DE60023261T2

DE60023261T2 - Verfahren zur untersuchung der wechselwirkung von substanz und hormonrezeptor

Info

Publication number: DE60023261T2
Application number: DE60023261T
Authority: DE
Inventors: Hiroko Sakamoto; Noriko Kato
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2020-07-25
Also published as: WO2001007919A1; EP1120653A1; EP1120653A4; JP4406183B2; US20020072076A1; EP1120653B1; DE60023261D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer Substanz (zum Beispiel endokrin wirkende Substanzen [endocrine disrupting chemicals] die auch als "Umwelthormon" [environmental hormone] bezeichnet werden), die mit einem Hormonrezeptorprotein interagiert.
Stand der Technik
In der letzten Zeit wurde intensiv untersucht, wie umweltchemische Substanzen auf das endokrine System in einem Organismus wirken. Ein wichtiger Schwerpunkt der Studien ist besonders das Thema der endokrin wirkenden Substanzen. Endokrin wirkende Substanzen, auch als „Umwelthormon" bekannt, werden als exogene chemische Substanz, oder als eine Mischung daraus, definiert, die die Wirkung des endokrinen Systems beeinflussen, wobei sie auf die Individuen, deren Nachkommen oder eine Population (Unterpopulation) eine negative Wirkung haben. Das Wirkprinzip der endokrin wirkenden Substanzen wird wie folgt erkannt. Werden die endokrin wirkenden Substanzen an einen Hormonrezeptor gebunden, der in einem lebenden Körper vorhanden ist, hindert das ein natürliches Hormon daran, an den Hormonrezeptor zu binden, oder es wird unpassenderweise ein falsches Hormonsignal emittiert, das in vivo nachteilige Wirkung haben kann. Unlängst wurde herausgefunden, dass endokrin wirkende Substanzen sogar in niedrigen Konzentrationen, in denen die endokrin wirkenden Substanzen nicht durch herkömmliche Toxizitätstests unter Verwendung von Tieren ermittelt werden können, die endokrinen Systeme stören können. Es ist jedoch immer noch nicht bekannt, ob die schädliche Wirkung durch eine einzelne endokrin wirkende Substanz durch die Aussetzung über einen langen Zeitraum, oder durch eine multiple Kombination einer großen Vielzahl an endokrin wirkenden Substanzen erzeugt wird. Daher konnte die Wirkungsweise der endokrin wirkenden Substanzen bisher noch nicht erklärt werden.
Bezüglich der Gründe, weshalb die Wirkungsweise bisher noch nicht herausgefunden wurde, werden die folgenden Tatsachen genannt: Eine herkömmliche Toxizitätsuntersuchung (die auf die Detektierung einer letalen Toxizität und einem chronischen Schaden der Organe abzielt) unter Verwendung von Tieren verwendet als Indikator die Schädigung und letale Toxizität, die durch die Verabreichung einer einzelnen endokrin wirkenden Substanz hervorgerufen wird. Aus diesem Grund ist es unmöglich, die Substanz, die das endokrine System usw. in geringen Konzentrationen beeinflusst, zu detektieren. Unter diesen Umständen werden nun nach und nach international, vor allem in der OECD, Richtlinien für einen Screening-Test für endokrin wirkende Substanzen entworfen. Jedoch wurden diese Richtlinien bisher noch nicht vollständig festgesetzt.
Es ist bekannt, dass die chemischen Substanzen, die eine endokrine Wirkung aufweisen, meist eine ähnliche Funktion wie Östrogen (ein weibliches Hormon) haben. Aus diesem Grund wurden die meisten Verfahren zur Detektierung der endokrin wirkenden Substanzen mit dem Ziel entwickelt, die östrogenartige Aktivität der chemischen Substanzen zu detektieren. Es wird angenommen, dass diese chemischen Substanzen ihre endokrine Wirkung ausüben, indem sie sich an Östrogenrezeptoren binden.
Typische Verfahren zur Detektierung von endokrin wirkenden Substanzen, die eine östrogenartige Aktivität aufweisen, sind wie folgt:
1) Rezeptor-Bindungs-Assay
Bei diesem Verfahren wird die endokrine Wirkung detektiert, indem eine zu testende chemische Substanz (im Nachfolgenden „Testsubstanz" bezeichnet) und ein radioisotop markiertes β-Estradiol (ein Östrogen) gleichzeitig zu gereinigten Östrogenrezeptoren hinzugefügt werden und ihre unterschiedliche Rezeptor-Bindungs-Fähigkeit bestimmt wird.
Die Vorteile dieses Verfahrens liegen darin, dass keine Zellen benötigt werden und dass die endokrine Wirkung einer Testsubstanz innerhalb von 24 Stunden geprüft werden kann. Zudem weist dieses Verfahren eine ausgezeichnete Empfindlichkeit auf. Nachteilig an diesem Verfahren ist jedoch die Tatsache, dass die Verwendung von Radioisotop notwendig ist. Ein weiterer Nachteil liegt darin, dass das Verfahren nur auf die Bindungsfähigkeit der Testsubstanz an den Rezeptor gerichtet ist, so dass nicht bewertet werden kann, ob die Substanz wirklich die physiologische Aktivität in vivo induzieren kann. Aus diesem Grund kann mit diesem Verfahren nicht bestimmt werden, dass die physiologische Aktivität aus der agonistischen Aktivität oder aus der antagonistischen Aktivität resultiert. Zur Überwindung des Problems mit der Verwendung eines Radioisotops wurde bei dem Detektierungsverfahren in letzter Zeit ein Fluoreszenz-markiertes Östrogen (β-Estradiol) verwendet. Jedoch ist es nun nicht möglich zu bestimmen, dass die physiologischen Aktivitätsergebnisse entweder aus agonistischen Aktivität oder der antagonistischen Aktivität resultiert, und dieses Problem bleibt weiter ungelöst. Zur Entwicklung eines pharmakologischen Mittels, das das synthetische Hormon verwendet, ist die Bewertung der spezifischen physiologischen Aktivität einer Testsubstanz in vivo zur Bewertung der pharmakologischen Wirksamkeit einer chemischen Substanz, wie zum Beispiel eines synthetischen Hormons, wichtig. Aus diesem Grund besteht großer Bedarf an der Entwicklung eines Assays, der in der Lage ist, zu bewerten, ob die physiologische Aktivität der Testsubstanz das Resultat der agonistischen Aktivität oder der antagonistischen Aktivität ist.
2) Reporter-Gen-Assay
Bei diesem Verfahren wird kultivierten Zellen, in die ein Reportergen mit einem Östrogen-responsiven Element transfiziert wurde, eine Testsubstanz hinzugefügt.
Danach wird die durch die Testsubstanz induzierte endokrine Wirkung detektiert, indem die Menge an dem Endprodukt, das durch die endokrine Wirkung erzeugt wurde, d.h. das Produkt des Reportergens, quantitativ bestimmt wird.
Mit diesem Verfahren dauert es mehrere Tage, bis die endokrine Wirkung einer Testsubstanz bestimmt werden kann. Dieser Zeitraum ist länger als derjenige bei dem Rezeptor-Bindungs-Assay 1). Was die Zellen anbelangt, werden kultivierte Hefezellen oder kultivierte menschliche Zellen verwendet. Als Reportergen kann im Allgemeinen β-Galactosidase oder ähnliches verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird desweiteren ein spezifisches Reagens (z.B. ein Leuchtsubstrat wenn das Reportergen β-Galactosidase ist) zur Quantifizierung des Produktes des Reportergens benötigt. Zudem verwendet dieses Verfahren als Detektionsindikator die Gegenwart oder Abwesenheit des Produktes des Reportergens, das als Ergebnis der endokrinen Wirkung erzeugt wird. Aus diesem Grund ist es möglich, die agonistische Aktivität unter den beiden physiologischen Aktivitäten (d.h. der agonistischen und der antagonistischen Aktivität) der Testsubstanz in vivo zu bestimmen. Es ist jedoch schwierig, die Aktivität des Antagonisten zu bewerten.
Insbesondere wenn Hefezellen verwendet werden, kann dieser Assay wegen der Bakterienzellen leicht durchgeführt werden. Die Hefezellen haben jedoch eine Zellwand, die die Permeabilität der Testsubstanz in die Zelle verringert. Dies kann dazu führen, dass die Detektionsempfindlichkeit wesentlich verringert sein kann. Dies ist ein großer Nachteil.
3) Proliferationsbeschleunigungstest
Bei diesem Verfahren wird kultivierten Zellen, die einen Östrogenrezeptor exprimieren, eine Testsubstanz hinzugefügt, und es wird detektiert, ob die Proliferation der Zellen beschleunigt wird, oder nicht.
Mit diesem Verfahren dauert es etwa eine Woche, bis die endokrine Wirkung einer Testsubstanz bestimmt werden kann. Dieser Detektionszeitraum ist länger als derjenige bei dem Reporter-Gen-Assay 2). Bei diesem Verfahren wird die Proliferation der Zellen beobachtet, nachdem kultivierten Zellen, die einen Östrogenrezeptor, wie zum Beispiel MCF-7 oder ISHIKAWA exprimieren, eine Testsubstanz hinzugefügt worden ist. Das Beobachtungsergebnis wird mit dem Ergebnis einer Kontrollgruppe, der β-Estradiol hinzugefügt wird, verglichen. Ob die Testsubstanz die endokrine Wirkung aufweist, wird durch das Ausmaß, in dem die Proliferation der Zellen in Gegenwart der Testsubstanz beschleunigt ist, bestimmt. Dieses Verfahren ist dahingehend einfach, dass, anders als bei den Verfahren 1) und 2), kein spezifisches Reagens benötigt wird. Jedoch wird bei diesem Verfahren eine beträchtliche Menge an Zellen benötigt, im Vergleich zu dem Reporter-Gen-Assay 2). Zur Herstellung der Zellen müssen Zeit und Mühe aufgewendet werden. Bei diesem Verfahren, wie auch bei dem Reporter-Gen-Assay 2), ist es schwierig, die antagonistische Aktivität unter den physiologischen Aktivitäten (d.h. Aktivitäten des Agonisten und Antagonisten) der chemischen Substanz in vivo zu bewerten. Weist die Testsubstanz eine Proliferationsaktivität auf, (z.B. ist die Testsubstanz ein Wachstumsfaktor, ein karzerogener Promotor, und ähnliches), kann leicht ein falsch positives Ergebnis (positives Ergebnis anzeigend) resultieren.
4) Test am Tierindividuum
Die Testsysteme von 1) bis 3) weisen die Nachteile auf, dass Pharmakokinetika (Absorption, Distribution, Metabolismus, Exkretion) nicht reproduzierbar sind. Andererseits kann bei der Untersuchung eines Tierindividuums eine interne Umgebung (eine Umgebung in einem lebenden Körper) besser reproduziert werden. Die Untersuchung eines Tierindividuums umfasst einen Uterus-Proliferations-Assay und einen Hershberger-Assay, wobei Nagetiere und Amphibien verwendet werden. Bei jedem dieser Assays gibt es jedoch die folgenden Probleme: Die Detektion kann bis zu mehreren Wochen dauern. Zur Aufzucht der Tiere wird eine besondere Ausrüstung benötigt und es fallen hohe Kosten an. Die Untersuchung des Tierindividuums führt zur Opferung von Tieren. Desweiteren variiert das funktionelle Molekül, das mit einer Testsubstanz interagiert je nach der Art des Tieres. Aus diesem Grund ist es manchmal schwierig, die erhaltenen Ergebnisse auf den Menschen zu extrapolieren.
Unter diesen Umständen entstand das Bedürfnis, ein hochempfindliches und spezifisches Detektionsverfahren für endokrin wirkende Substanzen zu entwickeln, wobei die obenstehend genannten Probleme, die mit den Testverfahren 1) bis 4) in Verbindung stehen, gelöst werden. Dennoch wurde bisher noch kein zufrieden stellendes Verfahren erhalten.
Die WO-A-00/26366 offenbart auf Zellen basierende Assays zur Detektion eines Analyts. Diese Assays basieren auf der Verwendung von Zellen, die ein Fusionsprotein, das durch die Fusion eines Oberflächenzellen-Östrogenrezeptors mit einem fluoreszierenden Protein erhalten wird, exprimieren. Die Gegenwart eines Liganden eines Rezeptors wird in der Probe durch eine Veränderung der Fluoreszenz detektiert. S. Nelson et al. (1999) Endovrinol. 140, 950–957, T. Awaji et al (1998) Mol. Endocrinol. 12, 1099–1111, und T. Drmota et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 24000–24008 offenbaren die Verwendung von Fusionsproteinen, die durch Fusion eines Hormonrezeptorproteins mit einem fluoreszierenden Protein zur Überwachung der Ligandenbindung und Internalisierung in lebenden Zellen erhalten wurden. R. N. Day (1998) Mol. Endocrinol. 12, 1410–1418 offenbart ein Verfahren zur Visualisierung von Pit-1 Transkriptionsfaktorinteraktionen in lebenden Zellen basierend auf Messungen des Fluoreszenzresonanzenergietransfers nach dem Binden von Pit-1, das mit einem grün fluoreszierenden Protein verschmolzen ist, an einen Östrogenrezeptor, der mit einem blau fluoreszierenden Protein verschmolzen ist.
Das Verfahren zur Detektierung von endokrin wirkenden Substanzen muss alle der folgenden Anforderungen erfüllen: eine sehr kleinen Menge an Substanzen muss detektiert werden können; beim menschlichen Körper muss die Wirkungsweise analog sein; und im Hinblick auf die Ausrüstung, Kosten, Zeitumfang für den Test, usw., muss das Verfahren einfach sein.
Der Östrogenrezeptor ist ein Protein, das zu einer nukleären Hormonrezeptor-Überfamilie gehört. In anderen Worten heißt das, dass der Östrogenrezeptor ein Ligandinduzierbarer transkriptionaler regulatorischer Faktor ist, der die Expression eines Targetgens durch die Bindung eines Liganden wie zum Beispiel eines Östrogenhormons steuert.
Als Östrogenrezeptor war bisher nur ein Östrogenrezeptor α (ERα), der aus 595 Aminosäuren besteht, bekannt. 1996 wurde jedoch eine Unterart des Östrogenrezeptors gefunden, die aus 530 Aminosäuren bestand und die mit ER- α eine hohe Homologie aufweist, und an Östrogen als Ligand binden kann. Dieser wird als Östrogenrezeptor β (ER β) bezeichnet. Das Gen von ER β wurde isoliert.
Beide Arten von Östrogenrezeptoren weisen analoge Strukturen auf. Die Struktur besteht aus vier funktionellen Domänen: eine A/B-Region (Aktivierungsfunktion-1: AF-1) an der N-Terminus-Seite; eine E/F-Region (Aktivierungsfunktion-2: AF-2) an der C-Terminus-Seite, wobei beide eine Fähigkeit zur transkriptionellen Aktivierung haben; und eine C-Region (DNA-bindende Domäne: DBD) mit zwei Zink-Finger-Motiven und einer Fähigkeit zur Bindung von DNA; und einer D-Region mit einem Signal (NLS) zur Verwendung bei der Übertragung eines Östrogenrezeptors selbst in einen Nukleus. Die Hauptregion für den Hormonrezeptor, nämlich eine Ligand-Bindungs-Region, liegt in der E/F-Region.
Der Östrogenrezeptor α (im Nachfolgenden als "ER α" bezeichnet) und der Östrogenrezeptor β (im Nachfolgenden als "ER β" bezeichnet) unterscheiden sich in ihren DNA-Bindungsregionen in nur drei Aminosäuren, und weisen damit eine hohe Homologie auf. Demgegenüber weisen sie in den Ligand-Bindungs-Bereichen eine nur 59%ige Homologie auf. Diese Tatsache legt nahe, dass die zwei Arten von Östrogenrezeptoren jeweils unabhängig unterschiedliche Liganden erkennen.
Ferner wird berichtet, dass ER α und ER β in verschiedenen Geweben exprimiert werden. Es wird zudem berichtet, dass ihr Exprimierungszeitraum unterschiedlich ist, selbst wenn sie im selben Gewebe exprimiert werden. Auf diesen Erkenntnissen basierend wird angenommen, dass ER α und ER β für unterschiedliche biologische Funktionen verantwortlich sind.
In einem Bericht (J-Å Gustafsson, Estrogen receptor β – a new dimension in estrogen mechanism of action. J. Endocrinology 163, 379–383 (1999) vor kurzer Zeit wurde ein interessantes Ergebnis beschrieben, das zeigte, dass ER β im Hoden oder im Eierstock (der von endokrin wirkenden Substanzen beeinflussbar ist) hoch exprimiert vorliegt. Im Hoden ist ER β insbesondere in einem Spermatogonium und einem Spermatocyten exprimiert. Diese Erkenntnis legt nahe, dass ER β in der Spermatogenese eine wichtige Rolle spielt. Insbesondere wird vorausgesetzt, dass eine Verminderung der Anzahl an Spermien sowie eine Spermien-Dysfunktion aufgrund von endokrin wirkenden Substanzen Phänomene sein können, die eher durch ER β als durch ER α verursacht werden.
Wie obenstehend erwähnt ist es denkbar, dass viele endokrin wirkende Substanzen neben ER α auch über ER β eine wesentliche Funktion haben können. Unter diesen Umständen wurde die Entwicklung eines Systems zur effizienten Detektierung einer Substanz, die auf ER β abzielt, gewünscht.
Andererseits wird als kultivierte Zellen in dem Detektierungssystem der obenstehend genannten endokrin wirkenden Substanzen im Allgemeinen ein MCF-7 Stamm verwendet. Leider exprimieren die MCF-7 Zellen ER α mit einer hohen Geschwindigkeit. Aus diesem Grund kann gegenwärtig keine Substanz detektiert werden, die insbesondere an ER β bindet.
Desweiteren wird im Bereich des „Drug Designs" auf die Verbindung, die auf einen Östrogenrezeptor zielt (targets) gescreent. Zu diesem Zeitpunkt kann auf die Verbindung, die gewebespezifisch wirkt, gescreent werden, wenn eine Verbindung, die auf ER α zielt, unabhängig von einer Verbindung, die auf ER β zielt, gescreent wird. Dies führt zur Entwicklung eines Hormonarzneimittels, das geringe Nebenwirkungen aufweist. Daher ist es sehr nützlich, eine Substanz effizient zu detektieren, die ER β als Ziel hat.
Daher ist es Ziel der vorliegenden Erfindung, die obenstehend beschriebenen Probleme zu lösen und die Substanz zu testen, die mit einem Hormonrezeptorprotein interagiert. Um diese Aufgaben zu lösen, zielt die vorliegende Erfindung auf die Erstellung eines einfachen Bewertungssystems ab, das zu einem lebenden Körper analog ist und in der Lage ist, das Verhalten einer sehr kleinen Menge an Molekülen zu detektieren.
Offenbarung der Erfindung
Ein Verfahren zur Untersuchung einer erfindungsgemäßen Substanz, die mit einem Hormonrezeptor interagiert, ist durch die Merkmale der anhängenden Ansprüche gekennzeichnet.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist eine schematische Ansicht, die ein Fusionsgen-tragendes Expressionsplasmid zeigt.
2 ist eine mikroskopische Aufnahme, die eine kultivierte Zelllinie zeigt, in die GERb3-9-1 Plasmid eingeschleust wurde.
3 ist eine Darstellung eines Verfahrens zur Detektierung von östrogenartigen endokrin wirkenden Substanzen.
4A und 4B sind Graphen, die die Merkmale der Anregungswellenlänge, beziehungsweise der Lumineszenzwellenläge, der fluoreszierenden Proteine zeigen.
5 ist eine schematische Abbildung, die Mittel zum Screenen der Zellen, die zur Detektion durch FCS geeignet sind, zeigt.
6 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse der FCS Messungen, bei denen die Menge an Fluoreszenz verändert wurde, zeigt.
7 ist ein Graph, der eine Autokorrelationsfunktion zeigt, wenn die Zellen, die geeignete Fluoreszenzintensität aufweisen, gemessen werden.
8 ist eine schematische Ansicht des Inneren einer Zelle während der FCS-Messung.
9 ist eine Abbildung, die einen Teil der Nukleotidsequenz eines Fusionsgens zeigt.
10 ist ein Graph, der die durch Durchflusscytrometrie analysierten Ergebnisse zeigt.
11 ist eine Darstellung, die die durchschnittliche Fluoreszenzintensität bei einzelnen Klonen einer Zelle, in die ein GFP-Gen eingeschleust wurde, zeigt.
12 ist eine Darstellung, die die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von einzelnen Klonen einer Zelle, in die ein YFP-Gen eingeschleust wurde, zeigt.
13 ist eine Darstellung, die die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von einzelnen Klonen einer Zelle, in die ein CFP-Gen eingeschleust wurde, zeigt.
14 ist ein Graph, der die Ergebnisse zeigt, die durch FCS-Messung unmittelbar nach (0 Minuten) und 45 Minuten nach dem Hinzufügen von 17 β-Estradiol zeigt.
Bestes Verfahren zur Durchführung der Erfindung
Bei dem Verfahren zur erfindungsgemäßen Untersuchung von endokrin wirkenden Substanzen in einer lebenden Zelle wird ein Rezeptor mit einer Markersubstanz markiert, und ein Ligand sowie eine Testsubstanz werden nicht markiert.
Als Hormonrezeptor kann bei der vorliegenden Erfindung ein beliebiger Hormonrezeptor verwendet werden, solange er eine Änderung des Zustands durch Binden seines natürlichen Liganden verursacht, was zu einer Veränderung hinsichtlich der detektierbaren Charakteristika des optischen Signals führt, das von der Markersubstanz emittiert wird. Der Hormonrezeptor kann ein Rezeptor, der an einer Zellmembran positioniert ist, ein Rezeptor, der in einer Zelle vorliegt, oder ein intranukleärer Rezeptor sein. Bevorzugt ist von diesen der Rezeptor, der innerhalb einer Zelle vorliegt, und besonders bevorzugt ist der intranukleäre Rezeptor. Beispiele für bevorzugte Hormonrezeptoren sind Rezeptoren, die zu einer nukleären Hormonrezeptor-Superfamilie gehören, z.B. ein Östrogenrezeptor, ein Progesteronrezeptor, ein Thyroidhormonrezeptor und ein Glucocorticoidrezeptor. Das besonders bevorzugte Rezeptorprotein ist ein Estrogenrezeptorprotein, das herkömmlicherweise zum Detektieren von endokrin wirkenden Substanzen verwendet wird. Von den Östrogenrezeptoren ist ein humaner Östrogenrezeptor β (hierin "hER β" bezeichnet) am meisten bevorzugt. Dies liegt darin, dass es erwünscht ist, eine Substanz zu detektieren, die via hER β eine endokrine Wirkung hervorruft, wie in dem Absatz über den Stand der Technik erläutert wurde.
In der vorliegenden Erfindung kann eine beliebige Substanz als Markersubstanz zur Markierung des Hormonrezeptorproteins verwendet werden, solange sie ein detektierbares optisches Signal emittiert. Es können entweder eine lumineszierende Substanz oder eine fluoreszierende Substanz verwendet werden. Zur Untersuchung einer Veränderung des Zustandes des intrazellulären Hormonrezeptorproteins während eine Zelle am Leben erhalten wird, ist eine bevorzugte Markersubstanz eine, die für die Zelle nicht toxisch ist und in Abwesenheit eines Substrats Licht emittiert. Es ist: insbesondere ein fluoreszierendes Protein bevorzugt. Beispiele für die fluoreszierenden Proteine umfassen GFP (grün fluoreszierendes Protein), CFP (cyan fluoreszierendes Protein), YFP (gelb fluoreszierendes Protein) and RFP (rot fluoreszierendes Protein). Diese fluoreszierenden Proteine sind mit einem Hormonrezeptorprotein verschmolzen und das resultierende Fusionsprotein kann durch eine allgemein bekannte rekombinante Gentechnik werden, wie später beschrieben werden wird.
Bei der vorliegenden Erfindung umfassen Veränderungen des Zustandes des Hormonrezeptorproteins zum Beispiel eine Veränderung des apparenten Molekulargewichtes des Hormonrezeptors. So wird zum Beispiel die Veränderung des apparenten Molekulargewichtes durch Dimerisation des Hormonrezeptorproteins/Testsubstanz-Komplexes induziert. Diese Veränderung des Zustandes kann nicht nur eine Veränderung eines einzelnen Zustandes, sondern auch eine Veränderung einer Mehrzahl von Zuständen umfassen. Jede dieser Zustandsänderungen stellt einen Signal-Transduktions-Pfad zur Expression der physiologischen Aktivität eines Hormons dar.
Eine Veränderung eines detektierbaren Merkmals des optischen Signals, das von der Markersubstanz emittiert wird, kann eine Wellenlängenveränderung des zu detektierenden optischen Signals umfassen, eine Veränderung bei der intrazellulären Verteilung (Lokalisation) des zu detektierenden optischen Signals, und eine Veränderung der durch eine Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (im Nachfolgenden „FCS" bezeichnet) zu detektierenden Fluoreszensintensität. Jedoch muss das Mittel zur Erfassung der Veränderung eines detektierbaren Merkmals des optischen Signals nicht auf diese beschränkt sein. Auf jeden Fall muss die Veränderung des detektierbaren Merkmals des optischen Signals einer Veränderung des Zustands zugeschrieben werden, die durch die Bindung des natürlichen Liganden an den Hormonrezeptor verursacht wird.
Es ist zu beachten, dass FCS ein Verfahren zur exakten Messung mikroskopischer Bewegungen von einzelnen Targetmolekülen ist. Insbesondere wird FCS durch Messung der Fluktuationsbewegung des Targetmoleküls, das mit Fluoreszenz in einem Medium markiert ist, und nachfolgendem Analysieren der Messungsergebnisse durch eine Autokorrelationsfunktion (Literaturhinweis: D. Magde und E. Elson, "Fluorescence correlation spectroscopy II. An experimental realization", Biopolymers 13(1) 29–61) durchgeführt. Das in der vorliegenden Erfindung angewendete FCS-Prinzip wird wie folgt beschrieben: Bei FCS wird ein fluoreszierendes Signal, das in einer Probe von einem Mikrosichtfeld emittiert wird, durch eine Mikroskopie mengenmäßig bestimmt. Da sich die Targetmoleküle, die mit Fluoreszenz markiert sind, in einem Medium bewegen, variiert der mengenmäßige Wert der Fluoreszenzintensität je nach dem wie häufig die Targetmoleküle in das Mikrosichtfeld kommen und wie lang die Targetmoleküle in dem Mikrofeld verbleiben. Genauer gesagt verlangsamt sich die Bewegung der Targetmoleküle und die apparente Anzahl an Molekülen nimmt ab, wenn sich das apparente Molekulargewicht aufgrund der Dimerisation erhöht. Daraus folgt, dass die Häufigkeit der Targetmoleküle, die ins Mikrosichtfeld kommen, sinkt, mit dem Ergebnis, dass sich die detektierte Fluoreszenzintensität verändert. Aus diesem Grund kann die Veränderung des apparenten Molekulargewichtes des Targetmoleküls überwacht werden, indem die Veränderung der Fluoreszenzintensität gemessen wird.
Da die molekulare Fluktuation in dem Mikrofeld durch FCS detektiert werden kann, ist die FCS-Analyse für eine spezifische Detektion der intermolekularen Interaktion mit einer hohen Empfindlichkeit verwendbar. Die FCS-Analyse wird wie folgt durchgeführt: Zuerst wird die Brownsche Bewegung von fluoreszierenden Molekülen, die in einer Lösung vorliegen, durch ein konfokales Lasermikroskop in einem Mikrofeld detektiert. Danach wird die Diffusionszeit auf der Basis der Schwankung der Fluoreszenzintensität analysiert.
Basierend auf der Diffusionszeit wird eine physikalische Menge, wie zum Beispiel Anzahl und Größe der Moleküle, bestimmt.
Zur Messung der Bewegung der intrazellulären organischen Moleküle durch FCS, müssen die organischen Targetmoleküle mit einer Markersubstanz markiert werden, die Fluoreszenz ausstrahlt, wobei die Funktion der Zellen unverändert beibehalten wird. Beispiele der herkömmlichen Markersubstanzen, die Fluoreszenz ausstrahlen, umfassen FITC, Rhodamin, Cy3 (erhältlich von Amarsham Pharmacia), Cy5 (erhältlich von Amarsham Pharmacia), und PI (Propidiumiodid). Jedoch sind die meisten dieser Markersubstanzen cytotoxisch. Aufgrund der cytotoxischen Wirkung war es bisher schwierig, die Bewegung der intrazellulären organischen Moleküle durch FCS zu messen.
Über biologische Anwendungen von FCS wird in den Dokumenten (Cell Mol. Biol. 44(5), 857–879 (1998); Biochemistry, 37, 12971–12978 (1998)) berichtet. Jedoch hat niemand die Erfindung offenbart, die sich darauf konzentriert, dass auf eine Substanz, die mit dem Hormonrezeptor interagiert (z.B. endokrin wirkende Substanzen), gescreent wird, indem FCS an einem intrazellulären Hormonrezeptor, der zur Analysierung des Hormonrezeptors mit Fluoreszenz markiert ist, angewendet wird.
In der vorliegenden Erfindung betreffen die vorbestimmten Bedingungen diejenigen, bei denen ein natürlicher Ligand an den Hormonrezeptor binden und eine Veränderung des Zustands wie obenstehend beschrieben bewirken kann. Die vorbestimmten Bedingungen können entweder in der kultivierten Zelle oder in der Lösung, die in einer Testkammer enthalten ist, vorliegen. Wird die kultivierte Zelle als Testsystem verwendet, können humane kultivierte Zellen wie zum Beispiel MCF-7 und HeLa, sowie nicht-humane Säugetierzellen einschließlich CHO-Zellen von einem chinesischen Hamster verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung betrifft die Testsubstanz eine beliebige chemische Substanz außer einem natürlichen Liganden für den Hormonrezeptor. Aus diesem Grund kann eine beliebige Substanz verwendet werden, bei der eine endokrine Wirkung vermutet wird.
Bei der vorliegenden Erfindung werden die vorbestimmten Bedingungen beibehalten, nachdem die Testsubstanz hinzugefügt wurde, wobei die Testsubstanz an den Hormonrezeptor gebunden wird, wenn die Testsubstanz ein endokrin wirkender Faktor ist, der auf den Hormonrezeptor reagiert. Als Ergebnis kann dieselbe Reihe an biochemischen Reaktionen stattfinden, wie diejenige, die durch Binden des natürlichen Liganden an den Rezeptor verursacht wird. Zu diesem Zeitpunkt verändert sich der Zustand des Rezeptors und dabei verändert sich auch das optische Signal, das von der Markersubstanz emittiert wird. Aus diesem Grund kann man durch Detektieren der Veränderung des optischen Signals feststellen, ob die Testsubstanz den endokrin wirkenden Substanzen entspricht. Tritt keine Veränderung des optischen Signals vor und nach dem Hinzufügen der Testsubstanz auf, interagiert die Testsubstanz nicht mit dem Hormonrezeptor, was zeigt, dass die Testsubstanz keiner endokrin auf den Hormonrezeptor wirkenden Substanz entspricht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Hormonrezeptor, der mit Fluoreszenz markiert ist, dazu gebracht, dass er in einer Zelle exprimiert, um einen Mechanismus zu bilden, der einem lebenden Körper entspricht. In dieser Beziehung unterscheidet sich die vorliegende Erfindung sehr von dem herkömmlichen Fall, bei dem der Ligand markiert wird.
Die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht insbesondere wie folgt aus: 1) Ein rekombinantes Gen wird hergestellt, indem ein Gen, das das Hormonrezeptorprotein, das in einem lebenden Körper vorliegt, kodiert, mit einem Gen, das eine Markersubstanz, die in der Lage ist, ein optisches Signal zu emittieren, kodiert, zu kombinieren. Dafür wird ein Expressionsvektor (im Nachfolgenden Expressionsplasmid bezeichnet), der das rekombinante Gen (d.h. das Fusionsgen) enthält, konstruiert. Danach 2) wird der Expressionsvektor, der das Fusionsgen, enthält, in eine kultivierte Zelle eingebracht, so dass das Fusionsprotein, das den Hormonrezeptor und die Markersubstanz, die ein optisches Signal emittiert, umfasst, in der Zelle exprimiert werden kann. Danach, 3) wird die Testsubstanz der Zelle hinzugefügt, die das Fusionsprotein exprimiert, das den Hormonrezeptor und die Markersubstanz umfasst. Die intrazelluläre Signaltransduktion über das Fusionsprotein wird durch das Hinzufügen der Testsubstanz induziert. Die Signalumwandlung wird durch das Messen des optischen Signals über einen vorbestimmten Zeitraum detektiert, indem mittels FCS oder einem Fluoreszenzmikroskop ein innerer Bereich der Zelle fokussiert wird. So ist es möglich, die Interaktion zwischen der Testsubstanz und dem Rezeptormolekül zu detektieren. Auf dieser Basis wird die Testsubstanz hinsichtlich der endokrin wirkenden Aktivität bewertet. Der Ausdruck "ein innerer Bereich der Zelle" kann sich auf den gesamten Bereich innerhalb der Zelle oder auf einen Teil des intrazellulären Bereiches beziehen. Als Teil des intrazellulären Bereiches kann ein beliebiger intrazellulärer Bereich verwendet werden. Wird die Messung durch FCS durchgeführt, folgt daraus, dass ein bestimmter Bereich innerhalb der Zelle gemessen wird.
Im Folgenden werden der Reihe nach nähere Angaben zu den obenstehend genannten 1) bis 3) gemacht.
1) Herstellung des Fusionsgens und Konstruktion des Expressionsplasmids.
Wie voranstehend erwähnt, ist das Gen, das ein Hormonrezeptorprotein kodiert, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nicht beschränkt, solange es als detektierbare Veränderung, ein optisches Signal, das emittiert wird, wenn ein natürlicher Ligand an das Rezeptorprotein bindet, im Vergleich zu dem optischen Signal, das vor der Bindung des Liganden von dem Rezeptorprotein emittiert wird, nachgewiesen werden kann. Desweiteren wird das hER β-Gen am meisten bevorzugt verwendet, wie obenstehend erwähnt, da es erwünscht war, eine Substanz zu detektieren, die über einen humanen Östrogenrezeptor β (im Nachfolgenden als "hER β" bezeichnet) eine endokrine Wirkung hervorruft. Jedoch ist das Gen, das das Hormonrezeptorprotein kodiert, in der vorliegenden Erfindung nicht auf das hER β-Gen beschränkt.
Als Gen, das das Hormonrezeptorprotein kodiert, kann in der vorliegenden Erfindung ein beliebiges Gen verwendet werden, so lange es mindestens einen kodierenden Bereich enthält, der einen Code für die Aminosäuresequenz des Hormonrezeptorproteins umfasst, in anderen Worten, eine Gensequenz vom Startcodon bis zum Stoppcodon. Insbesondere kann das Gen eine beliebige Länge einer Sequenz upstream des Startcodons und eine Sequenz downstream des Stoppcodons aufweisen, so lange es die Expression des Hormonrezeptorproteins nicht negativ beeinflusst.
So reicht es zum Beispiel aus, dass das humane Östrogenrezeptor-β Gen (Sequenz der cDNA wird durch Sequenz-ID Nr. 1 dargestellt) die Nukleotidsequenz des Codierungsbereiches von der 99. bis zur 1688. Position umfassen kann. Das Fusionsgen, das tatsächlich in der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, hat die Sequenz der 53. bis 1735. Position des hER β-Gens, wie nachfolgend in den Beispielen gezeigt. Die Länge der Sequenz des hER β-Gens im Fusionsgen variiert je nach den Klonierungsbedingungen des hER β-Gens und den Herstellungsbedinungen des Fusionsgens. Aus diesem Grund sollte die Länge der Sequenz des hER β-Gens nicht auf diejenige der unten aufgeführten Beispiele beschränkt sein.
Das Gen, das die Markersubstanz kodiert, die mit dem Hormonrezeptorgen verschmilzt, ist nicht besonders eingeschränkt, so lange es ein Gen einer Substanz ist, die in der Lage ist, ein detektierbares optisches Signal zu emittieren. Als Gen, das die Markersubstanz kodiert, kann ein Gen verwendet werden, das entweder eine lumineszierende Substanz oder eine Substanz, die Fluoreszenz emittiert, kodiert. Zudem kann das Gen, das eine Markersubstanz kodiert, eine beliebige Sequenzlänge aufweisen, so lange das Gen den kodierenden Bereich der Markersubstanz aufweist und die Markersubstanz exprimieren kann.
Als Gen für die Markersubstanz ist ein Gen des fluoreszierenden Proteins bevorzugt. Beispiele für das Gen, das das fluoreszierende Protein kodiert, umfassen die Gene von GFP (grün fluoreszierendes Protein), CFP (cyan fluoreszierendes Protein) und YFP (gelb fluoreszierendes Protein). Diese Fluoreszenzproteingene sind in der Form in der sie in Expressionsvektoren eingebracht werden können im Handel erhältlich. Im Hinblick auf die Herstellung und die Expression des Fusionsgens ist es wünschenswert, die im Handel erhältlichen Gene der fluoreszierenden Proteine zu verwenden.
Das Gen, einen Hormonrezeptor kodiert, wird mit dem Gen, das eine Markersubstanz kodiert, wie folgt verschmolzen: Zunächst wird ein gewünschter Hormonrezeptor durch Klonen isoliert. Danach wird ein auf diese Weise hergestellter Hormonrezeptor an das Gen für die Markersubstanz ligiert, das vorher in einen Expressionsvektor eingebracht worden war.
Für die Ligation umfasst die Sequenz des Bindungsabschnittes des Markersubstanzgens und des Rezeptorgens eine Sequenz mit einer beliebigen Multiklonierungsstelle.
Die Sequenz der Multiklonierungsstelle ist nicht besonders eingeschränkt, so lange sie die Spaltung mit Restriktionsenzymen und die Ligation mit Ligase ermöglicht. Ferner ist sie nicht beschränkt, solange sie eine Länge aufweist, mit der sie die Expression des Fusionsproteins nicht nachteilig beeinflusst.
Geeigneterweise wird ein im Handel erhältlicher Expressionsvektor verwendet, bei dem das Gen für die Markersubstanz bereits eingebracht wurde. 1 zeigt ein Beispiel des obenstehend genannten Expressionsvektors pEGFP-C1. Dieser Expressionsvektor weist ein Gen auf, das grün fluoreszierendes Protein als Gen für die Markersubstanz kodiert (in der Figur EGFP) und zudem die Multiklonierungsstelle (in der Figur MCS) downstream des EGFP-Gens umfasst. Das Fusionsgen mit dem EGFP-Gen kann hergestellt werden, indem ein beliebiges Gen in die MCS eingebracht wird. Ferner kann das Fusionsgen mit hoher Frequenz in eine kultivierte Säugetierzelle exprimiert werden, wobei es durch den Promoter reguliert wird (in der Figur CMV IE), der upstream davon angesiedelt ist. Der Vektor umfasst ein Arzneimittel-resistentes Markergen (Kan^r/Neo^r), das zum Screenen der Zelle, die den Vektor in sich enthält, verwendet werden kann. Desweiteren dient die Multiklonierungsstelle, die in dem Expressionsvektor vorliegt, als Verbindung, wenn das Markersubstanzgen, das vorher in den Expressionsvektor eingebracht wurde, mit dem Rezeptorgen ligiert wird.
Wie obenstehend beschrieben ist es durch die Verwendung eines gewünschten Expressionsvektors, der das Gen für die Markersubstanz enthält, möglich, das Fusionsgen herzustellen und das Expressionsplasmid zu konstruieren.
2) Transfektion einer Zelle mit dem Expressionsplasmid und Expression des Fusionsproteins.
Eine Zelle wird mit dem Expressionsplasmid, das das obenstehend konstruierte Fusionsgen enthält, transfiziert. Bevorzugt wird eine humane kultivierte Zelle für die Transfektion verwendet, um die endokrine Wirkung im Menschen zu bewerten. Als Beispiel für eine humane kultivierte Zelle kann ein Zellstamm aus einem humanen Brustkrebsgewebe genannt werden. Die Transfektion kann in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren, wie zum Beispiel einem Lipofectionsverfahren, einem Calciumphosphat-Verfahren oder einem Elektorporationsverfahren durchgeführt werden. Das Elektroporationsverfahren (untenstehend in den Beispielen beschrieben) wird jedoch bevorzugt verwendet, da eine Plasmid-DNA auf einen effiziente Weise eingeführt werden kann.
Danach wird unter den so transfizierten Zellen auf wirkstoffresistente transfizierte Zellen gescreent. Auf diese Weise kann eine stabile transfizierte Zelllinie etabliert werden. In der vorliegenden Erfindung ist es, wie obenstehend erwähnt, bevorzugt, dass das Expressionsplasmid, das das arzneimittelunempfindliche Markergen enthält, zum Screenen der transfizierten Zellen verwendet wird.
Die obenstehend genannten transfizierten Zellen exprimieren des Fusionsgen unter Kontrolle des Promoters im Expressionsplasmid. Das exprimierte Fusionsprotein kann ein optisches Signal emittieren, während die Funktion des Hormonrezeptors beibehalten wird. So lange das Protein die obenstehend genannten Bedingungen erfüllt, kann eine einzelne oder wenige Aminosäuren von der Aminosäurensequenz des Proteins gelöscht werden, ein einzelnes oder ein paar Aminosäuren des Proteins können verschoben werden, oder eine einzelne oder ein paar Aminosäuren können der Aminosäuresequenz des Proteins hinzugefügt werden.
3) Detektion der endokrin wirkenden Aktivität einer Testsubstanz, die durch einen Hormonrezeptor vermittelt wird.
Wird eine Testsubstanz einer Zelle, die das Fusionsprotein aus dem Hormonrezeptor und der Markersubstanz exprimiert, oder dem gereinigten Fusionsprotein hinzugefügt, kann die Zustandsänderung des Hormonrezeptorproteins anschließend induziert werden. Die Zustandsänderung wird durch FCS oder ein optisches Mikroskop detektiert. Auf diese Weise kann die endokrine Wirkung der Testsubstanz bewertet werden.
Im Folgenden erläutern wir eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, d.h. einen bevorzugter Fall, bei dem die endokrine Wirkung der Testsubstanz durch das Hinzufügen der Testsubstanz in die Zelle, die das Fusionsprotein des Östrogenrezeptors und die Markersubstanz exprimiert, oder durch Hinzufügen zum gereinigten Fusionsprotein, bewertet wird.
Zunächst werden der Östrogenrezeptor an sich und dessen Wirkungsweise erläutert.
Wie obenstehend erwähnt, ist der Östrogenrezeptor ein Protein, das zu einer intranukleären Hormonrezeptor-Überfamilie gehört, auch als Ligand-induzierbarer transkriptionaler regulatorischer Faktor bekannt, der für die Expression eines Targetgens durch die Bindung eines Liganden wie zum Beispiel eines Östrogens verantwortlich ist.
Das Östrogenrezeptorprotein bewegt sich nach dessen Erzeugung im Cytoplasma schnell in den Nukleus und legt sich für gewöhnlich örtlich auf den Nukleus fest. Auch die Lokalisierung des Östrogenrezeptorproteins in einem Nukleus wird in der vorliegenden Erfindung gezeigt, wie in 2 zu sehen.
Die beiden Rezeptoren bilden das Dimer, wenn ein Ligand (z.B. Östrogen) durch die Zellmembran passiert, in eine Zelle kommt und sich an den Östrogenrezeptor bindet. Das Dimer erkennt eine bestimme Nukleotidsequenz der internukleären DNA (Sequenz für das Östrogen-responsive Element: ERE), und bildet dabei einen Komplex aus Rezeptor/DNA. Der Rezeptor/DNA Komplex wird durch einen Koaktivator, der in dem Nukleus vorhanden ist, aktiviert, wobei die Transkription eines Gens, das downstream der ERE liegt, beschleunigt wird.
In Anbetracht der Wirkungsweise des oben genannten Östrogenrezeptors hatten wir die Idee, dass östrogenartige endokrin wirkende Substanzen in den folgenden drei Schritten detektiert werden können, wie in 3 gezeigt.

(1) Schritt I: Östrogenartige endokrin wirkende Substanzen werden an den Östrogenrezeptor (im Nachfolgenden "ER" bezeichnet) gebunden, wobei ein ER Dimer gebildet wird.
(2) Schritt II: Das ER Dimer bindet an eine östrogenresponsive Elementsequenz, (im Nachfolgenden "ERE" bezeichnet) auf der chromosomalen DNA.
(3) Schritt III: Der Komplex aus ER Dimer und dem ERE (d.h. ER/ERE Komplex) wird aktiviert, so, dass das Gen, das downstream des ERE positioniert ist, exprimiert wird.

Auf der Basis der obenstehend genannten Idee wurde das Verfahren zur Detektierung von endokrin wirkenden Substanzen entwickelt, wie es untenstehend beschrieben ist.
8 zeigt eine schematische Ansicht, bei der die intrazelluläre Signaltransduktion des Hormonrezeptormoleküls durch FCS detektiert wird. Insbesondere zeigt "A" in 8, dass sich als ein Ergebnis der Dimerisation das Molekulargewicht erhöht und sich die Anzahl an Molekülen verringert, und dass diese Erscheinungen als eine Veränderung der Autokorrelationsfunktion durch FCS detektiert werden. "B" in 8 zeigt, dass sich durch Bindung der Moleküle an den DNA-spezifischen Bereich die Anzahl an Molekülen verringert und dass diese Erscheinung als eine Veränderung der Autokorrelationsfunktion durch FCS detektiert wird.
(1) Detektion in Schritt I, bei der ER dimerisiert wird.
(In diesem Fall wird FCS zur Detektion verwendet).
Gemäß einem Verfahren zur Herstellung des obenstehend genannten Fusionsproteins wird ein Fusionsgen, das ein ER-Gen und ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) umfasst, hergestellt, und in eine Zelle eingebracht, wobei die Expression des ER/GFP-Fusionsproteins in die Zelle gestattet wird.
Bindet ER einen Liganden (östrogenartige endokrin wirkende Substanzen) und bildet dabei ein ER-Dimer, kann die Bildung des Dimers durch FCS als eine Veränderung des Molekulargewichts und eine Veränderung der Anzahl an Molekühlen des ER/GFP fluoreszierenden Fusionsproteins detektiert werden (siehe 8, A (Dimerisation).
Ferner kann bei der FCS-Detektion, das in eine Zelle exprimierte ER/GFP Fusionsprotein aus der Zelle extrahiert, gereinigt und verwendet werden.
(In diesem Fall wird die Veränderung der Wellenlänge der Fluoreszenz durch ein Fluoreszensmikroskop detektiert)
Es ist bekannt, dass ER zwei Unterarten, ER α und ER β, hat. Es werden Dimere gebildet, wie zum Beispiel αα, αβ, und ββ.
Die Fusionsgene werden durch die Verbindung von ER α mit ER β-Genen zu Genen, die fluoreszierende Proteine CFP bzw. YFP kodieren, hergestellt. Dabei werden ER α/CFP, bzw. ER α/YEP Fusionsproteine erzeugt. Das hierin verwendete CFP ist ein cyan fluoreszierendes Protein (maximale Anregungswellenlänge: 433, 453 nm/Wellenlänge mit maximaler Fluoreszenzemission 475, 501 nm). Das hierin verwendete YFP ist ein gelb fluoreszierendes Protein (maximale Anregungswellenlänge: 513 nm/Wellenlänge mit maximaler Fluoreszenz 527 nm). Die Merkmale der Anregungswellenlängen und der Fluoreszenzemissions-Wellenlängen der fluoreszierenden Proteine CFP und YFP sind in den 4A und 4B dargestellt.
Das ERα/CFP Fusionsprotein emittiert eine Fluoreszenz von 501 nm durch Ausstrahlung von Licht mit einer Wellenlänge von 453 nm, wohingegen ein ERβ/YEP Protein nicht durch die Strahlung von Licht mit einer Wellenlänge um die 453 nm angeregt wird. Dementsprechend wird von ERβ/YEP keine Fluoreszenz emittiert. Ist kein Ligand vorhanden, liegt aus diesem Grund jedes der Fusionsproteine unabhängig voneinander vor, so dass nur das ERα/CFP durch Ausstrahlung von Licht im Bereich von 453 nm, bei dem blaue Fluoreszenz emittiert wird, angeregt wird.
Andererseits, wenn das Dimer von ERα/CFP und ERβ/YEP in Gegenwart eines Liganden gebildet wird, wird zunächst eine Fluoreszenz von 501 nm von dem ERα/CFP Fusionsprotein durch Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge von 453 nm emittiert. Die auf diese Weise emittierte Fluoreszenz regt dann das ERβ/YEP Fusionsprotein an, das aufgrund der Dimerbildung in unmittelbarer Umgebung zu dem ERα/CFP Fusionsprotein vorliegt. Als ein Ergebnis wird eine gelbe Fluoreszenz von etwa 527 nm von dem ERβ/YEP Fusionsprotein emittiert. Aus diesem Grund kann die Anwesenheit und Abwesenheit des Dimers von ER α und ER β überwacht werden, indem kontrolliert wird, ob eine Fluoreszenz im Bereich von 527 nm durch die Ausstrahlung von Licht im Bereich von 453 nm erhalten wird. Die Dimerisation von ER α und ER β kann aufgrund einer Wellenlängenänderung der emittierten Fluoreszenz detektiert werden.
Wenn einzelne ERα-Rezeptoren mit CFP und YFP markiert werden, ist es alternativ auch möglich, ein αα-Dimer zu detektieren. Wenn einzelne ERβ-Rezeptoren mit CFP bzw. YFP markiert werden, ist es entsprechend auch möglich, ein ββ-Dimer zu detektieren.
(2) Detektion in Schritt II, in der das ER-Dimer an die östrogen-responsive Elementsequenz (ERE) bindet
(Detektionssystem in einer Zelle)
Das Fusionsgen, das das ER-Gen und das GFP-Gen umfasst, wird hergestellt und in eine Zelle eingebracht, wobei die Expression des ER/GFP-Fusionsproteins in die Zelle gestattet wird.
ER bindet einen Liganden (östrogenartige endokrin wirkende Substanzen), wobei danach ein Dimer gebildet wird, und das Dimer ferner an die ERE-Sequenz der chromosomalen DNA in einem Nukleus bindet. Dieses Phänomen kann durch FCS auf der Basis einer Veränderung in der Anzahl der fluoreszierenden Moleküle des ER/GFP-Fusionsprotein detektiert werden, insbesondere auf der Basis einer Verringerung der Anzahl der fluoreszierenden Moleküle des ER/GFP-Fusionsproteins, das in dem Nukleus suspendiert ist (siehe 8, B (Bindung an einen bestimmten Bereich der DNA).
Alternativ kann diese Erscheinung auch anhand der Veränderung in der intrazellulären Verteilung des optischen Signals, das von den fluoreszierenden Molekülen emittiert wird, detektiert werden. Insbesondere kann der Zustand des Bindens des intranukleären ER/GFP fluoreszierenden Fusionsproteins an die ERE-Sequenz der chromosomalen DNA mittels eines Fluoreszenzmikroskops detektiert werden, indem mit dem Zustand verglichen wird, in dem das fluoreszierende Protein nicht an die ERE-Sequenz bindet (der Zustand, in dem das Fluoreszenzprotein in den Nukleus gleitet) basierend auf der Differenz in der intranukleären Verteilung der Fluoreszenz.
Ferner kann bei der Verwendung von FCS zur Detektion, das in eine Zelle exprimierte ER/GFP Fusionsprotein aus der Zelle extrahiert, gereinigt und verwendet werden, wie untenstehend beschrieben.
(Zellfreies Detektionssystem)
Das Fusionsgen, das das ER-Gen und das GFP-Gen umfasst, wird hergestellt und dann wird das ER/GFP-Fusionsprotein in großer Menge hergestellt und gereinigt. Andererseits werden 15 Mer Oligonukleotide, ERE, synthetisiert. Beide Präparate werden zusammen in einer Lösung suspendiert, wobei ein ER/ERE-System ohne die Verwendung von Zellen konstruiert wird. Wird dem ER/ERE-System eine Testsubstanz hinzugefügt, bindet das ER einen Liganden, der ein Dimer bildet, das ferner an ERE bindet. Die Erscheinung kann durch FCS detektiert werden, auf der Basis der strukturellen Veränderung und der Veränderung des Molekulargewichtes des fluoreszierenden Moleküls des ER/GFP-Fusionsproteins.
(3) Detektion in der Schritt III, bei der ein Targetgen transkribiert und translatiert wird.
Das ER/GFP-Fusionsgen wird in eine Zelle transfiziert. Ferner wird ein Reportergen, das ein Gen ist, das in der Lage ist, eine optische Markersubstanz zu exprimieren, in die Zelle eingeschleust. Auf diese Weise wird ein Assaysystem konstruiert, bei dem das Gen, das die optische Markersubstanz kodiert, transkribiert wird, wenn ER einen Liganden bindet. In anderen Worten, das Assaysystem wird gebaut, indem das Reportergen, das eine östrogen-responsive Elementsequenz in seinem die Expression steuernden Bereich aufweist und in der Lage ist, die optische Markersubstanz zu exprimieren, in die kultivierten Zellen transfiziert wird. Wird eine Testsubstanz hinzugefügt, wird die Menge des Produktes des Reportergens, d.h. die Fluoreszenzmenge der optischen Markersubstanz, durch FCS detektiert, oder durch ein Fluoreszenzmikroskop, einen Microplate Reader oder ähnliches. Auf diese Weise kann eine endokrin wirkende Substanz detektiert werden.
Zudem kann außer GFP als fluoreszierendes Protein, das in dem obenstehend genannten Detektionssystem verwendet werden soll, ein weiteres fluoreszierendes Protein verwendet werden, wie zum Beispiel CFP und YEP. Gleichermaßen kann als fluoreszierendes Protein, das als Produkt des Reportergens verwendet wird, ein beliebiges fluoreszierendes Protein verwendet werden. Ferner kann außer einem Östrogenrezeptor auch ein anderer Hormonrezeptor, wie zum Beispiel ein Glucocorticoidrezeptor, als Rezeptormolekül verwendet werden.
Wie obenstehend beschrieben, wurde versucht, die zeitabhängige intrazelluläre Bewegung des Hormonrezeptormoleküls zu detektieren, und dabei versuchten die Erfinder der vorliegenden Erfindung das intrazelluläre Hormonrezeptormolekül zu markieren, und dabei die Zellen am Leben zu erhalten. Um dieses Ziel zu erreichen, verwendeten die Erfinder der vorliegenden Erfindung ein Mittel zur Expression des Fusionsgens, das ein Fluoreszenzsubstanzgen und ein Hormonrezeptorgen, wie oben beschrieben, umfasst.
Andererseits wurde die FCS-Analyse exklusiv zur Detektierung der Fluktuation der fluoreszierenden Moleküle in einem zellfreien Lösungssystem verwendet. Das zellfreie Lösungssystem, das hierin verwendet wird, betrifft nicht ein intrazelluläres System, das ein Fluoreszenz-markiertes intrazelluläres biologisches Molekül exprimiert, sondern es betrifft ein Lösungssystem, in dem Fluoreszenz-markierte Moleküle suspendiert sind. In Fall eines zellfreien Lösungssystems war es relativ leicht, die Anzahl an fluoreszierenden Molekülen vor der FCS-Messung anzupassen. Bei der FCS-Messung muss die Konzentration der fluoreszierenden Moleküle in einer Probe in den beschränkten Bereich fallen, in dem eine ordnungsgemäße Messung durchgeführt werden kann. Ist die Konzentration in der Probe geringer oder höher als der Bereich, kann keine ordnungsgemäße Messung durchgeführt werden. Daher ist es notwendig, den Vorgang der Anpassung der Anzahl an fluoreszierenden Molekülen durchzuführen.
Jedoch ist es in dieser Erfindung schwierig, die Konzentration (die exprimierte Menge) der Fluoreszenz-markierten biologischen Moleküle in der Zelle zu steuern, die erhalten wird, indem ein Fusionsgen eines Targetgens mit einem fluoreszierenden Proteingen hergestellt wird, und das Fusionsgen in die Zelle transfiziert wird. Tatsächlich ist es sehr schwierig, jedes Mal, wenn die Zellen, die die fluoreszierenden Moleküle exprimieren, durch Einbringen von deren Genen hergestellt werden, in einer Zelle eine optimale intrazelluläre Konzentration an fluoreszierenden Molekülen zur FCS-Messung zu reproduzieren. Daher ist es wichtig, eine Zelllinie zu etablieren, bei der die Fluoreszenz-markierten biologischen Moleküle stabil bei einer geeigneten Konzentration für die FCS-Messung exprimiert sind, nicht nur, um die Verwendung von Zellen, die für die FCS-Messung nicht geeignet sind zu umgehen, sondern auch, um Daten mit einer guten Reproduzierbarkeit in der Analyse der physiologischen Funktion zu erhalten. Ferner ist die Bildung eines experimentellen Systems unter Verwendung einer etablierten Zelllinie, die für die FCS-Messung geeignet ist, hinsichtlich der Errichtung eines Bewertungssystems für biologische Funktion sehr wichtig.
Auf das oben genannte Problem stießen wir im Zuge der Entwicklung der vorliegenden Erfindung und wir führten Untersuchungen durch, um eine uniforme Zelllinie für die FCS-Messung hinsichtlich der Detektierung einer Substanz, die mit einem Hormonrezeptor interagiert, geeignet zu machen. Durch die Verwendung dieser etablierten Zelllinie zielten wir auf die Errichtung eines Bewertungssystems ab, das analog zum lebenden Köper funktioniert und das den Test an einem tierischen Lebewesen ersetzen kann. Daher wurden als eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die untenstehend beschriebenen Mittel A-D verwendet. 5 zeigt ein schematisches Flussdiagramm, das ein Mittel zum Screenen eines Zellklons, der zur FCS-Messung geeignet ist, darstellt.
A. Screenen eines wirkstoffresistenten Zellklons.
Wird das Fusionsgen, das ein Hormonrezeptorgen und ein Gen für die Markersubstanz umfasst, transient exprimiert, kann es nicht als ein sicheres Experimentsystem verwendet werden. Daher wird ein Genvektor derart entworfen, dass das Fusionsgen ein wirkstoffresistentes Gen wie zum Beispiel ein antibiotikaresistentes Gen (Geneticin, Neomycin, Kanamycin und ähnliches) aufweist. Durch die Konstruktion eines solchen Genvektors wird es möglich, einen Zellklon zu screenen, der eine fluoreszierende Markierung des intrazellulären biologischen Moleküls konstitutiv exprimiert.
B. Screenen der Zellen, die für FCS-Messung geeignet sind
In der vorliegenden Erfindung bedeutet die Zelle, die zur FCS-Messung geeignet ist, eine Zelle, bei der die Intensität des detektierbaren optischen Signals durch FCS detektiert werden kann, und bei der der markierte Hormonrezeptor darin dessen physiologische Funktion beibehält und es wird ein Bewertungssystem, das analog zu einem lebenden Körper funktioniert, konstruiert.
B-1. Screenen von geeigneten Zellen auf der Basis der Intensität eines optischen Signals, das von einer Zelle emittiert wird.
Wie oben beschrieben wird ein Hormonrezeptorprotein mit einer fluoreszierenden Substanz markiert, die in der Lage ist, ein Signal zu emittieren, und dann in Zellen eingebracht. Danach wird von den Zellen eine Zelle, die ein optisches Signal mit der am meisten geeigneten Intensität emittiert, gescreent.
Bei der FCS-Messung beträgt ein konfokaler Bereich 1 Femto-Liter. Liegt die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle, die in dem Bereich vorhanden sind, nicht im Bereich von 0,1 bis 100, ist es unmöglich, die molekulare Fluktuation entsprechend zu messen. Da die Konzentration von 10^–7 bis 10^–9 M als Konzentration an fluoreszierenden Molekülen am meisten geeignet ist, ist es notwendig, die Zellen zu screenen, bei denen die Fluoreszenzmenge an fluoreszierenden Molekülen optimal exprimiert ist.
Zur Messung der Rezeptormoleküle, die durch FCS mit Fluoreszenz markiert sind, muss die Konzentration der Rezeptormoleküle in einer Zelle in einem messbaren Molekülkonzentrationsbereich liegen. Ist die Konzentration höher oder geringer als dieser Bereich, kann die Messung nicht durchgeführt werden. Dies wird in 6 erläutert. 6 zeigt in sequentieller Reihenfolge von oben nach unten: Den Fall, bei dem die Anzahl an fluoreszierenden Molekülen geringer ist als die erforderliche Konzentration an fluoreszierenden Molekülen für die FCS-Messung; den Fall, bei dem die Anzahl an fluoreszierenden Molekülen innerhalb des angemessenen Bereiches liegt und mittelmäßig ist; bzw. den Fall, bei dem die Anzahl an fluoreszierenden Molekülen größer als der angemessene Bereich ist. In beiden Fällen, wenn die Anzahl an fluoreszierenden Molekülen geringer oder größer als der angemessene Bereich ist, ist es unmöglich, die Autokorrelationsfunktion, die die Bewegung eines Targetmoleküls zeigt, entsprechend einzustellen. Andererseits ist es möglich, die Autokorrelationsfunktion, die die Bewegung eines Targetmoleküls zeigt, entsprechend einzustellen, wenn die Anzahl an fluoreszierenden Molekülen im angemessenen Bereich liegt. Dies ist in 7 gezeigt.
Daher ist es für das Screenen der Zelle, die ein optisches Signal, das für die FCS-Messung geeignet ist, emittiert, notwenig, die Fluoreszenz qualitativ und quantitativ zu bestimmen. Im Folgenden werden denkbare Analyseverfahren für Fluoreszenz dargestellt.
(a) Im Allgemeinen wird ein Fluoreszenzmikroskop verwendet, da mit ihm die Zellen während der Kultivierung beobachtet werden können. Jedoch kann die Fluoreszenzintensität dadurch nicht quantifiziert werden. (b) Durchflusscytometrie ist ausgezeichnet geeignet, da die Fluoreszenzmenge von jeder Zelle und eine mittlere Fluoreszenzmenge der Zellen hinsichtlich einer Vielzahl von Zellen quantifiziert werden kann, und daher kann die Fluoreszenzintensität der Zellklone verglichen werden. Bei der Durchflusscytometrie kann die Fluoreszenz der Zellen gemessen werden, während die Zellen dabei am Leben bleiben. Die Durchflusscytometrie hat jedoch dahingehend einen Nachteil, dass für die Suspendierung der Zellen Zeit benötigt wird und ein Aufwand entsteht. (c) Ebenso ist ein Fluoreszenz-Plattenreader ausgezeichnet geeignet, da eine mittlere Fluoreszenzmenge der Zellen bei einer Vielzahl von Zellen quantifiziert werden kann, und daher die Fluoreszenzintensität der Zellklone verglichen werden kann. Ferner ist es möglich, zahlreiche Zellklone gleichzeitig zu messen, wenn die Zellen auf der Fluoreszenzplatte kultiviert werden können.
In der vorliegenden Erfindung wird von den obenstehend erwähnten Analyseverfahren die Durchflusscytometrie (flow cytometry, FCM) verwendet. Mit der Durchflusscytometrie wird die Fluoreszenzintensität pro Zelle für jeden Klon quantifiziert. Auf diese Weise wird die Fluoreszenzintensität pro Zelle vor der FCS-Messung quantitativ bestimmt und dieser Intensitätswert wird mit einem Ergebnis der Analyse durch die PCS-Messung kontrolliert. Auf der Basis dieser Kontrolle ist es möglich, die Zellen, die eine optimale Anzahl an fluoreszierenden Molekülen aufweisen, zu screenen. Durch die Verwendung dieses Verfahrens fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung heraus, dass die Fluoreszenzintensität pro zur FCS-Messung geeigneten Zelle, bestimmt durch FCM, 0,2–240, bevorzugt 0,2–60 beträgt, vorausgesetzt, dass der Wert einer negativen Kontrolle (Zelle ohne eingeschleustes Gen) 0,1 beträgt.
Ferner ist das Verfahren zur Quantifizierung der Fluoreszenz pro Zelle nicht auf FCM beschränkt. Es können auch andere Verfahren, wie zum Beispiel ein Laser-Scanning-Cytometer (LCS) vom Nicht-Durchflusstyp verwendet werden. Es ist bevorzugt, dass die Fluoreszenzintensität geeigneterweise je nach der Messvorrichtung, der Art des Fluoreszenzreagens, den Messbedingungen, der Messumgebung, und ähnlichem definiert wird. So kann zum Beispiel die Fluoreszenzintensität durch das Verhältnis der Fluoreszenzintensität, die auf dem Wert der Autofluoreszenz in einem Bereich (z.B. einer Zelle), in den kein Fusionsgen eingebracht wurde, bestimmt werden. Zellen, die zur FCS-Messung geeignet sind, sind Zellen, deren Fluoreszenzintensitätsverhältnis im Bereich von 1–1200 liegen kann, bevorzugt im Bereich von 1–300.
B-2. Screenen von geeigneten Zellen auf der Basis einer Bestätigung der physiologischen Funktion eines Fluoreszenz-markierten Hormonrezeptors.
Es ist notwendig, zu bestätigen, dass das Molekül, das durch das Gen, das in eine Zelle eingebracht wurde, exprimiert wurde, deren physiologische Funktion aufweist. Um dies zu erreichen, ist es bevorzugt, durch ein geeignetes Verfahren aus der großen Anzahl an Zellklonen die Zellklone zu bestätigen und screenen, die die physiologische Funktion aufweisen.
Bei der vorliegenden Erfindung bezieht sich die physiologische Funktion des Hormonrezeptors sowohl auf die Funktion als Protein, das in der Lage ist, ein optisches Signal zu emittieren, als auch auf die Funktion als Hormonrezeptor.
Zunächst kann die Funktion als fluoreszierendes Protein dadurch bestätigt werden, dass die Emission von Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop qualitativ beobachtet und bestätigt wird.
Dann kann die Funktion als Hormonrezeptor bestätigt werden, indem die Lokalisierung der Fluoreszenz in einem Nukleus durch ein Phasen-Kontrast-Fluoreszenzmikroskop beobachtet wird, da bekannt ist, dass sich der Hormonrezeptor aus einem physiologischen Gesichtspunkt in einem Nukleus befindet. Dabei wird auch bestätigt, dass das Gen, das den Hormonrezeptor kodiert, ein nukleäres Lokalisierungssignal aufweist. Alternativ kann die Funktion als Hormonrezeptor durch die Verwendung von Immunoassay (Durchflusscytometrie, Western-Blotting-Analyse) bestätigt werden, wobei ein Antikörper zum Hormonrezeptor verwendet wird.
C. Entfernern einer Substanz, die die FCS-Messung hemmt.
Ist ein pH-Indikator (Phenolrot) in einem Kulturmedium für die Zellen, die ein mit einem Marker markiertes Protein exprimieren, enthalten, weist in der vorliegenden Erfindung der pH-Indikator eine Hormonaktivität auf und emittiert zudem Fluoreszenz. Das Ergebnis ist, dass die FCS-Messung durch die unspezifisch emittierende Fluoreszenz des pH-Indikators gehemmt wird. Desweiteren hat Kohlendioxidgas eine physiologische pH-puffernde Wirkung auf das Zellkulturmedium. Jedoch kann das Kohlendioxidgas nicht während der FCS-Messung zugeführt werden, so dass sich der pH des Kulturmediums in den alkalischen Bereich verschiebt, was auf lebende Zellen eine toxische Wirkung hat.
Zur Lösung der oben genannten Probleme ist es bevorzugt, dass als Kulturmedium zur FCS-Messung ein Kulturmedium verwendet wird, das aus einer stabilen Zusammensetzung, die keinen pH-Indikator (Phenolrot) aufweist und eine neutral puffernde Wirkung hat, besteht. Da die herkömmlichen Bedingungen für Zellkulturen (CO₂ 5%, 37°C) während der FCS-Messung nicht angewandt werden können, ist es insbesondere bevorzugt, ein Kulturmedium zu verwenden, dessen phyiologischer pH durch die Pufferwirkung, die nicht von CO₂ abhängt, gesteuert werden kann. Beispiele für solch ein Kulturmedium umfassen Leibovitz-l5-Medium, 10–20 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), usw.
D. Vorbehandlung einer Testsubstanz mit einem Extrakt aus einem lebenden Körper, das eine wirstoffmetabolisierende Aktivität hat.
Nachdem die zu untersuchende chemische Substanz (im Folgenden „Testsubstanz" bezeichnet) tatsächlich in einen lebenden Körper wie zum Beispiel einen menschlichen Körper eingebracht wurde, kann sie durch die folgenden beiden Mechanismen auf den lebenden Körper wirken. Bei einem Mechanismus wirkt die Testsubstanz ohne chemische Strukturänderung direkt auf den lebenden Körper. Bei dem anderen Mechanismus wird die Testsubstanz durch das Enzymsystem im lebenden Körper metabolisiert und der resultierende Metabolit wirkt auf den lebenden Körper. In der Tat tritt eine chemische Substanz, die eine endokrine Wirkung hat und in einen menschlichen Körper gelangt, zuerst in die Leber ein. Aus diesem Grund kann in Erwägung gezogen werden, dass der enzymatische Metabolit der Testsubstanz solch eine endokrin wirkende Wirkung aufweist. Im Folgenden erläutern wir ein Verfahren zur Detektierung der endokrinen Wirkung solch eines enzymatischen Metabolits außerhalb des lebenden Körpers.
Eine Testsubstanz mit unmittelbar vor oder gleichzeitig mit dem Hinzufügen einer Testsubstanz zu einem Testsystem mit einem Extrakt aus einem lebenden Körper (z.B. Leber S9 Fraktion) in Kontakt gebracht. Dabei wird nach der chemischen Modifizierung der Struktur der Testsubstanz durch Metabolismus die endokrine Wirkung auf die oben dargestellte Weise detektiert. Parallel zu der Detektion kann auch die Untersuchung der Kontrolle durchgeführt werden, bei der die Testsubstanz direkt dem Testsystem für die endokrine Wirkung hinzugefügt wird, ohne mit dem Extrakt von dem lebenden Körper, das eine arzneimittelmetabolische Wirkung hat, behandelt zu werden.
Somit ist es möglich, sowohl die direkte Wirkung der Testsubstanz an sich (ohne chemische Modifizierung) auf den lebenden Körper, als auch die Wirkung des Stoffwechselproduktes der Testsubstanz (metabolisiert durch das Enzymsystem und chemisch modifiziert) auf den lebenden Körper zu untersuchen. Dementsprechend kann auch bewertet werden, ob der Metabolit der Testsubstanz die endokrine Wirkung aufweist, obwohl die endokrine Wirkung des Metabolits nicht durch die herkömmlichen Verfahren detektiert werden kann, bei denen eine Testsubstanz direkt dem Testsystem hinzugefügt wird. Dabei kann die endokrine Wirkung einer chemischen Substanz genauer bewertet werden.
Beispiele
Im Folgenden werden die Beispiele der vorliegenden Erfindung erläutert.
[Klonierung eines humanen Östrogen-Rezeptor-β-Gens (hER β)]
Die folgenden Primer wurden zur Klonierung des humanen Östrogen-Rezeptor-β-Gens (hER β) auf der Basis der Nukleotidsequenz des hER β-Gens konzipiert.
Primer 1: 5'-GT GCCTC TTCTT GCAAG GTGTT-3' (Sequenz-ID Nr. 2)
Primer 2: 5'-TCAGC TTGTG ACCTC TGTGG-3' (Segzenz-ID Nr. 3)
PCR wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt, wobei die Primer und eine cDNA Bibliothek eines humanen Testis (Clontech) als Templat verwendet wurden. Insbesondere wurde PCR unter Verwendung der humanen Testis CDNA-Bibliothek (etwa 400 ng) als Templat und in einer PCR-Umsetzunglösung (50 μL), enthaltend die Primer (jeweils 4 μM), 0,2 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, und dTTP, jeweils 0,2 mM), 40 mM Tricine-KOH, 15 mM KOAC, 3,5 mM Mg(OAc)₂, 3,75 μg/mL BSA, 0,005 Tween-20, 0,005% Nonidet-P40 und Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech #8430-1)(5 μL) durchgeführt.
Die PCR wurde wie folgt durchgeführt: Nachdem ein anfänglicher Denaturierungsschritt 4 Minuten lang bei 95°C, 7 Zyklen 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 62°C, und 2,5 Minuten bei 72°C durchgeführt wurde, wurden anschließend 25 Arbeitgänge 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 58°C, und 2,5 Minuten bei 72°C durchgeführt. Nachdem eine abschließende Reaktion 10 Minuten bei 72°C durchgeführt worden war, wurde das Reaktionsprodukt bei 4°C gelagert.
Eine Teilmenge (5 μL) des PCR-Produktes wurde einer Elektrophorese mit 1%-igem Agarosegel unterzogen. Nachdem bestätigt war, dass die Molekulargröße des Produktes fast genauso groß ist wie diejenige eines Targetproduktes, ER β, wurde die Klonierung des PCR-Produktes unter Verwendung eines TA-Klonierungskits (Clontech #K1901-1) durchgeführt. Genauer gesagt wurde das PCR-Produkt (2 μL), das innerhalb von 24 Stunden nach der PCR erhalten wurde, 12 Stunden lang oder länger bei 14°C in einer Umsetzungslösung (10 μL) inkubiert, die 6 mM Tris-HCL, 6 mM MgCl₂, 5 mM NaCl, 0,1 mg/mL BSA, 7 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM ATP, 2 mM Dithiothreitol, 1 mM Spermidin, 50 ng eines pT-Adv Vektors, and 4,0 Weiss-Einheiten von T4 DNA-Ligase enthält.
Danach wurde TOP10F' E. coli (Clontech #K1901-1) transfiziert, wobei eine Ligationsreaktionslösung (2 μL) nach dem Protokoll, das dem Kit beilag, verwendet wurde.
Ein Plasmid wurde mit einem NucleoBond Plasmid Kit (Clontech #K3001-1) aus der resultierenden Transfektanten isoliert und einer Nukleotidsequenzierung unterzogen. Die Nukleotidsequenzierung wurde durch eine PE Biosystems 377XL Vorrichtung gemäß eines Dye Terminator Cycle Sequencing-Verfahrens durchgeführt.
Das Ergebnis der Sequenzierung war, dass eine Insert-DNA-Sequenz des erhaltenen Klons gleich war wie diejenige von 53–1735 bp des humanen Östrogenrezeptor β-Gens.
Diese Sequenz umfasst die gesamte Länge der Sequenz vom Startcodon bis zum Stoppcodon, die der kodierende Bereich des humanen Östrogenrezeptor-β-Proteins ist.
[Herstellung eines Fusionsgens und Konstruktion des Expressionsplasmids]
Das auf diese Weise isolierte hER β-Gen wurde in einen pEGFP-C1 Vektor (GenBank Accession Nr. U55763) subkloniert, wobei ein Fusionsgen hergestellt wurde, das das hER β-Gen und ein GFP (grün fluoreszierendes Protein)-Gen, das von der Qualle Aequorea victoria stammt, hergestellt wurde, und ein Plasmidvektor zur Expression in kultivierte Säugetierzellen konstruiert wurde. Die schematische Darstellung eines pEGFP-C1 Vektors ist in 1 zu sehen.
Das Plasmid hER β/pT-Adv (etwa 20 μg), das wie obensehend beschrieben hergestellt wurde, wurde mit zwei Arten von Restriktionsenzymen, HindIII und BamHi, verdaut. Danach wurde die Gesamtmenge der Umsetzungsmischung einer Elektrophorese unterzogen, wobei 1,0% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt verwendet wurde. Nachdem das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt wurde, wurde die Bande, die dem ER β Genfragment von etwa 1,7 kb entspricht, aus dem Gel ausgeschnitten, während die Größe des DNA-Fragmentes auf einem UV-Transilluminator visuell beobachtet wurde. Aus dem herausgeschnittenen Gel wurde das ER β-Fragment gereinigt, wozu das Concert Rapid Gel Extraction System (GIBCO BRL 11456-019) verwendet wurde.
Auf ähnliche Weise wurde ein pEGFP-C1-Vektor (etwa 20 μg) mit zwei Arten von Restriktionsenzymen, HindIII und BamHi, verdaut, um den Vektor zu linearisieren. Nachdem die Gesamtmenge der Umsetzungsmischung einer Elektrophorese unter Verwendung von 1,0% Agarosegel mit niederem Schmelzpunkt unterzogen wurde, wurde ein Bandenabschnitt, der dem linearen pEGFP-C1-Fragment von etwa 4,7 kb entspricht, herausgespalten. Aus dem herausgespaltenen Gel wurde ein pEGFP-C1 Vektor gereinigt, wozu das Concert Rapid Gel Extraction System (GIBCO BRL 11456-019) verwendet wurde.
Eine DNA-Lösung (etwa 10 μL), die das Vektorfragment (0,03 pmol) umfasst, und das hER β-Fragment (0,1 pmol), das wie obenstehend genannt gereinigt wurde, wurden mit der gleichen Menge an Lösung I von TAKARA DNA Ligation System Ver. 2 (TAKARA #6022) gemischt. Die Mischung wurde 12 Stunden lang bei 16°C inkubiert, wobei die Ligation durchgeführt wurde.
E. coli DH5 α (TAKARA #9057) wurde mit der so erhaltenen resultierenden Umsetzungsmischung (10 μL) transformiert. Ein Plasmid wurde von den Transformanten, die durch ein NucleoBond Plasmid Kit (Clontech #K3001-1) erhalten wurden, isoliert und einer Nukleotidsequenzierung unterzogen. Die Nukleotidsequenzierung wurde durch eine PE Biosystems 377XL-Vorrichtung gemäß eines Dye Terminator Cycle Sequencing-Verfahrens durchgeführt.
Ein Teil der Nukleotidsequenz des Fusionsgens ist in 9 gezeigt. 9 zeigt, dass das Gen, das das grüne fluoreszierende Protein (EGFP in der Figur) kodiert, die Multiklonierungsstelle, und das hER β-Gen (hER β in der Figur) sequentiell in der Richtung von 5 bis 3' angeordnet sind. Die Sequenz (GT GCC TCT TCT TGC AAG GTG TT), die in der Figur unterstrichen ist, gibt den Abschnitt einer Primersequenz an, die bei der Klonierung des hER β-Gens verwendet wird. Die Sequenz (AA GCT T), die in der Figur mit einer Wellenlinie unterstrichen ist, gibt eine Restriktionsstelle von HindIII an. Die ATG Stelle, die in der Figur von einem rechteckigen Rahmen umschlossen ist, gibt ein Transkriptions-Startcodon des hER β-Gens an.
[Transfektion eines kultivierten humanen Zellstammes mit einem Expressionsplasmid]
Ein kultivierter Zellstamm MDA-MB-231, der eine kultivierte Zelllinie aus Krebsgewebe eines Säugers ist, wurde mit dem Fusionsgenexpressionsplasmid GERb3-9-1 transfiziert, das wie obenstehend beschrieben gebildet wurde. Der kultivierte Zellstamm MDA-MB-231, der von menschlichem Krebsgewebe abstammt, wurde von ATCC erworben und in einem L-15-Medium, das 10% FBS (Fetal Bovine serum) enthält bei 37°C in einem befeuchteten Brutschrank kultiviert. Die MDA-MB-231-Zellen wurden zu ihrer Dispergierung mit Trypsin behandelt, und dann wurden ein Tag vor der Transfektion etwa 2 × 10⁵ der MDA-MB-231-Zellen auf einer 60 mm Petrischale aufgebracht. Das Plasmid GERb3-9-1 wurde am folgenden Tag mittels Lipofectin (GIBCO #10964-013) in die Zellen eingeschleust.
Die DNA-Lösung, die das Plasmid GERb3-9-1 (2 μg) enthält, wurde mit 250 μL serumfreiem L-15-Medium verdünnt. Dieser Lösung wurde ein Plus-Reagens (8 μL) hinzugefügt und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurde eine Lösung, die ein Lipofectamin-Reagens enthält (12 μL) mit dem serumfreien L-15 Medium (250 μL) verdünnt, der Lösungsmischung aus DNA/Plus-Reagens hinzugefügt, und weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Während dieser Zeit wurde die Kulturlösung von der Petrischale, auf der am vorangehenden Tag die Zellen aufgebracht worden waren, entfernt, und 2 mL des serumfreien L-15-Mediums wurden anstatt der Kulturlösung hinzugefügt. Nach 15 Minuten wurden 2,5 mL der vorher hergestellten Lösungsmischung aus DNA/Plus-Reagens/Lipofectamin der Petrischale hinzugefügt, deren Kulturlösung vorher mit dem serumfreien L-15-Medium (2 mL) ersetzt worden war. Die Petrischale wurde 3 Stunden lang bei 37°C in einem befeuchteten Brutschrank inkubiert. Nach 3 Stunden wurde die Kulturlösung mit 5 mL einem üblichen L-15-Medium, das 10% FBS enthält, ersetzt, und weitere 24 Stunden, oder länger, inkubiert. Auf diese Art wurde der kultivierte MDA-MB-231 Zellstamm mit dem Plasmid GERb3-9-1 transfiziert.
[Errichtung einer stabilen transfizierten kultivierten Zelllinie und Expression des Fusionsproteins in der Zelllinie]
Die auf diese Weise transfizierte kultivierte Zelle wurde durch die Behandlung mit Trypsin dispergiert, verdünnt und auf einer neuen Petrischale aufgebracht. Am folgenden Tag wurde ein G418 Antibiotikum hinzugefügt, wodurch eine Endkonzentration von 600 μg/mL zur Selektion von Transfektanten erhalten wurde.
Danach wurde die Inkubation fortgesetzt, während eine Kulturlösung (selektive Kulturlösung, L-15-Medium enthaltend 10% FBS und 600 μg/mL an G418) alle 3 bis 4 Tage ersetzt wurde. Auf diese Waise wurde mit G418 ein stabiler Transfektant gescreent. Etwa zwei Wochen später wurde ein stabiler Zellklon mit einer G418-Resistenz isoliert. Auf diese Art wurde eine stabile transfizierte kultivierte Zelllinie mit dem Plasmid GERb3-9-1 etabliert. Es war schwierig, den Zellklon zu erhalten, der das Fusionsprotein eines Östrogenrezeptors und GFP darin stabil exprimiert. Dies liegt daran, dass die Zelle, die das Fusionsprotein zu einem relativ hohen Niveau exprimierte, einige Tage nach der Transfektion abstarb. In der vorliegenden Erfindung wurde die Transfektion viele Male durchgeführt und eine große Menge an Zellen wurde dem Screenen unterzogen. Als Ergebnis war es möglich, eine Zelllinie (Klon) zu erhalten, die das Fusionsprotein stabil exprimiert.
2 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme, erhalten durch ein Fluoreszenzmikroskop, einer transfizierten kultivierten Zelllinie, die auf diese Weise etabliert wurde. Es wurde beobachtet, dass das GFP/hER β Fusionsprotein, das durch das Plasmid GERb3-9-1 kodiert wurde, in eine Zelle exprimiert wurde und in dem Nukleus der Zelle lokalisiert wurde.
[Markierung des intrazellulären Östrogenrezeptormoleküls mit einem Fluoreszenzantikörper]
Ansäen von Zellen

1. Kultivierte menschliche Säuger-Krebszellen MCF-7 in einer logarithmischen Wachstumsphase wurden mit Trypsin + EDTA (0,25% Trypsin-EDTA: GIBCO CAT #25200-056) freigesetzt und (5 Minuten lang bei 300 × g) zweimal mit einem D-PBS (Phosphatpuffer) gewaschen (5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert).
2. Die Zellen wurden auf 10 Teströhrchen für jeden Antikörper verteilt, um eine Konzentration von etwa 5 × 10⁵ Zellen pro Röhrchen zu erhalten, dabei wurden 50 μL D-PBS als Verdünnungslösung verwendet.

Hypotone Zellbehandlung
Als hypotone Lösung für Zellen wurde ein IntraPrep Permeabilisierungs-Reagens, für 50 Tests, (IMMUNOTECH (COULTER), CAT #2388) verwendet.

3. Intraprep Reagens 1 (100 μL) wurde in die Teströhrchen hinzugefügt und mit einem Vortex gut gemischt.
4. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (18–25°C) inkubiert.
5. D-PBS (4 ml) wurde der Mischung hinzugefügt und die resultierende Mischung wurde bei 300 × g 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Ansaugen entfernt.
6. Die Zellen wurden durch Klopfen gelöst. Danach wurde Intraprep Reagens 2 (100 μL) hinzugefügt und die Mischung wurde leicht ohne der Verwendung eines Vortex gemischt.
7. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
8. Die resultierende Mischung wurde 1 bis 2 Sekunden lang mit den Fingern geklopft (Vortex wurde nicht verwendet).

Hinzufügen eines Primärantikörpers
Als Anti-ERα-Antikörper wurde ein monoklonaler Anti-Östrogenrezeptor-Antikörper (Maus)(Affinity Bioreagents Inc., CAT #MA1-310) verwendet, und als Anti-ERβ-Antikörper wurde ein polyklonaler Anti-Östrogenrezeptorantikörper (Kaninchen)(Affinity Bioreagents Inc., CAT #PA1 1-313) verwendet.

9. Der Anti-ER α-Antikörper oder der Anti-ER β-Antikörper wurde mit einer Verdünnungslösung D-PBS bis zu 200-fach verdünnt. Die resultierende Lösung (50 μL) wurde einem vorher bestimmten Teströhrchen hinzugefügt und leicht gemischt.
10. Die resultierende Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur an einem dunklen Ort inkubiert.
11. D-PBS (4 ml) wurde der resultierenden Mischung hinzugefügt und die resultierende Mischung wurde bei 300 × g 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Ansaugen entfernt. Dieser Waschvorgang wurde insgesamt zwei Mal auf die oben beschriebene Art und Weise durchgeführt.

Hinzufügen eines Sekundärantikörpers
0,5 mL molekularer Proben, CAT #A-11029, Alexa 488/Ziege Anti-Maus IgG (H + L) wurden als Fluoreszenz-markierte Anti-Maus-Antikörper verwendet, 0,5 mL molekularer Proben CAT #A-11037, Alexa 594/Ziege Anti-Kaninchen IgG wurde als fluoreszenzmarkierter Anti-Kaninchen-Antikörper verwendet.

12. Der fluoreszenzmarkierte Anti-Maus-Antikörper (Alexa 488) und der fluoreszenzmarkierte Anti-Kaninchen-Antikörper (Alexa 594) wurden mit einer Verdünnungslösung D-PBS bis zu 100-fach bzw. 200-fach verdünnt. Die so verdünnten Lösungen wurden den vorher bestimmten Teströhrchen in einer Menge von 50 μL hinzugefügt und sachte vermischt.
13. Der Waschvorgang mit D-PBS wurde drei Mal durchgeführt.
14. Die so erhaltenen Zellen wurden in 500 μL D-PBS, das 0,5% Formaldehyd enthält, suspendiert und durch einen Durchflusscytometer analysiert.

Durch das oben genannte Verfahren wurde ein intrazellulärer Östrogenrezeptor mit Fluoreszenz markiert. Die Analyse durch Durchflusscytometrie zeigt, dass die menschliche Säuger-Krebszelle MCF-7 den Östrogenrezeptor α (ER α) exprimiert. Das Analyseergebnis ist in 10 dargestellt. Die menschliche Säuger-Krebszelle MCF-7 hat den Östrogenrezeptor β (ER β) nicht exprimiert. Andererseits exprimierten Zellen, die von menschlichem Säuger-Krebs-Gewebe, MDA-MB-231, stammen, weder ER β noch ER β.
[Vergleich zwischen der Fluoreszenzintensität und Daten der FCS-Messung, hinsichtlich der Zelle, bei der nur ein Gen für ein darin eingebrachtes Fluoreszenzprotein kodiert]
MCF-7 Zellen wurden in 60 mm Petrischalen bei etwa 80%igem Zusammenfluss ausgestreut. Die MCF-7-Zellen wurden mit den Expressionsvektoren pEGFP-c1, pEYFP-c1, pECFP-c1 (1–10 μg für jeden), die ein fluoreszierendes Proteincodierendes Gen, in Übereinstimmtung mit einem Lipofektionsverfahren durch CLONfection (CLONTECH) enthalten, transfiziert. Geneticin (600–800 μg/ml) wurde einem Wachstumsmedium für MCF-7 Zellen (MEM + 10% fötales Rinderserum + nichtessentielle Aminosäure + 1 mM Natriumpyruvat) hinzugefügt. Auf diese Weise wurde ein selektives Medium hergestellt.
Die Zellen, die wie oben beschrieben erhalten wurden, wurden 2 bis 3 Wochen in einem CO₂-Brutschrank inkubiert, während das Medium alle 3 bis 4 Tage durch ein frisches Medium ersetzt wurde. Als Ergebnis wurde ein selektierter Klon erhalten.
Die Zellklone wurden durch ein Fluoreszenzmikroskop beobachtet, wobei ein optimaler Fluoreszenzfilter verwendet wurde. Bei den Zellen, die die fluoreszierenden Proteine GFP und YFP exprimieren, wurde die Emission der Fluoreszenz beobachtet, wohingegen kein wesentliches von dem fluoreszierenden Protein CFP emittiertes Fluoreszenzsignal detektiert wurde.
Ferner wurde die Fluoreszenzintensität der erhaltenen Zellklone durch Durchflusscytometrie (BECKMAN-COULTER, XL) verglichen, wobei die Filter PF1 und PF2 verwendet wurden.
Im Folgenden werden die Analyseverfahren durch Durchflusscytometrie erläutert.

1. MCF-7 Zellklone, in die nur ein fluoreszierendes-Protein-kodierendes Gen transfiziert ist, werden einzeln kultiviert, und Zellen von etwa 10⁶ werden mit Trypsin + EDTA freigesetzt und zwei Mal mit D-PBS gewaschen.
2. Die resultierenden Zellen werden nur für die Durchflusscytometrie in ein Röhrchen eingebracht und einer Durchflusscytometrie unterzogen.
3. Unter Verwendung der Zellklone wird das Gating der Größe und Dichte der Zelle durchgeführt.
4. Wenn notwendig, wird die Fluoreszenz entsprechend korrigiert, um die Fluoreszenzintensität der resultierenden Zellpopulation optimal zu gestalten.

Die Messergebnisse der Fluoreszenzinstensität sind in den 11 bis 13 dargestellt.
Von diesen werden bei den Zellklonen GFP-5 und YFP-3, die unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten aufweisen, die FCS-Messergebnisse verglichen. Die FCS-Messung wird durch von Zeiss hergestellten FCS (ConfoCor^®) durchgeführt (Lichtquelle: Ar-Laser, Objektivlinse: 40-Fach, Konfokalbereich: 0,25 μm (Radius) × 1,7 μm (Höhe)). Die Fluoreszenzintensität von GFP-5 ist hoch (durchschnittliche Fluoreszenzintensität: 353,5 MnX), und übersteigt eine geeignete Konzentration an fluoreszierenden Molekülen. YFP-3 weist eine geeignete Konzentration an fluoreszierenden Molekülen auf (mittlere Fluoreszenzintensität: 170,5 MnX), so dass die Fluoreszenz durch FCS gemessen werden kann. Die Autokorrelationsfunktion von YFP-3 ist in 7 gezeigt. Im Hinblick auf die Zellklone, die keine Fluoreszenz abgeben, ist die Autokorrelationsfunktion nicht günstig festgelegt.
Im Fall von GFP-5, das eine hohe Fluoreszenzintensität aufweist, übersteigt die Anzahl an fluoreszierenden Molekülen in einem Messungsbereich den Grenzwert von 100. Aus diesem Grund wurde ermittelt, dass die FCS-Messung nicht durchgeführt werden kann. Andererseits wird die FCS-Messung dadurch durchgeführt, dass die Konzentration von Rohdamin 123 in einer Lösung bei 0,1–1000 nmol/L durchgeführt wird. Verglichen mit den Ergebnissen der FCS-Messung unter Verwendung von Rohdamin 123 wird angenommen, dass die Konzentration an fluoreszierenden Molekülen GFP-5 etwa 700 nM oder mehr beträgt. Daher beträgt die geeignetste Konzentration an intrazellulären fluroeszenz-markierten Molekülen für die FCS-Messung 0,1–700 nmol/L. Dieser Wert zeigt, dass als Wert für die Fluoreszenzintensität pro Zelle, die durch Durchflusscytometrie gemessen wird, ein Bereich von 0,2–240, bevorzugt von 0,2–60 als am Geeignetsten für die FCS-Messung ist, vorausgesetzt, dass die Intensität bei einer negativen Kontrolle (eine Zelle, in die kein Gen transfiziert wurde) auf 0,1 festgelegt ist. Aus diesem Grund kann für die FCS-Messung der Zellklon ausgesucht werden, dessen Fluoreszenzintensität in den obenstehend genannten Bereich fällt. Das Verfahren zur Quantifizierung der Fluoreszenz pro Zelle ist nicht auf FCM beschränkt. Es können auch andere Verfahren, wie zum Beispiel ein Laser-Scanning-Cytometer (LCS) vom Nicht-Durchflusstyp verwendet werden. Es ist bevorzugt, dass die Fluoreszenzintensität geeigneterweise je nach der Messvorrichtung, der Art des Fluoreszenzreagens, den Messbedingungen, der Messumgebung, und ähnlichem definiert wird. So kann zum Beispiel die Fluoreszenzintensität durch das Fluoreszenzintensitätsverhältnis ausgedrückt werden, das auf der Basis des Wertes der Autofluoreszenz in einem Bereich (zum Beispiel einer Zelle), in den kein Fusionsgen eingebracht wurde, bestimmt wird. Wird das Fluoreszenzintensitätsverhältnis verwendet, sind Zellen, die zur FCS-Messung geeignet sind, Zellen, deren Verhältnis an Fluoreszenzintensität im Bereich von 1–1200 liegt, bevorzugt im Bereich von 1–300.
Wie obenstehend beschrieben, ist es möglich, die Fluoreszenzintensität durch die Verwendung einer Durchflusscytometrie zu quantifizieren. Auf diese Weise kann die Fluoreszenzintensität jedes Zellklons zahlenmäßig ausgedrückt werden. Aus diesem Grund wurde ein Verfahren zum Screenen eines Zellklons, der bei der FCS-Analyse verwendet werden kann und der eine optimale Dichte an fluroeszierenden Molekülen aufweist, begründet.
[Detektion der Dimerisation des Fusionsproteins mit nachfolgender Ligandenbindung]
Die Dimerisation des GEP/hER β Fusionsproteins, die durch die Binden von 17 β Estradiol verursacht wird, wurde durch die Verwendung des kultivierten Zellklons #1 detektiert, der das GFP/hER β Fusionsgen, das vorher etabliert wurde, exprimiert. Der kultivierte Zellklon #1 der das GFP/hER β Fusionsgen exprimiert, wurde in einer Lab-Tek-Kammer (Nunc #136439) mit 8 Wells ausgestreut und in einem befeuchteten Brutschrank über Nacht bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Kulturlösung entfernt, die Zellen wurden mit PBS gewaschen und die Kulturlösung wurde dann mit einem serumfreien und phenolrotfreiem L-15-Medium ersetzt. 17 β-Estradiol wurden hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 10^–7M zu erhalten. Danach wurden zu vorbestimmten Intervallen von 2 Stunden das intranukleäre Verhalten des GFP/hER β-Fusionsproteins durch ein von Zeiss hergestelltes FCS (ConfoCor^®) gemessen.
14 zeigt die Daten der FCS-Messung unmittelbar nach (0 Minuten) und 45 Minuten nach dem Hinzufügen von 17 β-Estradiol. Wie aus den Messergebnissen offensichtlich ist, erhöht sich die Diffusionszeit des GFP/hER β-Fusionsproteins nach 45 Minuten nach dem Hinzufügen von 17 β-Estradiol. Es wurde bestimmt, dass solche Messergebnisse mit der Dimerisation des GFP/hER β-Fusionsprotein gefolgt von der Bindung von 17 β-Estradiol im Zusammenhang standen. Eine solche Reaktion wurde in der Kontrollzelle, die nur GFP exprimiert, nicht beobachtet.
Wie obenstehend beschreiben war es durch die vorliegende Erfindung zum ersten Mal möglich, das Dimerisationsstadium von Östrogenrezeptormolekülen zu detektieren.
Wirkung der Erfindung
Wie voranstehend beschrieben, wurde durch die vorliegende Erfindung zum ersten Mal ein neues Assaysystem zur Prüfung einer Substanz, die mit einem Hormonrezeptor interagiert durch die Verwendung der Zelle, die das Fluoreszenz/Rezeptor-Fusionsprotein in sich exprimiert, errichtet.
Zur Konstruktion des erfindungsgemäßen Assaysystems wird ein neuartiges Fusionsgen hergestellt, ein neuartiges Fusionsgen, das ein Gen, das das Hormonrezeptorprotein kodiert und ein Gen, das eine Markersubstanz kodiert, die in der Lage sind, ein optisches Signal zu emittieren, umfasst, und es wird ein rekombinanter Vektor, der das Fusionsgen enthält, konstruiert. Danach wird eine transfizierte Zelle gebildet, indem der rekombinante Vektor eingeschleust wurde. Durch dieses Verfahren ist es möglich, das Fusionsprotein der Hormonrezeptor/Markersubstanz in der transfizierten Zelle zu exprimieren. Als Ergebnis ist es möglich, das Hormonrezeptorprotein, das in der Lage ist, ein optisches Signal in einer lebenden Zelle zu emittieren, zu exprimieren.
Wird der Zelle, die das Hormonrezeptorprotein exprimiert, das in der Lage ist, ein optisches Signal zu emittieren, eine Testsubstanz hinzugefügt, ist es möglich, das Verhalten der Hormonrezeptormoleküle (d.h. Signaltransduktion) durch die Verwendung des optischen Signal zu verfolgen. Auf diese Weise kann die endokrine Wirkung der Testsubstanz in einer lebenden Zelle bewertet werden.
Wenn das Fusionsprotein des Hormonrezeptor/Fluoreszenzproteins in einer Zelle wie oben beschrieben konstruiert wird, ist es möglich, das Binden der Testsubstanz an den Hormonrezeptor direkt zu analysieren, während die physiologische Funktion des Rezeptors aufrecht erhalten wird. Desweiteren kann das zeitabhängige Verhalten des Hormonrezeptors in einer lebenden Zelle detektiert werden. Daher ist dieses Bewertungssystem vorteilhaft, da es analog zu dem System eines lebenden Körpers abläuft.
Zudem ist die Verwendung der Zelle, die das Fusionsprotein exprimiert in den folgenden Punkten vorteilhaft: Erstens wird nur eine geringe Anzahl an Zellen benötigt, und eine einzelne Zelle ist zur Messung ausreichend.
Ferner ist es möglich, zu beobachten, dass sich die intrazelluläre Lokalisierung eines Targetproteins durch externe Stimulierung verändert.
Andererseits ist es auch möglich, die endokrine Wirkung einer Testsubstanz durch das Hinzufügen der Testsubstanz zu dem gereinigten Fusionsprotein zu bewerten.
Die Verwendung des gereinigten Fusionsproteins hat den Vorteil, dass ein System zur Detektierung ohne verunreinigende Substanzen, wie sie in der Zelle vorliegen, etabliert werden kann. Die Konsequenz ist, dass die Messung mit einem verringerten Geräuschpegel durchgeführt werden kann. Das gereinigte Fusionsprotein kann durch Einfrieren über einen langen Zeitraum gelagert werden. Es wird keine Arbeit und keine Zeit für die Aufrechterhaltung der Zelle durch Subkultur benötigt. Ferner ist es leicht, die Konzentration des Targetproteins, die Umsetzungstemperatur und ähnliches zu steuern, so dass die Bedingungen für das Experiment leicht optimiert werden können.
Im Laufe der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde ein System, das einen lebenden Körper imitiert, entwickelt, indem das Fusionsprotein des Hormonrezeptor/Fluoreszenzproteins in eine lebende Zelle exprimiert wurde. Das Ergebnis ist, dass es notwendig wurde, die Zellen zu screenen, die eine Expressionsmenge an Fluoreszenz aufweisen, die zur FCS-Messung geeignet ist. Daher wurde die Expressionsmenge des Fluoreszenzproteins durch Durchflusscytometrie quantifiziert und dabei wurde die Fluoreszenzintensität der Zelle, die eine Expressionsmenge an Fluoreszenz, die zur FCS-Messung geeignet ist, zahlenmäßig ausgedrückt. Auf diese Weise wurde ein einfaches Verfahren zum Screenen einer Zelle erschaffen. Dieses Verfahren führte zur Errichtung eines stabilen experimentellen Systems, bei dem es möglich ist, das Verhalten der fluoreszierenden Rezeptormoleküle in einer lebenden Zelle mit einer guten Reproduzierbarkeit und mit einer hohen Sensibilität zu detektieren. Durch die Errichtung des stabilen experimentellen Systems wurde es desweiteren möglich, die Dimerisation des Hormonrezeptors in einer lebenden Zelle zu detektieren, obwohl dies nicht durch ein herkömmliches Verfahren erreicht werden konnte.
Desweiteren können mit dem erfindungsgemäßen Assaysystem verschiedene Wirkungen erzielt werden, wie untenstehend erläutert:
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, an einem frühen Stadium (bei Schritt I der 3) der intrazellulären Signaltransduktion mit dem Fluoreszenz/Rezeptorfusionsprotein, das durch eine chemische Substanz induziert wird, zu detektieren. Daher ist es möglich, die endokrine Wirkung der chemischen Substanz ein paar Stunden früher als bei herkömmlichen Verfahren zu detektieren.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, zu wissen bis zu welcher Schritt (Schritte I bis III der 3) der intrazellulären Signaltransduktion eine chemische Substanz über das Rezeptorprotein induziert. Auf dieser Basis ist es möglich, zu bewerten, ob die Testsubstanz als Agonist oder Antagonist wirkt.
Da das Fusionsprotein, das ein fluoreszierendes Protein (z.B. GFP) und ein Rezeptorprotein umfasst, durch genetische Veränderung hergestellt wird, und das Verhalten des resultierenden fluoreszierenden Proteins als Detektionsindikator verwendet wird, ist es möglich die einzelnen Schritte der intrazellulären Signaltransduktion zu detektieren, ohne ein bestimmtes Reagens wie es in einem herkömmlichen Verfahren verwendet wird, hinzuzufügen.
Die einzelnen Schritte der intrazellulären Signaltransduktion können im Grunde unter Verwendung einer einzelnen Zelle detektiert werden. Aus diesem Grund wird keine so große Anzahl an Zellen wie im Stand der Technik benötigt. Es ist zudem auch möglich, die Änderung des Verhaltens eines einzigen Moleküls des Fluoreszenz/Rezeptor-Fusionsproteins zu detektieren, indem FCS zur Detektion der intrazellulären Signaltransduktion verwendet wird. Das Ergebnis ist, dass die endokrine Wirkung einer chemischen Substanz, die in einer extrem geringen Menge vorhanden ist, mit einer hohen Empfindlichkeit detektiert werden kann.
Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem FCS-Messung verwendet wird, nur eine geringe Menge einer Probe benötigt wird, kann es an einer Vorrichtung zum High Through Put (HTP)-Verfahren angewendet werden, das unter hoher Geschwindigkeit durchgeführt wird und die Messung einer kleinen Probenmenge ermöglicht.
Ferner kann durch die Detektierung einer Substanz, die in der Lage ist, an einen Östrogenrezeptor zu binden, indem das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, außer den endokrin wirkenden Substanzen ein natürlich vorkommendes weibliches Hormon, das in einem lebenden Körper vorhanden ist (in Blut, Urin) detektiert werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist auf Östrogen sehr empfindlich, so dass es einen Östrogenspiegel detektieren kann, der abhängig von dem Menstruationszyklus schwanken und während der Zeit des Eisprungs einen hohen Östrogenspiegel aufweist. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Schwangerschaftsdiagnose verwendet werden.
Industrielle Anwendbarkeit
Wie obenstehend erläutert ist die vorliegende Erfindung zur Untersuchung einer Substanz wirksam, die mit einem Hormonrezeptor interagiert, wie zum Beispiel eine endokrin wirkende Substanz.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

In vitro Verfahren zur Untersuchung einer Substanz, die mit einem Hormonrezeptor interagiert, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: a) Behalten eines Hormonrezeptorproteins, das mit einer Markersubstanz markiert ist, die in der Lage ist, ein optisches Signal zu emittieren sowie eine Testsubstanz, unter vorbestimmten Bedingungen, in denen ein natürlicher Ligand mit dem Rezeptorprotein, das mit der Markersubstanz markiert ist, binden kann, und in denen nach der Bindung des natürlichen Liganden, das Hormonrezeptorprotein ein Dimer eines Komplexes des Hormonrezeptorprotein/Ligand bilden kann, wobei eine Veränderung in einem detektierbaren Merkmal des optischen Signals, das von der Markersubstanz, die das Hormonrezeptorprotein markiert, induziert wird; b) Detektieren des optischen Signals, das von der Markersubstanz unter den vorbestimmten Bedingungen emittiert wird; und c) Vergleichen der Merkmale des optischen Signals, das in Schritt b) detektiert wurde, mit denjenigen des optischen Signals, das von der Markersubstanz detektiert wurde, die das Hormonrezeptorprotein in Abwesenheit der Testsubstanz markiert, dabei Bestimmen, ob die Testsubstanz eine Substanz ist, die in der Lage ist, mit dem Hormonrezeptorprotein auf der Basis des Unterschieds in beiden detektierten Merkmalen zu interagieren, wobei der Unterschied aus der Dimerisierung des Komplexes des Hormonrezeptorprotein/Testsubstanz und des Monomers resultiert.
In vitro Verfahren zur Untersuchung einer Substanz, die mit einem Hormonrezeptor interagiert, umfassend: a) Behalten eines Hormonrezeptorproteins, das mit einer Markersubstanz markiert ist, die in der Lage ist, ein optisches Signal zu emittieren und eine Testsubstanz unter vorbestimmten Bedingungen, in denen ein natürlicher Ligand mit dem Rezeptorprotein, das mit der Markersubstanz markiert ist, binden kann, und in denen nach der Bindung des natürlichen Liganden, das Hormonreptorprotein ein Dimer eines Komplexes des Hormonrezeptorprotein/Liganden bilden kann, und dann wird es dem Komplex des Hormonrezeptorprotein/Liganden ermöglicht, an eine spezifische Nukleotidsequenz zu binden, wobdurch eine Veränderung in einer detektierbaren Eigenschaft des optischen Signals induziert wird, das von der Markersubstanz, mit der das Hormonrezeptorprotein markiert ist, emittiert wird; b) Detektieren des optischen Signals, das von der Markersubstanz unter den vorbestimmten Bedingungen emittiert wird; und c) Vergleichen der Merkmale des optischen Signals, das in Schritt b) detektiert wurde, mit denjenigen des optischen Signals, das von der Markersubstanz detektiert wurde, die das Hormonrezeptorprotein in Abwesenheit der Testsubstanz markiert, dabei Bestimmen, ob die Testsubstanz eine Substanz ist, die in der Lage ist, mit dem Hormonrezeptorprotein zu interagieren, auf der Basis des Unterschieds in beiden detektierten Merkmalen, wobei der Unterschied aus der Dimerisierung des Komplexes des Hormonrezeptorprotein/Testsubstanz und an die spezifische Nucleotidsequenz resultiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das mit der Markersubstanz markierte Hormonrezeptorprotein, das in der Lage ist, ein optisches Signal zu emittieren, ein Fusionsprotein ist, das ein Hormonrezeptorprotein umfasst, und die Markersubstanz in der Lage ist, ein optisches Signal zu emittieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung eines detektierbaren Merkmals eines optischen Signals eine Veränderung der Wellenlänge des optischen Signals ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung eines detektierbaren Merkmals eines optischen Signals eine Veränderung der intrazellulären Verteilung des optischen Signals ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung eines detektierbaren Merkmals eines optischen Signals durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) detektiert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt umfasst, in dem eine Testsubstanz mit einer Zelle in Kontakt gebracht wird, die in einem Zustand ist, in dem sie das mit der Markersubstanz, die ein optisches Signal emittieren kann, markierte Hormonrezeptorprotein exprimieren kann.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektierungsschritt den Schritt der Detektierung eines optischen Signals, das von der Markersubstanz in eine Zelle emittiert wird, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal bei dem Detektierungsschritt dadurch detektiert wird, dass auf den inneren Bereich einer Zelle fokusiert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt des Mischens und Umsetzens der Testsubstanz mit dem Hormonrezeptorprotein umfasst, das mit der Markersubstanz markiert ist, die in der Lage ist, das optische Signal zu emittieren, in einer Flüssigkeit, worin das Protein aus einer Zelle, die sich selbst exprimiert, suspendiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner den Schritt des Screenens einer Zelle, die zur FCS-Detektion geeignet ist, aus Zellen, die das Hormonrezeptorprotein exprimieren, das mit der Markersubstanz markiert ist, die in der Lage ist, ein optisches Signal zu emittieren, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt des Schreenens einer Zelle, die zur FCS-Detektion aus Zellen geeignet ist, die das mit der Markersubstanz markierte Hormonrezeptorenprotein zu exprimieren, das in der Lage ist, ein optisches Signal zu emittieren, basierend auf der Intensität eines optischen Signals, das aus der fluoreszenten Substanz emittiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt des Schreenens nach einer Zelle, deren Intensität eines optischen Signals per Zelle in den Bereich von 0,2–2400 fällt, umfasst, vorausgesetzt, dass die Intensität einer negativen Kontrolle (eine Zelle, die kein optisches Signal enthält) auf 0,1 festgelegt ist, aus Zellen, die das Hormonrezeptorprotein exprimieren, das mit der Markersubstanz, die in der Lage ist, ein optisches Signal zu emittieren, markiert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt des Schreenens nach einer Zelle umfasst, bei dem das markierte Hormonrezeptorprotein seine physiologische Funktion beibehält, aus Zellen, die das Hormonrezeptorprotein exprimieren, das mit der Markersubstanz, die in der Lage ist, ein optisches Signal zu emittieren, markiert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine Substanz, die die FSC-Messung hemmt, aus einer Zellkulturlösung entfernt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt des In-Kontakt-Bringens der Testsubstanz mit einem Extrakt umfasst, das aus einem lebenden Körper erhalten wurde, und eine arzneimittelmetabolische Aktivität aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem das Hormonrezeptorprotein ein Estrogenrezeptorprotein ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Hormonrezeptorprotein ein humaner Estrogenrezeptor β ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Markersubstanz ein Fluoreszenzprotein ist.