Sekretionssignal ist unterstrichen. Konservierte Cysteinreste und Aminosäuresequenzen des YR-Motivs und des WS-Motivs sind eingerahmt.
12 ist eine Fortsetzung von 11.
13 zeigt die Nucleotidsequenz der NR12.5-cDNA voller Länge. Die Aminosäuresequenz, die durch NR12.5 codiert wird, ist ebenfalls gezeigt. Das vorhergesagte Sekretionssignal ist unterstrichen. Die vorhergesagte transmembrane Sequenz ist schattiert. Konservierte Cysteinreste in der extrazellulären Region und Aminosäuresequenzen des YR-Motivs und des WS-Motivs sind eingerahmt.
14 ist eine Fortsetzung von 13.
Die beste Art, die Erfindung durchzuführen
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf Beispiele erklärt, soll jedoch nicht darauf beschränkt werden.
[Beispiel 1] Isolierung des NR12-Gens
(1) Primäres Durchmustern durch TblastN-Suche
Obwohl die Sequenzierung von menschlichem Genom beträchtlich durch menschliche Genom-Projekte von Instituten vorangetrieben wird, hat der Anteil an gänzlich vollendeten Sequenzen des gesamten menschlichen Genoms nicht einmal 10% erreicht. Informationen, die bis heute durch die vorstehenden Projekte bereitgestellt wurden, werden durch die Bestimmung von Nucleotidsequenzen und die Genkartierung jedoch als gute Mittel für die Suche nach Zielgenen gewertet. Die Informationsbasis der vorstehenden Sequenzen besteht aus umfangreichen Informationen, die durch die Zusammenstellung des künstlichen Bakterienchromosoms (BAC) und des künstlichen Hefechromosoms (YAC) bereitgestellt werden, die darauf abzielt, in Zukunft eine vollständige Datenbank zu bilden. Die vorliegenden Erfinder identifizierten ein menschliches Gen, das einen Teil eines neuen Hämopoietin-Rezeptorproteins codiert, aus einer BAC-Clonierungssequenz in einer der öffentlichen Datenbanken, „High Throughput Genomic Sequence (htgs)" von GenBank.
Wie vorstehend erwähnt fanden die hier genannten Erfinder Motivsequenzen, die in der Hämopoietin-Rezeptorfamilie konserviert sind, nämlich ein (Tyr/His)-Xaa-(hydrophob/Ala)-(Gln/Arg)-hydrophob-Arg-Motiv (YR-Motiv) in der extrazellulären Region und ein Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser-Motiv (WS-Motiv), das um den C-Terminus herum lokalisiert ist. Es ist jedoch extrem schwierig, eine Oligonucleotid-Sonde herzustellen, die beide Motiv-Sequenzen umfassend einschließt. Deshalb führten die Erfinder in silico unter Verwendung partieller Aminosäuresequenzen von dem Fragment bekannter Hämopoietin-Rezeptorproteine, einschließlich beider Motive als Abfragesequenz, eine Datenbanksuche durch. Die Fragmentierung partieller Aminosäuresequenzen, die als Abfragesequenz verwendet werden können, wurde unter Verwendung der menschlichen Rezeptoren untersucht, die in Tabelle 1 als die Sequenz bekannter Hämopoietin-Rezeptoren gezeigt sind. Gemäß der genomischen Struktur der bekannten Hämopoietin-Rezeptorsequenzen waren die Exons, die dieses YR-Motiv und WS-Motiv codieren, etwa 50 bis 70 Aminosäuren lang, und das Exon proximal dazu zum N-Terminus (PP-Exon) war auch etwa 50 bis 70 Aminosäuren lang. Somit wurde eine Sequenz, die beide Exons enthielt und die aus etwa 120 Aminosäuren bestand, geschnitten, um aus praktischen Gründen eine Abfragesequenz herzustellen. Obwohl die Länge der partiellen Aminosäuresequenz, die als Abfragesequenz verwendet wurde, abhängig von jedem bekannten Hämopoietin-Rezeptor variierte, war das Strukturmerkmal konserviert. Eine Sequenz, die von einem oder mehreren Prolinresten, die nahe der Initiationsstelle im PP-Exon liegen, bis zum Aminosäurerest, der etwa zehn Aminosäuren vom C-Terminus der WS-Motiv-Endaminosäure im WS-Exon entfernt liegt, reicht, wurde von allen bekannten Hämopoietin-Rezeptorsequenzen als die Abfragesequenz abgeleitet.
Die bekannten Hämopoietin-Rezeptoren, die als Abfrage-Sequenzen für die Datenbanksuche verwendet wurden, sind in der Tabelle gezeigt. Die Aminosäurereste, die unter den Motivsequenzen konserviert sind, sind fett unterstrichen dargestellt.
Tabelle 1
Die vorstehenden Abfragesequenzen wurden verwendet, um unter Verwendung des TblastN (Advanced TblastN 2.0.9)-Programms in der htgs-Datenbank in GenBank zu suchen. Die Standard-Werte (Erwartung = 100; Beschreibung = 250 und Alignment = 250) wurden als Parameter für die Suche verwendet. Als ein Ergebnis ergab die Suche viele falsche positive Clone, und die Clone mit sowohl dem YR-Motiv als auch dem WS-Motiv wurden nicht in demselben Leseraster codiert, beziehungsweise die, die ein Stopp-Codon zwischen den beiden Motiven enthielten, wurden ausgeschlossen. Auch wurden jene Clone ausgeschlossen, die nur das YR-Motiv enthielten, jedoch nicht das WS-Motiv, weil das YR-Motiv, wie vorstehend erwähnt, keine vollständig etablierte Consensus-Sequenz ist. Deshalb wurde die Konservierung des WS-Motivs als vordringlich betrachtet. Als ein Ergebnis der vorstehenden Auswahl wurden positive Clone der primären Suche, die in Tabelle 2 gezeigt sind, aus etwa 1000 pseudo-positiven Clonen, die durch die TblastN-Suche erhalten wurden, ausgewählt.
Positive Clone, die durch die primäre Suche in der htgs-Datenbank erhalten wurden und die die Ziel-Motivsequenz mit hoher Wahrscheinlichkeit haben, wurden ausgewählt und sind in der Tabelle gezeigt. Konservierte Aminosäurereste sind in den Motivsequenzen fett unterstrichen dargestellt.
Tabelle 2
(2) Sekundäres Durchmustern durch BlastX-Suche
Zuerst wurden Nucleotidsequenzen um die Sequenz, die in der primären Suche zu der Abfrage-Sequenz positiv war, von jedem der 28 positiven Clone der primären TblastN-Suche, die in Tabelle 2 gezeigt werden, ausgeschnitten. Unter Verwendung dieser Sequenzen als Abfragesequenzen wurde die nr-Datenbank von GenBank unter Verwendung des BlastX (Advanced BlastX 2.0.9)-Programms erneut durchsucht. Die Abfragesequenz bestand aus praktischen Gründen aus einer Nucleotidsequenz von insgesamt 240 Bp, die die Sequenz etwa 200 Bp stromaufwärts der Sequenz enthält, die das WS-Motiv codieren kann. Da das Exon, das das WS-Motiv codiert, wie vorstehend erwähnt, so kurz war, dass es etwa 50 bis 70 Aminosäuren in der Genomstruktur bekannter Hämopoietin-Rezeptoren enthielt, wird erwartet, dass die hergestellte Abfragesequenz von 240 Bp Länge das Exon ausreichend überdecken wird. Der Wert von „Erwartung = 100; Beschreibung = 250 und Alignment = 250, Filter = Standard" wurde für die BlastX-Suche verwendet. Es wurde erwartet, dass positive Clone, die zumindest eine Homologie mit mehreren verschiedenen bekannten Hämopoietin-Rezeptoren zeigen, als positive Clone der sekundären Suche, die Angehörige der Hämopoietin-Rezeptorfamilie codieren, von den positiven Clonen der sekundären Suche gemäss der Suche ausgewählt würden.
Als ein Ergebnis der vorstehenden zweistufigen Blast-Suche wurden von den in Tabelle 2 gezeigten menschlichen genomischen Clonen, drei Clone (AC008048, AC007174 und AL109843) erfolgreich als positive Clone der sekundären Suche identifiziert. Es wurde jedoch gezeigt, dass AC008048 und AC007174 Genomsequenzen sind, die den Betastrang des menschlichen IL-2-Rezeptors beziehungsweise den menschlichen IL-5-Rezeptor codieren. Es wurde gefolgert, dass AL109843 allein den neuen Ziel-Hämopoietin-Rezeptor codiert. Deshalb wurde dieser Clon NR12 genannt und wurde und zur Isolierung von cDNA voller Länge bestimmt.
AL109843 ist ein Entwurf einer genomischen Leit-Sequenz, die vom menschlichen Chromosom 1 abstammt, das der htgs-Datenbank am 16. August 1999 vorgelegt wurde und eine Länge von 149104 Bp hat. Es bleiben zu diesem Zeitpunkt jedoch Nucleotidsequenzen an zehn Positionen, insgesamt etwa 8000 Bp, unbestimmt. Die Existenz eines WS-Exons konnte in der Sequenz von AL109843 vorhergesagt werden, die in der primären TblastN-Suche positiv war, wie in 1 gezeigt wurde. Das YR-Motiv, die [YVFQVR]-Sequenz, und das WS-Motiv, die [WQPWS]-Sequenz, wurden in der Sequenz erkannt. Der Vergleich der Aminosäuresequenz von NR12 mit der des bekannten Hämopoietin-Rezeptors, von denen nachgewiesen wurde, dass sie in der sekundären BlastX-Suche eine Homologie haben, ist in 2 gezeigt. Basierend auf dem vorstehenden Ergebnis wurden basierend auf der Exonsequenz spezifische Oligonucleotid-Primer entworfen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie in der AL109843 vorkommen, und diese Primer wurden im 5'-RACE-Verfahren und im 3'-RACE-Verfahren, die später beschrieben werden, verwendet.
(3) Herstellung von Oligonucleotid-Primern
Wie vorstehend beschrieben, wurden Exonstellen auf AL109843-Sequenzen vorhergesagt, und diese wurde verwendet, um die folgenden Oligonucleotid-Primer, die für NR12 spezifisch sind, zu entwerfen. Drei Sense-Primer (NR12-S1, NR12-S2 und NR12-S3; stromabwärts orientiert) und drei Antisense-Primer (NR12-A1, NR12-A2 und NR12-A3; stromaufwärts orientiert) wurden unter Verwendung des ABI 394-DNA/RNA-Synthesegeräts unter Bedingungen synthetisiert, bei der eine Trityl-Gruppe an den 5'-Terminus angeheftet wird. Dann wurden die Herstellungen unter Verwendung einer OPC-Säule (ABI #400771) gereinigt, um Primer voller Länge zu erhalten.
NR12-S1; 5'-GCA ACA GTC AGA ATT CTA CTT GGA GCC-3' (SEQ ID NO: 11)
NR12-S2; 5'-CAT TAA GTA CGT ATT TCA AGT GAG ATG TC-3' (SEQ ID NO: 12)
NR12-S3: 5'-GGT ACT GGC AGC CTT GGA GTT CAC TG-3' (SEQ ID NO: 13)
NR12-A1; 5'-CAG TGA ACT CCA AGG CTG CCA GTA CC-3' (SEQ ID NO: 14)
NR12-A2; 5'-GAC ATC TCA CTT GAA ATA CGT ACT TAA TG-3' (SEQ ID NO: 15)
NR12-A3; 5'-GGC TCC AAG TAG AAT TCT GAC TGT TGC-3' (SEQ ID NO: 16)
Vorstehende Oligonucleotid-Primer, NR12-S1 und NR12-A3, NR12-S2 und NR12-A2 und NR12-S3 und NR12-A1 wurden so entworfen, dass sie eine vollständig komplementäre Sequenz zueinander haben.
(4) Clonierung N-terminaler cDNA durch das 5'-RACE-Verfahren
Um cDNA voller Länge von NR12 zu isolieren, wurde eine 5'-RACE-PCR unter Verwendung von NR12-A1 von (3) für die primäre PCR beziehungsweise NR12-A2 von (3) für die sekundäre PCR durchgeführt. Ein PCR-Versuch wurde unter Verwendung der Human Fetal Liver Marathon-Ready-cDNA-Bank (Clontech#7403-1) als Matrize und des Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech#8417-1) auf dem Thermocycler (Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400) durchgeführt. Als Ergebnis wurden unter den folgenden Bedingungen PCR-Produkte von zwei verschiedenen Größen, wie in 3 gezeigt, erhalten.
Die Bedingungen der primären PCR waren wie folgt: 94°C über 4 min, 5 Zyklen von „94°C über 20 sek, 72°C über 90 sek", 5 Zyklen von „94°C über 20 sek, 70°C über 90 sek", 28 Zyklen von „94°C über 20 sek, 68° über 90 sek", 72°C über 3 min, und Beendigung bei 4°C.
Die Bedingungen der sekundären PCR waren wie folgt: 94°C über 4 min, 5 Zyklen von „94°C über 20 sek, 70°C über 90 sek" 25 Zyklen von „94°C über 20 sek, 68°C über 90 sek", 72°C über 3 min, und Beendigung bei 4°C.
Zwei Amplifikationsprodukte wurden durch die PCR erhalten und beide wurden in pGEM-T Easy-Vektor (Promega #A1360) subcloniert, und die Nucleotidsequenzen wurden bestimmt. Die Transformation des PCR-Produkts in den pGEM-T Easy-Vektor wurde in einer Reaktion bei 4°C über 12 Stunden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Promega #A1360) durchgeführt. Die Rekombinanten der PCR-Produkte und des pGEM-T Easy-Vektors wurden durch die Transformation des E. coli-Strangs DH5α (Toyobo#DNA-903) erhalten. Rekombinanten wurden unter Verwendung von Insert Check Ready Blue (Toyobo#PIK-201) ausgewählt. Die Nucleotidsequenzen wurden unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI/Perkin Elmer#4303154) und durch Analyse mit dem ABI PRISM 377 DNA Sequencer bestimmt. Die Nucleotidsequenzen des gesamten inserierten Fragments von zehn unabhängigen Clonen wurden bestimmt. Als ein Ergebnis wurden sie, basierend auf der Länge der Basenpaare und der Sequenzunterschiede in zwei Gruppen unterteilt, wobei eine aus 4 Clonen mit einer Größe von 1,3 kB bestand und die andere aus 6 Clonen mit einer Größe von 1,0 kB bestand. Es wurde jedoch gezeigt, dass die früheren 5'-RACE-PCR-Produkte von 1,3 kB unspezifische PCR-Amplifikationsprodukte waren. Diese Sequenz wird von der kleineren Bande, die in 3 gezeigt ist, abgeleitet. Auf der anderen Seite wurde erkannt, dass die letzteren 5'-RACE-PCR-Produkte von 1,0 Kb partielle Nucleotidsequenzen von NR12 sind, die von einer korrekten PCR-Amplifikationsreaktion herrührten.
(5) Clonierung I-terminaler cDNA durch das 3'-RACE-Verfahren
Um die C-terminale Sequenz eines DNA-Clons, der dem NR12 voller Länge entspricht, zu isolieren, wurde eine 3'-RACE-PCR unter Verwendung von NR12-S1-Primer von (3) für die primäre PCR beziehungsweise NR12-A2 von (3) für die sekundäre PCR durchgeführt. Die PCR wurde unter denselben Bedingungen durchgeführt wie in dem vorstehenden 5'-RACE, mit der Ausnahme, dass die Human Thymus Marathon-Ready cDNA-Library (Clontech#7415-1) als Matrize verwendet wurde. Genauer wurden der Advantage cDNA Polymerase Mix und der Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400-Thermocycler in dem PCR-Versuch verwendet. Unter denselben PCR-Bedingungen wie jenen in (4) beschriebenen wurde das 3'-RACE-Amplifikationsprodukt, das eine identische Größe von 750 Bp zeigte, wie in 3 beschrieben, erhalten. Das erhaltene PCR-Produkt wurde wie vorstehend in den pGEM-T Easy-Vektor subcloniert, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Die Rekombination des PCR-Produkts in den pGEM-T Easy-Vektor wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in einer Reaktion bei 4°C über 12 Stunden durchgeführt. Die Rekombinante des PCR-Produkts und des pGEM-T Easy-Vektors wurde durch Transformation des E. coli-Strangs DH5α erhalten und die Selektion der Rekombinante wurde, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von Insert Check Ready Blue durchgeführt. Die Nucleotidsequenz wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit und des ABI PRISM 377 DNA Sequencer zur Analyse bestimmt. Die Nucleotidsequenzen des gesamten inserierten Fragments von 2 unabhängigen Clonen von genetischen Rekombinanten zeigten, dass die Clone die C-terminale Sequenz des NR12-cDNA-Clons voller Länge mit einer Poly A-Sequenz enthalten.
Dann wurden die Nucleotidsequenz, die durch die 3'-RACE-PCR bestimmt wurde, und jene, die durch 5'-RACE-PCR in (4) bestimmt wurden, kombiniert, um schließlich die gesamte Nucleotidsequenz des cDNA-Clons, der die sezernierte Form des löslichen Rezeptor-ähnlichen Proteins, genannt NR12.1, codiert, zu bestimmen. Die bestimmte Nucleotidsequenz von NR12.1-cDNA (SEQ ID NO: 1) und die Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz codiert wird (SEQ ID NO: 2), sind in 4 gezeigt.
(6) Clonierung einer C-terminalen Spleiß-Variante durch das 3'-RACE-Verfahren
Obwohl der vorstehend isolierte NR12.1-Clon nach dem Ergebnis der Strukturanalyse ausreichend Merkmale bekannter Hämopoietin-Rezeptoren hatte, besaß er keine Transmembran-Region. Deshalb wurde gefolgert, dass er ein löslichen Rezeptor-ähnliche Protein, wie vorstehend erwähnt, codiert. Weiterhin sagten die hier genannten Erfinder die Existenz von Spleiß-Varianten voraus, die vor allem in der C-terminalen Region des Transkriptionsprodukts des vorliegenden Gen eine Transmembran-Region haben, und versuchten, NR12-cDNA-Clone durch nachfolgendes 3'-RACE-Verfahren zu isolieren.
Somit wurde eine 3'-RACE-PCR unter Verwendung des vorstehend erwähnten NR12-S2-Primers von (3) für primäre PCR und des NR12-S3-Primers für sekundäre PCR durchgeführt. Unter denselben PCR-Bedingungen wie den in (4) beschriebenen für das 5'-RACE-Verfahren, mit der Ausnahme, dass eine Human Testis Marathon-Ready cDNA-Library (Clontech#7414-1) als Matrize verwendet wurde. Als Ergebnis wurden mehrere 3'-RACE-PCR-Produkte mit verschiedenen Größen erhalten. Alle erhaltenen PCR-Produkte wurden, wie vorstehend beschrieben, in den pGEM-T Easy-Vektor subcloniert, um die Nucleotidsequenzen zu bestimmen. Die Nucleotidsequenzen der gesamten inserierten Fragmente von 6 unabhängigen Clonen genetischer Rekombinanten wurden bestimmt. Als ein Ergebnis wurde herausgefunden, dass einer dieser Clone mit dem vorstehend bestimmten NR12.1 identisch ist. Die anderen 5 Clone codierten möglicherweise das Ziel-Transmembran-Protein, das Transmembran-Regionen hat. Das heißt, die vorliegenden Erfinder waren wie erwartet in der Lage, die Existenz von Spleiß-Varianten von NR12 zu bestätigen. Des Weiteren zeigten die 5 vorstehenden cDNA-Clone auf Grund von alternativem Spleißen Unterschiede in der extrazellulären C-terminalen Region. Zwei dieser Clone hatten nämlich nur eine kurze intrazelluläre Region und wurden NR12.2 genannt. Auf der anderen Seite hatten die anderen 3 Clone eine lange intrazelluläre Region. Diese cDNA-Clone mit einem langen ORF wurden NR12.3 genannt und wurden von der vorstehenden Sequenz, NR12.2., unterschieden.
Dann wurden die Nucleotidsequenz, die durch die 3'-RACE-PCR bestimmt wurde, und die von den 5'-RACE-PCR-Produkten in (4) kombiniert, um schließlich die gesamte Nucleotidsequenz des cDNA-Clons, der das transmembrane Rezeptorprotein codiert, zu bestimmen. Die Nucleotidsequenz, die für NR12.2-cDNA (SEQ ID NO: 3) bestimmt wurde, und ihre Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) sind in 5 gezeigt. Die Nucleotidsequenz der NR12.3-cDNA (SEQ ID NO: 5) und ihre Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6) sind in den 6 und 7 gezeigt.
Die Sequenz der Exonstelle wurde vorstehend in (2) aus der Spleiß-Consensus-Sequenz bei der RNA-Transkription vorhergesagt (Hames, B. D. und Glover, D. M., Transcription and Splicing (Oxford, IRL Press), 1988, S. 131–206) und nicht durch die Verwendung von Programmen wie Genom-Analyse-Software. Gemäß der Bestimmung der gesamten Nucleotidsequenz isolierter cDNA-Clone wurde gezeigt, dass die Exonstelle, die innerhalb der partiellen Sequenz von AL109843, gezeigt in 1, vorhergesagt wurde, vollständig mit der übereinstimmt, die bei der tatsächlichen Transkription des NR12-Gens beobachtet wurde. Es wurde jedoch gezeigt, dass nur das Transkriptionsprodukt des NR12.1-cDNA-Clons eines war, das sich, gelesen durch die identische Sequenz der Genomstruktur ohne Spleißen nach der Termination des WS-Exons, bis zur nicht-translatierten 3'-Region erstreckt.
(7) Strukturmerkmal von NR12 und Vorhersage seiner Funktion
Als ein Ergebnis der Bestimmung der gesamten Nucleotidsequenzen von NR12.1, NR12.2 und NR12.3 wurde gezeigt, dass sie die Transkriptionsprodukte sind, die auf Grund von alternativem Spleißen eine strukturelle Varietät im C-Terminus haben. NR12.1 kann eine sekretorische Form eines löslichen Hämopoietin-Rezeptor-ähnlichen Proteins codieren, das gemäß seiner Primärstruktur aus 337 Aminosäuren besteht, während NR12.2 und NR12.3 transmembrane Hämopoietin-Rezeptorproteine codieren können, die aus 428 beziehungsweise 629 Aminosäuren bestehen. Die Eigenschaften von jedem NR12 waren wie folgt.
Zuerst wird vorausgesagt, dass die Sequenz von dem ersten Met zum 23. Gly in der gemeinsamen extrazellulären Domäne dieser Clone die typische Sekretions-Signalsequenz ist. Hierin wird angenommen, dass das erste Met die Translations-Initiationsstelle ist, weil es an der Minus -32-Position vom 1. Met ein in-frame-Terminationscodon im Leserahmen gibt. Als nächstes gibt es eine Ig-ähnliche Region in der Region vom 24. Gly- zum 124. Pro-Rest. Zusätzlich wird vorhergesagt, dass die Region von dem 133. Cys- zum 144. Cys-Rest eine der Schleifenstrukturen bildet, die eine Liganden-Bindungsstelle ist. Des Weiteren entspricht die Region von dem 290. Tyr- zum 295. Arg-Rest dem hoch konservierten YR-Motiv, und ein typisches WS-Motiv wird auch an den Resten vom 304. Trp zum 308. Ser gefunden.
Hierin codiert das NR12.1 nach dem WS-Motiv 29 Aminosäuren, und das Translations-Raster endet am nächsten Stop-Codon. Deshalb codiert das NR12.1 ein lösliches Hämopoietin-Rezeptorprotein, das keine transmembrane Domäne hat. Auf der anderen Seite entsprechen die 26 Aminosäuren, die auf das vorstehende konservative Motiv vom 352. Gly- zum 377. Asn-Rest in NR12.2 und NR12.3 folgen, einer typischen transmembranen Domäne. NR12.2 und NR12.3 codieren identische Aminosäuresequenzen bis zu dem 413. Gln-Rest in der extrazellulären Region. Es gibt jedoch auf Grund von alternativem Spleißen strukturelle Unterschiede in der C-terminalen Region, die dem 413. Gln-Rest folgt, so dass sie an verschiedene Exons gebunden werden. NR12.2 codiert nämlich 428 Aminosäuren und das Translationsraster wird am nächsten Stop-Codon terminiert. Somit hat es nur eine kurze intrazelluläre Region, die aus 51 Aminosäuren besteht. Auf der anderen Seite codiert NR12.3 629 Aminosäuren und hat eine intrazelluläre Region, die aus 252 Aminosäuren besteht. Gemäß den vorstehenden Struktureigenschaften wurde erkannt, dass das NR12-Gen ausreichende Eigenschaften als neue Hämopoietin-Rezeptorproteine besitzt.
[Beispiel 2] Bestimmung der Gewebeverteilung und Expressionsmusteranalyse des NR12-Gens durch RT-PCR
mRNA wurde unter Verwendung des RT-PCR-Verfahrens zur Analyse der Expressionsverteilung und des Expressionsmusters des NR12.1-Gens in verschiedenen menschlichen Organen nachgewiesen. NR12-PPD-Primer mit der nachstehenden Sequenz wurde als Sense-Primer (stromabwärts orientiert) für die RT-PCR-Analyse synthetisiert. Der NR12-A1-Primer, der in Beispiel 1 (3) synthetisiert wurde, wurde als Antisense-Primer (stromaufwärts orientiert) verwendet. Der NR12-PPD-Primer wurde wie in Beispiel 1 (3) synthetisiert und gereinigt. Es wurde erwartet, dass die gemeinsame N-terminale Region in allen Spleiß-Varianten, NR12.1, NR12.2 und NR12.3, unter Verwendung dieser Primer-Reihen (NR12-PPD und NR12-A1) amplifiziert und nachgewiesen wurde.
hNR12-PPD; 5'-CCG CCA GAT ATT CCT GAT GAA GTA ACC-3' (SEQ ID NO: 17)
Die verwendeten Matrizen waren Human Multiple Tissue-cDNA (MTC) Panel I (Clontech #K1420-1), Human MTC Panel II (Clontech#K1421-1), Human Immune System MTC Panel (Clontech#K1426-1), und Human Fetal MTC Panel Clontech#K1425-1). PCR wurde unter Verwendung von Advantage cDNA-Polymerase Mix (Clontech#8417-1) auf einem Thermocycler (Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400) durchgeführt. PCR wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt, um das Ziel-Gen zu amplifizieren: 94°C über 4 min, 5 Zyklen von „94°C über 20 sek, 72°C über 1 min", 5 Zyklen von „94°C über 20 sek, 70°C über 1 min", 25 Zyklen von „94°C über 20 sek, 68° über 1 min", 72°C über 3 min und Beendigung bei 4°C.
Wie in 8 gezeigt, wurde eine starke Expression von NR12 in dem hämatopoetischen Zellliniengewebe und im Immunzelllinien-Gewebe wie adulter Milz, Thymus, Lymphknoten, Knochenmark und peripheren Leukocyten beobachtet. Die Expression wurde auch in Testis, Leber, Lunge, Niere, Pankreas und im Gastrointestinaltrakt wie Dünndarm und Dickdarm nachgewiesen. Darüber hinaus wurde eine NR12-Genexpression auch in der gesamten analysierten mRNA beobachtet, die von menschlichen fötalen Geweben abstammt. Durch die Durchführung von PCR unter Verwendung von menschlichen G3PDH-Primern unter den vorstehenden Bedingungen und durch Nachweisen der Expression des Haushaltsgens G3PDH wurde bestätigt, dass sich die Anzahl an mRNA-Kopien bei der Matrizen-mRNA normalisiert hatte.
Die Größe des RT-PCR-Amplifikationsprodukts betrug 561 Bp, was mit der Größe übereinstimmte, die aus der bestimmten Nucleotidsequenz von NR12-cDNA errechnet wurde. Demnach wurde angenommen, dass das Produkt das Produkt einer spezifischen PCR-Amplifikationsreaktion war. Dies wurde durch Southern-Blot-Verfahren, wie nachstehend, weiter bestätigt, und die Möglichkeit, dass das Produkt ein unspezifisches PCR-Amplifikationsprodukt war, wurde verworfen.
Die Analysen der Expressions-Verteilung und des Expressionsmusters des NR12-Gens durch BT-PCR zeigten, dass die Expression auf bestimmte Organe und Gewebe beschränkt ist, und ebenso, dass die Expressionsmenge zwischen den Organen stark variiert. Nimmt man alle Ergebnisse der NR12-Genexpressionsverteilung zusammen, so legt die Tatsache, dass eine besonders starke Expression in Gewebe nachgewiesen wurde, von dem man vor allem annahm, dass es Immunzellen-Gewebe und hämatopoetische Zellen enthielt, stark die Möglichkeit nahe, dass NR12 als neuer Hämopoietin-Rezeptor wirkt. Des Weiteren legt die Tatsache, dass die Expression von NR12 auch in anderen Geweben beobachtet wurde, nahe, dass NR12 verschiedene physiologische Funktionen in vivo regulieren kann, nicht nur jene im Immunsystem und im hämatopoetischen System.
Darüber hinaus wurde die Existenz von Spleiß-Varianten erkannt. Dies legt stark nahe, dass die transkriptionale Regulation der NR12-Genexpression streng durch die die transkriptionale Regulation bestimmende funktionale Spezifität, die transkriptionale Induktion durch exogenen stimulierenden Faktor und die Regulation alternativen Spleißens in spezifischen Zelltypen kontrolliert wird.
[Beispiel 3] Verifizierung der Spezifität des RT-PCR-Produkts durch das Southern-Blot-Verfahren
Um die Spezifität der Amplifikation zu verifizieren, wurde das durch RT-PCR amplifizierte Ziel-Genprodukt in Beispiel 2 unter Verwendung eines NR12-spezifischen cDNA-Fragments als Sonde einem Southern-Blot-Verfahren unterzogen. Zur selben Zeit wurde die Menge des RT-PCR-Produkts durch die Stärke des markierten Signals quantitativ nachgewiesen, um die relativen Genexpressionsmengen bei verschiedenen menschlichen Organen zu bestimmen. Das RT-PCR-Produkt wurde auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, auf eine geladene Nylonmembran, Hybond N (+) (Amersham, kat#RPN303B) geblottet, und einer Hybridisierung unterzogen. Das cDNA-Fragment als Produkt der 5'-RACE-PCR, das dem N-Terminus des NR12, erhalten in Beispiel 1 (4), entsprach, wurde als spezifische Sonde für NR12 verwendet. Die Sonden wurden unter Verwendung des Mega Prime Kit (Amersham, kat#RPN1607) hergestellt und mit Radioisotop, [α-³²P]-dCTP (Amersham, kat#AA0005) markiert. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von Express Hyb Hybridization Solution (Clontech#8015-2) durchgeführt, und nach der Prähybridisierung bei 68°C über 30 min wurde hitzedenaturierte markierte Sonde zugesetzt, um bei 68°C über 120 min eine Hybridisierung durchzuführen. Nach aufeinanderfolgendem Waschen in (1) 1 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur über 5 min; (2) 1 × SSC/0,1% SDS bei 50°C über 30 min; und (3) 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 50°C über 30 min wurde die Membran einer Imaging Plate (FUJI#BAS-III) ausgesetzt, und das NR12-spezifische Signal wurde durch den Image Analyzer (FUJIX, BAS-2000 II) nachgewiesen.
Wie in 9 gezeigt, wurden alle durch die vorstehende RT-PCR amplifizierten PCR-Produkte als spezifische Amplifikationsprodukte bestätigt. Des Weiteren unterstützte das Ergebnis der Quantifikation der relativen Expressionsmengen in jedem Gewebe ebenfalls die vorstehend erwähnte Bestimmung. Es ist bekannt, dass das Nachweisverfahren für die Ziel-Genexpression unter Verwendung von RT-PCR und Southern-Blot-Verfahren in Kombination, im Vergleich mit anderen Verfahren für die Expressionsanalyse, eine extrem hohe Sensitivität hat. Nichtsdestoweniger wurde die NR12-Genexpression überhaupt nicht in adultem Herzen, Skelettmuskel, adultem Gehirn, Prostata, Eierstock oder Plazenta nachgewiesen.
[Beispiel 4] Northern-Blot-Analyse der NR12-Genexpression
Die Northern-Blot-Analyse der NR12-Genexpression wurde durchgeführt, um das Expressionsmuster des NR12-Gens in menschlichen Organen und menschlichen Krebs-Zelllinien zu untersuchen und um die Größe der NR12-Transkripte zu bestimmten. Human Multiple Tissue Northern (MTN) Blot (Clontech#7760-1), Human MTN Blot II (Clontech#7759-1), Human MTN Blot III (Clontech#7767-1) und Human Cancer Cell Line MTN Blot (Clontech#7757-1) wurden verwendet.
Das cDNA-Fragment, erhalten durch 5'-RACE in Beispiel 1 (4), wurde als die Sonde verwendet. Die Sonde wurde unter Verwendung von Mega Prime Kit hergestellt und wie in Beispiel 3 mit [α-³²P]-dCTP radioaktiv markiert. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von Express Hybridization Solution durchgeführt, und nach Prähybridisierung bei 65°C über 30 min wurde hitzedenaturierte markierte Sonde zugesetzt, um bei 65°C über 16 h eine Hybridisierung durchzuführen. Nach aufeinanderfolgendem Waschen in (1) 1 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur über 5 min; (2) 1 × SSC/0,1% SDS bei 48°C über 30 min; und (3) 0,5 × SSC/0,1% SDS bei 48°C über 30 min wurde die Membran wie vorstehend einer Imaging Plate ausgesetzt, und ein Versuch, das NR12-spezifische Signal nachzuweisen, wurde unter Verwendung eines Image Analyzers unternommen.
Das Verfahren konnte in keinem der untersuchten menschlichen Organe ein Signal nachweisen. Dies könnte der Fall sein, weil das Northern-Blot-Verfahren eine signifikant geringere Sensitivität hat als RT-PCR und somit mRNA mit niedriger Expressionsmenge nicht nachweisen konnte.
[Beispiel 5] Konstruktion eines NR12-Liganden-Durchmusterungssystems unter Verwendung Wachstumsfaktor-abhängiger Zelllinien
Liganden, die spezifisch an das Protein dieser Erfindung binden, können durch den folgenden Schritt durchmustert werden: (1) Herstellung eines chimären Rezeptors durch Ligieren der extrazellulären Domäne des Proteins dieser Erfindung mit der intrazellulären Domäne, die die transmembrane Domäne eines Hämpoietin-Rezeptorproteins enthält und die eine bekannte Signal-Transduktions-Fähigkeit umfasst; (2) Exprimieren dieses chimären Rezeptors auf der Zelloberfläche einer geeigneten Zelllinie, vorzugsweise einer Zelllinie, die nur in Gegenwart eines geeigneten Faktors überleben und sich vermehren kann (eine Wachstumsfaktor-abhängige Zelllinie); und (3) Züchten der Zelllinie durch Zusetzen eines Materials, von dem erwartet wird, dass es verschiedene Wachstumsfaktoren, Cytokine oder hämatopoetische Faktoren enthält. Dieses Verfahren verwendet die Tatsache, dass die vorstehend erwähnte Wachstumsfaktor-abhängige Zelllinie nur überlebt und sich vermehrt, wenn ein Ligand, der spezifisch an die extrazelluläre Domäne des Proteins der Erfindung bindet, innerhalb des Testmaterials existiert, und ohne Existenz des Wachstumsfaktors schnell getötet wird. Bekannte Hämopoietin-Rezeptoren sind zum Beispiel der Thrombopoietin-Rezeptor, der Erythropoietin-Rezeptor, der G-CSF-Rezeptor, gp130 etc. Der Partner des chimären Rezeptors, der beim Durchmustern der Erfindung verwendet wurde, ist jedoch nicht auf diese bekannten hämatopoetischen Rezeptoren beschränkt, und jeder Rezeptor kann verwendet werden, solange er die Struktur enthält, die für die Signaltransduktions-Aktivität in der cytoplasmatischen Domäne notwendig ist. IL-3-abhängige Zelllinien wie Ba/F3 und FCD-P1 können als Wachstumsfaktor-abhängige Zelllinien beispielhaft genannt werden.
Zuerst wurde die cDNA-Sequenz, die die extrazelluläre Region von NR12 codiert (die Aminosäuresequenz vom 1. Met zum 319. Gly), durch PCR amplifiziert, und dieses DNA-Fragment wurde im Leserahmen an die DNA-Fragmente gebunden, die die Transmembran-Region und die intrazelluläre Region eines bekannten Hämopoietin-Rezeptors codieren, um eine Fusionssequenz herzustellen, die einen chimären Rezeptor codiert. Der TPO-Rezeptor (menschliches MPL-P) wurde aus den vorstehend beschriebenen Kandidaten als der bekannte Partner-Hämopoietin-Rezeptor ausgewählt. Die vorstehend konstruierte chimäre Rezeptorsequenz wurde in den Plasmid-Vektor, pME18S/neo, inseriert, der in Säugerzellen exprimiert werden kann. Ein schematisches Diagramm der Struktur des konstruierten chimären pME18S/NR12-POR-Rezeptors ist in 10 gezeigt. Der chimäre, den Rezeptor exprimierende Vektor wurde in die Wachstumsfaktor-abhängige Zelllinie Ba/F3 eingeführt und zur Expression gezwungen. Dann wurden stabile Zellen mit eingeführten Genen ausgewählt. Die Selektion kann unter Verwendung der Tatsache durchgeführt werden, dass der Expressionsvektor ein Wirkstoff (Neomycin)-resistentes Gen enthält, und somit können nur Zellen mit eingeführten Genen, die eine Wirkstofftoleranz erhielten, in der Kultur, die den Wirkstoff enthält, vermehrt werden. Neues Hämopoietin kann durch Konstruieren eines Durchmusterungs-Systems durchmustert werden, das die Fähigkeit der chimären Rezeptor-exprimierenden Zelllinien nutzt, nur bei Existenz eines Liganden, der funktional spezifisch an das NR12 bindet, zu überleben und sich zu vermehren. In diesem Fall wird die Züchtung der chimären Rezeptor-exprimierenden Zelllinie in Medium durchgeführt, das mit einem Material angereichert ist, von dem erwartet wird, dass es einen Ziel-Liganden an Stelle des vorstehend beschriebenen Wachstumsfaktor (in diesem Fall IL-3)-freien Mediums einschließt.
[Beispiel 6] Konstruktion eines Expressionssystems von sekretorischem und löslichem rekombinantem NR12-Protein
Obwohl selten können an die Zellmembran bindende Proteine außer löslichen Proteinen als ein Ligand betrachtet werden, der spezifisch an das Protein der Erfindung bindet. In solchen Fällen kann die Durchmusterung durch Markieren des Proteins, das nur die extrazelluläre Domäne des Proteins der Erfindung enthält, oder eines Fusionsproteins, in dem eine partielle Sequenz eines anderen löslichen Proteins zu der extrazellulären Domäne des vorliegenden Proteins zugesetzt ist, und anschließender Messung der Bindung mit Zellen, von denen erwartet wird, dass sie den Liganden exprimieren, durchgeführt werden.
Beispiele für die ersteren Proteine, die nur die extrazelluläre Domäne des Proteins der Erfindung enthalten, sind zum Beispiel lösliche Rezeptorproteine, die durch Insertion eines Stopp-Codons in die N-terminale Seite der transmembranen Domäne oder von NR12.1, das das Protein vom löslichen Typ von NR12 codiert, künstlich hergestellt werden. Auf der anderen Seite können letztere Proteine durch Anfügen markierter Peptidsequenzen wie die Fc-Stelle von Immunglobulinen und FLAG-Peptid zum C-Terminus der extrazellulären Domäne des Proteins der Erfindung hergestellt werden. Diese löslichen markierten Proteine können auch für den Nachweis beim West-Western Blot-Verfahren verwendet werden.
Die hier genannten Erfinder wählten ein Konstruktionsverfahren wie folgt aus: (1) cDNA-Sequenz, die die extrazelluläre Region von NR12 codiert (die Aminosäuresequenz vom 1. Met zum 319. Gly), wurde durch PCR amplifiziert; und (2) FLAG-Peptidsequenz wurde im Leserahmen zum C-Terminus des amplifizierten DNA-Fragments zugesetzt, um eine Sequenz zu erhalten, die das lösliche Ziel-Protein codiert. Die konstruierte Sequenz wurde in den Plasmid-Vektor, pCHO, inseriert, der in Säugerzellen exprimiert werden kann. Ein schematisches Diagramm der Struktur des konstruierten chimären pCHO/NR12-TPOR-Rezeptors wird in 10 gezeigt. Dieser Expressionsvektor wurde in Säugerzellen, CHO-Zellen, eingeführt und zur Expression gezwungen. Dann wurden stabile Zellen mit eingeführtem Gen ausgewählt. Nach Bestätigen des Expression des löslichen Proteins wurden die Expressionszellen im großen Maßstab gezüchtet. Das rekombinante Protein, das in den Kulturüberstand sezerniert wurde, kann unter Verwendung eines anti-FLAG-Peptid-Antikörpers immunpräzipitiert werden und kann durch Affinitätssäulen etc. gereinigt werden.
Das erhaltene rekombinante Protein kann nicht nur bei dem vorstehend erwähnten Test angewendet werden, sondern zum Beispiel auch zum Nachweis von spezifischer Bindungsaktivität innerhalb eines Materials, von dem erwartet wird, dass es einen Ziel-Liganden enthält, durch das BIA-CORE-System (Pharmacia). Somit ist es extrem wichtig, neue Hämopoietine zu suchen, die an NR12 binden können.
[Beispiel 7] Erneute Isolierung von menschlicher NR12-CDS voller Länge
(1) Herstellung von Oligonucleotid-Primern
Die hier genannten Erfinder waren bereits bei der Isolierung der cDNA des NR12-Gens voller Länge erfolgreich gewesen. Die N-terminale Sequenz und die C-terminale Sequenz des isolierten Ziel-Gens wurden jedoch auf Grund der Verwendung des 5'-RACE- und 3'-RACE-Verfahrens für die cDNA-Isolierung getrennt isoliert. Somit versuchten die hier genannten Erfinder, die NR12.2- und NR12.3-Gene, die fortlaufende Codierungssequenzen voller Länge enthalten, erneut zu isolieren.
Zuerst wurde ein Sense-Primer (NR12.2-MET), nachstehend beschrieben, der das Start-Codon, die Met-Sequenz, enthielt, mit einer gemeinsamen Nucleotid-Sequenz für jeden cDNA-Clon von NR12 hergestellt. Als Antisense-Primer wurden NR12.2-STP und NR12.3-STP, die ein Stopp-Codon enthalten, das für NR12.2 beziehungsweise NR12.3 spezifisch ist, hergestellt. Die Primer wurden wie in Beispiel 1 (3) synthetisiert. Genauer wurde ABI's 394 DNA/RNA-Synthesizer unter Bedingungen, bei denen eine Trityl-Gruppe an den 5'-Terminus angeheftet wird, für die Primersynthese verwendet. Dann wurde das Produkt unter Verwendung einer OPC-Säule (ABI#400771) gereinigt, um Primer voller Länge zu erhalten.
NR12.1-MET; 5'-ATG AAT CAG GTC ACT ATT CAA TGG-3' (SEQ ID NO: 18)
NR12.2-STP; 5'-GCA GTC CTC CTA CTT CAG CTT CCC-3' (SEQ ID NO: 19)
NR12.3-STP; 5'-TTG ATT TTG ACC ACA CAG CTC TAC-3' (SEQ ID NO: 20)
(2) PCR-Clonierung
Um die CDS von NR12 voller Länge zu isolieren, wurde eine PCR-Clonierung unter Verwendung von NR12.1-MET-Primer von (1) als Sense-Primer und von NR12.2-STP- beziehungsweise NR12.3-STP-Primer als Antisense-Primer durchgeführt. Human Thymus Marathon-Ready cDNA-Library (Clontech#7415-1) wurde als Matrize und Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech#8417-1) für den PCR-Versuch auf einem Thermocycler (Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400) unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen verwendet. Das PCR-Produkt aus 1301 Bp, genannt NR12.4, wurde unter Verwendung der Primer-Reihe „NR12.1-MET und NR12.2-STP" erhalten und das aus 1910 Bp, genannt NR12.5, wurde unter Verwendung der Primer-Reihe „NR12.1-MET und NR12.3-STP" erhalten.
Die PCR wurde durch einen einzigen Zyklus von „94°C über 4 min", 5 Zyklen von „94°C über 20 sek, 72°C über 90 sek", 5 Zyklen von „94°C über 20 sek, 70°C über 90 sek", 28 Zyklen von „94°C über 20 sek, 68°C über 90 sek", einen einzigen Zyklus von „72°C über 3 min" durchgeführt und bei 4°C beendet.
Die erhaltenen PCR-Produkte wurden wie in Beispiel 1 (4) in pGEM-T Easy-Vektoren (Promega #A1360) subcloniert, und die Nucleotidsequenzen wurden bestimmt. Die Rekombination der PCR-Produkte in die pGEM-T Easy-Vektoren wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Promega#1360) in einer Reaktion bei 4°C über 12 Stunden durchgeführt. Die Rekombinante des PCR-Produkts und des pGEM-T Easy-Vektors wurde durch Transformation des E. coli-Stamms DH5α (Toyobo#DNA-903) erhalten und Insert Check Ready Blue (Toyobo#PIK-201) wurde für die Selektion der genetischen Rekombinante verwendet. Die Nucleotidsequenz wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing SF Ready Reaction Kit (ABI/Perkin Elmer#4303150) bestimmt, und wurde durch den ABI PRISM 377 DNA Sequencer analysiert. Die Nucleotidsequenzen der inserierten Fragmente in entsprechenden Rekombinanten von NR12.4 und NR12.5 wurden analysiert, und die Sequenzen von DNA-Clonen, die die CDS voller Länge codieren können, wurden bestimmt.
Als ein Ergebnis wurde gezeigt, dass NR12.4 den ORF voller Länge von NR12.2 enthält, jedoch nicht die nicht-translatierte 5'-Region beziehungsweise die nicht-translatierte 3'-Region außer der Sequenz, die auf Grund der Anordnung der in der PCR verwendeten Primer, von Primern abstammt. NR12.5 enthielt auch den ORF von NR12.3 voller Länge, jedoch nicht die nicht-translatierte 5'-Region beziehungsweise die nicht-translatierte 3'-Region außer der Sequenz, die von den Primern abstammt. Die bestimmte Nucleotidsequenz von NR12.4 und ihre Aminosäuresequenz sind in den 11 und 12 gezeigt, und die bestimmte Nucleotidsequenz von NR12.5 und ihre Aminosäuresequenz sind in den 13 und 14 gezeigt.
Der E. coli-Stamm DH5α, der mit pGEM-T Easy-Vektor (pGEM/NR12.5CDS) transfiziert ist, der die NR12.5-cDNA dieser Erfindung enthält, wurde international am 31. Juli 2000 wie folgt hinterlegt.
Name und Adresse der Hinterlegungs-Institution

Hinterlegungs-Institution: National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry.
Adresse: 1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan.
Hinterlegungsdatum: 31. Juli 2000
Zugangsnummer: FERM BP-7259

[Beispiel 8] Clonierung von homologem genomischem Mäuse-NR12-Gen
(1) Herstellung eines Sonden-Fragments von menschlichem NR12
Mit dem Ziel, die Genomstruktur des Mäuse-NR12-Gens zu analysieren, führten die hier genannten Erfinder eine Plaque-Hybridisierung gegen die genomische Mäuse-DNA-Bank durch. Um heterologe Kreuz-Hybridisierungs-Clonierung gegen die genomische Mäuse-DNA-Bank durchzuführen, wurde ein Sondenfragment von menschlicher NR12-cDNA hergestellt. Das Insertionsfragment, das mit NotI aus dem 5'-RACE-Produkt von menschlichem NR12 ausgeschnitten wurde, das in Beispiel 1 (4) erhalten wurde, wurde gereinigt und als das Sondenfragment verwendet. Der QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN#28704) wurde verwendet, um das Insertionsfragment von dem Agarosegel zu extrahieren und zu reinigen. Die Sonde wurde mit [α-³²P]-dCTP unter Verwendung des Mega Prime Kit wie in Beispiel 3 radioaktiv markiert und für die Plaque-Hybridisierung verwendet.
(2) Plaque-Hybridisierung
Genomische DNA vom Mäusestamm 129SVJ (Stratagene #946313), die in Lambda FIX II konstruiert wurde, wurde als Bank verwendet. Eine genomische Bank von etwa 320.000 Plaques wurde in NZY-Agarmedium entwickelt, und die Plaques wurden auf eine Hybond N (+)-geladene Nylonmembran (Amersham #RPN303B) geblottet, um eine primäre Durchmusterung durchzuführen. Perfect-Hyb Solution (Toyobo#HYB-101) wurde für die Hybridisierung verwendet, und nach Prähybridisierung bei 60°C über 30 min wurde hitzedenaturierte markierte Sonde zugesetzt, und die Hybridisierung wurde bei 60°C über 16 h durchgeführt. Nach aufeinanderfolgendem Waschen in: (1) 1 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur über 5 min; (2) 1 × SSC/0,1% SDS bei 50°C über 30 min; und (3) 0,5 × SSC/0,1% SDS bei 50°C über 30 min wurde die Membran einem Röntgenfilm (Hyperfilm MP:Amersham, #RPN8H) ausgesetzt, um positive Mäuse NR21-Plaques nachzuweisen.
Als ein Ergebnis wurden 6 unabhängige positive oder pseudo-positive Clone erhalten. Den Erfindern gelang es, durch Durchführen einer sekundären Durchmusterung auf ähnliche Weise wie die primäre Durchmusterung auf diese 6 Clone, die bei der primären Durchmusterung erhalten wurden, Plaques von 2 unabhängigen positiven NR12-Clonen zu isolieren. Lambda-DNA des isolierten Plaques wurde durch das Platten-Lyseverfahren in großem Maßstab hergestellt. Die Insertionsfragmente wurden mit dem Restriktionsenzym SalI ausgeschnitten. Die Analyse ihrer Größe zeigte, dass die Fragmente etwa 18,5 kB beziehungsweise 16,0 kB groß waren.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt neue Hämopoietin-Rezeptorproteine und DNA, die dieselben codiert, zu Verfügung. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls zur Verfügung: einen Vektor, in den die DNA inseriert ist, eine Transformante, die den Vektor beherbergt, und ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen unter Verwendung der Transformante. Sie stellt weiterhin ein Verfahren zum Durchmustern nach einer Verbindung oder einem natürlichen Liganden, die/der an das Protein bindet, zur Verfügung. Es wird vorhergesagt, dass das Protein dieser Erfindung mit der Regulierung des Immunsystems und der Hämatopoese in Verbindung steht. Deshalb wird erwartet, dass die Proteine dieser Erfindung beim Verstehen von Immunantworten und fundamentalen Merkmalen der Hämatopoese in vivo von Nutzen sind. Es wird ebenfalls erwartet, dass die Proteine der vorliegenden Erfindung bei der Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die mit Immunität und Hämatopoese in Verbindung stehen, verwendet werden können.
Es ist wichtig, unbekannte hämatopoetische Faktoren zu isolieren, die an das NR12-Molekül dieser Erfindung binden können. Es wird angenommen, dass das Gen dieser Erfindung beim Durchmustern nach solchen unbekannten Faktoren extrem nützlich ist. Des Weiteren können Peptidbanken und synthetische chemische Materialien gesucht werden, um Agonisten und Antagonisten zu isolieren und zu identifizieren, die funktional an das NR12 binden können.
Wie vorstehend beschrieben, wird erwartet, dass das NR12-Gen eine nützliche Quelle zum Gewinnen unbekannter hämatopoetischer Faktoren oder Agonisten zur Verfügung stellt, die in der Lage sind, funktional an das Rezeptorprotein zu binden, das durch das NR12-Gen codiert wird. Es wird erwartet, dass die zelluläre Immunität und die hämatopoetische Funktion in vivo durch die Verabreichung solcher funktionalen Bindungssubstanzen oder spezifischer Antikörper verstärkt werden wird, die die Funktion des NR12-Moleküls gegenüber dem Organismus aktivieren können. Somit ermöglicht das NR12-Gen die Entwicklung von Wirkstoffen für die klinische Anwendung, die die Vermehrung oder Differenzierung der Immunzellen oder der hämatopoetischen Zellen fördern oder die die Funktion der Immunzellen aktivieren. Solche Wirkstoffe können verwendet werden, um die cytotoxische Immunität gegen spezifische Tumortypen zu verstärken. Es ist möglich, dass NR12 in einer beschränkten Zellpopulation in den hämatopoetischen Geweben exprimiert wird. Entsprechend wären anti-NR12-Antikörper bei der Isolierung solcher Zellpopulationen nützlich, die dann bei Zell-Transplantations-Behandlungen verwendet werden können.
Auf der anderen Seite kann NR12.1, eine Spleißvariante von NR12, als Köderrezeptor als Hemmstoff für den NR12-Liganden verwendet werden. Des Weiteren wird erwartet, dass man durch die Verabreichung von Antagonisten, die funktional an das NR12-Molekül binden können, oder anderer Hemmstoffe, sowie spezifischer Antikörper, die die molekulare Funktion von NR12 auf den Organismus hemmen können, möglicherweise die zelluläre Immunität unterdrücken oder die Vermehrung hämatopoetischer Zellen in vivo hemmen kann. Somit können solche Hemmstoffe als Wirkstoffe für die klinische Anwendung verabreicht werden, zum Beispiel zur Verwendung als Vermehrungshemmstoffe von Immunzellen und hämatopoetischer Zellen, Differentiations-Hemmstoffe, immunsuppressive Wirkstoffe und entzündungshemmende Wirkstoffe. Genauer können solche Hemmstoffe verwendet werden, um das Auftreten von Autoimmunkrankheiten, die von Autoimmunität herrühren, oder Gewebeabstoßung durch das Immunsystem des lebenden Körpers, das primäre Problem bei der Transplantation, zu unterdrücken. Weiterhin können die Hemmstoffe wirksam verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die durch eine solche anomale Förderung der Immunantwort verursacht werden. Somit können die Hemmstoffe verwendet werden, um eine Vielzahl von Allergien zu behandeln, die für bestimmte Antigene wie Metall und Pollen spezifisch sind.
Sequenzprotokoll

Claims

DNA, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA codierend ein Protein umfassend die Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 und 10; (b) DNA umfassend die codierende Region der Nucleotidsequenz einer der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 und 9; (c) DNA codierend ein Protein umfassend die Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 und 10, in der zwei bis zehn Aminosäuren durch Substitution, Deletion oder Addition modifiziert sind, wobei das Protein eine Aktivität als Rezeptor des hämatopoetischen Faktors besitzt; und (d) DNA codierend ein Peptid, das ein Teil des Proteins ist, das aus der Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 und 10 besteht, wobei das Peptid eine Aktivität als Rezeptor des hämatopoetischen Faktors besitzt.
Vektor, in den die in Anspruch 1 beschriebene DNA eingefügt ist.
Transformante, die den in Anspruch 2 beschriebenen Vektor beherbergt.
Verfahren zur Herstellung des Proteins oder Peptids, das von der DNA gemäß Anspruch 1 codiert wird, umfassend die Schritte: Züchten der Transformante gemäß Anspruch 3 und Gewinnen des exprimierten Proteins aus der Transformanten oder dem Kulturüberstand.
Protein oder Peptid, das von der in Anspruch 1 beschriebenen DNA codiert wird oder durch das Verfahren gemäß Anspruch 4 erhältlich ist.
Antikörper, der spezifisch mit dem Protein oder dem Peptid gemäß Anspruch 5 reagiert.
Antisense-Polynucleotid, umfassend eine DNA, die zu mindestens 15 Nucleotiden aus einer der SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 und 9 komplementär ist.
Verfahren zum Durchmustern nach einer Verbindung, die an das Protein oder Peptid gemäß Anspruch 5 bindet, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen einer Testprobe mit dem Protein oder Peptid davon; (b) Nachweis der Bindungsaktivität der Testprobe mit dem Protein oder Peptid davon; und (c) Auswahl der Verbindung, die an das Protein oder Peptid davon bindet.
Arzneimittel umfassend die DNA gemäß Anspruch 1, das Protein gemäß Anspruch 5, den Vektor gemäß Anspruch 2, den Antikörper gemäß Anspruch 6 und/oder das Polynucleotid gemäß Anspruch 7.
Verwendung des Proteins gemäß Anspruch 5 und/oder des Antikörpers gemäß Anspruch 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die mit der Immunität und Hämatopoese in Verbindung stehen.