DE4422801A1 - Elektroosmotische Flußsteuerung unter Verwendung von Gegendruck bei der Kapillarelektrophorese - Google Patents

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf eine Kapillarstruktur und auf ein Verfahren zur Steuerung des elektroosmotischen Flus­ ses (EOF) in einer Kapillarelektrophorese-Vorrichtung.

Die Kapillarelektrophorese (CE) ist eine allgemein bekannte analytische Technik, bei der die Komponenten (Ionenspezies) eines Analyts auf der Grundlage ihres Verhältnisses von Ladung zu Beweglichkeit getrennt werden. Bei einem typischen Kapillarzonenelektrophorese-System (CZE-System) (eine gängi­ ge Realisierung der CE) wird das Analyt zusammen mit einem Trägerelektrolyt oder einem Puffer in ein Ende einer Kapil­ lare geringen Durchmessers eingeführt und ein starkes elek­ trisches Trennpotential (ein elektrisches Feld) wird axial über die Länge der Kapillare angelegt. Stärker geladene und beweglichere Komponenten des Analyts tendieren dann dazu, sich schneller durch die Kapillare zu bewegen, so daß Kompo­ nenten in verschiedene Bänder oder Regionen getrennt werden. Dann wird ein Detektor, der üblicherweise auf Licht basiert, verwendet, um den Durchgang jedes Bandes nach einer Detek­ tionsregion zu erfassen und um die Geschwindigkeit der Wanderung der verschiedenen Bänder (auch bekannt als "Spit­ zen") durch die Kapillare zu bestimmen. Die absoluten und relativen Geschwindigkeiten der Wanderung, genauso wie spektographische oder andere Detektor-Informationen, können dann mit bekannten Strukturen verglichen werden, um teil­ weise zu bestimmen, welche chemischen oder biochemischen Komponenten sich in dem Analyt befinden.

Idealerweise trennen sich die verschiedenen Komponenten oder Spezies in dem Analyt in schmale, gut-getrennte Bänder: wenn aneinander angrenzende Bänder zu breit sind, können sie überlappen und es unmöglich machen, sie genau zu unterschei­ den.

Die Kapillarelektrophorese wird meist in runden Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 50 Mikrometern durchgeführt, da empirisch herausgefunden wurde, daß diese Größe gute Ver­ haltenskompromisse ergibt. Diese Größe ist groß genug, um eine empfindliche Erfassung zu ermöglichen, jedoch nicht so groß, als daß übermäßige radiale Wärme- und Viskositäts-Gra­ dienten erzeugt werden, welche die Bänder verbreitern und die Auflösung zerstören.

Bei diesem Kapillardurchmesser von 50 Mikrometern erzeugt der elektroosmotische Fluß (EOF) einen gut entwickelten bol­ zenförmigen Fluß. An den Rändern der Kapillare ist der Fluß laminar und ausgeschert, jedoch liegt die Dicke dieser Dop­ pelschichtregion bei gewöhnlich verwendeten Puffern und pH-Werten in einer Größenordnung von Mikrometern. Das Fluß­ geschwindigkeitsprofil steigt daher über die äußeren Mikro­ meter des Flußbolzens schnell an, und gehen dann in eine ziemlich flache Region über dem breiten Zentrum des Fluß­ profils über. Folglich fließt der Großteil des Elektrolyts mit derselben Geschwindigkeit und eine ungewünschte laminare Mischung, welche die Spitzen verbreitern würde, ist mini­ miert. Der Nachteil bei diesem Betriebsbereich liegt jedoch im wesentlichen im EOF, welcher detaillierter nachfolgend erörtert wird.

Kapillarröhren, die bei der CE verwendet werden, sind nor­ malerweise aus Quarzglas hergestellt. Über einem pH-Wert von etwa vier haften negative Ionen in dem Trägerlektrolyt an den Silanolgruppen des Quarzglases an und hinterlassen eine Konzentration von positiv geladenen Ionen in der Nähe der radial inneren Seite der Doppelschicht. Die resultierende Schicht von negativen Ionen, die an der Quarzoberfläche haftet, und die Schicht der positiven Ionen, die sich von der Oberfläche weg erstrecken, bilden die gut bekannte "Doppelschicht"-Struktur in der Nähe der inneren Kapillar­ wand. Unter dem Einfluß des großen elektrischen Feldes, das axial entlang der Kapillare angelegt wird, hat diese La­ dungskonzentration positiver Ionen ein beträchtliches uner­ wünschtes Vorwärtspumpen zu der Kathode hin, d. h. zu dem Ende der Kapillare hin, das in der "negativen" Region des angelegten elektrischen Feldes liegt, zur Folge. Der elek­ troosmotische Fluß (EOF) ist der Massenfluß in der Trenn­ kapillare, der durch dieses Pumpen verursacht wird, d. h. der eine Folge der Ionen in der Doppelschicht ist, die durch das axiale Trennpotential bewegt werden. Dieses Potential zieht auch die die neutral geladene innere Region des Puffers in der Kapillare mit sich.

Ein bedeutendes Problem, das mit dem EOF verknüpft ist, besteht darin, daß bewirkt werden kann, daß sich das Analyt so schnell durch die Kapillare bewegt, daß die Komponenten des Analyts nicht die Zeit haben, eindeutig genug getrennt zu werden, um sie zu unterscheiden und zu identifizieren. Obwohl ein gewisser EOF wünschenswert sein kann, um es Spezies von sowohl positiver als auch negativer ionischer Ladung zu ermöglichen, den Detektor zu erreichen, bestand ein langjähriger und häufig angesprochener Bedarf nach einer Reduzierung oder Steuerung des EOF.

Eine Möglichkeit, die Wirkung des EOF auszugleichen besteht einfach darin, die Kapillare länger zu machen, so daß die Komponenten des Analyts weiter zu wandern haben, und daher mehr Zeit haben, in der sie getrennt werden sollen, voraus­ gesetzt jedoch, daß das Potential entlang der Kapillare proportional erhöht ist. Andererseits besteht ein typischer Wunsch darin, die Kapillare kürzer zu machen, um die Ver­ wendung von erschwinglicheren Leistungsversorgungen zu er­ möglichen: je länger die Kapillare ist, desto stärker muß das Trennpotential sein, um den gleichen Potential-Gradien­ ten oder das gleiche -Feld zu erreichen.

Andere herkömmliche Versuche, den EOF zu steuern, waren nur teilweise erfolgreich, oder waren nur unter einem kleinen Bereich von Bedingungen erfolgreich. Ein bekanntes Verfahren schließt die Begrenzung der Trennungen auf nur die mit einem kleinen Puffer-pH-Wert ein, was die Brauchbarkeit der CE- Vorrichtung begrenzt. Ein weiteres Verfahren schließt eine starke Erhöhung der Pufferkonzentration ein. Dies erhöht jedoch die Joule-Erwärmung, was die CE-Auflösung verschlech­ tert. Noch ein weiteres Verfahren schließt die Erhöhung der Pufferviskosität ein, jedoch kann dies die Selektivität der Vorrichtung verändern. Noch ein weiteres Verfahren schließt die chemische Bindung einer bestimmten Verbindung an der Ka­ pillarwand ein, um die Silanolstellen zu schließen, jedoch bleiben derartige Beschichtungen nicht stabil.

Gemäß einer weiteren Kategorie von Verfahren zum Steuern des EOF, wird zumindest ein radiales elektrisches Feld durch Koaxial-Leiter oder -Widerstände an die Kapillare angelegt. Derartige Felder schließen nachlaufende Felder und Hüllfel­ der von konstantem Potential ein. Die Erfahrung hat jedoch gezeigt, daß keine dieser Konfigurationen über einen breiten pH-Bereich wirksam ist.

Die Superpolierung des laminaren Flusses über den EOF ist in dem Artikel "Electrokinetic Dispersion in Capillary Electro­ phoresis," Ravindra Datta und Veerabhadra Kotamarthi, AICHE Journal, Ausgabe 36, Nr. 6, Juni 1990, erörtert. In diesem Artikel wird gezeigt, daß radiale Viskositätsänderungen auf­ grund von Joule-Erwärmung ein leicht konvexes "Bolzen"-Fluß­ profil erzeugen, was durch die Verwendung eines leichten Gegendrucks abgeflacht werden kann. Durch geeignetes Ein­ stellen des Gegendrucks wurde eine geringere Dispersion realisiert und die Plattenhöhe minimiert, d. h. die Trenn­ bänder wurden verschmälert.

Es wird ursprünglich angenommen, daß ein starker Gegendruck die Schärfe der Zonengrenzen reduziert, d. h., daß er eine Bandverbreiterung verursacht. Der vermutliche Grund besteht darin, daß der Gegendruck einen Gegenfluß oder Wirbelströme entlang der Kapillare verursacht. Elektroosmotische Kräfte wirken primär an den äußeren Rändern des Bolzens und bewegen diese Region zu dem Detektor hin, wohingegen hydrostatische Kräfte über den gesamten Querschnitt wirken und dazu neigen, einen parabolischen Rückfluß zu entwickeln, der in der Mitte der Kapillare am größten ist. Die Kapillare tendiert daher durchgehend dazu, ihren Inhalt zu mischen, wobei die äußeren Ränder vorwärts und die mittlere Region rückwärts gewirbelt werden.

Im Zusammenhang mit der Isotachophorese haben Everarts Ver­ heggen und Van De Veene experimentell gezeigt, daß kleine Rückflüsse (in der Größenordnung von 10%) das Bolzenfluß­ profil verbessern und die Zonen verschärfen. Siehe "Iso­ tachophoretic Experiments with a Counter Flow of Electro­ lyte," 123 Journal of Chromatography, Seiten 139-148, 1976. Sie bemerkten jedoch, daß sie herausfanden, daß, wenn ein Rückfluß des Elektrolyts von 100% angelegt wird (so daß der hydrodynamische Rückfluß des Elektrolyts im Gleichge­ wicht mit dem elektrophoretischen Fluß ist), die Schärfe der Zonengrenzen verloren war. Sie berichteten ferner, daß sogar bei einem Rückfluß des Elektrolyts von 50 bis 60% viele Zo­ nengrenzen vermischt wurden. Zu bemerken ist, daß diese Ex­ perimente unter Verwendung einer Trennkapillare, die einen inneren Durchmesser von 500 Mikrometer hatte, durchgeführt wurden, was zehnmal größer ist, als bei Kapillaren, die nor­ malerweise bei der Kapillarelektrophorese verwendet werden.

Der Druck, der erforderlich ist, um bei einer herkömmlichen Kapillare einen Rückfluß von 10% einzuführen, liegt in der Größenordnung von 0,01 Atmosphären oder einer Wassersäule von einem Zentimeter. Obwohl diese bekannten hydrostatischen Verfahren danach streben, die Auflösung auf verschiedene Arten und unter verschiedenen Betriebsbedingungen zu erhö­ hen, scheitern sie, das Problem der Steuerung und Eliminie­ rung des EOF zu lösen.

Es ist bekannt, daß Kapillaren geringen Durchmessers für die CE den Vorteil haben, daß höhere elektrische Felder mit ei­ nem geringeren Problem des Entwickelns radialer Temperatur­ gradienten angelegt werden können. Andererseits leiden diese Kapillaren geringen Durchmessers normalerweise an einer stark reduzierten Empfindlichkeit, da ihre Kapazität gerin­ ger ist und quadratisch mit dem Kapillardurchmesser abfällt. Z.B. liefert eine Kapillare von 15 Mikrometer im Vergleich zu einer Kapillare von 50 Mikrometer weniger als ein Zehntel der Probe zu einem Detektor. Außerdem ist die Erfassung un­ ter Verwendung der kleineren Kapillare sehr viel schwieri­ ger, da die Erfassungspfadlänge für die UV-Absorptionsdetek­ toren weniger als ein Drittel der Länge aufweist, und die Erfassungszelle so schmal ist, daß es schwierig ist, das Er­ fassungslicht ohne Streulicht, das die gewünschte Linearität verschlechtert, in ihr zu fokussieren.

Eine weitere Begrenzung der Kapillaren geringen Durchmessers besteht darin, daß ihre Doppelschichtregion einiger Mikrome­ ter des laminaren Flusses nicht maßstäblich zu der Größe ist, sondern vielmehr ein bedeutender Prozentsatz des tota­ len Flusses wird, wobei sie folglich zu der laminaren Mi­ schung und dem Verlust der Auflösung beiträgt. Z.B. stellt eine Doppelschichtregion von 2 1/2 Mikrometern weniger als 20% der Querschnittsfläche einer Kapillare von 50 Mikrome­ tern dar, aber 75% der Fläche einer Kapillare von 10 Mikro­ metern, wobei folglich ein sehr schwerwiegender laminarer Fluß und eine Spitzenverbreiterung verursacht wird.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Kapillarelektrophorese-Vorrichtung, die durch die Steuerung und Reduzierung des elektroosmotischen Flusses ein besseres Betriebsverhalten von Kapillaren mit kleinem Innendurch­ messer über einen breiten pH-Bereich liefert, und ein Ver­ fahren zur Verwendung derselben schaffen.

Diese Aufgabe wird durch eine Kapillarelektrophorese-Vor­ richtung nach Patentanspruch 1 und ein Kapillarelektropho­ rese-Verfahren nach Patentanspruch 5 gelöst.

Eine Kapillarelektrophorese-Vorrichtung besitzt eine Kapil­ lare, durch welche ein Analyt von einem Injektionsende zu einem Auslaßende in eine Vorwärtsrichtung eluiert. Eine herkömmliche Speicher- und Injektions-Anordnung enthält das Analyt und einen Puffer und injiziert den Puffer und das Analyt in die Kapillare. Eine Energieversorgung legt ein elektrisches Potential über die Länge der Kapillare.

Eine Gegendruckanordnung setzt das Analyt in der Kapillare einstellbar zum Einspritzende hin unter Druck, um eine rückwärts gerichtete hydrostatische Flußgeschwindigkeits­ komponente mit einem hydrostatischen Flußgeschwindigkeits­ profil, das zumindest 50% so stark, aber entgegengesetzt gerichtet, ist, wie ein vorwärts gerichtetes elektroosmoti­ sches Flußgeschwindigkeitsprofil (EOF-Geschwindigkeitspro­ fil), zu erzeugen, wodurch der EOF reduziert wird.

Der innere Querschnitt der Kapillare ist vorzugsweise brei­ ter als hoch und hat eine Höhe, die nicht größer als 20 Mikrometer ist. Die Kapillare beschränkt dadurch das EOF- Geschwindigkeitsprofil, um im wesentlichen parabolisch zu sein. Das Seitenverhältnis der Kapillare ist vorzugsweise mindestens 2 : 1, wobei das Seitenverhältnis eine größte innere Breite geteilt durch eine größte innere Höhe der Kapillare ist. Bei den meisten Anwendungen sollte das Sei­ tenverhältnis mindestens 5 : 1 und vorzugsweise 10 : 1 oder größer betragen. Das Seitenverhältnis, das für jede speziel­ le Anwendung gewählt wird, hängt von dem erforderlichen Massenfluß und Herstellungsbetrachtungen ab. Die Kapillare ist vorzugsweise rechteckig.

Die Erfindung umfaßt ferner das Verfahren, einen Gegendruck auf das Analyt anzuwenden und das EOF-Geschwindigkeitsprofil zu beschränken, um im wesentlichen parabolisch zu sein.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1a, 1b und 1c Geschwindigkeitsprofile des elektroosmo­ tischen, zusammengesetzten bzw. hydrostatischen Flusses in einer herkömmlichen zylindrischen Kapil­ lare mit einem Durchmesser von 50 Mikrometern;

Fig. 2a, 2b und 2c Geschwindigkeitsprofile des elektroosmo­ tischen, zusammengesetzten bzw. hydrostatischen Flusses in einer im wesentlichen rechtwinkligen Kapillare gemäß der Erfindung mit einer inneren Höhe von 10 Mikrometern;

Fig. 3 eine perspektivische Darstellung der Kapillare ge­ mäß der Erfindung mit einem rechteckigen Quer­ schnitt;

Fig. 4 eine schematische Zeichnung eines Kapillarelektro­ phoresegeräts, das die Kapillare und das Gegen­ druckverfahren gemäß der Erfindung verwendet;

Fig. 5 eine qualitative Darstellung der Art und Weise, in der die CE-Auflösung und -Empfindlichkeit als Funk­ tionen des inneren Durchmessers der Trennkapillare unter dem Einfluß des Gegendrucks gemäß der Erfin­ dung variieren.

Die Fig. 1a, 1b und 1c zeigen typische Geschwindigkeits­ profile des elektroosmotischen, zusammengesetzten bzw. hy­ drostatischen Flusses in einer herkömmlichen zylindrischen Kapillare mit einem Durchmesser von 50 Mikrometern. Das Ge­ schwindigkeitsprofil des vorwärtsfließenden EOF (Fig. 1a) ist über den Großteil der mittleren Region der Kapillare annähernd planar, wohingegen das Geschwindigkeitsprofil des rückwärtsfließenden hydrostatischen Flusses (Fig. 1c) pa­ rabolisch ist. Der resultierende, sich überlagernde, zu­ sammengesetzte Fluß hat ein wellenförmiges Flußgeschwindig­ keitsprofil, das unerwünschte Wirbelgegenströme verursacht, welche wiederum eine Mischung und eine Spitzenverbreiterung verursachen.

Diese Erfindung nutzt den Vorteil des Phänomens aus, daß, wenn die Kapillaren kleiner werden, sich ihr EOF-Querschnitt zunehmend dem laminaren Fluß annähert und eine stärker para­ bolische Form entwickelt. Der Grund dafür liegt darin, daß die Dicke der Doppelschicht ziemlich unabhängig von dem Ka­ pillardurchmesser ist. Die Laminarflußregion der Doppel­ schicht wird daher relativ groß gegenüber dem Querschnitt der kleineren Kapillaren, während die Bolzenflußregion in der Mitte der Kapillare kleiner wird. Im Grenzfall wird, in sehr winzigen Kapillaren, der EOF parabolisch.

Als zweiten Schritt erzeugt die Erfindung einen Rückfluß in der Kapillare durch Anwenden eines hydrostatischen Gegen­ drucks von Ende zu Ende über die Kapillare. Dieser Fluß ist exakt laminar und erzeugt in kreisförmigen und rechtwink­ ligen Kapillaren ein exakt parabolisches Geschwindigkeits­ profil.

Wenn sowohl der vorwärts gerichtete EOF als auch der Rück­ fluß gleichzeitig eingeführt werden, wie dies bei dieser Erfindung durchgeführt wird, wird der Netto-Effekt durch die Superposition der zwei Teilflüsse bestimmt, d. h. die Effekte des EOF und des hydrodynamischen Flusses werden addiert. Bis zu dem Betrag, zu dem der EOF in kleinen Kapillaren laminar ist, löschen sich die vorwärts fließende EOF-Profil-"Para­ bel" und die rückwärts fließende hydrodynamische Profil-"Pa­ rabel" gegenseitig aus, mit dem Ergebnis, daß der EOF ge­ stoppt werden kann, ohne Wirbelströme und ein Mischen einzu­ führen, was andererseits die Schärfe der Spitzen vollständig zerstören würde.

Die Fig. 2a, 2b und 2c zeigen die Geschwindigkeitsprofile des elektroosmotischen, zusammengesetzten bzw. hydrostati­ schen Flusses in einer Kapillare gemäß der Erfindung mit ei­ ner inneren Höhe von 10 Mikrometern. Wie nachfolgend detail­ liert beschrieben wird, ist die Kapillare gemäß der Erfin­ dung vorzugsweise näherungsweise rechteckig. Wie die Fig. 2a, 2b und 2c zeigen, wird das näherungsweise parabolische EOF-Geschwindigkeitsprofil (Fig. 2a) beinahe genau von dem hydrostatischen Fluß (Fig. 2c) ausgelöscht, so daß das zu­ sammengesetzte Geschwindigkeitsflußprofil (2b) flach ist. In anderen Worten heißt das, der Fluß und der Gegenfluß sind im wesentlichen gestoppt. Die kleine restliche Biegung, die zu­ rückbleibt, ist verglichen mit der Bandverbreiterung durch die Diffusion, die immer stattfindet, besonders in kleinen Kapillaren, vernachlässigbar.

Fig. 3 zeigt die bevorzugte allgemein rechteckige Struktur eines Abschnitts einer Kapillare 10 gemäß der Erfindung. In dieser Erörterung ist die "Breite" der Kapillare ihre größte innere Abmessung, und die "Höhe" ist die kleinste innere Abmessung. In anderen Worten heißt das, wenn man die Kapil­ lare auf eine horizontale Oberfläche legt und in ihr Ende schaut, liegt die Breite in horizontaler Richtung und die Höhe liegt in vertikaler Richtung. Bei praktischen Ausfüh­ rungsbeispielen dieser Erfindung ist die Kapillare 10 be­ vorzugt hoch genug, um einen leichten restlichen Bolzenfluß in ihrem Zentrum zu ermöglichen.

Ein Vorteil einer derartigen Konfiguration besteht darin, daß die Empfindlichkeit maximiert wird, indem es einem grö­ ßeren Probenvolumen ermöglicht wird, mit nur einer vernach­ lässigbaren Reduzierung der Auflösung aufgrund einer unvoll­ kommenen Auslöschung der zwei Flußgeschwindigkeitsprofile den Detektor zu erreichen. Die Erfassung wird desto schwie­ riger, je kleiner die Kapillare wird: wenn der Kapillar­ durchmesser in der Größenordnung von nur etwa 10 Mikrometern liegt, können herkömmliche UV-Detektoren die Fähigkeit ver­ lieren, alles zusammen zu erfassen, teilweise weil die Ab­ sorptionspfadlänge für einen wirksamen Betrieb zu klein wird.

Eine breite, rechteckige Kapillare, wie sie bei der Erfin­ dung bevorzugt wird, erhöht den Massefluß und die Absorp­ tionspfadlänge, jedoch ist ihre Höhe noch so klein gehalten, daß das EOF-Geschwindigkeitsprofil im wesentlichen parabo­ lisch ist und die thermischen Gradienten in der Kapillare stark reduziert sind (wobei folglich das Risiko einer Kon­ vektions-Fluidbewegung reduziert ist, und es ermöglicht ist, stärkere elektrische Felder über die Kapillare anzulegen).

Das Verhältnis zwischen der Querschnittsfläche und der Höhe der Kapillare sollte daher vorzugsweise so groß wie möglich gemacht werden. Für eine gegebene Anwendung der Erfindung wird die maximale Grenze dieses Verhältnisses durch die Herstellungstechnik, die verwendet wird, um die Kapillare zu bilden, begrenzt. Ein minimales Seitenverhältnis (Breite zu Höhe) von 10 : 1 ist bevorzugt, um einen signifikanten Massen­ fluß zu liefern. Tests haben gezeigt, daß Kapillare von 5 Mikrometer mal 50 Mikrometer bis zu 15 Mikrometer mal 150 Mikrometer besonders gut arbeiten. Im allgemeinen sind Ka­ pillare mit einer minimalen Abmessung (Höhe) von 20 Mikro­ meter oder weniger für die hydrostatische EOF-Steuerung be­ vorzugt.

Insbesondere sind rechteckige Kapillare mit abgerundeten inneren Ecken besonders zur Verwendung bei der Reduzierung des EOF geeignet. Abgerundete Ecken reduzieren die Korona, die an scharfen Ecken wegen des starken elektrischen Feldes erzeugt werden kann. Dies ist erwünscht, da eine Korona die Flachheit des EOF ändert. Um einen radialen Wärmefluß besser auszugleichen, sind die Ränder der Kapillare (ihre "kurzen Seiten") vorzugsweise dicker als ihre breiten Seiten, um die thermische Impedanz in dieser Richtung zu erhöhen.

Die Kapillare gemäß der Erfindung wird vorzugsweise durch Herabziehen eines rechtwinkligen Quarzglas-Einkristallkör­ pers auf die gewünschte Größe und externes Beschichten desselben mit Polyamid hergestellt.

Weitere vorteilhafte Kapillarquerschnitte umfassen ovale, eliptische und mehrbeinige Strukturen, wie z. B. eine Stern­ form. Solange das Seitenverhältnis groß gehalten wird (vor­ zugsweise mindestens 10 : 1) maximieren diese Strukturen den Massefluß, während die größte Entfernung zwischen einem beliebigen Teil des Analyts und der nähesten Kapillarwand auf einem Minimum gehalten wird, wodurch thermische Gradien­ ten und damit verknüpfte Konvektionsströme minimiert werden.

Fig. 4 ist ein Blockdiagramm eines CE-Systems. Ein Injek­ tionsende 12 der Kapillare 10 erstreckt sich in oder ist mit einem Injektions- oder Einlaß-Speicherr 14 (wie z. B. ein Glasfläschchen) verbunden, der einen Puffer 16 enthält. Nor­ malerweise sind getrennte Speicher für das Analyt und den Puffer vorgesehen: zuerst wird der Puffer in die Kapillare injiziert, gefolgt von einer Menge des Analyts, gefolgt von zusätzlichem Puffer. Diese Technik ist gut bekannt. In Fig. 4 ist ein "Bolzen" des Analyts 17 in der Nähe der Injektion und in der Kapillare gezeigt, bevor das Analyt begonnen hat, sich in Bänder zu trennen. Die Kapillare 10 hat vorzugsweise die rechteckige Form, die in Fig. 3 gezeigt ist. Das Analyt 17 wird unter Verwendung bekannter Ausrüstung in das Injek­ tionsende 12 injiziert, und, während es durch die Kapillare wandert, trennen sich seine Komponenten in Bänder. Das Ana­ lyt verläßt die Kapillare an einem Ausgangsende 18 und wird in einen Abfallbehälter oder einen Auslaßspeicher 20 frei­ gesetzt.

Eine Hochspannungsquelle 21, die eine herkömmliche 30 Kilo­ volt-Leistungsversorgung sein kann, liefert das starke elek­ trische Feld über der Kapillare 10 über Anoden- und Katho­ den-Elektroden 22, 24, die elektrisch mit der Pufferlösung in den Einlaß- bzw. Auslaß-Speichern 14, 20 verbunden sind. Ein hydrostatischer oder hydrodynamischer Rückwärtsdruck, d. h. ein Druck, der dazu tendiert, das Analyt in die Richtung des Injektionsendes 12 der Kapillare 10 zurückzu­ drücken, kann auf den Puffer angewendet werden, indem eine geregelte Druckpumpe 28 verwendet wird, die z. B. den Auslaß­ speicher 20 unter Druck setzen kann.

Die Pumpe 28 kann von einem beliebigen herkömmlichen Typ sein, wie z. B. eine Druck-Servo-Membranpumpe. Der Gegen­ druck-Einstellpunkt und das Regel- oder Befehls-Signal, die verwendet werden, um den Druck der Pumpe 28 zu steuern, kön­ nen in einer herkömmlichen Steuerschaltung (nicht gezeigt) gespeichert oder erzeugt werden, wie z. B. einem Mikrocom­ puter mit geeigneten bekannten Benetzereingabevorrichtungen Die wirksame Servosteuerung der Pumpe kann in einer beliebi­ gen bekannten Art und Weise vervollständigt werden. Typi­ scherweise schließt das Servosystem einen Drucksensor ein, dessen Ausgabe zu der Steuerschaltung zurückgeführt und mit dem Einstellpunkt-Druck verglichen wird. Die Differenz zwi­ schen dem tatsächlichen und dem Einstellpunkt-Druck wird dann verstärkt und verwendet, um die Pumpengeschwindigkeit zu steuern. Der Drucksensor, die Rückkopplungs- und Diffe­ renzier-Schaltung, der Verstärker und andere Regelvorrich­ tungen sind auf dem Gebiet der automatischen Steuerung sehr gut bekannt und werden deshalb nicht gezeigt oder weiter beschrieben.

Wenn sich das Analyt 17 vorwärts durch die Kapillare 10 bewegt, laufen seine getrennten Komponenten durch einen Detektor, welcher eine Erfassungsregion 30 der Kapillare, eine Lichtquelle 32 und einen Sensor 34 einschließt. Licht­ energie (typischerweise UV-Licht) wird von der Lichtquelle 32 fokussiert, um in der Erfassungsregion 30 das Analyt 17 zu durchdringen, und wird dann von dem herkömmlichen Sensor 34 erfaßt. Der Sensor 34 ist elektrisch mit einer herkömm­ lichen Absorptionsschaltung 36 verbunden, welche die augen­ blickliche Lichtabsorption des Analyts in der Erfassungsre­ gion bestimmt. Die Absorptionsschaltung 36 ist elektrisch mit einer Standardverarbeitungsschaltung verbunden, wie z. B. einem Computer 38, die bestimmt, ob eine Spitze in der Er­ fassungsregion vorliegt, sowie ihre Breite, ihre Durchlauf­ zeit durch die Kapillare und andere gut bekannte Faktoren, die verwendet werden, um Spezies in einem CE-Analyt zu iden­ tifizieren. Die Faktoren und die erforderlichen Berechnungen sind in der Technik gut bekannt. Diese Erfindung macht es möglich, durch die Steuerung des EOF schärfer festgelegte Spitzen zu erhalten. Der Computer 38 kann ferner als Steuer­ schaltung zum Steuern der Pumpe 28 verwendet werden.

Gemäß der Erfindung wird ein differentieller Druck von einem Ende zum anderen über die Trennkapillare angelegt. Speziell legt die Gegendruckpumpe 28 einen positiven Druck an das Ausgangsende 18 der Kapillare, um das in Fig. 2 gezeigte pa­ rabolische hydrostatische Flußprofil zu erzeugen. Der Gegen­ druck, der in einer gegebenen Anwendung erforderlich ist, hängt von verschiedenen Faktoren, wie z. B. den genauen Ab­ messungen der Kapillare und der Größe des angelegten Trenn­ potentials, ab. Anders als die schwachen Drücke, die nach dem Stand der Technik verwendet wurden, um die Bolzenfluß­ fronten zu glätten, ist der Gegendruck, der verwendet wird, um den EOF zu steuern, bei der Erfindung jedoch beträchtlich größer und geht von einem Zehntel bis zu hunderten von At­ mosphären.

Ein Druck wird vor einem Durchlauf oft anderweitig zum Zweck des Ätzens, Beschichtens oder anderweitigen chemischen Be­ handelns einer Kapillare vor einem Durchgang angewendet. Der Benutzer kann während derartiger Schritte den ordnungsge­ mäßen differentiellen Druck bestimmen und wird oft in der Lage sein, die gleiche Ausrüstung zu verwenden. Gemäß dieser Erfindung wird jedoch ein Gegendruck, der viel höher ist als der in herkömmlichen Systemen verwendete, während des tat­ sächlichen Betriebs des Gerätes auf die Kapillare angewen­ det, d. h., wenn die hohe Trennspannung angelegt ist.

In einem Prototyp der Erfindung wurde die herkömmliche, run­ de Trennkapillare mit 50 µm Durchmesser durch eine recht­ eckige Kapillare der Größe 10 µm×100 µm ersetzt. Die Länge der Kapillare war 25 cm, etwa die Hälfte der Länge, die her­ kömmlich verwendet wird, welche die doppelte axiale Feld­ stärke lieferte. Normalerweise würde bei einer derartigen Konfiguration die Trennzeit um den Faktor vier abfallen, z. B. von 4 Minuten auf 1 Minute. Dies ist die Zeit, die der EOF benötigt, um das Elektrolyt und irgendwelche ungeladenen Bestandteile in der Probe von dem Injektionsende der Kapil­ lare zu der Erfassungsregion zu transportieren.

Statt das Abfallglasfläschchen auf atmosphärischen Druck (das herkömmliche Verfahren) zu entlüften, wurde der Gegen­ druck zusätzlich auf den Auslaß oder das Abfallglasfläsch­ chen 20 angewendet. Dieser Druck induzierte einen Rückfluß des Elektrolyts, welcher den vorwärtsgerichteten EOF "glät­ tete" und folglich stark verzögert den unerwünschten vor­ wärts gerichteten EOF stoppte.

Mehrere Verfahren können verwendet werden, um zu bestimmen, wieviel Gegendruck erforderlich ist, um den EOF zu stoppen. Für eine beliebige Realisierung der Erfindung zeigt dem Benutzer eine einfache Untersuchung unter der Verwendung von Testläufen des Puffers und des Analyts bei verschiedenen differentiellen Drücken, gefolgt von der Analyse der resul­ tierenden Spitzen, welcher differentielle Druck angewendet werden muß, um den scharfen, "nicht-parabolischen" zusammen­ gesetzten Fluß, der in Fig. 2b gezeigt ist, zu erzeugen. Ein Verfahren besteht darin, den Gegendruck einzustellen, bis sich identifizierbare Spitzen nach dem Detektor rückwärts und vorwärts bewegen.

Ein weiteres Näherungsverfahren für kleine Kapillare besteht darin, den EOF-Druck zu berechnen. Um dies durchzuführen, muß zuerst die EOF-Geschwindigkeit gemessen werden, z. B. durch zeitliches Erfassen eines Laufs ohne irgendwelche an­ gelegte Drücke. Für runde Kapillare lautet die Druckglei­ chung wie folgt:

wobei
P = Druck;
ν = Fluidviskosität;
L = Kapillarlänge;
F = Flußrate; und
R = Kapillarradius.

Eine runde Kapillare mit 10 Mikrometer Durchmesser und 25 mm Länge, die ein Elektrolyt mit der gleichen Viskosität wie Wasser mit einer Geschwindigkeit von 1 mm/Sekunde transpor­ tiert, erfordert z. B. einen Gegendruck von 20 Atmosphären. Die Druckberechnung für rechteckige Kapillare, wie z. B. die Kapillare gemäß dieser Erfindung, ist komplizierter, da sie hyperbolische Funktionen einschließt. Es können jedoch gut bekannte numerische Techniken verwendet werden, um diese Berechnungen durchzuführen, wenn eine größere Genauigkeit erforderlich ist. Im allgemeinen erfordern jedoch bei Ka­ pillaren mit vergleichbarer Breite rechteckige Kapillare ähnliche, jedoch etwas niedrigere Drücke, als die runden.

Noch eine weitere Möglichkeit, den EOF-Druck herzuleiten, gegen den der äquivalente Gegendruck angewendet wird, be­ steht darin, die Retentionszeiten für einen bekannten Ge­ gendruck mit denen ohne Druck zu vergleichen. Wenn z. B. beobachtet wird, daß fünf Atmosphären die Geschwindigkeit halbieren (Retentionszeiten verdoppelt), dann kann erwartet werden, daß zehn Atmosphären den Fluß völlig stoppen.

Wie in den Fig. 2a-2c gezeigt ist, kann man den EOF unter Verwendung der Erfindung durch Anwenden eines Gegen­ drucks, der ein Flußgeschwindigkeitsprofil aufweist, das im wesentlichen gleich, aber entgegengesetzt dem Geschwindig­ keitsprofil des EOF ist, stoppen. Andererseits liefert die Fähigkeit, den EOF zu stoppen, ferner die Fähigkeit, ihn zu steuern. Durch das Anwenden eines kleineren als des gleichen Gegendrucks, kann man steuern, wie stark das Flußgeschwin­ digkeitsprofil "ausgebeult" ist, d. h. wie flach das EOF- Profil sein darf.

Sobald der EOF-Druck bekannt oder berechnet ist, sind mehre­ re Meßstrategien möglich. Eine bevorzugte Strategie besteht darin, das Experiment mit einer konstanten, jedoch unvoll­ ständigen EOF-Löschung durchzuführen, so daß die Bestandtei­ le eventuell ohne weiteren Eingriff eluieren. Z.B. kann die Vorrichtung bei einer EOF-Löschung von 75% laufen, so daß der Durchgang viermal so lang dauert, wie ohne Gegendruck. Diese Strategie hat den Vorteil, daß die Spitzen langsamer durch den Detektor laufen. Danach kann eine Tiefpaßfilterung verwendet werden, um den Rauschabstand zu verbessern. Mit einer vierfachen Retentionszeit würde die Auflösung gleich der einer Trennung, die bei einer vierfachen Spannung durchgeführt wird, sein.

Diese Erfindung arbeitet besonders gut, wenn die Erfassungs­ region 30 (Fig. 4) als ein blasenförmiger Abschnitt der Ka­ pillare 10 gebildet ist. Ein derartiger "Blasenzellen"-Ab­ schnitt ist im US-Patent Nr. 5,061,361 offenbart. Da der EOF unter Verwendung der Erfindung gesteuert werden kann, kann eine Untersuchung ohne ein vorzeitiges Eluieren der getrenn­ ten Bestandteile der Probe viel länger laufen. In anderen Worten heißt das, daß mehrere schwer zu trennende Spitzen eines Analyts durch Verlängern ihrer Zeit in der CE-Vorrich­ tung gespaltet werden können.

Fig. 5 ist eine qualitative Darstellung der Art und Weise, in der die CE-Auflösung r(d) und -Empfindlichkeit s(d) sich als Funktionen des inneren Durchmessers d der Trennkapillare ändern. Der Betriebsbereich für eine Kapillare geringen Durchmessers mit einem Gegendruck gemäß der Erfindung (wie in Fig. 2) ist als Region A gezeigt. Der Betriebsbereich für eine nicht unter Druck gesetzte Standardkapillare ist als Region B gezeigt. Wie Fig. 5 zeigt, weist die Kapillare ge­ mäß der Erfindung eine viel bessere Auflösung auf, wenn auch auf Kosten einer verringerten Empfindlichkeit.

Wenn ein Gegendruck verwendet wird, zeigt die Auflösungs­ kurve r(d) einen "Hügel" über einem Bereich C der Durch­ messer. Der Bereich kann durch Verändern des Gegendruck­ betrages verändert werden. Der Durchmesserbereich C bestimmt ferner den bevorzugten Betriebsbereich der Erfindung. Durch das Ermöglichen eines leichten Bolzenflusses (weniger als 100% EOF-Auslöschung) kann das Analyt mit einer minimalen hydrostatischen Verschlechterung, d. h. ohne zu starkes Mi­ schen, eluieren. Um jedoch eine ausreichende EOF-Steuerung beizubehalten, sollte das rückwärts gerichtete hydrostati­ sche Flußgeschwindigkeitsprofil mindestens 50% (aber entge­ gengesetzt gerichtet) des vorwärts gerichteten Geschwindig­ keitsprofils des EOF betragen.

Die Erfindung überwindet viele Probleme, unter denen her­ kömmliche, runde CE-Kapillare leiden. Die Erfindung verwen­ det den Vorteil der Kapazität der Kapillaren geringen Durch­ messers für höhere Felder, welche schnellere Trennungen lie­ fern. Durch das Vorsehen einer rechteckigen Kapillare mit einem hohen Seitenverhältnis, vermeidet die Erfindung ferner den Verlust an Empfindlichkeit, der normalerweise auftritt, wenn kleine Kapillare verwendet werden.

Durch die Überwindung des EOF erhöht die Erfindung ferner die Auflösung durch die Verlängerung der Trennzeit stark, ohne außerordentliche Hochspannungs-Leistungsversorgungen zu erfordern. Zur Veranschaulichung sei angemerkt, daß sich ferner die Trennzeit zwischen zwei Spitzen bei einer gegebe­ nen Leistungsversorgung vervierfacht, wenn sich die Trenn­ zeit vervierfacht. Obwohl ihre Breite sich aufgrund von Dif­ fusion verdoppeln würde, gäbe es noch einen Nettogewinn von zwei bei der Fähigkeit, die zwei Spitzen aufzulösen. Dieser Gewinn wird unter Verwendung dieser Erfindung ohne weiteres erreicht. Das Erreichen derselben bei der Verwendung her­ kömmlicher Verfahren würde jedoch sowohl eine Vervierfachung der Länge der Trennkapillare als auch eine Vervierfachung der angelegten Trennspannung erfordern. Um eine Trennung gleich der der Erfindung zu erreichen, wären hochentwickelte 120 -Kilovolt-Leistungsversorgungen mit Laborqualität anstel­ le gewöhnlicher 30-Kilovolt-Versorgungen, die selbst in vie­ len Fernsehgeräten gefunden werden, erforderlich.

Die Erfindung ist folglich schneller, empfindlicher und öko­ nomischer und weist eine bessere Auflösung als herkömmliche CE-Systeme auf, die dem Problem des EOF nicht begegnen.

Claims (6)

1. Kapillarelektrophorese-Vorrichtung mit den folgenden Merkmalen:

• A. einer Kapillare (10) mit einem Injektionsende (12), durch das ein Analyt (17) in die Kapillare (10) ein­ tritt, und einem Auslaßende (18), zu dem die Kompo­ nenten des Analyts (17) in einer Vorwärtsrichtung wandern und sich trennen;
• B. einer Speicher- und Injektions-Einrichtung (14) zum Halten des Analyts (17) und eines Puffers (16) und zum Injizieren des Analyts (17) in das Injektionsende (12) der Kapillare (10);
• C. einer Spannungseinrichtung zum Anlegen eines elektri­ schen Potentials über der Länge der Kapillare (10) zwischen dem Injektionsende (12) und dem Auslaßende (18); und
• D. einer steuerbaren Gegendruckeinrichtung (28) zum un­ ter Druck Setzen des Analyts (17) in der Kapillare (10) zu dem Injektionsende (12) hin, zum Erzeugen ei­ ner einstellbaren rückwärts gerichteten hydrostati­ schen Flußgeschwindigkeitskomponente mit einem hydro­ statischen Flußgeschwindigkeitsprofil, das mindestens 50% der Größe, jedoch eine entgegengesetzte Richtung eines vorwärts gerichteten elektroosmotischen Flußge­ schwindigkeitsprofils (EOF-Geschwindigkeitsprofil) aufweist, und zum dadurch bedingten Reduzieren des EOF.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der ein innerer Quer­ schnitt der Kapillare (10) breiter als hoch ist, und eine Höhe aufweist, die nicht größer als 20 Mikrometer ist, wodurch die Kapillare (10) eine EOF-Behandlungsein­ richtung zum Beschränken des EOF-Geschwindigkeitspro­ fils, um im wesentlichen parabolisch zu sein, bildet.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, bei dem ein Seitenverhält­ nis der Kapillare (10) mindestens 5 : 1 beträgt, wobei das Seitenverhältnis eine größte innere Breite geteilt durch eine größte innere Höhe der Kapillare (10) ist.

4. Vorrichtung gemäß Anspruch 3, bei der die Kapillare (10) rechteckig ist.

5. Kapillarelektrophorese-Verfahren, das folgende Schritte aufweist:

• A. Injizieren eines Analyts (17) und eines Puffers (16) in ein Injektionsende (12) einer Kapillare (10), um zu ermöglichen, daß das Analyt (17) und der Puffer (16) in einer Vorwärtsrichtung zu einem Auslaßende (18) der Kapillare (10) hin eluieren;
• B. Anlegen eines elektrischen Potentials über die Länge der Kapillare (10) zwischen dem Injektionsende (12) und dem Auslaßende (18); und
• C: Einstellbares unter Druck Setzen des Analyts (17) in der Kapillare (10) zu dem Injektionsende (12) hin mit einer rückwärts gerichteten hydrostatischen Flußge­ schwindigkeitskomponente mit einem hydrostatischen Flußgeschwindigkeitsprofil, das zumindest 50% der Größe, jedoch eine entgegengesetzte Richtung eines vorwärts gerichteten elektroosmotischen Flußgeschwin­ digkeitsprofils (EOF-Geschwindigkeitsprofils) auf­ weist, wodurch der EOF reduziert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, das ferner den Schritt des Beschränkens des EOF-Geschwindigkeitsprofils, so daß dieses im wesentlichen parabolisch wird, einschließt.