DE60013591T2

DE60013591T2 - Screening nach modulatoren der funktion von immunstimulatorischer dna

Info

Publication number: DE60013591T2
Application number: DE60013591T
Authority: DE
Inventors: O. Berhard NOLL; Christian Schetter; M. Arthur KRIEG
Original assignee: Coley Pharmaceutical GmbH; University of Iowa Research Foundation UIRF
Current assignee: Coley Pharmaceutical GmbH; University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date: 1999-04-29
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2005-02-03
Anticipated expiration: 2020-04-29
Also published as: EP1177439B1; ATE275727T1; DE60013591D1; AU4978100A; WO2000067023A1; EP1177439A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Regulation der Immunantwort. Die Erfindung betrifft auch die Immunstimulation in Antwort auf immunstimulatorische DNA. Insbesondere betrifft die Erfindung Komplexe, die immunstimulatorische DNA-bindende Proteine beinhalten, wobei das immunstimulatorische DNA bindende Protein ein RNA-bindendes Protein ist.
Hintergrund der Erfindung
Im Gegensatz zu DNA von Vertebraten steuert bakterielle DNA einen Satz von immunstimulatorischen Aktivitäten (dargestellt in Krieg AM (1998) BioDrugs 10: 341–346 und Lipford GB et al (1998) Trends Microbiol 6: 496–500). Es ist früher gezeigt worden, daß die meisten dieser Effekte auf die Anwesenheit von unmethylierten CpG-Dinukleotiden in bestimmten Sequenzmotiven zurückzuführen sind. Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546–549. Bei Vertebraten sind DNA-CpG-Dinukleotide statistisch unterrepräsentiert und normalerweise an Position 5 des Cytosins methyliert. Bird AP (1987) Trends Genet 3: 342–347. Oligodesoxynukleotide (ODNs) mit bestimmten CpG-Motiven imitieren die immunstimulatorische Wirkung bakterieller DNA. Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546–549. Die Modulierung des Immunsystems mit spezifischen immunstimulatorischen ODNs scheint aufregende Möglichkeiten für die Behandlung und Verhinderung von Krebs, Infektionskrankheiten und Allergien zu bieten (dargestellt in Krieg AM (1998) BioDrugs 10: 341–346).
B-Lymphozyten reagieren rasch auf die Anwesenheit von immunstimulatorischen ODNs und beginnen zu proliferieren und Interleukin(IL)-6 und Immunglobulin (IG) zu sekretieren. Klinman DM et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 2879–2883; Yi A-K et al. (1996) J Immunol 156: 558–564; Yi AK et al. (1996) J Immunol 157: 5394–5402. Die durch immunstimulatorische DNA induzierten Zytokine sind besonders beachtenswert wegen der Sekretion der Thl-ähnlichen Zytokine IL-12, IL-18 und Interferon(IFN)-γ. Klinman DM et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 2879–2883; Halpern MD et al. (1996) Cell Immunol 167: 72–78; Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 148: 4072–4076; Roman M et al. (1997) Nat Med 3: 849. Das IL-12 wird überwiegend von monozytischen Zellen wie beispielsweise Makrophagen und dendritischen Zellen erhalten, die auch andere proinflammatorische Zytokine wie beispielsweise Type-1-Interferone, IL-6 und Tumornekrosefaktor(TNF)-α bilden. Darüber hinaus werden diese Zellen induziert, um ihre Oberflächenexpression von Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-Molekülen und von kostimulatorischen Molekülen hochzuregulieren. Auf diese Weise schafft immunstimulatorische DNA eine Th1-ähnlichen Zytokin-Umgebung und fördert die Funktion von antigenpräsentierenden Zellen. Zusammen mit immunstimulatorischer DNA aktiviert das IL-12 natürliche Killerzellen (NK), IFN-γ zu sekretieren und erhöhte lytische Aktivität zu zeigen. Ballas ZK et al. (1996) J Immunol 157: 1840–1845; Cowdery JS et al. (1996) J Immunol 156: 4570–4575. Die IFN-γ-Sekretion fördert die B-Zell-Antwort gegenüber immunstimulatorischer DNA, wobei sowohl die IL-6-Sekretion als auch die IgM-Sekretion eingeschlossen ist. Von Interesse ist, daß, obwohl immunstimulatorische DNA ein extrem starkes Mitogen sein kann, das mehr als 95% der B-Zellen in den Zellzyklus treiben kann, die DNA bei niedrigeren Konzentrationen Signale stark kostimuliert, die durch den B-Zell-Antigenrezeptor (BCR) vermittelt werden. Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546–549. Daher werden T-Zellen, die bestimmte Antigene gebunden haben, durch immunstimulatorische DNA bevorzugt aktiviert. Wie monozytische Zellen regulieren auch B-Zellen ihre Expression von kostimulatorischen Molekülen und Klasse-II-MHC auf Aktivierung mit immunstimulatorischer DNA hoch. Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546–549; Davis HL et al. (1998) J Immunol 160: 870–876.
Der der Antwort gegenüber CpG-Motiven zugrundeliegende molekulare Mechanismus ist bislang nicht gut verstanden. Ein möglicher Wirkungsmechanismus für immunstimulatorische DNA könnte die Bindung an einen Zelloberflächenrezeptor beinhalten, der dann ein stimulatorisches Signal transduziert. In der Tat sind Hinweise veröffentlicht worden, die dieses Modell stützen. Liang H et al. (1996) J Clin Invest 98: 1119–1129. Unsere eigenen Versuche unter Verwendung eines anderen experimentellen Modellsystems haben jedoch zu der entgegengesetzten Schlußfolgerung geführt. Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546–549. Um festzustellen, ob die Aufnahme immunstimulatorischer ODNs in die Zelle für die Zellaktivierung erforderlich ist, kultivierten Liang et al. B-Zellen in Gewebekulturschalen, bei denen immunstimulatorische ODNs an Sepharoseperlen gebunden waren. Liang H et al. (1996) J Clin Invest 98: 1119–1129. Anschließend wurden 48stündige Aufnahmeversuche mit tritiiertem Thymidin durchgeführt, um festzustellen, ob die Zellen immer noch zur Proliferation induziert waren, wie sie es in den Schalen waren, in denen die ODNs gebunden waren. Da eine ähnliche Zellaktivierung immer noch beobachtet wurde, schlossen diese Forscher, daß eine Aufnahme von DNA in die Zelle nicht erforderlich war, da sie annahmen, daß die DNA auf den Perlen während der Inkubation nicht aufgenommen wer den konnte. Andere haben Studien unter Anwendung einer ähnlichen Methodologie durchgeführt, haben aber gefunden, das ODN auf Sepharoseperlen immer noch aufgenommen wurden, und ließen die früheren Schlußfolgerungen zweifelhaft erscheinen. Manzel L und Macfarlane DE (1999) Antisense Nucl Acid Drug Develop 9: 459 464. Darüber hinaus waren ODNs, die an Partikel gebunden oder kovalent an einen festen Teflonträger angeheftet waren, nichtstimulatorisch. Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546–549; Manzel L and Macfarlane DE (1999) Antisense Nucl Acid Drug Develop 9: 459–464. Des weiteren haben wir in ausführlichen Untersuchungen zur Detektion möglicher Zelloberflächenmembranproteine mit Bindungsspezifität für immunstimulatorische ODNs unter Verwendung von sowohl menschlichen als auch murinen B-Zellen und Monozyten, eine durchflußzytometrische Messung der Oberflächenbindung, der Aufnahme und des Austritts von FITC-ODNs durchgeführt. Diese Untersuchungen zeigten keinen Unterschied zwischen den ODNs mit oder ohne ein immunstimulatorisches Motiv, was darauf hindeutet, daß die Spezifität nicht auf Ebene der Zellbindung oder der Aufnahme liegt (Krieg et al., unveröffentlichte Daten). Immunstimulatorische ODNs, die entweder an FITC oder Biotin konjugiert waren, behielten die vollständigen mitogenen Eigenschaften, was auf das Fehlen einer offensichtlichen sterischen Hinderung hindeutete. Wir haben aus unseren Untersuchungen daher geschlossen, daß es keinen CpG-spezifischen Zellmembranrezeptor gibt und daß die Aufnahme immunstimulatorischer ODNs in die Zelle für die Zellaktivierung erforderlich ist. Unsere Befunde befinden sich in Übereinstimmung mit denen von anderen Forschern. (D. Hume, persönliche Mitteilung).
Der Stand der Technik beschreibt keine Proteine, die für einzelsträngige (single-standed, ss) CpG-Motive spezifisch sind, es ist jedoch seit langem anerkannt, daß es DNA-bindende Proteine auf der Zelloberfläche gibt (Lerner RA et al.(1971) Proc Natl Acad Sci USA 68: 1212–1216; Aggarwal SK et al (1975) Proc Natl Acad Sci USA 72: 928–932; Beltinger C et al. (1995) J Clin Invest 95: 1814–23; Yao G-Q et al. (1996) Biochem Pharmacol 51: 431–436; Emlen W et al. (1992) J Immunol 148: 3042–3048; Hefeneider SH et al. (1992) Clin Immunol Immunopath 63:245–251) und das DNA durch Zellen spontan in ein endosomales Kompartiment aufgenommen wird, wo die DNA azidifiziert und abgebaut wird (Tonkinson JL und Stein CA (1994) Nucleic Acids Res 22: 42684275; Krieg AM, Uptake and localization of phosphodiester and chimeric oligodeoxynucleotides in normal and leukemic primary cells. In: Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics. Editor, S.Akhtar. CRC Press, Inc., 1995, S. 177; Bennett RM et al. (1985) J Clin Invest 76: 2182–2190). Nahezu alle Zelltypen scheinen in der Lage zu sein, DNA aufzunehmen. Unter den Zellen des Immunsystems ist die Aufnahme induzierbar und scheint im allgemeinen am höchsten unter von Monozyten abgeleiteten Zellen, Krebszellen und B-Zellen zu sein. Krieg AM, et al. (1991) Antisense Res Dev 1:161–171; Zhao Q et al. (1996) Blood 88: 1788–1795. Da ODNs durch die Zellen in Endosomen aufgenommen werden und anschließend ein Teil der intrazellulären ODNs in den Zellkern gelangt, können die stimulatorischen Wirkungen durch eine Wechselwirkung mit intrazellulären Proteinen oder anderen Molekülen in den Endosomen oder dem Zellkern vermittelt werden.
Ein nichtstimulatorisches ODN verdrängt die B-Zell-Stimulation durch ein immunstimulatorisches ODN selbst bei einem fünffachen molaren Überschuß im allgemeinen nicht, sofern das nichtstimulatorische ODN nicht komplementär zu dem immunstimulatorischen ODN ist. Dies deutet daraufhin, daß der stimulatorische Weg einzelsträngige intrazelluläre CpG-Motive erfordert. Doppelsträngige DNA kann den Weg induzieren, dies scheint jedoch auf die Tatsache zurückzuführen sein, daß ein Großteil der aufgenommenen DNA in ihre Einzelstränge denaturiert wird.
Da unsere Untersuchungen darauf hindeuten, daß einzelsträngige immunstimulatorische ODNs immunstimulatorisch sind, während doppelsträngige dies (sofern nicht denaturiert) nicht sind, werden die Wirkungen wahrscheinlich nicht direkt durch Transkriptionsfaktoren oder andere bekannte Proteine, die an doppelsträngige DNA binden, die unmethylierte CpGs enthalten, vermittelt. Iguchi-Ariga SM und Schaffner W (1989) Genes Dev 3: 612–619; Gaston K and Fried M (1995) Nucleic Acids Res 23: 901–909; Prendergast GC et al. (1991) Cell 65 : 395–407; Klempnauer K-H (1992) Oncogene 8: 111–115; Cox GS et al. (1998) Biochem Biophys Acta 1396: 67–68; Übersicht in Tate PH und Bird AP (1993) Curr Opin Genet Dev 3:226–231. Gleichermaßen erscheint es unwahrscheinlich, daß Proteine, die bekanntermaßen an methylierte immunstimulatorische DNA binden (Lewis JD et al. (1992) Cell 69: 905–914), an Wegen beteiligt sind, die durch immunstimulatorische ssDNA gesteuert werden. Von einigen der verschiedenen intrazellulären sequenzspezifischen ssDNA-bindenden Proteinen, die unter Anwendung von Standardtechniken kloniert und analysiert worden sind, ist gezeigt worden, daß sie die Transkription regulieren (z.B Yee HA et al. (1991) Nucleic Aciuds Res 19: 949–953). Keines wies jedoch irgendeine Spezifität für die Bindung unmethylierter CpG-Motive auf. Brunel F et al. (1991) Nucleic Acids Res 19: 5237–5245; Yee HA et al. (1991) Nucleic Acids Res 19: 949–953; Hollingsworth MA et al. (1994) Nucleic Acids Res 22: 1138–1146; Graumann P und Marahiel MA (1994) FEBS Letts 338: 157–160; Wold MS (1997) Ann Rev Biochem 66: 61–92; Ammerpohl 0 et al. (1997) Gene 200: 75–84; Wang Z-Y et al. (1993) J Biol Chem 268: 10681–10685.
Unabhängig von dem Eintrittsweg der DNA in die Zellen, zeigen T-Zellen und monozytäre Zellen, die immunstimulatorische DNA aufgenommen haben, schnell Zeichen von Aktivierung, einschließlich der Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies, dem Abbau von I-κB und der Translokation von NF-κB zum Zellkern, der Aktivierung der Signalwege von mitogenaktivierter Proteinkinase (MAPK) und der Induktion der Transkription von multiplen Protoonkogen- und Zytokin-mRNAs. Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546–549; Klinman DM et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 2879–2883; Yi AK et al. (1996) J Immunol 157: 4918–4925; Yi A-K et al. (1996) J Immunol 157: 5394–5402; Yi A-K et al.(1998) J Immunol 160: 4755; Yi A-K and Krieg AM (1998) J Immunol 161: 4493–4497; Stacey KJ et al. (1996) J Immunol 157: 2116–2122; Sparwasser T et al. (1997) Eur J Immunol 27: 1671–1679. Die frühesten Aktivierungsereignisse wie beispielsweise Anhäufung reaktiven Sauerstoffs, NF-κB-Aktivierung und MAPK-Aktivierung (die innerhalb weniger Minuten nach Exposition gegenüber immunstimulatorischer DNA auftreten) scheinen alle durch einen spezifischen chloroquinsensitiven Weg vermittelt zu werden, da diese vollständig durch niedrige Konzentrationen von Chloroquin und verwandten Verbindungen blockiert werden, die B-Zell- oder Monozyten-Aktivierung durch andere Aktivatoren wie beispielsweise Endotoxin oder CD40 jedoch nicht inhibiert wird. Yi A-K et al. (1998) J Immunol 160: 4754761; Macfarlane DE und Manzel L (1998) J Immunol 160:1122–1131; Hacker H et al. (1998) EMBO J 17:6230-6240.
Kürzliche Entdeckungen haben auch ergeben, daß bestimmte andere ODNs, unabhängig von den vorher beschriebenen Motiven, ebenfalls immunstimulatorische Wirkungen haben. Diese immunstimulatorischen ODNs enthalten mindestens ein T-reiches oder Poly-T-Motiv. Immunstimulatorische T-reiche Nukleinsäuren und Poly-T-ODNs wurden in der gleichzeitig anhängigen provisorischen US-Patentanmeldung 60/156,113, eingereicht am 25. September 1999, offenbart, deren gesamter Inhalt durch Inbezugnahme hier aufgenommen wird.
Da die Aufnahme in die Zelle offenbar für die Immunaktivierung erforderlich ist, und da sowohl CpG- als auch nichtimmunstimulatorische ODNs in Endosomen aufgenommen und eingeschlossen werden, muß der sequenzspezifische Diskriminierungsschritt, der zur Zellaktivierung durch immunstimulatorische DNA führt, innerhalb der Zelle nach der Endozytose stattfinden. Es besteht ein Bedarf, Proteine innerhalb der Zelle zu identifizieren, die spezifisch an immunstimulatorische ssODNs, insbesondere ss-CpG-ODNs, binden und deren immunstimulatorische Wirkungen vermitteln oder transduzieren.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die Erfindung stellt Screening-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, die an immunstimulatorische DNA bindende Proteine binden und als Inhibitoren, Imitatoren, Agonisten, Antagonisten und zelluläre Ziele immunstimulatorischer DNA agieren. Die immunstimulatorische DNA bindenden Proteine sind RNA-bindende Proteine. Die Erfindung stellt ferner Ver fahren zur Identifizierung zellulärer Ziele von immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen bereit. Die Erfindung sieht auch die Optimierung eines immunstimulatorischen ODNs zur Immunstimulation vor. Die Erfindung stellt ferner einen isolierten Immunstimulatorisches-ODN-immunstimulatorische-DNA-bindendes-Protein-Komplex bereit und ein Kit, das einen solchen Komplex verwendet, um nach zellulären Zielen eines immunstimulatorischen ODNs zu suchen.
Nach einem Aspekt der Erfindung stellt die Erfindung ein Screening-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, die an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein binden und zu einer Gruppe von Funktions-Modifikatoren immunstimulatorischer DNA gehören. Das Verfahren beinhaltet das Inkontaktbringen eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins mit einer Probe, die mindestens einen in Frage kommenden Liganden für ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein enthält, das Feststellen, ob der mindestens eine in Frage kommende Ligand des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins das immunstimulatorische DNA bindende Protein bindet, und das Feststellen, ob der mindestens eine in Frage kommende Ligand des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins, der an das immunstimulatorische DNA bindende Protein bindet, zu einer Gruppe von Funktions-Modifikatoren immunstimulatorischer DNA gehört, bestehend aus: Inhibitoren der Bindung immunstimulatorischer DNA, Agonisten immunstimulatorischer DNA und Imitatoren immunstimulatorischer DNA.
In bestimmten Ausführungsformen dieses ersten Aspekts der Erfindung bindet das immunstimulatorische DNA bindende Proteinen spezifisch an CpG-ODNs, d. h., es ist ein CpG-ODN-bindendes Protein. In bestimmten anderen Ausführungsformen dieses ersten Aspekts der Erfindung bindet das immunstimulatorische DNA bindende Protein spezifisch an T-reiche ODNs, d. h., es ist ein T-reiche ODNs bindendes Protein. In bestimmten anderen Ausführungsformen dieses ersten Aspekts der Erfindung bindet das immunstimulatorische DNA bindende Protein spezifisch an Poly-T-ODNs, d. h., es ist ein Poly-T-ODN-bindendes Protein.
Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung stellt die Erfindung ein Screening-Verfahren zur Identifizierung eines Bindungskompetitors zu immunstimulatorischer DNA bereit. Das Screening-Verfahren beinhaltet das Inkontaktbringen eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins mit einer Probe, die mindestens eine in Frage kommende Immunstimulatorische-DNA-Kompetitor-Verbindung und ein immunstimulatorisches ODN enthält, und das Feststellen einer ersten Menge von in Gegenwart der Probe an das immunstimulatorische DNA bindende Protein gebundenem immunstimulatorischen Referenz-ODN im Vergleich zu einer zweiten Menge von in Abwesenheit einer Kompetitor-Verbindung zu der immunstimulatorischen DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein gebundenem immunstimulatorischen Referenz-ODN, wobei die Probe mindestens eine in Frage kommende Immunstimulatorische-DNA-Kompetitor-Verbindung beinhaltet, wenn die erste Menge geringer ist als die zweite Menge. In bestimmten Ausführungsformen umfaßt das Verfahren ferner das Inkontaktbringen der Immunstimulatorische-DNA-Kompetitor-Verbindung mit einer Immunzelle in Gegenwart eines immunstimulatorischen ODNs, um festzustellen, ob die Immunstimulatorische-DNA-Kompetitor-Verbindung ein Inhibitor immunstimulatorischer DNA ist.
Nach einem dritten Aspekt der Erfindung sieht die Erfindung die Optimierung eines immunstimulatorischen ODNs für die Immunstimulation vor. Dieser Aspekt beinhaltet das Bereitstellen eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins, eines an das immunstimulatorische DNA bindende Protein bindenden immunstimulatorischen Referenz-ODNs und mindestens eines in Frage kommenden optimierten immunstimulatorischen ODNs, das sich von dem immunstimulatorischen Referenz-ODN durch mindestens ein Nukleotid oder mindestens eine Internukleotidverbindung unterscheidet, das Inkontaktbringen des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins mit einer Probe, die mindestens ein in Frage kommendes optimiertes immunstimulatorisches ODN und das immunstimulatorische Referenz-ODN enthält, das Feststellen, welches in Frage kommende optimierte immunstimulatorische ODN, sofern vorhanden, an das immunstimulatorische DNA bindende Protein in größerem Umfang als das immunstimulatorische Referenz-ODN bindet, das Neubestimmen eines in Frage kommenden optimierten immunstimulatorischen ODNs, das an das immunstimulatorische DNA bindende Protein in größerem Umfang als das immunstimulatorische Referenz-ODN bindet, als immunstimulatorische Referenz-DNA, und das Wiederholen der Schritte des Bereitstellens, Inkontaktbringens, Feststellens und Neubestimmens, bis kein in Frage kommendes optimiertes immunstimulatorisches ODN das immunstimulatorische DNA bindende Protein besser als das immunstimulatorische Referenz-ODN, mit dem es verglichen wird, bindet.
In bestimmten Ausführungsformen dieses dritten Aspekts der Erfindung ist die anfängliche immunstimulatorische Referenz-DNA ein CpG-ODN. In bestimmten anderen Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist die anfängliche immunstimulatorische DNA ein T-reiches ODN. In bestimmten anderen Ausfüh rungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist die anfängliche immunstimulatorische Referenz-DNA ein Poly-T-ODN.
Nach einem vierten Aspekt der Erfindung stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung zellulärer Ziele eines immunstimulatorischen ODNs bereit. Das Verfahren beinhaltet das Screening einer Reihe in Frage kommender Zielmoleküle mit einem zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplex, das Auswählen der in Frage kommenden, an den Komplex bindenden, Zielmoleküle, und das Feststellen der Sequenz der gebundenen in Frage kommenden Zielmoleküle zur Identifizierung der zellulären Ziele des immunstimulatorischen ODNs. In bestimmten Ausführungsformen ist das in Frage kommende Zielmolekül mit einem Marker markiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Digoxigenin, Biotin, einem Isotop, einem Fluorophor und einem Enzym.
Nach einem anderen Aspekt stellt die Erfindung einen isolierten Immunstimulatorisches-ODN-immunstimulatorische-DNA-bindendes-Protein-Komplex bereit. In bestimmten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist das immunstimulatorische DNA bindende Protein ein RNA-bindendes Protein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist das immunstimulatorische DNA bindende Protein ein RNA-bindendes Protein, das mindestens ein Motiv aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: RBD, RGG-Domäne, KH-Motiv und ARM (unten beschrieben). In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist das immunstimulatorische DNA bindende Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: hnRNPs, Nukleolin und Lupus-La-Protein. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist das immunstimulatorische DNA bindende Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: hnRNP D, AUF1, hnRNP A1, Nukleolin und Lupus-La-Protein.
Nach noch einem anderen Aspekt der Erfindung stellt die Erfindung ein Kit zur Identifizierung zellulärer Ziele eines immunstimulatorischen ODNs bereit. Dieses Kit beinhaltet ein immunstimulatorisches ODN in einem Behälter, ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein in einem Behälter und Anweisungen zur Herstellung eines Immunstimulatorisches-ODN-immunstimulatorische-DNA-bindendes-Protein-Komplex und zur Verwendung des Komplexes zum Screening einer Reihe in Frage kommender Zielmoleküle zur Identifizierung zellulärer Ziele eines immunstimulatorischen ODNs.
In bestimmten Ausführungsformen ist das immunstimulatorische DNA bindende Protein ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Nukleolin, Lupus-La-Protein, hnRNP D, AUF1, hnRNP A1, hnRNP U sowie Isoformen, Fragmenten, Varianten und Äquivalenten davon. Die Erfindung betrifft Komplexe von Bindungsproteinen, insbesondere solchen, die Nukleolin, Lupus-La-Protein, hnRNP D, AUF1, hnRNP A1, hnRNP U oder Isoformen, Fragmente, Varianten oder Äquivalente davon enthalten. In bestimmten Ausführungsformen ist das immunstimulatorische DNA bindende Protein an ein Substrat angeheftet, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: einer Kunststoff-Multiwellplatte, einer Perle, einem Harz, einem Filter, einem Glas-Objektträger, einem Kunststoff-Objektträger, einem BIAcore-Chip und einem Silizium-Chip. In bestimmten Ausführungsformen ist das immunstimulatorische DNA bindende Protein mit einem Marker markiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe, be stehend aus: Digoxigenin, Biotin, einem Isotop, einem Fluorophor und einem Enzym.
In bestimmten Ausführungsformen ist das immunstimulatorische ODN ein CpG-ODN. In bestimmten Ausführungsformen des CpG-ODNs ist das CpG-ODN ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: SEQ ID NO: 1 (#2059), SEQ ID NO: 2 (#2080), SEQ ID NO: 3 (#1619), SEQ ID NO: 11 (#5007) und SEQ ID NO: 12 (#5004). In bestimmten anderen Ausführungsformen ist das immunstimulatorische ODN ein Phosphorthioat-ODN. In bestimmten Ausführungsformen ist das Phosphorthioat-ODN ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: SEQ ID NO: 11 (#5007), SEQ ID NO: 16 (#5018), SEQ ID NO: 17 (#5027) und SEQ ID NO: 18 (#5030). In noch einer anderen Ausführungsform ist das immunstimulatorische ODN ein T-reiches ODN. In noch einer anderen Ausführungsformen ist das immunstimulatorische ODN ein Poly-T-ODN. In einer besonderen Ausführungsformen ist das Poly-T-ODN SEQ ID NO: 9 (#5017). In bestimmten Ausführungsformen ist das immunstimulatorische ODN mit einem Marker markiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Digoxigenin, Biotin, einem Isotop, einem Fluorophor, und einem Enzym.
In bestimmten Ausführungsformen werden die Probe und das immunstimulatorische ODN mit dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gleichzeitig in Kontakt gebracht, und in anderen Ausführungsformen werden die Probe und das immunstimulatorische ODN mit dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein nacheinander in Kontakt gebracht.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Menge gebundenen immunstimulatorischen ODNs unter Verwendung einer Methode detektiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: EMSA, ELISA, Oberflächen-Plasmon-Resonanz (BIA), Fluorimetrie, Biolumineszenz, Refraktometrie, Autoradiographie, Autoradiometrie, Polymerasekettenreaktion (PCR) und Szintillationsdetektion.
In bestimmten Ausführungsformen schließt das Screening-Verfahren einen Test der Immunzelle auf die Induktion von Zytokinen, die Bildung von Antikörpern, den Isotyp ausgeschiedener Antikörper, die Expression eines Zelloberflächenmoleküls, die Aktivierung zellulärer Kinasen oder auf Proliferation oder eine Änderung des Redoxpotentials ein.
In bestimmten Ausführungsformen ist die mindestens eine in Frage kommende Verbindung ein isoliertes Molekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Polynukleotiden, Peptidnukleinsäuren, Polypeptiden, Kohlenhydraten, Lipiden, Hormonen, kleinen organischen Molekülen, kleinen anorganischen Molekülen, Varianten eines mindestens eine Substitution einer Phosphodiesterbindung durch eine Bindung vom Phosphorthioat-Typ enthaltenden immunstimulatorischen Referenz-ODNs, Varianten eines mindestens eine Substitution einer Bindung vom Phosphorthioat-Typ durch eine andere Bindung vom Phosphorthioat-Typ enthaltenden immunstimulatorischen Referenz-ODNs, und Varianten eines mindestens eine Substitution eines Nukleotids durch ein anderes Nukleotid enthaltenden immunstimulatorischen Referenz-ODNs. In bestimmten Ausführungsformen ist die in Frage kommende Verbindung Teil einer kombinatorischen Bibliothek von Verbindungen.
In bestimmten Ausführungsformen wird der Ligand des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins mit einer Immunzelle zusammengebracht, um festzustellen, ob die Kompetitor-Verbin dung zur immunstimulatorischen DNA ein Funktions-Imitator immunstimulatorischer DNA ist. In bestimmten Ausführungsformen wird der Schritt des Inkontaktbringens des Liganden des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins mit einer Immunzelle in Gegenwart eines immunstimulatorischen ODNs durchgeführt, um festzustellen, ob der Ligand des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins ein Inhibitor immunstimulatorischer DNA ist.
In bestimmten Ausführungsformen ist das immunstimulatorische ODN an das immunstimulatorische DNA bindende Protein angebunden oder in anderer Weise mit dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein assoziiert.
Diese und andere Gegenstände der Erfindung werden in weiteren Einzelheiten in Zusammenhang mit der ausführlichen Beschreibung der Erfindung beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Ergebnisse eines Elektromobilitätsshift-Tests (EMSA) eines zytosolischen Extrakts unter Verwendung markierten immunstimulatorischen ODNs #2059 (Spur 1) und markierter ODNs #2059 (Spuren 2-4) oder #2060 (Spuren 5-7) als Kompetitor. Die beobachteten Komplexe C0-C5 sind angegeben.
2 zeigt Quervernetzungstests bei zytosolischen Extrakten von NK-Zellen, Ramos-Zellen und HeLa-Zellen mit verschiedenen digoxigeninmarkierten ODNs. MG-Standardmarker sind auf der rechten Seite dargestellt.
3 zeigt EMSA- (Tafel A) und Quervernetzungstests (Tafel B) mit markiertem CpG-ODN #5004 von aus einer Heparin-Affinitätssäule eluierten Fraktionen. MG-Standardmarker sind auf der rechten Seite in Tafel B dargestellt. Die Bindungsproteine BP1–BP5 sind wie angegeben.
4 zeigt EMSA- (Tafel A) und Quervernetzungstests (Tafel B) mit markiertem CpG-ODN #5004 von aus einer UNO-Q-Anionenaustauschsäule eluierten Fraktionen. MG-Standardmarker sind auf der rechten Seite in Tafel B dargestellt.
5 zeigt EMSA- (obere Tafel) und Quervernetzungstests (untere Tafel) mit markiertem CpG-ODN #5004 von A1-Anionenaustauschfranktionen, die weiter auf einer CpG-ODN-beschichteten Sepharose-Säule aufgereinigt wurden. MG-Standardmarker sind auf der rechten Seite in der Quervernetzungstafel dargestellt. Die Anwesenheit von BP2 (Lupus-La-Protein) in dem 500 mM KCl-Eluat ist in der EMSA-Tafel angegeben.
6 zeigt EMSA- (obere Tafel) und Quervernetzungstests (untere Tafel) mit markiertem CpG-ODN #5004 der Anionenaustauschfraktion A3, die weiter auf einer CpG-ODN-beschichteten Sepharose-Säule aufgereinigt wurden. Der MG-Standardmarker ist auf der linken Seite der Quervernetzungstafel dargestellt.
7 zeigt Silberfärbungstests von Proteinfraktionen, die bei der Reinigung in Beispiel 2 erhalten wurden. MG-Standardmarker sind auf der rechten Seite dargestellt.
8 zeigt EMSA- (Tafel A) und Quervernetzungstests (Tafel B) des Kationenaustausch-Laufs, der mit der Heparinsäulenfraktion H3 durchgeführt wurde. Die Bindungsproteine BP1 und BP3 sind wie angegeben. MG-Standardmarker sind auf der rechten Seite dargestellt.
9 zeigt EMSA- (Tafel A) und Quervernetzungstests (Tafel B) mit markiertem CpG-ODN #5004 der Kationenaustauschfraktion C1, die weiter auf CpG-ODN-beschichteter Sepharose-Säule aufgereinigt wurde. Die Bindungsproteine BP3 und BP4 sind wie in der Quervernetzungstafel angegeben. MG-Standardmarker sind auf der rechten Seite in der Quervernetzungstafel dargestellt.
10 zeigt Silberfärbungstests von Proteinfraktionen, die bei der Reinigung in Beispiel 2 erhalten wurden. MG-Standardmarker sind auf der rechten Seite dargestellt.
11 zeigt Kalt-Kompetitions-EMSA mit isoliertem BP1, BP2, BP3 und BP4.
12 zeigt Kalt-Kompetitions-EMSA mit isoliertem BP5.
13 zeigt einen Quervernetzungstest mit isoliertem BP6.
14 zeigt Western-Blot-Tests von Zytosol aus verschiedenen menschlichen Zellinien (linke Tafel) und von den Fraktionen H1–H4 der Heparin-Säule und des gereinigten BP1 (rechte Tafel). Die Spuren in der linken Tafel sind: N, NK-Zellen; J, Jurkat-Zellen; H, HeLa-Zellen; abd R, Ramos-Zellen. Monoklonale Anti-Nukleolin-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology sc- 8031) wurden für die Detektion verwendet. MG-Standardmarker sind auf der rechten Seite in jeder Tafel dargestellt.
15 zeigt ein Kit (11) zur Identifizierung zellulärer Ziele eines immunstimulatorischen ODNs, umfassend ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein (17), ein immunstimulatorisches ODN in einem Behälter (19), Anweisungen (21) und eine schachtelartige Verpackung (15).
Kurze Beschreibung der Sequenzen
SEQ ID NO: 1 ist die Nukleotidsequenz des CpG-Phosphodiester-ODNs #2059.
SEQ ID NO: 2 ist die Nukleotidsequenz des CpG-Phosphodiester-ODNs #2080.
SEQ ID NO: 3 ist die Nukleotidsequenz des CpG-Phosphodiester-ODNs #1619.
SEQ ID NO: 4 ist die Nukleotidsequenz des CpG-Phosphodiester-ODNs #1765, bei dem das CpG-Dinukleotid methyliert ist.
SEQ ID NO: 5 ist die Nukleotidsequenz des Nicht-CpG-Phosphodiester-ODNs #2049.
SEQ ID NO: 6 die Nukleotidsequenz des CpG-Phosphodiester-ODNs #5011, bei dem alle CpG-Dinukleotide methyliert sind.
SEQ ID NO: 7 ist eine Nukleotidsequenz des Nicht-CpG-Phosphodiester-ODNs #5015.
SEQ ID NO: 8 ist die Nukleotidsequenz des Nicht-CpG-Phosphodiester-ODNs #5009, das ein Poly-C-ODN und 5'-digoxigenin-markiert ist.
SEQ ID NO: 9 ist die Nukleotidsequenz des Nicht-CpG-Phosphodiester-ODNs #5017, das ein Poly-T-ODN und 5'-digoxigeninmarkiert ist.
SEQ ID NO: 10 ist die Nukleotidsequenz des CpG-Phosphodiester-ODNs #2059, modifiziert durch Addition einer Aminogruppe an das 5'-Ende.
SEQ ID NO: 11 ist die Nukleotidsequenz des Phosphorthioat-CpG-ODNs #5007, das SEQ ID NO: 1 mit einer Digoxigeninmarkierung am 5'-T entspricht.
SEQ ID NO: 12 ist die Nukleotidsequenz des Phosphodiester-CpG-ODNs #5004, das SEQ ID NO: 1 mit einer Digoxigeninmarkierung am 5'-T entspricht.
SEQ ID NO: 13 ist die Nukleotidsequenz des methylierten Phosphodiester-CpG-ODNs #5012, das SEQ ID NO: 6 mit einer Digoxigeninmarkierung am 5'-T entspricht.
SEQ ID NO: 14 ist die Nukleotidsequenz des Phosphodiester-Nicht-CpG-ODNs #5016, das SEQ ID NO: 7 mit einer Digoxigeninmarkierung am 5'-T entspricht.
SEQ ID NO: 15 ist die Nukleotidsequenz des CpG-Phosphodiester-ODNs #5008 mit einer Digoxigeninmarkierung am 5'-T.
SEQ ID NO: 16 ist die Nukleotidsequenz des Phosphorthioat-CpG-ODNs #5029, das SEQ ID NO: 10 entspricht.
SEQ ID NO: 17 ist die Nukleotidsequenz des Phosphorthioat-Poly-T-ODNs #5018, das SEQ ID NO: 9 entspricht.
SEQ ID NO: 18 ist die Nukleotidsequenz des Phosphorthioat-Poly-C-ODNs #5030, das SEQ ID NO: 8 entspricht.
SEQ ID NO: 19 ist die Nukleotidsequenz des Phosphorthioat-Nicht-CpG-ODNs #5027, das SEQ ID NO: 14 entspricht.
SEQ ID NO: 20 ist die Nukleotidsequenz des Poly-T-ODNs #5021.
SEQ ID NO: 21 ist die Nukleotidsequenz des Poly-C-ODNs #5031.
SEQ ID NO: 22 ist die Nukleotidsequenz des CpG-ODNs #2060.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß bestimmte natürlich vorkommende intrazelluläre Proteine spezifisch an immunstimulatorische ODNs binden. Die Komplexe, die zwischen diesen immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen und immunstimulatorischer DNA gebildet werden, sind die erste beschriebene direkte Verbindung zwischen immunstimulatorischer DNA, die durch Zellen aufgenommen wird, und einem intrazellulären Protein. Es werden Verfahren zur Verwendung dieser Bindungsproteine offenbart, um die Verbindungen, die sie binden, zu charakterisieren und zu studieren. Die Verfahren schließen das Screening und die Optimierung immunstimulatorischer ODNs, die durch immunstimulatorische DNA bindende Proteine gebunden werden, ein. Die offenbarten Verfahren sind auch geeignet zum Screening von in Frage kommenden Verbindungen, die entweder die Bindung immunstimulatorischer DNA und die Immunstimulation durch immunstimulatorische DNA beeinflussen, oder die anstelle von immunstimulatorischer DNA binden können und die eine Immunstimulation durch immunstimulatorische DNA imitieren. Es werden auch Komplexe offenbart, die zwischen immunstimulatorischem ODN und immunstimulatorische DNA bindendem Protein gebildet werden, Verfahren für deren Verwendung sowie Kits, die sämtlich zur Identifizierung intrazellulärer Zielmoleküle von immunstimulatorischer DNA geeignet sind.
A. Immunstimulatorische DNA bindende Proteine. Ein "immunstimulatorische DNA bindendes Protein" wie hier verwendet ist ein Protein, das in der Natur gefunden wird, das immunstimulatorische DNA spezifisch bindet, und das definiert ist als RNA-bindendes Protein. Immunstimulatorische DNA bindende Proteine können, müssen jedoch nicht notwendigerweise, in einer sequenzspezifischen Weise an immunstimulatorische DNA binden.
"Immunstimulatorische DNA" wie hier verwendet ist ein synthetisches oder natürlich vorkommendes Polynukleotid oder Oligonukleotid, das gekennzeichnet ist durch die Fähigkeit, bestimmte Immunzellen zu aktivieren, einschließlich B-Zellen, dendritischen Zellen, Monozyten, natürlichen Killer(NK)-Zellen und T-Zellen. Immunstimulatorische DNA schließt insbesondere CpG-Oligodesoxynukleotide, d. h. CpG-ODNs, ein, die gekennzeichnet sind durch Einschluß von mindestens einem 5'-Cytosin-Guanin-3'(5'-CG-3')-Dinukleotid, bei dem das Cytosin an der 5'-Position nicht methyliert ist, ist aber nicht auf diese beschränkt. Das 5'-CpG-3'-Dinukleotid im CpG-ODN kann, muß aber nicht, Teil eines Palindroms sein, d. h. einer selbstkomplementären Sequenz, die den Watson-Crick-Basenpaarungsregeln folgt. CpG-DNA kann isoliert sein, z. B. aus Invertebraten erhalten, vorzugsweise als DNA aus Bakterien oder anderen Humanpathogenen erhalten sein. Alternativ kann CpG-DNA ein synthetisches immunstimulatorisches ODN sein, das ein 5'-CG-3'-Dinukleotid beinhaltet und mindestens sechs Basen, bevorzugt acht oder mehr Basen, lang ist. CpG-ODNs können mindestens eine Bindung vom Phosphorthioat-Typ enthalten.
"Immunstimulatorische DNA" wie hier verwendet umfaßt auch bestimmte synthetische oder natürlich vorkommende Polynukleotide oder Oligonukleotide, die, trotz Fehlens des oben beschriebenen unmethylierten CpG-Motivs durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet sind, bestimmte Immunzellen, einschließlich B-Zellen, natürliche Killer(NK)-Zellen und dendritische Zellen, zu aktivieren. Eingeschlossen in diese Kategorie immunstimulatorischer DNA sind T-reiche Nukleinsäuren, Poly-T-ODNs, Poly-G-ODNs und methylierte CpG-ODNs. Eine T-reiche Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die mindestens eine Poly-T-Sequenz enthält und/oder eine Nukleotidzusammensetzung von mehr als 25 Prozent T-Nukleotidresten aufweist. Poly-T-ODNs schließen mindestens vier aufeinanderfolgende Thymin(T)-Nukleotide ein. Poly-G-ODNs schließen mindestens vier aufeinanderfolgende Guanin(G)-Nukleotide ein. So wie hier verwendet, schließen sich CpG-ODNs und T-reiche, Poly-T- und Poly-G-ODNs nicht notwendigerweise gegenseitig aus. Zum Beispiel kann ein gegebenes ODN, das mindestens ein CpG-Dinukleotid enthält und mindestens 25 Prozent T-Nukleotid-Gehalt aufweist, sowohl als CpG-ODN als auch als T-reiches ODN angesehen werden.
Ein "immunstimulatorische DNA bindender Proteinkomplex" wie hier verwendet ist ein Komplex aus mindestens zwei Polypeptiden, die spezifisch immunstimulatorische DNA binden, und wird durch mindestens ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein und mindestens eines der folgenden gebildet: ein anderes Molekül desselben immunstimulatorische DNA bindenden Proteins, ein anderes immunstimulatorische DNA bindendes Protein oder ein anderes ssDNA bindendes Protein, das kein immunstimulatorische DNA bindendes Protein ist. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen schließt ein immunstimulatorische DNA bindender Proteinkomplex mindestens ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein und Nukleolin ein.
In seinem weitesten Sinne ist ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein ein RNA-bindendes Protein. Viele bekannte RNA-bindende Proteine sind auch ssDNA-bindende Proteine. Bevorzugte RNA-bindende Proteine sind dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Strukturmotiv aufweisen, ausgewählt aus einer RNA-bindenden Domäne (RBD), einer Arginin-Glycin-Glycin(RGG)-Domäne, einem K-Homologie(KH)-Motiv und einem Arginin-reichen Motiv (ARM). Die RPD ist in der Literatur auch bekannt als das Ribonukleoprotein(RNP)-Motiv, RNA-Erkennungs-Motiv (RRM), RNP-Konsensussequenz (RNP-CS) und Konsensussequenz-RNA-bindende Domäne (CS-RBD). Diese RBD und andere Motive sind bereits früher im Detail beschrieben worden; für eine Übersicht siehe Burd CG und Dreyfuss G (1994) Science 265: 615–6621. Wie aus einer in Tabelle 1 wiedergegeben Liste von RNA-bindenden Proteinen ersichtlich ist, sind bestimmte Motive in mehreren Kopien und/oder in Kombination miteinander in verschiedenen mehreren RNA-bindenden Proteinen zugegen. Das ssDNA-bindende Protein Rekombinationsprotein A (RPA) wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ausdrücklich als RNA-bindendes Protein ausgeschlossen.
Tabelle 1. RNA-bindende Proteine
Unter den in der vorliegenden Erfindung identifizierten immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen sind solche, die zu einer Klasse von eukaryotischen Kernproteinen gehören, die als heterogene nukleäre Ribonukleoproteine (hnRNPs) bezeichnet werden, ein funktionell mannigfaltiger Satz von hochkonservierten mRNA- und ssDNA-bindenden Proteinen. Von zumindest einigen dieser Proteine ist bekannt, daß sie sowohl im Cytoplasma als auch im Kern gefunden werden. Strukturell sind hnRNPS gekennzeichnet durch eine oder mehrere RBDs, KH-Motive und/oder RGGs. Dreyfuss G et al. (1993) Annu Rev Biochem 62: 289–321; Burd CG und Dreyfuss G (1994) Science 265:615–621; Dempsey LA et al. (1999) J Biol Chem 274: 1066–1071. Viele der hnRNPs existieren jeweils in mehreren Isoformen, die transkritionelle Spleißvarianten darstellen. Früher war von diesen Proteine bekannt, daß sie bei verschiedenen Aspekten der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression, dem Prä-mRNA-Prozessing und dem intrazellulären RNA-Transport und der intrazellulären RNA-Lokalisation eine Rolle spielen. Zumindest einige hnRNPs sind Ziele für eine Autoimmunantwort, insbesondere Lupus erythematosus. Burd CG and Dreyfuss G (1994) Science 265: 615–621. Bestimmte bei der Erfindung als immunstimulatorische DNA bindende Proteine identifizierte hnRNPs schließen hnRNP D, AUF1 und hnRNP A1 ein.
Eines der als immunstimulatorische DNA bindendes Protein identifizierten hnRNP-Proteine ist hnRNP D, auch bekannt als hnRNP D (GenBank Zugriffs-Nr. 870749, 2815614, 870745). Jede der drei bekannten Isoformen von hnRNP D, die von mRNA abgeleitet sind, die alternatives Spleißen von zwei kodierenden Exons reflektieren, besitzt zwei RBDs und drei RGG-Motive. Kajita Y et al. (1995) J Biol Chem 270: 22167–22175. Die größte Isoform beinhaltet zwei Exons und kodiert ein Polypeptid aus 355 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 38,4 kDa; eine zweite Isoform enthält nur das größere der zwei Exons und kodiert ein Polypeptid mit 336 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 36,2 kDa; und eine dritte Isoform beinhaltet nur das kleinere der zwei Exons und kodiert ein Polypeptid mit 306 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 32,8 kDa. Eine vierte Isoform, die von der Spleiß-Variante abgeleitet ist, der sowohl die größeren als auch die kleineren Exons fehlen, entspricht der Isoform mit 287 Aminosäuren des RNA-bindenden Proteins AUF1. Bhattacharya S et al. (1999) Nucleic Acids Res 27 : 1464–1472. wie die anderen drei Isoformen von hnRNP D besitzt AUF1 zwei RBDs und drei RGG-Motive. Die hnRNP-D-Proteine pendeln zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma und können aus beiden Kompartimenten isoliert werden. Jedes der zwei RBDs kann Nukleinsäure binden, entweder allein oder gleichzeitig an entweder eine einzelne Aminosäure oder an bestimmte Nukleinsäuren. Von isoliertem hnRNP wird berichtet, daß es eine außergewöhnlich sequenzspezifische Bindung an Nicht-CpG-Nukleinsäuren (TTAGGG)₄ und (UUAGGG)₄ zeigt; die Bindung verschwindet durch Substitution jeder der ersten vier Basen der Wiederholungseinheiten. Kajita Y et al. (1995) J Biol Chem 270: 22167–22175. Diese Spezifität entspringt einer Sequenz innerhalb der RBDs, die relativ einzigartig für hnRNP D ist. Kajita Y et al. (1995) J Biol Chem 270: 22167–22175. Während die In-vivo-Funktionen von hnRNP D größtenteils unbekannt sind, ist von hnRNP D bekannt, daß es in vitro an 3'-Spleißstellen bindet, und die Isoform aus 306 Aminosäuren, in einem heterodimeren Komplex mit Nukleolin, der als LR1 bezeichnet wird, ist bei der Bindung an nicht-CpG-sequenzspezifische Duplex-DNA beteiligt. Dempsey LA et al. (1998) J Biol Chem 273: 29224–29229. Darüber hinaus ist der LR1-Komplex ein B-Zell-spezifischer Transkriptionsaktivator und kann auch bei der Immunglobulin-Klassenwechsel-Rekombination der schweren Kette mitwirken. Dempsey LA et al. (1998) J Biol Chem 273: 29224–29229; Williams M und Maizels N (1991) Genes Dev 5: 235361.
Ein zweites in der Erfindung identifiziertes immunstimulatorische DNA bindendes Protein ist hnRNP A1 (SwissProt Zugriffs-Nr. P09651). Wie hnRNP D besitzt hnRNP A1 zwei RBDs und ein RGG-Motiv und pendelt zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma. Pinol Roma S und Dreyfuss G (1992) Nature 355: 730–732. Im Zellkern bindet hnRNP A1 an 3'- und 5'-Intron-Spleißstellen bei Polypyrimidinabschnitten, die von AG flankiert sind. Burd CG und Dreyfuss G (1994) EMBO J 13: 1197–1204. Im Zytoplasma bindet hnRNP A1 an AU-reiche Elemente (wiederholte AUUUA-Sequenzen: AREs), die kennzeichnend sind für 3'-untranslatierte Regionen von vielen Zytokinen und Protoonkogenen. Hamilton BJ et al. (1997) J Biol Chem 45: 28732–28741. Zytoplasmatisches und nukleäres hnRNP A1 zeigen daher verschiedene spezifische RNA-Bindungsprofile und scheinen verschiedene Rollen in Bezug auf die posttranskriptionelle Regulation der Geneexpression zu haben. Zytoplasmatisches hnRNP A1, phosphoryliert an Serinen und Threoninen, kann Transkripte, die durch AREs gekennzeichnet sind, stabilisie ren. Nukleäres hnRNP A1, dephosphoryliert an Serinen und Threoninen, scheint das Prä-mRNA-Spleißen durch seinen antagonistischen Effekt auf den Spleißfaktor 2 (SF2/ASF) zu modulieren. Caceres JF et al. (1994) Science 265: 1706–1710; Hamilton BJ et al. (1997) J Biol Chem 45: 28732–28741.
Ein drittes als immunstimulatorische DNA bindendes Protein identifiziertes Protein ist Lupus-La-Protein, auch bekannt als Sjögren-Syndrom-Typ-B-Antigen oder SS-B (GenBank Zugriffs-Nr. 125985). Lupus-La-Protein ist ein Transkriptionsterminationsfaktor von 48 kDa und 408 Aminosäuren, der ein RBD enthält und an die 3'-Termini von naszierenden RNA-Polymerase-III-Transkripten bindet. Chan EKL et al. (1989) Nucleic Acids Res 17: 2233–2244; Gottlieb E und Steitz JA (1989) EMBO J 8: 851–861. Lupus-La-Protein ist in vivo in einer Unzahl von nukleären und zytoplasmatischen Ribonukleoproteinkomplexen zugegen, wo es als ein RNA-Faltungsprotein oder RNA-Chaperon fungieren kann. Rosenblum JS et al. (1998) J Cell Biol 143: 887-99. Es ist auch ein Calmodulin-bindendes Protein (Castro A et al. (1996) Cell Calcium 20:493–500) und wechselwirkt mit der kleinen Untereinheit von Ribosomen (Peek R et al. (1996) Eur J Biochem 236: 649-55) und Transkriptionsterminationsfaktor (Maraia RJ et al. (1994) Mol Cell Biol 14: 2147–58). Seren aus etwa 10% von Patienten mit systemischem Lupus erythematosus enthalten Anti-SS-B/La-Antikörper, die gegen die RBD gerichtet sind und mit normalem La-Protein reagieren, als ob es fremd wäre. Rischmueller M et al. (1995) Clin Exp Immunol 101: 39–44.
Ein nunmehr viertes in immunstimulatorische DNA bindenden Proteinkomplexen identifiziertes Protein ist Nukleolin. Nukleolin ist ein hochkonserviertes, multifunktionales, Multi domänen-Phosphorprotein, das in besonderer Häufigkeit im Nukleolus vorkommt und mit der Zellproliferation verbunden ist (Übersicht dargestellt in Srivastava M and Pollard HB (1999) FASEB J 13: 1911–1922). Aufgrund seiner stark sauren N-terminalen Domäne weist Nukleolin ein scheinbares MG von 105 kDa auf SDS-PAGE auf, trotz seines auf Grundlage seiner cDNA-Sequenz vorhergesagten MG von 77 kDa. Über seine Rolle bei der ribosomalen DNA-Transkription, prä-ribosomalen Montage und Organisation von nukleolärem Chromatin hinaus fungiert Nukleolin auch als Zelloberflächenrezeptor und Shuttle-Protein zwischen Plasmamembran, Zytoplasma und Zellkern. Kibbey MC et al. (1997) J Neurosci Res 42: 314–322; Nigg FA et al. (1997) Nature 386: 779–787; Lee CH et al. (1998) J Biol Chem 273: 7650–7656; Bates PJ et al. (1999) J Biol Chem 274: 26369–26377. Wie andere RNA-bindende Proteine, einschließlich hnRNP, enthält Nukleolin Motive, die für Proteine kennzeichnend sind, die in der Lage sind, mit RNA und ssDNA zu wechselwirken: vier RBDs und ein RGG. Von Nukleolin ist kürzlich gezeigt worden, daß es spezifische Sequenzen von RNA (UCCCGA) und T-reiche, nicht jedoch A-reiche ssDNA, erkennt. Dickinson LA et al. (1995) Mol Cell Biol 15 : 456–465; Ghisolfi-Nieto L et al. (1996) J Mol Biol 260: 34–54.
Zusammen mit hnRNP D bildet Nukleolin den B-Zell-spezifischen Transkriptionsfaktor LR1. Erhöhte Mengen von intaktem Nukleolin korrelieren mit erhöhter Zellproliferation. Hinweise deuten darauf hin, daß der Phosphorylierungszustand von Nukleolin den Abbau von Nukleolin und somit die Zellproliferation beeinflußt.
Sowohl allein als auch zusammen mit hnRNP D bindet Nukleolin G-Quartette, Strukturen, bei denen vier Guanin-Moleküle in einem planaren Ring verbunden sind und jedes Guanin mit zwei anderen Guanin-Molekülen durch G-G-Hoogsteen-Bindung interagiert. Folgen von G-Quartetten können vier Einzelstränge von G-reicher DNA zu viersträngiger G4-DNA stabilisieren, die ebenfalls durch Nukleolin gebunden wird. Dempsey LA et al. (1999) J Biol Chem 274:1066–1071; Hanakahi LA et al. (1999) J Biol Chem 274: 15908–15912. G-reiche DNA ist besonders charakteristisch für ribosomale DNA, Wechselregionen in der schweren Kette von Immunglobulinen und Telomere. Trotz der berichteten Verbindung zwischen Nukleolin und der Zellproliferation ist die Bindung von G-reicher DNA an Nukleolin mit der Hemmung der Zellproliferation in Verbindung gebracht worden. Bates PJ et al. (1999) J Biol Chem 274: 26369–26377. Erst kürzlich wurde gezeigt, daß Nukleolin G-reiche Phosphodiester-Oligonukleotide bindet, und die Proliferation verschiedener menschlicher Tumorzellinien hemmt. Bates PJ et al. (1999) J Biol Chem 274: 26369–26377.
Die Verfahren, die bei der spezifischen Isolation und Identifikation dieser immunstimulatorische DNA bindenden Proteine eingesetzt werden, sind in den Beispielen unten beschrieben. Kurz gesagt, begann sowohl die Isolation als auch die Identifikation mit der Herstellung von zytosolischen oder nukleären Extrakten von Zellen, die wahrscheinlich interessierende Proteine exprimieren. Hierbei wurde die menschliche B-Zellinie Ramos ausgewählt, da B-Zellen gegenüber CpG-Stimulation empfindlich sind, und, anders als viele B-Zellinien, trägt die Ramos-Zellinie keine Gene des Eppstein-Bar-Virus (EBV). Proteine, die aus dieser Zellinie isoliert wurden, sollten daher frei von EBV-kodiertem Protein sein. Da anfängliche Experimente keine großen Unterschiede zwischen mit oder ohne Detergenz (0,1% NP-40) hergestellten Extrakten ergaben, wurden oh ne Detergenz hergestellte zytosolische Extrakte für die unten beschriebenen Isolierungs- und Identifizierungsverfahren verwendet.
Die Isolierung verlief von der Extraktion bis zu einem Heparin-Affinitätschromatographie-Schritt. Aufgrund seiner stark negativen Ladung imitiert Heparin DNA bei der Bindung an einige Proteine und assoziiert mit einem breiten Bereich von DNA-bindenden Proteinen. Gebundene Proteine wurden von der Heparin-Affinitätssäule durch Anhebung der Ionenstärke des Elutionspuffers eluiert. Die Proteine innerhalb der einzelnen Elutionsfraktionen wurden auf Basis ihrer Ladung mittels Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung entweder einer anionischen UNO-Q-Säule oder einer kationischen UNO-S-Säule weiter aufgetrennt. Nach der Elution von der Ionenaustauschsäule, erneut bei ansteigender Ionenstärke, wurde der Puffer der erhaltenen Proteinfraktionen zu DNA-Bindungspuffer ohne Triton X-100 gewechselt und auf eine 1-ml-Sepharosesäule aufgegeben, die vorher mit immunstimulatorischem Desoxynukleotide konjugiert wurde. Proteine banden an die ODN-konjugierte Säule im Verhältnis zu ihrem Grad an Spezifität und Affinität für das Oligodesoxynukleotid. Nachdem die Säule mit dem unspezifischen Kompetitor Poly(dI-dC)·Poly(dI-dC) und 0,15 KCl gewaschen worden war, um das Ausmaß unspezifischer Bindung zu reduzieren, wurden gebundene Proteine anschließend von der ODN-konjugierten Säule durch Exposition gegenüber hoher Salzkonzentration eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden entsalzt und durch Ultrafiltration konzentriert, und einzelne Proteine wurden durch SDS-PAGE isoliert.
Mindestens sechs immunstimulatorische DNA bindende Proteine, BP1–BP6, wurden nach diesem Schema isoliert.
Die sequenzspezifische Bindung wurde durch Standard-Elektromobilitätsshift-Assays (EMSA) untersucht. Fried M und Crothers DM (1981) Nucl Acids Res 9: 6505–6525. Dieser Test beinhaltet das Mischen einzelner Teilmengen von Zellextrakt jeweils mit einem isotop- oder digoxigeninmarkierten spezifischen Oligonukleotid und das anschließende Trennen gebundener von ungebundenen Oligonukleotiden durch nichtdenaturierende PAGE. Ungebundene Oligonukleotide wanderten schneller durch das Gel als gebundene Oligonukleotide, so daß Spuren, die Protein-Oligonukleotid-Komplexe enthielten, durch die scheinbare Mobilitätsveränderung des Oligonukleotids nach Autoradiographie oder geeigneter Marker-Detektion schnell identifiziert werden konnten. Andere Verfahren des Markierens und Detektierens von Oligonukleotiden können verwendet werden, zum Beispiel photoemissive Chemilumineszenz- oder Fluoreszenztechniken. Unter Verwendung dieses Ansatzes wurden Oligonukleotide, die an ein Protein oder Proteine in einer gegebenen Probe banden, von Oligonukleotiden unterschieden, die nicht banden. Umgekehrt wurde ein Protein oder Proteine, die an ein spezifisches Oligonukleotid banden, von einem oder Proteinen unterschieden, die nicht banden.
Die EMSA-Technik wurde auch verwendet, um thermodynamische physikalische Konstanten von DNA-bindenden Proteinen zu bestimmen, einschließlich der relativen Affinität und der Assoziations- und Dissoziatonskonstante. Siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1999, Kapitel 12.2. Durch Zugabe von unmarkierten von markierten Oligonukleotiden in verschiedenen Konzentrationen zu einer Probe des Komplexes aus Bindungsprotein und markiertem Oligonukleotid konkurrierten die Oligonukleotide um die Bin dung an das Protein. Mit ansteigender Affinität und Konzentration des unmarkierten Oligonukleotids schwächte sich die Ablesung des proteinmarkierten Oligonukleotid-Komplexes ab, weil sich das Verhältnis von markiertem zu unmarkiertem Komplex zu dem unmarkierten Komplex verschob.
Eine Beschränkung von EMSA ist das Fehlen einer Information hinsichtlich der Größe der Proteine, die an der Komplexbildung beteiligt sind. Banden, die durch EMSA unter nichtdenaturierenden Bedingungen visualisiert wurden, entsprechen Komplexen und werden hier als solche bezeichnet. Von solchen Komplexen wird angenommen, daß sie mindestens ein Protein und mindestens ein Nukleotid enthalten. Molekülgrößenbestimmung für einzelne Proteine wurde durch Quervernetzen von in Lösung zwischen Oligonukleotiden und Proteinen gebildeten Komplexen und Analyse mit denaturierender SDS-PAGE vorgenommen. Die Quervernetzung wurde durch Ultraviolett-Bestrahlung leicht erreicht. Das scheinbare Molekulargewicht jedes gegebenen quervernetzten Komplexes wurde bestimmt durch Vergleich der Mobilität von gleichermaßen denaturierten definierten Molekulargewichts-Standards, die auf demselben Gel laufengelassen wurden. Weil das Oligonukleotid mit dem Protein quervernetzt war, reflektierte das scheinbare Molekulargewicht des Komplexes den Anteil des Oligonukleotids. Die Korrektur für diesen Anteil wurde durch die Tatsache kompliziert, daß jede Phosphodiesterbindung der Nukleinsäure eine negative Ladung trägt, was sie schneller wandern läßt als auf Basis des leicht errechenbaren Gewichts allein vorhergesagt. Es ist auch möglich, daß mehr als ein Oligonukleotid an das Protein gebunden ist, so daß selbst ein durch EMSA identifiziertes einzelnes Protein mehr als eine einzelne Bande in einem Quervernetzungstest ergeben kann. Darüber hinaus wird jedes Pro tein, das mit dem Oligonukleotid in einem Multiproteinkomplex assoziiert ist, auch mit dem grundlegende Bindungsprotein quervernetzt, was zu einem scheinbaren Molekulargewicht führt, das die Summe der Gewichte von allen Proteinen repräsentiert, die an dem Komplex beteiligt sind.
Die Identifikation einzelner so erhaltener Proteine wurde erreicht durch Massenspektrometrie (MS). Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI)-MS und Elektrospray-Ionisation (ESI)-MS sind nun Standardmethoden, die zur Identifizierung von Peptiden verwendet werden, die in Femtomol-Mengen verfügbar sind. Mann M und Talbo G (1996) Curr Opin Biotechnol 7: 1119; Mann M und Wilm M (1995) Trends Biochem Sci 20: 219–224; Mann M et al. (1989) Anal Chem 61: 1702–1708. Aus dem Polyacrylamidgel wurden einzelne Banden ausgeschnitten, mit Trypsin gespalten und anschließend eluiert, um Peptidfragmente zu erhalten, die einer MALDI-MS oder ESI-MS-Analyse unterzogen worden. Die Kombination aus Masse/Ladung-Daten aus der MS, Spaltstellenspezifität des Trypsin-Verdaus und Peptidsequenzdaten erlaubte die Identifikation von einzelnen Proteinen und Peptiden. Die MALDI-MS-Analyse ergibt einen Massen-Fingerabdruck der gespalten und analysierten Proteine. Der Fingerabdruck ist nur für die Abfrage einer Datenbank von berechneten Peptidmassen geeignet, die vollständig sequenzierten Proteinen entsprechen. Die ESI-MS-Analyse ist schwieriger, erlaubt jedoch die Identifikation auf der Grundlage eines Vergleichs von entweder vollständigen oder partiellen Sequenzdaten. Die Massengenauigkeiten für die beiden Methoden können 0,01 Prozent übersteigen, d. h. 1 Da pro 10 kDa.
B. Screening-Verfahren, die zur Identifizierung von Verbindungen geeignet sind, die an immunstimulatorische DNA bindende Proteine binden. Die Erfindung stellt Screening-Verfahren bereit, die geeignet sind zur Identifizierung von Verbindungen, die an immunstimulatorische DNA bindende Proteine binden. Insbesondere stellt die Erfindung ein Screening-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, die zur Hemmung der Wechselwirkung zwischen immunstimulatorischer DNA und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein geeignet sind. Die Erfindung stellt ferner insbesondere ein Screening-Verfahren bereit, um Agonisten-Verbindungen zu identifizieren, die für die Immuntherapie geeignet sind.
"Screening" wie hier verwendet bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem eine Probe, die mindestens eine in Frage kommende Verbindung ("Kandidaten"-Verbindung) enthält, nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt wird. Bevorzugt ist das Screening-Verfahren ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren, bei dem viele Kandidaten-Verbindungen in kurzer Zeitdauer behandelt werden. Beispielsweise können viele Tausende Kandidaten-Verbindungen an einem einzigen Tag auf ihre Fähigkeit untersucht werden, an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein zu binden.
"Binden" wie hier verwendet bezieht sich auf eine physikalische Assoziation zwischen Molekülen, die länger andauert und/oder von größerer Stärke oder Affinität ist als man dies im Anschluß an zufällige Kollisionen von Molekülen beobachten würde, die nicht aneinander binden. Zwei Einheiten, die "gebundenen" sind, sind physikalisch miteinander assoziiert, entweder vorübergehend oder für längere Perioden, oder verur sachen eine biochemische oder Konformationsänderung, die detektiert werden kann.
"Isoliert" wie hier mit Bezug auf Oligonukleotide, Polynukleotide und Polypeptide verwendet bedeutet, daß eine Verbindung aus ihre natürlichen Umgebung in ausreichend reiner Form abgetrennt wird, so daß sie zur Verwendung für irgendeinen der Zwecke der Erfindung gehandhabt werden kann. Isoliert bedeutet daher ausreichend rein zur Verwendung (i) zur Erhöhung und/oder Isolierung von Antikörpern, (ii) als Reagenz in einem Test oder (iii) zur Sequenzierung etc.
In erster Linie stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screening von Verbindungen bereit, die an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein binden. Jede Verbindung, die an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein bindet, wird hier als "Ligand eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins" oder einfach "Liganden-Verbindung" bezeichnet. Eine Liganden-Verbindung kann an jeder Stelle eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins binden; eine Liganden-Verbindung kann daher, muß jedoch nicht notwendigerweise, mit immunstimulatorischer DNA um die Bindung konkurrieren. In Frage kommende Liganden-Verbindungen können ausgewählt sein unter immunstimulatorischen DNAs, anderen Polynukleotiden, Peptidnukleinsäuren (PNAs), Polypeptiden, Kohlenhydraten, Lipiden, Hormonen, kleinen organischen Molekülen und kleinen anorganischen Molekülen.
"Bindung vom Phosphorthioat-Typ" wie hier verwendet ist eine Phosphorthioat- oder Phosphordithioat-Bindung, die benachbarte Nukleotidbasen entlang eines in einem Nukleinsäuremolekül vorkommenden Rückgrats ("backbone") verbindet. Frühere Studi en haben gezeigt, daß die ODN-Aufnahme durch Lymphozyten stark durch die Rückgrat-Chemie beeinträchtigt wird. Zhao Q et al. (1993) Antisense Res Dev 3: 5366. Die höchste Zellmembranbindung und Aufnahme wurde bei chimären Phosphorthioat-ODNs beobachtet, bei denen die zentralen Verbindungen Phosphodiester, die 5'- und 3'-Verbindungen aber phosphorthioat-modifiziert sind. Frühere Studien haben auch gezeigt, daß phosphorthioat-modifizierte ODNs sehr viel immunstimulatorischer sind als entsprechende unmodifizierte ODNs. Phosphodiester-ODNs wurden mit einem DNA-Synthetisierer Model 380A, 380B oder 394 von Applied Biosystems Inc. unter Verwendung von Standard-Beta-Cyanoethylphosphoramidit-Chemie synthetisiert. Beaucage SL und Caruthers MH (1981) Tetrahedron Lett 22: 1859. Phosphorthioat-Verbindungen wurden durch Oxidation der Phosphit-Verbindung mit elementarem Schwefel anstatt der Standard-Jod-Oxidation eingeführt. Die vier üblichen Nukleosid-Phosphoramidite wurden von Applied Biosystems erhalten. Alle phosphodiester- und phosphorthioat-haltigen DNs wurden durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniak bei 55 °C für 12 Stunden entschützt. Die ODNs wurden durch Gelausschluß-Chromatographie gereinigt und vor dem Einsatz bis zur Trockne lyophilisiert. Phosphordithioat-Verbindungen wurden unter Verwendung von Desoxynucleosid-S-(β-benzoylmercaptoethyl)pyrrolidinothiophosphoramiditen eingeführt. Wiesler WT et al., Synthesis and purification of phosphorodithioate DNA. In: Methods in Molecular Biology Protocols for Oligonucleotides and Analogs – Synthesis and Properties, Agrawal S (Hrsg.), Humana Press, Totowa, NJ, S. 191–206, 1993. Phosphordithioathaltige ODNs wurden durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniak bei 55 °C für 12 Stunden mit anschließender Umkehrphasen-HPLC-Aufreinigung entschützt.
"Andere Polynukleotide" wie hier verwendet bezieht sich auf Polynukleotid-Sequenzen, denen ein unmethyliertes 5'-CG-3'-Dinukleotid fehlt. Vorangegangene Studien haben zum Beispiel gezeigt, daß, obwohl das Stimulationsniveau durch Methylierung des CpG-Motivs vermindert ist, solche unmethylierten ODNs ein Niveau immunstimulatorischer Aktivität beibehalten, das eindeutig über der Hintergrundaktivität liegt, was darauf hindeutet, daß der Erkennungskomplex oder ein Teil des Komplexes methylierte Motive binden kann. Yi AK et al. (1998) J Immunol 160: 5898–906. Diese anderen Polynukleotide können synthetische, semi-synthetische oder natürlich vorkommende Sequenzen von DNA oder RNA sein.
"Peptidnukleinsäuren" (PNAs) wie hier verwendet sind nukleinsäureanaloge Moleküle, die als Oligonukleotide hergestellt werden, bei denen mindestens ein Teil des Zucker-Phosphat-Rückgrats durch ein neutrales achirales Polyamid(Peptid)-Rückgrat ersetzt wurde. Nielsen PE et al. (1991) Science 254: 1497–1500. PNAs können an komplementäre DNA oder RNA binden, und sie sind hochresistent gegenüber Proteasen und Nukleasen. Demidov VV et al. (1994) Biochem Biopharmacol 48: 1310–1313. Von PNA-Oligomeren ist bekannt, daß sie einen Antisense-Effekt zeigen, wenn sie in das Innere der Zelle gebracht werden. Hanvey JC et al. (1992) Science 258: 1481–1485; Bonham MA et al. (1995) Nucleic Acids Res 23: 1197–1203.
"Polypeptide" wie hier verwendet werden in Übereinstimmung mit ihrer in der Fachwelt bekannten Bedeutung verwendet, und schließen isolierte ganze Proteine und Teil-Proteine ein, die durch Nukleinsäuren kodiert sind. Solche Polypeptide können aus biologischen Proben, einschließlich Gewebe oder Zellhomogenaten, isoliert sein, und können auch in verschiedenen pro karyotischen und eukaryotischen Expressionssystemen rekombinant exprimiert werden durch Konstruieren eines Expressionsvektors, der für das Expressionssystem geeignet ist, Einführen des Expressionsvektors in das Expressionssystem und Isolieren des rekombinant exprimierten Proteins. Kurze Polypeptide, einschließlich antigener Peptide (die beispielsweise durch Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-Moleküle an der Oberfläche einer Zelle zur Immunerkennung präsentiert werden) können unter Verwendung wohlbekannter Verfahren der Peptidsynthese chemisch synthetisiert sein. Die Polypeptide können auch Glykoproteine beinhalten, die Proteine sind, die durch Addition mindestens eines Kohlenhydratrestes modifiziert sind, und Phosphorproteine, die Proteine sind, die durch Addition mindestens einer Phosphorsäure durch eine Peptid- oder Esterbindung modifiziert sind.
"Kohlenhydrate" wie hier verwendet sind native oder substituierte Polyhydroxyaldehyde, Polyhydroxyketone, Mono-, Di- und Polysaccharide. Beispiele schließen Glucose, Zellulose, Stärke, Glykogen, Chitosan und Chitin ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
"Lipide" wie hier verwendet schließen Fette, Öle, Fettsäuren, Steroide, Terpene, Lipoproteine, Glykolipide, Phospholipide, Sulfolipide und Aminolipide ein.
"Hormone" wie hier verwendet beinhaltet Steroidehormone und Peptidhormone.
"Kleine organische Moleküle" wie hier verwendet beinhaltet natürlich vorkommende, synthetische und semi-synthetische organische Moleküle. Vorzugsweise weisen die kleinen organi schen Moleküle ein Molekulargewicht von weniger als etwa 1 kDa auf. Dies schließt Arzneimittel ein.
"Kleine anorganische Moleküle" wie hier verwendet beinhaltet natürlich vorkommende, synthetische, und semi-synthetische anorganische Moleküle. Vorzugsweise weisen die kleinen organischen Moleküle ein Molekulargewicht von weniger als etwa 1 kDa auf.
Das Screening-Verfahren beinhaltet das Inkontaktbringen von mindestens einer in Frage kommenden Liganden-Verbindung mit einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein unter Bedingungen, die, in Abwesenheit einer Liganden-Verbindung, keinen Einfluß auf das scheinbare Molekulargewicht des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins oder die Fähigkeit, das immunstimulatorische DNA bindende Protein gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren zu detektieren, nehmen.
"In Frage kommende"-Verbindungen ("Kandidaten"-Verbindungen) umfassen eine Vielzahl chemischer Klassen, obwohl sie üblicherweise organische Verbindungen sind. In Frage kommende Verbindungen umfassen funktionelle chemische Gruppen, die erforderlich sind für eine strukturelle Wechselwirkung mit Polypeptiden, und beinhalten typischerweise mindestens einer Amino-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxyl-Gruppe, vorzugsweise mindestens zwei der funktionellen chemischen Gruppen und besonders bevorzugt mindestens drei der funktionellen chemischen Gruppen. Die Kandidaten-Verbindungen können zyklischen Kohlenstoff oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen umfassen, die substituiert sind mit einer oder mehreren der obengenannten funktionellen Gruppen. In Kandidaten-Verbindungen können auch Biomoleküle wie beispielsweise Peptide, Saccharide, Fettsäuren, Sterole, Isoprenoide, Purine, Pyrimidine, Derivate oder strukturelle Analoga der obigen Verbindungen oder Kombinationen davon und dergleichen sein. Wenn die Verbindung eine Nukleinsäure ist, ist die Verbindung typischerweise ein DNA- oder RNA-Molekül, obwohl modifizierte Nukleinsäuren, die nicht-natürliche Bindungen oder Untereinheiten aufweisen, ebenfalls umfaßt sind.
"Probe" wie hier verwendet ist jede Art von Material, die mindestens eine interessierende Verbindung enthält oder von der angenommen wird, daß sie eine solche Verbindung enthält. Eine Probe, die mindestens eine in Frage kommende Liganden-Verbindung enthält, ist jede Art von Material, die mindestens eine in Frage kommende Verbindung enthält. Die Probe kann beispielsweise ein biologisches Isolat sein, das eine Mehrzahl von in Frage kommenden Liganden-Verbindungen enthält. Die Probe kann auch eine einzelne in Frage kommende Liganden-Verbindung in isolierter Form sein. Alternativ kann die Probe eine Bibliothek oder eine Reihe von natürlichen und/oder synthetischen Verbindungen sein. Die Bibliothek kann beispielsweise eine kombinatorische Bibliothek von chemischen Verbindungen sein, die unter Anwendung einer Synthesestrategie erzeugt wurden, bei der chemische Mitglieder der Bibliothek gemäß einer systematischen Methodologie durch Zusammenfügen chemischer Untereinheiten hergestellt werden. Jedes Mitglied der Bibliothek ist daher aus einer oder mehreren der Untereinheiten aufgebaut. Abhängig von der endgültigen Natur des gewünschten Bibliotheksmitglieds können die chemischen Untereinheiten, die zur Erzeugung der Bibliothek verwendet wurden, natürlich vorkommende oder modifizierte Aminosäuren, natürlich vorkommende oder modifizierte Nukleotide, natürlich vor kommende oder modifizierte Saccharide oder andere organische oder anorganische Moleküle beinhalten. Rekombinante Bibliotheken können auch unter Verwendung von molekularbiologischen Werkzeugen in Bakterien oder Bakteriophagen-Partikeln erzeugt werden.
Um festzustellen, ob die Probe eine Liganden-Verbindung für ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein enthält, muß die Menge von Liganden-Verbindungen bestimmt werden, die an das immunstimulatorische DNA bindende Protein gebunden ist. Um dies zu erreichen, kann entweder die Liganden-Verbindung oder das immunstimulatorische DNA bindende Protein markiert sein. Eine Substanz ist "markiert", wenn sie physikalisch oder chemisch mit einem Marker assoziiert ist, so daß die Detektion oder die Messung des Markers zur Bestimmung der Anwesenheit oder Messung der Menge der Substanz in einer Probe äquivalent ist.
Ein "Marker" wie hier verwendet ist eine molekulare Markierung, die rasch durch physikalische, chemische, biochemische, enzymatische oder andere Mittel detektiert werden kann, und beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf: Digoxigenin; ein Isotop; ein Enzym; ein fluoreszierender, lumineszierender oder chromophorer Rest; ein Antikörper mit irgendeinem solchen Marker; ein unter Verwendung eines Antikörpers detektierbares Hapten; und markierte Bindungspartner wie beispielsweise (Strept)avidin und Biotin. Isotopenmarker schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I und ¹³¹I. Typische Fluoreszenzmarker Fluoreszein, Isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin und Fluorescamin. Typische chemilumineszierende Verbindungen schließen Luminol, Isoluminol, aromatische Akridinester, Imidazol und die Oxala tester ein. Typische biolumineszierende Verbindungen schließen Luziferin und Luziferase ein. Typische Enzyme schließen alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Maleat-Dehydrogenase, Glucoseoxidase und Meerrettich-Peroxidase ein.
Der Screening-Test beinhaltet das Ermessen einer Bindungs-Wechselwirkung. Der Umfang der Bindung, der zwischen zwei Bindungspartnern auftritt, kann auf verschiedenen Wegen untersucht werden. Zum Beispiel kann die Liganden-Verbindung markiert werden und dann mit dem stimulatorische DNA bindenden Protein unter Bedingungen, unter denen sie normalerweise wechselwirken würden, wie beispielsweise Bedingungen, die die In-vivo-Umgebung imitieren, in Kontakt gebracht. Ein Abtrennungsschritt kann dann durchgeführt werden, um alles ungebundene Material abzutrennen. Schließlich kann die Menge markierter Liganden-Verbindung, die gebunden wurde, bestimmt werden. Das Verfahren zur Bestimmung der Menge gebundener markierter Liganden-Verbindung hängt von dem Typ des verwendeten Markers ab. Die Fähigkeit einer Liganden-Verbindung, mit einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein zu binden, kann bestimmt werden durch Vergleichen der Menge markierter Liganden-Verbindung, die an das immunstimulatorische DNA bindende Protein in Anwesenheit oder Abwesenheit der in Frage kommenden Liganden-Verbindung gebunden ist.
Der Test kann die Abtrennung von ungebundener und gebundener markierter Liganden-Verbindung von der Probe beinhalten. Der Abtrennungsschritt kann in jeder in der Fachwelt bekannten Weise erreicht werden, zum Beispiel kann das immunstimulatorische DNA bindende Protein vor der Bindungsreaktion mit der markierten Liganden-Verbindung auf einem Substrat, d.h. einem Festphasen-Träger, immobilisiert sein, und dann kann ungebundene markierte Liganden-Verbindung nach der Bindungsreaktion durch Waschen des Festphasen-Trägers entfernt werden.
Ein alternativer Ansatz setzt markiertes immunstimulatorische DNA bindendes Protein statt einer markierten Liganden-Verbindung ein. Beispielsweise kann das immunstimulatorische DNA bindende Protein markiert sein und dann mit der in Frage kommenden Liganden-Verbindung unter Bedingungen, unter denen sie normalerweise wechselwirken würden, beispielsweise Bedingungen, die die In-vivo-Umgebung imitieren, in Kontakt gebracht werden. Ein Abtrennungsschritt kann anschließend durchgeführt werden, um alles ungebundene Material abzutrennen. Schließlich kann die Menge markierten immunstimulatorische DNA bindenden Proteins, das an die in Frage kommende Liganden-Verbindung gebunden ist, in einer Weise bestimmt werden, die den oben beschrieben Methoden ähnlich ist. Das Verfahren zur Bestimmung der Menge von gebundenem markierten immunstimulatorische DNA bindenden Protein wird von der Art des verwendeten Markers abhängig sein. Die Fähigkeit eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins, mit einer Liganden-Verbindung zu binden, kann durch Vergleichen der Menge von markiertem immunstimulatorische DNA bindenden Protein, das an die in Frage kommende Liganden-Verbindung in Gegenwart oder Abwesenheit des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins gebunden ist, bestimmt werden.
Dieser Test kann die Abtrennung von ungebundenem markierten immunstimulatorische DNA bindenden Protein aus der Probe beinhalten. Der Abtrennungsschritt kann auf jedem der in der Fachwelt bekannten Wege durchgeführt werden, in einer Weise, die den oben beschriebenen Verfahren ähnlich ist.
Viele Arten von Festphasen-Trägern sind in der Fachwelt wohlbekannt. Diese beinhalten beispielsweise, sind aber nicht beschränkt auf eine Kunststoff-Multiwell-Mikrotiterplatte, eine Mikroarray-Platte, eine Perle, Harz, ein Nitrozellulosefilter, ein Objektträger, ein Siliziumchip-Mikroarray oder ein Biomolekularer Interaktionsanalyse(BIA)-Chip.
"Perlen" wie hier verwendet beinhaltet, ist jedoch nicht beschränkt auf zum Beispiel Zelluloseperlen, "Controlled-pore"-Glasperlen, Silikagele, Polystyrolperlen, die optional quervernetzt sind mit Divinylbenzol und/oder Polyethylenglykol und optional funktionalisiert sind mit Amino-, Hydroxy-, Carboxy- oder Halo-Gruppen, Co-Poly-Perlen, Polyacrylamidperlen, Latexperlen, Dimethylacrylamidperlen, mit hydrophoben Polymeren beschichtete Glaspartikel. Die feste Träger kann mit verschiedenen Materialien beschichtet sein, um eine geladene oder neutrale Oberfläche herzustellen, oder kann mit Verbindungen wie beispielsweise einem Bindungspartner oder Verbindungsmolekül beschichtet sein. Über die Perlen hinaus können feste Träger auch jede andere Art unlöslicher Matrix beinhalten, wie beispielsweise ein Acrylamid-Derivat, Agarose, Zellulose, Nylon, Silika, magnetisierte Partikel, eine Zelle oder ein Bakteriophagenpartikel.
Das immunstimulatorische DNA bindende Protein oder die Liganden-Verbindung können in jeder in der Fachwelt bekannten Weise an einen Festphasenträger angeheftet sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf chemische Quervernetzung, nicht spezifische Adhäsion an eine Kunststoffoberfläche, Wechselwirkung mit einem an die feste Phase angehefteten Antikörper, Wechselwirkung mit einem oder einem Paar von Bindungspart nern, wie beispielsweise Biotin, das in der Lage ist, mit Avidin oder Streptavidin oder Aminogruppen zu binden, die an aktivierte Sepharose gebunden werden können.
Der Abtrennungsschritt kann auch durchgeführt werden durch Einfangen von in Lösungen gebildeten Komplexen auf einem Festphasenträger, und anschließendem, sofern dies angezeigt ist, Fortwaschen von ungebundenen Reaktanden. Zum Beispiel können die Materialien unter Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung oder eines Filters mit Poren, die die Passage des ungebundenen Materials erlauben, den gebundenen Komplex jedoch zurückhalten, nach der Größe getrennt werden. Derselbe Effekt kann erreicht werden durch Anwendung einer Gelfiltrationsmatrix.
Die Detektion der gebundenen Liganden-Verbindung oder des Liganden-Verbindung-immunstimulatorische-DNA-bindendes-Protein-Komplex kann erreicht werden unter Anwendung einer Anzahl von Verfahren, die der Fachwelt wohlbekannt sind. Diese Verfahren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf EMSA, enzymgekoppelten Immunassay (ELISA), ELIspot-Assay, Oberflächen-Plasmon-Resonanz (BIAcore), Fluorimetrie, Biolumineszenz, Refraktometrie, Autoradiographie, Autoradiometrie, PCR und Szintillationsdetektion. Die Technik der Oberflächen-Plasmon-Resonanz wird beispielsweise in Szabo A et al. (1995) Curr Opin Struct Biol 5: 699–705 diskutiert.
Wie oben erwähnt, stellt die Erfindung insbesondere ein Screening-Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereit, die die Wechselwirkung zwischen immunstimulatorischer DNA und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein hemmt. Ein "Bindungsinhibitor immunstimulatorischer DNA" ist eine Verbindung, die die Wechselwirkung zwischen immunstimulatorischer DNA und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein spezifisch hemmt. Ein Bindungsinhibitor immunstimulatorischer DNA wird in einigen Fällen mit immunstimulatorischer DNA um die Bindung an einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein konkurrieren. In anderen Fällen wird ein Bindungsinhibitor immunstimulatorischer DNA an eine Stelle eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins binden, die sich von der Stelle für die Bindung immunstimulatorischer DNA unterscheidet. Ein Bindungsinhibitor immunstimulatorischer DNA wird auch ein Funktionsinhibitor immunstimulatorischer DNA sein, wenn der Bindungsinhibitor nicht auch ein Funktionsimitator immunstimulatorischer DNA ist (siehe unten).
Das Screening-Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Wechselwirkung zwischen immunstimulatorischer DNA und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein hemmt, beinhaltet das Inkontaktbringen von mindestens einer in Frage kommenden Inhibitor-Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe von in Frage kommenden Bindungsinhibitoren immunstimulatorischer DNA, mit einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein unter Bedingungen, die es einer immunstimulatorischen Referenz-DNA in Abwesenheit eines Inhibitors erlauben, an das immunstimulatorische DNA bindende Protein zu binden. Die in Frage kommende Inhibitor-Verbindung wird mit dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein vor, nach oder gleichzeitig mit dem Kontakt zwischen einer markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA und dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein in Kontakt gebracht. Die restliche Bindung der markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein wird dann bestimmt. Die Bestimmung einer Abnahme der Bindung der immunstimulatorischen Referenz-DNA zeigt an, daß die in Frage kommende Inhibitor-Verbindung die Bindung der immunstimulatorischen Referenz-DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein stört. Beispiele für immunstimulatorischen Referenz-ODNs beinhalten immunstimulatorische ODNs mit der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 15. Ein in Frage kommender Bindungsinhibitor immunstimulatorischer DNA kann selbst eine immunstimulatorische DNA oder RNA, eine Nukleinsäure ohne ein CpG-Dinukleotid oder eine sich von einer Nukleinsäure unterscheidende Verbindung sein. In Frage kommende Bindungsinhibitor-Verbindungen immunstimulatorischer DNA können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf Peptidnukleinsäuren (PNAs), Antikörper, Polypeptide, Kohlenhydrate, Lipide, Hormone und kleine Moleküle. In Frage kommende Bindungsinhibitor-Verbindungen immunstimulatorischer DNA können ferner Varianten eines immunstimulatorischen Referenz-ODNs sein, die eine oder eine Kombination der folgenden beinhaltet: mindestens eine Substitution einer Bindung vom Phosphorthioat-Typ durch eine Phosphodiesterbindung, mindestens eine Substitution einer Phosphodiester-Bindung durch eine Bindung vom Phosphorthioat-Typ, mindestens eine Substitution einer Bindung vom Phosphorthioat-Typ durch eine andere Bindung vom Phosphorthioat-Typ oder mindestens eine Substitution eines Nukleotids durch ein anderes Nukleotid. In Frage kommende Inhibitor-Verbindungen können als Mitglieder einer kombinatorischen Bibliothek von Verbindungen erzeugt werden.
Dieser Test kann die Abtrennung sowohl von ungebundenen unmarkierten in Frage kommenden Inhibitor-Verbindungen als auch von ungebundener markierter immunstimulatorischer Referenz-DNA aus der Probe beinhalten. Der Abtrennungsschritt kann auf jede in der Fachwelt bekannte Art durchgeführt werden, in einer Weise, die dem oben beschriebenen Abtrennungsverfahren ähnlich ist. Gleichermaßen kann die Detektion der verbleibenden gebundenen markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA auf jede in der Fachwelt bekannte Art durchgeführt werden, in einer Weise, die dem oben beschriebenen Detektionsverfahren ähnlich ist.
Wie oben erwähnt, stellt die Erfindung insbesondere auch ein Screening-Verfahren zur Identifizierung einer Agonisten-Verbindung bereit, die für die Immuntherapie geeignet ist. Eine "Agonisten-Verbindung zu immunstimulatorischer DNA" wie hier verwendet ist eine Verbindung, die an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein bindet und einen Anstieg in zumindest einem Aspekt einer Immunantwort, die üblicherweise durch immunstimulatorische DNA induziert wird, verursacht. Eine Agonisten-Verbindung zu immunstimulatorischer DNA wird in einigen Fällen mit immunstimulatorischer DNA um die Bindung an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein konkurrieren. In anderen Fällen wird eine Agonisten-Verbindung zu immunstimulatorischer DNA an eine Stelle an dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein binden, die sich von der Bindungstelle für immunstimulatorische DNA unterscheidet.
Das Screening-Verfahren zur Identifizierung von Agonisten-Verbindungen, die in einer Immuntherapie geeignet sind, beinhaltet das Inkontaktbringen von mindestens einer in Frage kommenden Agonisten-Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe von in Frage kommenden Agonisten-Verbindungen zu immunstimulatorischer DNA, mit einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein unter Bedingungen, die es einer immunstimulatorischen Referenz-DNA erlauben, in Abwesenheit eines Ago nisten an das immunstimulatorische DNA bindende Protein zu binden. Die in Frage kommenden Agonisten-Verbindung wird mit dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein vor, nach oder gleichzeitig mit dem Kontakt zwischen einer markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA und dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein in Kontakt gebracht. Die restliche Bindung der markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein wird dann bestimmt. Die Bestimmung einer Abnahme der Bindung der immunstimulatorischen Referenz-DNA zeigt an, daß die in Frage kommenden Agonisten-Verbindung die Bindung der immunstimulatorischen Referenz-DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein stört. Die Bestimmung eines Anstiegs der Bindung der immunstimulatorischen Referenz-DNA zeigt an, daß die in Frage kommende Agonisten-Verbindung die Bindung der immunstimulatorischen Referenz-DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein fördert oder stabilisiert. Beispiele für immunstimulatorische Referenz-ODNs schließen immunstimulatorische ODNs der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 15 ein. Eine in Frage kommende Agonisten-Verbindung zu immunstimulatorischer DNA kann selbst eine immunstimulatorische DNA oder RNA, eine Nukleinsäure ohne ein CpG-Dinukleotid oder eine sich von einer Nukleinsäure unterscheidende Verbindung sein. In Frage kommende Agonisten-Verbindungen zu immunstimulatorischer DNA können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf Peptidnukleinsäuren (PNAs), Antikörper, Polypeptide, Kohlenhydrate, Lipide, Hormone und kleine Moleküle. In Frage kommende Agonisten-Verbindungen zu immunstimulatorischer DNA können ferner Varianten eines immunstimulatorischen Referenz-ODNs beinhalten, die irgend eine oder eine Kombination der oben für in Frage kommende Bindungsinhibitor-Verbindungen immunstimulato rischer DNA beschriebenen Substitutionen enthalten. In Frage kommende Agonisten-Verbindungen können als Mitglieder einer kombinatorischen Bibliothek von Verbindungen erzeugt werden.
Dieser Test kann die Abtrennung sowohl von ungebundenen unmarkierten in Frage kommende Agonisten-Verbindungen als auch von ungebundener markierter immunstimulatorischer Referenz-DNA aus der Probe beinhalten. Der Abtrennungsschritt kann auf jede in der Fachwelt bekannten Art durchgeführt werden, in einer Weise, die dem oben beschriebenen Trennungsverfahren ähnlich ist. Gleichermaßen kann die Detektion der verbliebenen gebundenen markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA auf jede in der Fachwelt bekannte Art durchgeführt werden, in einer Weise, die dem oben beschriebenen Detektionsverfahren ähnlich ist.
Das Screening-Verfahren für Agonisten-Verbindungen immunstimulatorischer DNA erfordert ferner das Inkontaktbringen einer in Frage kommenden Agonisten-Verbindung mit einer Immunzelle und das Feststellen, ob die in Frage kommende Agonisten-Verbindung ein Funktionsimitator immunstimulatorischer DNA ist.
Ein "Funktionsimitator immunstimulatorischer DNA" wie hier verwendet ist eine Verbindung, die an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein bindet und mindestens eine Funktion von immunstimulatorischen ODNs imitiert.
"Immunzelle" wie hier verwendet bezieht sich auf eine knochenmarksabgeleitete Zelle, die zirkulieren kann oder in sich in einem Gewebe aufhalten kann, und die an der Erkennung, Präsentation oder Antwort auf Moleküle oder Teile von Molekü len, die fremd sind oder eine potentielle Gefahr an den Wirt signalisieren, beteiligt sind. Beispiele für Immunzellen schließen B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, natürliche Killer(NK)-Zellen, dendritische Zellen, Mastzellen, Basophile, polymorphonukleäre Granulozyten und die Vorläufer dieser Zellen ein. Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von Immunzellen sind dem Fachmann sehr gut bekannt. Siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1999. Viele dieser Immunzellen scheiden als Antwort auf ihrer Aktivierung Produkte aus. Solche ausgeschiedenen Produkte schließen ein Immunglobuline (Antikörper), die spezifisch an verwandte molekulare Antigene binden; Zytokine, die als Signalmoleküle agieren, die Proliferation oder die Funktion von Populationen von Immunzellen fördern oder hemmen; und Zytokine, die als chemische Lockstoffe agieren, die für die Rekrutierung von Immunzellen an eine Stelle der Immunstimulation wichtig sind. Beispiele für menschliche Immunglobuline schließen Moleküle ein, die zu Klassen oder Isotypen gehören, die bezeichnet werden als IgG, IgM, IgE, IgA und IgD. Menschliche und Nager-IgG-Immunglobuline werden weiter eingeteilt in Isotyp-Unterklassen, die als die IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG2a und IgG2b bezeichnet werden. Zytokine schließen Interleukine, Interferone, bestimmte Wachstumsfaktoren und koloniestimulierende Faktoren ein. Zu diesen gehören zum Beispiel Interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, Interferon(IFN)-γ, Tumornekrosefaktor(TNF)-α, transformierender Wachstumsfaktor (TGF) β und Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF). Chemokine schließen Verbindungen aus vier Unterfamilien ein, die auf ihrer Struktur basieren: CXC, CC, C und CX₃C. Beispiele für Chemokine beinhalten unter anderen MIP-1α, MIP-1β, RANTES, MCP-1, MCP-2, IL-8 und GROα. Tests für Immunglobuline, Zyto kine und Chemokine sind dem Fachmann wohlbekannt. Siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1999. Eine Anzahl von kommerziellen Kits, insbesondere ELISAs, sind für die meisten dieser ausgeschiedenen Produkte erhältlich.
Das Screening-Verfahren für Funktionsimitatoren immunstimulatorischer DNA beinhaltet das Inkontaktbringen von mindestens einer in Frage kommenden Agonisten-Verbindung zu immunstimulatorischer DNA, die ausgewählt ist aus der Gruppe von in Frage kommenden Agonisten-Verbindungen zu immunstimulatorischer DNA, mit mindestens einer Immunzelle unter Bedingungen, die in Gegenwart einer immunstimulatorischen Referenz-DNA in einer meßbaren Statusänderung der Immunzellaktivierung oder der ausgeschiedenen Produkte führt. Die erwarteten Änderungen können erhöhte Produktion und Sekretion von IL-6, IL-12, IFN-γ, TNF-α, G-CSF und IgG2a; erhöhte B-Zellen-Proliferation und NK-Zellen-Aktivität; erhöhte Expression von Zelloberflächenmarkern für die Aktivierung; und verminderte Produktion und Sekretion von IgE und IL-4 einschließen. Solche Messungen können unter Verwendung von geeignet ausgewählten spezifischen Proben mit ELISA, Western-Blots, Northern-Blots, quantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) oder Durchflußzytometrie, Kinase-Assays oder Tests auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies oder Reduktion des intrazellulären Glutathiongehalts durchgeführt werden.
Die Erfindung stellt auch ein Screening-Verfahren für Funktionsinhibitoren immunstimulatorischer DNA bereit. Ein "Funktionsinhibitor immunstimulatorischer DNA" wie hier verwendet ist eine Verbindung, die an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein bindet und zumindest einen Aspekt der Immun antwort, die üblicherweise durch immunstimulatorische ODNs induziert wird, verhindert. Das Screening-Verfahren für Funktionsinhibitoren immunstimulatorischer DNA beinhaltet das Inkontaktbringen von mindestens einer in Frage kommenden Kompetitor-Verbindung zu immunstimulatorischer DNA, die ausgewählt ist aus der Gruppe von in Frage kommenden Kompetitor-Verbindungen immunstimulatorischer DNA, mit mindestens einer Immunzelle unter Bedingungen, die in Gegenwart einer immunstimulatorischen Referenz-DNA zu einer meßbaren Statusänderung der Immunzellaktivierung oder der ausgeschiedenen Produkte führt. Die erwarteten Änderungen können verminderte Produktion und Sekretion von IL-6, IL-12, IFN-γ, TNF-α, G-CSF und IgG2a; verminderte B-Zellen-Proliferation und NK-Zellen-Aktivität; verminderte Expression von Zelloberflächenmarkern der Zellaktivierung; und erhöhte oder unverminderte Bildung und Sekretion von IgE und IL-4 einschließen. Solche Messungen können unter Verwendung von Methoden durchgeführt werden, die oben für Agonisten-Verbindungen immunstimulatorischer DNA beschrieben sind.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum Screening für Verbindungen bereit, die direkt mit immunstimulatorischer DNA um die Bindung an immunstimulatorische DNA bindende Proteine konkurrieren. Ein "Bindungskompetitor zu immunstimulatorischer DNA" wie hier verwendet ist eine Verbindung, die mit einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein wechselwirken und die Bindung eines anderen immunstimulatorischen ODNs an das immunstimulatorische DNA bindende Protein verhindern kann. In einigen Fällen kann ein in Frage kommender Bindungskompetitor zu immunstimulatorischer DNA ein Inhibitor der Funktion immunstimulatorischer DNA sein. In anderen Fällen kann die in Frage kommende Kompetitor-Verbindung zu immunstimulatorischer DNA ein Funktionsimitator immunstimulatorischer DNA sein. In anderen Fällen kann die in Frage kommende Verbindung gemischte Eigenschaften immunstimulatorischer Imitatoren und Inhibitoren aufweisen. Der Bindungskompetitor immunstimulatorischer DNA kann an dieselbe Stelle eines Bindungsproteins wie ein immunstimulatorisches ODN binden und auf diese Weise die Wechselwirkung zwischen einem immunstimulatorischen ODN und dem Bindungsprotein blockieren. Alternativ kann der Kompetitor an eine entfernte Stelle binden und trotzdem die Wechselwirkung zwischen dem immunstimulatorischen ODN und dem Bindungsprotein verhindern, d.h. durch Herbeiführung einer Konformationsänderung.
Das Screening-Verfahren für Bindungskompetitoren immunstimulatorischer DNA beinhaltet das Inkontaktbringen von mindestens einer in Frage kommenden Bindungskompetitor-Verbindung zu immunstimulatorischer DNA, die ausgewählt ist aus der Gruppe von in Frage kommenden Bindungskompetitoren immunstimulatorischer DNA, mit einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein unter Bedingungen, die es einer immunstimulatorischen Referenz-DNA erlauben, in Abwesenheit eines Kompetitors an das immunstimulatorische DNA bindende Protein zu binden oder gebunden zu bleiben. Die in Frage kommende Bindungskompetitor-Verbindung wird mit dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein vor, nach oder gleichzeitig mit dem Kontakt zwischen der markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA und dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein in Kontakt gebracht. Die restliche Bindung der markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein wird dann bestimmt. Die Feststellung einer Abnahme der Bindung der immunstimulatorischen Referenz-DNA zeigt an, daß die in Frage kommende Kompetitor-Verbindung die Bindung der immunstimulatorischen Referenz-DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein stört. Beispiele für immunstimulatorische Referenz-ODNs beinhalten die immunstimulatorischen ODNs der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 15. Ein in Frage kommender Bindungskompetitor zu immunstimulatorischer DNA kann selbst eine immunstimulatorische DNA oder RNA, eine Nukleinsäure ohne ein CpG-Dinukleotid oder eine sich von einer Nukleinsäure unterscheidende Verbindung sein. Mögliche Bindungskompetitor-Verbindungen zu immunstimulatorischer DNA können beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Nukleinsäuren wie oben beschrieben, Peptidnukleinsäuren (PNAs), Antikörper, Polypeptide, Kohlenhydrate, Lipide, Hormone und kleine Moleküle. Mögliche Bindungskompetitor-Verbindungen zu immunstimulatorischer DNA können ferner Varianten eines immunstimulatorischen Referenz-ODNs einschließen, die irgend eine oder eine Kombination der Substitutionen beinhalten, die oben für in Frage kommende Bindungsinhibitor-Verbindungen immunstimulatorischer DNA beschrieben sind. In Frage kommende Bindungskompetitoren immunstimulatorischer DNA können als Mitglieder einer kombinatorischen Bibliothek von Verbindungen erzeugt werden.
Dieser Test kann die Abtrennung von sowohl ungebundenen unmarkierten in Frage kommenden Kompetitor-Verbindungen als auch ungebundener markierter immunstimulatorischer Referenz-DNA aus der Probe beinhalten. Der Abtrennungsschritt auf jede kann in der Fachwelt bekannte Art durchgeführt werden, in einer Weise, die dem oben beschriebenen Abtrennungsverfahren ähnlich ist. Gleichermaßen kann die Bestimmung der verbliebenen gebundenen markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA auf jede in der Fachwelt bekannte Art durchgeführt werden, in einer Weise, die dem oben beschriebenen Detektionsverfahren ähnlich ist.
Über ihre Eignung zur Identifizierung von Inhibitoren und Imitatoren hinaus sind die erfindungsgemäßen Screening-Tests geeignet zur Identifizierung von in Frage kommenden Kompetitoren zu immunstimulatorischen ODNs, um die Untersuchung von Struktur/Aktivität-Beziehungen zwischen immunstimulatorischen ODNs und immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen zu untersuchen.
C. Verfahren zur Optimierung immunstimulatorischer ODNs für die Immunstimulation. Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Optimierung eines ausgewählten stimulatorischen ODNs für die Immunstimulation bereit. "Optimierung" wie hier verwendet bezieht sich auf einen iterativen Prozeß der Einführung von Änderungen in ein vorliegendes System oder eine Verbindung und Untersuchen der funktionellen Bedeutung jeder Änderung, mit anschließendem Auswählen desjenigen erhaltenen Systems oder derjenigen erhaltenen Verbindung, die mit dem am meisten verbesserten funktionellen Ergebnis verbunden ist; diese Schritte werden wiederholt, bis ein gewünschter Endpunkt erreicht ist oder es ersichtlich ist, daß weitere Änderungen das funktionelle Ergebnis nicht verbessern werden. Dasselbe Ziel kann in paralleler Weise erreicht werden durch Erzeugen einer Bibliothek von eng verwandten Verbindungen und dem Screening der Bibliothek nach der Verbindung oder Verbindungen, die die vorteilhafteste Ausgestaltung der optimierten Eigenschaft aufweist. In diesem besonderen Fall beinhaltet die Optimierung eines ausgewählten immunstimulatorischen ODNs zur Immunstimulation das Testen einer Reihe von strukturell verwandten stimulatorischen ODNs auf ihre Fähigkeit, an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein zu binden. Das Screening-Verfahren beinhaltet das Inkontaktbringen von mindestens einer in Frage kommenden optimierten immunstimulatorischen DNA, die ausgewählt ist aus der Gruppe von in Frage kommenden optimierten immunstimulatorischen DNAs, mit einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein unter Bedingungen, die es einer immunstimulatorischen Referenz-DNA erlauben, in Abwesenheit eines Kompetitors an das immunstimulatorische DNA bindende Protein zu binden oder gebunden zu bleiben. Die in Frage kommende optimierte immunstimulatorische DNA wird mit dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein vor, nach oder gleichzeitig mit dem Kontakt zwischen der markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA und dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein in Kontakt gebracht. Die restliche Bindung der markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein wird dann bestimmt. Die Feststellung einer Abnahme in der Bindung der immunstimulatorischen Referenz-DNA zeigt an, daß die in Frage kommende optimierte immunstimulatorische DNA die Bindung der immunstimulatorischen Referenz-DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein stört. Beispiele für immunstimulatorische Referenz-ODNs beinhalten immunstimulatorische ODNs der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 15. Eine in Frage kommende optimierte immunstimulatorische DNA kann eine immunstimulatorische DNA, ein CpG-ODN oder eine Peptidnukleinsäure mit einem CpG-Dinukleotid sein. In Frage kommende optimierte immunstimulatorische DNAs können Varianten eines immunstimulatorischen Referenz-ODNs einschließen, die irgend eine oder eine Kombination der oben für in Frage kommende Bindungsinhibitor-Verbindungen immunstimulatorischer DNA beschriebenen Substitutionen beinhalten. In Frage kommende optimierte immunstimulatorische DNAs können als Mitglieder einer kombinatorischen Bibliothek von Verbindungen, zum Beispiel unter Verwendung der SELEX-Technologie, hergestellt werden. Tuerk C and Gold L (1990) Science 249:505–510; Gold L et al. (1995) Annu Rev Biochem 64: 763–797.
Dieser Test kann die Abtrennung von sowohl ungebundenen unmarkierten in Frage kommenden optimierten immunstimulatorischen DNAs als auch ungebundener markierter immunstimulatorischer Referenz-DNA aus der Probe beinhalten. Der Abtrennungsschritt kann auf jede in der Fachwelt bekannte Art durchgeführt werden, in einer Weise, die dem oben beschriebenen Abtrennungsverfahren ähnlich ist. Gleichermaßen kann die Bestimmung der verbliebenen gebundenen markierten immunstimulatorischen Referenz-DNA auf jede in der Fachwelt bekannte Art durchgeführt werden, in einer Weise, die dem oben beschriebenen Detektionsverfahren ähnlich ist.
Der Screening-Test kann auch als ein Konkurrenzkampf zwischen markierten in Frage kommenden optimierten immunstimulatorischen DNAs und unmarkierten immunstimulatorischen Referenz-DNAs um das immunstimulatorische DNA bindende Protein durchgeführt werden. Bei diesem Format wird dann die Bindung der markierten optimierten immunstimulatorischen DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein bestimmt. Die Detektion von gebundener optimierter immunstimulatorischer DNA zeigt an, daß die in Frage kommende optimierte immunstimulatorische DNA die Bindung der immunstimulatorischen Referenz-DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein stört.
Der Screening-Test kann auch durch Inkontaktbringen markierten immunstimulatorischen DNA bindenden Proteins mit immobilisierter immunstimulatorischer DNA durchgeführt werden. Bei diesem Format kann eine Reihe von in Frage kommenden immunstimulatorischen DNAs in Form einer feldartigen Anordnung auf einem Silizium-Chip oder in einer Kunststoff-Multiwell-Mikrotiter- oder Mikroarray-Platte präsentiert werden. Alternativ kann jede in Frage kommende optimierte immunstimulatorische DNA getrennt an eine Perle, ein Harz, ein Nitrozellulosefilter, einen Objektträger, oder einen biomolekularen Interaktionsanalyse(BIA)-Chip gekoppelt werden. Nach dem Inkontaktbringen des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins mit den immobilisierten in Frage kommenden immunstimulatorischen DNAs und, sofern dies angezeigt ist, dem Fortwaschen ungebundenen immunstimulatorische DNA bindenden Proteins, stellt die Detektion von zwischen der immobilisierten immunstimulatorischen DNA und dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplexen die Basis zur Auswahl bestimmter optimierter immunstimulatorischer DNAs bereit.
D. Screening-Verfahren, die zur Identifizierung zellulärer Ziele von immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen geeignet sind. Nach einem anderen Aspekt der Erfindung erlauben die erfindungsgemäßen Screening-Tests auch die Identifikation von zellulären Zielmolekülen. Das Verfahren beinhaltet das Screening einer Reihe in Frage kommender Zielmoleküle mit einem zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplex, das Auswählen der in Frage kommenden einen Komplex bindenden Zielmoleküle, und das Feststellen der Identität der gebundenen in Frage kommenden Zielmoleküle.
Ein "zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeter Komplex" wie hier verwendet ist ein bimolekularer Komplex, der durch die Bindung einer immunstimulatorischen DNA oder eines Kompetitors immunstimulatorischer DNA an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein gebildet wird. Solch ein bimolekularer Komplex kann Teil eines größeren Komplexes sein, der mindestens ein anderes Nukleinsäuremolekül oder anderes Nicht-Nukleinsäuremolekül, zum Beispiel ein anderes Polypeptid-Molekül, beinhaltet. Das immunstimulatorische ODN kann an das immunstimulatorische DNA bindende Protein in dem zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplex angebunden sein, beispielsweise durch Quervernetzung durch ultraviolettes Licht.
Ein "zelluläres Zielmolekül" ist ein Molekül, das durch einen zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplex gebunden wird. Beispiele für mögliche zelluläre Zielmoleküle beinhalten Nukleinsäuren, andere Proteine, Protein-Nukleinsäure-Komplexe, Kohlenhydrate, Hormone und Lipide. Reihen von in Frage kommenden zellulären Zielmolekülen können zum Beispiel eine cDNA-Bibliothek, einen Nukleinsäure-Mikrochip, eine Polypeptid-Bibliothek und ein Zell-Lysat einschließen. Ein Marker, wie vorher beschrieben, kann verwendet werden, um das immunstimulatorische ODN, das einen Teil des zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplexes bildet, zu markieren. Alternativ kann ein Marker verwendet werden, um ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein, das einen Teil des zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimula torische DNA bindenden Protein gebildeten Komplexes bildet, zu markieren. Als andere Alternative kann ein Marker verwendet werden, um das in Frage kommende Zielmolekül zu markieren, das durch den zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplex gebunden werden soll. Bei diesem Verfahren ist das immunstimulatorische DNA bindende Protein ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Nukleolin, hnRNP D, AUF1, hnRNP A1, Lupus-La-Protein und Isoformen, Fragmenten, Varianten und Äquivalenten davon. Beispiele für immunstimulatorische Referenz-ODNs beinhalten immunstimulatorische ODNs der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 15.
Der Screening-Schritt des Verfahrens beinhaltet das Inkontaktbringen eines zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplexes mit mindestens einem in Frage kommenden Zielmolekül. Bevorzugt wird die Reaktion unter Bedingungen durchgeführt, die es dem Komplex ermöglichen, in Abwesenheit eines Zielmoleküls im wesentlichen intakt zu bleiben. Mit anderen Worten, die bevorzugten Bedingungen sollten nicht dazu führen, daß der Komplex dissoziiert oder selbstaggregiert. Der Auswahlschritt des Verfahrens beinhaltet das Feststellen der Anwesenheit von in Frage kommendem an den Komplex gebundenem Zielmolekül. Dieser Schritt beinhaltet das Abtrennen von ungebundenen Komponenten, d. h. in Frage kommenden Zielmolekülen und ungebundenen Komplexen, aus der Probe. Der Abtrennungsschritt kann auf jede in der Fachwelt bekannte Art durchgeführt werden, in einer Weise, die dem oben beschriebenen Abtrennungsverfahren ähnlich ist. Gleichermaßen kann die Bestimmung der verbliebenen gebundenen markierten immunstimu latorischen Referenz-DNA auf jede in der Fachwelt bekannte Art durchgeführt werden, in einer Weise, die dem oben beschriebenen Detektionsverfahren ähnlich ist. Zum Beispiel kann die Probe im Anschluß an den Schritt des Inkontaktbringens des zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplexes mit markierten in Frage kommenden Zielmolekülen auf einen Filter aufgegeben werden, der die Verbindungen abfangen kann, die mindestens die Größe des Komplexes haben, ungebundene markierte Zielmoleküle jedoch nicht abfängt. Die Detektion des Markers auf dem Filter oberhalb jeglicher Hintergrundbindung, die ohne den Komplex stattfindet, zeigt die Anwesenheit von an den zwischen einen immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplex gebundenen in Frage kommenden Zielmolekülen an.
In Abhängigkeit von der Natur des in Frage kommenden Zielmoleküls beinhaltet der Schritt des Identifizierens des gebundenen Zielmoleküls dann die Bestimmung von dessen Sequenz oder Struktur. In einigen Fällen wird die Identität aus der Weise, in der die Reihe von in Frage kommenden Zielmolekülen hergestellt wurde, ersichtlich sein, zum Beispiel durch Ermitteln der Identität der als Teil einer räumlich angeordneten ("arrayed") kombinatorischen Bibliothek hergestellten Verbindung. In anderen Fällen wird es erforderlich sein, eine Nukleotid- oder Peptidsequenzierung unter Anwendung von Standardtechniken, die in der Fachwelt wohlbekannt sind, vorzunehmen. In noch anderen Fällen, in denen die in Frage kommenden Zielmoleküle keine isolierten Moleküle sind, sondern eher in einer Zell-Lysat-Probe enthalten sind, kann es erforderlich sein, das Zielmolekül von dem zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplex zu dissoziieren und das Zielmolekül anschließend unter Verwendung von z. B. MALDI-MS oder ESI-MS, Northern- oder Western-Blotting oder Polymerasekettenreaktion zu analysieren.
Die Erfindung umfaßt Varianten des oben beschriebenen immunstimulatorische DNA bindenden Proteins. Wie hier verwendet ist eine "Variante" eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins ein Polypeptid, das eine oder mehrere Modifikation(en) an der primären Aminosäuresequenz eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins enthält. Modifikationen, die eine Variante eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins erzeugen, werden typischerweise an der Nukleinsäure, die das immunstimulatorische DNA bindende Protein kodiert, vorgenommen und können Deletionen, Punktmutationen, Trunkierungen, Aminosäureaustausche und die Addition von Aminosäure- oder Nicht-Aminosäureresten umfassen, um: 1) die funktionelle Aktivität eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins zu erhalten; 2) eine Eigenschaft eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins zu verbessern, wie beispielsweise die Proteinstabilität in einem Expressionssystem oder die Stabilität der Protein-Protein-Bindung; 3) eine neue Aktivität oder Eigenschaft eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins bereitzustellen, wie beispielsweise die Addition eines antigenen Epitops oder die Addition eines detektierbaren Restes; oder 4) eine entsprechende oder bessere Bindung an eine immunstimulatorische DNA oder ein anderes Molekül bereitzustellen. Alternativ können die Modifikationen direkt an dem Polypeptid vorgenommen werden, beispielsweise durch Spaltung, Addition eines Linker-Moleküls, Addition eines detektierbaren Restes, wie beispielsweise Biotin, Addition einer Fettsäure, einer Histidin-Markierung und dergleichen. Die Modifikationen umfassen auch Fusionsproteine, die die vollständige Aminosäuresequenz des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins oder einen Teil davon umfassen. Der Fachmann ist mit den Verfahren zur Vorhersage der Wirkungen einer Änderung der Proteinsequenz auf die Proteinkonformation vertraut und kann daher eine Variante eines immunstimulatorische DNA bindenden Protein nach bekannten Verfahren "konstruieren". Ein Beispiel für sein solches Verfahren ist durch Dahiyat und Mayo in Science 278: 82 (1997) beschrieben, wobei Proteine de novo konstruiert werden können. Das Verfahren kann auf bekannte Proteine angewendet werden, um nur einen Bereich der Polypeptidsequenz zu verändern. Durch Anwendung Berechnungsverfahren von Dahiyat und Mayo können spezifische Varianten eines Polypeptids vorgeschlagen und getestet werden, um feststellen, ob die Variante eine gewünschte Konformation behält.
Varianten können immunstimulatorische DNA bindende Proteine einschließen, die in spezifischer Weise modifiziert sind, um eine Eigenschaft des Polypeptids zu verändern, die nicht mit dessen physiologischer Aktivität in Verbindung steht. Zum Beispiel können Cystein-Reste ersetzt oder entfernt werden, um unerwünschte Disulfid-Bindungen zu verhindern. Gleichermaßen können bestimmte Aminosäuren geändert werden, um die Expression eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins durch Eliminieren der Proteolyse durch Proteasen in einem Expressionssystem zu verbessern (z. B. dibasische Aminosäurereste in Hefe-Expressionssystemen, bei denen keine KEX2-Protease-Aktivität vorhanden ist).
Mutationen von Nukleinsäuren, die ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein kodieren, erhalten bevorzugt den Aminosäure-Leserrahmen der kodierenden Sequenz und erzeugen vor zugsweise keine Bereiche in der Nukleinsäure, die wahrscheinlich unter Bildung sekundärer Strukturen, wie beispielsweise Haarnadeln oder Schleifen, hybridisieren, die für die Expression der Polypeptid-Variante schädlich sind.
Mutationen können vorgenommen werden durch Auswählen eines Aminosäureaustauschs oder durch Zufallsmutagenese einer ausgewählten Stelle in einer Nukleinsäure, die das Polypeptid kodiert. Polypeptid-Varianten werden dann exprimiert und auf eine oder mehrere Aktivitäten getestet, um festzustellen, welche Mutationen eine Polypeptid-Variante mit den gewünschten Eigenschaften ergeben. Weitere Mutationen können an Varianten (oder an nicht abgewandelten immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen) vorgenommen werden, die sich auf die Aminosäuresequenz des Polypeptids nicht auswirken, jedoch bevorzugte Codons für die Translation in einem bestimmten Wirt bereitstellen. Die bevorzugten Codons für die Translation einer Nukleinsäure in z. B. E. coli sind dem Fachmann wohlbekannt. Noch andere Mutationen können an den nichtkodierenden Sequenzen eines Gens für ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein oder einem cDNA-Klon vorgenommen werden, um die Expression des Polypeptids zu fördern.
Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß konservative Aminosäureaustausche in immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen vorgenommen werden können, um funktionell äquivalente Varianten der vorstehenden Polypeptide zu erhalten, d. h. die Varianten behalten die funktionellen Fähigkeiten des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins und können in den erfindungsgemäßen Tests verwendet werden. Wie hier verwendet, bezieht sich ein "konservativer Aminosäureaustausch" auf einen Aminosäureaustausch, der die relativen Ladungs- oder Grö ßeneigenschaften des Proteins, bei dem der Aminosäureaustausch vorgenommen wird, nicht verändert. Varianten können gemäß Verfahren zur Änderung von Polypeptidsequenzen vorgenommen werden, die dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt sind, wie sie in Referenzen gefunden werden, die solche Verfahren zusammenstellen, z.B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., Hrsg., Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, oder Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., New York. Konservative Austausche von Aminosäuren schließen Austausche ein, die unter Aminosäuren innerhalb der folgenden Gruppen vorgenommen werden: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; und (g) E, D.
Daher ist die Verwendung von funktionell äquivalenten Varianten immunstimulatorischer DNA bindender Proteine, d. h. Varianten von immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen, die die Funktion des natürlichen immunstimulatorische DNA bindenden Proteins erhalten, in den erfindungsgemäßen Screening-Tests und Produkten mit umfaßt. Konservative Aminosäureaustausche in der Aminosäuresequenz von immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen zur Herstellung funktionell äquivalenter Varianten von immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen werden typischerweise durch Veränderung einer Nukleinsäure vorgenommen, die immunstimulatorische DNA bindendes Protein kodiert. Solche Austausche können durch eine Vielzahl von Verfahren vorgenommen werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Zum Beispiel können Aminosäureaustausche durch PCR-gerichtete Mutation, ortsgerichtete Mutagenese gemäß dem Verfahren von Kunkel (Kunkel TA (1985) Proc Nat Acad Sci USA 82: 488), oder durch chemische Synthese eines Gens, das ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein kodiert, vorgenommen werden. Die Aktivität von funktionell äquivalenten Fragmenten von immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen kann getestet werden durch Klonieren des das veränderte immunstimulatorische DNA bindende Protein kodierenden Gens in einem bakteriellen oder Säugetier-Expressionsvektor, Einführen des Vektors in eine geeignete Wirtszelle, Exprimieren des veränderten immunstimulatorische DNA bindenden Proteins und Testens des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins auf eine funktionelle Fähigkeit in den hier offenbarten Tests.
E. Isolierter zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeter Komplex. Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die Komplexe sind, die zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildet sind. Solche Komplexe sind für Screenings nach Zielmolekülen immunstimulatorischer DNA geeignet. Das immunstimulatorische ODN kann an das immunstimulatorische DNA bindende Protein in dem zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplex angebunden sein, zum Beispiel durch Quervernetzung mittels ultravioletten Lichts. Ein Marker kann verwendet werden, um das immunstimulatorische ODN zu markieren, das einen Teil des Komplexes bildet. Alternativ kann ein Marker verwendet werden, um ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein zu markieren, das einen Teil des Komplexes bildet. Beispiele für immunstimulatorische ODNs und für immunstimulatorische DNA bindende Proteine, die an dem Komplex beteiligt sein können, sind wie oben beschrieben.
F. Kit zur Identifizierung zellulärer Ziele eines immunstimulatorischen Oligonukleotids. In einem anderen Aspekt der Erfindung kann ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein in einem Reaktionsgefäß gegeben werden und in ein Kit aufgenommen werden, das für die Identifikation von zellulären Zielen immunstimulatorischer DNA verwendet werden soll. In bestimmten Ausführungsformen kann auch erfindungsgemäße immunstimulatorische DNA in einem Reaktionsgefäß plaziert sein und in denselben Kit enthalten sein. Die Kits können Anweisungen oder anderes gedrucktes Material zur Herstellung eines zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen gebildeten Komplexes und zur Verwendung des Komplexes zum Screening einer Reihe von Nukleinsäurenmolekülen zur Identifizierung zellulärer Ziele eines immunstimulatorischen ODNs enthalten. Beispiele für immunstimulatorische DNA bindende Proteine, die in einem Kit enthalten sein können, sind Nukleolin, Lupus-La-Protein, hnRNP D, AUF1, hnRNP A1 und Isoformen, Fragmente, Varianten und Äquivalente davon. Beispiele von immunstimulatorischen Referenz-ODNs beinhalten immunstimulatorische ODNs der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 15.
Ein Kit, das Eigenschaften der vorliegenden Erfindung verkörpert, allgemein gekennzeichnet durch die Ziffer 11, ist in 15 dargestellt. Das Kit 11 besteht aus den folgenden Hauptbestandteilen: die Verpackung 15, ein Kompartiment, das das immunstimulatorische DNA bindende Protein 17 enthält, eine immunstimulatorische DNA 19, die das immunstimulatorische DNA bindende Protein 17 bindet, und Anweisungen 21. Die Verpackung 15 ist eine schachtelartige Struktur zur Aufnahme immunstimulatorische DNA bindenden Proteins 17, einer immunsti mulatorischen DNA 19 und von Anweisungen 21. Der Fachmann kann die Verpackung 15 leicht modifizieren, um sie individuellen Bedürfnissen anzupassen.
Jede der Limitierungen der Erfindung kann verschiedene Ausführungsformen der Erfindung umfassen. Es wird daher vorweggenommen, daß jede der Limitierungen der Erfindung, die irgendein Element oder eine Kombination von Elementen beinhaltet, in jedem Aspekt der Erfindung enthalten sein kann.
BEISPIEL 1
Proteine in Rohextrakten von B-Lymphozyten binden an immunstimulatorische ODNs
Zellkultur. Suspensionskulturen von Ramos-Zellen, einer menschlichen Burkitt-Lymphom-B-Zellinie (ATCC CRL-1923 oder CRL-1596) wurden in RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 1,5 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin bei 37 °C, 5% CO₂ angezogen.
Herstellung von Zellextrakten. Zellen wurden durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geerntet, zweimal mit kalter phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, und 5 × 10⁹ Zellen wurden in 15 ml hypotonischem Puffer A [10 mM HEPES/KOH (pH 7,9), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,5 mM Dithiothreitol (DTT), 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 30 μg/ml Leupeptin, 50 μg/ml Aprotinin, 5 mg/ml Antipain, 5 μg/ml Pepstatin] resuspendiert. Nach Inkubation auf Eis für 15 Minuten wurden die Zytoplasmamembranen in einem Dounce-Homogenisator durch Anwendung von 15 bis 20 Schlägen zerstört. Die Suspension wurde bei 1000 × g für 5 Minuten zen trifugiert und der Überstand wurde als Zytoplasma-Fraktion entfernt und bei –70 °C aufbewahrt. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bradford-Proteintests (Bio-Rad) nach Herstelleranweisungen gemessen. Oligodesoxynukleotide. Oligodesoxynukleotide (ODNs) wurden von Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) bezogen. Die verschiedenen ODNs, die für die DNA-Bindungsanalyse verwendet wurden, waren:
Oligonukleotid-Rückgrate waren Phosphodiester, sofern nicht anders angegeben. CpG-Motive sind unterstrichen, Z bezeichnet 5-Methylcytosin und DIG repräsentiert Digoxigenin.
DNA-Bindungs-Test. Für Elektromobilitätsshift-Assays (EMSAs) wurden ODNs mit T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs) und [γ-³²P]ATP nach Anbieteranweisungen endmarkiert. Die Bindungsreaktionen wurden mit 2–4 μg Protein von Ganzzellextrakten oder weniger mit gereinigten Proteinextrakten, in DNA-Bindungs-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1% Triton X-100 und 8% Glycerin], versetzt mit 100–500 ng Poly(dI,dC)-(dI,dC)] und 20.000 – 40.000 cpm [γ-³²P]ATP- markiertem ODN oder 10 ng digoxigeninmarkiertem ODN in 10 μl Gesamtvolumen durchgeführt. Wenn unmarkierte Kompetitor-ODNs (1–500 ng) verwendet wurden, wurden die Proben vor Zugabe von markiertem ODN für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde Beladungspuffer zugegeben und die Sonden wurden auf einem 5% Polyacrylamidgel bei 10 V pro cm in 22 mM Tris-Borat-0,5-mM-EDTA-Puffer elektrophoretisiert. Alternativ wurden die Proben auf einem 1% Agarosegel bei 12 V pro cm in 0,5 × TAE-Puffer analysiert. Die Gele wurden getrocknet und für 6 bis 20 Stunden bei –80 °C einem Film mit einer Verstärkungsfolie ausgesetzt.
Bei einigen EMSAs wurden 10 ng nicht-radioaktivdigoxigeninmarkierter ODNs statt [γ-³²P]ATP markierter ODNs für die Bindung verwendet. Bei diesen Tests wurden die nicht-radioaktiv markierten Gele auf einer Biodyne-Plus-Membran (Pierce) einem Elektroblot unterzogen, für eine Minute UV-quervernetzt und mit einem nach Anbieterangaben verwendeten Peroxidase-DIG-Lumineszenz-Kit (Roche) entwickelt.
UV-Quervernetzung in Lösung und Ermittlung des Molekulargewichts (MG). 1–5 μl (0,75 μg Gesamtproteingehalt) von einem teilweise gereinigten Proteinextrakt wurden in DNA- Bindungspuffer, versetzt mit 100–300 ng Poly(dI-dC)·Poly(dI-dC)] und 20.000 bis 40.000 cpm [γ-³²P]ATP-markiertem ODN oder mit 10 ng digoxigeninmarkiertem ODN, und, wo angegeben, mit 100 bis 1000 ng Kompetitor-ODN in einem Endvolumen von 10 μl gemischt. Wenn Kompetitor zugegeben wurde, wurden die Proben für vor der Zugabe des markierten ODNs 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten wurden die Proben in die Näpfe einer 96-Napf-Platte transferiert und DNA-Protein-Komplexe wurden mit UV-Licht in einem Stratlinker (Stratagene) für 3 Minuten oder die angegebene Zeit quervernetzt. Die Sonden wurden dann mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE, siehe unten) analysiert. Vorgefärbter Proteinmarker (Bio-Rad, niedriger Bereich) wurde als MG-Standard verwendet. Die mit radioaktivem Marker gelaufenen Gele wurden auf Whatman-Papier getrocknet und autoradiographiert. Für mit nicht-radioaktivem Marker laufende Gele wurden die Proteine durch Elektroblotting aus dem Gel auf eine Biodyne-Plus-Membran übertragen und anschließend unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Detektions-Kits (Roche) nach den Anbieteranweisungen bestimmt.
Nachdem die Exposition abgelaufen war, wurden die MG-Marker auf dem Film markiert und der Abstand zwischen jeder Bande des Markers und der Lauffront wurde gemessen. Die Aufzeichnung des Abstandes in mm (lineare Skala) gegen das Molekulargewicht der Markerproteine (logarithmische Skala) ergab eine Standardkurve, die zur Ermittlung des Molekulargewichts der quervernetzten Protein-ODN-Komplexe verwendet wurde. Das ermittelte Molekulargewicht von jedem quervernetzten Protein-ODN-Komplex wurde dann durch Subtraktion des MG der entspre chenden ODN-Sonde korrigiert und nach der folgenden Formel berechnet: MG (g/mol) =(251 × nA) + (245 × nT) + (267 × nG) + (230 × nC) + (61 × (N-1)),wobei N Gesamtzahl der Basen, n_A die Zahl der Adeninbasen, n_T die Zahl der Thyminbasen, n_G die Zahl der Guaninbasen und n_C die Zahl der Cytosinbasen ist. Nach dieser Formel weist das ODN #2059 (SEQ ID NO: 1) ein berechnetes MG von 7355 Da auf. Während die Phosphatgruppen (61 × (N-1)) zu den Basen addiert wurden, wurden die Hydratation und die assoziierten Kationen nicht in diese Berechnung einbezogen.
Denaturierende Proteingele. Quervernetzte DNA-Protein-Komplexe wurden durch konventionelle SDS-PAGE analysiert. Das Trenngel enthielt 7,5%–10% Acrylamid, 1 M Tris-HCl (pH 8,45), 0,1% SDS und 0,5% Glycerin. Das Sammelgel bestand aus 4% Acrylamid, 0,75 M Tris-HCl (pH 8,45) und 0,075 SDS. Proteinproben wurden mit SDS-Probenpuffer [50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1% β-Mercaptoethanol, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau, 10% Glycerin] gemischt, für 10 Minuten gekocht, auf Eis gekühlt und auf das Gel geladen. Der Elektrophoresepuffer für die Kathode war 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M Tricin und 0,1% SDS mit einem pH von 8,25. Der Anodenpuffer war 0,2 M Tris-HCl (pH 8,8). Nach der Elektrophorese wurden die Gele auf Whatman-3M-Papier getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Silberfärbungstest. Nach der Elektrophorese wurde das SDS-Gel in Lösung 1 [50% Methanol, 12% TCA in H₂O] transferiert und für 20 Minuten inkubiert. Dann wurde das Gel in Lösung 2 [10% Ethanol, 5% Essigsäure] transferiert und für weitere 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurde Lösung 2 durch Lösung 3 er setzt [0,06 Ammoniumpersulfat in Wasser] und für weitere 10 Minuten inkubiert. Dann wurde Lösung 3 durch Lösung 4 [0,1% AgNO₃ in Wasser] ersetzt und für 15 Minuten inkubiert. Lösung 4 wurde ersetzt durch Entwicklungslösung [2% K₂CO₃, 0,04% H₂CO] und die Reaktion wurde mit 1% Essigsäure gestoppt, wenn die Proteinbanden klar sichtbar waren.
Ergebnisse. Rohe zytoplasmatische oder nukleäre Extrakte von Ramos-B-Lymphozyten ergaben mehrere Komplexe, wie durch EMSAs festgestellt wurde, wenn das immunstimulatorische ODN #2059 als markierte Sonde verwendet wurde (1, Spur 1). Der Komplex C5 schien statt aus einer einzelnen Bande aus mehreren Banden, die nahe beieinander liefen, zu bestehen. Der langsam wandernde Komplex CO wurde am ehesten bei hohen Proteinkonzentrationen (>15 μg/Spur) (1, Spur 1) beobachtet. DNA-Bindungstests in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von unmarkiertem Kompetitor-ODN, entweder immunstimulatorischem ODN #2059 (1, Spuren 2–4) oder nicht-immunstimulatorischem ODN #2060 (1, Spuren 5–7), ergaben, daß Komplex C3 spezifisch für CpG-Motive war, während C4 und C5 dies nicht waren. Die Komplexe C0, C1 und C2 zeigten nur schwache Spezifität für immunstimulatorische ODNs (1).
Wenn verschiedene digoxigeninmarkierte ODNs zu zytosolischen Extrakten von Ramos-(B-Lymphozyten)-Zellen, YT-Indy-(NK)-Zellen und HeLa-(Karzinom)-Zellen zugegeben wurden und durch Quervernetzungstests untersucht wurden, konnten drei verschiedene Sätze von Banden, die ODN-Bindungsproteinen entsprachen, unterschieden werden (2): ein Satz mit hohem MG, zusammengesetzt aus etwa drei Banden im Bereich von 113 bis 104 kDa (113, 108 und 104 kDa); ein Satz mit mittlerem MG, zusammengesetzt aus mindestens vier Banden im Bereich von 93 bis 74 kDa (93, 88, 78 und 74 kDa); und ein Satz mit niedrigem MG war aus mindestens vier oder fünf Banden im Bereich von 58 bis 36 kDa (58, 55, 51, 43 und 36 kDa) zusammengesetzt. Nicht aus 2 ersichtlich, jedoch auch in dem Satz mit mittlerem MG anwesend, sind mindestens zwei weitere Banden von ODN-bindendem Protein, die in dem vorliegenden Test nur schwach quervernetzten. Die Spuren in 2 entsprechen den folgenden Quervernetzungspartnern für zytosolische Extrakte aus jeder angegebenen Zellinie: Spur 1, Phosphorthioat-CpG-ODN #5007; Spur 2, Phosphodiester-CpG-ODN #5004; Spur 3, methyliertes Phosphodiester-CpG-ODN #5012; Spur 4, Phosphodiester-nicht-CpG-ODN #5016; Spur 5, Poly-T-ODN #5017; und Spur 6, Poly-C-ODN #5009.
Die Proteine in dem Satz mit hohem MG quervernetzten mit vergleichsweise gleicher Effizienz mit Phosphorthioat- und Phosphodiester-ODNs. Die Bindung von Proteinen mit hohem MG an Poly-T-ODNs oder Poly-C-ODNs war jedoch schwächer.
Anders als Proteine in den Sätzen mit hohem und mittlerem MG, quervernetzten Proteine in dem Satz mit niedrigem MG nur sehr schwach, wenn überhaupt, mit Phosphorthioat-ODNs. Beim Vergleich der Quervernetzungseffizienz verschiedener ODNs quervernetzten diese Proteine mit niedrigem MG am besten mit Poly-T-ODN und nur schwach, wenn überhaupt, mit Poly-C-ODN.
Ein auffälliger Unterschied wurde beobachtet durch Vergleich der Quervernetzung bei Ramos-B-Zellzytosol mit NK-Zellzytosol. Zwei der Banden mit hohem MG (106 und 108 kDa) erschienen bei T-Zell- und HeLa-Zellzytosol sehr viel markanter als bei NK-Zellzytosol. Zellkernextrakte dieser Zellinien zeigten weniger markante Unterschiede in der Verteilung ODN bindender Proteine unter den Zellinien.
BEISPIEL 2
Chromatographische Isolierung von immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen
Die chromatographische Isolierung von immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen aus Zell-Lysaten verlief entlang aufeinanderfolgender Schritte von Heparin-Affinitätschromatographie, Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie und Affinitätschromatographie mittels einer mit immunstimulatorischem ODN gekoppelter Sepharosesäule.
A. Affinitätchromatographie mit Heparin-Säule. Der erste Aufreinigungsschritt von immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen aus Zellextrakten wurde auf einer Heparin-Affinitätsäule durchgeführt. Alle Reinigungsschritte wurden bei 4 °C durchgeführt. Generell wurden nur zytoplasmatische Fraktionen verwendet, da angenommen wird, das immunstimulatorische DNA bindende Proteine aus Zytosol mit weniger anderen kontaminierenden DNA-bindenden Proteinen isoliert werden können als immunstimulatorische DNA bindende Proteine aus den Zellkernen isoliert werden können. Die rohen zytosolischen oder nukleären Extrakte wurden auf einer PD10-Gelfiltrationssäule (Pharmacia Biotech) gemäß dem Hersteller auf Puffer HA [50 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA] eingestellt. Die Proben wurden dann nacheinander durch 1,2 μm, 0,8 μm, 0,45 μm und 0,2 μm Spritzenfilter (Gelman, PVDF-Membran) filtriert. Die behandelten Proteinextrakte, die bis zu 240 mg Protein enthielten, wurden auf eine 7,5-ml- Heparin-Hyper-D-Säule (Biosepra) geladen. Mit einer auf 1 ml/min gesetzten Flußrate wurden die Proteine bei von 0 bis 1000 mM NaCl ansteigender Salzkonzentration eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und bei –80 °C aufbewahrt. Vier identische Heparin-Läufe wurden durchgeführt, von denen jeder mit ungefähr 18 ml Zellniederschlag startete. Die erhaltenen Fraktionen wurden durch EMSA und Quervernetzungstest, wie oben beschrieben, analysiert.
Ergebnisse. In einem ersten Trennungsschritt wurden verschiedene immunstimulatorische DNA bindende Proteine, die in dem Rohzytosol anwesend waren, an eine Heparin-Affinitätssäule gebunden und mit einem ansteigenden Salzgradienten eluiert. Die erhaltenen Fraktionen aus der Heparin-Affinitätschromatographie wurden in vier gepoolte Fraktionen aufgeteilt, die als H1, H2, H3 und H4 bezeichnet wurden, die anschließend in EMSA- und Quervernetzungstests mit dem CpG-ODN #2059 analysiert wurden. Für einige Tests wurden die Fraktionen H1 und H2 kombiniert und als einzelne gepoolte Fraktion, H1/2, eingesetzt. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 2 unten zusammengefaßt und in 3 (Tafel A, EMSA; Tafel B, Quervernetzung) dargestellt. Spur L in beiden Tafeln von 3 ist die Beladungs("load")-Fraktion und Spur U ist die ungebundene Fraktion (4mal stärker beladen als jede andere Spur). Die Fraktionsziffern innerhalb der gepoolten Fraktionen H 1/2, H3 und H4 sind angegeben. MG-Standardmarker sind auf der rechten Seite in Tafeln B angegeben. Die Bindungsproteine BP1–BP5 sind ebenfalls angegeben.
Tabelle 2 Analyse von Heparin-Affinitätschromatographie-Fraktionen mit dem CpG-ODN #2059
EMSA ergab, daß die gepoolten Fraktionen H1/2, zusammengesetzt aus den Fraktionen, die von der Heparin-Affinitätssäule im Salzbereich von 100–300 mM NaCl eluierten, mindestens drei Komplexe enthielten, von denen keiner sich in dem Quervernetzungstest sehr gut bemerkbar machte.
Die gepoolten Fraktionen H3, zusammengesetzt aus den Fraktionen, die von der Heparin-Affinitätssäule über den Salzbereich von 300–450 mM NaCl eluierten. Beim Quervernetzungstest enthielt H3 zwei vorherrschende Proteine mit MG von ca. 50 kDa und 58 kDa und geringere Mengen von einem 45-kDa-Protein und einem 108-kDa-Protein.
Die gepoolten Fraktionen H4, zusammengesetzt aus den Fraktionen, die von der Heparin-Affinitätssäule über den Salzbereich von 450–720 mM NaCl eluierten. Beim Quervernetzungstest enthielt H4 drei Proteine mit MG von ca. 50 kDa, 58 kDa und 108 kDa.
B. Ionenaustauschchromatographie mit UNO-Q- und UNO-S-Säulen. Nach der Heparin-Chromatographie wurde die gepoolte Fraktion H4 auf einer PD10-Säule in Puffer QA [50 mM NaCl (pH 7,5), 1 mM EDTA] entsalzt und dann auf eine UNO-Q-Anionenaustauschsäule (Bio-Rad) geladen. Bei einer auf 1 ml/min gesetzten Flußrate wurde gebundenes Protein mit einem ansteigenden Salzgradienten von 0 bis 1000 mM NaCl eluiert. Drei Anionen austausch-Fraktionen (A1, A2, A3) entsprachen Fraktionen, die von 130–260 mM, 260–400 mM und 400–530 mM NaCl gesammelt wurden. Die gepoolte Fraktion H1/2 wurde auf gleiche Weise ent salzt, auf eine UNO-Q-Anionenaustauschsäule geladen und eluiert.
Die Heparin-Fraktion H3 wurde in Puffer QA entsalzt, auf eine UNO-S-Kationenaustauschsäule (Bio-Rad) geladen und, bei der Flußrate von 1 ml/min über einen ansteigenden Salzgradienten von 0 bis 1000 mM NaCl eluiert. Alle gebundenen Proteine eluierten über den Bereich von 230–400 mM NaCl und wurden in einer einzigen Kationenaustauschfraktion (C1) gesammelt. Diese Anionen- und Kationenaustauschfraktionen wurden vor der Analyse durch EMSA und Quervernetzungstest mit dem ODN #5004 bei –80 °C aufbewahrt.
Ergebnisse. Dieser zweite Trennungsschritt trennte die in H4 vorhandenen 50-kDa-, 58 kDa- und 108 kDa-Proteine voneinander. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt (EMSA in Tafel A; Quervernetzung in Tafel B). Die frühe Fraktion (A1) enthielt zwei Proteine, BP2 und BP3, mit MG von 50 kDa und 58 kDa. Die mittlere Fraktion (A2) enthielt das 50-kDa-Protein zusammen mit dem 108-kDa-Protein. Die späte Fraktion (A3) enthielt das 108-kDa-Protein, BP1. Die Ladungsfraktion (Spur L) zeigte die 50-kDa-, 58-kDa- und 108-kDa-Proteine in dem Quervernetzungstest.
Die in H3 vorhandenen immunstimulatorische DNA bindenden Proteine BP3 und BP4 mit 50 kDa und 45 kDa wurden unter Verwendung von Kationenaustausch anstelle von Anionenaustausch getrennt. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt (EMSA in Tafel A und Quervernetzung in Tafel B). Das CpG-ODN #5004 wurde mit den folgenden Fraktionen verwendet: Spur 1, H3-Beladungsfraktion; Spur 2, ungebundene Fraktion; Spuren 4–10, Fraktionen 11, 13, 15, 17, 19, 21 und 23. Die C1-Fraktion enthielt BP3 und BP4.
C. Affinitätsaufreinigung mittels mit immunstimulatorischem ODN beschichteter Sepharosesäule. Eine Version des Phosphodiester-CpG-ODNs #2059 mit einer zusätzlichen Aminogruppe am 5'-Ende (SEQ ID NO: 10) wurde nach Herstelleranweisungen an NHS-aktivierte 1-ml-Sepharose-HiTrap-Säulen (Pharmacia) konjugiert.
Um die immunstimulatorische ODNs bindenden Proteine aufzureinigen, wurden die gepoolten Fraktionen aus der Ionenaustauschsäulenchromatographie, die dieselben Proteine enthielten, vereint und deren Puffer wurde zu glycerin- und detergenzfreiem DNA-Bindungspuffer auf PD10-Säulen (Pharmacia) geändert. Diese Proteinlösung wurde dann bei einer Flußrate von 100 μl/min auf die 1-ml-ODN-Sepharose-Säule aufgebracht. Nach Aufbringen der Probe wurde die Flußrate auf 200 μl/min erhöht. Beladene Säulen wurden dann mit 1 ml DNA-Bindungspuffer, versetzt mit zusätzlichen 100 mM NaCl und 20 μg/ml Poly(dI-dC)·Poly(dI-dC), gewaschen, gefolgt von einer zweiten Waschung mit 1 ml DNA-Bindungspuffer, versetzt mit zusätzlichen 200 mM NaCl. Es wurden schrittweise Elutionen mit 1 ml 0,5 M KCl in DNA-Bindungspuffer, 1 ml 1 M KCl in DNA-Bindungspuffer und 1 ml 1 M KSCN in DNA-Bindungspuffer durchgeführt. Die Elutionsfraktionen wurden bis zu den EMSA-, Quervernetzungs- oder Silberfärbungstests bei –80 °C aufbewahrt.
Ergebnisse. Ergebnisse von EMSA- und- Quervernetzungstests für Proteine, die aus Fraktion H1 mit markiertem CpG-ODN #5004 isoliert wurden, sind in den Tafeln A und B in 5 dargestellt. In jeder Tafel ist die linke Spur die Beladungsfraktion, die mittlere Spur ist das 0,5-M-KCl-Eluat und die rechte Spur ist das 1-M-KKCl-Eduard. Ein einzelnes Protein, BP2, mit einem scheinbaren MG von 58 kDa eluierte von der Anionenaustauschfraktion A1 bei 0,5 M KCl, und eine schwächere Bande bei 50 kDa, entsprechend BP3, eluierte bei 1 mM KCl. Diese zwei Banden stimmen mit den Quervernetzungsergebnissen aus Fraktion A1, wie oben beschrieben, überein. Wie in 7 dargestellt, waren bei Silberfärbungstests keine anderen Banden nachweisbar (Spuren 3 und 6 (0,5 M KCl) und Spur 4 (1 M KCl)).
Die Ergebnisse von EMSA- und Quervernetzungstests für Proteine, die mit markiertem CGG-ODN-#5004 aus Fraktion A3 isoliert wurden, sind in den Tafel A und B in 6 dargestellt. In jeder Tafel ist die linke Spur die Beladungsfraktion und die rechte Spur ist das 0,5-M-KKCl-Eluat. Wie in 6 dargestellt, eluierte ein einzelnes Protein, BP1, mit einem MG von 108 kDa von der Fraktion A3 bei 0,5 M KCl. Diese sehr dominante Bande stimmt mit dem oben diskutierten Quervernetzungsergebnis für Fraktion A3 überein. Obwohl der EMSA nur eine einzige ODN-bindende Bande in der A3-Fraktion zeigte, waren bei Silberfärbungstests mehrere schwache Proteinbanden bei niedrigeren MG sichtbar (Spur 5, 7). Von den Banden mit niedrigerem MG, die zusammen mit der sehr großen Menge des 108-kDa-Proteins vorhanden waren, wurde durch MS-Analyse herausgefunden, daß sie Abbauprodukte des Hauptproteins darstellen.
Die Ergebnisse von EMSA- und Quervernetzungstests für Proteine, die aus Fraktion Cl mit markiertem CpG-ODN #5004 isoliert wurden, sind in den Tafeln A und B in 9 dargestellt. In jeder Tafeln ist Spur 1 die Beladungsfraktion; Spuren 3–5, die 0,5-M-KCl-Eluat-Fraktionen 31–33; Spuren 6–8, die 1-M-KCl-Eluat-Fraktionen 36–38; und Spuren 9 und 10, die 1 M KSCN-Eluat-Fraktionen 42 und 43. Wie in 9 dargestellt, eluierte ein einzelnes Protein, BP4, mit einem MG von 45 kDa von der Fraktion Cl bei 0,5 M KCl. Ein zweites, markanteres Protein, BP3, mit einem MG von 50 kDa, eluiert bei 1 M KCl. Die Silberfärbungsanalyse ist in 10 dargestellt. Die Beladungen in 10 sind wie folgt: Spur 1, C1-Beladung; Spur 2, A1-Elution mit 500 mM KCl, enthaltend BP2; Spur 3, A1-Elution mit 1 M KCl, enthaltend BP3; Spur 4, C1-Elution mit 500 mM KCl, enthaltend BP4; Spur 5, C1-Elution mit 1 M KCl, enthaltend BP3; und Spur 6, C1-Elution mit 1-M-KSCN, enthaltend eine geringe Menge BP3.
BEISPIEL 3
Sequenzspezifität von isolierten immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen
Einzelne immunstimulatorische DNA bindende Proteine BP1–BP5 wurden nach den Verfahren, die in Beispiel 2 beschrieben sind, isoliert. In einem ersten Experiment wurden Kalt-Kompetitions-EMSAs unter Verwendung isolierter BP1, BP2, BP3 und BP4 mit 10 ng des digoxigeninmarkierten Phosphodiester-CpG-ODNs #5004 und verschiedener Mengen unmarkierter Phosphodiester-ODNs, ausgewählt aus: CpG-ODN #1619, methyliertes CpG-ODN #1765 und nicht-CpG-ODN #2049 durchgeführt. In einem ähnlichen Experiment wurde ein Kalt-Kompetitions-EMSA unter Verwendung von isoliertem BP5 mit 10 ng des digoxigeninmarkierten Phosphodiester-CpG-ODNs #5004 und verschiedenen Mengen von unmarkierten Phosphodiester-ODNs, ausgewählt aus: CpG-ODN #1619, methyliertes CpG-ODN #1765 und nicht-CpG-ODN #2049 durchgeführt. Gleichermaßen wurden in einem dritten Experiment Kalt-Kompetitions-EMSAs unter Verwendung isolierter BP1, BP2 und BP3 mit 10 ng digoxigeninmarkiertem CpG-ODN #5004 und verschiedenen Mengen von unmarkierten ODNs, ausgewählt aus: CpG-ODN #2059, Poly-T-ODN #5021 und Poly-C-ODN #5031 durchgeführt.
Ergebnisse. Einzelne isolierter immunstimulatorische DNA bindende Proteine zeigten individuelle Muster von Sequenzspezifität, wie durch das Kompetitions-EMSA-Verfahren gemessen wurde. Die Ergebnisse des ersten Experiments sind in 11 dargestellt. Die Spuren sind in allen Tafeln wie folgt: Spur 1 ist das angegebene Bindungsprotein mit 10 ng markiertem CpG-ODN #5004 allein. Bei den Spuren 2–4 wurde das CpG-ODN #1619 als Kaltkompetitor in Mengen von 300 ng, 30 ng bzw. 3 ng zugegeben. Bei den Spuren 5–7 wurde das methylierte CpG-ODN #1765 als Kaltkompetitor in Mengen von 300 ng, 30 ng bzw. 3 ng zugegeben. Bei den Spuren 8–10 wurde das Nicht-CpG-ODN #2049 als Kaltkompetitor in Mengen von 300 ng, 30 ng bzw. 3 ng zugegeben. Das CpG-ODN #1619 und das Nicht-CpG-ODN #2049 unterscheiden sich nur durch die Substitution eines GpC-Dinukleotids durch ein CpG-Dinukleotid.
Die Bindung von CpG-ODN an BP1 war hochkompetetiv mit anderen CpG-ODNs, mäßig kompetetiv mit methyliertem CpG und weniger kompetetiv mit Nicht-CpG-ODN. CpG und methyliertes CpG-ODN waren schwache Kompetitoren für BP2, wohingegen das Nicht-CpG-ODN überhaupt nicht zu konkurrieren schien. Sowohl CpG als auch methyliertes CpG-ODN konkurrierten sehr effektiv um BP3, während nicht-CpG-ODN schwach konkurrierte. Im Gegensatz dazu war die Bindung von CpG-ODN an BP4 schwach und gleichermaßen kompetetiv mit anderen CpG-ODNs, methyliertem CpG und nicht-CpG-artigem ODN.
Die Ergebnisse des zweiten Experiments sind in 12 dargestellt. Die Spuren dieser Figur entsprechen den Spuren in 11. Die Kompetition war mäßig bei CpG-ODN, schwächer beim methylierten CpG und noch schwächer beim Nicht-CpG-ODN. Dieses Muster war dem am ähnlichsten, das für BP2 in dem ersten Experiment beobachtet wurde.
In dem dritten Experiment zeigte BP1 keine Spezifität für Poly-T. BP2 und BP3 zeigten sehr starke Kompetition durch Poly-T, starke Kompetition durch unmarkiertes CpG-ODN und schwache Kompetition durch Poly-C.
BEISPIEL 4
Rückgratspezifität von isolierten immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen
Die in 2 dargestellten Quervernetzungstests legten nahe, daß mindestens bestimmte immunstimulatorische DNA bindende Proteine eine Rückgrat("backbone")präferenz besitzen. Quervernetzungstests wurden mit BP6, isoliert aus der Fraktion 17 des H1-Anionenaustausches von Beispiel 2, und 5'-digoxigeninmarkierten Paaren von Phosphodiester-ODNs (O-ODNs) und Phosphorthioat-ODNs (S-ODN) durchgeführt. Die ODN-Paare waren das CpG-O-ODN #5004 und das entsprechende S-ODN #5007; Poly-T-O-ODN #5017 und das entsprechende S-ODN #5018; Poly-C- O-ODN #5009 das entsprechende S-ODN #5030. Das 5'-digoxigeninmarkierte Nicht-CpG-O-ODN #5016 und das 3'-digoxigeninmarkierte CpG-O-ODN #5027 wurden ebenfalls eingesetzt.
Ergebnisse. BP6 zeigte eine Präferenz für S-ODN. Ergebnisse sind in 13 dargestellt. Die Spuren in 13 sind wie folgt: Spur 1, S-ODN #5007, Spur 2, O-ODN #5004; Spur 3, O-ODN #5027; Spur 4, O-ODN #5016; Spur 5, O-ODN #5017; Spur 6, 5-ODN #5018; Spur 7, O-ODN #5009; und Spur 8, S-ODN #5030. Nur Spuren mit S-ODN wiesen sichtbare Quervernetzungsprodukte auf.
BEISPIEL 5
Identifikation von isolierten immunstimulatorische DNA bindenden Proteinen
Identifikation der Bindungsproteine 1–4. Die Eluate A1, A3 und C1 aus der Ionenaustauschchromatographie wurden auf gleichermaßen bezeichneten ODN-beschichteten Affinitätssäulen (A1, A3 und C1) wie in Abschnitt C von Beispiel 2 beschrieben laufengelassen. Die Eluate von A1, A3 und C1 aus den ODN-beschichteten Affinitätssäule A1, A3 und C1 wurden entsalzt und mit Spin-Säulen von Centricon auf konzentriert. Proben der konzentrierten Eluate wurden auf denaturierender SDS-PAGE laufengelassen und die Proteinbanden durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht. Einzelne Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten, in dem Gel einer sequenzspezifischen Spaltung mit Schweine-Trypsin unterzogen, extrahiert und unter Verwendung einer C₁₈-Kartusche für die Analyse durch Massenspektroskopie gereinigt. In dem Gel in Titern von 0,5 pmol oder mehr vor handene Proteine können durch matrixunterstützte Laserdesorption/-ionisation (MALDI)-MS-Analyse analysiert werden, um einen Massen-Fingerabdruck der Proteinfragmentprodukte zu erhalten, der mit einer Datenbank von vorhergesagten Fragmenten, die aus vollständig sequenzierten Proteinen abgeleitet wurden, verglichen wird. Wenn das Protein in den Datenbanken nicht mit seiner vollständigen Aminosäuresequenz oder seiner vollständigen Kodierungsregion vorhanden ist, wenn die Ausgangsmenge niedriger ist als 0,5 pmol, oder wenn das Protein Teil einer Mischung ist, dann ist das Identifikationsverfahren der Wahl die Elektrospray-Ionisation-Tandem-Massenspektroskopie (ESI-MS). Die Analyse verschiedener Eluate durch MALDI-TOF-MS und ESI-MS wurde bei M-Scan Ltd. (Ascot, GB) durchgeführt.
Auf Grundlage der MS-Befunde wurde ein Western-Blot mit verschiedenen zytosolischen Extrakten und Fraktionen für Nukleolin durchgeführt. Die SDS-PAGE wurde wie vorher beschrieben durchgeführt. Kein ODN wurde verwendet. Das Gel wurde durch Elektroblot auf eine Biodyne-Plus-Membran (Pierce) übertragen, UV-quervernetzt und mit Blockierungslösung blockiert (Roche). Zur Detektion wurde ein monoklonaler Anti-Human-Nukleolin-Antikörper der Maus (C-23; sc-8031, Santa Cruz Biotech) 1:1000 als erster Antikörper und ein peroxidasekonjugiertes Anti-Maus-IgG vom Schaf (#A7282, Sigma) 1:10.000 als zweiter Antikörper verwendet. Der Nachweis wurde mit einem Chemilumineszenz-Detektions-Kit nach Anweisungen gemäß Anbieter (Roche) durchgeführt. Ein Röntgenfilm (Kodak) wurde für 1–10 min im Dunkeln ausgesetzt.
Ergebnisse. In dem 0,5-M-KCl-Eluat von der A3-Affinitätssäule vorhandenes BP1 wanderte bei der SDS-PAGE bei einem MG von 110 kDa. Durch "delayed extraction" (DE) MALDI-TOF-MS und ESI-MS wurde es als Nukleolin identifiziert, SwissProt Zugriffs-Nr. P19338. Nukleolin enthält vier RBDs und eine RGG-Domäne.
Das in dem von der A1-Affinitätssäule erhaltenen 0,5-M-KCl-Eluat enthaltene BP2 wanderte bei SDS-PAGE zu einem MG von 58 kDa. Durch DE-MALDI-TOF-MS und ESI-MS wurde es als Lupus-La-Protein, SwissProt Zugriffs-Nr. P05455, identifiziert, entsprechend Sjögren-Syndrom-Typ-B-Antigen La/SS-B-Protein. Von diesem Protein wird angenommen, daß es ein Transkriptionsterminationsfaktor ist, und es bindet an die 3'-Termini von nahezu allen naszierenden RNA-Polymerase-III-Transkripten. Lupus-La-Protein enthält ein einzelnes RBD.
Das in dem von der C1-Affinitätssäule erhaltenen 1-M-KCl-Eluat enthaltene BP3 wanderte bei SDS-PAGE zu einem MG von 50 kDa. Durch MALDI-MS und ESI-MS wurde es als eine Isoform von hnRNP D identifiziert, entsprechend den SwissProt Zugriffs-Nrn. Q14100 und Q12771. Isoformen von hnRNP D besitzen einen errechneten pI nahe 8,8 und wandern bei SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) zu höheren scheinbaren Molekulargewichten als vorhergesagt. Kajita Y et al (1995) J Biol Chem 270: 22167–22175. AUF1 und hnRNP enthalten beide jeweils zwei RBDs und drei RGG-Motive.
Das in dem von der C1-Affinitätssäule erhaltenen 0,5-M-KCl-Eluat enthaltene BP4 wanderte bei SDS-PAGE zu einem MG 45 kDa. Durch MALDI-MS und ESI-MS wurde es als hnRNP A1, SwissProt Zugriffs-Nr. P09651, identifiziert. HnRNP A1 enthält ebenfalls zwei RBDs und ein RGG-Motiv.
Die Ergebnisse des Westernblots für Nukleolin sind in 14 dargestellt. In der linken Tafel repräsentieren die Spuren Zytosol von den folgenden menschlichen Zelltypen: N, NK-Zellen; J, Jurkat-T-Zellen; H, HeLa-Zellen; und R, Ramos-T-Zellen. Nukleolin-Färbung war bei allen Zelltypen vorhanden, allerdings mit zellspezifischen Mustern. In der rechten Tafel entsprechen die Spuren dem Ramos-Zytosol, den Heparin-Affinitätsfraktionen H1–H4 und isoliertem BP1. BP1 färbte eindeutig sehr kräftig und zeigte eine vorherrschende Bande bei etwa 112 kDa. In der A4-Fraktion färbte diese Bande sowie eine andere bei 108 kDa stark, während in H3 eine geringere Menge der 112-kDa-Bande und keine für die 108-kDa-Bande beobachtet wurde. Diskrete Banden bei niedrigeren MG, die möglicherweise Abbauprodukte von intaktem Nukleolin repräsentieren, waren in den Fraktion H3 und H4 ebenfalls anwesend. In den H1- oder H2-Fraktionen wurde keinerlei Färbung beobachtet.
Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß das ssDNA-bindende Protein Nukleolin, zusammen mit hnRNP D, den B-Zellproliferations-induzierenden Transkriptionsfaktor LR1 bildet, und daß hnRNP im allgemeinen Heterokomplexe im Zellkern bilden, wird erwartet, daß alle vier identifizierten Proteine, möglicherweise in verschiedenen Stöchiometrien, bei der Bildung eines oder mehrerer sequenzspezifischer ssDNA (ODN) bindender Komplexe beteiligt sein können. Von der Bindungsspezifität wird erwartet, daß sie von einzelnen Komponenten in einem gegebenen Komplex abhängt und aufrechterhalten wird. Da von Nukleolin beschrieben ist, daß es an der Zelloberfläche exprimiert wird und zwischen der Außenseite der Zelle und dem Nukleolus pendelt, wird von Nukleolin erwartet, daß es, komplexiert zusammen mit bestimmten RNA-bindenden Proteinen (z. B. hnRNP A1, hnRNP D, AUF1, oder Lupus-La-Protein) nicht nur eine CpG-spezifische Bindung an ODNs vermittelt, sondern auch spezifische transkriptionelle Ereignisse innerhalb des Zellkerns der Zelle steuert.
Die vorgeschlagenen drei Sätze immunstimulatorischer DNA bindende Proteine mit verschiedenen MG zeigen offenbar verschiedene Affinitäten für Phosphorthioat- oder Phosphodiester-ODNs, wenn sie unabhängig voneinander in Quervernetzungstests analysiert werden. Es wird angenommen, daß diese Unterschiede, die in vitro beobachtet werden, für die In-vivo-Affinität dieser ODNs repräsentativ sind und darauf hindeuten, daß Bindungsproteine, die zusammen als ein Komplex agieren, eine solche Bindungsselektivität durch die kombinierten Beiträge der jeweiligen Bindungsaffinitäten der einzelnen Bindungsproteine bewirken können.
Das von uns als Nukleolin identifiziertes 108-kDa-Protein zeigt starke Affinität für Phosphorthioat- und Phosphodiester-ODNs. Dies kann ausschlaggebend für Nukleolin sein, das als Oberflächenrezeptor für Phosphorthioat-ODNs fungiert. Im Gegensatz dazu zeigen die Proteine im niedrigeren MG-Bereich keine starke Affinität zu Phosphorthioat-ODNs. Stattdessen zeigen die 58-kDa- und 50-kDa-Proteine eine klare Sequenzspezifität für immunstimulatorische ODNs und eine besonders hohe Affinität für POLY-T-ODNs. Komplexe, die mehr als eines dieser Proteine enthalten, können daher ein verschiedenartiges Muster von Sequenzspezifitäten bei der ssDNA/ODN-Bindung zeigen. Nukleolin kann als ein Hauptprotein in diesen Komplexen fungieren, wobei es eines der oder alle anderen Proteine wie beispielsweise hnRNP A1, hnRNP D, AUF1 oder Lupus-La-Protein (und andere, nicht-ODN-bindende Proteine auch) zur Ausübung spezifischer Funktionen bei der ODN-Erkennung rekrutiert.
Es wird erwartet, daß die Funktion dieser Komplexe in vivomit der hochaffinen Bindung eines breiten Spektrums von ODNs durch Nukleolin, an der Zelloberfläche und/oder im Zytoplasma, beginnt, und zusammen mit anderen zytosolischen RNA bindenden Proteinen, z. B. verschiedenen hnRNPs und Lupus-La-Protein, sequenzspezifische Komplexe bilden. Möglicherweise werden ODNs mit bestimmten Sequenzen zu hochaffinen Proteinen weitergeleitet. Die Verlagerung von mindestens einem Bestandteil des Komplexes in den Zellkern führt zur Steuerung von transkriptionellen Ereignissen. Alternativ könnten immunstimulatorische DNA bindende Proteine im Zytosol verbleiben und das Prä-mRNA-Prozessing, den Transport von mRNA aus dem Nukleolus und/oder die Translation blockieren. Im Zytosol verbleibende immunstimulatorische DNA bindende Proteine könnten auch davon abgehalten werden oder dazu angeregt werden, an instabile mRNA zu binden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Screening-Verfahren zur Identifizierung von in Frage kommenden Liganden, die an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein binden und als Funktions-Modifikator immunstimulatorischer DNA agieren, umfassend das: Inkontaktbringen eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins mit einer Probe, die mindestens einen in Frage kommenden Liganden für ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein enthält, wobei das immunstimulatorische DNA bindende Protein ein RNA-bindendes Protein ist, Feststellen, ob der mindestens eine in Frage kommende Ligand des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins das immunstimulatorische DNA bindende Protein bindet, und Feststellen, ob der mindestens eine in Frage kommende Ligand des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins, der an das immunstimulatorische DNA bindende Protein bindet, zur Gruppe der Funktions-Modifikatoren immunstimulatorischer DNA gehört, bestehend aus: Inhibitoren der Bindung immunstimulatorischer DNA, Imitatoren immunstimulatorischer DNA, Agonisten immunstimulatorischer DNA und Antagonisten immunstimulatorischer DNA.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Binden des in Frage kommenden Liganden an das immunstimulatorische DNA bindende Protein unter Verwendung einer Methode festgestellt wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Elektromobilitätsshift-Assay (EMSA), enzymgekoppelter Immunassay (ELISA), Oberflächen-Plasmon-Resonanz (BIA), Fluorimetrie, Biolumineszenz, Refraktometrie, Autoradiographie, Autoradiometrie, Polymerasekettenreaktion (PCR) und Szintillationsdetektion.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Feststellens, ob der wenigstens eine in Frage kommende Ligand des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins, der an das immunstimulatorische DNA bindende Protein bindet, zur Gruppe der Funktions-Modifikatoren immunstimulatorischer DNA gehört, das Inkontaktbringen des in Frage kommenden Liganden, der an das immunstimulatorische DNA bindende Protein bindet, mit einer Immunzelle und Messen der Antwort der Immunzelle umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, weiter umfassend das Inkontaktbringen eines immunstimulatorischen Referenz-ODNs mit einer Immunzelle.
Screening-Verfahren zur Identifizierung eines immunstimulatorische DNA bindenden Kompetitoren, umfassend: Inkontaktbringen eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins mit einer Probe, die mindestens eine in Frage kommende Kompetitor-Verbindung und ein immunstimulatorisches Referenz-ODN enthält, wobei das immunstimulatorische DNA bindende Protein ein RNA-bindendes Protein ist, und Feststellen einer ersten Menge von in Gegenwart der Probe an das immunstimulatorische DNA bindende Protein gebundenem immunstimulatorischen Referenz-ODN im Vergleich zu einer zweiten Menge von in Abwesenheit einer Kompetitor- Verbindung zu der immunstimulatorischen DNA an das immunstimulatorische DNA bindende Protein gebundenem immunstimulatorischen Referenz-ODN, wobei die Probe mindestens eine in Frage kommende Kompetitor-Verbindung beinhaltet, wenn die erste Menge geringer ist als die zweite Menge.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Probe und das immunstimulatorische Referenz-ODN mit dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gleichzeitig oder nacheinander in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Menge von gebundenem immunstimulatorischen Referenz-ODN unter Verwendung einer Methode bestimmt wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: EMSA, ELISA, BIA, Fluorimetrie, Biolumineszenz, Refraktometrie, Autoradiographie, Autoradiometrie, PCR und Szintillationsdetektion.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 5, wobei der mindestens eine in Frage kommende Ligand gemäß Anspruch 1 oder die mindestens eine in Frage kommende Kompetitor-Verbindung zur immunstimulatorischen DNA gemäß Anspruch 5 ein isoliertes Molekül ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Polynukleotiden, Peptidnukleinsäuren, Polypeptiden, Kohlenhydraten, Lipiden, Hormonen, kleinen organischen Molekülen, kleinen anorganischen Molekülen, Varianten eines mindestens eine Substitution einer Bindung vom Phosphorthioat-Typ durch eine Phosphodiesterbindung enthaltenden immunstimulatorischen Referenz-ODN-Moleküls, Varianten eines mindestens eine Substitution einer Phosphodiesterbindung durch eine Bindung vom Phosphorthioat-Typ enthaltenden immunstimulatorischen Re ferenz-ODN-Moleküls, Varianten eines mindestens eine Substitution einer Bindung vom Phosphorthioat-Typ durch eine andere Bindung vom Phosphorthioat-Typ enthaltenden immunstimulatorischen Referenz-ODN-Moleküls, und Varianten eines mindestens eine Substitution eines Nukleotids durch ein anderes Nukleotid enthaltenden immunstimulatorischen Referenz-ODN-Moleküls.
Verfahren nach Anspruch 5, weiter umfassend die Schritte des Inkontaktbringens der Kompetitor-Verbindung zur immunstimulatorischen DNA mit einer Immunzelle und Messens der Antwort der Immunzelle zur Feststellung, ob die Kompetitor-Verbindung zur immunstimulatorischen DNA ein Funktions-Imitator einer immunstimulatorischen DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 5, weiter umfassend die Schritte des Inkontaktbringens der Kompetitor-Verbindung zur immunstimulatorischen DNA und eines immunstimulatorischen Referenz-ODNs mit einer Immunzelle und Messens der Antwort der Immunzelle zur Feststellung, ob die Kompetitor-Verbindung zur immunstimulatorischen DNA ein Inhibitor immunstimulatorischer DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 10, wobei der in Frage kommende Ligand und das immunstimulatorische Referenz-ODN gemäß Anspruch 4 oder die Kompetitor-Verbindung zur immunstimulatorischen DNA und das immunstimulatorische Referenz-ODN gemäß Anspruch 10 gleichzeitig oder nacheinander mit der Immunzelle in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 9 oder 10, wobei die Antwort der Immunzelle gemessen wird durch: (a) Feststellung einer Menge von mindestens einem durch die Immunzelle ausgeschiedenen Zytokin; (b) Feststellung einer Menge eines durch die Immunzelle ausgeschiedenen Antikörpers; (c) Feststellung eines Isotyp eines durch die Immunzelle ausgeschiedenen Antikörpers; (d) Feststellung der Expression von mindestens einem Zelloberflächenmolekül auf der Immunzelle; (e) Feststellung der Aktivierung von mindestens einer zellulären Kinase der Immunzelle; oder (f) Feststellung einer Änderung des Redoxpotentials der Immunzelle.
Verfahren zur Optimierung eines immunstimulatorischen ODNs zur Immunstimulation, umfassend das: Bereitstellen eines immunstimulatorische DNA bindenden Proteins, eines an das immunstimulatorische DNA bindende Protein bindenden immunstimulatorischen Referenz-ODNs und mindestens eines in Frage kommenden optimierten immunstimulatorischen ODNs, das sich von dem immunstimulatorischen Referenz-ODN durch mindestens ein Nukleotid oder mindestens eine Internukleotidverbindung unterscheidet, wobei das immunstimulatorische DNA bindende Protein ein RNA-bindendes Protein ist, Inkontaktbringen des immunstimulatorische DNA bindenden Proteins mit einer Probe, die mindestens ein in Frage kommendes optimiertes immunstimulatorisches ODN und das immunstimulatorische Referenz-ODN enthält, Feststellen, welches in Frage kommende optimierte immunstimulatorische ODN, sofern vorhanden, an das immunstimulatorische DNA bindende Protein in größerem Umfang als das immunstimulatorische Referenz-ODN bindet, Neubestimmen eines in Frage kommenden optimierten immunstimulatorischen ODNs, das an das immunstimulatorische DNA bindende Protein in größerem Umfang als das immunstimulatorische Referenz-ODN bindet, als immunstimulatorische Referenz-DNA, und Wiederholen der Schritte des Bereitstellens, Inkontaktbringens, Feststellens und Neubestimmens, bis kein in Frage kommendes optimiertes immunstimulatorisches ODN das immunstimulatorische DNA bindende Protein besser als das immunstimulatorische Referenz-ODN, mit dem es verglichen wird, bindet.
Verfahren zur Identifizierung zellulärer Ziele eines immunstimulatorischen ODNs, umfassend das: Screening einer Reihe von in Frage kommenden Zielmolekülen mit einem zwischen einem immunstimulatorischen ODN und einem immunstimulatorische DNA bindenden Protein gebildeten Komplex, wobei das immunstimulatorische DNA bindende Protein ein RNA-bindendes Protein ist, Auswählen der in Frage kommenden, an den Komplex bindenden, Zielmoleküle, und Feststellen der Sequenz der gebundenen in Frage kommenden Zielmoleküle zur Identifizierung der zellulären Ziele des immunstimulatorischen ODNs.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Reihe von in Frage kommenden Zielmolekülen (a) eine cDNA-Bibliothek; (b) ein Nukleinsäure-Mikrochip; oder (c) eine Polypeptid-Bibliothek ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Komplex zusammengesetzt ist aus einem immunstimulatorischen ODN, angebunden an ein immunstimulatorische DNA bindendes Protein.
Isolierter Immunstimulatorisches-ODN-immunstimulatorische-DNA-bindendes-Protein-Komplex, wobei das immunstimulatorische DNA bindende Protein ein RNA-bindendes Protein ist.
Komplex nach Anspruch 17, wobei das immunstimulatorische ODN (a) an das immunstimulatorische DNA bindende Protein angebunden ist; oder (b) mit dem immunstimulatorische DNA bindenden Protein assoziiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 5, 10, oder ein Komplex nach Anspruch 17, wobei das immunstimulatorische Referenz-ODN gemäß Anspruch 4 oder 10, die mindestens eine in Frage kommende Kompetitor-Verbindung zur immunstimulatorischen DNA gemäß Anspruch 5 oder das immunstimulatorische ODN gemäß Anspruch 18 (a) ein Phosphorthioat-ODN; (b) ein CpG-ODN; (c) ein T-reiches ODN, vorzugsweise ein Poly-T-ODN; oder (d) ein Poly-G-ODN ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 5 oder 14, oder ein Komplex nach Anspruch 17, wobei der in Frage kommende Ligand gemäß Anspruch 1, das immunstimulatorische Referenz-ODN gemäß Anspruch 5, das immunstimulatorische ODN gemäß Anspruch 14 oder 17, das immunstimulatorische DNA bindende Protein gemäß Anspruch 14 oder 17 oder das in Frage kommende Zielmolekül gemäß Anspruch 14 mit einem Marker markiert ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Digoxigenin, Biotin, einem Isotop, Fluorophor und einem Enzym.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 14, oder Komplex nach Anspruch 17, wobei das immunstimulatorische Referenz-ODN gemäß Anspruch 5 oder das immunstimulatorische ODN gemäß Anspruch 14 oder 17 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO: 1 (#2059), SEQ ID NO: 2 (#2080), SEQ ID NO: 3 (#1619), SEQ ID NO: 11 (#5007) und SEQ ID NO: 12 (#5004).
Kit zur Identifizierung zellulärer Ziele eines immunstimulatorischen ODNs, umfassend: ein immunstimulatorisches ODN in einem Behälter, ein immunstimulatorischen DNA bindendes Protein in einem Behälter, wobei das immunstimulatorische DNA bindende Protein ein RNA-bindendes Protein ist, und Anweisungen zur Herstellung eines immunstimulatorisches-ODN-immunstimulatorische-DNA-bindendes-Protein-Komplexes und zur Verwendung des Komplexes zum Screening einer Reihe von in Frage kommenden Zielmolekülen zur Identifizierung zellulärer Ziele eines immunstimulatorischen ODNs
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 5, 13 oder 14, ein Komplex nach Anspruch 17 oder ein Kit nach Anspruch 22, wobei das immunstimulatorische DNA bindende Protein (a) ein Einzelstrang-DNA bindendes Protein ist; (b) ein RNA-bindendes Protein ist, das mindestens ein Motiv aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RBD, RGG-Domäne, KH-Motiv und ARM; (c) ein RNA-bindendes Protein ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus hnRNPs, Nukleolin und Lupus-La-Protein; (d) ein RNA-bindendes Protein ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nukleolin, hnRNP D, AUF1, hnRNP A1 und Lupus-La-Protein; oder (e) Teil eines Komplexes ist, umfassend ein Protein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nukleolin, Lupus-La-Protein, hnRNP D, AUF1 und hnRNP A1.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 5, wobei der in Frage kommende Ligand gemäß Anspruch 1, oder die in Frage kommende Kompetitor-Verbindung zu immunstimulatorischer DNA gemäß Anspruch 5 Teil einer kombinatorischen Bibliothek von Verbindungen ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 5, wobei das immunstimulatorische DNA bindende Protein an ein Substrat angeheftet ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Kunststoff-Multiwellplatte, einer Perle, einem Harz, einem Filter, einem Glas-Objektträger, einem BIAcore-Chip und einem Silizium-Chip.