DE60021373T2

DE60021373T2 - Verfahren der zellkultivierung

Info

Publication number: DE60021373T2
Application number: DE60021373T
Authority: DE
Inventors: Yasuko Gotemba-shi OZAKI; Yasuo Gotemba-shi KOISHIHARA; Shin-ichi Gotemba-shi KAIHO
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-05-10
Filing date: 2000-05-10
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2020-05-11
Also published as: CN1350580A; WO2000068371A1; WO2000068371A8; KR20020013538A; AU4430500A; HK1045715A1; DE60021373D1; EP1176194A4; EP1176194B1; HK1045715B; CN1182244C; US6900052B1; CA2372585A1; HK1042522A1; NO20015494L; ES2241599T3; NO20015494D0; ATE299932T1; JP4721522B2; EP1176194A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von Zellen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Durchmustern von Zellen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins durch Zellkultur.
Technischer Hintergrund
Man geht davon aus, dass eine Zellgruppe, die von einer einzelnen Zelle gewonnen wird, aus Zellen besteht, die jeweils absolut identische Eigenschaften besitzen, und das Clonieren einer einzelnen Zelle, um eine solche homogene Zellgruppe zu erhalten, ist sowohl in akademischer als auch kommerzieller Hinsicht zu einer wichtigen Technologie geworden. So ist es beispielsweise für die Herstellung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen, für die die Herstellung von homogenen Produkten eine Voraussetzung ist, insbesondere für die Herstellung eines Proteins, notwendig, eine einzelne Zelle auszuwählen, zu isolieren und zu züchten, die das Protein produziert, und dadurch homogene Zellgruppen zu konstruieren, die das Protein produzieren. Das Clonieren einer einzelnen Zelle ist daher zu einer unverzichtbaren Technologie für die Herstellung von Proteinen, insbesondere von rekombinanten Proteinen geworden.
Bei dem herkömmlichen Verfahren zur Herstellung eines monoclonalen Antikörpers, das das Clonieren einer einzelnen Zellen verlangt, wurde das so genannte begrenzende Verdünnungsverfahren eingesetzt, bei dem Milzzellen, die von einem mit einem Antigen immunisierten Tier erhalten wurden, und immortalisierte Myelomzellen einer Zellfusion unterzogen werden, um Hybridome herzustellen, und jede Zelle der heterogenen Zellgruppe, die auf diese Weise hergestellt wurde, wurde zusammen mit einer Nährzelle kultiviert. Als Nährzellen wurden zu diesem Zeitpunkt Milzzellen verwendet, die einer Mitomycin- oder Bestrahlungsbehandlung unterzogen wurden, um den Zellen die Wachstumsfähigkeit zu nehmen.
In den Fällen, bei denen die Züchtung schwierig war, wurde dem Kultursystem weiterhin ein Wachstumfaktor wie IL-6 zugegeben. Jedoch hatten diese Verfahren den Nachteil, dass die verwendeten Nährzellen keine homogene Zellgruppe waren, dass die Schwankung auf Grund von experimentellen Vorgehensweisen groß war und dass eine Vorbehandlung zur Ausschaltung der Wachstumsfähigkeit notwendig war, usw. Weiterhin war bei manchen Zellen die Züchtung aus einzelnen Zellen selbst dann schwierig, wenn die Nährzelle zugegeben wurde oder ein Wachstumsfaktor und fötales Rinderserum zugegeben wurden.
Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, Seiten 16.32–16.36 beschreiben eine Calciumphosphat vermitteltes Transfektionsverfahren. Nach dem Schritt der Transfektion können die Zellen über einen Zeitraum (wie 24 bis 60 Stunden) inkubiert werden, bevor sie auf DNA-Expression hin untersucht oder in ein selektives Medium replattiert werden.
WO9813388 (als englische Übersetzung EP0962467 ) betrifft einen Antikörper gegen ein menschliches Parathyroidhormon verwandtes Protein, eine DNA, die den Antikörper codiert, einen rekombinanten Vektor, der die DNA enthält, eine Transformante, die mit dem rekombinanten Vektor transformiert wurde, ein Verfahren zur Herstellung des Antikörpers und Verwendungen des Antikörpers.
WO9814580 (als englische Übersetzung EP0960936 ) betrifft einen umgeformten menschlichen anti-HM-1.24-Antikörper, vom dem vorhergesagt wird, dass er zur medizinischen Behandlung nützlich ist.
Kudo et al. (1991): A simple and improved method to generate human hybridomas. Journal of immunological methods, Bd. 145, Nr. 1–2, Seiten 119–126, beschreiben ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von menschlichen Hybridomen unter Verwendung von bestrahlten (30 Gy)-Myelomzellen als Nährzellen.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Züchtung einer Zelle oder ein Verfahren zum Clonieren von Zellen bereit und stellt gleichzeitig ein Verfahren zum Erhalt eines Proteins durch Zellkultur bereit, wobei das Verfahren keinen der im herkömmlichen begrenzenden Verdünnungsverfahren auftretenden Nachteile besitzt.
Nach eingehender Untersuchung haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass eine homogene Zellgruppe wirksam mittels Züchtung einer transformierten Zelle oder einer Hybridomzelle, die ein Protein herstellt, zusammen mit der Mutterzelle konstruiert werden kann.
Ausführungsformen zur Durchführung der Erfindung
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „Züchtung ,einer' transformierten Zelle" den Beginn der Züchtung aus einer Zelle sowie das Züchten einer Vielzahl von Zellen, die aus dieser einen Zelle im Verlauf der Züchtung hergestellt werden.
Transformierte Zellen, umfassend gentechnisch hergestellte Zellen und Hybridomzellen, sind Zellen, die manipuliert wurden, um ein Protein konstitutiv zu produzieren, und die nicht induziert werden müssen, um das Protein zu produzieren.
Gentechnisch hergestellte Zellen beziehen sich auf die transformierten Zellen, in die eine DNA eingeführt wurde, die das Protein codiert, um ihnen die Eigenschaft der konstitutiven Herstellung des gewünschten Proteins zu verleihen. Gentechnisch hergestellte Zellen können durch Ligieren der das gewünschte Protein codierenden DNA in einen geeigneten Expressionsvektor und Einführen des erhaltenen Expressionsvektor in eine Zelle mittels gewöhnlich verwendeter Verfahren hergestellt werden. Derartige gentechnisch hergestellte Zellen schließen Zellen, bei denen die DNA in das Chromosom innerhalb der transformierten Zelle eingebaut wurde, und Zellen, bei denen die DNA außerhalb der Zelle gehalten wurde, ein.
Zellen, die für die Herstellung von gentechnisch hergestellten Zellen geeignet sind, schließen alle Arten von Wirtszellen ein, und bevorzugt sind eukaryontische Zellen zu nennen. Als eukaryontische Zellen sind tierische Zellen wie beispielsweise Säugerzellen, Hefezellen, Insektenzellen und ähnliche zu erwähnen. Als Säugerzellen sind bevorzugt CHO-, COS-, Myelomzellen, BHK (Babyhamsternieren)-, Hela-, Verozellen und andere Zellen zu nennen. Als CHO-Zellen können bevorzugt dhfr-CHO-Zellen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980), 77: 4216–4220), denen das dhfr-Gen fehlt, CHO-K-1-Zellen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60: 1275) oder CHO-DG44-Zellen (Urlaub et al., Cell (1983) 33(2): 405–412) verwendet werden.
Hybridomzellen beziehen sich auf Hybridzellen, die durch Fusionieren von Zellen, die das gewünschte Protein konstitutiv produzieren, wie beispielsweise Immunglobulin produzierende Zellen, mit immortalisierten Zellen, die mit ihnen kompatibel sind, wie beispielsweise Myelomzellen (P3K, YB2/0, U266), hergestellt werden. Weiterhin schließen Hybridomzellen immortalisierte Zellen, die mit einem Mittel zum Immortalisieren von Zellen, die das gewünschte Protein produzieren, wie beispielsweise durch die Verwendung des Epstein-Barr-Virus (EBV), erhalten wurden, ein. Als Zellen, die das gewünschte Protein produzieren und die zur Herstellung der Hybridomzellen verwendet werden, können tierische Zellen wie Zellen von Mäusen, Ratten und Menschen und ähnliche verwendet werden.
Mutterzellen beziehen sich auf Zellen, die vor der Transformation vom selben Stamm wie die Protein produzierenden Zellen sind. Als Mutterzellen wurden genau gesagt die Zellen, die zur Herstellung der Protein produzierenden Zellen verwendet wurden, verwendet. Die Mutterzellen der gentechnisch hergestellten Zellen sind beispielsweise die Zellen, die zur Einführung von DNA, die das gewünschte Protein codiert, in die Konstruktion von transformierten Zellen verwendet wurden und die nicht transformiert wurden. Die Mutterzellen von Hybridomzellen sind immortalisierte Zellen, die zur Verwendung bei der Fusion mit Immunglobulin produzierenden Zellen bestimmt sind.
Selektierbare Markergene beziehen sich auf Gene, die die Eigenschaft verleihen, dass nur das selektive Überleben der Zellen, die das gewünschte Protein produzieren, ermöglichen. Gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten transformierte Zellen, die das Protein produzieren, vorzugsweise ein selektierbares Markergen. Vorzugsweise enthalten Mutterzellen keine selektierbaren Markergene.
Als selektierbare Markergene zur Verwendung in gentechnisch hergestellten Zellen sind das Aminoglycosid-Transferase (APH)-Gen, das Thymidinkinase (TK)-Gen, das E. coli-Xanthinguanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT)-Gen, das Dihydrofolatreductase (DHFR)-Gen und ähnliche zu nennen. Somit ist es zur Tötung der Mutterzellen, während gleichzeitig die transformiertes Protein produzierenden Zellen am Leben erhalten werden, nur notwendig, die Zellen unter Bedingungen zu züchten, unter denen die Zellen ohne die Expression des selektierbaren Markergens nicht überleben können. Derartige Bedingungen schließen die Zugabe von G418 und Methotrexat und ähnliches mit ein.
Als selektierbare Markergene zur Verwendung bei Hybridomzellen sind HPRT und ähnliche zu nennen. Das selektierbare Markergen kann in die immortalisierten Zellen eingeführt werden, die einer Fusion unterzogen werden sollen, oder die immortalisierten Zellen, die bereits das selektierbare Markergen enthalten, können mit den Zellen fusioniert werden, die das gewünschte Protein produzieren. Die Zellen, die das selektierbare Markergen enthalten, können unter Bedingungen gezüchtet werden, unter denen die Zellen nicht ohne die Expression des selektierbaren Markergens überleben können. Derartige Bedingungen schließen das Züchten in einem Hypoxanthin-Thymidin freien Medium und ähnliches mit ein.
Das von den Zellen produzierte Protein kann jegliches Protein sein, das von Nutzen oder biologisch aktiv ist. Derartige Proteine schließen Hormone (Hypophysenhormon freisetzende Hormone, Oxytocine, Vasopressine, Parathyroidhormon (PTH), Parathyroidhormon verwandte Peptide (PTHrP), Wachstumshormon (GH), Prolactin, Gastrin, Secretin, Cholecystokinin, Insulin, Glucagon, Calcitonin), Enzyme (zum Beipiel Glucoseoxidase), Enzymhemmer (zum Beispiel Chymostatin), Lymphokine oder Cytokine (zum Beispiel Interleukin-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, Tumornekrosefaktor (TNF), Interferon-α (IFNα), Interferon-β, Interferon-γ, Interferon-ω, Interferon-τ), hämatopoietsche Faktoren (zum Beispiel Erythropoietin (EPO), Thromboplastin (TPO), Ganulocytenkolonie stimulierenden Faktor (G-CSF), Makrophagen stimulierenden Faktor (M-CSF), Granulocytenmakrophagenkolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF), Stammzellenwachstumsfaktor (SCF), Wachstumsfaktoren (zum Beispiel Gefäßepithelialwachstumsfaktor (VEGF), Neuronenwachstumsfaktor (NGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), von Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktor (PDGF), transformierenden Wachstumfaktor β (TGF-β), Leukocytenmigration hemmenden Faktor (LIF), ziliären, neurotrophischen Faktor (CNTF), Oncostatin M (OSM), Immunglobuline (zum Beispiel menschliche Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper oder Fragmente davon, Fv, scFv (Einzelketten-Fv), scFv-Dimer) und ähnliche ein. Wenn es sich bei der Zelle um eine Hybridomzelle handelt, ist das Protein insbesondere ein Immunglobulin.
Das Züchten oder Clonieren von Zellen kann unter Verwendung von gewöhnlich verwendeten Verfahren erfolgen. Zuerst werden Zellen, die das gewünschte Protein produzieren, in einem geeigneten Kulturmedium suspendiert. Das verwendete Medium kann ein gewöhnlicherweise verwendetes Medium wie beispielsweise DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM und ähnliches sein. Das Medium kann mit Serumergänzungen wie beispielsweise fötalem Kälberserum (FCS) oder mit einem serumfreien Medium kombiniert werden. Der pH-Wert des Mediums liegt bevorzugt im Bereich von etwa 6–8.
Die verwendeten Zellen befinden sich bevorzugt in der logarithmischen Wachstumsphase. Wenn die Zellen Cluster gebildet haben, können sie durch Spritzen unter Verwendung eine Spritze mit einem geeigneten Maß entwirrt werden. Die erhaltene Zellsuspension kann, wie es geeignet ist, verdünnt werden und in eine Zellkulturplatte mit einer Rate von einer Zelle pro Vertiefung plattiert werden.
Mutterzellen können in ähnlicher Weise hergestellt werden, und etwa 1.000 bis 20.000 Mutterzellen, bevorzugt etwa 3.000 bis 10.000 Zellen und stärker bevorzugt 5.000 bis 10.000 Zellen werden einer Vertiefung mit einer Zelle von Interesse zugegeben. Die Platte kann anschließend unter geeigneten Bedingungen gezüchtet werden. Das Züchten kann im Allgemeinen bei etwa 30 bis 40°C für etwa 96 bis 120 Stunden je nach Notwendigkeit mit einer geeigneten Konzentration an Kohlendioxid erfolgen, das Ersetzen, Belüften und Schütteln des Mediums kann durchgeführt werden.
Da die gezüchteten Zellen bevorzugt ein selektierbares Markergen enthalten, während die Mutterzellen dieses nicht enthalten, werden die Mutterzellen unter der Bedingung abgetötet, unter der das selektierbare Markergen exprimiert wird, wobei die Zellen von Interesse überleben. Die Bedingung, unter der das selektierbare Markergen exprimiert wird, kann eine Zugabe von Methotrexat zum Kulturmedium sein, wenn das selektierbare Markergen dhfr ist. Nach der Expression des selektierbaren Markergens wird das Züchten über einen geeigneten Zeitraum fortgesetzt, und anschließend wird die Kultur beipielsweise unter einem Mikroskop untersucht, um die Bildung von überlebenden Zellkolonien zu bestätigen. Nach der Bestätigung der Koloniebildung wird die Kultur in ein größeres Kulturgefäß überführt, das für eine erweiterte Kultur geeignet ist. Da die erhaltenen Kolonien von einer einzigen Zelle abstammen, zeigt die Koloniebildung, dass die Zellen cloniert wurden.
Das Züchten der erhaltenen Kolonie wird fortgesetzt und, wenn angemessen, wird sie in eine Subkultur und/oder erweiterte Kultur überführt, und das produzierte gewünschte Protein kann vom Kulturüberstand oder den Zellen geerntet werden, um das homogene Protein zu erhalten. Das erhaltene Protein kann, wenn angemessen, durch Kombinieren einer Säulenchromatographie, etc. mit einem dem Fachmann bekannten Verfahren gereinigt werden, und dann wie gewünscht gelagert und verwendet werden. Da das Protein, das durch ausgedehnte Kultur einer einzelnen Zelle erhalten wird, homogen ist, ist die nachfolgende Reinigung ebenfalls einfach, und ein Protein von höherer Reinheit kann in einer großen Menge erhalten werden. Daher ist es besonders bei der Reduzierung der Herstellungskosten von pharmazeutisch wirksamen Substanzen von Nutzen. Als Säule zur Verwendung bei der Affinitätschromatographie kann eine Affinitätschromatographiesäule verwendet werden, in der ein Antikörper für das Protein gebunden ist. Wenn das Protein ein Antikörper ist, kann eine Protein A- oder eine Protein-G-Säule verwendet werden.
Insbesondere sind als Säule, bei der Protein A verwendet wird, Hyper D, Sepharose F. F. (Pharmacia) und ähnliches zu nennen. Ionenaustauschsäulen-Chromatographie, Umkehrphasensäulen-Chromatographie, Gelfiltrationssäulen-Chromatography, etc. können geeigneterweise zur Anwendung kombiniert werden (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Hrsg. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Zusätzlich zur Säulenchromatographie kann ein Rohaufreinigungsverfahren wie beispielsweise ein Ultrafiltrationsmembranverfahren und ein Ammoniumsulfatverfahren verwendet werden.
Proteine, die cloniert und durch das Clonieren einer einzelnen Zelle der vorliegenden Erfindung produziert wurden, können insbesondere als Arzneimittel verwendet werden. Obwohl das Verabreichungsverfahren von der Aktivität der Proteine abhängt, können sie systemisch oder lokal auf parenteralem Wege verabreicht werden. Beispielsweise kann eine intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Verabreichung gewählt werden, und das Verabreichungsverfahren kann wie angemessen ausgewählt werden, abhängig vom Alter und dem Erkrankungszustand des Patienten. Zusätzlich, abhängig vom Weg der Verabreichung, können die Arzneimittel pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Zusatzstoffe enthalten. Insbesondere pharmazeutisch verträgliche grenzflächenaktive Mittel, isotonische Mittel, Stabilisatoren, Puffer, Solubilisierungsmittel, Analgetika, schwefelhaltige Reduktionsmittel und Antioxidantien können zugegeben werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun in Bezug auf die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1: Gemeinsame Züchtung mit Mutterzellen
CHO-DG44-Zellen, die Mutterzellen, wurden in dem CHO-S-SPM II (DPM)-Medium (hergestellt von GIBCO-BRL) Passagen unterzogen und gezüchtet, das mit einem 1% HT-Zusatz ergänzt wurde (hergestellt von GIBCO-BRL), und die CHO-DG44-Zellen, die sich in der logarithmischen Wachstumsphase befanden, wurden verwendet. CHO-DG44-Zellen, in die ein Gen, das den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper codiert, eingebaut worden war, wurden durch das in der Internationalen Patentveröffentlichung WO98/14580 beschriebene Verfahren hergestellt. Die so erhaltenen, den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierenden CHO-Zellen (der Expressionsvektor HEF-RVHs-AHM-gγl (FERM BP6127) für die H-Kette des humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers und der Expressionsvektor HEF-RVLa-AHM-gκ (FERM BP5645) für die L-Kette des humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers wurden zur gleichzeitigen Transformation der CHO-Zellen verwendet) wurden als transformierte Zellen verwendet.
Die den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierende CHO-Zellen wurden mit einem Verfahren hergestellt, das dem in der Internationalen Patentveröffentlichung WO98/14580 beschriebenen ähnlich ist. Die den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierenden CHO-Zellen wurden in einem CD-CHO-Medium (hergestellt von GIBCO-BRL), das mit 640 μg/ml G418 (hergestellt von GIBCO-BRL), 50 nMol/l MTX und 8 mMol/l L-Glutamin ergänzt worden war, vor der Verwendung subkultiviert. Da diese Zellen leicht Zellcluster gebildet hatten, wurde eine Spritzenbehandlung mit einer 23G-Nadel durchgeführt, um die Zellen zu entwirren.
Nachdem die den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierenden CHO-Zellen in einem zur Subkultivierung verwendeten Medium gewaschen worden waren, wurde die Zellkonzentration auf eine Zelle/Vertiefung unter Verwendung des Mediums eingestellt, um 250 ml einer Zellsuspension (20 Zellen/ml) zu erhalten. Die Zellkonzentration der Mutterzellen, der CHO-DG44-Zellen, wurde unter Verwendung desselben Mediums auf 100 Zellen/Vertiefung, 1.000 Zellen/Vertiefung und 10.000 Zellen/Vertiefung eingestellt, um 150 ml einer Zellsuspension (1 × 10³ Zellen/ml, 1 × 10⁴ Zellen/ml, 1 × 10⁵ Zellen/ml) zu erhalten.
0,05 ml der Suspension mit den den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierenden CHO-Zellen und 0,1 ml von jeder der CHO-DG44-Zell-Suspensionen wurden auf eine Platte mit 96 Vertiefungen plattiert. Somit enthielt jede Vertiefung eine den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierende CHO-Zelle. 15 Platten mit je 96 Vertiefungen wurden in ähnlicher Weise für eine Gesamtzahl von 1440 Proben für jede Suspension hergestellt.
Nach der Züchtung in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C über 14 Tage wurden sie unter einem Mikroskop untersucht. Zellen wurden aus den Vertiefungen, in denen eine Koloniebildung bestätigt wurde, geerntet und einer ausgedehnten Kultur in einer Platte mit 24 Vertiefungen (1 ml) unter Verwendung des gleichen Kulturmediums unterworfen, um ein stabiles Wachstum der Zellen sicher zu stellen. Die Zahl der Vertiefungen, bei denen Kolonien von Zellen bestätigt wurden, ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1. Ergebnis der Clonierung des Tests, dem der Mutterstamm zugegeben wurde (a)
(b)
In Tabelle 1 (a) zeigt die Zahl der Kolonien, die während der Untersuchung unter dem Miskroskop ausgewählt wurden (d.h. die Zahl der Kolonien, die auf eine Platte mit 24 Vertiefungen subkultiviert wurden) (Tag 14) und (b) zeigt die Zahl der Kolonien, die von Platten mit 24 Vertiefungen auf Platten mit 6 Vertiefungen erweitert wurden.
Es bildeten sich keine Kolonien der den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierenden CHO-Zellen in den Vertiefungen, in denen eine gemeinsame Züchtung mit 100 Zellen/Vertiefung der CHO-DG44-Zellen erfolgte, wohingegen in den Vertiefungen, in denen eine gemeinsame Züchtung mit 1.000 Zellen/Vertiefung oder 10.000 Zellen/Vertiefung der CHO-DG44-Zellen erfolgte, 6 bzw. 30 Kolonien bestätigt wurden.
Dies lässt daher vermuten, dass durch die gemeinsame Züchtung mit 1.000 Zellen/Vertiefung oder 10.000 Zellen/Vertiefung an Mutterzellen sogar eine Konzentration von einer Zelle/Vertiefung einer transformierten Zelle gezüchtet werden kann, um einzelne Clone zu erhalten, und ein Verfahren, bei dem eine gemeinsame Züchtung mit den Mutterzellen verwendet wurde, das Clonieren einer einzelnen Zelle ermöglicht, was vorher als unmöglich erachtet wurde. Die Kolonien, die unter Verwendung von Platten mit 24 Vertiefungen eine stabile Wachstumsrate in der ausgedehnten Kultur aufwiesen, wurden in Anwesenheit von 640 μg/ml G418 und 50 nM MTX gezüchtet, um dadurch homogene, den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierende CHO-Zellen zu erhalten.
Beispiel 2. Ausgedehnte Kultur
1 × 10⁵ Zellen der den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierenden CHO-Zellen, die einer ausgedehnten Kultur unterzogen wurden, wurden 11 Tage lang in einem CHO-S-SFM-11-Medium, dem Primatone 10 g/l zugegeben wurde (6 Liter × drei Behälter) bei einem pH-Wert von 7,2, DO60% luftgesättigt und 60 UpM gezüchtet. Die Kulturüberstände aus den drei Behältern wurden vereinigt, gefiltert mit Sartobran-PH-Kapseln (Sartorius), auf eine rProtein A-FF-Säule (Pharmacia) geladen, mit 1 M NaCl/10 mM Citratphosphatpuffer, pH 7,5 und 10 mM Citratphosphatpuffer, pH 7.5 gewaschen und anschließend mit 2,5 mM HCl, pH 2,7 eluiert.
Zur Entfernung des Endotoxins wurde Kurimover (Kurita Kogyo) direkt zu der erhaltenen Protein A-Elutionsfraktion zugegeben, die bei 4 bis 10°C 6 Stunden lang gerührt wurde. Durch Filtern mit einem Celluloseacetatfilter, 0,2 μm (Corning), wurden 2,65 ml einer Lösung mit dem humanisierten anti-HM1.24-Antikörper erhalten. Es wurde mittels Umkehrphasen-HPLC-Analyse bestätigt, dass der erhaltene humanisierte anti-HM1.24-Antikörper fast homogen war.
Beispiel 3.
Unter Verwendung der den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierenden CHO-Zellen und der den humanisierten anti-PHTrP-Antikörper produzierenden CHO-Zellen wurden das Clonieren einer einzelnen Zelle durch gemeinsame Züchtung mit den Mutterzellen, den CHO-DG44-Zellen, und das Clonieren einer einzelnen Zelle mittels anderer Verfahren (dem Verfahren mit konditioniertem Medium, dem Serumzugabeverfahren und dem Zelllysatverfahren) verglichen.
Die CHO-DG44-Zellen, in die ein Gen eingebaut worden war, das den humanisierten anti-PTHrP-Antikörper codiert, wurden durch das in der Internationalen Patentveröffentlichung WO 98/13388 beschriebene Verfahren hergestellt. Die so erhaltenen den humanisierten anti-PTHrP-Antikörper produzierenden CHO-Zellen (der Expressionsvektor hMBC1HcDNA/pUC19 (FERM BP-5629) für die H-Kette des anti-PTHrP-Antikörpers und ein Expressionsvektor hMBC1Lq λcDNA/pUC19 (FERM BP-5630) für die L-Kette des humanisierten anti-PTHrP-Antikörpers wurden zur gleichzeitigen Transformierung der CHO-Zellen verwendet) wurden als die transformierten Zellen verwendet. Weiterhin wurde modifiziertes CHO-S-SFMII/CD-CHO-Medium von GIBCO (halbes Medium) als frisches Medium für die den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierenden CHO-Zellen verwendet, und CHO-S-SFMII-Medium von GIBCO wurde als frisches Medium für die den humanisierten anti-PTHrP-Antikörper produzierenden CHO-Zellen verwendet.
(1) Verfahren der gemeinsamen Züchtung mit Mutterzellen
Die den humanisierten anti-HM1.24-Antikörper prdouzierenden CHO-Zellen oder die den humanisierten anti-PTHrP-Antikörper produzierenden CHO-Zellen an Tag 1 der Kultur wurden in einem frischen Medium verdünnt, so dass 0,2 ml davon jeweils eine Zelle enthalten, zu denen 5.000.000 Mutterzellen, DG44CHO-Zellen, zugegeben und suspendiert wurden. Die Zellsuspension wurde in fünf Platten mit jeweils 96 Vertiefungen mit 0,2 ml/Vertiefung inokuliert.
(2) Verfahren mit konditioniertem Medium (CM)
Der Überstand nach Zentrifugation der transformierten Zellkultur an Tag 1 der Kultur wurde durch einen 0,2 μm-Filter gefiltert. Dem Filtrat wurde die Suspension in einer Menge zugegeben, die 500 transformierten Zellen an Tag 1 der Kultur entsprach, um ein Endvolumen von 100 ml zu erzielen. Die Zellsuspension wurde in fünf Platten mit jeweils 96 Vertiefungen mit 0,2 ml/Vertiefung suspendiert. In einem Verfahren, bei dem die Kulturflüssigkeit an Tag 3 der Kultur verwendet wurde, wurde der Zentrifugations-Überstand der Kulturflüssigkeit mit transformierten Zellen an Tag 3 der Kultur in ähnlicher Weise verwendet.
(3) Serumzugabeverfahren
Die Kulturflüssigkeit mit transformierten Zellen an Tag 1 der Kultur wurde in einem frischem Medium verdünnt, um eine Zelle/200 μl zu erhalten. Zu 90 ml dieser Verdünnung wurden 10 ml FBS (Fetal Bovine Serum I.S.C. bei #3000 Charge #300050933) zugegeben und in fünf Platten mit jeweils 96 Vertiefungen mit 0,2 ml/Vertiefung verdünnt.
(4) Zelllysat-Zugabeverfahren
Die Kulturflüssigkeit mit transformierten Zellen an Tag 1 der Kultur wurde in einem frischen Medium verdünnt, um eine Zelle/200 μl zu erhalten. Das Präzipitat des Zelllysats wurde zu dieser Verdünnung suspendiert, die dann in fünf Platten mit jeweils 96 Vertiefungen mit 0,2 ml/Vertiefung plattiert wurde. Das vorstehende Zelllysat wurde wie folgt zubereitet. Nach der Zentrifugation von 5.000.000 Zellen des Mutterstammes an Tag 3 der Kultur wurde es in 10 ml sterilem Wasser suspendiert. Nach Gefrieren bei –80°C und zweimaligem Wiederholen des Auftauvorgangs bei 37°C wurde es bei 3.500 UpM 60 Minuten lang zentrifugiert. Das Präzipitat wurde in 10 ml sterilem Wasser gespült und wiederum bei 3.500 UpM 60 Minuten lang zentrifugiert, um ein Zelllysat herzustellen.
Ergebnis
Das Erscheinen von Kolonien der humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzierenden CHO-Zellen und der humanisierten anti-PTHrP-Antikörper produzierenden CHO-Zellen wurde für das jeweilige Verfahren an Tag 20 und 21 nach dem Plattieren beobachtet, und die Rate der Koloniebildung pro Platte wird in Tabelle 2 gezeigt. Als Ergebnis war das Clonieren einer einzelnen Zelle bei beiden Zellen durch das gemeinsame Züchten mit der Zelle des Mutterstammes möglich. Während das Clonieren einer einzelnen Zelle mit anderen Verfahren nicht möglich war, wie bei dem humanisierten anti-HM1.24-Antikörper beobachtet, stellte sich das Clonieren einer einzelnen Zelle durch das gemeinsame Züchten mit den Zellen des Mutterstammes als wirksam heraus. Als nur zur Kontrolle eine, drei, 10, 30 und 100 Zellen/Vertiefung der transformierten Zellen plattiert wurden, bildeten sich für jede der transformierten Zellen Kolonien, wenn 30 oder 100 Zellen plattiert wurden, während keine Kolonienbildung beobachtet wurde, wenn 10 oder weniger der transformierten Zellen plattiert wurden.
Tabelle 2 Anzahl der erschienen Kolonien für das jeweilige Clonierungsverfahren (A) Humanisierter anti-PTHrP-Antikörper (Tag 20)
(B) Humanisierter anti-HM1.24-Antikörper (Tag 21)
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung ermöglicht das Züchten oder Clonieren einer Zelle, die ein gewünschtes Protein produziert.

Claims

Verfahren zur Züchtung einer Protein produzierenden Zelle die Schritte umfassend: (a) Herstellen transformierter Zellen, die das Protein konstitutionell produzieren können, (b) Isolieren einer einzelnen transformierten Zelle von den Zellen nach Schritt (a); und (c) Züchten der einzelnen transformierten Zelle aus Schritt (b) zusammen mit Mutterzellen; wobei die transformierten Zellen unter Verwendung gentechnischer Methoden hergestellte Zellen oder Hybridomzellen sind, wobei wenn die einzelne transformierte Zelle eine unter Verwendung gentechnischer Methoden hergestellte Zelle ist, die Mutterzellen Zellen von demselben Stamm vor der Transformation sind, und wenn die einzelne transformierte Zelle eine Hybridomzelle ist, die Mutterzellen immortalisierte Zellen sind, die bei der Hybridisierung verwendet wurden, um das Hybridom herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hybridomzelle oder die unter Verwendung gentechnischer Methoden hergestellte Zelle eine Zelle ist, die ein selektierbares Markergen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein, das durch die unter Verwendung gentechnischer Methoden hergestellte Zelle produziert wurde, eine biologisch aktive Substanz ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die biologisch aktive Substanz ein Hormon, ein Enzym, ein Lymphokin, ein Cytokin, ein Wachstumsfaktor oder ein Transkriptionsfaktor, oder ein Derivat davon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein, das durch die Hybridomzelle oder die unter Verwendung gentechnischer Methoden hergestellte Zelle produziert wurde, ein Immunglobulin oder ein Derivat eines Immunglobulins ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Immunglobulin ein Maus-Antikörper, ein Ratten-Antikörper, ein chimärer Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein menschlicher Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der humanisierte Antikörper ein humanisierter Anti-HM1.24-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Derivat eines Immunglobulins Fab, F(ab')₂, oder ein Einzelketten-Fv ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die transformierte Zelle eine Säugerzelle, eine Hefezelle oder eine Insektenzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Säugerzelle eine CHO-Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Anzahl der Mutterzellen für das gemeinsame Züchten etwa 1.000 bis 10.000 ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins die Schritte umfassend: (a) Herstellen transformierter Zellen, die das Protein konstitutionell produzieren können; (b) Isolieren einer einzelnen transformierten Zelle von den Zellen nach Schritt (a); (c) Züchten der einzelnen Zelle aus Schritt (b) zusammen mit etwa 1.000 bis 10.000 Mutterzellen der transformierten Zelle, um eine transformierte Zelle mit den erwünschten Eigenschaften zu selektieren; (d) Überführen der transformierten Zelle, die in Schritt (c) selektiert wurde, in eine Subkultur und/oder eine erweiterte Kultur; und (e) Ernten der Proteins vom Kulturüberstand oder der Zelle; wobei die transformierten Zellen unter Verwendung gentechnischer Methoden hergestellte Zellen oder Hybridomzellen sind, wobei wenn die einzelne transformierte Zelle eine unter Verwendung gentechnischer Methoden hergestellte Zelle ist, die Mutterzellen Zellen von demselben Stamm vor der Transformation sind, und wenn die einzelne transformierte Zelle eine Hybridomzelle ist, die Mutterzellen immortalisierte Zellen sind, die bei der Hybridisation verwendet wurden, um das Hybridom herzustellen.