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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Zahnschmelzmatrix,
Zahnschmelzmatrix-Derivaten und/oder Zahnschmelzmatrix-Proteinen
oder -Peptiden als therapeutische oder prophylaktische Mittel in
Verbindung mit Transplantation bei nicht-mineralisiertem Gewebe.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Zahnschmelzmatrix-Proteine
wie jene, die in der Zahnschmelzmatrix vorhanden sind, sind insbesondere
als Vorläufer
von Zahnschmelz bekannt. Über
Zahnschmelz-Proteine und Zahnschmelzmatrix-Derivate wurde kürzlich in
der Patentliteratur beschrieben, dass sie die Bildung von hartem
Gewebe (d. h. Zahnschmelzbildung, US-Patent 4,672,032 (Slavkin))
oder die Bindung zwischen harten Geweben (EP-B-0 337 967 und EP-B-0
263 086) induzieren. Somit konzentriert sich der Stand der Technik
allein auf die Regeneration harter Gewebe, während die vorliegende Erfindung
sich mit günstigen
Wirkungen auf die Transplantation von weichem Gewebe beschäftigt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass Zahnschmelzmatrix,
Zahnschmelzmatrix-Derivate und/oder Zahnschmelzmatrix-Proteine (die
im Folgenden zusammenfassend „eine
aktive Zahnschmelzsubstanz" genannt
werden) günstige
Mittel zur Verstärkung
oder Verbesserung des Anhaftens oder der Heilung von Transplantaten
bei nicht-mineralisiertem Gewebe sind. Wie hierin im experimentellen
Teil gezeigt, zeigen die Zahnschmelzmatrix, Zahnschmelzmatrix-Derivate
und/oder Zahnschmelzmatrix-Proteine besonders nützliche Wirkungen bei der Heilung
von Hauttransplantaten.
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Dementsprechend
bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung einer Zusammensetzung
einer aktiven Zahnschmelzsubstanz zur Herstellung einer pharmazeutischen
oder kosmetischen Zusammensetzung zur Förderung der Transplantatannahme
bei nicht-mineralisiertem
Gewebe. Es wird vorweggenommen, dass zusätzlich zu der Heilung selbst
das Ausmaß der
Narbenbildung, die oft mit Transplantatverfahren einhergeht, durch
eine solche Verwendung reduziert werden kann.
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Im
vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck „Transplantatannahme" den gesamten Heilungsprozess
angeben, der bei dem Transplantationsverfahren von dem anfänglichen
Anhaften des Transplantats, zu Proliferation von Fibroblasten, Erzeugung
eines Granulationsgewebes, Erzeugung von Kollagen durch Fibroblasten
und Revaskularisierung, und, im Falle von Oberflächentransplantaten wie Haut-
oder Schleimhauttransplantaten, Wanderung von Keratinozyten in das
Transplantatbett, umfasst ist. Der Ausdruck „Säugetier" soll ein Mitglied einer Säugetierart
angeben, welches vorteilhafterweise mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
behandelt werden kann, einschließlich domestizierter Säugetiere
wie Pferde, Rinder, Schweine, Hunde und Katzen, oder, bevorzugt,
Menschen.
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DETAILLIERTE
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Basierend
auf den derzeitigen Erkenntnissen der Erfinder glaubt man, dass
die aktive Zahnschmelzsubstanz besonders vorteilhaft zur Verwendung
in Verbindung mit Transplantaten aus nicht-mineralisiertem Gewebe
wie beispielsweise weichem Gewebe, das einen wesentlichen Anteil
von Epithelzellen umfasst, wie beispielsweise Haut und Schleimhaut,
ist. Jedoch kann die aktive Zahnschmelzsubstanz auch erfolgreich
in Verbindung mit Transplantaten anderer Gewebe mit höheren regenerativen
Eigenschaften verwendet werden, wie beispielsweise Knorpel, oder
sogar in Verbindung mit Hornhauttransplantaten.
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Haut- und
Schleimhaut-Transplantation
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In
der dermatologischen Chirurgie werden Transplantate am häufigsten
verwendet, um Läsionen,
die nach chirurgischem Ausschneiden auftreten, wie dem Entfernen
von Hautkrebs, und traumatische Läsionen, z. B. solche die aus
Unfällen,
Verbrennungen (ob nun thermal, chemisch oder elektrisch) oder pathologischen Prozessen
herrühren,
z. B. von Bein- oder Fuß-Geschwüren, zu
versorgen.
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Abhängig von
dem Läsionstyp,
der durch Transplantation versorgt werden soll, z. B. abhängig davon, ob
es eine tiefe oder eher oberflächliche
Läsion
ist, und von dem Ort der Läsion,
z. B. davon, ob das Rezipienten-(Transplantat-)Bett eine ausreichende
vaskuläre
Versorgung für
kapillares Wiederwachstum umfasst oder ob das Gewebe an der Rezipientenstelle
freiliegender Knochen, Knorpel oder ein Band ist, welches keine ausreichende
vaskuläre
Versorgung enthält,
werden normalerweise unterschiedliche Transplantattypen angewendet.
Daher wurden Vollhauttransplantate traditionell verwendet, um Gesichtsläsionen zu
versorgen, da solche Transplantate oft ein ästhetisch ansprechenderes Ergebnis
hervorbringen. „Vollhauttransplantate" sollen auf Transplantate
hindeuten, welche sowohl aus der Epidermis als auch der gesamten
Dicke der Dermis bestehen, einschließlich der Strukturen wie Haarfollikeln,
Schweißdrüsen und
Nerven. Vollhauttransplantate werden daher auch zur Verwendung in
Verbindung mit Haartransplantaten bevorzugt. Bei der Durchführung der Vollhauttransplantationen
wird die Donorhaut an einer geeigneten Stelle ausgeschnitten und
entfettet (d. h. Fettgewebe wird von dem Transplantat entfernt).
Das Rezipienten-Bett wird mit einem antibakteriellen Mittel gereinigt
und gespült.
Das Transplantat wird auf geeignete Weise auf die Größe der Rezipientenstelle
zugeschnitten und mit der Dermis nach unten auf das Rezipienten-Bett
platziert. Das Transplantat wird dann durch Nähen gesichert und kann mittels
eines geeigneten Wundverbands oder einer Bandage weiter immobilisiert werden.
Während
Vollhauttransplantate von einem ästhetischen
Standpunkt aus dazu neigen, die besten Ergebnisse hervorzubringen,
ist die Transplantatannahme oft schwieriger zu erreichen, da die
Revaskularisierung des Transplantats erforderlich ist.
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Ein
anderer Transplantattyp ist das Spalthauttransplantat, das sich
aus der gesamten Dicke der Epidermis und einem Teil der Dicke der
Dermis zusammensetzt. Diese haben den Vorteil, weniger Gewebe zur Revaskularisierung
zu enthalten, und es ist eher wahrscheinlich, dass diese bei verschiedenen
Arten von Rezipienten-Betten erfolgeich sind als bei Vollhauttransplantaten
zu erwarten. Spalthauttransplantate werden oft verwendet, um ausgedehntere
Läsionen
zu bedecken, aber sie sind oft ästhetisch
weniger attraktiv als die Vollhauttransplantate. Um große Läsionen wie
ausgedehnte Verbrennungen zu bedecken, können Spalthauttransplantate
als Streu- oder Netz-Transplantate verwendet werden, was bedeutet,
dass das Transplantat in kleinere Teile (wie Streifen) geteilt wird
und auf die Läsion
aufgebracht wird. Neues Epithelwachstum findet dann ausgehend von
jedem der Hautteile statt, die auf die Läsion transplantiert wurden.
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Kürzlich wurde
eine Reihe von Hautäquivalenten
entwickelt, entweder aus biotechnologischen Epidermiszellen wie
Fibroblasten und Keratinozyten, oder aus azellulärer Hautmatrix. Beispiele von
kultivierten epidermalen Zellen umfassen humane Fibroblasten (abgeleitet
von neonataler Vorhaut), welche von Novartis unter dem Handelsnamen
Appligraf vermarktet werden, und Hautgewebezellen, die von Smith & Nephew unter dem
Handelsnamen Dermagraft und Dermagraft TC vermarktet werden. Andere
Beispiele umfassen kultivierte Keratinozytentransplantate, kultivierte
allogenische Keratinozytentransplantate, azelluläre Kollagenmatrizes und zelluläre Matrizes
(wie in einem Übersichtsartikel
zusammengefasst z. B. in WH Eaglstein und V. Falanga, Cutis 62 (1.
Anhang), Juli 1998, S. 1–8).
Ein Beispiel eines azellulären
Produktes ist AlloDerm, das von LifeCell Corp. hergestellt wird.
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Knorpeltransplantate
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Es
wurde zuvor offenbart (B Rahfoth et al., Osteoarthritis Cartilage
6(1), 1998, S. 50–65),
dass Schäden
von Gelenkknorpel in Knien und anderen Gelenken mittels Implantaten
repariert werden können,
die sich aus Chondrozyten zusammensetzen, die in eine Trägermatrix
wie Agarose eingebettet sind. Es wird erwartet, dass die Aufnahme
einer aktiven Zahnschmelzsubstanz in solche Implantate die Heilung
des Transplantats wesentlich stimulieren kann.
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An
Stellen der Transplantatanhaftung besteht ein erhöhtes Risiko,
dass das neue Gewebe, das an der Fläche zwischen dem transplantierten
Gewebe und dem Rezipienten-Bett gebildet wird, sich strukturell
und chemisch vom ursprünglichen
Gewebe unterscheidet (Narbengewebe). In dem frühen Stadium der Gewebereparatur
ist ein Prozess, der fast immer beteiligt ist, die Bildung eines
transienten Bindegewebes im Bereich der Gewebeverletzung. Dieser
Prozess beginnt mit der Bildung einer neuen extrazellulären Kollagenmatrix
durch Fibroblasten. Diese neue extrazelluläre Kollagenmatrix bildet dann
während
des Endheilungsprozesses die Grundlage für ein Bindegewebe. Die Endheilung
ist in den meisten Geweben eine Narbenbildung, die Bindegewebe enthält. In Geweben,
welche regenerative Eigenschaften besitzen, wie Haut und Knochen,
umfasst die Endheilung die erneute Bildung des ursprünglichen
Gewebes. Dieses regenerierte Gewebe besitzt häufig ebenfalls gewisse Narbeneigenschaften,
z. B. eine Verdickung der geheilten Knochenfraktur.
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Die
Stufen der Transplantatanhaftung und -heilung umfassen normalerweise
eine Entzündung
(normalerweise 1–3
Tage), die Migration (normalerweise 1–6 Tage), die Proliferation
(normalerweise 3–24
Tage) und die Reifung (normalerweise 1–12 Monate). Der Heilungsprozess
ist ein komplexer und wohl geordneter physiologischer Prozess, der
Migration, Proliferation und Differenzierung einer Vielzahl von
Zelltypen sowie die Synthese von Matrixkomponenten umfasst. Der
Heilungsprozess kann in die folgenden Phasen aufgeteilt werden:
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i) Hämostase und Entzündung
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Wenn
Blutplättchen
außerhalb
des Blutkreislaufssystems auftreten und Thrombin und Kollagen ausgesetzt
werden, werden sie aktiviert und sie aggregieren. Somit initiieren
Blutplättchen
den Reparaturprozess, indem sie aggregieren und einen temporären Pfropfen
bilden, um die Blutstillung sicherzustellen und das Eindringen von
Bakterien zu verhindern. Die aktivierten Blutplättchen initiieren das Blutgerinnungssystem
und setzen Wachstumsfaktoren wie Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor
(PDGF) und epidermale Wachstumsfaktoren (EGFs) und transformierende
Wachstumsfaktoren (TGFs) frei.
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Die
ersten Zellen, die in die Stelle einer Transplantation eindringen,
sind Neutrophile, gefolgt von Monozyten, welche von Makrophagen
aktiviert werden.
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Die
Hauptrolle der Neutrophilen scheint es zu sein, das Rezipienten-Bett
am Transplantatort von Bakterien zu befreien oder das Transplantat
gegen kontaminierende Bakterien zu verteidigen, und die Heilung
des Transplantats zu verbessern, indem tote Zellen und Blutplättchen entfernt
werden. Die Infiltration durch Neutrophile stoppt ungefähr innerhalb
der ersten 48 Stunden, vorausgesetzt, dass keine bakterielle Kontamination in
der Wunde vorhanden ist. Überschüssige Neutrophile
werden von Gewebemakrophagen phagozytiert, die aus dem zirkulierenden
Pool Blut-transportierter Monozyten rekrutiert werden. Man glaubt,
dass Makrophagen für
eine effiziente Wundheilung essentiell sind, da sie auch für die Phagozytose
von pathogenischen Organismen und das Befreien von Gewebedebris
verantwortlich sind. Außerdem
setzen sie zahlreiche Faktoren frei, die an den nachfolgenden Ereignissen
des Heilungsprozesses beteiligt sind. Die Makrophagen ziehen Fibroblasten
an, welche mit der Produktion von Kollagen beginnen.
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ii) Bildung von Granulationsgewebe
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Innerhalb
von 48 Stunden nachdem ein Transplantat aufgebracht wurde beginnen
Fibroblasten zu poliferieren und aus dem Bindegewebe am Rande des
Transplantats in den Ort der Transplantation zu wandern. Man fand überraschenderweise
heraus, dass die Anwendung der aktiven Zahnschmelzsubstanz am Transplantatort
die Fibroblasten dazu stimuliert, Kollagene und Glykosaminoglykane
zu produzieren, welche an der Anhaftung des Transplantats an das
Transplantatbett teilnehmen. Unter anderem stimuliert ein niedriger
Sauerstoffzug bei dem Transplantat die Proliferation von Epithelzellen,
welche ein Kapillarnetzwerk hervorbringen. Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise
herausgefunden, dass das Aufbringen der aktiven Zahnschmelzsubstanz
auf das Rezipienten-Bett,
bevorzugt vor dem Aufbringen des Transplantats, die Proliferation von
Fibroblasten und deren Produktion von einer Reihe von Wachstumsfaktoren
wie TGF-β,
PDGF und Interleukin-6 stimuliert. Man leitet davon ab, dass die
aktive Zahnschmelzsubstanz die Prozesse, insbesondere die Bildung
eines Granulationsgewebes, das es einem Transplantat erlaubt, angenommen
zu werden, d. h. fest an das Rezipienten-Bett anzuhaften, fördert. Die
aktive Zahnschmelzsubstanz kann für eine Zeitspanne bis zu 72
Stunden bevor das Transplantat auf das Rezipienten-Bett aufgebracht
wird angewendet werden, um eine gewünschte Stimulierung von Fibroblasten
sicherzustellen, um die Aufnahme des Transplantats zu fördern.
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Kollagenasen
und Plasminogenaktivatoren werden von Keratinozyten sezerniert.
Wenn das Transplantat ungestört
und mit Sauerstoff und Nährstoffen
wohlgenährt
bleibt, wandern Keratinozyten in das Transplantat-Bett. Man glaubt,
dass Keratinozyten nur über
wachstumsfähiges
Bindegewebe wandern und dass die Keratinozyten dementsprechend über die
Ränder
des Transplantats in den Bereich unterhalb des toten Gewebes und
der Kruste der Wunde wandern.
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Man
sagt, dass eine klinische Heilung des Transplantats eingetreten
ist, wenn visuell keine Gewebeunterbrechung mehr beobachtet werden
kann und lediglich leichte Anzeichen einer Entzündung vorhanden sind, wie leichte
Rötung,
Exsudat oder ein leicht geschwollenes Gewebe. Zusätzlich gibt
es keine Beschwerden über
Schmerz, wenn das transplantierte Gewebe entspannt oder unberührt ist.
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Wie
oben erwähnt,
bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Zahnschmelzmatrix,
Zahnschmelzmatrix-Derivaten und/oder Zahnschmelzmatrix-Proteinen
als Mittel, welches die Transplantatannahme bei nicht-mineralisiertem
Gewebe beschleunigt, stimuliert oder fördert.
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Es
wurde zuvor vorgeschlagen, dass Wachstumsfaktoren wie Epidermiswachstumsfaktor
(EGF), transformierender Wachstumsfaktor-α (TGF-α), Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor
(PDGF), Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs) einschließlich saurer
Fibroblastenwachstumsfaktor (α-FGF)
und basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (β-FGF), transformierender Wachstumsfaktor-β (TGF-β) und insulinähnliche Wachstumsfaktoren
(IGF-1 und IGF-2) Vermittler des Wundheilungsprozesses sind und
sie werden häufig
als Förderer
der Wundheilung zitiert, auch in Verbindung mit Transplantation;
tatsächlich können sie
jedoch zu Fibrose führen,
was wiederum selbst eine erfolgreiche Heilung stören kann. Obwohl eine Beschleunigung
der Heilung am ehesten eine Reduzierung des Risikos einer Infektion
und der daraus hervorgehenden Entzündung, die zu Narbenbildung
führen
kann, verspricht, waren therapeutische Versuche, den normalen Transplantatheilungsprozess
zu beschleunigen, mit relativ geringem Erfolg verbunden. Dies ist
auch wahrscheinlich, da der Reparaturprozess das konzertierte Einbinden
einer Reihe von Faktoren umfasst, siehe oben.
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Dazu
haben die gegenwärtigen
Erfinder beobachtet, dass in verschiedenen Zellkulturen von Fibroblasten
(embryonalen, dermalen, abgeleitet vom periodontalem Ligament, Fisch
oder Vogel) viermal so viel TGFβ1
in den Zellkulturen hergestellt wird, die mit EMDOGAIN® stimuliert
wurden, im Vergleich mit nicht-stimulierten Kulturen, wenn z. B.
mittels ELISA eine Probe des Kulturmediums untersucht wird. Der
Anstieg findet nach 24 Stunden Kultur statt, ist aber signifikanter
an den folgenden Tagen (Tag 3 und 4). Nach dem zweiten Tag ist auch
die Zellproliferation in Zellkulturen, die mit EMDOGAIN® stimuliert
wurden, erhöht.
Da TGFβ1
von zentraler Wichtigkeit bei der Epithelisierung von Haut- und
Schleimhauttransplantaten zu sein scheint, stützen diese Ergebnisse das Konzept
der vorliegenden Erfindung.
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Die
gegenwärtigen
Erfinder haben nun herausgefunden, dass Zahnschmelzmatrix, Zahnschmelzmatrixderivate
und/oder Zahnschmelzmatrixproteine Transplantat-heilende Eigenschaften
besitzen. Außerdem gibt
es Anzeichen dafür,
dass das Aufbringen von Zahnschmelzmatrix, Zahnschmelzmatrixderivaten
und/oder Zahnschmelzmatrixproteinen auf Transplantationsorte zu
verbesserter Anhaftung und/oder Heilung führt. Insbesondere haben die
Erfinder beobachtet, dass nach dem Aufbringen von Zahnschmelzmatrixproteinen und/oder
Zahnschmelzmatrixderivaten das Entzündungsstadium verkürzt ist
und die typischen Anzeichen wie Wärme, Rötung, Ödeme und Schmerz weniger auffällig sind,
und neue Gewebe schneller gebildet werden. Die beobachtete Zeit
zur Transplantatheilung (z. B. nach dermatologischer Chirurgie)
ist wesentlich verkürzt
im Vergleich mit chirurgischen Eingriffen ohne die Verwendung von
Zahnschmelzmatrix, Zahnschmelzmatrixderivaten und/oder Zahnschmelzmatrixproteinen.
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Ein
zusätzlicher
Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung
der aktiven Zahnschmelzsubstanz ist der, dass herausgefunden wurde,
dass sie Infektions-vermindernde Eigenschaften besitzt. Da Infektionen
eine häufige
Komplikation in Verbindung mit Transplantationen sind, welche zu
Transplantatabstoßung
oder zumindest zu einer gestörten
Heilung des Transplantats und einem erhöhten Risiko der Narbenbildung
führen
können,
tragen die Infektions-vermindernden Eigenschaften der aktiven Zahnschmelzsubstanz
zu den Verbesserungen bei der Anhaftung und der Heilung des Transplantats
bei, welche beobachtet werden, wenn die aktive Zahnschmelzsubstanz
verwendet wird. Insbesondere fand man heraus, dass die aktive Zahnschmelzsubstanz antibakterielle
Eigenschaften in dem Sinne aufweist, dass sie das Wachstum von Bakterien
unterdrückt.
Von besonderem Interesse für
den vorliegenden Zweck ist die Inhibierung von Bakterien, die Wundinfektionen
hervorrufen, insbesondere von Staphylokokken wie Staphylococcus
aureus.
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Die
therapeutische und/oder prophylaktische Aktivität der aktiven Zahnschmelzsubstanz
kann natürlich
durch in-vivo-Tests unter Verwendung von Versuchstieren (siehe Beispiel
2 unten) oder von Menschen bewiesen werden. Jedoch kann man einen
Hinweis auf die Wirksamkeit und/oder Aktivität der aktiven Zahnschmelzsubstanz
erhalten, indem man relativ einfache in-vitro-Tests durchführt, wie
z. B. Tests mit Zellkulturen.
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Außerdem gibt
es eine Reihe von Parametern, welche verwendet werden können, um
eine Transplantatheilungswirkung zu bewerten. Diese umfassen:
- – Computer-gestützte Planimetrie
(Bestimmung der Transplantatheilungsrate)
- – Laser-Doppler-Bildgebung
(Ermittlung der Transplantatperfusion)
- – Tensiometrie
(Ermittlung der Transplantatstärke)
- – Histopathologie/-zytologie
(mikroskopische Untersuchung von Transplantatgeweben und -flüssigkeiten)
- – Biochemie
(HPLC/RIA/ELISA) (Untersuchung verschiedener Arzneien und biochemischer
Komponenten der Gewebeheilung)
- – Elektrodiagnostiken
(Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Transplantatheilung und
Innervation)
- – Szintigraphie
(Radionuklidbildgebung von Transplantatgewebe)
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In
Verbindung mit der Präparation
der jeweiligen Stellen für
die Transplantation können
Wundausschneidung und Säuberung
des Transplantatbetts von besonderer Wichtigkeit sein. Man glaubt,
dass die Säuberung
und/oder die Wundausschneidung von Transplantatbetten vor der Transplantation
eine Voraussetzung für
die erfolgreiche Anhaftung des Transplantats und den Transplantatsheilungsprozess
sind. Man glaubt außerdem,
dass die aktive Zahnschmelzsubstanz ihre Wirkung auf frisches und
lebendiges Gewebe ausüben muss
und nicht auf totes oder kontaminiertes Gewebe. Die Wundausschneidung
von nektrotischem Gewebe kann mittels mindestens vier verschiedener
Verfahren durchgeführt
werden: (1) scharfer Wundausschnitt, (2) mechanischer Wundausschnitt,
(3) enzymatischer Wundausschnitt und (4) autolytischer Wundausschnitt.
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Zahnschmelzmatrix, Zahnschmelzmatrixderivate
und Zahnschmelzmatrixproteine
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Zahnschmelzmatrix
ist ein Actodental-abgeleiteter Vorläufer von Zahnschmelz und kann
aus jeder passenden natürlichen
Quelle erhalten werden, d. h. aus einem Säuger, bei dem sich die Zähne in der
Entwicklung befinden. Eine geeignete Quelle sind sich entwickelnde
Zähne von
geschlachteten Tieren wie beispielsweise Kälbern, Schweinen oder Lämmern. Eine
andere Quelle ist beispielsweise Fischhaut.
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Zahnschmelzmatrix
kann wie zuvor beschrieben (EP-B-0 337 967 und EP-B-0 263 086) aus
sich entwickelnden Zähnen
präpariert
werden. Die Zahnschmelzmatrix wird abgekratzt und es werden Zahnschmelzmatrixderivate
präpariert,
z. B. durch Extraktion mit einer wässrigen Lösung wie einem Puffer, einer
verdünnten Säure oder
Base oder mit einem Wasser/Lösungsmittel-Gemisch,
gefolgt von einer Größenexklusion,
Entsalzung oder anderen Reinigungsschritten, gefolgt von Gefriertrocknung.
Enzyme können
durch Behandlung mit Hitze oder Lösungsmitteln deaktiviert werden,
wobei die Derivate in flüssiger
Form ohne Gefriertrocknung gelagert werden.
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In
dem vorliegenden Zusammenhang sind Zahnschmelzmatrixderivate Derivate
von Zahnschmelzmatrix, welche ein oder mehrere Zahnschmelzmatrixproteine
oder Teile solcher Proteine, die natürlich durch alternatives Spleissen
oder durch Prozessierung erzeugt werden, oder durch entweder enzymatische
oder chemische Spaltung von Proteinen natürlicher Länge erzeugt werden, oder aber
die durch Synthese von Polypeptiden in vitro oder in vivo (rekombinante
DNA-Verfahren oder Kultivierung diploider Zellen) hergestellt werden, umfassen.
Zahnschmelzmatrixproteinderivate umfassen auch Zahnschmelzmatrix-verwandte
Polypeptide oder Proteine. Die Polypeptide oder Proteine können an
geeignete bioabbaubare Trägermoleküle gebunden sein,
wie beispielsweise Polyaminosäuren
oder Polysaccharide oder Kombinationen davon. Weiterhin umfasst der
Ausdruck Zahnschmelzmatrixproteine auch synthetische analoge Substanzen.
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Proteine
sind biologische Makromoleküle,
die aus Aminosäureresten
zusammengesetzt sind, die durch Peptidbindungen verbunden sind.
Proteine als lineare Polymere von Aminosäuren werden auch Polypeptide
genannt. Typischerweise weisen Protein 50–800 Aminosäurereste auf und besitzen daher
Molekulargewichte im Bereich von ungefähr 6000 bis ungefähr mehrere
hunderttausend Dalton oder mehr. Kleine Proteine werden Peptide
oder Oligopeptide genannt.
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Zahnschmelzmatrixproteine
sind Proteine, welche normalerweise in der Zahnschmelzmatrix vorkommen,
d. h. die Vorläufer
für Zahnschmelz
(Ten Cate: Oral Histology, 1994; Robinson: Eur. J. Oral Science,
Jan. 1998, 106 Anhang 1: 282–91),
oder Proteine, welche durch Abbau solcher Proteine erhalten werden
können. Im
Allgemeinen besitzen solche Proteine ein Molekulargewicht niedriger
als 120000 Dalton und umfassen Amelogenine, non-Amelogenine, Prolin-reiche
non-Amelogenine, Ameline (Ameloblastin, Sheathlin), Enemaline und
Tufteline.
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Beispiele
für Proteine
zur erfindungsgemäßen Verwendung
sind Amelogenine, Prolin-reiche non-Amelogenine,
Tufteline; Tuftproteine, Serumproteine, Speichelproteine, Amelin,
Ameloblastin, Enemaline, Sheathlin, und Derivate davon, und Gemische
daraus. Eine Zusammensetzung, die eine aktive Zahnschmelzsubstanz
enthält,
für die
erfindungsgemäße Verwendung
kann auch mindestens zwei der zuvor genannten proteinösen Substanzen
umfassen. Weiterhin finden sich andere Proteine zur erfindungsgemäßen Verwendung
in dem vermarkteten Produkt EMDOGAIN® (Biora
AB).
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Im
Allgemeinen sind die Hauptproteine einer Zahnschmelzmatrix als Amelogenine
bekannt. Sie stellen ungefähr
90% Gew./Gew. der Matrixproteine dar. Die übrigen 10% Gew./Gew. umfassen
Prolin-reiche non-Amelogenine, Tuftelin, Enemaline, Tuftproteine,
Serumproteine und mindestens ein Speichelprotein; jedoch können auch
andere Proteine vorhanden sein, wie z. B. Amelin (Ameloblastin,
Sheathlin), welche in Verbindung mit Zahnschmelzmatrix identifiziert
wurden. Weiterhin können
die verschiedenen Proteine zu unterschiedlichen Größen synthetisiert
und/oder prozessiert worden sein (d. h. unterschiedlichen Molekulargewichten).
Man hat daher herausgefunden, dass die dominierenden Proteine in
der Zahnschmelzmatrix, Amelogenine, in zahlreichen verschiedenen
Größen vorkommen,
welche zusammen supramolekulare Aggregate bilden. Sie sind ausgesprochen
hydrophobe Substanzen, welche unter physiologischen Bedingungen
unlösliche Aggregate
bilden. Sie können
andere Proteine oder Peptide tragen oder Trägerstoffe für diese sein.
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Andere
Proteinsubstanzen wurden ebenfalls als geeignet zur erfindungsgemäßen Verwendung
vorgeschlagen. Beispiele umfassen Proteine wie Prolin-reiche Proteine
und Polyproline. Andere Beispiele von Substanzen, welche als für die erfindungsgemäße Verwendung
geeignet vorgeschlagen wurden, sind Aggregate solcher Proteine,
von Zahnschmelzmatrixderivaten und/oder von Zahnschmelzmatrixproteinen
sowie Abbauprodukte von Zahnschmelzmatrix, Zahnschmelzmatrixderivaten
und Zahnschmelzmatrixproteinen. Die Abbauprodukte können jede
Größe haben,
und zwar im Bereich der Größe der Proteine
bis zu der von kurzen Peptiden.
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Wie
oben erwähnt
besitzen die Proteine, Polypeptide oder Peptide zur erfindungsgemäßen Verwendung
typischerweise ein Molekulargewicht von maximal 120 kDa, wie z.
B. maximal 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa oder 60 kDa, bestimmt
durch SDS-PAGE-Elektrophorese.
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Die
Proteine zur erfindungsgemäßen Verwendung
liegen normalerweise in Form einer Zusammensetzung vor, wobei der
Proteingehalt der aktiven Zahnschmelzsubstanz in der Zusammensetzung
in einem Bereich von ungefähr
0,05% Gew./Gew. bis 100% Gew./Gew. liegt, wie z. B. ungefähr 5–99% Gew./Gew.,
ungefähr
10–95%
Gew./Gew., ungefähr
15–90%
Gew./Gew., ungefähr
20–90%
Gew./Gew., ungefähr
30–90% Gew./Gew.,
ungefähr
40–85%
Gew./Gew., ungefähr
50–80%
Gew./Gew., ungefähr
60–70%
Gew./Gew., ungefähr
70–90%
Gew./Gew. oder ungefähr
80–90%
Gew./Gew.
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Eine
Zusammensetzung einer aktiven Zahnschmelzsubstanz zur erfindungsgemäßen Verwendung kann
auch ein Gemisch von Proteinen mit unterschiedlichen Molekulargewichten
enthalten.
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Die
Proteine einer Zahnschmelzmatrix können in einen Teil mit hohem
Molekulargewicht und einen Teil mit niedrigem Molekulargewicht aufgeteilt
werden, und man hat herausgefunden, dass eine wohl definierte Fraktion
von Zahnschmelzmatrixproteinen wertvolle Eigenschaften im Hinblick
auf die Behandlung von paradontalen Defekten (d. h. paradontalen
Wunden) besitzt. Diese Fraktion enthält Essigsäure-extrahierbare Proteine,
die im Allgemeinen Amelogenine genannt werden, und sie stellt den
Teil mit niedrigem Molekulargewicht einer Zahnschmelzmatrix dar
(s. EP-B-0 337 967 und EP-B-0 263 086).
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Wie
oben diskutiert besitzt der niedermolekulargewichtige Teil einer
Zahnschmelzmatrix eine geeignete Aktivität, die Bindung zwischen harten
Geweben in paradontalen Defekten zu induzieren. Im vorliegenden Zusammenhang
sind die aktiven Proteine jedoch nicht auf den niedermolekulargewichtigen
Teil einer Zahnschmelzmatrix beschränkt. Zur Zeit umfassen bevorzugte
Proteine Zahnschmelzmatrixproteine wie Amelogenin, Amelin, Tuftelin
etc. mit Molekulargewichten unterhalb von 60000 Dalton (gemessen
in vitro mittels SDS-PAGE), aber Proteine mit einem Molekulargewicht über 60000
Dalton besitzen ebenfalls vielversprechende Eigenschaften als Kandidaten
für die
Wundheilung, als antibakterielle und/oder antiinflammatorische Mittel.
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Dementsprechend
wird vorgeschlagen, dass die aktive Zahnschmelzsubstanz für die erfindungsgemäße Verwendung
ein Molekulargewicht von bis zu 40000 aufweist, wie z. B. ein Molekulargewicht
zwischen ungefähr
5000 und ungefähr
25000.
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Innerhalb
des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen auch Peptide, die
in der WO 97/02730 beschrieben sind, d. h. Peptide, welche mindestens
ein Sequenzelement, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus den Tetrapeptiden DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala),
VTKG (Val-Thr-Lys-Gly),
EKGE (Glu-Lys-Gly-Glu) und DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu), umfassen, und
welche weiterhin eine Aminosäuresequenz
umfassen, von der ein aufeinanderfolgender Strang von 20 Aminosäuren zu
einem Grad von mindestens 80% identisch ist mit einem Strang von
Aminosäuren
derselben Länge,
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:
1 gezeigt ist, und einer Sequenz bestehend aus den Aminosäuren 1 bis
103 von SEQ ID NO: 1, und Aminosäuren
6 bis 324 von SEQ ID NO: 2, die in der WO 97/02730 gezeigt sind.
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Mit
dem Ausdruck "Sequenzidentität" ist die Identität bei der
Sequenz der Aminosäuren
in der Übereinstimmung
im Hinblick auf Identität
und Position der Aminosäuren
der Peptide gemeint. Eine Lücke
wird geeigneterweise als nicht-Identität für eine oder mehrere Aminosäuren gewertet.
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Solche
Peptide können
6 bis 300 Aminosäuren,
z. B. mindestens 20 Aminosäuren,
mindestens 30 Aminosäuren,
mindestens 60 Aminosäuren,
mindestens 90 Aminosäuren,
mindestens 120 Aminosäuren,
mindestens 150 Aminosäuren
oder mindestens 200 Aminosäuren,
umfassen.
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Ein
Verfahren zur Isolierung von Zahnschmelzmatrixproteinen umfasst
die Extraktion der Proteine und das Entfernen von Calcium- und Phosphationen
aus dem gelösten
Hydroxyapatit mittels eines geeigneten Verfahrens, z. B. Gelfiltration,
Dialyse oder Ultrafiltration (siehe z. B. Janson, J-C & Rydén, L.
(Hrsg.), Protein purification, VCH Publishers 1989 und Harris, ELV & Angal, S., Protein
purification methods – A
practical approach, IRL Press, Oxford 1990).
-
Eine
typische lyophilisierte Proteinpräparation kann vornehmlich oder
ausschließlich
bis zu 70–90% Amelogenine
mit einem Molekulargewicht (MW) zwischen 40.000 und 5.000 Dalton
enthalten, wobei sich die 10–30%
aus kleineren Peptiden, Salzen und Restwasser zusammensetzen. Die
Hauptproteinbanden liegen bei 20 kDa, 12–14 kDa und um 5 kDa herum.
-
Durch
Auftrennen der Proteine, z. B. durch Präzipitation, Ionenaustauschchromatographie,
präparative
Elektrophorese, Gelpermeationschromatographie, Umkehrphasenchromatographie
oder Affinitätschromatographie,
können
die Amelogenine unterschiedlichen Molekulargewichts aufgereinigt
werden.
-
Die
Kombination von Amelogeninen unterschiedlichen Molekulargewichts
kann verändert
werden, von einer dominierenden 20 kDa-Verbindung zu einem Aggregat
von Amelogeninen mit vielen verschiedenen Molekulargewichten zwischen
40 und 5 kDa, und zu einer dominierenden 5 kDa-Verbindung. Andere
Zahnschmelzmatrix-Proteine wie Amelin, Tuftelin oder proteolytische
Enzyme, die man normalerweise in Zahnschmelzmatrix findet, können hinzugefügt werden
und von dem Amelogenin-Aggregat getragen werden.
-
Als
alternative Quelle der Zahnschmelzmatrix-Derivate oder -Proteine
können
auch allgemein anwendbare synthetische Wege, die einem Fachmann
wohl bekannt sind, verwendet werden, oder es können kultivierte Zellen oder
Bakterien verwendet werden, die durch rekombinante DNA-Techniken
modifiziert wurden (siehe z. B. Sambrook J. et al.: Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
-
Physikochemische Eigenschaften
von Zahnschmelzmatrix, Zahnschmelzmatrix-Derivaten und Zahnschmelzmatrix-Proteinen
-
Im
Allgemeinen sind die Zahnschmelzmatrix, Zahnschmelzmatrix-Derivate
und Zahnschmelzmatrix-Proteine hydrophobe Substanzen, d. h. insbesondere
bei erhöhten
Temperaturen weniger löslich
in Wasser. Im Allgemeinen sind diese Proteine bei nicht-physiologischen pH-Werten
und bei einer niedrigen Temperatur wie ungefähr 4–20°C löslich, während sie bei Körpertemperatur
(35–37°C) und neutralem
pH aggregieren und präzipitieren
werden.
-
Mindestens
ein Teil der aktiven Zahnschmelz-Substanz zur erfindungsgemäßen Verwendung
kann in Form von Aggregaten vorliegen oder nach der Anwendung in
vivo in der Lage sein, Aggregate zu bilden. Die Partikelgröße der Aggregate
liegt in einem Bereich von ungefähr
20 nm bis ungefähr
1 μm.
-
Es
wird in Erwägung
gezogen, dass die Löslichkeitseigenschaften
der aktiven Zahnschmelzsubstanz in Verbindung mit der prophylaktischen
und therapeutischen Aktivität
der Substanz von Bedeutung sind. Wenn eine Zusammensetzung, die
die aktive Zahnschmelzsubstanz enthält, z. B. einem Menschen verabreicht
wird, werden die proteinösen Substanzen
aufgrund des unter physiologischen Bedingungen normalerweise vorherrschenden
pH-Wertes präzipitieren.
Daher wird eine Lage von Zahnschmelzmatrix, Zahnschmelzmatrix-Derivaten und/oder
Zahnschmelzmatrix-Proteinen an der Anwendungsstelle gebildet und
diese Lage (welche auch eine molekulare Lage sein kann, und zwar
in jenen Fällen,
in denen Aggregate gebildet wurden) ist unter physiologischen Bedingungen
schwer abzuwaschen. Weiterhin ist die präzipitierte Lage aufgrund der
bioadhäsiven
Eigenschaften der Substanzen (siehe unten) fest an das Gewebe gebunden,
und zwar auch am Rand zwischen der präzipitierten Lage und dem Gewebe.
Die proteinöse
Lage bedeckt daher das Gewebe, auf welches die aktive Zahnschmelzsubstanz
oder die Zusammensetzung daraus aufgebracht wurde, und die aktiven Zahnschmelzsubstanzen
werden in situ über
eine verlängerte
Zeitspanne aufrecht erhalten, d. h. es ist nicht notwendig, die
aktive Zahnschmelzsubstanz innerhalb kurzer Intervalle zu verabreichen.
Außerdem
kann die in situ gebildete Lage beinahe mit einem Okklusiv-Verband
verglichen werden, d. h. die gebildete Lage schützt das Gewebe, auf welcher
die Lage gebildet ist, vor der Umgebung. Im Falle von Transplantatgewebe
schützt eine
solche Lage solch ein Gewebe vor weiterer Kontamination durch Mikroorganismen,
die in der Umgebung vorhanden sind. Weiterhin kann die proteinöse Lage
ihre Wirkung durch direkten Kontakt mit dem Gewebe oder mit Mikroorganismen,
die in/an/auf dem Gewebe vorhanden sind, ausüben.
-
Um
es zu ermöglichen,
dass eine proteinöse
Lage in situ nach der Anwendung gebildet wird, kann es vorteilhaft
sein, eine geeignete Puffersubstanz in eine pharmazeutische oder
kosmetische Zusammensetzung der aktiven Zahnschmelzsubstanz aufzunehmen;
der Zweck solch einer Puffersubstanz könnte es sein, die Auflösung der
Zahnschmelzsubstanz an der Stelle der Anwendung zu verhindern.
-
Es
wurde (von den Erfindern) auch beobachtet, dass die aktive Zahnschmelzsubstanz
bioadhäsive
Eigenschaften besitzt, d. h. sie besitzen eine Fähigkeit, an Hautoberflächen anzuhaften.
Diese Eigenschaften sind in Verbindung mit einer therapeutischen
und/oder prophylaktischen Behandlung zumindest aus den folgenden
Gründen äußerst wertvoll:
- – die
prophylaktisch und/oder therapeutisch aktive(n) Substanz(en) kann/können an
der Anwendungsstelle über
eine längere
Zeitspanne aufrecht erhalten werden, (d. h. i) die Verabreichungsfrequenz
kann reduziert werden, ii) ein kontrollierter Ausschüttungseffekt
der aktiven Substanz kann erhalten werden und/oder iii) eine lokale
Behandlung der Anwendungsstelle wird verbessert),
- – die
Substanzen können
selbst als Vehikel für
andere prophylaktisch oder therapeutisch aktive Substanzen geeignet
sein, da ein Vehikel, das die aktive Zahnschmelzsubstanz enthält, als
bioadhäsives
Vehikel formuliert werden kann (d. h. ein neues bioadhäsives Arzneiverabreichungssystem
basierend auf den bioadhäsiven
Eigenschaften der aktiven Zahnschmelzsubstanz).
-
Theorien im Hinblick auf
den Wirkmechanismus
-
Zahnschmelzmatrix
ist ein Beispiel für
eine extrazelluläre
Proteinmatrix, welche sowohl an Mineraloberflächen als auch an proteinöse Oberflächen anhaftet.
Bei physiologischem pH und bei physiologischer Temperatur bilden
die Proteine ein unlösliches
supra-molekulares Aggregat (Fincham et al. in J. Struct. Biol. 1994 März–April;
112(2): 103–9
und in J. Struct. Biol. 1995 Juli–August; 115(1): 50–9), welches
durch proteolytische Enzyme allmählich
abgebaut wird (was sowohl in vivo als auch in vitro auftritt, vorausgesetzt
dass die Proteasen keiner Inaktivierung unterzogen wurden).
-
Bei
vielen Arten findet man Überbleibsel
von Zahnschmelzmatrix in der neumineralisierten Krone, wenn ein
Zahn in die Mundhöhle
hervorbricht. Man könnte
argumentieren, dass ein neuer Zahn sehr verwundbar wäre gegenüber einem
bakteriellen Angriff durch übliche
orale Bakterien, wenn er nicht einen natürlichen Schutz während dieser
Anfangsphase aufwiese. Dies wird durch die Tatsache gestützt, dass
Kinder mit unvollständiger
Amelogenese weniger Kariesläsionen
entwickeln (siehe S. Sundell, Swed. Dent. J. 10(4), 1986, S. 151–163).
-
Entsprechend
der vorliegenden Erfindung kann die aktive Zahnschmelzsubstanz zur
Herstellung einer pharmazeutischen oder kosmetischen Zusammensetzung
zum Fördern
von Heilprozessen sowie für
präventive
Zwecke verwendet werden. Weiterhin kann die aktive Zahnschmelzsubstanz
zusammen mit anderen aktiven Arzneisubstanzen verwendet werden,
wie z. B. antibakteriellen, antiinflammatorischen, antiviralen,
und antifungalen Substanzen, immunsuppressiven Mitteln wie Cyclosporinen
oder Ascomycinen, oder in Kombination mit Wachstumsfaktoren wie
z. B. TGFβ,
PDGF, IGF, FGF, EGF, Keratinocyten-Wachstumsfaktor oder deren Peptidanaloga
(man vermutet, dass EGF die Heilung fördert, indem die Migration
und Zellteilung von Epithelzellen erhöht wird; weiterhin erhöht EGF die
Fibroblastenanzahlen in Wunden, was zu einer größeren Kollagenproduktion führt). Enzyme – entweder
inhärent
in der Zahnschmelzmatrix oder der Präparation daraus vorhanden oder
hinzugefügt – können ebenfalls
in Kombination mit der aktiven Zahnschmelzsubstanz verwendet werden,
insbesondere Proteasen.
-
Eine
Zusammensetzung der aktiven Zahnschmelzsubstanz wird normalerweise
als pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung formuliert.
Solch eine Zusammensetzung kann natürlich aus der proteinösen Präparation
bestehen oder außerdem
ein pharmazeutisch-annehmbares Exzipienz umfassen. Besonders geeignete
Exzipienzien zur Verwendung in pharmazeutischen oder kosmetischen
Zusammensetzungen sind Propylenglykolalginat oder Hyaluronsäure oder
Salze oder Derivate davon.
-
Pharmazeutische
oder kosmetische Zusammensetzungen
-
Im
Folgenden werden Beispiele für
geeignete Zusammensetzungen gegeben, die die aktive Zahnschmelzsubstanz
enthalten. Abhängig
von der Verwendung der aktiven Zahnschmelzsubstanz kann eine Zusammensetzung
eine pharmazeutische oder eine kosmetische Zusammensetzung sein.
Im Folgenden soll der Ausdruck "pharmazeutische
Zusammensetzung" auch
kosmetische Zusammensetzungen umfassen, sowie Zusammensetzungen,
die zu dem Graubereich zwischen pharmazeutischen und kosmetischen
Zusammensetzungen gehören,
die sogenannten Kosmozeutika.
-
Zur
Verabreichung an ein Individuum (ein Tier oder einen Menschen) wird
die aktive Zahnschmelzsubstanz und/oder eine Präparation davon bevorzugt zu
einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert, die die aktive
Zahnschmelzsubstanz und wahlweise ein oder mehrere pharmazeutisch
annehmbare Exzipienzien enthält.
-
Die
Zusammensetzungen können
z. B. in Form von festen, halbfesten oder flüssigen Zusammensetzungen vorliegen,
wie z. B. bioabsorbierbaren Stücken,
Güssen,
Verbänden,
Hydrogel-Verbänden,
Hydrocolloid-Verbänden,
Folien, Schäumen,
flächigen
Bahnen, Verbänden,
Pflastern, Verabreichungsgeräten,
Implantaten, Pudern, Granula, Granulaten, Kapseln, Agarose- oder
Chitosan-Kügelchen,
Tabletten, Pillen, Pellets, Mikrokapseln, Mikrosphären, Nanopartikeln,
Gelen, Hydrogelen, Pasten, Salben, Cremes, Seifen, Lösungen, Dispersionen,
Suspensionen, Emulsionen, Gemischen, Lotionen, Kits, die z. B. zwei
getrennte Behälter
enthalten, wobei der erste der Behälter die aktive Zahnschmelzsubstanz,
z. B. als Puder oder in gefriergetrockneter Form, enthält, wahlweise
mit einer anderen Arzneisubstanz/anderen Arzneisubstanzen und/oder
pharmazeutisch annehmbaren Exzipienzien gemischt, und wobei der
zweite Behälter
ein geeignetes Medium enthält,
das dafür
vorgesehen ist, zu dem ersten Behälter vor der Verwendung hinzugegeben
zu werden, um eine gebrauchsfertige Zusammensetzung zu erhalten.
-
Zusammensetzungen
zur Anwendung auf der Haut oder der Schleimhaut werden im Zusammenhang mit
der vorliegenden Erfindung als am Wichtigsten angesehen. Daher kann
eine Zusammensetzung, die die zu verabreichende aktive Zahnschmelzsubstanz
enthält,
zur Verabreichung über
jeden geeigneten Weg, z. B. mittels topischer (dermaler) Verabreichung,
angepasst werden. Außerdem
kann eine Zusammensetzung der Verabreichung in Verbindung mit chirurgischer
Behandlung angepasst werden, z. B. in Verbindung mit Einschnitten
in den Körper,
um die Heilung interner Gewebezerstörung zu verbessern, wie bei
Knochen- oder Knorpel-Transplantaten.
-
Die
Zusammensetzungen können
entsprechend konventioneller pharmazeutischer Praxis formuliert werden,
siehe z. B. "Remington's Pharmaceutical
Sciences", und "Encyclopedia of Pharmaceutical
Technology", hrsg.
Swarbrick, J. & J.
C. Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988.
-
Eine
pharmazeutische Zusammensetzung, die eine active Zahnschmelzsubstanz
enthält,
dient als Arzneimittelverabreichungssystem. Im vorliegenden Zusammenhang
bezeichnet der Ausdruck "Arzneimittelverabreichungssystem" eine pharmazeutische
Zusammensetzung (eine pharmazeutische Formulierung oder eine Dosierungsform),
welche nach der Verabreichung die aktive Substanz dem Körper eines
Menschen oder eines Tieres präsentiert.
-
Daher
umfasst der Ausdruck "Arzneimittelverabreichungssystem" schlichte pharmazeutische
Zusammensetzungen wie z. B. Cremes, Salben, Flüssigkeiten, Puder, etc. sowie
kompliziertere Formulierungen wie Sprays, Pflaster, Bandagen, Verbände, Geräte, etc.
-
Neben
der aktiven Zahnschmelzsubstanz kann eine pharmazeutische Zusammensetzung
zur erfindungsgemäßen Verwendung
pharmazeutisch-annehmbare Exzipienzien umfassen.
-
Ein
pharmazeutisch-annehmbares Exzipienz ist eine Substanz, welche im
Wesentlichen für
das Individuum, an das die Zusammensetzung zu verabreichen ist,
harmlos ist. Solch ein Exzipienz erfüllt normalerweise die Erfordernisse,
die von den nationalen Gesundheitsstellen vorgegeben werden. Offizielle
Arzneibücher
wie z. B. die "British
Pharmacopoeia",
die Pharmacopoeia der Vereinigten Staaten und die Europäische Pharmacopoeia
setzen Standards für
pharmazeutisch-annehmbare Exzipienzien fest.
-
Ob
ein pharmazeutisch-annehmbares Exzipienz zur Verwendung in einer
pharmazeutischen Zusammensetzung geeignet ist, hängt im Allgemeinen davon ab,
bei welcher Dosierungsform sie zur Verwendung bei einer bestimmten
Art von Wunde ausgewählt
ist. Im Folgenden werden Beispiele für geeignete pharmazeutisch-annehmbare
Exzipienzien zur Verwendung in unterschiedlichen Arten von Zusammensetzungen
zur erfindungsgemäßen Verwendung
gegeben.
-
Im
Folgenden wird eine Übersicht
relevanter pharmazeutischer Zusammensetzungen zur erfindungsgemäßen Verwendung
gegeben. Die Übersicht
basiert auf dem jeweiligen Verabreichungsweg. Es wird jedoch berücksichtigt,
dass in jenen Fällen,
in denen ein pharmazeutisch-annehmbares Exzipienz in unterschiedlichen
Dosierungsformen oder Zusammensetzungen verwendet werden kann, die
Anwendung eines besonderen pharmazeutisch-annehmbaren Exzipienz
nicht auf eine besondere Dosierungsform oder eine besondere Funktion
des Exzipienz beschränkt
ist.
-
Die
Auswahl eines pharmazeutisch annehmbaren Exzipienz/von pharmazeutisch
annehmbaren Exzipienzien in einer Zusammensetzung zur erfindungsgemäßen Verwendung
und dessen/deren optimale Konzentrationen) können im Allgemeinen nicht vorhergesagt
werden und müssen
auf der Grundlage einer experimentellen Untersuchung der Endzusammensetzung
bestimmt werden. Jedoch kann ein Fachmann auf dem Gebiet der pharmazeutischen
Formulierung eine Richtlinie finden, z. B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18. Auflage, Mack
Publishing Company, Easton, 1990.
-
Topische Zusammensetzungen
-
Zum
Aufbringen auf die Schleimhäute
oder die Haut können
die Zusammensetzungen zur erfindungsgemäßen Verwendung konventionell
nicht-toxische pharmazeutisch oder kosmetisch annehmbare Trägerstoffe
und Exzipienzien enthalten einschließlich Mikrosphären und
Liposomen.
-
Die
Zusammensetzungen zur erfindungsgemäßen Verwendung umfassen alle
Arten von festen, halbfesten und flüssigen Zusammensetzungen. Zusammensetzungen
von besonderer Relevanz sind z. B. Pasten, Salben, hydrophile Salben,
Cremes, Gele, Hydrogele, Lösungen,
Emulsionen, Suspensionen, Lotionen, Einreibemittel, Shampoos, Gelees,
Seifen, Stifte, Sprays, Puder, Folien, Schäume, Pads, Schwämme (z.
B. Collagen-Schwämme),
Pads, Verbände
(wie z. B. absorbierende Wundverbände), Güsse, Bandagen und Pflaster.
-
Die
pharmazeutisch annehmbaren Exzipienzien können Lösungsmittel, Puffermittel,
Konservierungsstoffe, Befeuchtungsmittel, Cheliermittel, Antioxidantien,
Stabilisatoren, Emulgatoren, suspendierende Mittel, Gelbildungsmittel,
Salbengrundstoffe, Penetranzverstärker, Geruchsstoffe und Hautschutzmittel
umfassen.
-
Beispiele
für Lösungsmittel
sind z. B. Wasser, Alkohole, vegetabile oder marine Öle (z. B.
Speiseöle wie
Mandelöl,
Rhizinusöl,
Kakaobutter, Kokosnussöl,
Maisöl,
Baumwollsamenöl,
Leinsamenöl,
Olivenöl,
Palmenöl,
Erdnussöl,
Mohnöl,
Rapsöl,
Sesamöl,
Sojabohnenöl,
Sonnenblumenöl
und Teeamenöl),
Mineralöle, Fettöle, flüssiges Paraffin,
Polyethylenglykole, Propylenglykole, Glycerin, flüssige Polyalkylsiloxane,
und Gemische daraus.
-
Beispiele
für Puffermittel
sind z. B. Zitronensäure,
Essigsäure,
Weinsäure,
Milchsäure,
Phosphorsäure,
Diethylamin etc.
-
Geeignete
Beispiele für
Konservierungsmittel für
die Verwendung in Zusammensetzungen sind Parabene wie Methyl-, Ethyl-,
Propyl-p-hydroxybenzoat, Butylparaben, Isobutylparaben, Isopropylparaben,
Kaliumsorbat, Sorbinsäure,
Benzoesäure,
Methylbenzoat, Phenoxyethanol, Bronopol, Bronidox, MDM Hydantoin, Jodpropynylbutylcarbamat,
EDTA, Benzalconiumchlorid und Benzylalkohol, oder Gemische von Konservierungsmittel.
-
Beispiele
für Befeuchtungsmittel
sind Glycerin, Propylenglykol, Sorbitol, Milchsäure, Harnstoff, und Gemische
daraus.
-
Beispiele
für Cheliermittel
sind Natrium-EDTA und Zitronensäure.
-
Beispiele
für Antioxidantien
sind butyliertes Hydroxyanisol (BHA), Ascorbinsäure und Derivate davon, Tocopherol
und Derivate davon, Cystein, und Gemische daraus.
-
Beispiele
für Emulgatoren
sind natürlich
vorkommende Gummis, z. B. Akaziengummi oder Tragant; natürlich vorkommende
Phosphatide, z. B. Sojabohnenlecithin; Sorbitanmonooleat-Derivate;
Wollfette; Wollalkohole; Sorbitanester; Monoglyceride; Fettalkohole;
Fettsäureester
(z. B. Triglyceride von Fettsäuren);
und Gemische daraus.
-
Beispiele
für Suspendiermittel
sind z. B. Cellulosen und Cellulose-Derivate wie z. B. Carboxymethylcellulose,
Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose,
Caragenan, Akaziengummi, Gummi arabicum, Tragant, und Gemische daraus.
-
Beispiele
für Gelgrundstoffe,
viskositätserhöhende Mittel
oder Komponenten, welche in der Lage sind, ein Exsudat von einer
Wunde aufzunehmen, sind: flüssiges
Paraffin, Polyethylen, Fettöle,
Kolloid-Kieselsäure oder
-Aluminium, Zinkseifen, Glycerin, Propylenglykol, Tragant, Carboxyvinylpolymere,
Magnesium-Aluminium-Silikate, Carbopol®, hydrophile
Polymere wie z. B. Stärke
oder Cellulose-Derivate wie z. B. Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose
und andere Cellulose-Derivate, Wasser-quellfähige Hydrocolloide, Carragenane,
Hyaluronate (z. B. Hyaluronat-Gel, das wahlweise Natriumchlorid
enthält),
und Alginate einschließlich Propylenglykolalginat.
-
Beispiele
für Salbengrundstoffe
sind z. B. Bienenwachs, Paraffin, Hexadecanol, Palmitinsäurecetylester,
vegetabile Öle,
Sorbitanester von Fettsäuren
(Span), Polyethylenglykole, und Kondensationsprodukte von Sorbitanestern
mit Fettsäuren
und Ethylenoxid, z. B. Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween).
-
Beispiele
für hydrophobe
oder Wasser-emulsierende Salbengrundstoffe sind Paraffine, vegetabile Öle, Tierfette,
synthetische Glyceride, Wachse, Lanolin, und flüssige Polyalkylsiloxane.
-
Beispiele
für hydrophile
Salbengrundstoffe sind feste Makrogole (Polyethylenglykole).
-
Andere
Beispiele für
Salbengrundstoffe sind Triethanolamin-Seifen, sulfatisierte Fettalkohole
und Polysorbate.
-
Beispiele
für Puderkomponenten
sind: Alginat, Collagen, Lactose, Puder, welches in der Lage ist
ein Gel zu bilden, wenn es auf ein Transplantat aufgebracht wird
(absorbiert Flüssigkeit/Wundexsudat).
Normalerweise müssen
Puder, die für
das Aufbringen auf Transplantate vorgesehen sind, steril sein und
die vorhandenen Partikel müssen
mikronisiert sein.
-
Beispiele
anderer Exzipienzien sind Polymere wie Carmellose, Natriumcarmellose,
Hydroxymethylpropylmethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose,
Pectin, Xanthangummi, Johannisbrotkernmehl, Akaziengummi, Gelatine,
Carbomer, Emulgatoren wie Vitam E, Glycerinstearate, Cetanylglykosid, Collagen,
Carragenan, Hyaluronate und Alginate und Chitosane.
-
Verbände und/oder
Bandagen können
auch als Verabreichungssysteme für
die aktive Zahnschmelzsubstanz verwendet werden. Wenn Verbände als
Dosierungsform verwendet werden, kann die aktive Zahnschmelzsubstanz
vor oder während
der Herstellung des Verbandes mit den anderen Inhaltsstoffen vermischt werden
oder die aktive Zahnschmelzsubstanz kann auf irgendeine Weise auf
den Verband aufgebracht werden, z. B. durch Eintauchen des Verbandes
in eine Lösung
oder Dispersion der aktiven Zahnschmelzsubstanz oder durch Aufsprühen einer
Lösung
oder Dispersion der aktiven Zahnschmelzsubstanz auf den Verband.
Alternativ dazu kann die aktive Zahnschmelzsubstanz in Form eines
Puders auf den Verband aufgebracht werden. Verbände können in Form von absorbierenden
Wundverbänden
zur Anwendung auf exsudierende Wunden vorliegen. Verbände können auch
in Form von Hydrogel-Verbänden
(z. B. vernetzten Polymeren wie z. B. Intrasite®, welches
Carboxymethylcellulose, Propylenglykol oder Polysaccharide, Disaccharide
und Proteine enthält)
oder in Form von Occlusiv-Verbänden wie
z. B. Alginaten, Chitosan, hydrophilem Polyurethanfilm, Collagenlagen,
Platten, Puderschäumen
oder Schwämmen,
Schäumen
(z. B. Polyurethan oder Silicon), Hydrocolloiden (z. B. Carboxymethylcellulose,
CMC), Collagen- und Hyaluronsäure-basierten Verbänden vorliegen, einschließlich Kombinationen
daraus.
-
Alginat-,
Chitosan- und Hydrocolloid-Verbände
nehmen Wundexsudat auf, wenn sie auf einem Transplantat platziert
werden. Dabei produzieren sie ein wässriges Gel auf der Oberfläche des
Transplantats und man glaubt, dass dieses Gel für die Heilung des Transplantats
aufgrund des Zurückhaltens
von Feuchtigkeit an der Transplantatstelle günstig für die Heilung ist.
-
Zusammensetzungen,
die sich als günstig
in Verbindung mit topischer Anwendung erwiesen haben, sind jene,
welche thixotrophe Eigenschaften besitzen, d. h. die Viskosität der Zusammensetzung
wird z. B. durch Schütteln
oder Rühren
beeinflusst, so dass die Viskosität der Zusammensetzung zum Zeitpunkt
der Verabreichung reduziert werden kann, und die Viskosität sich erhöht, wenn
die Zusammensetzung aufgebracht wurde, so dass die Zusammensetzung
am Anwendungsort verbleibt.
-
Dosierungen von Zahnschmelzmatrix,
Zahnschmelzmatrixderivaten und Zahnschmelzmatrixproteinen
-
In
einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur erfindungsgemäßen Anwendung
auf der Haut oder auf der Schleimhaut ist eine aktive Zahnschmelzsubstanz
im Allgemeinen in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 0,01%
bis ungefähr
99,9% Gew./Gew. vorhanden. Die Menge der aufgebrachten Zusammensetzung
führt normalerweise
zu einer Menge Gesamtprotein pro cm2 des
Rezipientenbettbereichs, die ungefähr 0,01 mg/cm2 bis
ungefähr
20 mg/cm2 entspricht, wie beispielsweise
ungefähr
0,1 mg/cm2 bis ungefähr 15 mg/cm2.
-
Die
aufgebrachte Menge der Zusammensetzung hängt von der Konzentration der
aktiven Zahnschmelzsubstanz in der Zusammensetzung ab und von der
Freisetzungsrate der aktiven Zahnschmelzsubstanz aus der Zusammensetzung,
aber sie liegt im Allgemeinen in einem Bereich, der maximal ungefähr 15 bis
20 mg/cm2 entspricht.
-
In
jenen Fällen,
in denen die aktive Zahnschmelzsubstanz in Form einer flüssigen Zusammensetzung verabreicht
wird, liegt die Konzentration der aktiven Zahnschmelzsubstanz in
der Zusammensetzung in einem Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 50 mg/ml.
Höhere
Konzentrationen sind in einigen Fällen wünschenswert und können auch
erreicht werden, wie beispielsweise eine Konzentration von mindestens
ungefähr
100 mg/ml.
-
Die
Konzentration der aktiven Zahnschmelzsubstanz in einer pharmazeutischen
Zusammensetzung hängt
von der spezifischen Zahnschmelzsubstanz, ihrer Wirksamkeit, der
Schwere der zu verhindernden oder zu behandelnden Krankheit und
dem Alter und dem Zustand des Patienten ab. Methoden, die angewandt
werden können,
um passende Konzentrationen der aktiven Zahnschmelzsubstanz in der
pharmazeutischen Zusammensetzung auszuwählen, sind einem Fachmann wohl
bekannt und können
entsprechend etablierten Richtlinien für gute klinische Praxis (GCP)
oder den "Investigational
New Drug Exemption" ("IND")-Richtlinien durchgeführt werden,
wie beschrieben z. B. in dem internationalen Standard ISO/DIS 14155
Klinische Untersuchung medizinischer Geräte, 1994 und ICH ("International Committee
for Harmonisation"):
Harmonisierte Dreiteilige Richtlinie für Gute Klinische Praxis, Brookwood
Medical Publications, LTD., Surrey, UK, 1996. Ein Fachmann würde mittels
Verwendung der in Standardlehrbüchern,
Richtlinien und Vorschriften, wie oben beschrieben, sowie unter
Anwendung des allgemeinen Fachwissens, in der Lage sein, die genaue
Dosierungskur auszuwählen,
die für
jede aktive Zahnschmelzsubstanz und/oder ausgewählte andere aktive Substanzen durchgeführt werden
muss, und ebenso die Dosierungsform, in dem er lediglich Routineexperimente
durchführt.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
-
Die
Erfindung wird im Folgenden weiter beschrieben mit Bezugnahme auf
die anhängenden
Figuren:
-
1 ist eine Darstellung,
die das Anhaften von humanen dermalen Fibroblasten (NHDF)-Zellen
an der Oberfläche
von Kulturschalen zeigt, die mit EMD beschichtet sind, im Vergleich
zu unbeschichteten Kulturschalen, die als Kontrolle verwendet wurden;
-
2 ist eine Darstellung,
die DNA-Synthese durch NHDF-Zellen zeigt, die in Anwesenheit oder
Abwesenheit von EMD gemessen wurde, gemessen mittels des Einbaus
von 5-Brom-2'-desoxyuridin
(BrdU) in neu synthetisierte DNA proliferierender Zellen;
-
3 ist eine Darstellung,
die nach 72 Stunden die Dichte von NHDF-Zellen zeigt, die in Anwesenheit oder
Abwesenheit von EMD gewachsen sind;
-
4 ist eine Darstellung,
die die Menge von intrazellulärem
cAMP in NHDF-Zellen zeigt, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von
EMD gewachsen sind;
-
5 ist eine Darstellung,
die die Überlebensrate
von NHDF-Zellen zeigt, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von EMD
gewachsen sind, gemessen mittels des Apoptose-Wertes spezifischer Nucleinsäure-Abbauprodukte;
und
-
6 ist eine Darstellung,
die die Bildung von Multilayer-Kolonien von NHDF-Zellen nach 72
und 96 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit von EMD zeigt.
-
Die
vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben,
welche in keinster Weise den Umfang der Erfindung, wie er beansprucht
ist, begrenzen sollen.
-
EXPERIMENTELLER TEIL
-
Material und
Methoden
-
Zahnschmelzmatrix-Derivate,
EMDOGAIN®,
von BIORA AB, S-205 12 Malmö,
Schweden, enthaltend 30 mg gefriergetrocknetes Zahnschmelzmatrix-Protein
(im Folgenden EMD abgekürzt),
und 1 ml Vehikellösung
(Propylenglykolalginat), welche vor der Anwendung gemischt werden,
es sei denn das Protein und das Vehikel werden getrennt getestet.
Das Gewichtsverhältnis
der Haupt-Protein-Peaks bei 20, 14 bzw. 5 kDa ist ungefähr 85/5/10.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1
-
Material und
Methoden
-
Normale
humane Hautfibroblasten wurden von BioWhittaker, CC-2511, NHDF,
einzelner Spender, männlicher
Erwachsener, Chargennr. NHDF-4196, Lot Nr. 16503 bezogen. Die Zellen
wurden in Dulbecco's modifiziertem
Eagle-Medium, versetzt mit 10% fötalem
Kälberserum,
gezogen. EMD wurde sowohl durch Beschichten der Oberfläche der
Kulturschalen mit einer 0,5 mg/ml EMD-Lösung in 0,1% HAc zugesetzt,
als auch indem dem Medium 100 μg
EMD pro ml Medium zugesetzt wurden. Alle Experimente begannen bei
einer Zelldichte von 50.000 Zellen pro ml Kulturmedium.
- (a) NHDF-Zellen wurden auf der Oberfläche von Kulturschalen, die
mit EMD beschichtet waren, für
30, 60, 120 oder 240 Minuten gezogen, bevor die Kulturschalen mit
PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) gewaschen wurden, um
nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Zellen, die in unbeschichteten
Kulturschalen gezogen wurden, dienten als Kontrollen. Die anhaftenden
Zellen wurden dann durch Trypsinierung abgelöst und in einer Bürker-Zählkammer
gezählt
(n = 3 zu jedem Zeitpunkt). Aus 1 scheint
ersichtlich, dass die anfängliche
Anhaftung von NHDF-Zellen signifikant durch Anwesenheit von EMD
erhöht
wird.
- (b) NHDF-Zellen wurden 24, 48, 72 oder 96 Stunden in Anwesenheit
oder Abwesenheit (Kontrollen) von EMD kultiviert, bevor sie einem
Zellproliferations-Immunoassay unterzogen wurden, der den Einbau
von 5-Brom-2'-desoxyuridin
(BrdU) misst. Über
eine Zeitspanne von 4 Stunden wurde BrdU anstelle von Thymidin in
die neu synthetisierte DNA proliferierender Zellen eingebaut. Nach
der Markierung wurden die Zellen gewaschen, fixiert und denaturiert,
und die Menge an eingebautem BrdU wurde mittels colorimetrischem
ELISA unter Verwendung eines Peroxidase-gekoppelten anti-BrdU-Antikörpers entsprechend
den Anweisungen des Herstellers (Boehringer Mannheim, Cat. No. 1647
229) gemessen (n = 6 zu jedem Zeitpunkt). Es scheint aus 2 hervorzugehen, dass die
Zellen, die in Anwesenheit von EMD gezogen wurden, eine verstärkte DNA-Synthese
zeigen, verglichen mit den Kontrollzellen, mit einer Ausnahme bei
24 Stunden.
- (c) NHDF-Zellen wurden in Kulturen für 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden
in Anwesenheit oder Abwesenheit (Kontrollen) von EMD gezogen. Die
Kulturen wurden dann mit PBS gewaschen und die Zellen wurden im Mikroskop
unter Verwendung eines festen Rasters gezählt. Es wurden fünf unterschiedliche
Bereiche in jeder von 6 parallelen Kulturen zu jedem Zeitpunkt ausgezählt. Nach
72 Stunden zeigten die Zellkulturen, die in Anwesenheit von EMD
gezogen wurden, einen schnellen Anstieg in der Zelldichte, verglichen
mit den unbehandelten Kontrollen (3).
- (d) NHDF-Zellen wurde für
24 oder 120 Stunden kultiviert, zweimal mit PBS gewaschen und zentrifugiert. 100 μl Zellen
von jeder Kultur (n = 6 bei jedem Zeitpunkt/Experiment) wurden dann
lysiert und freigesetztes intrazelluläres cAMP wurde mittels eines
kompetitiven Enzym-Immunassays (EIA) unter Verwendung eines Amersham
Pharmacia Biotech "Biotrak
cAMP EIA"-Kits (Cat.
No. RPN 225) entsprechend den Anweisungen des Herstellers gemessen.
Verglichen mit den Kontrollen, die in Abwesenheit von EMD gezogen
wurden, zeigten NHDF-Zellen einen merklichen Anstieg an intrazellulärem cAMP
nach 24 Stunden Wachstum in Anwesenheit von EMD (4). Dieser Anstieg konnte immer noch
nach 120 Stunden in Kultur beobachtet werden. Der Anstieg an intrazellulärem cAMP
deutet darauf hin, dass die Zellen, die in Anwesenheit von EMD gezogen
wurden, ein internes Signal/interne Signale erzeugen, das/die ein
Teil eines Signalwegs für Wachstumsregulation
und Differenzierung sein könnte(n).
- (e) NHDF-Zellen wurden von Kulturen nach 24, 48, 72, 96 oder
120 Stunden geerntet (n = 5 bei jedem Zeitpunkt/Experiment), in
PBS gewaschen und zentrifugiert. 200 μl Zellen wurden lysiert, und
der Apoptose-Spiegel spezifischer Nukleinsäureabbauprodukte (Histon-gebundene DNA-Fragmente)
wurde mittels Sandwich-ELISA unter Verwendung eines "Cell Death Detection
ELISA"-Kits (Cat.
No. 1 774 425) von Boehringer Mannheim entsprechend den Anweisungen
des Herstellers quantifiziert. Die Ergebnisse sind als Verhältnis von
EMD-behandelten
Zellen zu unbehandelten Zellen dargestellt. Daher deuten Werte oberhalb von
1 auf induzierten Zelltod hin, während
Werte unterhalb von 1 ein verlängertes Überleben
der Zellen widerspiegeln. Es scheint aus 5 hervorzugehen, dass die NHDF-Zellen
eine erhöhte Überlebensrate zeigten,
wenn EMD in den Kulturen anwesend ist (Werte unterhalb von 1).
- (f) NHDF-Zellen wurden für
24, 48, 72 und 96 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit (Kontrollen)
von EMD kultiviert, mit PBS gewaschen, und die Anzahl von Multilayer-Kolonien
wurde im Mikroskop unter Verwendung eines festen Rasters gezählt. Fünf unterschiedliche
Bereiche wurden in jeder von 9 parallelen Kulturen zu jedem Zeitpunkt
ausgezählt.
Die Zellen wurden dann durch Trypsinierung geerntet und in einer Bürker-Zählkammer ausgezählt, und
die Anzahl von Multilayer-Kolonien pro 1000 Zellen wurde errechnet. Es
scheint aus 6 hervorzugehen,
dass die Anzahl an Multilayer-Kolonien in NHDF-Zellkulturen erhöht wurde,
wenn die Zellen in Anwesenheit von EMD gezogen wurden. Multilayer-Koloniebildung
konnte nach 72 Stunden Kultur beobachtet werden, und dieser ging
ein Anstieg an cAMP voran (4),
und sie fällt
mit dem Einsetzen der TGF-β-Produktion zusammen
(nicht gezeigt).
-
Basierend
auf diesen Ergebnissen wurde geschlussfolgert, dass NHDF-Zellen,
die in Anwesenheit von EMD kultiviert wurden, eine höhere Replikation,
höhere
Metabolismus-Aktivität, erhöhte Anhaftungsrate,
und die Entwicklung einer höheren
Anzahl von Multilayer-Kolonien zeigen.
-
Beispiel 2
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Pilotstudie zur Hauttransplantation
bei Schweinen
-
Einführung
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Ziel
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Das
Ziel dieser Pilotstudie war es, den Heilungsprozess von Spalthaut-transplantierten
Wunden bei Schweinen zu untersuchen und die Wirkung von EMD auf
diese Wunden zu untersuchen.
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Material und Methoden
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Tiere
-
Das
Experiment wurde mit 4 weiblichen SPF-Schweinen durchgeführt (Mischrasse
aus Danish Country, Yorkshire und Duroc). Zu Beginn der Akklimatisierungsphase
betrug das Körpergewicht
der Tiere ungefähr 35
kg.
-
Eine
Akklimatisierungsphase von 1 Woche wurde gewährt während der die Tiere täglich beobachtet wurden,
um ein Tier auszuschließen,
das einen schlechten Zustand zeigte. Alle Beobachtungen wurden aufgenommen.
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Haltung
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Die
Studie fand in einem Tierstall statt, der mit gefilterter Luft bei
einer Temperatur von 21°C ± 3°C, relativer
Feuchte von 55% ± 15%,
und einem Luftaustausch von 10 Mal/Stunde versorgt wurde. Der Raum
wurde so beleuchtet, dass sich ein Zyklus von 12 Stunden Licht und
12 Stunden Dunkelheit ergab. Die Tiere wurden individuell in Boxen
gehalten.
-
Lagerstreu
-
Die
Lagerstreu war Weichholzsägemehl "LIGNOCEL H ¾" von Hahn & Co., D-24796
Bredenbek-Kronsburg. Eine regelmäßige Untersuchung
auf mögliche
relevante Kontaminanten wurde durchgeführt.
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Futter
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Kommerziell
erhältliches
Schweinefutter "Altromin
9033", von Chr.
Petersen A/S, DK-4100
Ringsted wurde zur Verfügung
gestellt (ungefähr
800 g zweimal täglich).
Eine Analyse im Hinblick auf die Hauptnährstoffkomponenten und relevante
mögliche
Kontaminanten wurde regelmäßig durchgeführt.
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Trinkwasser
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Zweimal
täglich
wurde den Tieren Trinkwasser von Tierhaltungsqualität angeboten.
Analysen im Hinblick auf relevante mögliche Kontaminanten wurden
regelmäßig durchgeführt.
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Verwundung und Transplantation
-
Die
Wunden wurden am Tag 1 zugefügt.
Die Tiere wurden mit Stresnil® Vet. Janssen, Belgien
(40 mg Azaperon/ml, 1 ml/10 kg), und Atropin DAK, Dänemark (1
mg Atropin/ml, 0,5 ml/10 kg), verabreicht als einzelne intramuskuläre Injektion,
gefolgt von einer intravenösen
Injektion Hypnodil® Janssen, Belgien (50
mg Metomidat/ml, ungefähr
2 ml), anästhesiert.
Ein Bereich dorso-lateral auf jeder Seite des Rückens des Tiers wurde rasiert,
mit Seife und Wasser gewaschen, mit 70% Ethanol desinfiziert, welcher
mit steriler Kochsalzlösung weggewaschen
wurde, und am Ende mit sterilem Mull getrocknet.
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Acht
Spalthautwunden (25 × 25 × 0,4 mm)
wurden im vorbereiteten Bereich erzeugt, 4 auf jeder Seite des Rückgrats,
unter Verwendung eines ACCU-Dermatoms (GA 630, Aesculap®. Die
Wunden wurden durchnummeriert von 1 (am weitesten kranial) bis 4
(am weitesten kaudal) auf der linken Seite des Tieres und von 5
(am weitesten kranial) bis 8 (am weitesten kaudal) auf der rechten
Seite des Tieres. Direkt nach der Verwundung und der Hämostase
wurde die ausgeschnittene Epidermis der Wunden der Behandlung C
und D auf die Wundoberfläche
aufgebracht. Geronnenes Blut wurde mit sterilem Mull entfernt.
-
Direkt
vor der Operation, ungefähr
8 Stunden nach Ende der Operation, und wann immer danach notwendig,
wurde den Tieren eine intramuskuläre Injektion Anorfin®,
A/S GEA, Dänemark
(0,3 mg Buprenorphin/ml, 0,04 ml/kg) verabreicht.
-
Dosierung
-
Nach
dem Zufügen
der Wunden wurden die Transplantationsbetten wie folgt behandelt:
- C
- Transplantat
- D
- Transplant + EMD
-
Ungefähr 15 Minuten
vor der Dosierung wurde die EMD-Formulierung entsprechend den Anweisungen,
die vom Hersteller gegeben werden, hergestellt. Die EMD-Formulierung
wurde innerhalb von 2 Stunden nach der Herstellung verwendet. Für die Wunden
der Behandlung D wurde EMD als eine dünne Schicht zwischen der ersetzten
ausgeschnittenen Epidermis und der Wundoberfläche aufgebracht. Ein Fläschchen
EMD wurde für
4 Wunden verwendet.
-
Verband
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Die
Wunden wurden mit Tegaderm® verbunden. Die Verbände wurden
mit einer Mullbandage bedeckt, die durch Fixomul® fixiert
wurden. Die Verbände,
der Mull und das Fixomul® wurden mittels eines
netzartigen Körperstrumpfes
am Ort gehalten. Bend-a-rete® (Tesval, Italien). Die
Verbände
wurden täglich
beobachtet. Die Verbände
wurden am Tag 2 (bei allen Tieren) und 3 (Tieren Nr. 3 und 4) gewechselt.
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Vor
jedem Wechsel wurden die Tiere mit einer intramuskulären Injektion
in den Nacken (1,0 ml/10 kg Körpergewicht)
eines Gemisches aus Zoletil 50® Vet., Virbac, Frankreich
(125 mg Tiletamin und 125 mg Zolazepam in 5 ml Lösungsmittel, 5 ml), Rompun® Vet.,
Bayer, Deutschland (20 mg Xylazin/ml, 6,5 ml), und Methadon® DAK,
Nycomed DAK, Dänemark
(10 mg Methadon/ml, 2,5 ml), anästhesiert.
-
Beobachtung der Transplantate
-
Jedes
Transplantat wurde am Tag 2 (bei allen Tieren), 3 (bei allen Tieren)
und 4 (bei Tieren Nr. 3 und 4) beobachtet und fotografiert. Der
Grad der Exsudation und Entzündung
wurde ermittelt.
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Klinische Anzeichen
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Alle
sichtbaren Anzeichen mangelnder Gesundheit und jedwede Verhaltensveränderungen
wurden täglich
aufgenommen. Jede Abweichung vom Normalzustand wurde im Hinblick
auf den Zeitpunkt des Beginns, der Dauer und der Intensität aufgenommen.
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Körpergewicht
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Die
Tiere wurden am Tag der Ankunft gewogen, am Tag des Zufügens der
Wunde und am Ende der Studie.
-
Endbeobachtungen
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Am
Tag 3 (ungefähr
56 Stunden nach dem Zufügen
der Wunde) wurden Tiere Nr. 1 und 2 nach Betäubung mit einer Bolzenpistole
durch einen Schnitt durch die Arteria und die Vena subclavia getötet.
-
Am
Tag 4 (ungefähr
72 Stunden nach dem Zufügen
der Wunde) wurden Tiere Nr. 3 und 4 nach Betäuben mit einer Bolzenpistole
durch einen Schnitt durch die Arteria und die Vena subclavia getötet.
-
Probennahme
von Gewebe
-
Jede
Wunde wurde als Block getrennt von Skelettmuskelgewebe freigeschnitten.
Jeder Block wurde in Phosphat-gepuffertem neutralem 4%-igem Formaldehyd
fixiert.
-
Histologische Präparation
-
Nach
der Fixierung wurden vier repräsentative
Proben von allen Wunden in Paraffin eingebettet, mit einer nominellen
Dicke von 5 μm
geschnitten, und mit Hämatoxylin
und Eosin gefärbt.
Nach dem Färben
wurden die Schnitte unter dem Lichtmikroskop unter Verwendung eines
Rasters beobachtet. Dies erlaubte die Messung der Gesamtmenge des
Transplantationsbettes und der Länge
der epithelialisierten Oberfläche.
Dieses Verhältnis
wurde als prozentualer Anteil des Transplantationsbettes, der mit
Epithelzellen bedeckt war, pro Schnitt ausgedrückt. Die Durchschnittswerte
von jeder Wunde wurden genommen, wonach die Durchschnittswerte der
Gruppen errechnet wurden.
-
Statistiken
-
Die
Daten werden so aufbereitet, dass sie Gruppendurchschnittswerte
und Standardabweichungen angeben, wo dies angebracht ist. Mögliche Ausreißer werden
ebenfalls identifiziert. Danach wird jede kontinuierliche Variable
auf Homogenität
der Varianz mit dem Bartlett-Test untersucht. Wenn die Varianz homogen
ist, wird die Untersuchung der Varianz für die Variable durchgeführt. Wenn
irgendwelche signifikanten Unterschiede gemessen werden, werden
mögliche
Unterschiede zwischen den Gruppen mit dem Dunnett-Test untersucht.
Wenn die Varianz heterogen ist, wird jede Variable auf Normalität mittels
des Shapiro-Wilk-Verfahrens getestet. Im Falle einer Normalverteilung
werden die möglichen
Unterschiede zwischen den Gruppen mittels des Student-t-Tests identifiziert.
Ansonsten werden die möglichen
Unterschiede zwischen den Gruppen mittels des Kruskal-Wallis'schen Tests untersucht.
Wenn jeder signifikante Unterschied zwischen den Gruppen detektiert
ist, wird die anschließende
Identifikation der Gruppen mittels des Wilcoxon-Rank-Surn-Tests
durchgeführt.
-
Die
statistischen Analysen werden mit SAS®-Verfahren
(Version 6.12), beschrieben in „SAS/STAT® User's Guide, Version
6, Vierte Ausgabe, Band 1 + 2",
1989, SAS Institute Inc., Cary, North Carolina 27513, USA, durchgeführt.
-
Ergebnisse
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Klinische
Beobachtungen in der Pilotstudie zeigten eine schnelle Epithelialisierung
der transplantierten Wunden, welche mit EMD behandelt wurden, im
Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Es wurde außerdem weniger
Exsudat bei diesen Transplantaten beobachtet. Die Ergebnisse der
Histologie zeigten weniger Exsudat und weniger extravasierte Blutzellen,
was eine geringere Entzündung
anzeigt.