DE60019988T2

DE60019988T2 - Verfahren zur Bestimmung von Rezeptorbindungseigenschaften und Reagenz zum Assay

Info

Publication number: DE60019988T2
Application number: DE60019988T
Authority: DE
Inventors: Yoshihiro Tsuruga-shi Soya; Shigeaki Tsuruga-shi Nishii; Kazuhiro Tsuruga-shi Matsui; Takuya Tsuruga-shi Ishibashi; Yoshihisa Tsuruga-shi Kawamura
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-22
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2020-01-23
Also published as: US20010046683A1; US6638725B2; JP3649319B2; US20040072260A1; EP1026504A1; DE60019988D1; EP1026504B1; JP2000283984A

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung einer rezeptorbindenden Substanz in einer wässrigen Probe (z.B. biologisches Material, Meerwasser, Flusswasser, Grundwasser und dergleichen) oder auf ein Verfahren zur Bestimmung der Rezeptorbindungseigenschaft einer chemischen Substanz sowie auf ein Assayreagens zur Verwendung bei diesem Verfahren.
Hintergrund der Erfindung
Neuere Berichte haben ergeben, dass Substanzen verschiedene biochemische Reaktionen induzieren, die in einem lebenden Körper vorkommen. Diese Substanzen binden im Körper an ihre Rezeptoren und verursachen die Freisetzung von Signaltransmittern, die solche Reaktionen induzieren. Die Rezeptoren werden grob unterteilt in solche, die auf der Zellmembran vorhanden sind, und solche, die in einer Zelle oder einem Zellkern vorhanden sind.
Die Rezeptoren, die auf der Zellmembran vorhanden sind, sind Hormonrezeptoren, wie adrenergischer Rezeptor, LH-Rezeptor und dergleichen. Viele dieser Rezeptoren sind für die intrazelluläre Regulierung durch Signalübertragung und -verstärkung über Tyrosin-Kinase, Adenylat-Cyclase und dergleichen verantwortlich, die durch die Wechselwirkungen der Rezeptoren und ihrer Liganden reguliert werden. Beispiele für diejenigen, die in einer Zelle oder einem Zellkern vorhanden sind, sind der Estrogenrezeptor, Retinoidrezeptor und dergleichen.
Einige Rezeptoren wirken als Trägersubstanzen im Blut, wie Transferrin. Insbesondere wird davon ausgegangen, dass der Wirkungsmechanismus eines Zellkernrezeptors Folgendes beinhaltet: die Bindung zwischen einem Zellkernrezeptor und seinem Liganden, welche einen nucleinsäurebindenden Bereich des Rezeptors aktiviert, und dessen Bindung an die Nucleinsäure, die die von der Nucleinsäure ausgehende Transcription und Translation steuert, was schließlich zur Steuerung verschiedener Reaktionen im Körper führt.
Die Bindung zwischen Substanz und Rezeptor wurde in Form von Modellen, die verschiedene Reaktionen im Körper darstellen, untersucht und studiert. "Rezeptor" bedeutet eine Substanz, die kein Antikörper ist und die eine Bindungseigenschaft an ein Hormon, einen biochemischen Botenstoff, ein Steroid, einen Wirkstoff, einen Wirkstoffmetaboliten, ein Polypeptid, ein Protein, ein Vitamin, ein Alkaloid, ein Monosaccharid, ein Disaccharid, ein Polysaccharid und dergleichen zeigt.
Es gibt einige Verfahren, um die Rezeptorbindungseigenschaft einer Substanz in vitro zu beurteilen. Dazu gehören ein Verfahren, bei dem ein Radioisotop verwendet wird (Obourn, J.D. et al., Biochemistry, 32, 6229–6236, 1993), ein Verfahren, bei dem Fluoreszenzdepolarisation verwendet wird (Bolger, R. et al., Environ. Health Perspect., 106, 551–557, 1998), ein Verfahren, bei dem Oberflächenplasmonresonanz verwendet wird (Ward, L.D. et al., J. Biol. Chem., 269, 23286–23289, 1994), ein Verfahren, bei dem ein Mikrokalorimeter für einen thermodynamischen Assay verwendet wird (Moore, J.L. et al., J. Biol. Chem., 271, 21273–21278, 1996), und dergleichen.
Als in-vivo-Verfahren wurden ein Verfahren, bei dem kultivierte Zellen verwendet werden (Soto A.M. et al., Environ. Health Perspect., 103, 113–122, 1995), ein Verfahren, bei dem rekombinante Hefe verwendet wird (Arnold, S.F. et al., Environ. Health Perspect., 104, 544–548, 1996), und dergleichen beschrieben und in der Praxis durchgeführt.
Das von Bolger et al. beschriebene Verfahren, bei dem Fluoreszenzdepolarisation verwendet wird, umfasst die kompetitive Umsetzung eines fluoreszenzmarkierten Tracers mit einem Rezeptor und einer Assay-Zielsubstanz mit einem Rezep tor und die Messung der Depolarisation der Fluoreszenz aufgrund der Bindung des Tracers und des Rezeptors. Dieses Verfahren weist den Mangel auf, dass die Verwendung des fluoreszenzmarkierten Tracers eine geringere Reaktivität bewirkt, und das Verfahren unterliegt einem Einfluss einer kontaminierenden fluoreszierenden Substanz in der Probe und der Trübheit der Probe.
Das Verfahren von Obourn et al., bei dem ein Radioisotop verwendet wird, umfasst die kompetitive Umsetzung eines radioisotopmarkierten Tracers mit einem Rezeptor und einer Assay-Zielsubstanz mit einem Rezeptor und die quantitative Bestimmung des an den Rezeptor gebundenen Radioisotops. Dieses Verfahren kann nur in einer speziellen Einrichtung verwendet werden, da es ein Radioisotop verwendet, was die leichte Durchführbarkeit und Verarbeitbarkeit beschränkt.
Das Verfahren von Ward et al., bei dem Oberflächenplasmonresonanz verwendet wird, verwendet einen immobilisierten Rezeptor und analysiert die direkte molekulare Wechselwirkung zwischen der Assay-Zielsubstanz und dem Rezeptor. Mit diesem Verfahren lassen sich jedoch nicht mehrere Proben gleichzeitig verarbeiten, und es erfordert einen teuren Sensorchip und eine spezielle Apparatur.
Das Verfahren von Moore et al. für den thermodynamischen Assay ist insofern überlegen, als es keine Immobilisierung des Rezeptors oder Verwendung eines markierten Tracers erfordert. Mit diesem Verfahren lassen sich jedoch auch nicht mehrere Proben gleichzeitig verarbeiten, und es erfordert eine spezielle Apparatur.
In den letzten Jahren entstand ein Bedürfnis nach einer breiten Suche (Screening) nach endokrin wirksamen Substanzen (EWS) (Toyama, C., Clinical Endocrinology, 46, 517–528, 1998), die die Untersuchung der Rezeptorbindungseigenschaft von Zehntausenden bekannten oder neuen chemischen Substanzen erfordert. Mit den oben genannten Verfahren lassen sich nicht mehrere Proben gleichzeitig verarbeiten, und daher werden enorm viel Zeit und Arbeit benötigt.
Es besteht ein dringendes Bedürfnis nach einem Assayverfahren für die Wechselwirkung zwischen einem Rezeptor und einer chemischen Substanz, das einen hohen Durchsatz erzielen kann.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren, mit dem sich mehrere Testproben gleichzeitig verarbeiten lassen, für die Rezeptorbindungseigenschaft einer chemischen Substanz, das keine Immobilisierung des Rezeptors oder eine spezielle Vorrichtung erfordert, und ein Reagens zur Verwendung bei diesem Verfahren bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Ergebnis, dass ein Ligand, der nicht an einen Rezeptor gebunden ist, leicht allein bestimmt werden kann durch die Schritte des kompetitiven Umsetzens eines Liganden und einer Assay-Zielsubstanz mit dem Rezeptor in einer Lösung und, ohne den an den Rezeptor gebundenen Liganden physikalisch zu entfernen, des weiteren Zugebens eines Antikörpers gegen den Liganden und eines markierten Liganden, so dass eine Reaktion ermöglicht wird.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Folgendes bereit:

1. Ein Verfahren zur Bestimmung der Rezeptorbindungseigenschaft einer Assay-Zielsubstanz, das die folgenden Schritte umfasst:
(a) kompetitive Umsetzung einer bekannten Konzentration eines Liganden und der Assay-Zielsubstanz mit einer bekannten Konzentration des Rezeptors in einer Lösung;
(b) Messen der Menge des freien Liganden in der Lösung unter Verwendung von einem oder mehreren Antikörpern gegen den Liganden, ohne den an den Rezeptor gebundenen Liganden vor dem Assay physikalisch zu entfernen; und
(c) Bestimmen der Rezeptorbindungseigenschaft der Assay-Zielsubstanz anhand der Menge des freien Liganden.
2. Das Verfahren gemäß dem obigen Punkt 1, wobei der Schritt (b) die Zugabe von einem oder mehreren Antikörpern gegen den Liganden und eines markierten Liganden zu dem in Schritt (a) erhaltenen Reaktionsgemisch, so dass eine kompetitive Reaktion des Antikörpers und des freien oder markierten Liganden stattfinden kann, und das Messen der Menge des an den Antikörper gebundenen oder nicht gebundenen Markers umfasst.
3. Das Verfahren gemäß dem obigen Punkt 1, wobei der Antikörper in einem 1%igen organischen Lösungsmittel seine Aktivität zu 60% oder mehr beibehält.
4. Das Verfahren gemäß dem obigen Punkt 1, wobei der Ligand nicht markiert, gebunden, prozessiert oder denaturiert ist.
5. Das Verfahren gemäß dem obigen Punkt 1, wobei der Rezeptor in einer Menge verwendet wird, die zu einer Bindung von 50% oder mehr des Liganden an den Rezeptor führt.
6. Das Verfahren gemäß dem obigen Punkt 1, wobei der Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Rezeptoren von Hormonen, Wirkstoffen, Wirkstoffmetaboliten, Polypeptiden, Proteinen, Sacchariden, biochemischen Botenstoffen und vitamin- und ligandbindenden Domänen davon besteht.
7. Ein Reagens zur Bestimmung der Rezeptorbindungseigenschaft einer Substanz, umfassend ein Reagens, das eine bekannte Konzentration eines Rezeptors enthält, ein Reagens, das eine bekannte Konzentration eines Liganden des Rezeptors enthält und ein Reagens zur Messung eines freien Liganden, das einen oder mehrere Antikörper gegen den Liganden enthält.
8. Das Reagens gemäß dem obigen Punkt 7, das weiterhin ein Reagens umfasst, das den markierten Liganden enthält.
9. Das Reagens gemäß dem obigen Punkt 7, wobei der Antikörper in einem 1%igen organischen Lösungsmittel seine Aktivität zu 60% oder mehr beibehält.
10. Das Reagens gemäß dem obigen Punkt 7, wobei der Ligand nicht markiert, gebunden, prozessiert oder denaturiert ist.
11. Das Reagens gemäß dem obigen Punkt 7, wobei der Rezeptor in einer Menge verwendet wird, die zu einer Bindung von 50% oder mehr des Liganden an den Rezeptor führt.
12. Das Reagens gemäß dem obigen Punkt 7, wobei der Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Rezeptoren von Hormonen, Wirkstoffen, Wirkstoffmetaboliten, Polypeptiden, Proteinen, Sacchariden, biochemischen Botenstoffen und vitamin- und ligandbindenden Domänen davon besteht.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich, kurz gesagt, auf ein Verfahren zur Bewertung der Rezeptorbindungseigenschaft einer natürlichen Verbindung oder einer künstlich synthetisierten Verbindung. Gemäß diesem Verfahren werden die zu bewertende Substanz und ein unmarkierter Ligand kompetitiv an einer Bindungsstelle auf dem Rezeptor umgesetzt, und die Konzentration des freien Liganden wird direkt im Reaktionsgemisch bestimmt, ohne den an den Rezeptor gebundenen Liganden vom freien Liganden abzutrennen. In der vorliegenden Erfindung umfasst der Rezeptor ein Hormon, einen Wirkstoff, Wirkstoffmetaboliten, ein Polypeptid, Protein, Saccharide, einen biochemischen Botenstoff, ein Vitamin, ligandbindende Domänen davon und dergleichen. Der Rezeptor umfasst Rezeptoren auf Biomembranen (z.B. LH-Rezeptor (LH = luteinisierendes Hormon, FSH-Rezeptor (FSH = follikelstimulierendes Hormon), Human-Choriogonadotropin-Rezeptor, Thyreotropinrezeptor und dergleichen), Zellkern- und Cytoplasmarezeptoren (z.B. Estrogenrezeptor, Androgenrezeptor, Progesteronrezeptor, PPAR-Rezeptor (peroxisome proliferator activated receptor), Glucocorticoidrezeptor, Retinsäurerezeptor, Retinoid-X-Rezeptor, Thyroidhormonrezeptor, Ubichinonrezeptor, Vitamin-D-Rezeptor, Mineralcorticoidrezeptor und dergleichen) sowie Rezeptoren um Serum als Träger (z.B. Thyroglobulin, Transferrin und dergleichen). Daher bedeutet der "Ligand" in der vorliegenden Erfindung luteinisierendes Hormon, follikelstimulierendes Hormon, humanes Choriogonadotropin, Thyreotropin, Estrogen, Androgen, Progesteron, Peroxisom, Glucocorticoid, Retinsäure, Retinoid X, Thyroidhormon, Ubichinon, Vitamin D, Mineralcorticoid, Eisen und dergleichen, die den oben genannten Rezeptoren entsprechen.
Das Bindungsverhältnis der Assay-Zielsubstanz und des Liganden mit dem Rezeptor wird anhand ihrer bestehenden Verhältnisse und der jeweiligen Bindungskonstanten bestimmt. Wenn ein Rezeptor und ein Ligand in gegebenen Konzentrationen vorhanden sind, wird das Bindungsverhältnis des Liganden mit dem Rezeptor konstant. Wenn eine Substanz mit Rezeptorbindungseigenschaft vorhanden ist, nimmt die Menge des Liganden, der an den Rezeptor bindet, jedoch in Abhängigkeit von der Menge der Substanz und ihrer Bindungskonstante ab, und die Menge an freiem Ligand nimmt zu. Durch Messung der Variation der Konzentration des Liganden wird eine indirekte Bewertung der Rezeptorbindungseigenschaft einer Substanz ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung umfasst höchst charakteristischerweise die folgenden Schritte, um die Rezeptorbindungseigenschaft zu bewerten:

(a) Hinzufügen eines Liganden, von dem bekannt ist, dass er an den Rezeptor bindet;
(b) kompetitives Umsetzen einer Assay-Zielsubstanz und des Liganden an einer Bindungsstelle des Rezeptors; und
(c) Messen der Menge des freien Liganden im Reaktionsgemisch, ohne den an den Rezeptor gebundenen Liganden vor dem Assay physikalisch zu entfernen. Gemäß diesem Verfahren und im Unterschied zu herkömmlichen Verfahren braucht der Rezeptor oder Ligand nicht auf einem unlöslichen Träger immobilisiert zu werden. Da der kompetitiv mit einem Rezeptor umzusetzende Ligand außerdem nicht markiert ist, nimmt die Reaktivität nicht ab. Außerdem kann der Ligand ein beliebiger Ligand sein, solange er Rezeptorbindungseigenschaft aufweist, und es kann einer verwendet werden, der ökonomisch und effizient bestimmt werden kann. "Physikalisches Entfernen" bedeutet hier einen Schritt zum Abtrennen eines an einen Rezeptor gebundenen Liganden von einem freien Liganden, wobei es sich um ein herkömmliches Verfahren handeln kann, wie Waschen, Filtrieren durch einen Filter, Trennung durch Magnetismus und dergleichen. Die Trennung kann während der Bestimmung des freien Liganden durchgeführt werden, zum Beispiel wenn ein festphasengebundener Antikörper verwendet wird und dergleichen.

Nach einem Assay zur Bestimmung einer endokrin wirksamen Substanz bestand in letzter Zeit ein starkes Bedürfnis. Die Kombination eines Rezeptors und eines Liganden zum Screening nach einer solchen Substanz unterliegt zwar keiner besonderen Einschränkung, doch handelt es sich vorzugsweise um einen Estrogen-Rezeptor und Estradiol, Estron oder Estriol, einen Thyroidhormonrezeptor und Thyroxin oder Triiodthyronin und dergleichen. Das Assayverfahren der vorliegenden Erfindung kann auch für eine andere Kombination aus Rezeptor und Ligand als die oben genannten verwendet werden.
Der oben genannte Ligand ist vorzugsweise nicht markiert, gebunden, prozessiert oder denaturiert. Die hinzuzufügende Menge des Rezeptors ist vorzugsweise so groß, dass eine Bindung von nicht weniger. als 50% des daneben vorliegenden Liganden ermöglicht wird. Wenn die Konzentration kleiner als 50% ist, zeigt der Ligand eine sehr geringe Variation der Konzentration, was wiederum die Bewertung der Rezeptorbindungseigenschaft schwierig macht.
Die Konzentration an freiem Liganden wird nach einem bekannten Verfahren gemessen. Vorzugsweise wird ein spektroskopisches Verfahren oder ein Fluoreszenz/Lumineszenz-Assay angewendet. Wenn ein spektroskopisches Verfahren verwendet wird, beinhaltet der Assay im Allgemeinen eine kompetitive Reaktion des freien Liganden und eines enzymmarkierten Liganden mit einem immobilisierten Anti-Ligand-Antikörper. Das als Marker zu verwendende Enzym kann eine Peroxidase, Alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Acetylcholin-Esterase und dergleichen sein, wobei eine Peroxidase bevorzugt ist. Bei einem Fluoreszenz/Lumineszenz-Assay werden anstelle eines Enzymmarkers ein Fluoreszenzmarker, Lumineszenzmarker und dergleichen verwendet. Beispiele für den Fluoreszenzmarker sind Fluorescein, Rhodamin und dergleichen, und Beispiele für den Lumineszenzmarker sind Acridiniumester, Photoprotein (z.B. Aequorin) und Enzyme (z.B. Luciferase).
Der in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Antikörper unterliegt keiner besonderen Einschränkung hinsichtlich seiner Herkunft, Eigenschaft und dergleichen, solange er einen Liganden bestimmen kann. Der Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper sein. Wenn in einer Probe eine gegenüber dem Antikörper reaktive Substanz vorhanden ist, wird vorzugsweise ein Antikörper gegen die Substanz zu dem Reagens gegeben, um einen Einfluss der Substanz auf den Assay zu verhindern. Wenn ein Antikörper auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisiert ist, kann alternativ dazu auch ein Antikörper (sekundärer Antikörper) gegen den für eine höhere Orientierung zu verwendenden Antikörper zuvor an einen wasserunlöslichen Träger gebunden werden. Es ist auch möglich, ein bekanntes Verfahren zur Bereitstellung einer festen Phase zu verwenden, wie ein Verfahren, das das vorherige Immobilisieren von Protein A oder Protein G und das Binden des Antikörpers oder aber das Binden eines biotinylierten Antikörpers an einen wasserunlöslichen Träger, an dem zuvor Streptavidin oder Avidin immobilisiert wurde, umfasst.
Da die Assay-Zielsubstanz eine geringere Löslichkeit in Wasser haben kann, wird ein organisches Lösungsmittel verwendet, um die Probe aufzulösen. Das zu verwendende organische Lösungsmittel unterliegt zwar keiner besonderen Einschränkung, doch werden Methanol, Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Ethanol und dergleichen bevorzugt. In diesem Fall muss der zu verwendende Antikörper beständig gegenüber dem zu verwendenden organischen Lösungsmittel sein. Wünschenswerterweise behält dieser Antikörper seine Antikörperaktivität in einem organischen Lösungsmittel mit 1%iger Konzentration zu 60% oder mehr bei. "Antikörperaktivität" bedeutet hier die spezifische Affinität des Antikörpers zu dem zu verwendenden Liganden.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen ausführlicher erläutert, auf die die vorliegende Erfindung jedoch nicht beschränkt ist.
Beispiel 1: Bewertung der Estrogen-Rezeptor-Bindungseigenschaft
Zusammensetzung von Reagens 1

Estrogenrezeptor: 100 nM (in 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl; pH 7,2)
17β-Estradiol: 33 nM (in 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl; pH 7,2)

Zusammensetzung von Reagens 2
Mikrotiterplatte mit gebundenem Anti-Estradiol-Antikörper HRP-markiertes Estradiol
Probe
Diethylstilbesterol (0, 3,3, 10, 33, 100, 333, 1000 ng/ml)
Assayverfahren
Eine Probe (30 μl) und eine Estrogenrezeptor-Lösung (20 μl) wurden miteinander gemischt, und eine 17β-Estradiol-Lösung (30 μl) wurde hinzugefügt, und anschließend erfolgte eine Inkubation bei 37 °C während 1 h. Die Lösung (50 μl) wurde in eine Mikrotiterplatte mit gebundenem Anti-Estradiol-Antikörper gegeben, und gleichzeitig wurde eine Lösung von mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiertem Estradiol (50 μl) zugegeben, und danach wurde 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde entfernt, und die Platte wurde dreimal mit 10 mM Phosphatpuffer gewaschen, der 0,15 M NaCl und 0,05% Tween 20 enthielt. Nach dem Waschen wurde eine Lösung von o-Phenylendiamin (OPD) (50 μl) hinzugefügt, und das Gemisch wurde 20 min lang bei 37 °C inkubiert. 1 N Schwefelsäure (100 μl) wurde hinzugefügt, und die Extinktion bei 490 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Die Extinktion nahm mit zunehmenden Diethylstilbesterol-Konzentrationen ab. Es wurde also bestätigt, dass Diethylstilbesterol in der Lage ist, quantitativ eine Estrogen-Rezeptor-Bindungseigenschaft zu zeigen.
Beispiel 2: Bewertung der Estrogen-Rezeptor-Bindungseigenschaft
Zusammensetzung von Reagens 1
Estrogenrezeptor: 100 nM (in 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl; pH 7,2)
17β-Estradiol: 33 nM (in 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl; pH 7,2) Mikrotiterplatte A mit gebundenem Anti-Estradiol-Antikörper HRP-markiertes Estradiol
Zusammensetzung von Reagens 2

Mikrotiterplatte B mit gebundenem Anti-Estradiol-Antikörper HRP-markiertes Estradiol
Probe
Diethylstilbesterol (0, 1000 ng/ml; hergestellt mit PBS, hergestellt mit 1% DMSO-Lösung)
Assayverfahren
In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurde der Assay durchgeführt.
Tabelle 2
Wenn PBS als Lösungsmittel verwendet wurde, zeigten die beiden Arten von Antikörpern keinen signifikanten Unterschied in den Assaywerten. Wenn jedoch ein organisches Lösungsmittel verwendet wurde, variierten die Assaywerte stark je nach den verwendeten Antikörpern. Das heißt, wenn ein Antikörper verwendet wird, der in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels eine geringere Reaktivität zeigt, wird die Bewertung der Rezeptorbindungseigenschaft einer Assay-Zielsubstanz aufgrund der geringen Variation der Extinktion schwierig.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Rezeptorbindungseigenschaft einer Assay-Zielsubstanz, das die folgenden Schritte umfasst: (a) kompetitive Umsetzung einer bekannten Konzentration eines Liganden und der Assay-Zielsubstanz mit einer bekannten Konzentration des Rezeptors in einer Lösung; (b) Messen der Menge des freien Liganden in der Lösung unter Verwendung von einem oder mehreren Antikörpern gegen den Liganden, ohne den an den Rezeptor gebundenen Liganden vor dem Assay physikalisch zu entfernen; und (c) Bestimmen der Rezeptorbindungseigenschaft der Assay-Zielsubstanz anhand der Menge des freien Liganden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt (b) die Zugabe von einem oder mehreren Antikörpern gegen den Liganden und eines markierten Liganden zu dem in Schritt (a) erhaltenen Reaktionsgemisch, so dass eine kompetitive Reaktion des Antikörpers und des freien oder markierten Liganden stattfinden kann, und das Messen der Menge des an den Antikörper gebundenen oder nicht gebundenen Markers umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Antikörper in einem 1%igen organischen Lösungsmittel seine Aktivität zu 60% oder mehr beibehält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Ligand nicht markiert, gebunden, prozessiert oder denaturiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Rezeptor in einer Menge verwendet wird, die zu einer Bindung von 50% oder mehr des Liganden an den Rezeptor führt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Rezeptoren von Hormonen, Wirkstoffen, Wirkstoffmetaboliten, Polypeptiden, Proteinen, Sacchariden, biochemischen Botenstoffen und vitamin- und ligandbindenden Domänen davon besteht.
Reagens zur Bestimmung der Rezeptorbindungseigenschaft einer Substanz, umfassend ein Reagens, das eine bekannte Konzentration eines Rezeptors enthält, ein Reagens, das eine bekannte Konzentration eines Liganden des Rezeptors enthält und ein Reagens zur Messung eines freien Liganden, das einen oder mehrere Antikörper gegen den Liganden enthält.
Reagens gemäß Anspruch 7, das weiterhin ein Reagens umfasst, das den markierten Liganden enthält.
Reagens gemäß Anspruch 7, wobei der Antikörper in einem 1%igen organischen Lösungsmittel seine Aktivität zu 60% oder mehr beibehält.
Reagens gemäß Anspruch 7, wobei der Ligand nicht markiert, gebunden, prozessiert oder denaturiert ist.
Reagens gemäß Anspruch 7, wobei der Rezeptor in einer Menge verwendet wird, die zu einer Bindung von 50% oder mehr des Liganden an den Rezeptor führt.
Reagens gemäß Anspruch 7, wobei der Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Rezeptoren von Hormonen, Wirkstoffen, Wirkstoffme taboliten, Polypeptiden, Proteinen, Sacchariden, biochemischen Botenstoffen und vitamin- und ligandbindenden Domänen davon besteht.