DE60017801T2

DE60017801T2 - Inhalierung von anti-endotoxinmitteln zur vorbeugung oder behandlung von bakterieller lungeninfektion oder symptomatischer endotoxinaussetzung der lunge

Info

Publication number: DE60017801T2
Application number: DE60017801T
Authority: DE
Inventors: P. Daniel ROSSIGNOL; W. Mary VERMEULEN
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 1999-11-23
Filing date: 2000-11-22
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2020-11-23
Also published as: EP1248629A1; EP1248629A4; AU1794601A; JP2003514862A; US6417172B1; HK1051490A1; CA2392356A1; EP1248629B1; US20030134805A1; ES2237475T3; WO2001037843A1; US6683063B2; ATE287719T1; DE60017801D1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Anti-Endotoxins bei der prophylaktischen und fördernden Behandlung einer pulmonalen bakteriellen Infektion oder einem symptomatischen pulmonalen Kontakt mit Endotoxin durch Inhalation.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Auftreten von Gramm-negativen Bakteriämien in den Vereinigten Staaten von Amerika wird auf ungefähr 100.000 bis 300.000 Fälle pro Jahr geschätzt mit einer Sterbensrate von 30–60%. Es werden üblicherweise Antibiotika als primäre Chemotherapie für diese Erkrankung eingesetzt, jedoch kann deren bakterizide Wirkung die Zerstörung des Bakteriums und die damit verbundene Freisetzung von Endotoxin, d.h. dem Lipopolysaccharid (LPS)-Rest der äußeren Membran des Bakteriums bewirken. Das freigesetzte LPS löst eine Anzahl von pathophysiologischen Ereignissen in Säugetieren aus (die zusammen als Gramm-negative Endotoxämien oder als Sepsis-Syndrom bezeichnet werden). Diese umfassen Fieber, Allgemeinentzündung, disseminierte intravasale Koagulation (DIC), Hypotonie, akutes Nierenversagen, akutes Atemnotsyndrom (ARDS), hepatocelluläre Destruktion und Herzversagen.
Obwohl Endotoxin einen septischen Schock auslöst, besitzt es geringe oder keine toxische Wirkung auf Gewebe; stattdessen steuert es eine biologische Immunantwort, die zu einer Freisetzungskaskade von Cytokinen, wie Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Interleukin-1, Interleukin-6 und Interleukin-8 und anderen biologischen Mediatoren wie Stickstoffoxid sowie einer Reihe von sekundären Mediatoren (z.B. Prostaglandinen, Leukotrienen, Interferonen, Plättchen-aktivierender Faktor, Endorphinen und Kolonie-stimulierenden Faktoren) führt. Die Erzeugung von pathophysiologischen Konzentrationen von diesen Cytokinen und inflammatorischen Mediatoren beeinflusst den Vasomotorentonus, die mikrovasculäre Permeabilität und die Aggregation von Leukozyten und Plättchen, was zu einem Syndrom, das als „systemisches inflammatorisches Antwortsyndrom" (oder SIRS) bezeichnet wird und zu septischem Schock führt.
Das bakterielle Lipopolysaccharid-Molekül besteht aus drei Hauptregionen: ein langkettiges Polysaccharid (O-Antigen), eine Kernregion und eine Lipid-A-Region. Das gesamte Lipopolysaccharid-Molekül als auch dessen einzelne Bestandteile weisen wie oben beschrieben toxische Wirkungen auf. Die meisten dieser toxischen Wirkungen sind jedoch vermutlich auf den Lipid-A-Teil zurückzuführen. Strukturell ist Lipid-A aus einem diphosphorilierten Disaccharid, das durch langkettige Fettsäure acyliert ist, aufgebaut.
Therapien für Endotoxin-bezogene Erkrankungen sind im Allgemeinen auf die Kontrolle der Entzündungsantwort gerichtet worden. Solche Therapien umfassen eine Corticosteroid-Behandlung, von der angenommen wird, dass sie eine Endotoxinvermittelte Zellmembramverletzung verbessert und die Herstellung von bestimmten biologischen Mediatoren verringert; die Verabreichung von Antikörpern, die so entworfen worden sind, dass sie bakterielles LPS neutralisieren; die Behandlung mit Agenzien zur Supprimierung von Hypotonie oder mit Naloxon, welches die Hypotonie-Wirkungen, die mit einem Sepsis-Syndrom in Verbindung stehen, hemmt und die Behandlung mit nicht steroidalen anti-inflammatorischen Arzneimitteln, von denen behauptet wird, dass sie Cyclooxygenasen hemmen und dadurch die Herstellung von bestimmten sekundären Mediatoren wie Prostaglandine und Thromboxan verringern.
Jedoch führte keine dieser Therapien bis jetzt zu einer signifikanten Verringerung bei der Morbidität und der Sterblichkeitsrate, die auf Sepsis und das septische Schock-Syndrom zurückzuführen sind. Daher besteht ein seit längerem bestehender Bedarf an Agenzien, um diese Erkrankung vorteilhaft zu behandeln.
Christ et al., „Anti-Endotoxin Compounds", US-Patentnr. 5,530,113 offenbaren bestimmte Disaccharid-Verbindungen wie das unten gezeigte B531, die zur Behandlung von Endotoxämie verwendbar sind.
Andere Literaturstellen, die bestimmte Lipodisaccharide offenbaren, umfassen Macher et al., Britische Patentnr. 2,179,945; Meyers et al., Britische Patentnr. 2,220,211; Shiba et al., Europäische Patentnr. 172,581; Anderson et al., US-Patentnr. 4,495,346 und Shiba et al., US-Patentnr. 5,066,794. WO 96/39411 offenbart substituierte Lipopolysaccharide, die zur Behandlung und Vorbeugung von Endotoxämie verwendbar sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Prävention und Behandlung von pulmonaler bakterieller Infektion oder von symptomatischem pulmonalen Kontakt mit Endotoxinen und damit verbundenen Erkrankungen unter Verwendung von Liposaccharid-Analoga, die durch Inhalation verabreicht werden. Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Verbindungen besitzen Vorteile bezüglich deren pharmazeutischen Verwendung wie eine erhöhte pharmakologische Selektivität, Wirksamkeit und insbesondere eine erhöhte Wirkungsdauer. Eine beispielhafte Verbindung von dieser Erfindung, Verbindung 1 (1287; SGEA), ist unten gezeigt:
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung die prophylaktische und fördernde Behandlung einer beliebigen LBS-vermittelten Erkrankung. Diese Erkrankungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Sepsis, Septikämie, (einschließlich, aber nicht beschränkt auf) Endotoxämie, Endotoxämie, die auf eine Gramm-negative Bakteriämie zurückzuführen ist (mit deren Begleitsymptomen wie Fieber, Allgemeinentzündung, disseminierte intravasale Koagulation, Hypotonie, akutes Nierenversagen, akutes Atemnotsyndrom, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen (ARDS), hepatocelluläre Destruktion und/oder Herzversagen) und verschiedene Formen von septischem Schock (einschließlich, aber nicht beschränkt auf endotoxischen Schock). Auch sind die erfindungsgemäßen Verbindungen bei der prophylaktischen oder fördernden Behandlung einer lokalisierten oder systemischen Entzündungsantwort gegenüber einer Infektion von unterschiedlichen Arten von Organismen, einschließlich Gramm-negativen Bakterien und bei Erkrankungen, die auf eine Verlagerung von Gramm-negativen Bakterien oder Endotoxin aus dem Darm zurückzuführen sind, einsetzbar. Zusammen werden diese Erkrankungen als systemisches inflammatorisches Antwortsyndrom oder SIRS bezeichnet (zur Erörterung von diesen Begriffen siehe Bone et al., Chest 101:1644-1655, 1992).
DEFINITIONEN
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung und so wie hier verwendet, besitzen die folgenden Ausdrücke die folgenden Bedeutungen, soweit es nicht explizit anders angegeben ist.
Der Ausdruck „Alkyl" bezeichnet aliphatische organische Gruppen, die entweder verzweigt oder geradkettig sein können und die gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen an einer beliebigen Position entlag der Alkylkette substituiert sein können. Alkylgruppen umfassen sowohl Gruppen, die eine einzelne unbesetzte Valenz aufweisen, z.B. -CH₂-CH₃ sowie Alkylengruppen, die zwei nicht besetzte Valenzen besitzen, z.B. -CH₂-CH₂-. Da es für den Fachmann offensichtlich ist, wird eine einzeln oder doppelt unbesetzte Valenz als zweckdienlich erachtet, um Verbindungen zu beschreiben, die chemisch stabil sind.
Der hier verwendete Ausdruck „Prodrug" (Pro-Pharmakon) bezeichnet eine beliebige Verbindung, die eine geringere intrinsische Aktivität aufweist als das korrespondierende „Arzneimittel", welches jedoch bei einer Verabreichung an ein biologisches System die „Arzneimittel"-Substanz entweder als Ergebnis einer spontanen chemischen Reaktion oder durch Enzymkatalyse oder metabolische Reaktion erzeugt. Es wird auf verschiedene Prodrugs wie Acylester, Carbonate, Phosphate und Urethane, die hier als Beispiele eingeschlossen sind, Bezug genommen. Die beschriebenen Gruppen sind beispielhaft und nicht erschöpfend und ein Fachmann könnte andere bekannte Abwandlungen von Prodrugs herstellen. Solche Prodrugs der Verbindungen der Formel I fallen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Der Ausdruck „pharmazeutisch verträgliches Salz" umfasst Salze von Verbindungen der Formel I, die von der Kombination einer erfindungsgemäßen Erfindung abgeleitet sind und eine organische oder anorganische Säure oder Base einschließen. Die Verbindungen der Formel I sind sowohl in der nicht-ionisierten als auch in deren Salzform verwendbar. In der Praxis kommt der Verwendung einer Salzform der Verwendung einer Basenform gleich; beide Formeln fallen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Der Ausdruck „geometrische Isomere" bezeichnet „trans" oder „cis" (oder „entgegen" oder „zusammen")-Isomere, wie es im Allgemeinen von dem Fachmann verstanden wird. Alle geometrische Isomere fallen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Weiter können die erfindungsgemäßen Verbindungen asymmetrische Kohlenstoffatome enthalten und können daher als Stereoisomere, d.h. sowohl als Enantiomere als auch als Diastereomere vorkommen. Alle Stereoisomere und Gemische davon sollen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung fallen. Die hier genannten synthetischen Beispiele beziehen sich auf das am meisten bevorzugte Isomer. Es ist offensichtlich, dass neben dem Zuckerrest zusätzliche asymmetrische Kohlenstoffatome in den Verbindungen der Formel I vorhanden sein können, beispielsweise in den Seitenketten. In diesem Fall werden alle daraus entstehenden Diastereomere als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung fallend angesehen werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Inhibition der Freisetzung von TNF-α durch Verbindung 1, was die Inhibition einer LPS-vermittelten Induktion von Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) in humanem Vollblut durch eine erfindungsgemäße Erfindung verdeutlicht.
2 zeigt das allgemeine Schema, das zur Analyse der antagonistischen Wirksamkeit eines Arzneimittels nach der Inkubation in Vollblut für verschiedene Zeiten verwendet wird.
3 zeigt die Beziehung zwischen der Zeit gegenüber der Fähigkeit der Testverbindung TNF-α zu inhibieren und beweist, dass die Verbindung 1 eine bessere Wirkungsdauer als LPS-Antagonist im Vergleich zu B531 besitzt. Diese Daten stellen den Durchschnitt von sieben getrennten Experimenten dar, wobei jedes dreifach durchgeführt wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Prävention und Behandlung einer pulmonalen bakteriellen Infektion, einem symptomatischen pulmonalen Kontakt mit Endotoxin und damit verbundenen Zuständen in einem Patienten durch Verabreichung einer Anti-Endotoxin-Verbindung durch Inhalation an den Patienten. Diese Verbindungen und Verfahren sind im Folgenden weiter beschrieben.
LIPOSACCHARIDE
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von substituierten Liposacchariden, welche die Verbindungen der allgemeinen Formel I einschließen.
worin R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
worin jedes J, K und Q unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1-bis C15-Alkyl ist;
L O, NH oder CH₂ ist; M O oder NH ist; und G NH, O, S, SO oder SO₂ ist;
R² geradkettiges oder verzweigtes C5- bis C15-Alkyl ist;
R³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus geradkettigem oder verzweigtem C5- bis C18-Alkyl,
worin E NH, O, S, SO oder SO₂ ist; wobei A, B und D jeweils unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C15-Alkyl sind;
R⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus geradkettigem oder verzweigtem C4- bis C20-Alkyl und
worin U und V jeweils unabhängig voneinander geradkettiges C2- bis C15-Alkyl sind und W Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C5-Alkyl ist;
R_A R⁵ oder R⁵-O-CH₂- ist, wobei R⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, J', -J'-OH, -J'-O-K', -J'-O-K'-OH, und -J'-O-PO(OH)₂, wobei jedes J' und K' unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C5-Alkyl ist;
R⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Hydroxygruppe, Halogen, C1- bis C5-Alkoxy, und C1- bis C5-Acyloxy;
A¹ und A² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
worin Z geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C10-Alkyl ist;
oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
Ausführungsformen der oben genannten Formel umfassen die folgenden oder die Kombinationen der folgenden:
R² ist C8- bis C15-geradkettiges oder verzweigtes Alkyl;
R² ist C9- bis C12-geradkettiges oder verzweigtes Alkyl;
R² ist C10-geradkettiges oder verzweigtes Alkyl;
A¹ und A² sind unabhängig OH oder -O-PO(OH)₂;
R⁶ ist eine Hydroxygruppe;
R⁵ ist C1- bis C5-geradkettiges oder verzweigtes Alkyl;
R¹ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
worin jedes J, K und Q unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C15-Alkyl ist;
R³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
worin jedes A, B und D unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C18-Alkyl ist;
die Doppelbindungen R³ cis oder zusammen sind;
die Doppelbindungen von R³ trans oder entgegen sind;
R⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus geradkettigem oder verzweigtem C4- bis C20-Alkyl und
worin U geradkettiges oder verzweigtes C2- bis C5-Alkyl ist, V geradkettiges oder verzweigtes C5- bis C12-Alkyl und W Wasserstoff ist oder geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C5-Alkyl;
R_A R⁵ ist und R_A R⁵-O-CH₂- ist.
In anderen Ausführungsformen sind A¹ und A² unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus OH und -O-PO(OH)₂;
R¹ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
worin jedes J, K und Q unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C15-Alkyl ist;
R² geradkettiges oder verzweigtes C8- bis C15-Alkyl ist;
R³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
worin jedes A, B und D unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C15-Alkyl ist;
R⁴
ist,
worin U geradkettiges oder verzweigtes C2- bis C5-Alkyl ist, V geradkettiges oder verzweigtes C5- bis C12-Alkyl ist und W Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C5-Alkyl ist; und R⁵ geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C5-Alkyl ist und
R⁶ eine Hydroxygruppe ist.
In einer anderen Ausführungsform sind A¹ und A² -O-PO(OH)₂;
R¹ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
worin jeweils J und Q unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C5-Alkyl sind
und K geradkettiges oder verzweigtes C8- bis C15-Alkyl ist;
R² geradkettiges oder verzweigtes C8- bis C15-Alkyl ist;
R³
ist,
worin A geradkettiges oder verzweigtes C5- bis C12-Alkyl ist und B geradkettiges oder verzweigtes C6- bis C12-Alkyl ist;
R⁴
ist,
worin U geradkettiges oder verzweigtes C2- bis C5-Alkyl ist, V geradkettiges oder verzweigtes C5- bis C12-Alkyl ist und W Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C5-Alkyl ist; und
R⁵ geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C5-Alkyl ist; und
R⁶ eine Hydroxygruppe ist.
In einer anderen Ausführungsform sind A¹ und A² -O-PO(OH)₂;
R¹ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
worin jeweils J und Q unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C- bis C3-Alkyl sind und
K geradkettiges oder verzweigtes C10- bis C12-Alkyl ist;
R² geradkettiges oder verzweigtes C9- bis C12-Alkyl ist;
R³
worin A geradkettiges oder verzweigtes C8- bis C12-Alkyl ist und B geradkettiges oder verzweigtes C6- bis C10-Alkyl ist;
R⁴
ist,
worin U geradkettiges oder verzweigtes C2- bis C4-Alkyl ist, V geradkettiges oder verzweigtes C5- bis C10-Alkyl ist und W Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C3-Alkyl ist und
R⁵ geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C3-Alkyl ist; und
R⁶ eine Hydroxygruppe ist.
In einer anderen Ausführungsform sind A¹ und A² -O-PO(OH)₂;
R¹ ist

R² ist (CH₂)₉CH₃;
R³ ist

R⁴ ist

R⁵ ist -CH₃; und
R⁶ ist eine Hydroxygruppe.
Auch innerhalb des Umfangs der Erfindung sind Verbindungen, in denen R1 und R3 Sulfonyle sind, d.h. Verbindungen, in denen das Carbonyl auf diesen Seitenketten mit SO₂ ersetzt ist. Diese Verbindungen könnten hergestellt werden, indem der passend substituierte alkoholische Zucker mit dem passenden Alkylsulfonylchlorid behandelt wird. Somit können R1 und R3 auch aus dem Folgenden ausgewählt sein, wobei A, B, D, E, J, K, L, Q und M wie oben defniert sind:
Weiter fallen innerhalb des Umfangs der Erfindung Verbindungen, in denen der Sättigungspunkt innerhalb der R3-Seitenkette keine Doppelt- oder Dreifach-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung ist, sondern eine gegebenenfalls substituierte aromatische Gruppe ist, d.h. Verbindungen, in denen R3 die folgende Struktur haben kann:
worin E NH, O, S, SO oder SO₂ ist, jeweils A geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C15-Alkylen ist; D geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C15-Alkyl ist; F H, -OT, NT¹T², -CO2T, Phenyl oder Null ist, worin jeweils T, T¹ und T² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff oder C1- bis C15-Alkyl; worin B neben F liegt und F Null ist, B geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C15-Alkyl ist;
Im Allgemeinen sind Verbindungen bevorzugt, in denen:
R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
worin jeweils J, K und Q unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C15-Alkyl sind;
R² geradkettiges oder verzweigtes C8- bis C12-Alkyl ist;
R³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
worin jeweils A, B und D unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C15-Alkyl sind;
R¹
ist,
worin U geradkettiges oder verzweigtes C2- bis C5-Alkyl ist, V geradkettiges oder verzweigtes C4- bis C10-Alkyl ist und W Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C5-Alkyl ist;
R⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Wasserstoff, -J', und -J'OH, worin J' C1- bis C5-geradkettiges oder verzweigtes Alkyl ist;
R⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxygruppe, Halogenatom und C1- bis C5-Acyloxygruppe;
jeweils A¹ und A² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
OH und
und pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Am meisten bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, in denen:
R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
worin J geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C5-Alkyl ist und K geradkettiges oder verzweigtes C9- bis C14-Alkyl;
R² geradkettiges oder verzweigtes C8- bis C12-Alkyl ist;
R³
ist,
worin A geradkettiges oder verzweigtes C6- bis C12-Alkyl ist und B geradkettiges oder verzweigtes C4- bis C8-Alkyl ist;
R⁴
ist,
worin U geradkettiges oder verzweigtes C2- bis C4-Alkyl ist, V geradkettiges oder verzweigtes C5- bis C9-Alkyl ist und W Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes C1- bis C3-Alkyl ist;
R⁵ C1- bis C3-geradkettiges oder verzweigtes Alkyl ist;
R⁶ eine Hydroxygruppe ist;
A¹ und A²
sind;
oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
ALLGEMEINE SYNTHESEVERFAHREN
Diese Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I. Es sind hier allgemeine Synthesewege zur Herstellung von unterschiedlich substituierten erfindungsgemäßen Verbindungen offenbart. Die Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, Verbindung 1 (1287; SGEA), ist unten gezeigt.
Die meisten der Reagenzien und Ausgangsstoffe sind für den Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Bestimmte Reagenzien und Ausgangsstoffe für diese Herstellung wurden im Detail von Christ et al., US-Patentnr. 5,530,113 beschrieben, wobei deren Offenbarung unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
Eine Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen ist unten aufgeführt. Obwohl dieses Beispiel die Herstellung der Verbindung 1 (1287; SGEA) beschreibt, wird die Verwendung von alternativen Ausgangsstoffen andere erfindungsgemäße Analoga hervorbringen. Daher ist die Synthese der Art nach tatsächlich allgemeingültig.
Zum Beispiel bringt die Verwendung von alternativen alkylierenden Agenzien in dem Syntheseschritt 22 Analoga mit strukturell unterschiedlichen Substituenten bei R1 hervor. Das Substitutionsmuster bei R2 wird durch die Verwendung des geeigneten alkylierenden Agenzes in Schritt 15 kontrolliert. Weiter wird die Substitution von geeigneten alternativen Verbindungen in Schritt 25 in der Synthese Analoga hervorbringen, die sich bezüglich R3 unterscheiden.
Es können Analoga ohne oxidierte Seitenketten bei R_A hergestellt werden, indem das unten genannte Syntheseschema geringfügig variiert wird, was für den Fachmann bekannt ist. Bei der Verbindung, in der R_A eine Methylgruppe ist, könnte z.B. das Produkt des Syntheseschrittes 8, das Tosylat, diese Abgangsgruppe mit Jod in der Finklestein-Reaktion ersetzt haben. Die Jod-Verbindung könnte durch Behandlung mit Zinkmetall dehalogeniert werden, um eine Methylgruppe an der Position R_A hervorzubringen.
Eine beispielhafte Synthese der R4-Seitenkette ist unten aufgeführt. Die Herstellung von Variationen dieser Seitenkette kann erreicht werden, indem der Ausgangsstoff mit anderen geeigneten Ausgangsstoffen ersetzt wird. Zum Beispiel kann die Länge oder die Verzweigung dieser Seitenkette erzeugt werden, indem mit dem geeigneten Ausgangsstoff gestartet wird. Somit wird die Verwendung von alternativen Tosylaten in Schritt 6 Variationen in R4 hervorbringen.
Somit stellt die unten kurz aufgeführte Synthese vielseitige Wege zu den erfindungsgemäßen Verbindungen bereit (für Details bezüglich der Synthese siehe die folgenden experimentellen Beispiele).
Die Anmelder glauben, dass die oben genannte Route, Route 1, das beste Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist. Aufgrund der Vielzahl von Faktoren, wie die Verwendung von billigeren Ausgangsstoffen, höheren Ausbeuten und die Verwendung von weniger toxischen chemischen Agenzien kann die unten veranschaulichte Route, Route 2, verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Verbindungen herzustellen.
Die meisten der Reagenzien und Ausgangsstoffe sind für den Fachmann bekannt. Bestimmte Reagenzien und Ausgangsstoffe für diese Herstellung sind im Detail beschrieben von Christ et al., US-Patentnr. 5,530,113, wobei die Offenbarung davon unter Bezugnahme eingeschlossen ist. Obwohl dieses Beispiel die Herstellung von Verbindung 1 beschreibt, wird die Verwendung von alternativen Ausgangsstoffen andere erfindungsgemäße Analoga hervorbringen. Daher ist die Synthese der Art nach tatsächlich allgemeingültig.
Zum Beispiel wird die Verwendung von alternativen alkylierenden Agenzien für die Herstellung von dem Zwischenprodukt U Analoga mit strukturell unterschiedlichen Substituenten bei R1 hervorbringen. Das Substitutionsmuster bei R2 wird durch die Verwendung des geeigneten alkylierenden Agenzes bei der Herstellung des Zwischenprodukts O kontrolliert. Weiter wird die Substitution von geeigneten alternativen Verbindungen für das Zwischenprodukt E bei der Herstellung des Zwischenprodukts G Analoga hervorbringen, die sich hinsichtlich R3 unterscheiden.
Eine beispielhafte Synthese der R4-Seitenkette ist unten aufgeführt. Die Erzeugung von Variationen in dieser Seitenkette kann erreicht werden, indem der Ausgangsstoff mit anderen geeigneten Ausgangsstoffen ersetzt wird. Zum Beispiel kann die Länge oder die Verzweigung dieser Seitenkette erzeugt werden, indem mit dem geeigneten Ausgangsstoff gestartet wird. (Für Details bezüglich der Synthese siehe die folgenden experimentellen Beispiele).
Eine beispielhafte Herstellung des „linken" Teils ist unten aufgeführt.
Eine beispielhafte Synthese des „rechten" Teils der Verbindung 1 ist unten gezeigt.
Diese zwei „Hälften" des Moleküls werden dann wie unten aufgeführt, miteinander verbunden und weiter behandelt, um die Verbindung 1 hervorzubringen.
FORMULIERUNGEN
Die hier beschriebenen Lipid-A-Analoga werden dem Respirationstrakt eines Menschen, der unter einer pulmonalen bakteriellen Infektion oder einen symptomatischen pulmonalen Kontakt mit Endotoxin leidet oder einem Risiko dafür ausgesetzt ist, verabreicht. In Abhängigkeit von den Umständen kann die Verabreichung chronisch oder akut erfolgen. Im Falle einer chronischen Verabreichung wird die Therapie über einen ausgedehnten Zeitraum durchgeführt (in einigen Fällen über die gesamte Lebensdauer des Menschen), so dass die Konzentration des Arzneimittels in dem Oberflächenfluid oder Serum des Luftweges während des gesamten Verlaufs der Behandlung auf einem therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Spiegel aufrecht erhalten wird. Eine akute Arzneimittelverabreichung wird unter den Umständen durchgeführt, bei denen ein kurzfristiger pulmonaler Kontakt mit Bakterien und/oder Endotoxin diagnostiziert worden ist, einschließlich einer kürzlich diagnostizierten bakteriellen Infektion oder dem Risiko einer bevorstehenden Infektion.
CHRONISCHE BEHANDLUNG
Eine chronische Verabreichung des Lipid-A-Analogs kann mittels einer periodischen Bolus-Verabreichung durch eine kontinuierliche, dosierte Inhalation oder durch eine Kombination von diesen beiden bewirkt werden. Eine Einzeldosis wird durch Inhalation von 1 μg-24 mg, z.B. 5–150 μg oder vorzugsweise 10–100 μg des Arzneimittels verabreicht. Natürlich kann eine sehr beständige Erkrankung die Verabreichung von relativ hohen Dosen erforderlich machen, beispielsweise 5 mg, wobei die geeigneten Mengen davon durch den Fachmann bestimmt werden können. Eine geeignete Verabreichungshäufigkeit kann durch den Fachmann bestimmt werden und kann beispielsweise 1–4, z.B. 2–3 mal pro Tag erfolgen. Vorzugsweise wird das Arzneimittel einmal pro Tag verabreicht.
Eine der Hauptklassen der Zustände, die eine chronische Verabreichung erfordern, ist eine angeborene oder erworbene Prädisposition gegenüber einer pulmonalen bakteriellen Infektion. Beispiele für diese Bedingungen in dieser Klasse sind:
Zystische Fibrose
Immundefizienzen, einschließlich:
Abwehrschwäche aufgrund einer Anti-Krebs-Therapie
Abwehrschwäche aufgrund einer Anti-Abstoßungs-Therapie nach einer Organtransplantation
Asplenie
Hypogammaglobulinämie
Dysglobulinämien
Defizienzen bei Bestandteilen der Komplementkaskade
HIV-Infektion oder andere virale Infektionen
Polymorphnukleare Granulocytendefekte
Ziliar-Dyskinäsie (z.B. Katagener's Syndrom)
Obstruktioe Lungenerkrankungen, einschließlich:
Dekompensierte Herzinsuffizienz mit pulmonalem Ödem
Chronische obstruktive pulmonale Erkrankung
Tumore, die zu einer bronchialen Obstruktion führen
Bronchiektase (z.B. als eine Komplikation von Asthma)
AKUTE BEHANDLUNG
Eine akute Verabreichung des Lipid-A-Analogs kann, wie eine chronische Verabreichung, durch ein Bolus oder durch kontinuierliche Verabreichung oder durch eine Kombination der beiden bewirkt werden. Der Unterschied besteht in der Dauer der Behandlung: Während eine chronische Behandlung für Wochen, Monate oder sogar Jahre durchgeführt werden kann, wird eine akute Behandlung typischerweise für Zeiträume von Stunden oder Tagen durchgeführt. Eine Einzeldosis wird durch Inhalation von 1 μg bis 24 mg, z.B. 5–150 μg oder vorzugsweise 10–100 μg des Arzneimittels verabreicht. Natürlich kann eine sehr beständige Erkrankung die Verabreichung von relativ hohen Dosen erforderlich machen, z.B. 5 mg, wobei die geeigneten Mengen davon durch den Fachmann bestimmt werden können. Die geeignete Verabreichungshäufigkeit kann durch den Fachmann bestimmt werden und kann beispielsweise 1 bis 4 z.B. 2–3 mal täglich erfolgen. Vorzugsweise wird das Arzneimittel einmal pro Tag verabreicht.
Die Dosierung eines Arzneimittels, das akut über einen Zeitraum von 24 Stunden abgegeben wird, kann höher sein als die chronisch verabreichte Dosis. Jedoch wird im Allgemeinen eine 1–6malige Verabreichung über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführt, wenn eine einzelne Bolus-Verabreichung eingesetzt wird. Eine Verabreichung des Arzneimittels kann so lange stattfinden, bis die Symptome der pulmonalen bakteriellen Infektion oder der pulmonale Kontakt mit Endotoxin in dem Patienten bis zu einem befriedigenden Maß zurückgegangen sind oder vorzugsweise verschwunden sind. Es kann nun in einigen Fällen notwendig sein, die Verabreichung für mehrere Tage, z.B. 1, 2, 3 oder 4 Wochen weiter durchzuführen.
Eine akute Verabreichung wird im Allgemeinen entweder prophylaktisch oder unmittelbar nach einer Diagnose von einem Endotoxin-Kontakt oder dem Vorkommen eines Zustandes, der einem Patienten für eine pulmonale bakterielle Infektion oder Endotoxin-Kontakt empfindlich machen würde, durchgeführt. Zu einer Gruppe von solchen prädisponierenden Bedingungen gehören Beschäftigungsfelder, in denen eine Inhalation von Feinstaub sehr wahrscheinlich ist. Das Arzneimittel kann routinemäßig an die Arbeiter in solchen Beschäftigungsfeldern vor dem Kontakt mit Feinstaub verabreicht werden. Diese Zustände umfassen:
Kontakt mit Pflanzen (z.B. Korn- oder Baumwoll-)Produktstäube
Kontakt mit Bakterien-beladenen Aerosolen (z.B. von Abwasser, kontaminiertem Wasser, Müll oder Abfall von Menschen)
Kontakt mit inhaherbaren Mineralteilchen, welche die Integrität der Lunge zerstören (z.B. Kieselerde)
Eine andere Klasse von Zuständen, die eine akute Arzneimittelverabreichung erforderlich machen, sind akute Lungenverletzungen, die prädisponiert sind für eine Infektion, welche die Sensitivität gegenüber Endotoxin erhöhen oder die Fähigkeit beeinflussen, Endotoxin zu reinigen. Diese umfassen:
Inhalation von Rauch oder Hitzeaussetzung (z.B. Verbrennung; Inhalation von heißer Luft oder Dampf)
Einatmung von Mageninhalten
Beinahes Ertrinken
Inhalation von gesundheitsschädlichen Substanzen
Beispiele für eine abschließende Klasse von Zuständen oder Umständen, die eine pulmonale bakterielle Infektion oder einen Anstieg der Sensitivität gegenüber Endotoxin prädisponieren, sind unten aufgeführt; die meisten davon erfordern eine akute Arzneimittelverabreichung, jedoch wird in einigen Fällen, in denen der Zustand über einen längeren Zeitraum andauert, eine chronische Verabreichung erforderlich:
Trauma (z.B. Brusttrauma)
Maschinelle Beatmung
Intubation mit einer endotrachealen Röhre
Zigarettenrauchen (Emphysem; Tendenz zu Bronchitis)
Intravenöser Missbrauch von Substanzen
Chronischer Kontakt mit verschmutzter Luft
Bordetella pertussis-Infektion
Krampfanfall-auslösende Erkrankung (erhöhtes Atmungsrisiko, das beispielsweise zu einer chemischen Verletzung durch Magensäure führt)
Alkoholismus (erhöhtes Atmungsrisiko, das beispielsweise zu einer chemischen Verletzung durch Magensäure führt)
Intestinale Ischämie und Reperfusion
Nierenversagen/Urämie
Hypotonie und Schock
Lebererkrankung, einschließlich Zirrhose
Pankreatitis
Unterernährung
Verbrennungen
Virale Pneumonien, einschließlich solche, die durch Myxovirus verursacht werden (z.B. Influenza)
Intravasculäre Infektionen (z.B. infektiöse Endocarditis)
Sowohl eine chronische als auch eine akute Verabreichung können standardgemäße Formulierungen für eine pulmonale Arzneimittelverabreichung einsetzen. Eine Verabreichung über diese Route bietet mehrere Vorteile, beispielsweise ein schnelles Einsetzen der Wirkung durch Verabreichen des Arzneimittels an die gewünschte Wirkungsstelle bei höheren lokalen Konzentrationen. Pulmonale Arzneimittelformulierungen werden im Allgemeinen als Zerstäuber- und aerosolisierte Formulierungen, die weiter wie folgt beschrieben werden, eingestuft.
Zerstäuber setzen das Arzneimittel in Tropfenform, in Lösung oder Suspension zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeitsträger ein. Beispiele für einen solchen Ansatz wie eine Strahl-Zerstäubung sind beispielsweise in Flament et al., Drug Development and Industrial Pharmacy 21(20):2285, 1995 beschrieben. Kurz gesagt wird in solchen Verfahren Luft schnell durch eine enge Düse von einem Röhrchen mittels einer Pumpe hindurchgelassen, wobei der Luftdruck fällt und ein Vakuum erzeugt, was ein Ansaugen der Flüssigkeit, die in einem Reservoir enthalten ist, das mit den Röhrchen verbunden ist, bewirkt. Die angesaugte Flüssigkeit wird dadurch zu einem feinen Spray oder Nebel reduziert, der inhaliert werden kann.
Aerosole sind Trockenpulverformulierungen, die gewöhnlicher Weise über druckgesteuerte, dosierte Doseninhalatoren (pMDIs) abgegeben werden. Techniken für eine Aerosol-Formulierung, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind beispielsweise in Sciarra, „Aerosols", Kapitel 92 in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, (Hrsg. A. Osol), Seiten 1614-1628 beschrieben. Die Verwendung von pMDIs hat einige Nachteile, wie die Verwendung von Treibgasen wie Fluorchlorkohlenwasserstoffe, die für die Umwelt schädlich sind. Daher können Alternativen wie Trockenpulverinhalatoren, Spacer-Vorrichtungen und Haltekammern verwendet werden (siehe z.B. Malcolmson et al., PSTT 1(9):394-398, 1998 und Newman et al., „Development of New Inhalers for Aerosol Therapy" in Proceedings of the Second International Conference on the Pharmaceutical Aerosol, Seiten 1-20).
Es soll jedoch so verstanden werden, dass der spezifische Dosisspiegel für jeden einzelnen Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängen wird, einschließlich der Aktivität der eingesetzten spezifischen Verbindung; dem Alter, Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, und dem Geschlecht des zu behandelnden Individuums, der Verabreichungszeit und -route; der Ausscheidungsrate; anderen Arzneimitteln, die zuvor verabreicht worden sind und der Schwere der speziellen Erkrankung, die therapiert wird.
BEISPIELE
Beispiele für die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen die folgenden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen und deren Herstellung können weiter durch die Beispiele nachvollzogen werden, die einige der Verfahren veranschaulichen, durch welche diese Verbindungen hergestellt oder verwendet werden. Diese Beispiele sollten nicht als spezifische Beschränkung der Erfindung ausgelegt werden und Variationen der Erfindung, die nicht bekannt oder später entwickelt werden, sollen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung wie sie nachfolgend beansprucht wird, fallen.
Auf die erfindungsgemäßen Verbindungen wird entsprechend den unten genannten Tabellen durch die Verbindungsnummer Bezug genommen.
CHEMISCHE BEISPIELE
Soweit nichts anderes angegeben ist, wurden alle Reaktionen unter einer inerten Atmosphäre durchgeführt. Die Zwischenprodukte und Endprodukte brachten Spektralanalysen (z.B. Kernspinresonanzspektroskopie und/oder Massenspektroskopie) hervor, die mit deren vorhergesagten Strukturen übereinstimmten. Die Reaktionen wurden über Kieselgel-Dünnschichtchromatographie verfolgt. Präparative Chromatographien wurden, soweit nichts anderes angegeben ist, auf einem Kieselgel durchgeführt.
HERSTELLUNG VON VERBINDUNG 1 (1287; SGEA) durch Route 1
Alle empfindlichen Reaktionen wurden unter Stickstoff und in einer trockenen Umgebung durchgeführt und wasserfreies Natriumsulfat wurde als Trocknungsagenz, soweit nichts anderes angemerkt ist, verwendet. Alle Produkte ergaben zufriedenstellende nukleare magnetische Resonanzspektren.
Aufreinigung von
Der Stoff (5 kg) wurde auf Kieselgel chromatographiert und über einen Gradienten aus Hexan und EtOAc (100% bis 33% Hexan) eluiert. Die reinen Fraktionen wurden kombiniert und destilliert (97° bis 100°C bei 0,15 mm Hg). Die Ausbeute des aufgereinigten Stoffes betrug 4,513 g.
Zu einer eiskalten Lösung von Ester (4500 g, 22,2 Mol) in 12,6 l THF wurden Natriumhydroxid (27 Mol) in 10,8 lWasser zugesetzt. Das Gemisch wurde kurz gerührt und 2,5 l von konzentrierter Salzsäure wurden zugesetzt. Die Schichten wurden abgetrennt und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc re-extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Salzwasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Das Produkt kristallisierte langsam und ergab 2983 g weißes Pulver.
Aufreinigung von
Zu einer Lösung der Säure (15,8 Mol) in 33 l Acetonitril wurden Dicyclohexylamin (16,7 Mol) zugesetzt. Die Lösung wurde auf 60°C erhitzt und über Nacht abkühlen gelassen. Die Kristalle wurden gesammelt, zweimal mit einem Lösungsmittel gewaschen und aus Acetonitril re-kristallisiert. Zu einer Suspension des zuvor mit Methanol gewaschenen Amberlit IR-120 Plus (12 kg) in EtOAc (24 l) und Wasser (24 l) wurde das oben beschriebene Salz zugesetzt. Das Gemisch wurde für mehrere Stunden gerührt und die organische Schicht wurde abgetrennt. Die wässrige Schicht wurde mit EtOAc (12 l) re-extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (Natriumsulfat) und konzentriert, um 2,997 g eines weißen Feststoffes zu ergeben.
Zu einer heißen (~ 67°C) 1 Mol Lösung von Lithiumaluminiumhydrid (8 l) in THF wurde langsam eine Lösung der Säure (1 kg) in 4 l THF zugesetzt. Der Lösung wurde es ermöglicht über Nacht abzukühlen. Die Lösung wurde langsam zu einer 1 Mol wässrigen HCl (5 l) zugesetzt. Das Gemisch wurde mit Toluen (12 l) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Natriumbicarbonatlösung gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, um einen Sirup zu ergeben, das destilliert wurde (103°C), um 914 g eines hellgelben Öls zu ergeben.
Zu einer 0°C Lösung des Diols (913,8 g) in Pyridin (3 l) wurden 3 l Triethylamin zugesetzt, gefolgt von einer Lösung Tosylchlorid (1 kg) in Pyridin (1,5 l) und Triethylamin (1,5 l). Dem Gemisch wurde es ermöglicht, über Nacht aufzuwärmen und in eine kalte Lösung von 6 Mol wässriger HCl (16 l) und Methylenchlorid (8 l) gegossen. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wässrige Schicht wurde mit zusätzlichem Methylenchlorid extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde zweimal auf einem Kieselgel chromatographiert und mit einem Gradienten aus Hexan:EtOAc (9:1 bis 1:6) eluiert, um 642 g Tosylat hervorzubringen.
Zu einer Suspension von 60% Natriumhydrid Öl-Dispersion (8,68 Mol) in 1,15 l DMF und 1,1 l THF wurde langsam das Tosylat (1,139 kg) und Methyliodid (7,7 kg) in 1,15 l DMF und 1,1 l THF zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und dann mit DMF (3 l) verdünnt und langsam zu einer gesättigten wässrigen Lösung Ammoniumchlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde mit Hexan (8 l), das getrocknet war (Natriumsulfat), extrahiert und das Lösungsmittel wurde entfernt, um ein orange-/braunfarbiges Öl hervorzubringen. Das Öl wurde auf einem Kieselgel chromatographiert und mit einem Gradienten (Hexan:EtOAc 100:0 bis 6:1) eluiert, um 940 g eines hellgelben Öls hervorzubringen.
Zu einer Suspension des Aminozuckers (1019 g) in 5 1 MeOH wurde eine 25%ige Lösung aus NaOMe in MeOH (1080 ml, 5 Mol), gefolgt von 610 ml Ethyltrifluoracetat, zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde mit Isopropanol pulverisiert. Das Gemisch wurde filtriert und der Rest wurde mit zusätzlichem Isopropanol gewaschen, um 1369 g des Produktes hervorzubringen.
Zu einer Suspension des Hydroxyzuckers (1300 g) in Pyridin (4 l) wurde Dimethylaminopyridin (79 g), gefolgt von Essigsäureanhydrid (2713 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Toluen (5 × 500 ml) wurde zugesetzt und auch unter reduziertem Druck entfernt, um einen Feststoff zu ergeben, der auf einem Kieselgel chromatographiert wurde. Eine Elution mit Hexan:EtOAc (1:1) ergab 1479 g eines weißen Feststoffes.
Zu einer Lösung des acetylierten Zuckers (1479 g) in 8 l Methylenchlorid wurde Allylalkohol (764 ml) zugesetzt, gefolgt von dem langsamen Zusatz von Zinntetrachlorid (976 ml). Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und langsam in eiskaltes Wasser (7,5 l) gegossen. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wässrige Schicht wurde mit zusätzlichem Methylenchlorid gewaschen. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit wässrigem Natriumbicarbonat gewaschen, getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde auf einem Kie selgel (7,5 kg) chromatographiert und mit einem Hexan:EtOAc-Gradienten (4:1 bis 1:1) eluiert, um 1327 g eines blassgelben Öls hervorzubringen.
Zu einer eiskalten Lösung von geschütztem Zucker (1322 g) in 8,5 l Methanol wurde eine 25%ige Lösung von NaOMe in Methanol (437 ml) über eine Stunde zugesetzt. Zu dieser wurden 1740 g von zuvor gewaschenem Amberlit IR-120 Plus-Harz zugesetzt. Das Gemisch wurde filtriert, konzentriert und der Rest wurde auf Kieselgel chromatographiert. Eine Elution mit Methanol ergab 907 g des Produktes.
Das Triol wurde in Aceton (7,5 l) suspendiert und es wurde Kampfersulfonsäure (85 g) zugesetzt und dann wurden 2,2-Diemethoxypropan (965 ml) langsam zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, gefolgt von dem Zusatz von Triethylamin (51 ml). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um einen braunen Feststoff hervorzubringen, der auf einem Kieselgel chromatographiert wurde. Eine Elution mit einem Hexan:EtOAc-Gradienten (3:1 bis 2:1) brachte 842 g eines seidenweißen Gummis hervor.
Zu einer Suspension von 60% Natriumhydridöldispersion (82 g) in 2,2 l THF und 580 ml DMF wurde Tosylat (351 g) zugesetzt und eine Lösung des freien Alkohols (400 g) in einem Gemisch aus 1360 ml THF und 360 ml DMF. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde auf Eis abgekühlt und Methanol wurde zugesetzt, gefolgt von Wasser (2 l). Das Gemisch wurde dreimal mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet und konzentriert. Das entstehende Gemisch wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution mit Hexan:EtOAc (19:1 bis 1:1) ergab 711 g.
Zu einem Gemisch aus 48%iger wässriger Fluorwasserstoffsäure in 1500 ml Acetonitril in einer Teflonflasche wurde eine Lösung des Ausgangsstoffes (613 g) in 750 ml Acetonitril und 750 ml Methylenchlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde für eine Stunde gerührt und in 8 l Wasser gegossen. Das Gemisch wurde mit Methylenchlorid (4 × 2 l) extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit wässriger gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen, getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution mit Methylenchlorid:Methanol (39:1 bis 9:1) ergab 519 g des Produktes.
Zu einer Lösung des Diols (577 g) in Pyridin (5 l) wurde Tosylchlorid (339 g) und N,N-Diemethylaminopyridin (14,5 g) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für zwei Tage gerührt und dann in 14 l kalter wässriger 1 molarerM Salzsäure gegossen. Das Gemisch wurde mit Methylenchlorid extrahiert (2 × 5 l). Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet und konzentriert. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution (Hexan:EtOAc, 6:1 bis 1:1) ergab 632 g eines gelben Sirups, der langsam beim Stehenlassen kristallisierte.
Zu einer Lösung (85°C) aus 25%igem Natriummethoxid in Methanol (1825 ml) in DMF (1365 ml) wurde das Tosylat (714 g) in DMF (1365 ml) über 1,25 Stunden zugesetzt. Das Gemisch wurde für 30 Minutengerührt und auf 4°C abgekühlt und in ein eiskaltes Gemisch aus wässriger 1 Mol Salzsäure und 4,6 kg Eis gegossen. Das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde mit 2 l Wasser gewaschen und die kombinierten wässrigen Schichten wurden mit 2 × 41 EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet und konzentriert. Der Rest wurde auf einem Kieselgel durch Chromatographie aufgereinigt. Eine Gradientenelution (Hexan:Ethylacetat, 3:1 bis 1:1) ergab 549 g eines blassgelben bis weißen Feststoffes.
Diese Reaktion wurde unter Argon laufen gelassen. Zu einer Lösung aus Kalium-t-Butoxid (139 g) in 440 ml DMSO wurde eine Lösung des Zuckers (247 g) in 440 ml wasserfreiem DMSO zugesetzt. Das Gemisch wurde auf 85°C für 1,5 Stunden erhitzt und dann wurden 250 ml Wasser zugesetzt und das Gemisch wurde über Nacht bei 85°C erhitzt und in einem Eisbad abgekühlt. Das Gemisch wurde in 3,5 l Salzwasser gegossen und das Gemisch wurde mit 3 × 750 ml Methylenchlorid extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurde getrocknet und konzentriert, um 560 g eines braunen Öls hervorzubringen.
Zu einem Gemisch des freien Amins (199 g), 780 ml THF und 390 ml gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat wurden Troc-Cl (157 g) zugesetzt. Nach einer halben Stunde wurde das Gemisch langsam in eine Lösung aus 500 ml 40%igem wässrigem Methylamin und 3 l Wasser gegossen. Das Gemisch wurde mit 2 × 1750 ml Methylenchlorid extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet und konzentriert. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert.
Eine Gradientenelution mit Hexan:EtOAc (5:1 bis 1:1) ergab eine quantitative Ausbeute von 287 g eines gelben bis cremefarbenen Feststoffs.
Zu einer Lösung des Hydroxyzuckers in 2 l Methylenchlorid wurde Tetrazol (155,6 g), gefolgt von Diallyldiisopropylphosphoramidit (182 ml), zugesetzt. Nach einer halben Stunde wurde das Gemisch in ein eiskaltes Gemisch aus Oxone^® (Kaliumperoxymonosulfat) (455,6 g), Wasser (1,25 l) und THF (2,5 l) gegossen. Nach 15 Minuten wurde dieses Gemisch in kaltes 10%iges wässriges Natriumthiosulfat gegossen. Nach 15 Minuten wurde das Gemisch mit 2 l Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, die wässrige Schicht mit Methylenchlorid re-extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution mit Hexan/Ethylacetat (6:1 bis 2:1) ergab 205,7 g eines blassgelben Sirups.
Zu einer Lösung von 48% wässriger Fluorwasserstoffsäure, 400 ml, in Acetonitril, 1,2 l, in einem Teflon-Behälter wurde eine Lösung des Zuckers, 138,8 g, in Methylenchlorid, 500 ml, zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, mit 3 l Was ser verdünnt und mit 2,4 l Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde mit wässriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution (Hexan:Ethylacetat, 2:1 bis 1:1), gefolgt durch eine Elution mit einem Gradienten aus Methylenchlorid:Methanol (19:1 bis 9:1), ergab 129,2 g eines wachsartigen Gummis.
Zu einer eiskalten Lösung aus 450 g 1-Decanol in 685 ml Triethylamin und 1125 ml Methylenchlorid wurden 330 ml Mesylchlorid zugesetzt. Das Abkühlungsbad wurde nach 1,5 Stunden entfernt und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Zu dem Rest wurden 2,5 1 l Mol wässriger Salzsäure zugesetzt. Dieses Gemisch wurde mit 3 × 2 l Methylenchlorid extrahiert. Die organischen Schichten wurden kombiniert, getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Elution mit 1:1 Hexan:Ethylacetat ergab 651 g des Produkts.
Zu einer Suspension einer 60%igen Natriumhydrid-Mineralöldispersion in 1 l THF und 470 ml DMF wurde eine Lösung des Alkohols in 280 ml DMF und 1 l THF über eine Stunde zugesetzt. Das Mesylat, 470 g, wurde dann über einen Zeitraum von 15 Minuten zugegeben. Nach zwei Tagen wurden 400 ml Methanol, gefolgt von 4 kg Eis und 4 l Wasser zugegeben. Dieses Gemisch wurde mit 2 × 4 l Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution mit Hexan:EtOAc (39:1 bis 2:1) ergab 618 g.
Eine Lösung des Zuckers, 520 g, in 5,2 l Eisessig und 1,3 l Wasser wurden über Nacht gerührt. Sie wurde auf 7,5 l Wasser gegossen und filtriert. Das Filtrat wurde durch eine azeotrope Destillation mit Toluen (3 × 500 ml) unter reduziertem Druck getrocknet, um 458 g hervorzubringen.
Diese Reaktion wurde unter Argon laufen gelassen. Zu einer Suspension aus Kalium-t-butoxid, 295 g, in DMSO, 11, wurde eine Lösung aus 340 g des Zuckers in 1,5 l DMSO zugegeben. Das Gemisch wurde auf 85°C für 1 ¼ Stunden erhitzt und es wurden 1,4 l 3 M wässriges Kaliumhydroxid zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei 85°C gerührt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und in ein Gemisch aus 3,5 l Salzwasser und 3,5 l Wasser gegossen. Das Gemisch wurde dreimal mit Methylenchlorid extrahiert, das Gemisch wurde getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution mit Methylenchlorid: Methanol (19:1 bis 4:1) ergab 740 g des Produktes.
Eine Lösung des Aminozuckers, 740 g, in Benzophenonimin, 338 g, wurde auf 45°C über Nacht erhitzt. Das Gemisch wurde auf einem Kieselgel chromatographiert und mit einem Gradienten aus Hexan/Ethylacetat (39:1 bis 1/1) eluiert, um 371 g eines blassgelben Feststoffes hervorzubringen.
Zu einer Lösung des Diolzuckers, 366 g, in 1,3 l DMF wurde Imidazol, 118 g, gefolgt von t-Butyldimethysilylchlorid, 117 g, zugegeben. Nach 5 Minuten wurde das Gemisch in 1,4 l wässrigem gesättigtem Natriumbicarbonat gegossen. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat dreimal extrahiert. Die organischen Schichten wurden kombiniert, das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution mit Hexan/Ethylacetat (49:1 bis 4:1) ergab 446 g eines Sirups.
Zu einer Lösung des Alkohols, 437 g, in Toluen, 3 l, wurden 225 ml Pyridin zugegeben und die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt. Es wurden 531 ml Phosgen einer 1,9 Mol Lösung in Toluen zugegeben und die Lösung wurde für 10 Minuten gerührt. Es wurden 469 ml Allylalkohol zugegeben. Nach 40 Minuten wurden 2,3 l gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung zugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Das Gemisch wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution mit Hexan/Ethylacetat (49:1 bis 4:1) ergab 441 g gelben Sirup.
Zu einer Lösung des Zuckers, 431 g, in THF, 200 ml, wurde Eisessig, 330 ml, und Wasser, 110 ml, zugegeben. Das Gemisch wurde für drei Stunden gerührt, auf Eis abgekühlt und 6,6 l 1 M wässriges Natriumhydroxid wurde zugegeben. Das Gemisch wurde mit Methylenchlorid, 2 × 2 l, extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gra dientenelution mit Methylenchlorid:Methanol (19:1 bis 4:1) ergab das Amin, 309 g, als ein Sirup.
Zu einer eiskalten Lösung des Aminozuckers, 309 g, in 3 l Methylenchlorid wurden 435 g von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) und nach 10 Minuten die Carboxylsäure, 275 g, zugegeben. Nach 10 Minuten wurde das Gemisch mit gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, die wässrige Schicht wurde mit Methylenchlorid reextrahiert, die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution (Hexan:Ethylacetat, 19:1 bis 3:1) ergab 338 g eines blassgelben Sirups.
Zu einer Lösung aus 48%iger wässriger Fluorwasserstoffsäure, 11 ml, in Acetonitril, 293 ml, wurden 4,6 g Kieselgel, gefolgt von einer Lösung des Zuckers, 146,7 g, in Methylenchlorid, 147 ml, zugesetzt. Nach 1 ½ Stunden wurde das Gemisch mit 975 ml Wasser verdünnt und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wässrige Schicht wurde mit Methylenchlorid reextrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit wässrigen Natriumbicarbonatlösung gewaschen, getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution (Hexan:Ethylacetat, 5:1 bis 0:1) ergab 110,4 g eines cremefarbenen wachsartigen Feststoffes.
Zu einer Lösung des Zuckers, 129 g, in 500 g Trichloracetonitril wurden 240 g Kaliumcarbonat zugegeben. Das Gemisch wurde für eine halbe Stunde gerührt und über Kieselgur filtriert. Der Filterkuchen wurde mit Methylenchlorid gewaschen und die Filtrate wurden kombiniert und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution (Hexan:Ethylacetat, 1:1 bis 0:1) ergab 145,7 g eines gelben Gummis.
Der linke Zucker, 145,7 g und der rechte Zucker, 109,2 g, wurden azeotropisch durch Evaporation von Toluen (3 × 200 ml) getrocknet. Eine Lösung der zwei Zucker in 750 ml Methylenchlorid wurde zu einer eiskalten Lösung aus Silbertriflat, 62,7 g, in 130 ml Methylenchlorid zugegeben. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde in ein Gemisch aus gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat und Natriumthiosulfatlösung gegossen. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wässrige Schicht wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde zweimal auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution mit Hexan:Ethylacetat (5:1 bis 1:1) ergab 189,56 g eines klebrigen Schaumes.
Zu einer Lösung des Disaccharids, 188,7 g, in 590 ml THF wurde Zinkstaub, 457,6 g, gefolgt von Eisessig, 395 ml, zugegeben. Nach einer halben Stunde wurde das Gemisch über Kieselgur gereinigt und der Filterkuchen wurde mit THF gewaschen. Die organischen Schichten wurden kombiniert und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde azeotropisch durch destilliertes Benzol aus dem Rest (4 × 250 ml) getrocknet, um 223,1 g eines rosafarbenen Gummis hervorzubringen.
Zu einer Lösung des Zuckers, 223,1 g, in 1,3 l THF wurde eine Lösung aus Natriumbicarbonat, 37,5 g, in 250 ml Wasser zugegeben. Es wurden 67,4 g cis-11-Octadecenoylchlorid zugegeben. Nach 10 Minuten wurde das Gemisch zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution mit Hexan:Ethylacetat (2:1 bis 0:1) ergab 160,2 g eines blassgelben Wachses.
Eine Lösung des Zuckers, 161,3 g, in Methylenchlorid, 215 ml, in einer Teflon-Flasche wurde zu einer Lösung aus 48%iger Fluorwasserstoffsäure, 150 ml, in Acetonitril, 474 ml, zugegeben. Nach vier Stunden wurde das Gemisch in 500 ml Wasser gegossen. Das Gemisch wurde zweimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit wässrigem gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen, getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde auf einem Kieselgel chromatographiert. Eine Gradientenelution (Methylenchlorid:Ethyacetat:Methanol 500:500:20 bis 500:500:160) ergab einen gelben wachsartigen Gummi.
Der Zucker, 719 mg, wurde in Methylenchlorid gelöst und Natriumsulfat (1,4 g) wurde zugegeben. Diallyldiisopropylphosphoramidit (189 μl) und Tetrazol (162 mg) wurden zugegeben, das Gemisch wurde für 10 Minuten gerührt und dann auf 78°C abgekühlt. Eine Lösung aus m-Chlorperoxybenzoesäure (192 mg) in Methylenchlorid (4 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde mit wässrigem Natriumthiosulfat und mit wässrigem Natriumbicarboriat gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde chromatographiert, um 660 mg hervorzubringen.
Zu einer Lösung aus Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) (166 mg) in 2 ml Tetrahydrofuran:Essigsäure (10:1)-Gemisch wurde eine Lösung des Zwischenproduktes Z (660 mg) in 3 ml des selben Lösungsmittelgemisches zugegeben. Nach 30 Minuten wurde zusätzliches Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) zugegeben. Nach weiteren 1 ½ Stunden wurde Toluen zugegeben und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Das Gemisch wurde durch Chromatographie auf Diethylaminoethylcellulose aufgereinigt. Das aufgereinigte Gemisch wurde in 0,1 N wässrigem Natriumhydroxid gelöst, über einen 0,45 μm Steril-Filter filtriert und durch HPLC auf einer YMC-Pack-ODS-AP-Säule aufgereinigt, um 130 mg der Verbindung 1 hervorzubringen.
Analytische Daten zur Verbindung 1, die durch die oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sind unten angegeben:
Verbindung 1: ¹H NMR (CD₃OD) δ: 5,3 (1H, m), 4,6 (1, m), 4,0 (m, m), 3,9 (1H, d), 3,7 (1H, t), 3,6 (1H, t), 3,4 (3H, s), 3,3 (3H, t), 2,6 (2H, t), 2,3 (2H, m), 2,0 (2H, m), 1,7 – 1,2 (m, m), 0,9 (6H, t).
³¹P NMR (CD₃OD) δ: 4,71, 3,98.
HERSTELLUNG VON VERBINDUNG 1 DURCH ROUTE 2
HERSTELLUNG VON VERBINDUNG 1
BEISPIEL 1: ZWISCHENPRODUKT B
Zu einer Suspension des Zwischenprodukts A (15 g), das durch das Verfahren von Christ et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 92309057.5, in CH₂Cl₂ (150 ml) und 48% HBF₄ (29,2 g) hergestellt und über ein Eisbad abgekühlt wurde, wurde TMSCHN₂ (165 ml als eine 2M Lösung in Hexan) zugegeben. Das Gemisch wurde solange gerührt, bis die Reaktion beinahe durch TLC beendet war und dann wurde Methanol (20 ml) gefolgt von Essigsäure (10 ml) zugegeben. Wässriges Natriumbicarbonat wurde zugegeben und das Gemisch wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Das Gemisch wurde getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Eine Chromatographie des Restes ergab 14,9 g des Zwischenproduktes B.
BEISPIEL 2: ZWISCHENPRODUKT C
Zu einer kalten (0°C) Lösung von B (14,9 g) in Methylenchlorid (100 ml) wurde langsam Diisobutylaluminiumhydrid (140 ml als eine 1 M Lösung in Hexan) zugegeben, bis die Reaktion beendet war, was durch TLC bestimmt wurde. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von wässriger 1N Salzsäure (100 ml) gefolgt von konzentrierter Salzsäure (50 ml) gelöscht. Den Schichten wurde es ermöglicht, sich abzutrennen und die wässrige Schicht wurde mit CH₂Cl₂ re-extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden dann mit Salzwasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert. Nach einer Aufreinigung durch eine Kieselgelchromatographie wurden 12,06 g des Zwischenproduktes C erhalten.
BEISPIEL 3: ZWISCHENPRODUKT D
Zu einer Lösung von C (10,64 g) in Methylenchlorid (40 ml) wurde Triethylamin (15,75 ml), p-Toluensulfonylchlorid (11,86 g) und Dimethylaminopyridin (690 mg) zugegeben. Der entstehenden Suspension wurde es ermöglicht, bis die Reaktion zu Ende war, zu rühren, was durch TLC bestimmt wurde und wurde dann über einen Wasseraufbau mittels Methylenchloridextraktion gelöscht. Nach der Aufreinigung durch eine Kieselgelchromatographie wurden 18,7 g von D erhalten.
BEISPIEL 4: ZWISCHENPRODUKT E
Zu einer Lösung von D (18,7 g) in 200 ml Aceton wurde Natriumiodid (24,6 g) zugegeben. Das Gemisch wurde bei einem Rückfluss von 1 ½ Stunden, das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde zwischen Wasser und Hexan aufgeteilt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde entfernt. Eine Chromatographie (Kieselgel) ergab 15,4 g von E als eine farblose Flüssigkeit.
BEISPIEL 5: ZWISCHENPRODUKT F
Diese Verbindung wurde durch das Verfahren von Christ et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 92309057.5 hergestellt.
BEISPIEL 6: ZWISCHENPRODUKT G
Zu einer Lösung aus 18,6 g des Zwischenprodukts F und 15,4 g des Zwischenprodukts E in Hexan wurden 23,9 g Silberoxid zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht rückgeführt. Das Gemisch wurde abgekühlt, über Kieselgur filtriert, das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rest wurde chromatographiert (Kieselgel), um das Zwischenprodukt G (21 g) als einen farblosen Sirup hervorzubringen.
BEISPIEL 7: ZWISCHENPRODUKT H
Zu einer kalten (0°C) Lösung des Zwischenprodukts G (21 g) in Methylenchlorid wurde tropfenweise 3,5 ml 48%ige Tetrafluorborsäure zugegeben. Nach 5 Minuten wurde das Gemisch mit wässriger Natriumbicarbonatlösung und mit Salzwasser gewaschen. Das Gemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert und chromatographiert (Kieselgel), um das Zwischenprodukt H (18,7 g) als einen farblosen Sirup hervorzubringen.
BEISPIEL 8: ZWISCHENPRODUKT I
Zu einer Lösung des Zwischenprodukts H (17,6 g) in puren Methyliodid (105 ml) wurde Silberoxid (83 g) zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und dann mit Hexan verdünnt und über Kieselgur filtriert. Das Gemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert und der Rest wurde in Methylenchlorid (40 ml) gelöst. Das Gemisch wurde auf 0°C abgekühlt und dazu wurde Imidazol (2,44 g) und t-Butyldimethylsilylchlorid (4,7 ml) zugegeben. Es wurde über Nacht gerührt und 150 ml Natriumbicarbonatlösung wurden zugegeben. Die organische Schicht wurde getrocknet (Natriumsulfat) und chromatographiert (Kieselgel), um das Zwischenprodukt I, 10,5 g, als einen farblosen Sirup hervorzubringen.
BEISPIEL 9: ZWISCHENPRODUKT J
Das Zwischenprodukt I wurde in 100 ml Methylenchlorid gelöst, zu dem Diallyldiisopropylphosphoramidit (7,4 ml), gefolgt von Tetrazol (6,37 g) zugegeben wurde. Das Gemisch wurde abgekühlt und für 20 Minuten gerührt. Eine Suspension von meta-Chlorperoxybenzoesäure (24,2 mMol) in 50 ml Methylenchlorid wurde über 15 Minuten zugegeben, während die Temperatur der Reaktion unterhalb von –60°C aufrechterhalten wurde. Natriumbicarbonatlösung wurde zugegeben, die organische Schicht wurde abgetrennt und getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Eine Chromatographie (Kieselgel) ergab 14 g eines farblosen Sirups des Zwischenprodukts J.
BEISPIEL 10: ZWISCHENPRODUKT K
Zu einer Suspension aus 39,5 g Di(thiopheny)zinn (hergestellt durch das Verfahren von Christ et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 92309057.5) in 235 ml Methylenchlorid würde Thiophenol (12 ml) zugegeben. Zu diesem Gemisch wurde tropfenweise Triethylamin über 15 Minuten zugegeben. Ein Teil (150 ml) dieses „Zinnreagenz"-Gemisches wurde tropfenweise über 15 Minuten zu einer Lösung des Zwischenprodukts J (12,9 g) in 25 ml Methylenchlorid zugegeben. Der verbleibende
Rest des „Zinnreagenzes" wurde über 30 Minuten zugegeben, um die Reaktion bis zum Ende ablaufen zu lassen. Das Gemisch wurde mit Methylacetat verdünnt und mit wässrigem 1 N Natriumhydroxid und mit Salzwasser gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Natriumsulfat), das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rest chromatographiert, um 11,1 g eines gelben Sirups des Zwischenprodukts K hervorzubringen.
BEISPIEL 11: ZWISCHENPRODUKT L
Zu einer kalten Lösung des Zwischenprodukts K (11,1 g) und Pyridin (7,1 ml) in 80 ml Methylenchlorid wurde Trichlorethylchloroformat (2,9 ml) zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Eine wässrige Natriumbicarbonatlösung wurde zugesetzt, die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Eine Chromatographie brachte 12,96 g des Zwischenprodukts L als einen hellgelben Feststoff hervor.
BEISPIEL 12: ZWISCHENPRODUKT M
Das Zwischenprodukt L, 12,96 g, wurde in Methylenchlorid gelöst. Zu diesem Gemisch wurde eine 6 M Lösung von Fluorwasserstoff in Acetonitril zugegeben und das Gemisch wurde für 4 Stunden gerührt. Wässrige Natriumbicarbonatlösung wurde zugegeben, die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Eine Chromatographie ergab 10,9 g eines bernsteinfarbenen Sirups, das Zwischenprodukt M.
BEISPIEL 13: ZWISCHENPRODUKT N
Zu einer Lösung des Zwischenprodukt M (9,5 g) in 50 ml Trichloracetonitril wurde Kaliumcarbonat (15 g) zugegeben und das Gemisch wurde für 10 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde über Kieselgur filtriert und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Eine Chromatographie ergab 14,5 g des Zwischenprodukts N, das unmittelbar in Beispiel 19 verwendet wurde.
BEISPIEL 14: ZWISCHENPRODUKT O
Zu einer Lösung des Zwischenprodukts F (160 g) in Hexan (475 ml) und Ioddecan (474 ml) wurde Silberoxid (723 g) zugegeben. Das Gemisch wurde auf 70°C im Dunkeln für zwei Stunden erhitzt und über Kieselgur filtriert. Die Lösung wurde unter reduziertem Druck konzentriert und der Rest wurde chromatographiert, um 221 g des Zwischenprodukts O als ein farbloses Öl hervorzubringen.
BEISPIEL 15: ZWISCHENPRODUKT P
Zu einer Lösung des Zwischenprodukts O (30 g) in Methylenchlorid (90 ml) und Acetonitril (90 ml) wurde eine Lösung aus 48% wässrigem Fluorwasserstoff (9 ml) in Acetonitril (81 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt und 350 ml von wässrigem Natriumbicarbonat wurden zugegeben. Das Gemisch wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet (Natriumsulfat), das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde chromatographiert, um 30 g des Zwischenprodukts P als ein gelbes Öl zu ergeben.
BEISPIEL 16: ZWISCHENPRODUKT Q
Zu einer kalten (0°C) Lösung des Zwischenprodukts P (30 g) und Imidazol (10,2 g) in Methylenchlorid (500 ml) wurde t-Butyldimethylsilylchlorid (10,85 g) zugegeben. Das Gemisch wurde für 1 ½ Stunden gerührt und dann in 400 ml gesättigtes wässriges Ammoniumchlorid gegossen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (Natriumsulfat), das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde chromatographiert, um 34,5 g des Zwischenprodukts Q als einen farblosen Sirup zu ergeben.
BEISPIEL 17: ZWISCHENPRODUKT R
Zu einer kalten (0°C) Lösung des Zwischenprodukts Q (32,2 g) und Pyridin (184 ml) in Toluen (213 ml) wurde eine 1,94 Mol Lösung aus Phosphogen in Toluen zugegeben. Nach 20 Minuten wurde Allylalkohol (31 ml) zugegeben und das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt. Wässriges Natriumbicarbonat wurde zugegeben, die organische Schicht wurde abgetrennt und getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Eine Chromatographie ergab 36,9 g des Zwischenprodukts R als ein farbloser Sirup.
BEISPIEL 18: ZWISCHENPRODUKT S
Zu einer Lösung von 2,4 ml 48% wässrigem Fluorwasserstoff in 48 ml Acetonitril wurde eine Lösung des Zwischenprodukts R (20 g) in Methylenchlorid (24 ml) zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Es wurde wässrige Natriumbicarbonatlösung zugegeben, die organische Schicht wurde abgetrennt und getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Eine Chromatographie brachte 11 g des Zwischenprodukt S als einen farblosen Sirup hervor.
BEISPIEL 19: ZWISCHENPRODUKT T
Das Zwischenprodukt S (8,97 g) und das Zwischenprodukt N (14,5 g) wurden in Toluen (20 ml) gelöst und das Gemisch wurde durch ein azeotropes Entfernen des Lösungsmittels getrocknet. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt. Das getrocknete Gemisch wurde in 50 ml Methylenchlorid gelöst, das langsam zu einer Lösung aus Silbertriflat (5,8 g) in 50 ml Methylenchlorid zugegeben wurde. Das Gemisch wurde für 10 Minuten gerührt und 250 ml wässrige Natriumbicarbonatlösung und 250 ml 10%iges wässriges Natriumthiosulfat wurden zugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Eine Chromatographie ergab 13 g des Zwischenprodukts T als einen blassgelben Sirup.
BEISPIEL 20: ZWISCHENPRODUKT U
Zu einer Lösung des Zwischenprodukts T in Methylenchlorid (10 ml) wurde langsam Zinn(II)tris-benzolthiolattriethylaminkomplex (12 ml einer 0,5 M Lösung in Methylenchlorid) zugegeben. Nach 10 Minuten wurde ein weiteres Äquivalent von Zinn-Reagenz zugegeben. Nach weiteren 15 Minuten wurde ein weiteres Äquivalent zugegeben. Nach 15 Minuten wurde Ethylacetat (250 ml) zugegeben und das Gemisch wurde mit 1 N wässriger Natriumhydroxidlösung (250 ml) extrahiert. Das Gemisch wurde getrocknet (Natriumsulfat und unter reduziertem Druck konzentriert. Es wurde Toluen zugegeben und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein Öl zu ergeben, das in der nächsten Umwandlung ohne eine weitere Aufreinigung verwendet wurde.
BEISPIEL 21: ZWISCHENPRODUKT V
Zu einer gekühlten (0°C) Lösung des Zwischenprodukts U (2 mmol) in Methylenchlorid (5 ml) wurde 3-Ketotetradecansäure (997 mg) zugegeben, die durch das Verfahren von Christ et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 92309057.5, hergestellt wurde, gefolgt von dem Zusatz von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (1,5 g) und das Gemisch wurde für ungefähr 30 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde mit Methylenchlorid (150 ml) verdünnt, mit 1 N wässrigem Natriumhydroxid gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Eine Chromatographie auf Kieselgel, gefolgt von einer Chromatographie auf basischem Aluminiumoxid ergab 1,64 g des Zwischenprodukts V.
BEISPIEL 22: ZWISCHENPRODUKT W
Eine Lösung des Zwischenprodukts V (1,45 g) in Eisessig (5 ml) wurde zu einer Suspension aus einem gut-gerührten Zinkkupferpaar (14 g) in Essigsäure (10 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde für 15 Minuten gerührt und ein zusätzliches Zink/Kupferpaar (10 g) wurde zugegeben. Nach weiteren 15 Minuten wurde das Gemisch über Kieselgur filtriert und wurde dann mit Methylacetat gewaschen. Die kombinierten Waschlösungen wurden mit Toluen verdünnt und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde auf einem zweischichtigen Gemisch aus basischem Aluminiumoxid und Kieselgel chromatographiert, um das Zwischenprodukt W hervorzubringen, was ohne eine weitere Aufreinigung verwendet wurde.
BEISPIEL 23: ZWISCHENPRODUKT X
Eine Lösung aus Zwischenprodukt W (1,02 mmol) und cis-Vakzensäure (575 mg) wurde in Toluen (5 ml) dreimal gelöst und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der getrocknete Rest wurde in Methylenchlorid (3 ml) gelöst und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (780 mg) wurden zugegeben und das Gemisch wurde für drei Stunden gerührt. Das Gemisch wurde mit Methylenchlorid verdünnt und direkt chromatographiert, um 734 mg des Zwischenprodukts X hervorzubringen. Eine weitere Chromatographie der unreinen Fraktion ergab zusätzlich 58 mg des Stoffes.
BEISPIEL 24: ZWISCHENPRODUKT Y
Zu einer Lösung des Zwischenprodukts X (785 mg) in Methylenchlorid (10 ml) wurde eine Lösung aus 48% wässrigem Fluorwasserstoff in Acetonitril (15 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde für 90 Minuten gerührt, mit Methylenchlorid (50 ml) verdünnt, und mit Wasser und wässriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Das Gemisch wurde getrocknet (Natriumsulfat) und chromatographiert, um das Zwischenprodukt Y, 719 mg, zu ergeben.
BEISPIEL 25: ZWISCHENPRODUKT Z
Das Zwischenprodukt Y (719 mg) wurde in Methylenchlorid gelöst und es wurde Natriumsulfat (1,4 g) zugegeben. Diallyldiisopropylphosphoramidit (189 μl) und Tetrazol (162 mg) wurden zugegeben, das Gemisch wurde für 10 Minuten gerührt und dann auf –78°C abgekühlt. Eine Lösung aus m-Chlorperoxybenzoesäure (192 mg) in Methylenchlorid (4 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde mit wässrigem Natriumthiosulfat und wässrigem Natriumbicarbonat gewaschen, wurde getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel wurde unter redu ziertem Druck entfernt. Der Rest wurde chromatographiert, um 660 mg des Zwischenprodukts Z hervorzubringen.
BEISPIEL 26: VERBINDUNG 1
Zu einer Lösung aus Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) (166 mg) in 2 ml Tetrahydrofuran:Essigsäure (10:1)-Gemisch wurde eine Lösung des Zwischenprodukts Z (660 mg) in 3 ml des selben Lösungsmittelgemisches zugegeben. Nach 30 Minuten wurde zusätzliches Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) zugegeben. Nach weiteren 1 ½ Stunden wurde Toluen zugegeben und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Das Gemisch wurde durch Chromatographie auf Diethylaminoethylcellulose aufgereinigt. Das aufgereinigte Gemisch wurde in 0,1 N wässrigem Natriumhydroxid gelöst, über einen 0,45 μm Sterilfilter filtriert und durch HPLC auf einer YMC-Pack-ODS-AP-Säule aufgereinigt, um 130 mg der Verbindung 1 hervorzubringen.
Analytische Daten für einige der Verbindungen und der Zwischenprodukte, die durch die oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, sind unten angegeben:
Verbindung 1: ¹H NMR (CD₃OD) δ: 5,3 (1H, m), 4,6 (1, m), 4,0 (m, m), 3,9 (1H, d), 3,7 (1H, t), 3,6 (1H, t), 3,4 (3H, s), 3,3 (3H, t), 2,6 (2H, t), 2,3 (2H, m), 2,0 (2H, m), 1,7-1,2 (m, m), 0,9 (6H, t).
³¹P NMR (CD₃OD) δ: 4,71, 3,98.
Verbindung 1: (M + Na)⁺ = 1333
Verbindung 2: (M + 3 Na)⁺ = 1363
Verbindung 3: (M + 3 Na)⁺ = 1365
Verbindung 5: (M + Na)⁺ = 1303
Verbindung 6: (M + Na)⁺ = 1359
Verbindung 7: (M + Na)⁺ = 1305
Verbindung 8: (M + 3 Na)⁺ = 1393
Verbindung 10: (M + Na)⁺ = 1425
Zwischenprodukt G: ¹H NMR (CDCl₃) δ: d, (1H), 3,9-3,7 (m, multipel), 3,65 (t, 1H), 3,37 (s,3H), 3,2 (m,2H), 1,75 (q, 2H), 1,52 (s,3H), 1,4 (s,3H), 1,3 (breit m, multipel), 0,95 (s,9H), 0,9 (t,3H), und 0,2 (d,6H)
Zwischenprodukt H: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 4,58 (d,1H), 4,09 (m,2H), 3,9 (dd, 1H), 3,75 (dd,1H), 3,7 (m,1H), 3,5 (t,1H), 3,37 (s,3H), 3,23 (t,1H), 3,05 (t,1H), 1,8 (m,2H), 1,68 (m,1H), 1,5 (m,1H), 1,3 (breit m, multipel), 0,95 (s,9H), 0,9 (t,3H), 0,2 (d,6H)
Zwischenprodukt I: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 4,52 (d,1H), 4,05 (m,2H), 3,75 (m,1H), 3,67 (t,1H), 3,5 (t,1H), 3,45 (s,3H), 3,35 (s,3H), 3,25 (t,1H), 3,05 (t,1H), 1,8 (m,2H), 1,65 (m,1H), 1,5 (m,1H), 1,3 (breit s,m), 0,95 (s,9H), 0,9 (t,3H), 0,2 (s,6H)
Zwischenprodukt J: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 5,95 (m,2H), 5,35 (d,1H), 5,22 (d,1H), 4,6 (q,2H), 4,5 (d,1H), 4,32 (q,1H), 3,9-3,75 (m,3H), 3,7 (dd,1H), 3,65 (dd,1H), 3,45 (m,1H), 3,38 (s,3H), 3,3 (s,3H), 3,27 (t,1H), 3,2 (t,1H), 1,9-1,75 (m,3H), 1,5 (m,1H), 1,3 (breit m,multipel), 0,95 (s,9H), 0,9 (t,3H), 0,2 (s,6H)
Zwischenprodukt L: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 5,95 (d,1H), 5,4 (d,2H), 5,25 Z(d,2H), 4,95 (d,1H), 4,7 (q,2H), 4,55 (q,2H), 4,32 (q,1H), 3,9-3,75 (m,3H), 3,7 (dd,1H), 3,65 (dd,1H), 3,55 (m,1H), 3,4 (m,1H), 3,4 (s,3H), 3,3 (s,3H), 3,25 (m,1H), 1,75 (m,multipel), 1,5-1,4 (m,2H), 1,3 (breit s,multipel), 0,95-0,9 (breit s,12H), 0,2 (d,6H)
Zwischenprodukt M: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 5,95 (m,2H), 5,75 (d,1H), 5,4 (d,1H), 5,25 (d,2H), 4,75-5,65 (dd,2H), 4,6 (q,1H), 4,3 (q,1H), 4,1 (m,2H), 3,9 (m,2H), 3,65 (m,1H), 3,4 (s,3H), 3,25 (s,3H), 1,75 (breit m,2H), 1,55-1,4 (m,2H), 1,3 (breit s,multipel), 0,9 (t,3H)
Zwischenprodukt O: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 4,5 (d,1H), 3,8 (dd,1H), 3,78 (m,2H), 3,6 (m,multipel), 3,2 (m,2H), 1,5 (s,3H), 1,4 (s,3H), 1,3 (breit s, multipel), 0,95 (s,9H), 0,9 (t,3H), 0,18 (d,6H)
Zwischenprodukt P: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 4,5 (d,1H), 3,75 (dd,2H), 3,6 (q,2H), 3,5 (t,1H), 3,3 (m,1H), 3,2 (t,1H), 3,0 (t,1H), 1,6 (m,2H), 1,25 (breit s,multipel), 0,95 (s,9H), 0,9 (t,3H), 0,18 (d,6H)
Zwischenprodukt Q: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 4,5 (d,1H), 3,82 (t,2H), 3,7 (m,2H), 3,6 (t,1H), 3,3 (m,1H), 3,2 (t,1H), 3,05 (q,2H), 1,6 (m,2H), 1,3 (breit s,multipel), 0,95 (s,9H), 0,88 (s,9H), 0,85 (t,3H), 0,2 (d,6H), 0,1 (d,6H)
Zwischenprodukt R: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 5,9 (m,1H), 5,4-5,25 (dd,2H), 4,75 (t,1H), 4,6 (d,2H), 4,45 (d,1H), 3,75 (q,1H), 3,7 (d,2H), 3,53 (q,1H), 3,38 (m,1H), 3,25 (t,1H), 3,15 (t,1H), 1n5 (t,2H), 1,25 (s, multipel), 0,95(s,9H), 0,85 (m,12H), 0,2 (s,6H), 0,07 (s,6H)
Zwischenprodukt S: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 5,9 (m,1H), 5,4-5,25 (dd,2H), 4,75 (t,1H), 4,6 (d,2H), 4,52 (d,1H), 3,7 (m,multipel), 3,65-3,6 (dd,2H), 3,55 (q,1H), 3,4 (m,1H), 3,28 (t,1H), 3,2 (t,1H), 1,5 (t,2H), 1,3 (s, multipel), 0,9 (s,9H), 0,85 (t,3H), 0,2 (s,6H)
Zwischenprodukt T: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 5,9 (m,3H), 5,6 (d,1H), 5,4-5,2 (m,6H), 4,8 (d,1H), 4,7-4,6 (m,2H), 4,55 (q,1H), 4,5 (d,1H), 4,3 q,1H), 3,8-3,7 (m,multipel), 3,6 (dd, 1H), 3,5 (m,multipel), 3,35 (s,3H), 3,2 (s,3H), 3,15 (t,1H), 1,7 (m,2H), 1,5 (m,2H), 1,3 (s,multipel), 0,95 (t,6H), 0,2 (t,6H)
Zwischenprodukt V: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7,3 (d,1H), 5,95 (m,3H), 5,6 (d,1H), 5,4-5,2 (m,6H), 4,95 (d,1H), 4,8 (d,1H), 4,7-4,5 (m,multipel)4,3 (q,1H), 3,9-3,65 (m,multipel), 3,6 (m,multipel), 3,45 (t,1H), 3,4 (t,3H), 3,35 (s,2H), 3,28 (3H), 2,5 (t,2H), 1,8 (m,2H), 1,6 (m,2H), 1,45 (m,2H), 1,3 (breit s,multipel), 0,95-0,8 (m,18H), 0,15 (d,6H)
Zwischenprodukt X: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7,3 (d,1H), 5,95 (m,4H), 5,4-5,2 (m,8H), 4,95 (d,1H), 4,8 (d,1H), 4,7 (t,1H), 4,6 (d,1H), 4,55 (q,1H), 4,3 (q,1H), 4,1 (t,1H), 3,9 (q,1H), 3,8 (t,1H), 3,7-3,5 (m,multipel), 3,45 (t,1H), 3,35 (s,3H), 3,3 (s,2H), 3,28 (s,3H), 2,5 (t,2H), 2,2 (t,1H), 2 (d,1H), 1,7 (q,2H), 1,6 (m,2H), 1,3 (s,multipel), 0,95-0,8 (m,21), 0,15 (d,6H)
Zwischenprodukt Y: ¹H NMR (CDCl₃) δ: 6,65 (d,1H), 6,55 (d,1H), 5,905 (m,5H), 5,7 (m,1H), 5,4-5,2 (m,12H), 4,8 (m,2H), 4,6 (d,1H), 4,5 (m,10H), 4,3 (q,1H), 4,1 (m,1H), 3,85-3,45 (m,multipel), 3,4 (s,3H), 3,35 (s,3H), 3,25 (s,3H), 3,2 (t,1H), 2,5 (dd,2H), 2,2 (t,2H), 2 (m,multipel), 1,7-1,2 (m,multipel), 0,9 (t,12H).
BIOLOGISCHE BEISPIELE
Sowohl bakterielles LPS als auch bakterielles Lipid-A steuern die Herstellung von Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), IL-1β, IL-6 und IL-8 sowie weitere Cytokine und zelluläre Mediatoren im menschlichen Vollblut und in menschlichen Makrophagen-Zelllinien. Es wurde festgestellt, dass die Erzeugung von pathophysiologischen Mengen dieser Cytokine einen wichtigen Teil bei der Initiation des systemischen Entzündungsantwortsyndrom und beim septischen Schock spielen. Die hier beschrieben Polysaccharid-Analoga inhibieren eine solche LPS- und/oder Lipid-A-vermittelte Induktion von Cytokinen, was durch die folgenden Experimente veranschaulicht wird.
BEISPIEL A: In vitro Inhibition der LPS-induzierten Herstellung von Cytokinen
Menschliches Vollblut wurde wie beschrieben hergestellt und getestet (Rose et al., Infection and Immunity, 63:833-839, 1995). HL-60-Zellen wurden in RPMI-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika ergänzt war, kultiviert und induziert, damit sie sich in Makrophagen durch eine Behandlung mit 0,1 μM 1,25-Dihydroxycholecalciferol (Vitamin D3; Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA) differenzieren und auf eine LPS-vermittelte Herstellung von IL-8 getestet. Kurz gesagt wurde bakterielles LPS (z.B. aus E. coli 0111:B4; Sigma Chemicals, St. Louis, MO) bei 10 ng/ml oder Lipid-A (Daiichi Chemicals, Tokio, Japan) als 10fach konzentrierte Lösungen in Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ freier ausgeglichener Hank's Salzlösung (CMF-HBSS; Gibco) zugegeben. In Experimenten, welche die Analoga der vorliegenden Erfindung beinhalten, wurde das Analog unmittelbar vor dem Zusatz von LPS oder Lipid-A in CMF-HBSS (z.B. zwischen 0 und 100 μM als ein 10fach konzentriertes Aliquot) zugegeben. Nach einer dreistündigen Inkubation wurde Plasma direkt aus Vollblut hergestellt oder es wurde Kulturüberstand entfernt und auf das Vorliegen des gezeigten Cytokins unter Verwendung eines ELISA Assay-Kits von Genzyme (Cambridge, MA) entsprechend den Anweisungen des Herstellers untersucht, wobei jedoch jeder beliebige andere Standard ELISA-Kit eingesetzt werden kann. Die Experimente wurden jeweils dreifach, mindestens aber zweifach durchgeführt.
Die Lipid-A-Analoga inhibierten die LPS-induzierte Herstellung von TNF im menschlichen Vollblut in einer konzentrationsabhängigen Weise. Von den getesteten Analoga hat sich Verbindung 1 als die am meisten wirksame Verbindung herausgestellt. Die Ergebnisse von diesem Test sind in 1 gezeigt. Verbindung 1 inhibiert die LPS-induzierte Herstellung von TNF, und weist einen IC₅₀ von ungefähr 1,5 nM auf. Andere Analoga, bei denen festgestellt wurde, dass sie eine LPS-induzierte TNF-Herstellung inhibieren, umfassen Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 8, Verbindung 9 und Verbindung 10. Diese Verbindungen wiesen IC₅₀ von zwischen 1,5 nM und 159 nM auf.
Verbindung 1 inhibierte auch eine LPS-vermittelte Induktion von IL-8 in HL-60 (menschliche Makrophagen-ähnliche)-Zellen. Die Inhibition der IL-8-Erzeugung war vollständig bei Konzentration von 1 nM oder mehr von Verbindung 1, wenn entweder LPS oder Lipid-A als Agonist verwendet wurde.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibierten in ähnlicher Weise die LPS-induzierte Herstellung von anderen Cytokinen im menschlichen Vollblut, obwohl einige dieser Cytokine mehrere Stunden nach dem Zusatz von LPS erzeugt wurden. Zum Beispiel benötigen IL-1β und IL-6 vier oder mehrere Stunden, um die maximalen Spiegel zu erreichen, während IL-8 die maximalen Spiegel zehn oder mehrere Stunden nach dem Zusatz von LPS erreicht. Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren wurden die erfindungsgemäßen Verbindungen bei Konzentrationen zwischen 0 und 10 μM zugegeben und LPS wurde bei 10 ng/ml zugegeben. Eine Inhibition der Herstellung von TNF, IL-1β, IL-6 und IL-8 wurde als eine Funktion der Zeit nach dem Zusatz von LPS gemessen. Es wurde festgestellt, dass diese Inhi bition der Cytokin-Erzeugung konzentrationsabhängig war, jedoch betrug in allen Fällen die Suppression der Cytokin-Synthese >90% bei Konzentrationen von Verbindung 1 von 10 nM und mehr für bis zu 24 Stunden nach dem Zusatz von LPS.
BEISPIEL B: Persistenz von Verbindungen im menschlichen Vollblut
Obwohl einige der erfindungsgemäßen Verbindungen nicht rasch von der Zirkulation entfernt werden, verringert sich deren Aktivität bei einer Halbwertszeit von 1–3 Stunden. Um eine antagonistische Wirksamkeit aufrechtzuerhalten, kann diese schnelle Deaktivierung eine kontinuierliche Verabreichung erforderlich machen. Die Untersuchung dieser Deaktivierung hat zu der Entwicklung eines Assays geführt, um die in vitro Deaktivierung von Arzneimitteln in menschlichem Vollblut zu messen. Dies wird bewerkstelligt, indem Lipid-A-Antagonisten mit Blut für verschiedene Zeiträume präinkubiert werden, gefolgt von einem Zusatz des LPS-„Herausforderers", wie oben beschrieben, der Inkubation für drei Stunden und der Untersuchung auf freigesetzte Cytokine. Ein schematisches Diagramm für diesen Assay ist in 2 gezeigt.
Unter Verwendung von diesem Assay konnte gezeigt werden, dass B531, wie von Christ et al., U.S. Patent Nr. 5,530,113, beschrieben, „deaktiviert" (d.h. Aktivität bei zunehmender Präinkubationszeit verliert). Wie in 3 gezeigt, deaktiviert Verbindung 1 ebenfalls, jedoch macht ihre bessere Aktivität und die erniedrigte Deaktivierungsrate sie nach sechs Stunden genauso wirksam wie B531 unmittelbar nach dessen Zusatz. Diese Daten stellen den Durchschnitt von sieben getrennten Experimenten dar, die dreifach durchgeführt worden sind.
BEISPIEL C: Inhibition von TNF- oder IL-6-Herstellung in in vitro-Tiermodellsystemen
Eine LPS-induzierte TNF- oder IL-6-Herstellung wurde durch die erfindungsgemäßen Verbindungen in Vollblut oder Makrophagen, die aus Meerschweinchen, Ratten und Mäusen isoliert worden sind, inhibiert. Makrophagen aus Hartley White-Meerschweinchen (Elm Hill Breeders, Chelmsford, MA) und C57BL/6-Mäuse (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) wurden von dem Abdomen der vorbereiteten Tiere isoliert. Die Vorbereitung wurde durch eine intraperitoneale Injektion von 2 mg Bacillus calmette guerin (BCG; RIBI Immunochemical Research, Inc., Hamilton, MT) bei einer Konzentration von 10 mg/ml in physiologischer Kochsalzlösung für Mäuse und 2 mg BCG bei einer Konzentration von 2 mg/7 ml in Mineralöl für Meerschweinchen durchgeführt. Drei Tage nach der Injektion wurden peritoneale Makrophagen aus dem Abdomen der Tiere durch Standardtechniken isoliert. Den Zellen wurde es ermöglicht, sich für zwei bis drei Stunden auf Zellkulturplatten anzuheften und wurden dann mit RPMI-1640-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, kultiviert und dann wurde LPS (Endkonzentration von 10 ng/ml) wie oben beschrieben zugegeben. Um eine Inhibition zu testen, wurden die erfindungsgemäßen Verbindungen (bei einer Konzentration zwischen 0 und 100 μM) zu dem Kulturmedium unmittelbar vor dem Zusatz von LPS zugegeben. Nach einer dreistündigen Inkubationsperiode wurden die TNF-Spiegel und/oder IL-6-Spiegel von Meerschweinchen, Maus und Ratte durch ELISA oder durch den cytolytischen Bioassay, der in Lymphokines 2;235, 1981 beschrieben worden ist, auf von Makrophagen des Meerschweinchen freigesetzten TNF gemessen. In peritonealen Makrophagen der Maus zeigte Verbindung 1 eine wirksame Inhibition (IC₅₀ = 16 nM für IL-6 bzw. 20 nM für TNF); in Makrophagen des Meerschweinchens betrug der IC₅₀ der TNF-Freisetzung 0,3 nM und in peritonealen Makrophagen der Ratte betrug die IC₅₀ der Freisetzung von TNF 11 nM.
BEISPIEL D: In vivo-Assays
BCG-vorbereitete Mäuse (Vogel et al., J. Immunology 124:2004-2009. 1980) wurden als ein in vivo-Assay-System zur Beobachtung der inhibitorischen Wirkungen von Lipid-A-Analoga auf (1) LPS-induzierte TNF-Herstellung und (2) LPS-induzierte Lethalität wie folgt eingesetzt.
Fünf Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse (oben) wurden durch eine intravenöse Injektion in die Schwanzvene mit 2 mg BCG vorbereitet. Zehn Tage nach der Injektion wurde LPS von E. coli (oben) in Pyrogen-freier 5%iger Glucoselösung (Otsuka Pharmaceuticals Inc., Tokio, Japan) intravenös über die Schwanzvene der BCG-vorbereiteten Mäuse verabreicht. LPS wurde bei 1–3 μg pro Maus sowohl bei der TNF-Herstellung als auch den Mortalitätsstudien verabreicht. Die Testverbindung wurde als ein Bestandteil der injizierten LPS-Lösung bei einer Konzentration zwischen 3 und 300 μg pro Maus verabreicht. Plasma wurde eine Stunde nach der LPS-Injektion erhalten und das TNF wurde durch den oben beschriebenen ELISA-Assay gemessen. Eine Mortalität, die auf einen septischen Schock zurückzuführen war, wurde für 36 Stunden nach der LPS-Injektion aufgezeichnet.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen supprimierten die Herstellung von TNF nach der Verabreichung von LPS in wirksamer Weise. Verbindung 10 und Verbindung 1 inhibierten die TNF-Herstellung in vivo in Mäusen (ED_50s = 5 bzw. 10,6 μg pro Maus). Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 8 und Verbindung 9 inhibierten die TNF-Herstellung mit ED₅₀ zwischen 10 und 200 μg pro Maus und die Verbindungen 5, 6 und 7 ergaben ED₅₀-Werte > 100.
In parallelen Experimenten, die in Meerschweinchen durchgeführt wurden, waren diese Analoga auch wirksame Inhibitoren für eine LPS-induzierte TNF-Herstellung in vivo (Optimum ED₅₀ zwischen 2,3 und 6,1 μg pro Meerschweinchen für Verbindung 1, Verbindung 7 und Verbindung 10).

Claims

Verwendung einer Antiendotoxin-Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prävention und Behandlung von pulmonaler bakterieller Infektion oder von symptomatischem pulmonalem Kontakt einer Versuchsperson mit Endotoxin, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung an die Versuchsperson durch Inhalation verabreicht wird, wobei die Antiendotoxin-Verbindung ein Lipid A-Analog ist, und wobei das Lipid A-Analog die Formel
aufweist, wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

wobei jeweils J, K und Q unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1 bis C15 Alkyl sind; L ist O, NH oder CH₂; M ist O oder NH; und G ist NH, O, S, SO oder SO₂; R² ist geradkettiges oder verzweigtes C5 bis C15 Alkyl; R³ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus geradkettigern oder verzweigtem C5 bis C18 Alkyl,

wobei E NH, O, S, SO oder SO₂ ist; wobei A, B, und D jeweils unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1 bis C15 Alkyl sind; R⁴ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus geradkettigem oder verzweigtem C4 bis C20 Alkyl, und
wobei U und V jeweils unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C2 bis C15 Alkyl sind und W ist Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes C1 bis C5 Alkyl; R_A ist R⁵ oder R⁵-O-CHa-, wobei R⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, J', -J'-OH, -J'-O-K', J'-O-K'-OH, und J'-O-PO(OH)₂, wobei jedes J' und K' unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1 bis C5 Alkyl ist; R⁶ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Hydroxygruppe, Halogen, C1 bis C5 Alkoxy, und C1 bis C5 Acyloxy; A¹ und A² sind unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

wobei Z geradkettiges oder verzweigtes C1 bis C10 Alkyl ist; oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Lipid A-Analog die Struktur
hat.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Antiendotoxin-Verbindung in einer zerstäubten Formulierung verabreicht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Antiendotoxin-Verbindung in einer Aerosol-Formulierung verabreicht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei 1 μg-24 mg der Antiendotoxin-Verbindung in einer Einzeldosis an die Versuchsperson verabreicht werden.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei 5–150 μg der Antiendotoxin-Verbindung in einer Einzeldosis an die Versuchsperson verabreicht werden.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei 10–100 μg der Antiendotoxin-Verbindung in einer Einzeldosis an die Versuchsperson verabreicht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Antiendotoxin-Verbindung in einer aerosolisierten oder zerstäubten Formulierung, wobei die Antiendotoxin-Verbindung ein Lipid A-Analog ist, und wobei das Lipid A-Analog die Formel
aufweist, wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

wobei jeweils J, K und Q unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1 bis C15 Alkyl sind; L ist O, NH oder CH₂; M ist O oder NH; und G ist NH, O, S, SO oder SO₂; R² ist geradkettiges oder verzweigtes C5 bis C15 Alkyl; R³ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus geradkettigem oder verzweigtem C5 bis C18 Alkyl,
wobei E NH, O, S, SO oder SO₂ ist; wobei A, B, und D jeweils unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1 bis C15 Alkyl sind; R⁴ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus geradkettigem oder verzweigtem C4 bis C20 Alkyl, und
wobei U und V jeweils unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C2 bis C15 Alkyl sind und W ist Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes C1 bis C5 Alkyl; R_A ist R⁵ oder R⁵-O-CH₂-, wobei R⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, J', -J'-OH, -J'-O-K', J'-O-K'-OH, und J'-O-PO(OH)₂, wobei jedes J' und K' unabhängig voneinander geradkettiges oder verzweigtes C1 bis C5 Alkyl ist; R⁶ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Hydroxygruppe, Halogen, C1 bis C5 Alkoxy, und C1 bis C5 Acyloxy; A¹ und A² sind unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
wobei Z geradkettiges oder verzweigtes C1 bis C10 Alkyl ist; oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei das Lipid A-Analog die Struktur
hat.