DE60015980T2

DE60015980T2 - Biosensorsystem mit erhöhter empfindlichkeit mittels molekularer amplifikation des signals

Info

Publication number: DE60015980T2
Application number: DE60015980T
Authority: DE
Inventors: Hans Sigrist
Original assignee: Centre Suisse dElectronique et Microtechnique SA CSEM
Current assignee: Centre Suisse dElectronique et Microtechnique SA CSEM
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 2000-07-10
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2020-07-11
Also published as: FR2796465A1; EP1200630B1; ATE282719T1; WO2001006002A1; EP1200630A1; US6872810B1; FR2796465B1; DE60015980D1

Description

Die vorliegende Erfindung hat ein biochemisches Sensorsystem zum Gegenstand, dessen Empfindlichkeit durch eine molekulare Amplifikation eines Signals, das durch eine Wechselwirkung zwischen einer biochemischen Entität, die in einer biologischen Lösung oder in einem biologischen Fluid vorliegt, und einem auf dem Substrat des Sensors immobilisierten Reagenz, das eine für die biochemische Entität spezifische Affinität besitzt, initialisiert wird, erhöht wird.
Auf dem Gebiet der biologischen Sensoren werden mehr und mehr Systeme erforscht, die ermöglichen, die Nachweis- und Dosierungsgrenzen für biochemische Entitäten in biotischen Fluida noch weiter zurückzudrängen, in der Hoffnung, eine sehr hohe Nachweisempfindlichkeit zu erzielen. Zu diesem Zweck sind die technologischen Weiterentwicklungen nicht nur auf die instrumentelle Ausrüstung, beispielsweise auf die Nachweisgrenzen eines Signals, sondern auch, sobald die Grenzen gerätetechnischer Verbesserungen erreicht waren, auf das eigentliche Design des Sensors gerichtet worden. Aber auch die Verbesserungen der Sensoren haben eine Schwelle erreicht, jenseits der es nicht mehr möglich ist, in Spuren vorliegende Biomoleküle nachzuweisen, wobei die Schwelle in der Größenordnung von Nanomol (nM) oder Pikomol (pM) liegt.
Gleichwohl haben andere Weiterentwicklungen ermöglicht, das Signal eines Sensors, das bisher mittels Verfahren des Standes der Technik nicht erfassbar war, durch eine Amplifikation des Signals, auf dem das Nachweisprinzip beruht, messbar zu machen. Eine solche Amplifikation findet bevorzugt auf dem Gebiet der biologischen Sensoren Anwendung, vorausgesetzt, die Bedingungen, die bei der biologischen Analyse angewendet werden, sind mit den Bioamplifikationssystemen verträglich.
Zurzeit werden zwei Formen der Bioamplifikation in Systemen angewendet, die beispielsweise dafür ausgelegt sind, Immunreaktionen nachzuweisen. Gemäß einer ersten Form der Amplifikation, in den ELISA- (Enzyme Linked Immunosorbent Assays) Tests, wird das nachzuweisende Molekül, beispielsweise ein Antikörper, der mit einer chemischen Entität wie etwa einem immobilisierten Antigen in Wechselwirkung tritt, chemisch an ein Enzym gebunden. Das Enzym dient als Katalysator für die Transformation der nachweisbaren Moleküle. In den üblicherweise benutzten ELISA-Systemen sind die Enzyme, die die Produktion von chemischen Entitäten katalysieren, fast immer Hydrolasen. Die wasserlöslichen Reaktionsprodukte werden vorzugsweise in der Gesamtheit des Reaktions mediums nachgewiesen, indem die Absorption, die Lumineszenz oder die Biolumineszenz gemessen wird.
Bei den Biosensoren wird eine zweite Form der Amplifikation erzielt, indem die Anzahl oder die Masse der nachzuweisenden Spezies erhöht wird. Dieses Amplifikationsprinzip wird beispielsweise verwirklicht, indem massereiche Marker an das nachzuweisende Molekül gebunden werden.
Wenn das Nachweisprinzip auf der Fluoreszenz oder der Absorption beruht, werden fluoreszierende oder absorbierende Moleküle chemisch an die chemische Entität gebunden. Für ein Beispiel für die Amplifikation dieser Form kann auf das Patent US 5,175,270 verwiesen werden, das einen von einer Dendrimer-Architektur auf der Oberfläche des Sensors ausgehenden Amplifikationsmechanismus beschreibt. Das Anlagern modifizierter Moleküle an jedes Zielmolekül oder das Anlagern markierter sekundärer Reaktionsteilnehmer (beispielsweise Kolloide, Nanopartikel oder sekundäre Antikörper, die mit einem Fluorophor markiert sind) wird eine lineare Amplifikation des Signals bewirken. Latexkügelchen, nanokristalline Halbleiterverbindungen oder kolloidales Gold sind massereiche Marker, die üblicherweise in Biosensorsystemen verwendet werden. Bei handelsüblichen Amplifikationssystemen tragen sekundäre Antikörper, die mit fluoreszierenden Molekülen stark markiert sind, dazu bei, das Signal linear zu verstärken.
Die üblichen Systeme amplifizieren die Signale des Sensors im Allgemeinen durch enzymkatalysierte Reaktionen, wobei das Enzym die Anzahl der sekundären chemischen Entitäten der Gesamtheit durch Katalyse erhöht. (katalytische Amplifikation für eine globale Detektion, siehe WO 9 727 317). Andernfalls werden die Signale des Sensors verstärkt, indem entweder, für einen masseempfindlichen Nachweis, Masse hinzugefügt wird, oder indem die Anzahl der markierten Moleküle, die an die Einheit gebunden werden, erhöht wird.
Als Beispiel für eine lineare Amplifikation an der Oberfläche eines Sensors kann die Amplifikation eines Fluoreszenzsignals angeführt werden: In diesem System werden die sekundären Antikörper konjugiert, um den Nachweis der Targets bei einer geringen Menge zu ermöglichen.
Diese beiden Amplifikationsformen, die soeben kurz in Erinnerung gebracht wurden, haben ermöglicht, entweder in einer Lösung oder an einer Oberfläche die Nachweisempfindlichkeit wesentlich zu erhöhen; sie ermöglichen jedoch nicht, ein Signal zu erzielen, das stark genug ist, um sie in der Praxis zufrieden stellend einsetzen zu können.
Die vorliegende Erfindung hat folglich zum Ziel, die Nachweisschwelle eines biochemischen Sensors durch ein Amplifikationsverfahren zu erhöhen, das nicht die Nachteile des Standes der Technik aufweist, wobei es vor allem leicht durchzuführen und kostengünstiger ist.
Dazu hat die Erfindung einen biochemischen Sensor mit molekularer Amplifikation eines Signals für die Erfassung und die Dosierung einer biologischen Entität in einem biotischen Milieu zum Gegenstand, wobei diese biologische Entität Oligonukleotide, Peptide oder Polysaccharide umfassen kann. Das Amplifikationssystem ist dadurch gekennzeichnet, dass dem biotischen Milieu Monomer-Komponenten und katalytische Einheiten zugesetzt werden, die beginnend bei einem Ende eines Einzelstrangs der biologischen Entität ausgehend von den Monomer-Komponenten eine Polymerkette katalysieren können, wodurch sie einen an der Oberfläche des Sensors messbaren physikalischen Parameter lokal erhöhen.
Die katalytischen Einheiten sind Enzyme, die aus allen Klassen der Transferasen, Polymerasen und Synthetasen, die verwendet werden können, gewählt sind, entweder einzeln, d. h. dass nur eine einzige Enzymspezies gewählt wird, oder indem mehrere Enzyme gewählt werden, die in Kombination verwendet werden oder die dem biotischen Milieu nacheinander zugesetzt werden.
Von den bevorzugten katalytischen Einheiten kann eine für die DNA oder die einsträngige RNA spezifische Transferase angeführt werden, die den Oligonukleotidstrang verlängert.
Die Monomer-Komponenten, die dem biotischen Milieu zugesetzt werden, um die Masse lokal durch Polymerisation zu erhöhen, sind vorzugsweise unter den Nukleinsäuren gewählt: NTP oder dNTP; wobei N = A (Adenosin), C (Cytidin), G (Guanosin) oder T (Thymidin) und d = desoxy- ist.
Die Peptidasen, die unter Bedingungen, die die Rückreaktion begünstigen, verwendet werden, ermöglichen die Synthese von eiweißartigen Stoffen. Wenn eine lokale Zunahme an Kohlenhydratmasse durch aufeinander folgendes Zugeben von Enzymen erzielt werden soll, werden vorzugsweise Monosaccharid-Transferasen gewählt.
Wie zuvor angegeben worden ist, beruhen der Nachweis und die Dosierung einer chemischen Entität in einem biotischen Milieu gemäß der Erfindung prinzipiell auf einer Erhöhung eines messbaren Parameters wie etwa der Masse an der Oberfläche des Sensors.
Gemäß einer ersten Form des Nachweises weist die Oberfläche des Sensors eine Gitter- oder Gittergradientenanordnung auf, die ermöglicht, beispielsweise mit optischen Mitteln im Evaneszenzfeld eine Veränderung des Brechungsindex zu erfassen, die aus der Masseänderung an der Sensoroberfläche resultiert, wobei diese Änderung mit der Dosierung der biochemischen Entität korreliert.
Gemäß einer zweiten Form des Nachweises sind die Monomer-Komponenten, die dem biotischen Milieu zugesetzt werden, mit einem Chromophor oder einem Fluorophor markiert, so dass das gebildete Polymer die Markierungsdichte lokal erhöhen und ermöglichen wird, eine Messung der Fluoreszenz durchzuführen, die mit der Dosierung der biochemischen Entität korreliert werden kann.
Diese beiden Nachweisformen sind als Beispiele gegeben, das Sensorsystem gemäß der Erfindung kann jedoch an jeden anderen Biosensortyp, der hinsichtlich einer Erhöhung eines physikalischen Parameters wie etwa der Masse an seiner Oberfläche empfindlich ist, angepasst werden.
Es ist folglich erforderlich, den Einzelstrang der elementaren Entität an der Oberfläche des Sensors so festzuhalten, dass beispielsweise eine Massezunahme durch Polymerisation beginnend von einem ihrer Enden möglich ist. Zu diesem Zweck erfährt das Substrat eine entsprechende Behandlung, wie in der Folge genauer erläutert wird, die ermöglicht, die Erfassungseinheit direkt oder indirekt zu immobilisieren.
Die direkte Immobilisierung der Erfassungseinheit wird durch eine kovalente oder nichtkovalente gegenseitige Beeinflussung mit der nachzuweisenden chemischen Entität bewirkt, wobei die Beeinflussung nur eine Richtung haben kann, wenn sie beispielsweise durch eines der Enden der Nukleotidsequenz erzeugt wird.
Diese Immobilisierung kann auch mit einem photopolymerisierbaren Vernetzungsmittel erzielt werden.
Wenn die Immobilisierung indirekt erfolgt, wird ein Molekülgerüst benutzt, das ermöglicht, eine größere Anzahl von Erfassungseinheiten zu immobilisieren, wobei das Molekülgerüst seinerseits mittels einer Ankopplungseinheit an die Oberfläche des Biosensors gebunden ist. Optimal hat diese Ankopplungseinheit eine große Affinität, um in Wechselwirkung mit den Nachweismolekülen zu gelangen. Solche Wechselwirkungen sind beispielsweise Wechselwirkungen vom Typ (erster Antikörper)-(zweiter Antikörper), wie im Fall der allgemein üblichen Methodenprotokolle der ELISA-Tests, oder Wechselwirkungen vom Typ DNA/DNA, wie im Fall von Biosensorvorrichtungen auf DNA-Basis.
Zur Bildung des Molekülgerüsts können zahlreiche Strukturen benutzt werden; davon seien genannt:

– kleine molekulare Entitäten, die zumindest eine doppelte Funktionalisierung ermöglichen, wie etwa ein hetero-bifunktionales Netzmittel, beispielsweise N-(m-(Trifluormethyl)diazirin-3yl)phenyl)-4-maleimido-butyramid,
– ein mit einem Oligonukleotid oder einem seiner Fragmente modifizierter Antikörper. Der Kohlenwasserstoffteil und der Schlüsselbereich des Antikörpers besitzen funktionelle Gruppen, wie etwa Seitenketten aus Kohlenhydraten und Aminosäuren, die jeweils das Anfügen von Oligonukleotiden erleichtern.
– DNA-Dendrimere geeigneter Größen, die auf Grund ihrer Fähigkeit zu Mehrfachfunktionalisierungen für die spezifischen Oligonukleotide von großem Nutzen sind. Die einsträngigen Verlängerungen der DNA-Dendrimere ermöglichen, mit Hilfe von Oligonukleotiden funktionalisierte Antikörper festzuhalten.
– Metall-Kolloide oder nanokristalline Halbleiterkomponenten, die die wesentlichen Elemente für eine Mehrfachfunktionalisierung bieten.

Die Ankopplungseinheit, die eine selektive Bindung zwischen dem Molekülgerüst und dem Erfassungsmolekül herstellt, ist in einer bevorzugten Ausführungsform von einem Teil eines Moleküls gebildet, der vom gleichen Typ wie die Nachweiseinheit ist, wie etwa ein Antikörper, oder der vom gleichen Typ wie ein Fragment dieser ist. Von den Ankoppeleinheiten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können angeführt werden:

– alle Klassen der Immunglobuline, das Protein A, das Protein G, das verschmolzene Protein A-G,
– Avidin, Neutravidin, Streptavidin und Oligonukleotide, die ein Viertel der einzelnen Orte der Biotinbindung belegen,
– markiertes Polyhistidin,
– markiertes Nitro-L-Tetraacetat,
– jede Art molekularere Wechselwirkung, die zu einer spezifischen, jedoch nicht kovalenten Bindung führt.

In Abhängigkeit von den Eigenschaften des Molekülgerüsts und vor allem dann, wenn es eine Dendrimer-Architektur besitzt, kann die Polymerbindungseinheit ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz sein, die teilweise zu einem der Zweige eines Dendrimers komplementär ist.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung deutlich, die sich auf die beigefügte Zeichnung bezieht, worin:
1A, 1B und 1C schematisch die Schritte zeigen, die zu einer ersten Ausführungsform führen;
2 eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform ist; und
3A und 3B schematisch eine dritte Ausführungsform zeigen.
Es wird nun eine erste Ausführungsform eines einfachsten Sensorsystems gemäß der Erfindung beschrieben, wobei sich auf 1A, 1B und 1C bezogen wird, wo die Schritte, die ermöglichen, ein Signal zu amplifizieren, schematisch dargestellt sind.
Der erste Schritt (1A) zeigt einen Sensor 1, an dessen Oberfläche 2 ein Oligonukleotid 3 mit seinem 3'-Ende immobilisiert ist. Dieses Oligonukleotid 3 wird allgemeiner als "Erfassungsmolekül" 4 bezeichnet. Diese Immobilisierung kann entweder durch eine geeignete Behandlung der Oberfläche des Sensors, um die Herstellung einer kovalenten Bindung mit dem 3'-Ende des Oligonukleotids 3 zu ermöglichen, oder durch ein thermochemisches Verfahren oder auch mittels einer Technik der Photoimmobilisierung mit Hilfe eines photopolymerisierbaren Vernetzungsmittels bewirkt werden, wie in den folgenden Beispielen genauer erläutert wird. Dieses Erfassungsmolekül weist eine spezifische Nukleotidsequenz auf, welche die Immobilisierung eines Einzelstrangs 5 der zu analysierenden biochemischen Entität 6 durch Hybridisieren (1B) ermöglichen wird, wobei dieser Einzelstrang eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu jener des Erfassungsmoleküls 4 komplementär ist. Diese Hybridisierung erfolgt unter Auslassung des 3'-Endes des Einzelstrangs 5. In dem folgenden Schritt (1C) sind monomere Nukleotide 7, im Folgenden mit ihrer üblichen Abkürzung dNTP bezeichnet, und ein Enzym 10, wie etwa eine auf das 3'-Ende wirkende Transferase, hinzugefügt worden. Dieses Enzym 10 wird spezifisch die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen dem 3'-Ende des Einzelstrangs 5 und nacheinander den Nukleotiden, die dem Milieu hinzugefügt worden sind, katalysieren, um eine Polymerkette 9 entstehen zu lassen, die die Gesamtmasse an der Oberfläche erhöhen wird, was in einer messbaren Änderung des Brechungsindex zum Ausdruck kommen wird. In dem Fall, in dem die dem Milieu zugesetzten Nukleotide mit einem Fluoreszenzmarker markiert sind, wird diese Massezunahme in einer Ansammlung von markierten Nukleotiden an der Oberfläche des Sensors und in einer globalen Abnahme der Fluoreszenz des Milieus zum Ausdruck kommen.
In 2, worauf sich nun bezogen wird, ist schematisch ein Sensorsystem gemäß der Erfindung dargestellt, das einer Amplifikationsform entspricht, die insofern komplexer ist, als die Oligonukleotide 3 indirekt, über ein Molekülgerüst 20, das mittels einer Ankopplungseinheit 30 an der Oberfläche des Sensors immobilisiert ist, an die Oberfläche 2 des Sensors 1 gebunden sind. In dem gezeigten Beispiel ist das Molekülgerüst 20 aus einem Kolloid gebildet, das zwei Funktionen erfüllt, um gleichzeitig die mit ihrem 5'-Ende angelagerten Oligonukleotide 3 und ein Antikörperfragment 31, das zu einem an der Oberfläche immobilisierten Antigen 32 komplementär ist, festzuhalten, wobei der Antikörper 31 und das Antigen 32 das Ankoppeln gemeinsam bewerkstelligen. Um die Amplifikation des Signals zu bewirken, wird wie zuvor angegeben vorgegangen, wobei ein Enzym 10 und Nukleotide 7 zugegeben werden.
Die nachstehende Beschreibung gibt im Einzelnen die verschiedenen Schritte an, die ermöglichen, ein biochemisches Sensorsystem gemäß der Erfindung sowie die Modifikationen zu erzielen, die zweckmäßigerweise an der Oberfläche eines optischen Sensors eines Typs, der auf einer Fluoreszenzdetektion oder auf einer refraktometrischen Detektion beruht, vorgenommen werden sollten. Mit geringfügigen Abwandlungen finden die beschriebenen Verfahren auch auf andere Sensorsysteme und auf andere Messwandlermaterialien Anwendung. Eine Modifikation der Oberfläche durch Silanisieren empfiehlt sich bei Oberflächen, die Hydroxy-Gruppen an der Oberfläche aufweisen, oder bei Oberflächen, an denen Hydroxy-Gruppen erzeugt werden können. Zum anderen werden auch Verfahren der Photoimmobilisierung angewendet, um eine Oberfläche zu funktionalisieren, wenn gewünscht ist, eine ansteuerbare Obertlächenfunktionalisierung zu haben und in dem Milieu die unspezifischen Verbindungen der biologischen Entität zu unterdrücken. Grundsätzlich sind die Stoffe, die für den Sensor verwendet werden, Metalloxide, sowohl für die auf der Refraktometrie beruhenden Messungen als auch für jene, die auf der Fluoreszenz beruhen. Die Modifikationen durch ein amplifizierendes Molekülgerüst sind mit Gold-Kolloiden und mehrfach verzweigten Dendrimeren bewerkstelligt worden. In allen nachfolgend beschriebenen Beispielen ist die Amplifikation des Signals mit der auf das 3'-Ende wirkenden Transferase (3'TT) vorgenommen worden, um das Anfügen von Nukleotiden an das freie 3'-Ende zu katalysieren.
1. Funktionalisierung der Oberfläche des Sensors und Immobilisierung der Erfassungseinheit
Silanisieren der Oberfläche eines Metalloxids und Binden eines Oligonokleotids
Ausgehend von den Methodenprotokollen von R.E. Kunz, die in den Publikationen "Sensor and Actuators A (1997) 60, 23" und "Sensors and Actuators 8 (1997) 38–39, 705" beschrieben sind, wurde die Anzahl der Hydroxy-Radikale erhöht, indem die über organische Polymere replizierten optischen Sensoren in einem Plasmagenerator mit einem Sauerstoffplasma behandelt wurden. Die optischen Sensorsysteme auf Glas sind mittels Ultraschall dreißig Minuten (30 min) lang in 65 %-iger Salpetersäure und durch anschließendes Spülen mit doppelt destilliertem Wasser gereinigt worden. Die äußeren Metalloxidflächen sind zwei Tage lang bei 180 °C und 10 mbar mit 3-(glycidyloxy)propoyl-Trimethoxysilan in der Dampfphase silanisiert worden. Schließlich sind auf den auf diese Weise erhaltenen Epoxid-Oberflächen handelsübliche Oligonukleotide mit einer 3'- oder 5'-Amino-Endkette, die zuvor in einem 1:100 verdünnten Natriumphosphat-Puffer gelöst wurden, immobilisiert worden.
Immobilisierung von Oligonukleotiden durch Vermittlung von photopolymerisierbaren Polymeren
Nach einem von N. Gao u. a. beschriebenen Methodenprotokoll (Biotechnol. Appl. Biochem. (1994) 20, 251–263) zur Photoimmobilisierung von Protein ist das Verfahren zur steuerbaren Immobilisierung von Biomolekülen auf die kovalente Bindung von Oligonukleotiden ausgedehnt worden. Auf einmal hat sich herausgestellt, dass das Auftragen in Schichten und Immobilisieren in einem einzigen Schritt auf Nukleotide anwendbar ist. Statt Albumin von aryldiazirin-modifiziertem Rinderserum zu benutzen, ist als neuartige Reaktionskomponente für das photopolymerisierbare Polymer ein aryldiazirin-modifiziertes Dextran verwendet worden. Ein aryldiazirin-modifiziertes Dextran (T-Dextran) ist durch Thiocarbamoylation von Aminodextran mit 3-(Trifluormethyl)-3-3(m-isothiocyanophenyl)diazirin synthetisiert worden. Für die Photoimmobilisierung der Oligonukleotide ist eine Lösung bereitet worden, die 20 Nanomol T-Dextran und 10 Nanomol Oligonukleotide, gelöst in einem Puffermedium mit pH 7,4 (1,5 mM NaCl und 0,05 mM Natriumphosphat), enthielt.
Diese Mischung ist benutzt worden, um mittels Tintenstrahltechnik eine Oberfläche von 10 mm² zu bedrucken, was einer Dichte von 500 fmol/mm² entspricht, d. h. noch 5 nl bei einer Fläche von 3 × 3 mm. Wenn dieses Auftragen erfolgt ist, werden die Proben bei Raumtemperatur und 20 mbar zwei Stunden lang getrocknet, anschließend werden sie dem Licht ausgesetzt, um das Vernetzen des Polymers zu aktivieren. Diese Immobilisierung ist durch eine drei Minuten dauernde Bestrahlung mit einer Orvel-Lichtquelle (11 mW/cm²) mit einem Filter zur Beseitigung der kurzwelligen Strahlung unterhalb von 320 nm bewirkt worden. Die modifizierten Oberflächen sind mit mehreren Pufferlösungen und schließlich fünfmal mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen worden. Durch eine Isotopenmarkierung konnte festgestellt werden, dass 40 % der Oligonukleotide auf dem Sensor immobilisiert waren, was einer Dichte von ungefähr 200 fmol/mm² entspricht.
Oligonukleotid-orientierte Immobilisierung
Um eine oligonukleotid-orientierte Immobilisierung zu erhalten sind Substrate hergestellt worden, die Siliciumnitrid, organische Polymere, Diamant oder auch DLC (Diamond-like Carbon) auf ihrer Oberfläche haben. Die Grundsubstrate, ausgenommen die organischen Polymere, werden nacheinander jeweils 5 min in Hexan und in Ethanol ultraschallgewaschen und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und 6 mbar getrocknet. Anschließend wird mit einer Spritze ein Tropfen alkoholische Lösung mit 0,25 mM des Vernetzungsmittels N-(m-(Trifluormethyl)diazirin-3yl)phenyl)-4-maleimido-butyramid aufgebracht. Ein Tropfen von 10 μl ermöglicht, eine Fläche von 25 mm² zu bedecken. Nach einem zwei Stunden dauernden Trocknen bei Raumtemperatur und 30 mbar wird die Photoimmobilisierung bewirkt, indem die Proben 20 min lang mit einer 350 nm-Stratalinker-Lichtquelle, die eine Strahlung von 0,9 mW/cm² abgibt, bestrahlt werden. Anschließend werden die modifizierten Oberflächen dreimal mit Hexan und Ethanol gewaschen, wobei im Fall eines organischen Polymers, das als Substrat benutzt wird, Methanol als Waschmittel verwendet wird. Um eine kovalente Immobilisierung zu erzielen, werden 10 nmol 5'Thio-Oligonukleotid in 50 μl einer entgasten Pufferlösung mit pH 7,7 (0,2 M HEPES + 1 mM EDTA) gelöst. Diese Lösung wird anschließend durch Pipettieren auf die maleimid-modifizierte Oberfläche aufgebracht und sechzehn Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Schluss wird, wie weiter unten im Text erläutert ist, die oligonukleotid-modifizierte Oberfläche mit der Hybridisierungs-Pufferlösung gespült.
II. Herstellung des Molekülgerüsts
Funktionalisierung von Gold-Kolloiden mit Oligonukleotiden und F(ab')-Antikörperfragmenten
Es wird das Absetzzentrifugieren (10 000 Umdrehungen/min, 30 min lang) der Gold-Kolloide mit einem Durchmesser von 20 nm durchgeführt, dann wird der Überstand entfernt und eine Lösung zugegeben, die 0,7 nmol 5'Thio-Oligonukleotide und 0,3 nmol frisch aufbereitete F(ab')-Fragmente, die in 50 μl einer entgasten Pufferlösung auf pH 7,7 (0,2 M HEPES + 1 mM EDTA) gelöst sind, enthält. Die Lösung wird sechzehn Stunden lang auf Raumtemperatur gehalten, dann werden die modifizierten Kolloide gewaschen, wobei drei Zyklen der Sedimentation und Resuspension in einem Natriumphosphat-Puffer ausgeführt werden.
Molekülgerüst aus drei- und mehrzähniger DNA
Bei einer dreizähnigen DNA-Struktur liegt eine DNA mit zwei 3'OH-Enden und bei der ersten Dendrimer-Generation mit fünf 3'OH-Enden vor.
Die Dendrimer-Architektur dieses Molekülgerüsts ist wie in den Patenten ( US 5 175 270 , US 5 484 904 ; US 5 487 973 ) der Firma Polyprobe angegeben hergestellt worden. Die DNA-Oligonukleotidsequenzen sind im Hinblick auf eine wirksame Bindung des komplementären Strangs ausgewählt worden. Es ist eine Dendrimer-Grundstruktur 41 zusammengefügt worden (3A), bei der die zwei 3'-Enden für die 3'TT-Amplifikation frei gelassen wurden, wobei ein 5'-Ende zu dem auf der Oberfläche immobilisierten Erfassungsmolekül komplementär ist. Diese Molekülzusammenfügung ermöglicht, die Anzahl der Orte der 3'TT-Verlängerungen zu verdoppeln. Die Molekülgerüste der Dendrimere der ersten Generation sind in gleicher Weise aufgebaut. Das Hinzufügen eines vierzähnigen Dendrimers (40) und einer zweiten Stufe zu den dreizähnigen Dendrimeren (41) und zweizähnigen Dendrimeren (42) hat die Anzahl der Orte der 3'TT-Verlängerungen auf fünf erhöht (siehe 3B).
III. Hybridisierung komplementärer DNA-Stränge und Reaktion der Transferase am 3'-Ende
Hybridisierung der DNA-Oligonukleotide mit den auf der Oberfläche immobilisierten Erfassungsmolekülen
Die Hybridisierungsreaktion ist mit den auf der Oberfläche immobilisierten Erfassungsmolekülen, d. h. mit 15 bis 60 Nukleotiden, ausgeführt worden. Nach dem Immobilisieren der DNA-Erfassungsmoleküle sind die Oberflächen dreimal mit einer 5×SSC-Lösung, die 0,1 Gew.-% Natriumdodecylsulfat enthält, gewaschen worden, um die nicht kovalent adsorbierten Oligonukleotide zu entfernen. Anschließend sind DNA-Einzelstränge mit einer einzigen Kette in 250 ml Hybridisierungslösung, die 1 Gew.-% Casein, 0,1 Gew.-% Lauroylsarcosin-Natriumsalz und 0,02 Gew.-% Natriumdodecylsulfat in einer 5×SSC-Pufferlösung enthält, aufgelöst worden.
Die auf diese Weise erhaltene Lösung ist auf die Oberfläche des Sensors aufgebracht und zwei Stunden bei 45 °C inkubiert worden. Nach dem Hybridisierungsschritt sind die Oberflächen zweimal mit 2×SSC, das 0,1 Gew.-% Natriumdodecylsulfat enthält, bei Raumtemperatur und dreimal mit einer auf 50 °C erwärmten 5×SSG-Pufferlösung, die 0,1 Gew.-% Natriumdodecylsulfat enthält, gewaschen worden. Diese Arbeitsschritte des intensiven Waschens unter Zugabe von Detergenzien sind erforderlich, um die nicht hybridisierten Einzelstränge zu entfernen.
Reaktion der auf das 3'-Ende wirkenden Transferase (3'TT-Reaktion)
In dem folgenden Schritt ist gleichzeitig mit den Nukleotiden mit oder ohne Fluoreszenzmarker das 3'TT-Enzym zu den hybridisierten Einzelsträngen gegeben worden. Dieses Enzym katalysiert die Verbindung der Nukleotide mit dem Einzelstrang. Indem es den Einzelsträngen Monomere hinzufügt, erhöht das Enzym den Brechungsindex für die Detektion der Masse oder der Fluoreszenz an der Oberfläche des Biosensors. Zuerst ist die Oberfläche des Sensors zweimal mit 200 μl Cacodylat-Puffer auf pH 7 (0,5 M Cacodylat, 5 mM CoCl₂, 1 mM Dithiothreit) gewaschen worden. Die Reaktion ist durch die Zugabe von zwei Einheiten 3'TT zu einem Inkubationsmilieu, das aus 20 μl Cacodylat-Puffer, 100 μl Desoxynukleotidphosphat (dNTP), 4 μl dCTP (5m M) und 100 μl Wasser zusammengesetzt ist, gestartet worden. Das Gemisch wurde durch Ansaugen mit einer Pipette kurz durchmischt und auf das Substrat aufgebracht.
Die Veränderungen des Brechungsindex an der Oberfläche des Sensors wurden entweder optisch mit einem integrierten optischen Sensor oder durch eine Fluoreszenzdetektion verfolgt. Die Amplifikation des Signals ist durch Bilden der Differenz zwischen dem stärksten Signal, das von einer Oberfläche mit dem immobilisierten Einzelstrang erhalten wurde, und dem Signal, das von einem Referenzsensor stammt, bei dem der Einzelstrang keine Hybridisierung erfahren hat, berechnet worden.
IV. Amplifikation des Signals bei einem genetischen Test
Nachweistest bei Amplifikation des Fluoreszenzsignals
Bei diesem Test sind die DNA-Erfassungsmoleküle an der Oberfläche des Sensors durch Photoimmobilisierung auf der Basis von Dextran immobilisiert und mit Oligonukleotiden, entweder einer synthetischen Kontrollverbindung oder aber einem aus der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) stammenden Oligonukleotid, hybridisiert worden. In dem 3'TT-Reaktionsmedium gibt es "dCTP" und fluoreszierende Nukleotide ChromaTide BODIPY FL-14-dCTP (Molecular Probes, Eugene Oregon, USA). Die Amplifikationsreaktion ist durch Zugabe von zwei Einheiten 3'TT in Gang gebracht und nach fünf Minuten abgestoppt worden, indem die Oberfläche des Sensors mit der Pufferlösung der Reaktion gewaschen wurde. Die Zunahme der Fluoreszenz an der Oberfläche ist verfolgt worden, und die Ergebnisse sind mit der Fluoreszenz nach der Hybridisierung eines fluoreszeinmarkierten Erfassungsmoleküls verglichen worden.
In einer zweiten Versuchsreihe sind die Oligonukleotide am Verbindungszweig der ersten Dendrimer-Generation und gleichzeitig an dem an der Oberfläche gebundenen Erfassungsmolekül hybridisiert worden. Bei dieser Konfiguration findet die 3'TT-Reaktion mit fünf 3'-Enden statt, die an dem Molekülgerüst zur Verfügung stehen.
Es ist der Einbau der fluoreszierenden dCTP-Verbindungen registriert worden. Die Versuchsergebnisse zeigen, dass das Signal im Vergleich zu jenem eines Biosensors, der ohne Dendrimere aufgebaut ist, um einen Faktor von 3,8 erhöht ist.
V. Amplifikation des 3'TT-Signals in immunologischen Tests
Die Bindung eines Antikörpers an ein photoimmobilisiertes Antigen ist unter Verwendung der integrierten optischen Detektion ohne Marker, wie von H. Gao u. a. (Biosensors and Bioelectronics (1995) 10, 317–328) beschrieben, untersucht worden. Der Test wurde mit einem nicht modifizierten Antikörper und, in einer zweiten Versuchsreihe, mit einem mit einem Oligonukleotid funktionalisierten Antikörper durchgeführt. Die Funktionalisierung des Antikörpers ist wie von Ghosh u. a. (Bio-conjugate. Chem. (1990) 1,71–76) angegeben durchgeführt worden. Die Amplifikation des Sekundärsignals durch die 3'TT-Reaktion ist für die beiden Testsysteme gleichzeitig durchgeführt worden. Das Reaktionsmedium enthielt "dCTP" und zwei Einheiten des 3'TT-Enzyms. Die Massezunahme wurde in Abhängigkeit von der Zeit verfolgt, indem die Änderungen des Brechungsindex gemessen wurden. Es hat sich herausgestellt, dass bei der Probe mit dem durch die Oligonukleotide modifizierten Antikörper die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion und das Sättigungsniveau 64-mal höher als bei der Probe ohne Oligonukleotide sind.
Es ist mit einem Molekülgerüst aus bifunktionalisierten Gold-Kolloiden, das an seiner Oberfläche Fragmente von Antikörpern, die für ein Antigen spezifisch sind, und gleichzeitig Oligonukleotide hat, eine Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit für eine biologische Entität um einen Faktor von 150 erreicht worden. Diese Molekülanordnung ist benutzt worden, um das Signal eines immunologischen Biosensors zu amplifizieren. Wie weiter oben beschrieben worden ist, sind kolloidale Goldpartikel (10 nmol} mit Oligonukleotiden und F(ab')-Fragmente in einem Verhältnis von 7:3 modifiziert worden. Anschließend sind diese bifunktionalen Gold-Kolloide gleichzeitig mit zwei Einheiten 3'TT auf die Oberfläche des Biosensors aufgebracht worden, und es ist die Massezunahme in Abhängigkeit von der Zeit registriert worden. Die Antigendeterminante des auf dem Kolloid immobilisierten F(ab')-Fragments orientiert sich in Richtung eines Antikörper-Epitops des ELISA-Tests. Die Amplifikation des masseabhängigen Signals ist in erster Linie mit Hilfe einer selektiven Bindung der substituierten Kolloide erzielt worden. Die durch die 3'TT-Reaktion herbeigeführte Verlängerung der Oligonukleotidkette führt zu einer sehr großen Verstärkung des Signals. Dies führt schließlich bei der Amplifikation zu einer Sättigung, die 150-mal höher als jene einer Probe ohne Kolloide ist.

Claims

Biochemisches Sensorsystem mit molekularer Verstärkung eines Signals für die Erfassung und die Dosierung einer biologischen Entität in einem biotischen Milieu, wobei die biologische Entität durch wenigstens einen elementaren Strang identifizierbar ist, der eine bestimmte Folge von Nukleotiden enthält, wobei der Sensor auf seiner Oberfläche eine direkt oder indirekt unbeweglich gemachte Erfassungseinheit aufweist, die eine Nukleotidfolge besitzt, die zu jener der biologischen Entität komplementär ist, und wobei die Oberfläche des Sensors so beschaffen ist, dass sie an Erfassungs- und Messmittel ein Signal liefert, das eine Zunahme der Masse durch Hybridisierung der biologischen Entität mit der Erfassungseinheit repräsentiert, dadurch gekennzeichnet, dass das biotische Milieu Monomer-Komponenten und katalytische Einheiten enthält, die beginnend bei einem Ende eines elementaren Strangs der biologischen Entität ausgehend von den Monomer-Komponenten eine Polymerkette katalysieren können, wodurch sie die Masse durch eine Verlängerung der Kette lokal erhöhen und dabei eine Verstärkung des an der Oberfläche des Sensors messbaren Signals erzeugen.
Sensorsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das messbare Signal die Absorption einer Lichtwelle oder die Emission eines Fluoreszenzsignals ist.
Sensorsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die katalytischen Einheiten Enzyme sind, die aus Transferasen, Polymerasen und Synthetasen gewählt sind.
Sensorsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme dem biotischen Milieu hinzugefügt werden, indem eine einzige Sorte gewählt wird, mehrere Sorten kombiniert werden oder nacheinander mehrere Sorten hinzugefügt werden.
Sensorsystem nach den Ansprüchen 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Transferase mit ADN-Strang ist, etwa eine Transferase mit 3'-Ende oder eine Polymerase mit ARN-Strang.
Sensorsystem nach den Ansprüchen 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Entität ein Peptid oder ein Protein ist und dass das Enzym eine Peptid-Synthetase ist.
Sensorsystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Entität ein Di- oder Oligo-Saccharid ist und dass die nacheinander hinzugefügten Enzyme eine Mono- oder Oligo-Saccharid-Transferase umfassen.
Sensorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Monomer-Komponenten unter den Nukleotiden und den Oligonukleotiden gewählt sind.
Sensorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Sensors eine Gitter- oder Gittergradienten-Anordnung aufweist, die eine optische Erfassung der Änderung des Brechungsindex, die mit der Massenänderung auf der Oberfläche des Sensors in Verbindung steht, ermöglicht, wobei diese Änderung des Brechungsindex mit der Dosierung der biochemischen Entität korrelierbar ist.
Sensorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Monomer-Komponenten mit einem Chromophor oder mit einem Fluorophor markiert sind, was ermöglicht, eine Messung der Absorption oder der Fluoreszenz auszuführen, die mit der Dosierung der biochemischen Entität korrelierbar ist.
Sensorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Folge von Nukleotiden, die eine Erfassungseinheit bildet, an die Oberfläche des Sensors durch Kovalenzbildung direkt gebunden ist.
Sensorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Erfassungseinheit mit seinem 3'- oder 5'-Ende unidirektional gebunden ist.
Sensorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidfolge, die die Erfassungseinheit bildet, an die Oberfläche des Sensors durch Photo-Immobilisierung gebunden ist.
Sensorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidfolge, die die Erfassungseinheit bildet, an die Oberfläche des Sensors durch ein bifunktionales Molekulargerüst gebunden ist, das seinerseits an die Oberfläche durch eine Brückenbildungseinheit gebunden ist.
Sensorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten, die die Bildung des Molekulargerüsts ermöglichen, gewählt sind aus einer bifunktionalen molekularen Entität wie etwa einem hetero-bifunktionalen Vernetzungsmittel, aus einem Antikörper, der durch ein Nukleotid oder eines seiner Fragmente modifiziert ist, aus ADN-Dendrimeren mit geeigneter Größe und aus Metall-Kolloiden oder aus nanokristallinen Halbleiterkomponenten.
Sensorsystem nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten, die die Bildung der Brückenbildungseinheit ermöglichen, aus den Immunoglobulinen, dem A-Protein, dem G-Protein und dem verschmolzenen A-G-Protein gewählt sind.
Sensorsystem nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten, die die Bildung der Brückenbildungseinheit ermöglichen, gewählt sind aus Avidin, Neutravidin, Streptavidin und den ADN- oder ARN-Oligonukleotiden, die ein Viertel der Orte der Biotinbindung belegen, gewählt sind.
Sensorsystem nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten, die die Bildung der Brückenbildungseinheit ermöglichen, aus markiertem Polyhistidin und aus markiertem Nitroloacetat gewählt sind.
Sensorsystem nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Brückenbildungseinheit durch ein Oligonukleotid gebildet ist, das eine Nukleotidfolge besitzt, die zu einem der Zweige eines Dendrimers teilweise komplementär ist, wenn das Molekulargerüst eine Dendrimer-Architektur hat.