DE4427221A1 - Retrovirus-induzierte Osteoklasten-Modulation für die Osteoporose-Therapie - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Verringerung des durch Osteoklasten hervorgerufenen, unphysiologischen Knochenabbaus bei der Osteo­ porose und anderen, durch Knochenschwund charakterisierten Ske­ lettveränderungen.

Die Knochenmatrix ist während des ganzen Lebens einem ständigen Umbau unterworfen, wobei sowohl der Knochenaufbau als auch der Knochenabbau durch zahlreiche Faktoren reguliert wird. Dabei erfolgt die Neubildung von Knochengewebe durch Osteoblasten, der Abbau von Knochengewebe durch Osteoklasten. Durch eine ge­ ordnete Regulation dieser Vorgänge bleibt, ungeachtet des gene­ tisch programmierten Knochenwachstums, die Form sowie die phy­ sikalische Funktion des Knochens und somit des gesamten Skeletts über mehrere Jahrzehnte erhalten (Skeletthomeosta­ se).

Mit zunehmendem Alter kommt es insbesondere bei der Frau zu einem fortschreitenden Verlust an mineralisiertem Knochengewe­ be, der aufgrund veränderter Struktur und verminderter Funktion des Skeletts vermehrt zu Knochenbrüchen führt. Dieser auf einer Imbalanz zwischen Osteoblastenaktivität und Osteoklastenakti­ vität begründete Knochenverlust wird als Osteoporose klinisch manifest und verursacht erhebliche gesundheitliche und sozio­ ökonomische Probleme.

Bisher gibt es für die Osteoporoseprophylaxe bzw. für die Osteo­ porosetherapie mehrere Ansätze mit sehr unterschiedlichen, ge­ nerell gesehen jedoch insgesamt unbefriedigenden Ergebnissen. Dazu gehören:

• a) eine Östrogenprophylaxe, bei der dem positiven Einfluß auf die Knochenzellen und den Lipidstoffwechsel das Risiko einer Thromboembolie entgegensteht,
• b) eine erhöhte Kalziumgabe,
• c) eine Kalzitoninbehandlung, welche selbst bei nasaler Ap­ plikation die Knochenresorption in einem gewissen Umfang hemmt,
• d) eine Vitamin D-Therapie, die jedoch für eine prophylakti­ sche Behandlung keine eindeutigen Ergebnisse erbrachte und bei therapeutischer Anwendung stark von der Dosierung und von der Wahl des biologisch wirksamen Vit. D-Metaboliten abhängt und außerdem jederzeit die Gefahr der Entwicklung einer Hyperkalzä­ mie in sich trägt.

In jüngster Zeit konnten in einer Reihe von in vivo- und in vi­ tro-Untersuchungen in unseren Labors experimentell gezeigt wer­ den, daß durch Infektion von Osteoblasten mit Retroviren (MuLV), insbesondere mit dem RFB Virus, entweder lokal oder generalisiert die Knochenneubildung signifikant induziert wird. In infizierten Labormäusen kommt es dabei zur Entstehung von Osteomen und Osteopetrose. Bei der Infektion von Knochenzellen in vitro mit Retroviren, insbesondere mit dem RFB Virus, kommt es zu einer Erhöhung der osteoblastischen Differenzierung. Dar­ aus ergibt sich, daß entweder ein virus-kodierter Faktor oder ein durch die Virusinfektion in der Zelle induzierter Faktor für die Erhöhung der Differenzierungsleistung verantwortlich ist. Die daraus sich ableitende therapeutische Ausnutzung der biologischen Aktivität von sogenannten osteoinduktiven Retro­ viren für eine Induktion der Knochenzell-Differenzierung und somit Erhöhung der Knochenmatrix-Produktion ist in der DE 44 11 718.3, eingereicht beim Deutschen Patentamt am 5.4.1994, be­ schrieben.

Ein Nachteil des in der DE 44 11 718.3 beschriebenen Verfahrens liegt darin, daß der Abbau der natürlichen Knochensubstanz nicht verhindert wird.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Weg zur therapeutischen Behandlung von Osteoporose und anderen, mit dem Verlust von Knochengewebe einhergehenden Krankheiten auf­ zuzeigen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß mit ei­ nem osteoinduktiven Retrovirus infizierte menschliche oder tie­ rische Osteoblasten zur Produktion und Isolation eines oder mehrerer Faktoren verwendet werden, der bzw. die die Funktion von Osteoklasten modulieren kann bzw. können, wobei der oder die Faktoren aus den infizierten Osteoblastenzellen oder aus dem Zellkulturüberstand infizierter Osteoblastenzellen isolier­ bar sind.

Bei dem Faktor handelt es sich um eines oder mehrere Proteine, die vom Virus kodiert oder vom Virus in der Zelle induziert werden. Dieses Protein bzw. diese Proteine können

• a) die Bereitstellung von Osteoklastenvorläufer-Zellen aus dem hämatopoetischen System inhibieren (Rekrutierungsinhibi­ tion) und/oder
• b) die knochen-resorbierende Aktivität von differenzierten Osteoklasten inhibieren (Funktionsinhibition)).

Erfindungsgemäß wurde überraschend festgestellt, daß Osteobla­ sten nach einer RFB Retrovirusinfektion nicht mehr in der Lage sind, die Osteoklastenrekrutierung aus undifferenzierten Vor­ läuferzellen und die Ausbildung zu differenzierten Osteokla­ sten, das heißt die Neubildung von knochensubstanz-abbauenden Zellen, zu bewerkstelligen.

Erfindungsgemäß wurde somit gefunden, daß im Gegensatz zur di­ rekten Induktion der Knochenproduktion durch eine Retrovirusin­ fektion von Osteoblasten, wie sie in der obengenannten DE 44 11 718.3 beschrieben wurde, eine Inhibition des Knochenabbaus ebenfalls, und zwar indirekt, zur einer stetigen Erhöhung der Gesamtmenge an Knochengewebe führt und dadurch bei beginnender oder bereits fortgeschrittener Osteoporose die Skeletthomeosta­ se sicherstellt.

Im Skelett sind knochenaufbauende und knochenabbauende Zellen selten in direkter, zellulärer Nachbarschaft gelegen. Aus die­ sem Grund sind osteoblasten-vermittelte Signale, sofern sie die Osteoklastenaktivität regulieren, als exo- bzw. parakrine Fak­ toren anzusehen. Die bioaktiven Moleküle sind deshalb direkt durch das Virus kodiert oder als Folge einer Virusinfektion eines Osteoblasten in der Zielzelle induziert und wirken entwe­ der innerhalb einer "Mikroumgebung" oder, über die Blutbahn verteilt, auf weiter entfernt liegende Zielzellen.

Die biologische Wirkung von Osteoklasten im Skelett im Rahmen des sogenannten "bone remodeling" ist eine Folge enger Wechsel­ wirkungen zwischen Osteoblasten und Osteoklasten (Rodan und Martin, Calcif. Tissue Int.). Ein Eingriff in diese Wechselwir­ kungen durch eine Retrovirusinfektion im experimentellen System hat somit

• a) eine verminderte Rekrutierung von Osteoklasten aus Vorläu­ ferzellen und/oder
• b) eine Reduktion des Knochenabbaus durch Osteoklasten zur Fol­ ge.

Erfindungsgemäß wird durch die Infektion von Osteoblasten mit osteoinduktiven Retroviren eine Reduktion der Osteoklastenre­ krutierung aus Vorläuferzellen und/oder eine Reduktion der bio­ logischen Aktivität differenzierter Osteoklasten erreicht.

Die vorliegende Erfindung wird auch durch andere Retroviren, die für ein Polypeptid oder mehrere Polypeptide mit osteokla­ sten-modulierenden Aktivitäten kodieren oder entsprechende Fak­ toren in der Zielzelle induzieren, gelöst. Der Begriff "osteoklasten-modulierende Aktivitäten" betrifft in diesem Zu­ sammenhang den Erhalt der Skeletthomeostase in Situationen, in denen ansonsten ein erhöhter Abbau von Knochengewebe durch ver­ stärkte Osteoklastenaktivität gegeben ist oder eine stetige Zunahme von Knochengewebe beobachtet wird.

Diese Retroviren können auch im Tierexperiment eine Knochenneu­ bildung induzieren. Der Begriff "Knochenneubildung" bedeutet in diesem Zusammenhang die generelle Zunahme der Trabekeldicke in der Knochenspongiosa von Röhrenknochen und Wirbelkörpern, die Zunahme und Verstärkung des Knochenschaftes im diaphysären und metaphysären Bereich langer Röhrenknochen sowie die lokale Kno­ chenneubildung im gesamten Skelettbereich.

Retroviren mit osteoinduktiven Eigenschaften wurden isoliert:

• - direkt aus dem Mausgenom klonierte Retroviren (Murray et al. Osteopetrosis induced by retrovirus, mouse. Monographes on Pa­ thology of Laboratory animals. Springer Berlin, Heidelberg, New York. T.C. Jones, U. Mohr, R.d. Hunt (Eds.), ILSI, Seiten 284-291, 1991; Luz et al., Osteoma mouse, spontaneous and virus­ induced. Monographs on Pathology of Laboratory Animals, Sprin­ ger Berlin, Heidelberg, New York. T.C. Jones, U. Mohr, R.D. Hunt (Eds.), ILSI, Seiten 182-190, 1991; Pedersen et al. Virology 179, S. 931-935, 1990;
• - aus normalem Knochengewebe (OL-6 MLV, Schmidt et al. 1988, Leuk. Res., 12, S. 393-403);
• - aus bestrahltem Knochengewebe im Verlauf der Knochentumorent­ stehung, (OL-1, OL-2, OL-7, OL-8 MLV, Schmidt et al. 1988, Leuk. Res. 12, Seiten 393-403);
• - aus spontan entstehenden, benignen Knochentumoren (OA MLV, Schmidt et al. 1984, Journal of General Virology, 65, S. 2237-2248); RFB, Pedersen et al. 1992, Journal of Virology , 66, S. 6186-6190);
• - aus Osteosarkomen, (OS-5 MLV, Erfle et al. 1986 (Leuk. Res., 10, S. 905-913);

RFB MLV, Pedersen et al. 1992; Bone tumor viruses. In: Bone- Certain aspects of neoplasia. Colston Papers No. 24 (ed. Price, C., H., G., Ross, F., G., M.) 353-366, Butterworth, London.

Erfindungsgemäß wird bevorzugt das RFB Retrovirus, bevorzugt in der molekular geklonten Form (RFB-14), verwendet, produziert von der Zellinie RFB MBK 6a (DSM ACC 2146).

Als gemeinsames Merkmal induzieren diese Viren nach Injektion in neugeborene Mäuse, in Abhängigkeit vom Mäuse-Teststamm, Kno­ chenveränderungen wie Osteopetrose und Osteome und in unter­ schiedlichem Maße auch Lymphome. Die stärkste biologische Wirksamkeit dieser Retroviren auf Skelettzellen hat das RFB Virus. Im Teststamm CBA ist acht Monate nach der Infektion mit RFB Virus noch keine Lymphombildung feststellbar, während zu diesem Zeitpunkt bereits in über 50% der Mäuse multiple Osteo­ me entstanden.

Bevor diese Knochenveränderungen voll ausgeprägt sind, stirbt in anderen Mäusestämmen, wie z. B. in NMRI-Mäusen, ein hoher Prozentsatz der Tiere an den durch die osteoinduktiven Retrovi­ ren induzierten Lymphomen. Nicht nur das RFB-Retrovirus, son­ dern auch die anderen, obengenannten osteoinduktiven Retroviren sind demnach für bestimmte infizierte Mäuse pathogen, und sie führen zum frühzeitigen Tod.

Die Lymphominduktion und die von den osteoinduktiven Retroviren verursachten Knochenveränderungen (Osteopetrose und Osteome) sind unphysiologischer, pathologischer Natur; letztere gehen mit einer unkontrollierten Zunahme an Knochengrundsubstanz ein­ her. Es war deshalb überraschend, daß osteoinduktive Retroviren zur Entwicklung eines Therapeutikums zur Behandlung degenerati­ ver Knochenerkrankungen verwendbar sind.

Osteopetrose ist gekennzeichnet durch eine Verdickung des Kno­ chenschafts im Bereich langer Röhrenknochen und einer fokalen bzw. generalisierten Verdickung der Knochenbälkchen im Spongio­ sa-Bereich der Wirbelkörper. In stärker ausgeprägten Formen kann es zum vollständigen Verlust der Knochenmarkhöhle und Er­ satz von Knochenmark durch kompaktes Knochengewebe kommen. In diesen Fällen kommt es auch durch massiven Zuwachs von Knochen­ gewebe an den Knochenbälkchen im Spongiosabereich der Wirbel­ körper zum vollständigen Verlust der Spongiosastruktur und zur Entstehung eines soliden, "petrosierten" Knochens (A.B. Murray, J. Schmidt, A. Luz Osteopetrosis induced by retrovirus, mouse. In: Cardiovascular and Musculoskeletal Systems, T.C. Jones, U. Mohr, R.D. Hunt (Eds.) Springer, 1991).

Der von mit osteoinduktiven Retroviren infizierten Osteoblasten produzierte, osteoklasten-modulierende Faktor wirkt auf Osteo­ klastenvorläufer-Zellen und auf Osteoklasten und kann zur Ent­ wicklung eines Arzneimittels zur Therapie der Osteoporose her­ angezogen werden.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beilie­ gende Abbildung näher erläutert.

Die Abbildung 1 zeigt die Induktion von multinukleären, TRAP- positiven Zellen nach einer Behandlung von Milzzellen mit 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ und verschiedenen Retroviren.

Osteoklasten stammen von hämatopoetischen Stammzellen ab (Hat­ tersley und Chambers, J. Cell Physiol. 140: 478-482, 1989; Hage­ naars et al., Bone Miner. 6: 187-190, 1989). Die Induktion von Osteoklasten aus Stammzellen erfolgt durch zelluläre Wechsel­ wirkungen in Folge eines Zell-Zell-Kontaktes zwischen hämato­ poetischen Vorläuferzellen und Stromazellen (Takahashi et al., Endocrinology 123: 2600-2602, 1988). Osteoklasten-induktive Stro­ mazellen finden sich vornehmlich im Knochenmark, wobei sich Osteoklasten-Vorläuferzellen im Knochenmark und in der Milz finden. Es gibt bereits auch in vitro wachsende Zellen, die sowohl Stromazell-Eigenschaften als auch osteoblastäre Eigen­ schaften aufweisen; jedoch sind nur wenige kontinuierliche Zel­ linien in der Lage, ähnlich wie Stromazellen, die Induktion von Osteoklasten aus Milzzellpopulationen zu bewerkstelligen (Ya­ mashita et al., J. Cell Physiol. 145: 587-595, 1990). Im experimentellen System wird die Induktion von Osteoklasten aus Knochenmark oder Milzzellen durch Vitamin D₃ (1,25(OH)₂D₃) (Fuller und Chambers, J. Cell Physiol. 132: 4412, 1987) und Prostaglandin E₂ (PGE₂) (Akatsu et al., J. Bone Miner. Res. 4: 29-35,1989) verstärkt, wobei PGE₂, das auch von hämatopoeti­ schen Zellen produziert wird, wiederum auf hämatopoetische Stammzellen wirkt und im Zellkontakt mit Stromazellen die Osteoklasteninduktion hervorruft (Collins und Chambers, J. Bone Miner. Res. 7: 555-561, 1992).

Bei Untersuchungen des onkogenen Potentials von murinen Retro- Viren auf das Skelett von jungen Mäusen wurde festgestellt, daß virusinfizierte Mäuse bis zu 100% Osteopetrose entwickeln (Pe­ dersen et al., J. Virol. 179: 931-935, 1990). Osteopetrose ist gekennzeichnet durch eine Verdickung des Knochenschafts im Be­ reich langer Röhrenknochen und einer Verdickung der Knochen­ bälkchen im Spongiosa-Bereich der Wirbelkörper. In stärker aus­ geprägten Formen kann es zum vollständigen Verlust der Knochen­ markhöhle und Ersatz von Knochenmark durch kompaktes Knochenge­ webe kommen. In diesen Fällen kommt es auch durch massiven Zu­ wachs von Knochengewebe an den Knochenbälkchen im Spongiosabe­ reich der Wirbelkörper zum vollständigen Verlust der Spongiosa­ struktur und zur Entstehung eines soliden, "petrosierten" Kno­ chens (A.B. Murray, J. Schmidt, A. Luz Osteopetrosis induced by retrovirus, mouse. In: Cardiovascular and Musculoskeletal Sy­ stems, T.C. Jones, U. Mohr, R.D. Hunt (Eds.) Springer, pp 284-291, 1991).

Die Entstehung von Osteopetrose als Folge einer Retrovirusin­ fektion kann einerseits als direkte Folge einer Infektion von Osteoblasten und anschließender kontinuierlicher, erhöhter Ma­ trixprotein-Bildung gesehen werden (Schmidt et al., Am J. Pathol. 129: 503-510, 1987; Livne et al., Calcif. Tissue Int. 44: 25-35, 1989). Andererseits kann eine Störung der Skelettho­ meostase mit kontinuierlichem Knochenzuwachs auch aus einer Reduktion der Gesamtzahl der Osteoklasten im Skelett und somit aus einer daraus resultierenden verminderten Knochenresorption entstehen.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß das RFB-Virus und ande­ re, osteoinduktive Retroviren in der Lage sind, die Osteokla­ steninduktion signifikant zu vermindern, was im Umkehrschluß eine Zunahme der Knochenneubildung bewirkt. Dieses Ergebnis war äußerst überraschend, da die gesamte Literatur und insbesondere die DE 44 11 718.3 ausschließlich die knocheninduzierenden Ei­ genschaften osteoinduktiver Retroviren, insbesondere des RFB- Retrovirus, beschreiben.

Obwohl die Verminderung der Osteoklasteninduktion eine an sich krankhafte Zunahme der Knochenneubildung bewirkt, ist die vor­ stehende Erfindung auch zur Entwicklung eines Therapeutikums zur Behandlung von z. B. altersbedingtem Knochenschwund einsetz­ bar. Dieser Schritt ist insofern erstaunlich und unerwartet, als diese Viren in den infizierten Mäusen pathogen sind und nicht nur die Veränderungen des lymphatischen, sondern auch die des knochenbildenden Systems unphysiologischer, pathogener Na­ tur sind.

Erfindungsgemäß wird aus der infizierten Zelle oder dem Über­ stand, d. h. aus dem Nährmedium, RFB-Virus-infizierter Osteobla­ sten-Vorläuferzellen mit Stromazellcharakter ein Faktor, näm­ lich ein Protein, bereitgestellt, der osteoklasten-modulierende Aktivitäten besitzt. Die Induktion dieses Faktors erfolgt durch das RFB Virus. Eine kontinuierlich wachsende Zellinie (RFB MBK 6a), die das RFB-14 Provirusgenom enthält, wurde am 18. 8. 1993 bei der DSM hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer DSM ACC2146 (vgl. DE 44 11 718.3).

Erfindungsgemäß wird somit bevorzugt das RFB-Retrovirus, ins­ besondere bevorzugt in seiner molekular geklonten Form als RFB- 14, verwendet. Erfindungsgemäß können aber auch andere osteoin­ duktive Retroviren verwendet werden, die weiter oben in der Beschreibung näher gekennzeichnet sind. Weiterhin bevorzugt wird die DNA oder RNA dieser osteoinduktiven Retroviren verwen­ det, entweder in ihrer vollständigen Sequenz oder in Form einer Teilsequenz hiervon, wobei diese Sequenzen weiterhin bevorzugt in einem geeigneten Vektosystem vorliegen.

Die Natur des osteoklasten-modulierenden Faktors ist noch unbe­ kannt, wobei es sich mit an Sicherheit grenzender Wahrschein­ lichkeit jedoch um ein Protein oder um mehrere Proteine han­ delt. Der osteoklasten-modulierende Faktor wird entweder vom osteoinduktiven Retrovirus kodiert oder von diesem in der Zelle induziert. Die DNA oder RNA der osteoinduktiven Retroviren ko­ dieren somit für einen osteoklasten-modulierenden Faktor oder induzieren diesen. Bevorzugt werden Heilsequenzen der DNA oder der RNA der osteoinduktiven Retroviren verwendet, die für den osteoklasten-modulierenden Faktor kodieren oder diesen induzie­ ren. Damit hybridisieren die DNA oder RNA, bevorzugt unter stringenten Bedingungen, sind ebenfalls verwendbar.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der unten aufgeführten Experimente und der darauf resultierenden Befunde in der bei­ liegenden Tabelle und Abbildung näher erläutert.

Durchführung der Experimente:
Für den experimentellen Nachweis der Induktion der Osteokla­ stenrekrutierung und der Verminderung der Osteoklasteninduktion aus undifferenzierten Vorläuferzellen durch Retroviren werden Zellkulturen aus Milzgewebe junger Mäuse verwendet. Dazu wird aus der Milz eine Einzelzellsuspension hergestellt. Diese Milz­ zellen werden in einer Zahl von 5×10⁵ Zellen pro Vertiefung zusammen mit jeweils 4×10⁴ Osteoblasten in Multi-Loch-Platten (96 Vertiefungen pro Platte) kultiviert. Die Osteoblasten stam­ men aus dem knöchernen Schädeldach neugeborener Mäuse, aus de­ nen durch fraktionierten enzymatischen Verdau des Gewebes eine Einzelzellpopulation herstellt wurde. Für die Verminderung der Osteoklastenrekrutierung werden die für die Kokultivierung vor­ gesehenen Osteoblasten mit RFB Virus oder anderen Retroviren infiziert.

2 Tage nach Beginn der Kultur werden 100 µl des Zellkulturmedi­ ums entnommen und durch neues Medium (D′MEM, 10% fötales Köl­ berserum, Antibiotika, 10^-8M 1,25(OH)₂ Vitamin D₃) ersetzt. 3 bis 5 Tage nach Beginn der Kokultivierung dieser zwei Zellpopu­ lationen werden die Zellen 2 mal mit gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit 3%iger Formalinlösung fixiert. Danach wird den Zellen eine Substratlösung, die mit Tartrat versetzt wurde, zugesetzt. Tartrat-Resistenz ist zusammen mit der Expression des Calcitonin-Rezeptors ein spezifisches Merkmal von Osteokla­ sten. Nach etwa 30-60 Min Einwirkungszeit der Substratlösung färben sich einkernige und mehrkernige Zellen an. Erstere stel­ len Osteoklastenvorläuferzellen, letztere stellen Osteoklasten dar. Mit dem Lichtmikroskop kann die jeweilige Zahl der gefärb­ ten Zellen quantitativ bestimmt werden. Die Experimente werden zur statistischen Absicherung im 4-fach Parallelansatz durchge­ führt. Die Zahl der gefärbten Zellen ergibt ein Maß für die Osteoklasten-Rekrutierungsaktivität der verwendeten Osteobla­ stenpopulation bzw. für den Effekt der Retrovirusinfektion der Osteoblasten auf die Reduktion der Osteoklasten-Rekrutierungs­ aktivität.

Die Tabelle 1 zeigt die Induktion von mononukleären (Osteokla­ stenvorläufer) und multinukleären (Osteoklasten), TRAP (tar­ trat-resistente, saure Phosphatase, ein Osteoklasten-Marker)­ positiven Zellen nach einer Behandlung von Milzzellen mit 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ und RFB Virus. Die Behandlung zeigt eine signifikante Reduktion der Osteoklastenvorläufer (p<0.005) bzw. der Osteoklasten (p<0.05)-Rekrutierung in zwei unabhängigen Experimenten.

Die Abbildung 1 zeigt die Induktion von multinukleären (Osteo­ klasten), TRAP-positiven Zellen nach einer Behandlung von Milz­ zellen mit 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ und verschiedenen Retroviren. A), Kontrollgruppe, 1,25(OH)₂ Vitamin D₃-Behandlung; B) negative Kontrolle, die Osteoblasten wurden mit Virus-freiem Medium be­ handelt; C) die Osteoblasten wurden mit einem Retrovirus (λOTS- 25G18, Pedersen et al., Virology 179: 931-935, 1990) mit gerin­ ger biologischer Aktivität, behandelt; D) die Osteoblasten wur­ den mit RFB Virus, einem Retrovirus mit hoher biologischer Ak­ tivität, behandelt. Die biologische Aktivität ist durch stetige Zunahme von Knochengewebe in infizierten Mäusen definiert. Die Behandlung der Zellen im in vitro-Experiment zeigt eine geringe Reduktion der Osteoklasten-Rekrutierung bei λOTS-25-G18 (p<0,05) und eine starke Reduktion der Osteoklasten-Rekrutie­ rung bei RFB Virus (p<0,005).

Zur Induktion und Produktion dieses osteoklasten-modulierenden Proteins bzw. dieser Proteine werden menschliche oder murine Osteoblasten infiziert bzw. transfiziert, das so induzierte Protein aus den Zellen oder dem Zellüberstand isoliert und di­ rekt oder nach einer Filtration zur Eliminierung infektiöser Viruspartikel als Therapeutikum oder zur Entwicklung eines sol­ chen bereitgestellt. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich aufgrund seiner hohen biologischen Wirksamkeit besonders gut für die Reduktion der Osteoklasten-Rekrutierung aus Vorläufer­ zellen und somit für eine Verminderung der Knochenresorption.

Geklonte Retrovirusgenome, insbesonders das RFB-Provirusgenom, sowie die für dessen biologische Wirksamkeit verantwortlichen Teilsequenzen von Retrovirusgenomen, insbesonders des RFB-Pro­ virusgenoms oder damit verwandte, hybridisierende Sequenzen können auch zur somatischen Gentherapie eingesetzt werden. Bevorzugt handelt es sich um Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren oder Teilsequenzen hiervon.

Tabelle 1

Claims (17)

1. Verfahren zur Herstellung osteoklasten-modulierender Fak­ toren durch Infektion menschlicher oder tierischer Osteo­ blastenzellen mit einem osteoinduktiven Retrovirus und Isolation der Faktoren aus den infizierten Osteoblasten­ zellen oder aus dem Zellkulturüberstand infizierter Osteo­ blastenzellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA oder die RNA osteoinduktiver Retroviren ver­ wendet wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die vollständige Sequenz oder eine Teilsequenz oder eine damit hybridisierende Sequenz der DNA oder der RNA eines osteoinduktiven Retrovirus in einem Vektorsystem verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Retrovirus das RFB-Retrovirus, bevorzugt in mole­ kular geklonter Form als RFB-14, oder damit verwandete Retroviren verwendet werden.

5. Osteoklasten-modulierender Faktor, hergestellt durch In­ fektion menschlicher oder tierischer Osteoblastenzellen mit osteoinduktiven Retroviren und nachfolgender Isolation des Faktors nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Osteoklasten-modulierender Faktor nach Anspruch 5, hergestellt durch Transfektion menschlicher oder tieri­ scher Osteoblastenzellen mit der DNA oder RNA osteoinduk­ tiver Retroviren und nachfolgender Isolation des Faktors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

7. Osteoklasten-modulierender Faktor nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß er ein oder mehrere Proteine umfaßt.

8. Osteoklasten-modulierender Faktor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er vom Retrovirus kodiert oder vom Retrovirus in der Zelle induziert wird.

9. Osteoklasten-modulierender Faktor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er die Bereitstellung von Osteoklastenvorläuferzellen aus dem hämatopoetischen System inhibiert.

10. Osteoklasten-modulierender Faktor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er die knochen-resorbierende Aktivität differenzierter Osteoklasten inhibiert.

11. DNA oder RNA osteoinduktiver Retroviren oder eine damit hybridisierende Sequenz, die für eine osteoklasten-modu­ lierenden Faktor kodiert oder diesen induziert.

12. Teilsequenz einer DNA oder RNA osteoinduktiver Retroviren oder eine damit hybridisierende Sequenz, die für einen osteoklasten-modulierenden Faktor kodiert oder diesen in­ duziert.

13. DNA oder RNA nach einem der Ansprüche 11 oder 12 in einem Vektorsystem.

14. Verwendung osteoinduktiver Retroviren oder DNA oder RNA osteoinduktiver Retroviren oder damit hybridisierender DNA oder RNA oder Teilsequenzen hiervon zur Gewinnung eines osteoklasten-modulierenden Faktors aus Osteoblastenzellen.

15. Verwendung der DNA oder RNA osteoinduktiver Retroviren oder damit hybridisierender DNA oder RNA oder Teilsequen­ zen hiervon zur somatischen Gentherapie bei Mensch oder Tier.

16. Verwendung eines von osteoinduktiven Retroviren oder von DNA oder RNA osteoinduktiver Retroviren, Teilsquenzen hiervon oder damit hybridisierender Sequenzen induzierten oder produzierten osteoklasten-modulierenden Faktors zur Behandlung von durch Knochenschwund charakterisierten Ske­ lettveränderungen, insbesondere der Osteoporose, bei Mensch oder Tier.

17. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als osteoinduktives Retrovirus das RFB Retrovirus, bevorzugt das RFB-14 Retrovirus, verwendet wird.