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DE60016233T2 - Differenz-nachweismethoden unter verwendung einer vielzahl von abgestimmten farbstoffen - Google Patents

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DE60016233T2
DE60016233T2 DE60016233T DE60016233T DE60016233T2 DE 60016233 T2 DE60016233 T2 DE 60016233T2 DE 60016233 T DE60016233 T DE 60016233T DE 60016233 T DE60016233 T DE 60016233T DE 60016233 T2 DE60016233 T2 DE 60016233T2
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proteins
dyes
protein
dye
labeled
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DE60016233T
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Jonathan Minden
Alan Waggoner
Susan Janet Fowler
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GE Healthcare UK Ltd
Carnegie Mellon University
Original Assignee
Amersham Biosciences UK Ltd
Carnegie Mellon University
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Unterschieden in Proteinzusammensetzungen, einschließlich Proteinen, die post-translationale Modifikationen aufweisen, und insbesondere ein Verfahren, das ein Paar aneinander angepaßter Markierungsreagenzien zur Detektion solcher Unterschiede einsetzt.
  • Forscher, die verschiedene Aspekte der Zellbiologie untersuchen, verwenden eine Vielzahl von Hilfsmitteln, um Unterschiede in der Struktur, der Funktion und der Entwicklung von Zellen zu detektieren und zu verfolgen. Einen wesentlichen Teil der Untersuchung von Zellen nimmt die Untersuchung der Unterschiede und Ähnlichkeiten von Proteinzusammensetzungen verschiedener Zelltypen, verschiedener Entwicklungsstufen und unter verschiedenen Bedingungen ein. Die Bestimmung von Unterschieden im Proteingehalt, zum Beispiel von normalen Zellen im Vergleich zu Krebszellen oder von Wildtypzellen im Vergleich zu Mutantenzellen, kann eine wertvolle Informationsquelle und ein wertvolles diagnostisches Hilfsmittel sein.
  • Proteinmischungen können mit verschiedenen Techniken, die die Elektrophorese und die Chromatographie einschließen, in einzelne Bestandteile aufgetrennt werden. Eine Trennung nach Masseunterschieden kann durch Elektrophorese in einem Polyacrylamid-Gel unter denaturierenden Bedingungen erreicht werden. Die eindimensionale und die zweidimensionale Gelelektrophorese sind Standardhilfsmittel zur Untersuchung von Proteinen geworden. Die eindimensionale SDS-Elektrophorese (Natriumdodecylsulfat-Elektrophorese) durch ein zylindrisches Gel oder ein Plattengel läßt nur die Hauptproteine, die in der untersuchten Probe vorliegen, erkennen. Die zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE), die Proteine durch isoelektrische Fokussierung, d.h. in einer Dimension nach ihrer Ladung und in der zweiten Dimension nach ihrer Größe, trennt, ist die empfindlichere Trennmethode und liefert eine Auflösung der meisten Proteine einer Probe.
  • Die Proteine wandern in ein- oder zweidimensionalen Gelen als Banden bzw. Spots (Flecken). Die getrennten Proteine werden mit verschiedenen Verfahren sichtbar gemacht; durch Anfärben mit einem für Proteine spezifischen Farbstoff, durch Proteinvermittelte Silberfällung, durch autoradiographische Detektion radioaktiv markierter Proteine und durch kovalente Bindung von fluoreszierenden Verbindungen. Das zuletzt genannte Verfahren konnte bisher nur nach dem Schritt der isoelektrischen Fokussierung in der 2D-PAGE durchgeführt werden. Sofort nach der Elektrophorese können die erhaltenen Gelmuster mit dem bloßen Auge betrachtet oder photographisch oder durch elektronische Bilderfassung, zum Beispiel unter Einsatz eines gekühlten ladungsgekoppelten Gerätes (charge-coupled device – CCD) aufgezeichnet werden.
  • Um Proteinproben aus verschiedenen Quellen, zum Beispiel verschiedene Zellen oder verschiedene Stadien der Zellentwicklung, mit herkömmlichen Verfahren zu vergleichen, wird gegenwärtig jede der verschiedenen Proben in getrennten Spuren eines eindimensionalen Gels oder auf getrennten zweidimensionalen Gelen laufen gelassen. Ein Vergleich erfolgt durch visuelle Begutachtung oder durch elektronische Bildgebung, zum Beispiel durch Computer-gestützte Bildanalyse digitalisierter ein- oder zweidimensionaler Gele.
  • Die zweidimensionale Elektrophorese wird von Forschern häufig eingesetzt. O'Farrell, P.H., "High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins", Journal of Biological Chemistry, 250:4007–4021 (1975), trennte Proteine in der ersten Dimension nach ihren entsprechenden isoelektrischen Punkten mit der inzwischen allgemein bekannten Technik der isoelektrischen Fokussierung und in der zweiten Dimension nach dem Molekulargewicht mit der diskontinuierlichen SDS-Elektrophorese. Garrels, J.I., "Two-dimensional Gel Electrophoresis and Computer Analysis of Proteins Synthesized By Clonal Cell Lines", Journal of Biological Chemistry, Bd. 254, Nr. 16, 7961–7977 (1979), verwendete ein zweidimensionales Gelelektrophorese-System, um das Muster der Proteinsynthese in Nervenzellen und Gliazellen zu untersuchen. Garrels führte eine vergleichende Analyse der Daten aus vielen Proben durch, um das Vorliegen bestimmter Proteine mit spezifischen Funktionen zu korrelieren. Eine Computer-basierte Scannvorrichtung wurde eingesetzt, um einen Abschnitt des Gel-Fluorogramms zu scannen, die Spots zu detektieren und ihre Dichten zu integrieren. Die Information wurde gespeichert und entsprechend der Intensität in jedem der einzelnen unterschiedlichen Scans ausgegeben.
  • Urwin, V.E. und Jackson, P., "A multiple High-resolution Mini Two-dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis System: Imaging Two-dimensional Gels Using A Cooled Charge-Coupled Device After Staining With Silver Or Labeling With Fluorophore", Analytical Biochemistry 195:30-37 (1991), beschreiben eine Technik, in der mehrere Gele für die isoelektrische Fokussierung (IEF) eingesetzt wurden, um Proteine nach ihrer Ladung zu trennen, die dann so auf ein Gradienten-Plattengel aufgebracht wurden, daß die IEF-Gele mit zueinander gerichteten Enden entlang der Oberseite des Plattengels angeordnet waren. Anschließend wurden die Gele der Elektrophorese unterzogen. Die resultierenden Protein-Spots wurden entweder durch Anfärben des für die zweite Dimension eingesetzten Plattengels mit Silber oder durch Fluoreszenz-Markierung nach dem Schritt der isoelektrischen Fokussierung sichtbar gemacht. Die Markierung muß nach der ersten Elektrophorese, d.h. nach der isoelektrischen Fokussierung, vorgenommen werden, da das Vorhandensein der Fluorescein-Markierung am Protein den isoelektrischen Punkt des Proteins bei der Elektrophorese verändert. Außerdem bindet die Markierung unter Bildung einer instabilen Bindung an einen Schwefel im Protein, die während der isoelektrischen Fokussierung dazu tendieren würde, aufzubrechen, wenn die Markierung vor dem Elektrophorese-Schritt angebracht wird. Ein Artikel von Santaren, J. et al., "Identification of Drosophila Wing Imaginal Disc Proteins by Two-Dimensional Gel Analysis and Microsequencing", Experimental Cell Research 206:220–226 (1993), beschreibt den Einsatz der hochauflösenden zweidimensionalen Gelelektrophorese zur Identifizierung von Proteinen in Drosophila melanogaster. Mit dem getrockneten Gel wurde ein Röntgenfilm für 5 Tage belichtet. Der entwickelte Röntgenfilm wurde mit einem Computer analysiert, um die Unterschiede zwischen den Proben festzustellen.
  • Die zweidimensionale Gelelektrophorese ist ein wirkungsvolles Hilfsmittel zur Auftrennung komplexer Proteinmischungen. Die Unterschiede zwischen den Proteinen können jedoch fein sein. Fehlstellen im Gel können genaue Beobachtungen beeinträchtigen. Um die Fehlstellen zu minimieren, werden die Gele, die in kommerziell erhältlichen Elektrophorese-Systemen zur Verfügung gestellt werden, mit hoher Präzision hergestellt. Selbst bei akribischer Kontrolle sind jedoch keine zwei Gele identisch. Die Gele können sich voneinander hinsichtlich der pH-Gradienten oder der Gleichmäßigkeit unterscheiden. Außerdem können sich die Elektrophorese-Bedingungen von einer Durchführung zur nächsten ändern. Computersoftware zur automatischen Angleichung verschiedener Gele wurde entwickelt. Alle Software-Pakete basieren jedoch auf einer linearen Ausdehnung oder Kontraktion einer oder beider Dimensionen der zweidimensionalen Gele. Lokale Verzerrungen in den Gelen können durch die Software nicht ausgeglichen werden.
  • Ein Verfahren zur Überwindung der genannten Schwierigkeiten ist in der internationalen Veröffentlichung mit der Nummer WO 96/33406 (internationale Anmeldenummer PCT/US96/05435) beschrieben, die ein Verfahren zur Detektion von Unterschieden in zwei oder mehreren Proteinproben offenbart. Proteinextrakte, zum Beispiel von jeder der zu vergleichenden verschiedenen Zellproben einer Gruppe, werden hergestellt. Jeder Proteinextrakt wird mit einem unterschiedlichen Farbstoff aus einem Satz aneinander angepaßter Lumineszenzfarbstoffe markiert. Die aneinander angepaßten Farbstoffe weisen im wesentlichen die gleichen ionischen und pH-Eigenschaften auf, emittieren jedoch Licht bei verschiedenen Wellenlängen, wodurch sie in der Lumineszenz-Detektion unterschiedliche Farben zeigen. Die markierten Proteinextrakte werden miteinander gemischt, gemeinsam durch Elektrophorese getrennt und die markierten Proteine werden durch Lumineszenz-Detektion identifiziert.
  • Proteinproben können auch durch alternative elektrophoretische oder chromatographische Techniken aufgetrennt werden. Solche Techniken, insbesondere in orthogonalen Kombinationen, sind in der Lage, hochauflösende Trennungen von Proteinen oder Peptiden zu liefern. Gegenwärtig verfügbare chromatographische Systeme haben jedoch tendenziell eine geringere Auflösung als elektrophoretische Systeme, d.h. die Anzahl von Proteinen oder Peptiden, die getrennt werden können, ist geringer. Typische Elutionsdarstellungen können den Katalogen der Hersteller entnommen werden, z.B. dem Katalog "BioDirectory'99" von Amersham Pharmacia Biotech unter "Chromatography columns and media" ab Seite 502. Trotzdem weisen chromatographische Systeme für einige Anwendungen bestimmte Vorteile gegenüber der Elektrophorese auf. Zum Beispiel sind sie oft einfacher zu automatisieren und es ist gewöhnlich einfacher, nach der Trennung Proben der Proteine zu erhalten.
  • Aus diesen Gründen ist die Trennung mit chromatographischen Systemen zum Beispiel für die Erstellung von Proteom-Profilen von Interesse. Zum Beispiel veröffentlichten Opiteck und Kollegen Beispiele zweidimensionaler chromatographischer Systeme, in denen Fraktionen, die aus einem chromatographischen Trennsystem eluiert wurden, auf ein zweites chromatographisches System gegeben wurden. (Siehe speziell Opiteck, Lewis und Jorgenson, Anal. Chem., Bd. 69, 1518, (1997), worin der Einsatz eines Kationenaustauschersystems in Kombination mit einem Umkehrphasenchromatographie-System beschrieben wird, und Opiteck et al., Anal Biochem., Bd. 258, 349, (1998), worin der Einsatz der Größenausschlußchromatographie in Kombination mit der Umkehrphasenchromatographie beschrieben wird.) Die besonders geringe Auflösung der Größenausschlußchromatographie wird in der zuletzt genannten Veröffentlichung dadurch verbessert, daß vor der weiteren Fraktionierung des Eluats mittels Umkehrphasenchromatographie 8 Größenausschlußsäulen in Serie eingesetzt werden. Eine theoretische Auflösung von 800 Proteinen wurde für dieses System geschätzt. Der begrenzten Auflösung bestimmter chromatographischer und elektrophoretischer Systeme kann auch im Analyseschritt begegnet werden. Die Massenspektrometrie wird im Anschluß an eine chromatographische oder elektrophoretische Trennung zur Identifizierung von Proteinen zunehmend eingesetzt und kann selbst als ein auf der Masse basierendes Trennverfahren verwendet werden. Zum Beispiel beschreibt Jensen et al., Anal. Chem., Bd. 71, 2076, (1999), den Einsatz der kapillaren isoelektrischen Fokussierung als Trennverfahren und den anschließenden Einsatz der Fourier-Transformation-Ionencyclotronresonanz-Massenspektrometrie mit Elektrospray-Ionisierung, um die Proteine im Eluat des Systems zur isoelektrischen Fokussierung weiter aufzutrennen und eine Identifizierungsmöglichkeit zu schaffen.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Probleme, die mit den Verzerrungen im Gel oder der Veränderlichkeit der Säulen zusammenhängen, zu beseitigen und ein einfaches, relativ schnelles und zuverlässiges Verfahren für den Vergleich und die Gegenüberstellung der Proteingehalte verschiedener Proben zur Verfügung zu stellen.
  • Kurze Zusammenfassung der Erfindung
  • Die genannten Aufgaben wurden durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gelöst, in dem Unterschiede, falls vorhanden, zwischen mehreren Proteinproben, zum Beispiel denjenigen Proben, die aus verschiedenen Zellen extrahiert oder aus anderen Quellen erhalten wurden, detektiert werden, indem jede Probe dieser Proteine mit einem unterschiedlichen Farbstoff aus einem Satz aneinander angepaßter Lumineszenzfarbstoffe markiert wird. Die hierin verwendeten Proteine schließen Proteine, die post-translationale Modifikationen aufweisen, und deren Teile, einschließlich Peptide, ein. Die aneinander angepaßten Farbstoffe weisen im wesentlichen die gleichen ionischen und pH-Eigenschaften auf, absorbieren und/oder fluoreszieren jedoch Licht bei unterschiedlichen Wellenlängen, so daß unterschiedliche Fluoreszenzfarben erzeugt werden. Außerdem sollten die Farbstoffe eine ähnliche Größe aufweisen. Nach einer Inkubationszeit, die ausreichend ist, um die Bildung kovalenter Bindungen zwischen dem Farbstoff und einer oder mehreren Bindungsstellen in den Proteinen zu ermöglichen, werden die markierten Proben dann miteinander gemischt und die Proteine werden in einem einzigen Trennverfahren getrennt. Die Trennung kann durch Elektrophorese oder mit chromatographischen Verfahren erfolgen. Wenn die Trennung mittels Elektrophorese auf einem einzelnen Gel vorgenommen wird, wandern die Proteine, die gleichzeitig in den jeweiligen Proben vorliegen, gemeinsam an die gleiche Stelle. Wenn die Trennung mit chromatographischen Mitteln, zum Beispiel in einer Säule, durchgeführt wird, wandern die Proteine, die gleichzeitig in den jeweiligen Proben vorliegen, ebenfalls an die gleiche Stelle. Unterschiedliche Proteine wandern einzeln zu unterschiedlichen Stellen im Gel oder eluieren zu unterschiedlichen Zeiten aus der Säule und fluoreszieren in verschiedenen Farben, wodurch festgestellt werden kann, welche ursprüngliche Probe ein oder mehrere Proteine aufweist, die sich von denen der anderen ursprünglichen Probe oder Proben unterscheiden.
  • Die Erfindung schließt außerdem ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein. Das Kit beinhaltet den Satz aus aneinander angepaßten Farbstoffen und kann außerdem Materialien zur Trennung der Proteine einschließen. Gegebenenfalls können Quencher-Materialien zum Abstoppen der Reaktion zwischen dem Protein und dem Farbstoff, sofern notwendig, zur Verfügung gestellt werden. Die Materialien können zum Beispiel Elektrophoresegele oder chromatographische Säulen umfassen.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • 2a) und 2b) sind Abbildungen von Proteinen, die mit einem bevorzugten Paar aneinander angepaßter Markierungen der vorliegenden Erfindung markiert sind und auf einem einzelnen SDS-Polyacrylamid-Gel laufen gelassen wurden.
  • 3a) – d) sind Abbildungen von Abschnitten eines zweidimensionalen Gels, auf das zwei unterschiedlichen Proben aus Bakterienextrakten gegeben wurden, eine IPTG-induziert und die andere nicht-induziert, die mit verschiedenen Farbstoffen des Paares aus aneinander angepaßten Farbstoffen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung markiert wurden.
  • 4a) – d) sind Abbildungen von Abschnitten eines zweidimensionalen Gels, auf das zwei unterschiedlichen Proben aus Bakterienextrakten gegeben wurden, eine mit exogen zugesetzter Carboanhydrase und eine ohne Carboanhydrase, die jeweils mit einem unterschiedlichen Farbstoff des Paares aus aneinander angepaßten Farbstoffen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung markiert wurden.
  • 5a) und b) sind Abbildungen von Cy2-NHS- und Cy3-Hydrazid-markierten Proteinen, welche einer SDS-PAGE unterworfen wurden, die zeigen, daß die Hydrazid-Farbstoffe spezifisch den Kohlenhydrat-Teil des Glycoproteins markieren.
  • 6a) und b) sind Abbildungen von Cy3- und Cy5-Hydrazid-markierten Proteinmischungen nach der SDS-PAGE.
  • 7a) und b) sind Abbildungen eines Abschnitts eines 2DE-Gels, auf das ein Cy3-Hydrazid-markierter HBL100-Zellextrakt und ein Cy5-Hydrazid-markierter BT474-Zellextrakt aufgebracht wurden.
  • 8a) und b) sind Abbildungen eines 2DE-Gels, auf das ein Cy3-Hydrazidmarkierter BT474-Zellextrakt ohne exogen zugesetztes Protein und ein Cy5-Hydrazid-markierter BT474-Zellextrakt mit exogen zugesetztem Protein aufgebracht wurden.
  • 9 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Ionenaustauschchromatographie eines Cy3-markierten bovinen Serumalbumins (BSA; 33 μg) und eines Cy5-markierten Transferrins (33 μg) zeigt.
  • 10 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Ionenaustauschchromatographie eines Cy5-markierten Myoglobins, Transferrins und bovinen Serumalbumins (13 μg eines jeden Proteins) zeigt.
  • 11 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Umkehrphasenchromatographie einer Cy5-markierten Ribonuklease a, eines Cy5-markierten Cytochroms c, Holotransferrins und Apomyoglobins (3,3 μg eines jeden Proteins) zeigt.
  • 12 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Größenausschlußchromatographie eines Cy3-markierten Thryoglobulins, Apoferritins, IgGs und β-Lactoglobulins (23,5 μg eines jeden Proteins) zeigt.
  • 13 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse einer Protein-Differenz-Analyse mittels Größenausschlußchromatographie unter Verwendung von Proben, die mit Cy3 oder Cy5 markiert sind, zeigt. Die Cy3-markierten Proteine sind Thryoglobulin (38 μg), Apoferritin (28 μg), IgG (2,6 μg) und β-Lactoglobulin (12 μg). Die Cy5-markierte Probe enthält kein IgG. Die Cy3- und Cy5-markierten Proben wurden vor der Chromatographie gemischt.
  • 14 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse einer Differenz-Analyse mittels Ionenaustauschchromatographie von Cy3- oder Cy5-markierten Proben zeigt. Die Cy3-markierten Proben enthielten Transferrin und die Cy5-markierten Proben enthielten Transferrin und bovines Serumalbumin (13 μg eines jeden Proteins). Die Cy3- und Cy5-markierten Proben wurden vor der Chromatographie gemischt.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet einen Satz aneinander angepaßter Farbstoffe, wobei jeder Farbstoff im Satz den anderen Farbstoffen hinsichtlich ionischen und pH-Eigenschaften und hinsichtlich der chemischen Reaktivität für die kovalente Bindung an Proteine im wesentlichen gleicht, jedoch bei einer unterschiedlichen Wellenlänge fluoresziert, so daß bei der Betrachtung unterschiedliche Lumineszenzfarben vorliegen. Bevorzugt, jedoch nicht notwendigerweise, weisen die Farbstoffe ungefähr das gleiche Molekulargewicht auf. Jeder der Farbstoffe innerhalb des Satzes aus aneinander angepaßten Farbstoffen wird zur Markierung von Proteinen in einer unterschiedlichen Probe eines Satzes unterschiedlicher Proteinproben verwendet, so daß jede Probe mit einem unterschiedlichen Farbstoff aus dem Farbstoffsatz markiert wird. Nach der Markierung werden die Proteine gemischt und im gleichen Medium mit einer beliebigen geeigneten bekannten Trenntechnik, zum Beispiel der Elektrophorese oder der Chromatographie, getrennt. Die Elektrophorese-Techniken schließen die ein- und die zweidimensionale Elektrophorese, die Kapillarzonenelektrophorese, die Kapillargelelektrophorese, die isoelektrische Fokussierung, die Isotachophorese und die mizellare elektrokinetische Chromatographie ein. Chromatographische Techniken schließen die Affinitätschromatographie, die Größenausschlußchromatographie, die Umkehrphasenchromatographie, die hydrophobe Interaktionschromatographie und die Ionenaustauschchromatographie ein.
  • Bezugnehmend auf die schematische Darstellung in 1 wird ein erster Proteinextrakt mit bekannten Techniken aus einer ersten Gruppe von Zellen hergestellt und anschließend mit dem ersten Farbstoff eines Paares aus aneinander angepaßten Farbstoffen markiert. Ein zweiter Proteinextrakt wird mit bekannten Techniken aus einer zweiten Gruppe von Zellen hergestellt und anschließend mit dem zweiten Farbstoff des Paares aus aneinander angepaßten Farbstoffen markiert. Um das Protein zu markieren, werden die reaktive Form des Farbstoffes und das Protein für eine Zeitspanne inkubiert, die für die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der reaktiven Form des Farbstoffes und potentiellen Anlagerungs- oder Bindungsstellen in den Proteinen ausreichend ist. Die Zeitspanne beträgt in Abhängigkeit von der Temperatur im allgemeinen 15 bis 30 Minuten. Der Temperaturbereich beträgt im allgemeinen etwa 0°C bis 25°C. Die Reaktion zwischen dem Farbstoff und den Proteinen kann abgestoppt werden, nachdem ein ausreichender Prozentsatz verfügbarer Bindungsstellen im Proteinmolekül kovalent an den Farbstoff gebunden hat. Jedes geeignete bekannte Quencher-Material kann eingesetzt werden. Andere Verfahren zur Entfernung von überschüssigem Farbstoff, wie zum Beispiel die Gelfiltration, können ebenfalls eingesetzt werden. In Fällen, in denen die Markierungsreaktion bis zur Beendigung ablaufen gelassen wird, zum Beispiel, wenn der gesamte reaktive Farbstoff verbraucht wurde, kann das Abstoppen oder das Entfernen des Farbstoffüberschusses nicht erforderlich sein.
  • Die erste und die zweite Gruppe von Zellen können beliebige zwei Sätze von Zellen sein, deren Proteingehalt man zu vergleichen oder gegenüberzustellen wünscht. Zum Beispiel kann die erste Gruppe Zellen aus Wildtyp- oder normalen Zellen bestehen, und die zweite Gruppe Zellen kann aus mutierten Zellen, die von der gleichen Art stammen, bestehen. Alternativ kann die erste Gruppe Zellen aus normalen Zellen bestehen, und die zweite Gruppe kann aus Krebszellen des gleichen Individuums bestehen. Ebenfalls können Zellen des gleichen Individuums in unterschiedlichen Entwicklungsstadien oder unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus eingesetzt werden. Zellen aus einem sich entwickelnden Embryo, zum Beispiel aus der Ventralfur che von Drosophila melanogaster, können als erste Gruppe Zellen gewonnen werden, und Zellen, die sich in Nachbarschaft der Ventralfurchen-Zellen entwickeln, können als zweite Gruppe Zellen gewonnen werden. Die Unterschiede in der Proteinzusammensetzung von Zellen des gleichen Typs aus unterschiedlichen Arten können ebenfalls Untersuchungsgegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens sein. Außerdem kann das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, um zu verfolgen, wie Zellen auf eine Vielzahl von Stimuli oder Arzneimittel reagieren. Alle Vorgänge, die das Verhalten der Zelle ändern können, wobei sich die Verhaltensänderung in Proteinänderungen widerspiegelt, können detektiert werden, ohne daß kostenintensive 2D-PAGE-Systeme hoher Präzision notwendig sind. Fachleuten erschließt sich, daß die zu vergleichenden Proteine auch aus biologischen Flüssigkeiten, zum Beispiel aus Serum, Urin oder Spinalflüssigkeit, stammen können.
  • Die markierten Proben werden gemischt und, wie in 1 dargestellt, in abgemessenen Anteilen auf ein Gel gegeben und anschließend bevorzugt einer 2D-PAGE unterzogen. Eine eindimensionale SDS-Elektrophorese kann anstelle der 2D-PAGE eingesetzt werden. Die Vorgehensweisen zur Durchführung eindimensionaler und zweidimensionaler Elektrophoresen sind Fachleuten allgemein bekannt.
  • Proteine, die in beiden Zellgruppen gleichzeitig vorliegen, bilden sich deckende Spots. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensität identischer Proteine aus jeder der beiden Gruppen ist für die große Mehrzahl der Proteine konstant. Proteine, die nicht in beiden Gruppen gleichzeitig vorliegen, wandern unabhängig voneinander. Somit weist ein Protein, das nur in einer Gruppe vorliegt oder in einer Gruppe eine unterschiedliche relative Konzentration aufweist, ein von der Mehrzahl der Protein-Spots verschiedenes Verhältnis der Fluoreszenzintensität auf und erzeugt eine Farbe, die in Abhängigkeit von der gewählten Markierung für den einen oder den anderen Proteinextrakt spezifisch ist. Zum Beispiel können die Proteine, die in der ersten Probe vorliegen, rot markiert werden, während die zweite Gruppe blau markiert wird. Unter der Bedingung, daß exakt gleiche Proteinmengen aus jeder Gruppe miteinander gemischt und auf dem gleichen Gel laufen gelassen werden, ist das Verhältnis der Flu oreszenzintensität für die Mehrzahl der Proteine 1. Diejenigen Proteine, die für die eine oder die andere Gruppe charakteristisch sind, weisen ein Verhältnis der Fluoreszenzintensität auf, das in Abhängigkeit von der Größenordnung oder der Verhältnisbildung kleiner oder größer als 1 ist.
  • Das Gel kann mit einem Fluoreszenzscanner für zwei Wellenlängen, mit einem Fluoreszenzmikroskop oder mit jeder anderen bekannten Vorrichtung zur Fluoreszenzdetektion analysiert werden. Die Gelanalyse kann durch den Einsatz einer Computerbasierten Identifizierung der Proteinunterschiede vollständig automatisiert werden. Bei Verwendung eines elektronischen Detektionssystems, zum Beispiel eines Laserscanner-Systems mit einem Sekundärelektronenvervielfacher oder einer Kamera mit einer ladungsgekoppelten Einheit (CCD-Kamera) und einer weißen Lichtquelle, werden zwei elektronische Abbildungen des feuchten Gels unter Verwendung verschiedener bekannter Filtersätze zur Anpassung an die unterschiedlichen spektralen Eigenschaften der Markierungen aufgenommen. Eine Abbildung macht die Fluoreszenz des ersten Farbstoffes sichtbar, indem ein erster Filter verwendet wird, der geeignet ist, jegliches Licht mit Ausnahme des Lichtes herauszufiltern, das bei der Wellenlänge des ersten Farbstoffes emittiert wird, und die andere Abbildung macht die Fluoreszenz des zweiten Farbstoffes sichtbar, indem ein zweiter Filter verwendet wird, der geeignet ist, jegliches Licht mit Ausnahme des Lichtes herauszufiltern, das bei der Wellenlänge des zweiten Farbstoffes emittiert wird. Die Belichtungszeit beträgt etwa 5 bis 500 Sekunden. Die Unterschiede zwischen den Proben können entweder während der Elektrophorese oder innerhalb von weniger als einer halben Stunde nach der Elektrophorese festgestellt werden. Mehrere Software-Pakete sind kommerziell erhältlich, die entweder die erste Abbildung von der zweiten subtrahieren, um Spots, die unterschiedlich sind, zu identifizieren, oder alternativ können die Abbildungen dividiert werden, so daß nur die Spots übrigbleiben, die nicht in beiden Abbildungen gleichzeitig vorliegen. Bei der Subtraktion der Abbildungen heben sich gleiche Spots gegenseitig auf, wodurch nur diejenigen übrigbleiben, die verschieden sind. Bei der Verhältnisanalyse ergeben gleiche Spots einen Wert von 1. Unterschiede führen zu Werten von größer als 1 oder kleiner als 1.
  • In herkömmlichen Analysen wird eine Kontrolle aus Proteinen, die für den untersuchten Zelltyp bekannt sind, mitlaufen gelassen. Die bekannten Spots auf dem Probengel müssen im Vergleich mit der Kontrolle und dem zweiten Gel identifiziert und gekennzeichnet werden, um Unterschiede zwischen den zwei Gelen festzustellen. In der vorliegenden Erfindung gibt es nur ein Gel, so daß keine Kennzeichnung notwendig ist. Außerdem korrigiert die Software, die in herkömmlichen Verfahren zur Ausrichtung verschiedener Gele vor dem Vergleich und der Gegenüberstellung von Proteinunterschieden eingesetzt wird, lokale Verzerrungen und Inkonsistenzen zwischen zwei oder mehreren Gelen nicht. Das erfindungsgemäße Verfahren eliminiert den Bedarf an einer solchen Korrektur, da die markierten Proteine aller zu testenden Proben gemischt und zusammen getrennt werden. Jede Probe unterliegt zum Beispiel etwaigen Verzerrungen im Elektrophoresegel in gleicher Weise.
  • Die Auswahl und Synthese des Satzes aneinander angepaßter Farbstoffe ist von Bedeutung. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Fluoreszenzfarbstoffe kovalent an Proteine gekoppelt, bevorzugt über die Lysinreste der Proteine, die Kopplung kann jedoch auch zu Sulfhydryl- oder Carbonsäuregruppen in den Proteinen erfolgen. Im Fall von modifizierten Proteinen können die Farbstoffe an die modifizierenden Gruppen gekoppelt werden; zum Beispiel können die Farbstoffe an den Zuckerrest von Glycoproteinen, nach deren Oxidation zum Aldehyd, gekoppelt werden. Die Einstellung des pH der Proteine, um die Bindung der Markierungsverbindungen an einen Aminosäurerest, unter Ausschluß der anderen Aminosäuren, zu forcieren, ist eine bekannte Technik, die in R. Baker, Organic Chemistry of Biological Components, (Prentice Hall, veröff. 1971) beschrieben ist. Zur Analyse von Proteinen wird eine Vielzahl von Bindungsstellen markiert. Der optimale Prozentsatz an zu markierenden Bindungsstellen hängt vom Farbstoff und den ausgewählten funktionellen Zielgruppen ab. Wenn die bevorzugten Farbstoffe, die nachfolgend genauer beschrieben werden, eingesetzt werden, um Lysine zu markieren, werden bevorzugt nicht mehr als 2% der Bindungsstellen und besonders bevorzugt etwas weniger als 1% markiert, um zu vermeiden, daß das Protein unlöslich wird. Für den Fall, daß ein typisches Protein aus etwa 7% Lysin aufgebaut ist, liegt somit weniger als eine modifizierte Aminosäure pro Eintausend vor. Ein typisches Protein ist aus etwa 450 Aminosäuren aufgebaut. Eine alternative Strategie besteht darin, alle funktionellen Gruppen eines bestimmten Typs, der im Protein nicht sehr häufig vorkommt, zu markieren, zum Beispiel die Sulfhydrylgruppen in Cysteinen. Wenn Lysin die Bindungsstelle ist, zerstört die kovalente Bindung die positive Ladung des primären Amins im Lysin. Da die isoelektrische Fokussierung von der Ladung abhängig ist, ist es wichtig, den Ladungsverlust zu kompensieren. Ein basischer Rest sollte basisch bleiben. Eine Änderung des pKa eines Restes pro Protein um höchstens 3 kann toleriert werden, vorausgesetzt, daß die Basizität oder Acidität des modifizierten Restes nicht verändert wird, wie es der Fall sein kann. Farbstoffe wie Rhodamin oder Fluorescein sind aufgrund der Unterschiede hinsichtlich der Ladung nicht geeignet.
  • Für Fachleute ist ersichtlich, daß die beschriebenen Markierungsverfahren ebensogut auf Peptidmoleküle angewendet werden können, die aus Zellen gewonnen wurden oder in biologischen Flüssigkeiten, zum Beispiel im Plasma, Serum, Urin, Ascites oder in der Spinalflüssigkeit, vorliegen. Weiterhin kann es unter bestimmten Umständen bei der Herstellung einer Proteinprobe für die Markierung nützlich sein, zuerst einen Enzymverdau mit Trypsin oder anderen Proteaseenzymen durchzuführen, um vor der Markierung und Trennung Peptide zu erzeugen.
  • Alternativ ist es möglich, auf spezielle Gruppen von Proteinen abzustellen, zum Beispiel auf Proteine, die post-translationale Gruppen aufweisen, um Unterschiede in den post-translationalen Modifikationen und andere in Proteinen auftretende Unterschiede zweier oder mehrerer Proben zu vergleichen.
  • Ein Beispiel für solche Proteine sind Glycoproteine. In den letzten Jahren wurde die funktionelle Bedeutung der Kohlenhydrate in Proteinen zunehmend erkannt. Von Kohlenhydraten weiß man inzwischen, daß sie in viele zelluläre Prozesse und in viele mit Krankheiten verbundene Vorgänge involviert sind. Es ist möglich, die endständigen Kohlenhydratgruppen von Glycoproteinen zu markieren, indem, wie von Wilchek, M. und Bayer, E.A., "Methods in Enzymology" Bd. 138, 429–442 (1987) beschrieben, zuerst die endständigen Zucker zu Aldehyden oxidiert werden, gefolgt von einer Reaktion mit einem Hapten oder einem Fluorophor, das eine reaktive Gruppe aufweist, wie zum Beispiel einem Hydrazid.
  • Genauer gesagt schließt dieses Verfahren ein: Die Herstellung eines Extraktes zweier oder mehrerer Proteinproben und das Inkubieren jeder der genannten Proteinproben in Gegenwart von Periodat für kurze Zeit, um die vicinalen Diole der endständigen Zucker zu Aldehydgruppen zu oxidieren. Überschüssiges Periodat wird dann durch Zugabe von Bisulfit zerstört, bevor mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff aus einem Satz aneinander angepaßter Farbstoffe markiert wird. Alternativ ist es möglich, unter Verwendung einer geringeren Periodat-Konzentration, typischerweise 1 mM, und bei einer Temperatur von 0°C speziell Sialinsäure-Reste durch Oxidation ihrer exocyclischen Kohlenstoffe zu markieren. Es ist auch möglich, die Proteinprobe mit Galactose-Oxidase zu behandeln, um an endständigen Galactose-Resten eine Aldehydgruppe zu erzeugen, so daß ein C-6-Aldehyd-Derivat gebildet wird, das dann mit einem geeigneten Fluorophor umgesetzt werden kann. Die Umsetzung des Farbstoffes mit dem Kohlenhydrat kann durch Zugabe eines geeigneten Materials abgestoppt werden, bevor die Proben miteinander gemischt und einem geeigneten Trennverfahren unterworfen werden.
  • Fluoreszenzfarbstoffe, die zur Markierung von Glycoproteinen eingesetzt werden können, schließen diejenigen Farbstoffe ein, die als reaktive Gruppen Hydrazin-Derivate, wie zum Beispiel Hydrazide, Semicarbazide und Carbohydrazide, oder Amin-Derivate aufweisen. Um die Gesamtladung des Glycoproteins aufrechtzuerhalten, werden geeigneterweise Farbstoffe eingesetzt, die eine neutrale Gesamtladung aufweisen. Eine neutrale Gesamtladung kann erhalten werden, indem geeignet geladene Linker-Gruppen an das Farbstoffmolekül angefügt werden, so daß die gewünschte Gesamtladung erzeugt wird. Geeignete Farbstoffe schließen neutrale Cyanin-Derivate, BODIPY-Derivate oder andere fluoreszierende Derivate ein, die als Sätze aneinander angepaßter Farbstoffe, wie sie hierin beschrieben werden, verfügbar sind und eine neutrale Gesamtladung aufweisen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch auf Phosphoproteine anwendbar, die spezifisch mit Fluorophoren markiert werden können. Phosphoproteine spielen eine wichtige biologische Rolle, zum Beispiel in der Signalübermittlung zwischen Zellen, und sind in eine Anzahl regulativer Mechanismen involviert. Die Phosphatgruppen in Proteinen können spezifisch markiert werden, zum Beispiel mit dem Verfahren, das von Giese und Wang im US-Patent Nr. 5,512,486, das hierin durch Bezugnahme eingeschlossen wird, beschrieben wurde und das fluoreszierende oder Hapten-Imidazol-Derivate einsetzt. Die Markierungsreagenzien, die die Imidazolgruppen aufweisen, werden in Gegenwart eines geeigneten Carbodiimids zu den Proteinproben gegeben, um die Markierung zu bewirken.
  • Speziell beinhaltet das Verfahren die Herstellung eines Extraktes zweier oder mehrerer Proteinproben und das Inkubieren jeder der genannten Proteinproben mit einem geeigneten wasserlöslichen Carbodiimid sowie einem fluoreszierenden Imidazol-Derivat aus einem Satz aneinander angepaßter Farbstoffe. Obwohl das Carbodiimid die Carboxylseitenketten und die Phosphatseitenketten aktiviert, ist die Bindung zu den Carboxylgruppen instabil, wenn der pH auf etwa 8 angehoben wird. Überschüssiges reaktives Material kann durch Zugabe eines geeigneten bekannten Quencher-Materials entfernt werden. Anschließend werden die Proben gemischt und mit einem bekannten Trennverfahren getrennt.
  • Damit die Gesamtladung des Phosphoproteins unverändert bleibt, weisen geeignete fluoreszierende Imidazol-Derivate eine negative Gesamtladung auf. Diese negative Gesamtladung kann erhalten werden, indem eine geeignet geladene Linker-Gruppe an das Farbstoffmolekül angefügt wird. Beispiele für Farbstoffe, die eingesetzt werden können, schließen Cyanin-Farbstoffe, die eine negative Gesamtladung aufweisen, Quadrat-Farbstoffe, die eine negative Gesamtladung aufweisen, oder andere fluoreszierende Derivate, die eine negative Gesamtladung aufweisen und als Satz aneinander angepaßter Farbstoffe verfügbar sind, ein. Bevorzugte Carbodiimid-Moleküle sind wasserlösliche Moleküle, wie zum Beispiel (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid) (EDC) und 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimidiodid (EAC).
  • Die erste untersuchte Gruppe von Farbstoffen waren fluoreszierende Cyanin-Farbstoffe, die in Mujumdar, R.B. et al., "Cyanine dye labeling reagents containing isothiocyanate groups", Cytometry 10:11-19 (1989) und Waggoner et al., US-Patent Nr. 5,268,486 mit dem Titel "Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes", das 1993 erteilt wurde und hierin durch Bezugnahme eingeschlossen wird, beschrieben sind. Die Cyanin-Farbstoffe weisen die folgende allgemeine Struktur auf.
    Figure 00170001
    worin X und Y O, S oder (CH3)2-C sein können, m eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist und mindestens eine der Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6 oder R7 eine reaktive Gruppe ist, die mit Amino-, Hydroxy- oder Sulfhydryl-Nukleophilen reagiert. Die gepunktete Linie stellt die Kohlenstoffatome dar, die zur Bildung von einem Ring bis zu drei kondensierten Ringen mit 5 bis 6 Atomen in jedem Ring notwendig sind. R3, R4, R6 und R7 sind an die Ringe gebunden. Die reaktive Einheit kann jede bekannte reaktive Gruppe sein. Reaktive Gruppen, die direkt oder indirekt an das Chromophor gebunden sein können, um R1-, R2-, R3-, R4-, R5-, R6- oder R7-Gruppen zu bilden, können reaktive Einheiten einschließen, wie zum Beispiel Gruppen, die Isothiocyanat, Isocyanat, Monochlortriazin, Dichlortriazin, mono- oder dihalogen-substituiertes Pyridin, mono- oder dihalogen-substituiertes Diazin, Maleimid, Phosphoramidit, Aziridin, Sulfonylha logenid, Säurehalogenid, Hydroxysuccinimidester, Hydroxysulfosuccinimidester, Imidoester, Hydrazin, Azidonitrophenyl, Azid, 3-(2-Pyridyldithio)-proprionamid, Glyoxal, Keton, Amino und Aldehyd enthalten.
  • Aufgrund ihrer intrinsischen positiven Ladung sind die im Patent von Waggoner et al. beschriebenen Cyanin-Farbstoffe die Fluorophore der Wahl, wenn zur Markierung primärer Amine eine positive Ladung erwünscht ist. Die Cyanine binden über den aktivierten Ester der Hexansäure an das Protein. Obwohl durch die Kopplung die Ladung der Lysinseitenkette aufgehoben wird, erfolgt eine Kompensation durch die intrinsische Ladung des Farbstoffes. Im Ergebnis wird die Ladung vom Proteinmolekül weg bewegt, die Gesamtladung innerhalb der Probe, die der Elektrophorese unterzogen wird, bleibt jedoch gleich. Im Cyanin-Farbstoffmolekül sind zwei funktionalisierte Indolringe über eine Polyen-Linker-Gruppe verbunden. Die spektralen Eigenschaften von Cyanin-Farbstoffen können leicht moduliert werden, indem einfach die Länge der Linker-Gruppe zwischen den Indolringen des Farbstoffes verändert wird. Eine längere oder kürzere Linker-Gruppenlänge führt zu einer Fluoreszenz bei unterschiedlichen Wellenlängen und somit zu unterschiedlichen Farben. Eine Änderung der Länge der Linker-Gruppe verändert jedoch das Molekulargewicht des Farbstoffes. Da die Elektrophorese auch von der Masse der Proteine abhängig ist, kann die Wirkung des Farbstoffes auf die Proteinmasse auch von Bedeutung sein. Da die Proteine vor der Elektrophorese markiert werden, darf die Masse des Farbstoffes, der an das Protein gebunden wird, die relativen Unterschiede der Molekulargewichte der verschiedenen Proteine im Extrakt nicht signifikant verändern. Das Molekulargewicht ist jedoch nicht kritisch, weil nur eine relativ kleine Anzahl Stellen im Protein markiert werden. Wie oben angegeben werden bevorzugt weniger als 1 % bis zu etwa 2% der möglichen Bindungsstellen in den Proteinen markiert. Wenn mehr Stellen markiert werden, erlangt die Aufrechterhaltung von im wesentlichen gleichen Molekulargewichten für die Farbstoffe innerhalb des Satzes aus aneinander angepaßten Farbstoffen eine größere Bedeutung.
  • Der Unterschied im Molekulargewicht, der durch die Änderung der Länge der Linker-Gruppe in den fluoreszierenden Cyanin-Farbstoffen hervorgerufen wird, kann dadurch kompensiert werden, daß die Größe der aliphatischen Kette R1 oder R2, die an einen der Indolringe des Farbstoffes gebunden ist, angepaßt wird. Eine der Gruppen R1 und R2 muß eine reaktive Gruppe sein. Diese Anforderungen hinsichtlich des Aufbaus führten zu einer Modifizierung der Cyanine und zur Entwicklung eines Farbstoffes mit der allgemeinen Formel
    Figure 00190001
    worin X und Y gleich S, O oder CH3-C-CH3 sind, m eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist und entweder R1 oder R2 eine reaktive Gruppe ist, die in der Lage ist, kovalent an das Protein zu binden, wie zum Beispiel die reaktiven Gruppen, die oben für die nicht-modifizierten Cyanin-Farbstoffe beschrieben sind. Die gepunktete Linie stellt 1, 2 oder 3 kondensierte Ringe mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen in jedem Ring dar. Jede Seite sollte die andere Seite ausgleichen.
  • Es folgt ein Beispiel für ein Paar aus aneinander angepaßten Farbstoffen, das entsprechend der allgemeinen Formel entwickelt wurde:
    Figure 00190002
    (Propyl-Cy-3-NHS), das rot fluoresziert, und
    Figure 00200001
    (Methyl-Cy-5-NHS), das im fernen Rot des Spektrums fluoresziert, worin R eine reaktive Gruppe ist. Wie oben angegeben kann anstelle von (CH3)2C- in die X- und Y-Positionen O, S oder eine Kombination aus beiden eingefügt werden.
  • Die Cyanin-Farbstoffe sind eine Wahl für den Satz aus aneinander angepaßten Farbstoffen der vorliegenden Erfindung. Anstelle der Cyanine können andere Farbstoff-Verbindungen eingesetzt werden, zum Beispiel Dipyrromethenbordifluorid-Farbstoffe und die derivatisierten 4,4-Difluor-4-bora-3a,4a-diaza-S-indacen-Farbstoffe, die im US-Patent Nr. 4,774,339 von Haugland et al. beschrieben sind, das hierin als Bezugnahme eingeschlossen wird, und die von Molecular Probes, Inc. unter dem Warenzeichen BODIPY® vertrieben werden. Die BODIPY®-Farbstoffe, die keine Nettoladung aufweisen, werden unter Verwendung eines aktivierten N-Hydroxysuccinimidylesters, der eine Amid-Bindung bildet, kovalent an Lysinseitenketten gebunden. Im Ergebnis geht die positive Ladung des Lysins verloren. Daher wird in den aneinander angepaßten Farbstoffen der Erfindung eine positiv geladene Linker-Gruppe eingesetzt, um das verloren gegangene primäre Amin durch das tertiäre Amin der Linker-Gruppe zu ersetzen. Die Verfahren zur Herstellung von BODIPY®-Farbstoffen sind in US-Patent Nr. 4,774,339 beschrieben. Techniken zur Einführung einer positiv geladenen Linker-Gruppe sind Fachleuten bekannt. Eine Linker-Gruppe kann mit drei funktionellen Gruppen ausgestattet werden: (1) zur Reaktion mit dem BODIPY®-NHS-Ester, (2) zur Verfügungstellung der gewünschten Ladung und (3) zur Aktivierung, so daß das BODIPY®-Linker-Konstrukt mit spezifischen Aminosäureresten der Proteine im Extrakt reagiert.
  • Die Haupterwägungen für den Satz aus aneinander angepaßten Farbstoffen sind die Aufrechterhaltung der Ladung und charakteristische unterscheidbare spektrale Eigenschaften. Beliebige neutrale Farbstoffe mit einer positiven Linker-Gruppe oder beliebige positiv geladene Farbstoffe, die bevorzugt jeweils die Ladung +1 aufweisen und die auch die übrigen hierin beschriebenen Anforderungen erfüllen, können im Satz aus aneinander angepaßten Farbstoffen der vorliegenden Erfindung als Farbstoffe dienen. Ein etwa gleiches Molekulargewicht in den Proben der markierten Proteine ist wünschenswert, wie oben erläutert jedoch nicht kritisch. Die intrinsische positive Ladung der Cyanin-Farbstoffe wird in der bevorzugten Ausführungsform vorteilhaft eingesetzt, um die positive Ladung des Lysins zu ersetzen. Die pKa-Werte von Cyaninen und Lysin sind recht unterschiedlich; jedoch wurden Bedingungen gewählt, unter denen das Verhältnis Farbstoff : Protein kleiner als 1 ist. Dieser geringe Markierungsgrad stellt sicher, daß Änderungen hinsichtlich der Wanderung des Proteins auf den zweidimensionalen Elektrophoresegelen vernachlässigbar sind. Farbstoffe, die näher am pKa des Lysins liegen, können eingesetzt werden. Alternativ können Farbstoffe eingesetzt werden, die andere Aminosäurereste modifizieren, vorausgesetzt, daß die ionischen Eigenschaften der Aminosäuren bei der Modifikation erhalten bleiben. Anstelle des Lysins kann die Bindungsstelle im Protein eine Sulfhydryl- oder Carboxylgruppe sein. Wenn die Bindungsstelle im Protein eine Sulfhydrylgruppe ist, ist die entsprechende Bindungsstelle im Farbstoff eine Iodalkyl- oder Maleimidgruppe. Wenn die Bindungsstelle im Protein eine Carboxylgruppe ist, ist die entsprechende Bindungsstelle im Farbstoff ein Chlorketon oder ein Carbodiimid.
  • Es wird im voraus erwähnt, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch eingesetzt werden kann, um das Vorliegen unterschiedlicher Nukleinsäuren in verschiedenen Proben zu detektieren. Die Ladung von Nukleinsäuren ist stark negativ. Die Zugabe des Farbstoffes verändert daher die Gesamtladung in den Nukleinsäuren nicht, so daß die Auswahl des Satzes aus-aneinander angepaßten Farbstoffen den Ladungsverlust nicht kompensieren muß, wenn eine Nukleinsäure-Analyse beabsichtigt ist. Um die Anbindung des Farbstoffes zu erleichtern, können Nukleinsäuren mit Techniken, die Fachleuten bekannt sind, modifiziert werden, so daß sie eine freie Aminosäure aufweisen, die aus dem Kern der Nukleinsäure stammt. Auch in diesem Fall wäre ein Lysin geeignet.
  • Beispiel 1
  • Synthese der Farbstoffe (Methyl-Cy-5 und Propyl-Cy-3):
  • 1. Synthese der Indolderivate (beiden Farbstoffen gemeinsam):
  • 4,8 g (30 mmol) 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol und 35 mmol des gewünschten Bromalkyl-Reagenzes (6-Bromhexansäure oder 1-Brompropan) in 40 ml 1,2-Dichlorbenzen wurden unter Stickstoffgas auf 110°C erwärmt und über Nacht unter Rückfluß gerührt. Das Produkt (saures Indol, Methylindol oder Propylindol) fiel als leicht orangefarbenes Gummi aus. Der Überstand wurde dekantiert und das Gummi wurde mehrmals mit Ethylether gewaschen. Dieses Intermediat wurde so wie es war eingesetzt.
  • 2. Cy-3-Intermediat:
  • 1,5 g (7,5 mmol) Propylindol wurde zu 1,6 g (7,6 mmol) N,N'-Diphenylformamidin in 20 ml Eisessig gegeben und für 4 h unter Rückfluß erwärmt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wodurch ein tief orangefarbener Sirup zurückblieb. Dieses Intermediat wurde so wie es war eingesetzt.
  • 2a. Cy-5-Intermediat:
  • Die Synthese des Cy-5-Intermediates entspricht der Synthese des Cy-3-Intermediates in Schritt 2. der Farbstoff-Synthese, mit der Ausnahme, daß 2-Methylen-1,3,3-trimethylindolin anstelle von Propylindol eingesetzt wurde und die Linker-Gruppe Malonaldehyddianil war. Das gummiartige bläuliche Intermediat wurde zweimal mit Ethylether gewaschen.
  • 3. Cy-3:
  • 2,5 ml Triethylamin und 1,8 ml wasserfreies Ac2O wurden zu dem Intermediat aus Schritt 2. gegeben und die Mischung wurde für 5 Minuten sieden gelassen. 1,70 g (5,0 mmol) saures Indol wurde zugegeben und die Mischung wurde für 2 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und die Produkte wurden in 10 ml EtOH gelöst.
  • 3a. Cy-5:
  • Die Herstellung von Cy-5 entspricht der des Cy-3, mit der Ausnahme, daß das Intermediat aus Schritt 2a. anstelle des Intermediates aus Schritt 2. eingesetzt wurde.
  • 4. Reinigung der Produkte aus den Schritten 3. und 3a.:
  • Eine Flash-Chromatographie mit einer festen Phase aus Silicagel und 40% MeOH in Dichlormethan als mobile Phase wurde durchgeführt, um Methyl-Cy-5 und Propyl-Cy-3 von verunreinigenden Nebenprodukten zu befreien.
  • 5. Aktivierung der Carboxylgruppen:
  • Die Carbonsäuregruppe eines jeden Farbstoffes wurde durch Lösen einer Menge des gereinigten Materials in 5 ml trockenem Dimethylformamidin (DMF) in einen N- Hydroxysuccinimidylester überführt. 1,5 Äquivalente N,N'-Disuccinimidylcarbonat (DSC) wurden zusammen mit 0,1 ml trockenem Pyridin/100 mg Farbstoff zugefügt. Die Reaktion wurde unter Stickstoff bei 60°C für 90 Minuten unter Rückfluß erwärmt.
  • Beispiel 2
  • Protein-Markierung:
  • 1. Bakterienkultur:
  • Anfängliche Experimente wurden mit E. coli durchgeführt, das, wie in Chasman, D.I. et al., "Activation of yeast polymerase II transcription by Herpesvirus VP16 and GAL4 derivatives in vitro", Molecular Cell Biology 9:4746–4749 (1989) beschrieben, unter der Kontrolle des lac-Promotors das chimäre Protein GAL4VP16 exprimiert. Zwei Bakterienkulturen wurden bei 37°C in 125 ml Standard-LB-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, bis zu einer OD600 von 0,7 kultiviert. Isophenylthiogalactopyranosid (IPTG), ein nicht-hydrolysierbares Lactose-Analogon, wurde in einer Endkonzentration von 1 mM zu einer Kultur gegeben. Beide Kulturen wurden für weitere 2,5 Stunden inkubiert.
  • 2. Protein-Isolierung für die zweidimensionale Gelelektrophorese:
  • Die Protein-Isolierung wurde wie folgt durchgeführt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren isoliert. Jedes Bakterienpellet wurde mit einem Ultraschall-Puffer, der 5 mM Hepes KOH (pH 8,4) und 5 mM Mg(OAc) 2 enthielt, gewaschen. Das Pellet wurde in einem Ultraschall-Puffer, der 50 μg/ml RNase enthielt, resuspendiert, so daß ein Endvolumen von 100 μl erhalten wurde. Dieses wurde anschließend in Eis mit Ultraschall behandelt bis die Lösung klar war, üblicherweise für einige Minuten. DNase wurde zu 50 μg/ml gegeben und die Probe wurde für 30 min bei 0°C inkubiert. Fester Harnstoff und CHAPS wurden zugegeben, so daß eine Endkonzentration von 8 M bzw. 5% erhalten wurde. Die Probe wurde aus dem Eis genommen und 1 Volumen Lyse-Puffer wurde zugesetzt. Die Probe wurde entweder sofort markiert oder bei –80°C aufbewahrt.
  • 3. Protein-Markierung:
  • Propyl-Cy-3-NHS wurde zu der ersten Probe und Methyl-Cy-5-NHS wurde zu der zweiten Probe des Zellextraktes in einer Konzentration von 2 nmol Farbstoff/50 μg Protein gegeben. Die Farbstoffstammlösung lag typischerweise als 2 mM Lösung in Dimethylformamid vor. Die Reaktion wurde bei 0°C für 30 Minuten inkubiert. Die Inkubationszeiten können in Abhängigkeit von der Temperatur und dem untersuchten Zelltyp von etwa 15 bis etwa 30 Minuten variieren. Die Inkubation kann 15 Minuten dauern, wenn die Temperatur etwa 25°C beträgt. Die Temperatur sollte nicht höher als die Temperatur sein, die zu einem Abbau der Proteine führt. Die markierte Probe wurde sofort der isoelektrischen Fokussierung unterzogen oder bei –80°C aufbewahrt.
  • 4. Protein-Isolierung und -Markierung für die SDS-Gelelektrophorese:
  • Bakterien wurden wie in Schritt 2. des Verfahrens zur Protein-Markierung kultiviert und mittels Ultraschall isoliert, mit der Ausnahme, daß RNase oder DNase nicht zugefügt wurden. Der Zellextrakt wurde wie in Schritt 3. des Verfahrens zur Protein-Markierung direkt markiert. SDS, Glycerin, Tris-HCl (pH 6,8) und Bromphenol-Blau wurden zugegeben, so daß die Endkonzentrationen 1 %, 10%, 64 mM bzw. 5 μg/ml betrugen. Die Probe wurde dann für 2 Minuten in ein siedendes Wasserbad getaucht und anschließend der Elektrophorese unterzogen.
  • 5. Bestimmung des Verhältnisses Farbstoff : Protein:
  • Um Löslichkeitsprobleme für die markierten Proteine zu vermeiden, wurden die Bedingungen so gewählt, daß nur 1–2% des Lysins im Zellextrakt markiert wurden. Das basiert auf der Annahme, daß die Aminosäuren eines durchschnittlichen Proteins zu 7% aus Lysin bestehen. Der erste Schritt zur Bestimmung des Verhältnisses von Farbstoff zu Protein war die Entfernung des freien Farbstoffes durch Adsorption an SM-2-Kügelchen (Bio-Rad). Die Protein-Konzentration wurde aus dem OD260/280-Wert bestimmt. Der Farbstoffgehalt wurde aus dem OD548- und dem OD650-Wert für Propyl-Cy-3 bzw. Methyl-Cy-3 bestimmt (∈ = 100.000 für beide Farbstoffe).
  • Beispiel 3
  • Gelelektrophorese:
  • 1. Zweidimensionale Elektrophorese:
  • Die hochauflösende zweidimensionale Gelelektrophorese wurde mit allgemein bekannten Techniken durchgeführt.
  • 2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese:
  • Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde mit bekannten Techniken durchgeführt.
  • Beispiel 4
  • Abbildung des fluoreszierenden Gels:
  • Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die Gele in eine Lösung aus 25% Methanol und 7% Essigsäure getaucht. Die Fluoreszenz-markierten Proteine im Gel wurden auf die folgende Weise abgebildet. Die Gele wurden auf eine Oberfläche aus anodisiertem Aluminium aufgebracht und unter einem Einfallswinkel von 60° mit einer 300 W Halogenlampe, die in einem Diaprojektor untergebracht war, bestrahlt. Das Licht, das den Projektor verließ, wurde durch Bandpaß-Filter (Chroma Techno logies, Brattleboro VT) mit einem Durchmesser von 1' für 545 ± 10 nm und 635 ± 15 nm für Cy-3 bzw. Cy-5 geleitet. Die Abbildungen wurden mit einer gekühlten CCD-Kamera (Photometrics Inc., Tucson AZ), die mit einer 50 mm Linse (Nikon) und einem Doppelbandpaß-Emissionsfilter (Chroma Technologies, Brattleboro VT) für 587,5 ± 17,5 nm und 695 ± 30 nm für Cy-3 bzw. Cy-5 ausgestattet war, aufgenommen. Die CCD-Kamera wurde von einem Macintosh II si Computer mit installierter Kamerasteuerungssoftware von Photometrics gesteuert. Die Bildintegrationszeit betrug Zehntelsekunden bis einige Minuten. Die Anregungsfilter waren in einem Filterrad untergebracht, das am Projektor befestigt war. Zwei aufeinanderfolgende Abbildungen wurden mittels Bestrahlung durch die zwei Filter aufgenommen ohne das Gel zu bewegen.
  • Beispiel 5
  • Bildverarbeitung:
  • Die Bilddateien wurden auf einen Personal Iris 4D/35 (Silicon Graphics Inc., Mountain View CA) übertragen. Anschließend wurden die Bilddateien unter Verwendung der Software DeltaVisionTM (Applied Precision, Mercer Island WA) verarbeitet. Zwei Systeme wurden verwendet, um die Unterschiede zwischen den unterschiedlich markierten Proben auf dem Gel zu bestimmen:
  • 1. Subtraktion:
  • Jede Abbildung kann als gitterartige Anordnung von Pixel-Intensitäten angesehen werden. Diese Anordnungen aus Werten können verschiedenen arithmetischen Operationen unterworfen werden. Hier wurde eine Abbildung von der anderen subtrahiert. Da die zwei auf das Gel aufgebrachten Proben hinsichtlich der Gesamtfluoreszenz nicht perfekt abgestimmt waren, wurde eine Abbildung mit einer ausgleichenden Konstanten multipliziert. Dieser Faktor wurde willkürlich so gewählt, daß die Anzahl Unterschiede zwischen den Proben klein gehalten wurde.
  • 2. Bilderzeugung durch Verhältnisbildung:
  • Hier wurde eine Abbildung durch die andere dividiert. Bevor diese Operation durchgeführt wurde, wurden zunächst die Abbildungen auf einen gemeinsamen Intensitätsbereich normiert. Das wurde dadurch erreicht, daß die minimalen und maximalen Pixelwerte jeder Abbildung auf Null und einen willkürlich gewählten großen Wert, 4095, der maximal mögliche Ausgabewert der verwendeten CCD-Kamera, gesetzt wurden. Dazwischen liegende Pixelwerte wurden linear zwischen diesen Werten angeordnet. Anschließend wurde eine Abbildung durch die andere dividiert. Ein ausgleichender Faktor wurde hier ebenfalls verwendet, um den mittleren Quotienten auf 1 einzustellen. Unterschiedliche Bereiche waren jene mit einem Quotienten von größer als 1.
  • Beispiel 6
  • 1. Differenz-SDS-Gelelektrophorese einer induzierten GAL4VP16-Expression in Bakterien:
  • 2 zeigt Abbildungen von Propyl-Cy-3- und Methyl-Cy-5-markierten Proteinen, die auf einem einzelnen SDS-Polyacrylamid-Gel laufen gelassen wurden.
  • Spuren 1–3 zeigen Cy-3-markierte Proteine. Die in diesen Spuren aufgebrachten Proben waren:
    • Spur 1. Propyl-Cy-3-markierter IPTG-induzierter Bakterienextrakt.
    • Spur 2. Propyl-Cy-3-markierter IPTG-induzierter Bakterienextrakt und Methyl-Cy-5-markierter nicht-induzierter Extrakt.
    • Spur 3. Propyl-Cy-3-markiertes gereinigtes GAL4VP16-Protein.
  • Spuren 4–6 zeigen Cy-5-markierte Proteine. Die in diesen Spuren aufgebrachten Proben waren:
    • Spur 4. Propyl-Cy-3-markierter IPTG-induzierter Bakterienextrakt.
    • Spur 5. Propyl-Cy-3-markierter IPTG-induzierter Bakterienextrakt und Methyl-Cy-5-markierter nicht-induzierter Extrakt.
    • Spur 6 Propyl-Cy-3-markiertes gereinigtes GAL4VP16-Protein.
  • Nur Spur 5 zeigte Cy-5-Fluoreszenz.
  • Spuren 7 und 8 zeigen das subtrahierte Produkt von Spur 2 – Spur 5 bzw. Spur 3 – Spur 6. Die Pfeile zeigen auf die Position des GAL4VP16, wie durch die Position der Bande des gereinigten GAL4VP16 in Spur 8 bestätigt wird. Die Identität der oberen Banden ist nicht bekannt. Es gibt jedoch verschiedene Proteine, von denen bekannt ist, daß sie durch IPTG induziert werden, einschließlich β-Galactosidase.
  • Spuren 9–11 zeigen Cy-5-markierte Proteine. Die in diesen Spuren aufgebrachten Proben waren:
    • Spur 9. Methyl-Cy-5-markierter IPTG-induzierter Bakterienextrakt.
    • Spur 10. Methyl-Cy-5-markierter IPTG-induzierter Bakterienextrakt und Propyl-Cy-3-markierter nicht-induzierter Extrakt.
    • Spur 11. Methyl-Cy-5-markiertes gereinigtes GAL4VP16-Protein.
  • Spuren 12–15 zeigen Cy-5-markierte Proteine. Die in diesen Spuren aufgebrachten Proben waren:
    • Spur 12. Methyl-Cy-5-markierter IPTG-induzierter Bakterienextrakt.
    • Spur 13. Methyl-Cy-5-markierter IPTG-induzierter Bakterienextrakt und Propyl-Cy-3-markierter nicht-induzierter Extrakt.
    • Spur 14. Methyl-Cy-5-markiertes gereinigtes GAL4VP16-Protein.
  • Nur Spuren 12–15 zeigten eine geringe Cy-3-Fluoreszenz. Das ist auf eine leichte Überlagerung zwischen den Bandpaß-Filtern zurückzuführen. Das führt dazu, daß das Cy-5-markierte Material durch Anregung mit Cy-3-Licht erscheint. Das Gegenteil wird nicht beobachtet. Cy-3-Material wird durch das Cy-5-Anregungslicht nicht sichtbar gemacht. Es gibt zwei Möglichkeiten die Überlagerungseffekte zu eliminieren: bessere Bandpaß-Filter zu entwickeln oder, bei Kenntnis der Überlagerungskonstanten, mit Computerunterstützung den Cy-5-Beitrag zur Cy-3-Abbildung zu entfernen.
  • Spuren 15 und 16 zeigen das subtrahierte Produkt von Spur 10 – Spur 13 bzw. Spur 11 – Spur 14. Die Pfeile zeigen auf die Position des GAL4VP16, wie durch die Position der Bande des gereinigten GAL4VP16 in Spur 16 bestätigt wird. Die Identität der oberen Banden ist nicht bekannt. Es gibt jedoch verschiedene Proteine, von denen bekannt ist, daß sie durch IPTG induziert werden, einschließlich β-Galactosidase.
  • 2. Zweidimensionale Differenz-Gelelektrophorese einer induzierten GAL4VP16-Expression in Bakterien:
  • 3 zeigt Abbildungen eines Abschnitts eines zweidimensionalen Gels, auf das Propyl-Cy-3-markierter IPTG-induzierter Bakterienextrakt und Methyl-Cy-5-markierter nicht-induzierter Extrakt aufgetragen wurden.
    • Feld A. Abbildungen, die mit Cy-3-Anregungslicht aufgenommen wurden und die IPTG-induzierten Proteine zeigen.
    • Feld B. Abbildungen, die mit Cy-5-Anregungslicht aufgenommen wurden und die nicht-induzierten Proteine zeigen.
    • Feld C. Verhältnis der Cy-3-Abbildung dividiert durch die Cy-5-Abbildung.
    • Feld D. Überlagerung der Abbildung aus Feld C, rot gefärbt, die auf die Abbildung aus Feld B, blau gefärbt, gelegt wurde.
  • 3. Zweidimensionale Differenz-Gelelektrophorese eines Bakterienextraktes mit exogen zugesetztem Protein:
  • 4 zeigt Abbildungen eines Abschnitts eines zweidimensionalen Gels, auf das Propyl-Cy-3-markierter Bakterienextrakt, dem exogen Carboanhydrase zugesetzt wurde, und Methyl-Cy-5-markierter Extrakt ohne zugesetzte Carboanhydrase gegeben wurden.
    • Feld A. Abbildungen, die mit Cy-3-Anregungslicht aufgenommen wurden und die Bakterienproteine und die Carboanhydrase zeigen.
    • Feld B. Abbildungen, die mit Cy-5-Anregungslicht aufgenommen wurden und nur die Bakterienproteine zeigen.
    • Feld C. Verhältnis der Cy-3-Abbildung dividiert durch die Cy-5-Abbildung.
    • Feld D. Überlagerung der Abbildung aus Feld C, rot gefärbt, die auf die Abbildung aus Feld B, blau gefärbt, gelegt wurde.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren stellt einen einfachen und kostengünstigen Weg zur Verfügung, um die Unterschiede im Proteingehalt verschiedener Zellen oder verschiedener Proben aus anderen Quellen zu analysieren. Das Verfahren beseitigt Probleme, die auftreten können, wenn zwei getrennte Gele eingesetzt werden, die einzeln der Elektrophorese unterzogen werden müssen. Die aneinander angepaßten Farbstoffe, die zur Markierung der verschiedenen Proteine eingesetzt werden, ermöglichen eine gleichzeitige Elektrophorese zweier oder mehrerer verschiedener Proben in einem einzelnen Gel. Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf zwei Proteinproben und ein Paar aus aneinander angepaßten Farbstoffen beschrieben wurde, ist für Fachleute ersichtlich, daß mehr als zwei Proben gleichzeitig getestet werden können, wobei eine entsprechende Anzahl aneinander angepaßter Farbstoffe eingesetzt wird. Sofern die spektralen Eigenschaften der Farbstoffe dahingehend beeinflußt werden können, daß Fluoreszenz bei einer Anzahl verschiedener Wellenlängen auftritt, wodurch visuell unterschiedliche Abbildungen resultieren, und die pH- und ionischen Eigenschaften der Farbstoffe im wesentlichen angeglichen werden können, um Änderungen des Proteins, die durch die kovalente Bindung an den Farbstoff hervorgerufen werden, zu kompensieren, können die unterschiedlichsten Farbstoffe eingesetzt werden.
  • Differenz-Analyse von Glycoproteinen
  • Farbstoff-Synthese
  • Beispiel 7
  • Die Synthese der Cyanin-Farbstoff-Intermediate wurde wie vorausstehend beschrieben durchgeführt. Die Carbonsäuregruppe sowohl des Cy3- als auch des Cy5-Intermediates wurde anschließend, wie nachfolgend detailliert beschrieben, in ein Hydrazid überführt.
  • Figure 00320001
  • Zu einer gerührten Lösung von Cy-3 (50 mg, 8,9 × 10–5 mol), das in einer Stickstoffatmosphäre in wasserfreiem Acetonitril (2 ml) gelöst vorlag, wurden Diisopropylamin (0,03 ml, 9,7 × 10–5 mol) und O-(N-Succinimidyl)-N,N,N',N'-bis(terramethyl)uronium tetrafluoroborat (TSTU) (30 mg, 9,7 × 10–5 mol) gegeben und die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur für 1 Stunde gerührt. Eine Analyse des Materials mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) zeigte, daß kein Ausgangsmaterial mehr vorlag, daher wurde ein zusätzliches Äquivalent Diisopropylamin (0,03 ml, 9,7 × 10–5 mol) zugegeben, gefolgt von tert-Butylcarbazat (30 mg, 1,78 × 10–4 mol). Die Reaktion wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt, anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, wodurch ein intensiv gefärbtes rosa Öl erhalten wurde. Das Öl wurde mittels Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Siliciumdioxid: Dichlormethan-Methanol-Gradient), wodurch ein rosafarbener Feststoff erhalten wurde (59 mg, 97%). Das Produkt war rein, wie durch 1H-NMR und UV/VIS-Spektrometrie (λmax = 552 nm) gezeigt wurde.
  • Figure 00330001
  • Chloroform (1 ml) wurde zu einem Teil des rosafarbenen Feststoffes (5 mg) gegeben, wodurch eine trübe Lösung entstand, die mit Trifluoressigsäure (4 Tropfen) behandelt wurde. Nachdem 1 Stunde inkubiert wurde, zeigte die TLC, daß das gesamte Produkt verbraucht worden war und sich ein polareres Produkt gebildet hatte, daher wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das resultierende halbfeste Produkt wurde mit Diethylether verrieben und anschließend im Vakuum getrocknet. Das Produkt schien rein zu sein, wie durch 1H-NMR und UV/VIS-Spektrometrie (λmax = 552 nm) gezeigt wurde.
  • Beispiel 8
  • Die Herstellung des Cy5-Hydrazids entspricht der des Cy3-Hydrazids, mit der Ausnahme, daß das Ausgangsmaterial Cy5 ist.
  • Beispiel 9
  • Protein-Markierung
  • 1) Zellkultur
  • Anfängliche Experimente wurden mit HBL100-Kulturen der menschlichen Brust (siehe In Vitro Cell & Dev. Biol., Bd. 26, 933 (1990)) und mit BT474-Kulturen des menschlichen duktalen Brustkarzinoms (J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), Bd. 61, 967 (1978)), Epithelzell-Linien, durchgeführt. HBL100-Zellen wurden in McCoys 5A-Medien, die mit 10% fötalem Kälberserum und 2 mM Glutamin angereichert waren, bei 37°C in einer Luftatmosphäre mit 5% CO2 kultiviert, so daß sie zu einer Monoschicht zusammenwuchsen. BT474-Zellen wurden in RPMI-1460-Medien, die mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 0,02 mg/ml bovinem Insulin, 0,45% Glucose und 1 mM Natriumpyruvat angereichert waren, bei 37°C in einer Luftatmosphäre mit 5% CO2 kultiviert, so daß sie zu einer Monoschicht zusammenwuchsen.
  • 2) Protein-Isolierung aus den Zellen
  • Fläschchen mit Zellmonoschichten wurden zweimal mit PBS gewaschen, um die Medien zu entfernen, und die Zellen wurden durch Inkubieren in Trypsin gewonnen. Die Zellsuspension wurde bei 2000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde verworfen und die Zellpellets wurden mit Tris gewa schen, um überschüssiges Salz zu entfernen. Die Zellpellets wurden bei ~70°C aufbewahrt. Die Proteine wurden aus den Zellen mittels Ultraschall extrahiert. Die Zellpellets (~2 × 106 Zellen/ml) wurden in Lyse-Puffer, der 2 M Harnstoff, 100 mM Acetat-Puffer (pH 5,5), 1% (v/v) NP-40 und 0,1% (w/v) SDS enthielt, resuspendiert und auf Eis viermal jeweils für 20 Sekunden mit Ultraschall behandelt. Die Zell-Lysate wurden bei 4°C und 13.000 Upm in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zelltrümmer und den verbliebenen Überstand zu entfernen. Der Zellüberstand wurde bei –20°C aufbewahrt.
  • 3) Bestimmung der Proteinkonzentration zur Abschätzung des Verhältnisses Farbstoff : Protein
  • Um Löslichkeitsprobleme der markierten Proteine zu vermeiden und den Einsatz einheitlicher Verhältnisse von Farbstoff : Protein zu ermöglichen, wurde die Konzentration der extrahierten Proteine mit dem BioRad-Dc-Protein-Assay (BioRad Laboratories) bestimmt.
  • 4) Markierung der Kohlenhydrate in Glycoproteinen unter Verwendung von Hydrazid-Farbstoffen
  • a) Markierung von Modell-Glycoproteinen für die SDS-PAGE
    • i) Lösungen einzelner Glycoproteine wurden als 10 mg/ml Stammlösungen in Wasser hergestellt. 10 μg eines jeden Proteins wurden zur Markierung verwendet und mit Acetat-Puffer (pH 5,5) auf eine Endkonzentration im Puffer von 100 mM verdünnt.
    • ii) Zucker-Reste wurden durch Zugabe von Natriummetaperiodat in Wasser, wobei eine Endkonzentration von 10 mM erhalten wurde, oxidiert und für 20 Minuten bei Umgebungstemperatur im Dunkeln inkubiert. Überschüssiges Metaperiodat wurde durch Zugabe von Natriummetabisulfit in 200 mM Acetat-Puffer (pH 5,5), wobei eine Endkonzentration von 5 mM erhalten wurde, entfernt und für 5 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert.
    • In einer Konzentration von ~25 nmol/10 μg Protein wurde Cy3-Hydrazid zur ersten Zellprobe und Cy5-Hydrazid zum zweiten Zellextrakt gegeben. Die Farbstoff-Stammlösung lag typischerweise als 10 mM Dimethylformamid-Lösung vor. Die Markierungsreaktion wurde bei Umgebungstemperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Inkubationszeiten können sich im Bereich von etwa 10 bis 60 Minuten bewegen und die Inkubationstemperatur kann in Abhängigkeit vom untersuchten Zelltyp von 0°C bis –25°C variieren. Die Temperatur sollte nicht oberhalb der Temperatur liegen, die zu einem Abbau der Proteine führt, und die Zeitdauer sollte nicht länger als die Zeitdauer sein, die zu einer unspezifischen Markierung führen könnte.
    • iii) Zu den markierten Proben wurde für den Auftrag auf das Gel ein Probenpuffer gegeben, so daß eine Endkonzentration von 2% (w/v) SDS, 10% (v/v) Glycerin, 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5% (v/v) Mercaptoethanol und 0,01% Bromphenol-Blau vorlag. Die Probe wurde für 4 Minuten in ein siedendes Wasserbad getaucht und anschließend der Elektrophorese unterzogen.
  • b) Markierung einfacher Glycoprotein-Mischungen für die SDS-PAGE
  • Einfache Mischungen aus 12 oder 14 verschiedenen Modell-Proteinen, die ~10 μg eines jeden Proteins enthielten, wurden aus 10 mg/ml Protein-Stammlösungen hergestellt, so daß eine Abstufung von Molekulargewichten erhalten wurde. Die Proteinlösung wurde 1 : 1 mit 200 mM Acetat-Puffer (pH 5,5) verdünnt. Die Protein-Mischungen wurden gemäß der oben in Schritt 4a (ii) beschriebenen Vorgehensweise markiert. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE analysiert, nachdem, wie beschrieben, Probenpuffer zugegeben wurde.
  • c) Markierung von Glycoproteinen in Zellextrakten für die zweidimensionale Gelelektrophorese
  • Proteine wurden, wie in Schritt 3 dieses Beispiels beschrieben, aus den Zellen extrahiert und direkt zur Markierung der Kohlenhydratgruppen in den Glycoproteinen eingesetzt. ~150 μg extrahiertes Protein wurde, wie oben in Schritt 4a (ii) beschrieben, markiert. Markierte Proben (~25 – 50 μg) wurden mit 2× IEF Probenpuffer (8 M Harnstoff, 4% (w/v) CHAPS, 2% (v/v) Pharmalytes, 20 mg/ml DTT) gemischt und direkt auf Streifen für die isoelektrische Fokussierung (immobilisierte pH-Gradienten, Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen.
  • 5) Markierung von Lysinresten in Proteinen unter Verwendung von NHS-Farbstoffen
  • Die Proteine wurden an den Lysinresten, wie vorausgehend beschrieben, mit Aminreaktiven NHS-Farbstoffen unter Verwendung von 200 pmol Cy2-NHS-Ester/50 μg Protein in 5 mM Tris-Puffer markiert. Die Proteine aus Zellextrakten wurden, wie vorausgehend beschrieben, direkt mit Cy2 markiert.
  • 6) Gelelektrophorese
    • 1. Zweidimensionale Elektrophorese: Die hochauflösende zweidimensionale Elektrophorese wurde mit allgemein bekannten Techniken gemäß Laemmli [Nature, Bd. 227, 680–685 (1970)] durchgeführt.
    • 2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese: Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde mit bekannten Techniken durchgeführt.
  • 7) Abbildung des Fluoreszenz-Gels
  • Nach Beendigung der Elektrophorese wurden von den Fluoreszenz-markierten Proteinen im Gel unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Scanners mit geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen [Cy2-Anregung 480 / 30, Cy2-Emission 530 / 30; Cy3-Anregung 540 / 25, Cy3-Emission 590 / 35; Cy5-Anregung 620 / 30, Cy5-Emission 680 / 30] Abbildungen erstellt.
  • Beispiel 10
  • Markierung von Modell-Glycoproteinen
  • 5a) bzw. b) zeigen Abbildungen von Cy2-NHS- und Cy3-Hydrazid-markierten Proteinen, die der SDS-PAGE unterzogen wurden.
  • Spuren 1 und 3 zeigen Proteine, die an den Lysinresten mit Cy2-NHS-Ester markiert sind und die durch Cy2-Anregung und -emission sichtbar gemacht wurden.
    • Spur 1. Cy2-markiertes Transferrin (Molekulargewicht ~76 kDa).
    • Spur 3. Cy2-markierter Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen (Molekulargewicht ~20 kDa).
  • Spuren 2 und 4 zeigen die gleichen Proteine, in denen die Kohlenhydratgruppen mit Cy3-Hydrazid markiert sind und die durch Cy3-Anregung und -emission sichtbar gemacht wurden.
    • Spur 2. Cy3-markiertes Transferrin.
    • Spur 4. Cy3-markierter Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen.
  • Spuren 1 und 3 zeigen, daß sowohl das Transferrin als auch der Trypsin-Inhibitor mit dem Cy2-Lysin-Farbstoff markiert sind. Spur 4 zeigt, daß das Transferrin mit Cy3-Hydrazid markiert ist. Der Trypsin-Inhibitor in Spur 4 ist mit Cy3 nicht sichtbar, da dieses Protein nicht glycosyliert ist und daher durch Cy3 nicht markiert wird.
  • Beispiel 11
  • Differenz-SDS-PAGE-Analyse einfacher Proteinmischungen
  • 6a) und b) zeigen Abbildungen von Cy3-Hydrazid-markierten (6a) und Cy5-Hydrazid-markierten (6b) Proteinmischungen, die der SDS-PAGE unterzogen wurden. Proteinmischung B wurde hergestellt, indem 10 mg jedes der folgenden Proteine markiert wurden – Fetuin, Albumin, Carboxypeptidase Y, Ribonuklease B, saures α-1-Glycoprotein, Trypsin-Inhibitor, Lactoglobulin, Cytochrom C, α-Lactalbumin, Lysozym, Myoglobin und Actin. Proteinmischung A enthält die gleichen Proteine wie Mischung B plus Transferrin und Carboanhydrase.
  • Spuren 1 und 3 in 6(a) zeigen die Cy3-markierten Proteinmischungen A und B.
  • Spuren 2 und 4 in 6(b) zeigen die Cy5-markierten Proteinmischungen A und B.
  • Spur 5 zeigt die Cy3-markierte Proteinmischung A und die Cy5-markierte Proteinmischung B.
  • Spur 6 zeigt die Cy5-markierte Proteinmischung A und die Cy3-markierte Mischung B.
  • Spuren 5 und 6, in denen die Proteinmischungen in der gleichen Spur laufen gelassen wurden, zeigen eine unterschiedliche Detektion der beiden zusätzlichen Proteine in Mischung A – in Spur 5 sind sie auf der Cy3-Abbildung sichtbar und in Spur 6 sind sie auf der Cy5-Abbildung sichtbar.
  • Beispiel 12
  • Differenz-2DE-Analyse von Säugerzellextrakten
  • 7(a) und (b) zeigen Abbildungen eines Abschnitts eines 2DE-Gels, auf das Cy3-Hydrazid-markierter HBL100-Zellextrakt (7a) und Cy5-Hydrazid-markierter BT474-Zellextrakt (7b) aufgebracht wurden. Unterschiede im Glycoprotein-Gehalt der Zell-Linien sind aus den unterschiedlichen Spot-Mustern ersichtlich, die mit den zwei Zellextrakten erhalten wurden. Einige der qualitativen und quantitativen Unterschiede wurden mit Pfeilen gekennzeichnet.
  • Beispiel 13
  • Differenz-2DE-Analyse eines Säugerzellextraktes mit exogen zugesetztem Protein
  • Zellextrakte wurden wie oben in den Schritten 1–4 des Beispiels 9 beschrieben hergestellt. Um Unterschiede in komplexen Zell-Lysaten zu simulieren, wurden die Zellextrakte mit Cy3- und Cy5-Hydrazid markiert, und Cy5-markierte bekannte Glycoproteine wurden in die Cy5-markierte Probe gegeben. Die Cy3- und Cy5-markierten Proben wurden dann vor der 2DE in gleichen Volumenteilen gemischt. 8a) und b) zeigen Abbildungen eines 2DE-Gels, auf das Cy3-markierter Zellextrakt (ohne exogen zugesetztes Protein) (8a) und Cy5-markierter Zellextrakt mit exogen zugesetztem Protein (8b) aufgetragen wurden. Die folgenden Proteine wurden zugesetzt:
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Der hervorgehobene Abschnitt des Gels zeigt Proteine, deren Molekulargewicht im Bereich von ~15 – 80 kDa liegt und deren pH im Bereich von 5 – 8 liegt. Dieser Abschnitt schließt somit die Proteine Fetuin, saures α-1-Glycoprotein und Albumin von der Detektion in der Cy5-Abbildung aus.
  • Die Cy3- und Cy5-Abbildungen zeigen eine gute Reproduzierbarkeit hinsichtlich der Spots, die unter Einsatz der zwei Farbstoffe zur Markierung der gleichen Probe aus BT474-Zellen detektiert wurden, und die Unterschiede können den exogen zugesetzten Proteinen zugeschrieben werden. Transferrin und Carboanhydrase sind in der Cy5-Abbildung hervorgehoben, in der Cy3-Abbildung jedoch nicht sichtbar. Das Vorliegen der Carboxypeptidase-Y in der Cy5-Probe konnte nicht klar gezeigt werden, das kann jedoch auf mehrere Ursachen zurückzuführen sein, zum Beispiel auf eine Überlagerung mit den endogenen Zellproteinen, die verhindern, daß sie aufgelöst dargestellt wird, oder auf einen geringen Kohlenhydrat-Gehalt im Protein.
  • Protein-Differenz-Analyse mittels Säulenchromatographie
  • Beispiel 14
  • Protein-Markierung
  • Proteine wurden mit einem Verfahren zur minimalen Markierung markiert, das so ausgestaltet ist, daß jedes Protein mit einer einzigen Markierung versehen wird. Dieses Verfahren führt dazu, daß nur ein kleiner Anteil eines jeden Proteins markiert wird. Proteinkonzentrationen, die im folgenden Text angegeben sind, sind Proteingesamtmengen und berücksichtigen den tatsächlich markierten Proteinanteil nicht.
  • Farbstoffe, die eine einfach positive Nettoladung aufweisen, wurden mit primären Amingruppen des Proteins umgesetzt, um eine Änderung des Gesamtladungszustandes des Proteins zu vermeiden.
  • Die N-Hydroxysuccinimidylester der Cy3- und Cy5-Derivate, deren Molekulargewichte aneinander angepaßt waren (Amersham Pharmacia Biotech) und die eine einfach positive Ladung aufwiesen, wurden in einem Verhältnis von 800 Picomol Farbstoff pro 200 Mikrogramm Protein in einem Gesamtvolumen von 46 μl zu Proteinen oder Peptiden gegeben, die einen Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,6) enthielten. Die Lösung wurde auf Eis im Dunkeln für 30 Minuten inkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 4 μl einer 10 mM Lysinlösung gestoppt und für weitere 10 Minuten auf Eis inkubiert.
  • Die gereinigten Proteine wurden entweder einzeln markiert oder gemischt und anschließend markiert. Anti-Maus-Immunglobulin G (IgG) wurde vom Hersteller (Amersham Pharmacia Biotech) bereits fertig entweder mit Cy3 oder mit Cy5 markiert bezogen.
  • Instrumente
  • Ein FPLC-System (Amersham Pharmacia Biotech), das aus Pumpen, Ventilen und einer Steuerung aufgebaut war, wurde eingesetzt, um Proben durch die Chromatographiesäulen zu pumpen. Das Eluat aus jeder Säule wurde in eine 8 μl Durchflußzelle aus Quarz (Hellma) geleitet, die in einem F4500-Fluorimeter (Hitachi) angeordnet war. Die Optik war jedoch nicht optimiert, da die Duchflußzelle ein vertikales Fenster und der Lichtstrahl eine horizontale Ausrichtung aufwies, wodurch die mögliche Empfindlichkeit dieses bestimmten Systems begrenzt war. Software, die dafür ausgelegt war, 2 Anregungs- und Emissionswellenlängen abzufragen, wurde eingesetzt, um eine kontinuierliche Verfolgung des Vorliegens von Cy3- und C5-markierten Proteinen zu ermöglichen. Zur Detektion von Cy3 wurden die Wellenlängen-Einstellungen 530 nm (Anregung) und 570 nm (Emission) verwendet. Zur Detektion von Cy5 wurden die Einstellungen 630 nm (Anregung) und 670 nm (Emission) verwendet. Die Bandbreiten für die Anregung und Emission betrugen 10 nm.
  • Chromatographie
  • Cy3- und Cy5-markierte Proteine oder Peptide wurden gleichzeitig und kontinuierlich bei der Elution aus den Chromatographiesäulen detektiert. Das Profil der Protein- und Peptidmischungen wurde auf verschiedenen Säuleentypen erstellt. Unterschiede zwischen zwei Proteinproben konnten auch untersucht werden, indem die Proben mit verschiedenen Fluorophoren markiert und anschließend gemischt wurden, gefolgt von einer Chromatographie und gleichzeitigen Detektion der Fluoreszenz der zwei Fluorophore.
  • Beispiel 15
  • Ionenaustauschersäule
  • Eine MonoQ-HR5/5-Anionenaustauschersäule (50 × 5 mm Innendurchmesser) (Amersham Pharmacia Biotech) wurde mit einem Startpuffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,6) äquilibriert. In Startpuffer angesetzte Proteinproben wurden unter Verwendung einer 100 μl Schleife auf die Säule gegeben. Die Proteine wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten des gleichen Puffers, der 350 mM NaCl enthielt, über einen Zeitraum von 25 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute aus der Säule eluiert. Cy3- und Cy5-markierte Proteine wurden gleichzeitig und kontinuierlich während der Elution aus der Ionenaustauschersäule detektiert.
  • 9 zeigt die Trennung von Cy3-markiertem bovinen Serumalbumin (BSA) und Cy5-markiertem Transferrin.
  • 10 zeigt die Trennung der Mischung aus Cy5-markiertem Myoglobin, Transferrin und bovinem Serumalbumin.
  • Die Differenz-Analyse mittels Ionenaustauschchromatographie und Fluoreszenzdetektion ist in 14 gezeigt. Eine Probe, die Cy3-markiertes Transferrin enthielt, wurde mit einer anderen Probe, die Cy5-markiertes Transferrin und Cy5-markiertes bovines Serumalbumin (BSA) enthielt, gemischt. Die Abwesenheit von BSA in der zweiten Probe ist klar ersichtlich.
  • Beispiel 16
  • Umkehrphasensäule
  • Eine ProRPC-Säule (auf Siliciumdioxid basierende C1/C8-Mischung) (100 × 5 mm Innendurchmesser) wurde mit einer Mischung aus Elutionsmittel A (70%) und Elutionsmittel B (30%) äquilibriert. Elutionsmittel A enthielt 0,1 % Trifluoressigsäure und 0,1 % Triethylamin in Wasser/Acetonitril (95%/5%). Elutionsmittel B enthielt 0,1 % Trifluoressigsäure und 0,1% Triethylamin in Wasser/Acetonitril (25%/75%). Proteinproben, die in Elutionsmittel A angesetzt worden waren, wurden unter Verwendung einer 100 μl Schleife auf die Säule gegeben und mit einem linearen Gradienten aus 70% Elutionsmittel A / 30% Elutionsmittel B bis 20% Elutionsmittel A / 80% Elutionsmittel B über einen Zeitraum von 25 Minuten und mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute eluiert. Cy3- und Cy5-markierte Proteine wurden gleichzeitig und kontinuierlich während der Elution aus der Umkehrphasensäule detektiert.
  • 11 zeigt die Umkehrphasen-Trennung der Mischung aus Cy5-markierter Ribonuklease A, Cy5-markiertem Cytochrom C, Holotransferrin und Apomyoglobin.
  • Beispiel 17
  • Größenausschlußsäule
  • Eine Superose-6-HR10/30-Säule (300 × 10 mm Innendurchmesser) (Amersham Pharmacia Biotech) wurde mit 10 mM Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit einem pH von 7,4 äquilibriert. Proteinproben, die im gleichen Puffer angesetzt worden waren, wurden unter Einsatz einer 100 μl Schleife auf die Säule gegeben und mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute eluiert. Cy3- und Cy5-markierte Proteine wurden gleichzeitig und kontinuierlich während der Elution aus der Größenausschlußsäule detektiert.
  • 12 zeigt die Trennung der Mischung aus Cy3-markiertem Thyroglobulin, Apoferritin, IgG und β-Lactoglobulin mittels Größenausschlußchromatographie.
  • 13 zeigt die Differenz-Analyse mittels Größenausschlußchromatographie. Die Cy3-markierte Probe enthält vier Proteine (Thryoglobulin, Apoferritin, IgG und β-Lactoglobulin) und die Cy5-markierte Probe zeigt nur drei der vier Proteine (minus IgG). Die Abwesenheit des vierten Proteins ist klar ersichtlich.
  • Beispiel 18
  • Differenz-Analyse von Proteinen mittels Affinitätsreinigung
  • Kultivierung der Zellen, Lyse und Affinitätsreinigung
  • Lysate von E. coli Bakterien, die GST entweder exprimieren oder nicht exprimieren, wurden als Modelle für komplexe Proteinproben verwendet. Zellen des E. coli Stammes JM109 wurden entweder mit dem Plasmid pGEX-5X, das für GST kodiert, oder mit dem Kontrollplasmid pTrc99, das nicht für GST kodiert, transformiert (Plasmide von Amersham Pharmacia Biotech) und auf Agar-Platten ausplattiert. Flüssige Kultu ren (10 ml) wurden über Nacht bei 37°C in LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert. Frische Medien (typischerweise 150 ml) wurden dann mit 0,5% Starterkultur beimpft und bis zu einem A600-Wert von 1,0 kultiviert. Die Zellen wurden dann durch Zugabe von IPTG, wobei eine Endkonzentration von 0,5 mM erhalten wurde, induziert und für weitere 2 bis 3 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 2800 g gewonnen, in 7,5 ml PBS aufgenommen und auf Eis mittels Ultraschall (MSE 150 Soniprep) lysiert (30 Sekunden, Pause für 90 Sekunden, dreimal wiederholt). Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren bei 2800 g entfernt, und nach der Überführung des Überstandes in ein frisches Röhrchen wurde das Zentrifugieren wiederholt. Der Überstand (100 μl Aliquot bezüglich der durch Messung des A280-Wertes bestimmten Konzentration normiert) wurde dann auf Eis im Dunkeln für 60 Minuten mit 1,5 nmol Cy-Farbstoff markiert und wie oben mit Lysin abgestoppt.
  • Zu diesem Zeitpunkt wurden die Lysate entweder separat behandelt oder sie wurden gemischt, zum Beispiel wurde eine pGEX-Zell-Lysatprobe, die mit Cy3 markiert war, mit dem gleichen Volumen pTrc-Zell-Lysat, das mit Cy5-markiert war, gemischt. Anschließend wurde die GST aus dem Zellextrakt unter Verwendung von Glutathion-Sepharose 4B (Kat.-Nr. 17-0756-01, Amersham Pharmacia Biotech) entsprechend dem Protokoll für das diskontinuierlichen Verfahren, das durch den Hersteller zur Verfügung gestellt wird, oder mittels Fusionsprotein-Screening affinitätsgereinigt.
  • Die Proben wurden in einem Hitachi-Fluorimeter ausgelesen, in dem Cy3 bei 530 nm angeregt wurde (das Emissionssignal wurde bei 565 nm gemessen) und Cy5 bei 630 nm angeregt wurde (das Emissionssignal wurde bei 661 nm gemessen) und die Bandbreite für die Anregung und für die Emission 5 nm betrug. Zur Fluoreszenz-Bestimmung wurde Material, das nicht an die Affinitätsmatrix gebunden wurde, in Waschvorgängen zusammengeführt. Material, das an die Affinitätsmatrix gebunden wurde, wurde unter Verwendung eines Überschusses an nicht-markierter GST eluiert. Vor dem Auslesen wurde ein Aliquot von 15 μl einer jeden Probe auf ein Gesamtvolumen von 100 μl verdünnt. Durch Waschen erhaltene Proben wurden aufgrund ihrer relativ hohen Werte vor dem Auslesen weiterhin zehnfach verdünnt.
  • Nachfolgend wurden die Auslese-Ergebnisse dahingehend korrigiert, daß die relativen Volumen und Verdünnungen der gebundenen und der gewaschenen Fraktionen berücksichtigt wurden.
  • Affinitätsreinigung
  • Die Differenz-Analyse mittels Affinitätsreinigung wurde eingesetzt, um ein spezielles Protein (Glutathion-S-Transferase, GST) in einem Zell-Lysat zu identifizieren. Anfängliche Experimente zeigten, das in Bakterienzell-Lysaten, die entweder mit Cy3 oder mit C5 markiert waren und separat analysiert wurden, das Vorhandensein von GST bestimmt werden konnte. Proben aus induzierten Bakterien, die das pGEX-Plasmid enthielten, das für GST kodiert, enthielten eindeutig GST-Protein, wie durch das fluoreszierende Material gezeigt wird, das mit freiem Glutathion aus der Glutathion-Affinitätsmatrix spezifisch eluiert wurde (Tabelle 1). Durch Abbildung der Fluoreszenz eines SDS-PAGE-Gels, das Cy5-markierte gereinigte CST (Sigma) und die wie oben beschrieben affinitätsgereinigte GST enthielt, wurde bestätigt, daß es sich bei diesem Material um GST handelte. Proben aus induzierten Bakterien, die das pTrc-Plasmid enthielten, das nicht für GST kodiert, jedoch ansonsten sehr ähnlich ist, enthielten anscheinend kein GST-Protein. Diese Schlußfolgerung ergibt sich aus der geringen Menge an fluoreszierendem Material, die aus der Affinitätsmatrix eluiert wurde, und aus der Abwesenheit einer Fluoreszenzbande mit korrektem Molekulargewicht auf dem SDS-PAGE-Gel.
  • Tabelle 1
    Figure 00480001
  • Nachfolgende Experimente zeigten, daß für den Fall, in dem zwei getrennte Lysate mit verschiedenen Farbstoffen markiert und vor der Affinitätsreinigung gemischt werden, Unterschiede im GST-Gehalt der zwei Proben aufgrund ihrer relativen Fluoreszenz bestimmt werden konnten. Zum Beispiel wurden Cy3-markierte induzierte pGEX-Zell-Lysate mit Cy5-markierten induzierten pTrc-Zell-Lysaten gemischt und affinitätsgereinigt. Der Anteil des gebundenen Materials, das in den GST-exprimierenden Zellen enthalten war, war mehr als zehnmal so hoch wie der in Zellen, die GST nicht exprimieren (Tabelle 2). In der nächsten Probe wurde Cy3-markiertes induziertes pGEX-Zell-Lysat mit Cy5-markiertem nicht-induzierten pGEX- Zell-Lysat gemischt und affinitätsgereinigt. Der Anteil des gebundenen Materials, das in den GST-exprimierenden Zellen enthalten war, war erneut mehr als zehnmal so hoch wie der in Zellen, die GST nicht exprimieren (Tabelle 2).
  • Tabelle 2
    Figure 00490001

Claims (29)

  1. Verfahren zum Vergleichen von Proteinzusammensetzungen von mindestens zwei verschiedenen Zellproben, welches umfasst: a) Herstellen eines Proteinextrakts aus jeder der mindestens zwei Zellproben, b) Bereitstellen eines Satzes aus aneinander angepassten Lumineszenzfarbstoffen, die aus Farbstoffen ausgewählt sind, die in der Lage sind, an Proteine in diesem Proteinextrakt kovalent zu binden, wobei jeder Farbstoff in dem Satz 1) eine Nettoladung, welche die Gesamtnettoladung der Proteine nach einer solchen kovalenten Bindung aufrechterhält, und ionische und pH-Eigenschaften besitzt, durch welche die relative Migration eines mit einem der Farbstoffe markierten Proteins dieselbe wie diejenige dieses mit einem anderen Farbstoff aus dem Satz markierten Proteins ist, und 2) Lumineszenzlicht mit einer Wellenlänge emittiert, die sich ausreichend von dem emittierten Lumineszenzlicht der übrigen Farbstoffe aus diesem Satz unterscheidet, um ein nachweisbar anderes Lichtsignal liefern zu können, c) Umsetzen eines jeden Proteinextrakts aus Stufe a) mit einem anderen Farbstoff aus dem Satz von Stufe b), um Farbstoff-markierte Proteine zu ergeben, d) Vermischen der Farbstoff-markierten Proteine, um ein einziges Gemisch aus verschiedenen Farbstoff-markierten Proteinen zu bilden, e) Abtrennen der interessierenden Farbstoff-markierten Proteine durch ein Chromatographieverfahren aus dem Gemisch und f) Detektieren des Unterschieds der Lumineszenzintensität zwischen den verschiedenen interessierenden Farbstoff-markierten Proteinen durch Lumineszenzdetektion.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Farbstoffe an ein primäres Amin eines Lysinrests des Proteins binden und jeder Farbstoff von den Lumineszenzfarbstoffen eine +1-Nettoladung trägt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Satz aus aneinander angepassten Lumineszenzfarbstoffen aus Cyaninfarbstoffen besteht, die folgende Struktur haben:
    Figure 00510001
    wobei die Strichellinien jeweils Kohlenstoffatome bedeuten, die für die Bildung von einem Ring bis drei kondensierten Ringen mit fünf bis sechs Atomen pro Ring erforderlich sind, X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus S, O und CH3-C-CH3 besteht, m eine ganze Zahl von 1 bis 3 und einer der Reste R1 und R2 eine reaktive Gruppe und der andere einen Alkylrest bedeutet.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Farbstoffe jeweils mindestens eine reaktive Gruppe besitzen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Isothiocyanat, Isocyanat, N-Hydroxysuccinimidylester, Imidoester, Glyoxal, Carbonsäure, Halogenacetamid, Maleinsäureimid, Alkylhalogenid, Säurehalogenid, Azid, Hydrazid, Hydrazin, Keton und Amino besteht.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Satz aus aneinander angepassten Lumineszenzfarbstoffen aus neutralen Farbstoffen besteht, die durch eine positiv geladene Linker-Gruppe an die primäre Aminogruppe eines Lysinrests im Protein gebunden werden.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Satz aus aneinander angepassten Lumineszenzfarbstoffen aus neutralen Farbstoffen besteht, die an eine Sulfhydrylgruppe im Protein gebunden werden.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Satz aus aneinander angepassten Lumineszenzfarbstoffen aus Derivaten von Dipyrromethenbordifluoridfarbstoffen besteht.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Chromatographieverfahren Affinitätschromatographie, Größenausschlußchromatographie, Umkehrphasen-chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie oder Ionenaus-tauschchromatographie umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin vor dem Vermischen der Farbstoffmarkierten Proteine das Quenchen der Umsetzung der Proteine mit den Farbstoffen umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Stufe des Nachweises von Unterschieden in der emittierten Farbe mittels Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Stufe des Nachweises von Unterschieden in der emittierten Farbe mittels elektronischer Bildgebung durchgeführt wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Proteine für eine kovalente Bindung an die Farbstoffe Bindungsstellen besitzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Lysin-, Carbonsäure- und Sulfhydrylgruppen besteht.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Proteine Glykoproteine mit endständigen Zuckergruppen umfassen, die Herstellung des Proteinextrakts ferner die Stufe der Oxidation endständiger Zuckergruppen umfasst, um Aldehydgruppen zu bil den, und jeder Farbstoff des Satzes eine reaktive Gruppe besitzt, die in der Lage ist, mit der Aldehydgruppe eine kovalente Bindung einzugehen.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Proteine Phosphoproteine umfassen.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Herstellung des Proteinextrakts außerdem die Verdauung mindestens eines Teils der Proteine mit einem Enzym, um Peptide zu bilden, umfasst.
  16. Verfahren zum Vergleichen interessierender Proteine von mindestens zwei verschiedenen Proben, welches umfasst: a) Herstellen eines Proteingemischs aus jeder der mindestens zwei Proben, b) Bereitstellen eines Satzes aus aneinander angepassten Lumineszenzfarbstoffen, die aus Farbstoffen ausgewählt sind, die in der Lage sind, an die Proteine in diesem Proteingemisch kovalent zu binden, wobei jeder Farbstoff in dem Satz 1) ionische und pH-Eigenschaften besitzt, durch welche die relative Migration eines mit einem der Farbstoffe markierten Proteins dieselbe wie diejenige dieses mit einem anderen Farbstoff aus dem Satz markierten Proteins ist, und 2) Lumineszenzlicht mit einer Wellenlänge emittiert, die sich ausreichend von dem emittierten Lumineszenzlicht der übrigen Farbstoffe in diesem Satz unterscheidet, um ein nachweisbar anderes Lichtsignal liefern zu können, c) Umsetzen eines jeden Proteingemischs aus Stufe a) mit einem anderen Farbstoff aus dem Satz von Stufe b), um Farbstoff-markierte Proteine zu ergeben, d) Vermischen der Farbstoff-markierten Proteine, um ein einziges vereinigtes Gemisch aus verschiedenen Farbstoff-markierten Proteinen zu bilden, e) Abtrennen der interessierenden verschiedenen Farbstoff-markierten Proteine durch ein Chromatographieverfahren aus dem vereinigten Gemisch und f) Detektieren des Unterschieds der Lumineszenzintensität zwischen den verschiedenen interessierenden Farbstoff-markierten Proteinen durch Lumineszenzdetektion.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, worin der Satz aus aneinander angepassten Lumineszenzfarbstoffen aus Cyaninfarbstoffen besteht, die folgende Struktur haben:
    Figure 00540001
    wobei die Strichellinien jeweils Kohlenstoffatome bedeuten, die für die Bildung von einem Ring bis drei kondensierten Ringen mit fünf bis sechs Atomen pro Ring erforderlich sind, X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus S, O und CH3-C-CH3 besteht, m eine ganze Zahl von 1 bis 3 und einer der Reste R1 und R2 eine reaktive Gruppe und der andere einen Alkylrest bedeutet.
  18. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Farbstoffe jeweils mindestens eine reaktive Gruppe besitzen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Isothiocyanat, Isocyanat, N-Hydroxysuccinimidylester, Imidoester, Glyoxal, Carbonsäure, Halogenacetamid, Maleinsäureimid, Alkylhalogenid, Säurehalogenid, Azid, Hydrazid, Hydrazin, Keton und Amino besteht.
  19. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Proteine Bindungsstellen besitzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Lysin-, Carbonsäure- und Sulfhydrylgruppen besteht.
  20. Verfahren nach Anspruch 16, worin das Chromatographieverfahren Affinitätschromatographie, Größenausschlußchromatographie, Umkehrphasenchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie umfasst.
  21. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Proteine Glykoproteine mit endständigen Zuckergruppen sind, die Herstellung des Proteinextrakts ferner die Stufe der Oxidation endständiger Zuckergruppen umfasst, um Aldehydgruppen zu bilden, und jeder Farbstoff des Satzes eine reaktive Gruppe besitzt, die in der Lage ist, mit der Aldehydgruppe eine kovalente Bindung einzugehen.
  22. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Proteine Phosphoproteine sind und der Farbstoff eine Imidazolgruppe enthält, wobei das Verfahren weiterhin die Zugabe von Carboiimid zu dem Gemisch aus Proteinen und Farbstoffen für die Umsetzung von Stufe c) umfasst.
  23. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Herstellung der Proteinprobe außerdem die Verdauung mindestens eines Teils der Proteine mit einem Enzym, um Peptide zu bilden, umfasst.
  24. Verfahren zum Vergleichen interessierender Proteine von mindestens zwei verschiedenen Proben, welches umfasst: a) Herstellen eines Proteingemischs aus jeder der mindestens zwei Proben, b) Bereitstellen eines Satzes aus aneinander angepassten Lumineszenzfarbstoffen, die aus einer einzigen Klasse von Farbstoffen ausgewählt sind, die in der Lage sind, an Proteine in diesem Proteingemisch kovalent zu binden, wobei jeder Farbstoff in dem Satz 1) ionische und pH-Eigenschaften besitzt, durch welche die relative Migration eines mit einem der Farbstoffe markierten Proteins dieselbe wie diejenige dieses mit einem anderen Farbstoff aus dem Satz markierten Proteins ist, und 2) Lumineszenzlicht mit einer Wellenlänge emittiert, die sich ausreichend von dem emittierten Lumineszenzlicht der übrigen Farbstoffe aus diesem Satz unterscheidet, um ein nachweisbar anderes Lichtsignal liefern zu können, c) Umsetzen eines jeden Proteingemischs aus Stufe a) mit einem anderen Farbstoff aus dem Satz von Stufe b), um Farbstoff-markierte Proteine zu ergeben, d) Vermischen der Farbstoff-markierten Proteine, um ein einziges vereinigtes Gemisch aus verschiedenen Farbstoff-markierten Proteinen zu bilden, e) Abtrennen der interessierenden verschiedenen Farbstoff-markierten Proteine durch ein Chromatographieverfahren aus dem vereinigten Gemisch und f) Detektieren des Unterschieds der Lumineszenzintensität zwischen den verschiedenen interessierenden Farbstoff-markierten Proteinen durch Lumineszenzdetektion.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, worin das Chromatographieverfahren Affinitätschromatographie, Größenausschlußchromatographie, Umkehrphasenchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie umfasst.
  26. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Proteine Glykoproteine mit endständigen Zuckergruppen sind, die Herstellung des Proteinextrakts ferner die Stufe der Oxidation endständiger Zuckergruppen umfasst, um Aldehydgruppen zu bil den, und jeder Farbstoff des Satzes eine reaktive Gruppe besitzt, die in der Lage ist, mit der Aldehydgruppe eine kovalente Bindung einzugehen.
  27. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Herstellung der Proteinprobe außerdem die Verdauung der Proteine mit einem Enzym, um Peptide zu bilden, umfasst.
  28. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Proteine Phosphoproteine sind und der Farbstoff eine Imidazolgruppe enthält, wobei das Verfahren darüber hinaus die Zugabe von Carbodiimid zu dem Gemisch aus Proteinen und Farbstoffen für die Umsetzung von Stufe c) umfasst.
  29. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Farbstoffe jeweils mindestens eine reaktive Gruppe besitzen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Isothiocyanat, Isocyanat, N-Hydroxysuccinimidylester, Imidoester, Glyoxal, Carbonsäure, Halogenacetamid, Maleinsäureimid, Alkylhalogenid, Säurehalogenid, Azid, Hydrazid, Hydrazin, Keton und Amino besteht.
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