DE4420791C1

DE4420791C1 - Verfahren zur Expression von genetisch modifizierten Molekülen und dafür geeignete Wirtszellen

Info

Publication number: DE4420791C1
Application number: DE19944420791
Authority: DE
Inventors: Hinrich Dr Luehring
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-06-15
Filing date: 1994-06-15
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2014-06-16

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Expression von genetisch modifizierten Molekülen in Wirtszellen durch Einschleusung der entsprechend kodierten mRNA oder rekombinanten DNA.

Zu den bislang hauptsächlich angewandten Expressionssystemen für genetisch abgewandelte Biomoleküle, insbesondere Proteine, gehören Mikroorganismen, Zellkulturen (z. B. Nierenzellinien) und Hefen. Für die funktionelle Expression von Proteinen, die als Ionentransporter in Zellmembranen lokalisiert sind und elektrophysiologisch charakterisiert werden können, werden vornehmlich Oozyten des Krallenfroschs Xenopus laevis eingesetzt. Hierzu müssen Krallenfrösche betäubt und zur Entnahme der Oozyten operiert werden. Zur Injektion von mRNA in die Oozyten müssen diese dann entweder präparativ oder mit Hilfe von Enzymen vereinzelt und zur darauf folgenden elektrophysiologischen Charakterisierung unter mikroskopischer Beobachtung weiter präpariert werden.

Gemäß CA 116: 249633y verknüpften die Autoren ein Diatomeen-Plasmid mit einem anderen (PSV-CAT) Plasmid zu einem neuen Hybridplasmid, das als shuttle Vektor verwendet werden kann. Dieser shuttle Vektor kann zur DNA-Amplifikation eingesetzt werden.

Die Autoren des Abstracts JP 3076-583-A beschreiben die Transformation von Blaualgen durch Einbau eines rekombinanten Plasmids, das für Superoxiddismutase (SOD) kodiert. Sie schlagen eine Verwendung des transformierten Systems für die Massenproduktion von (explizit) SOD in Blaualgen vor.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Characeae-Zellen für die Expression von genetisch modifizierten Molekülen durch Injektion von mRNA brauchbar sind.

Demgemäß ist das erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtszellen Zellen der Characeae verwendet.

Mit Algenzellen der Familie Characeae sind Anzucht, Manipulation und auch Versand außerordentlich einfach. Solche Algen können ohne besonderen Aufwand in Kübeln, in denen sie unter Minimalbedingungen heranwachsen, gezüchtet und entnommen werden. Die Algenzellen haben einen Durchmesser von etwa 1 mm und eine Länge von 5-15 cm (variiert mit Anzuchtbedingungen). Solche Algenzellen sind ohne weitere Vorbehandlung für eine Injektion tauglich.

Für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet man die Internodialzellen der Characeae.

In diese können artfremde - insbesondere tierische - mRNA oder rekombinante DNA speziell in Form von Plasmiden oder Vektoren eingeschleust werden.

Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.

Besonders zweckmäßig ist die Injektion von mRNA für die Polypeptidsynthese von Membran-Transportproteinen: auf diese Weise erlangt man nach Entleerung der entsprechend infizierten Zelle in eine wäßrige Lösung cytoplasmatische Tropfen mit im Tonoplasten eingebautem Protein (Ionenkanäle), die z. B. für Untersuchungen der die Kanalaktivität beeinflussenden Eigenschaften neuer Medikamente geeignet sind.

Algenzellen mit exprimierten Proteinen können als versandfähiges Produkt ohne weiteres zur Verfügung gestellt werden.

Nachfolgend werden Anzucht, Präparation und Injektion sowie die Charakterisierung der mit exprimiertem Protein versehenen Alge am Beispiel der Chara corallina (C. australis R. Brown) im einzelnen beschrieben:

Anzucht

Der Boden von Plastikkübeln (Pflanzkübel) mit einem Fassungsvermögen von 50 l oder größerem Volumen wird auf eine Höhe von etwa 3-5 cm mit Lauberde gefüllt. Mit Leitungswasser wird vorsichtig auf eine Höhe von ca. 10 cm aufgefüllt. Nach Absetzen der aufgeschwemmten Erde werden Büschel von Characeen mit den Wirtel-Enden in die Erde eingesetzt. Der Kübel wird mit Leitungs-/demin. Wasser im Verhältnis von etwa 1 : 2 bis zum Rand gefüllt. Innerhalb von 6 Wochen sind die Algen angewachsen und haben neue Internodien gebildet. Um lange Internodien zu erhalten sollte direktes Sonnenlicht vermieden werden (Abschattung durch Gärtnernetze). Die Pflanzen wachsen ohne weitere Pflege; Freilandhaltung ist ab Mai empfehlenswert, ab Ende September sollten die Anzuchtkübel im Hause gehalten werden (Raumtemperatur, Beleuchtung mit 12h/12h Licht/Dunkel-Periode durch Osram-Fluora Röhrenlampen). Es empfiehlt sich, einmal im Jahr einen Anzuchtkübel neu anzusetzen.

Präparation und Injektion von Algenzellen

Stränge von Internodialzellen werden dem Anzuchtkübel entnommen und in einer flachen Schale in Leitungswasser ohne Zusatz vereinzelt.

Mehrere Zellen werden in ein Medium höheren osmotischen Wertes überführt und mindestens 15 min adaptiert (Injektionsmedium).

Injektionsmedium

Pflanzenzellen besitzen einen Turgor. Um zu vermeiden, daß beim Einstich einer Mikropipette in die Zelle Cytoplasma in die Pipette eindringt, oder daß bei Zurückziehen der Mikropipette nach erfolgter Injektion die Zelle Cytoplasma verliert, wird vor der Injektion der Turgor gesenkt, indem die Zelle in ein Medium höheren osmotischen Werts gebracht wird. Durch Wasserabgabe verringert sich der Turgor.

Zusammensetzung des Injektionsmediums (in mol·m^-3):
1 KCl, 1 CaCl₂, 220 Sorbitol, 5 Tris, pH 7.5.

Adaptierte Zellen werden entnommen und nach Injektion von mRNA wieder ins Injektionsmedium transferiert. Nach weiteren ca. 15 min werden die durch Injektion manipulierten Zellen in das Inkubationsmedium transferiert

Inkubationsmedium

Die Physiologie der Zelle ist bei niedrigen (im Gegensatz zu hohen) osmotischen Werten des externen Milieus nicht eingeschränkt. Als Inkubations- oder Kontrollmedium dient eine Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mol·m^-3):
0.5 KCl, 0.5 CaCl₂, 0.5 MgCl₂, 5 Tris, pH 7.5.

Je nach Expressionsdauer können Zellen entnommen und für elektrophysiologische Untersuchungen präpariert werden. Die Präparation selbst dauert etwa 2 min. Hierzu wird eine Internodialzelle auf saugfähiges Papier (z. B. Kleenex) gelegt und vorsichtig trocken gewischt; auf einem Träger (z. B. Objektträger für Mikroskopie, Kunststoffplatte von ähnlicher Geometrie) wird sie so plaziert, daß an einer Seite des Trägers ungefähr 1 cm der Zelle über den Rand hinausragt; nach Turgorverlust (lokal zu beobachtendes Abflachen der Zelle) kann die Spitze der Zelle mit einer Schere abgeschnitten werden; die Öffnung der Zelle wird in die mit Meßlösung gefüllte Experimentierkammer getaucht, das Cytoplasma läuft aus dem offenen Internodium.

Meßlösungen

Da cytoplasmatische Tropfen keine Zellwand besitzen, muß auf den osmotischen Wert der externen Lösung geachtet werden. Mit großer Toleranz sind etwa 300 osmol·m^-3 zu empfehlen. Als typische Meßlösung wird im folgenden ein Medium angegeben, das entsprechend des gewünschten Meßprotokolls in seiner ionalen Komposition geändert werden kann. Im allgemeinen ist die Lebensdauer der cytoplasmatischen Tropfen bei Ca²⁺-Anwesenheit langer. Zusammensetzung einer typischen Meßlösung (in mol·m^-3):
150 KCl, 5 CaCl², 5 MgCl₂, 5 Tris, pH 7.5.

Als Puffersysteme können auch HEPES, MES, MOPS etc. verwendet werden. Cytoplasmatische Tropfen adaptieren zumindest innerhalb eines pH-Bereichs 5.5-8.0.

Das auf den Boden sinkende Cytoplasma ist mit dem Original-Tonoplasten umgehen und bildet sogenannte cytoplasmatische Tropfen. Die Unversehrtheit der Membran ist durch eine kugelförmige Geometrie der Tropfen angezeigt. Große Tropfen können auch eine unregelmäßige Gestalt annehmen, auf jeden Fall ist bei intakter Membran eine klare Kontur zu erkennen. Bei vorsichtiger Präparation können die Tropfen in der Regel Durchmesser zwischen 200 und 800 µm erreichen.

Die membranumschlossenen Tropfen sind der patch clamp-Technik unmittelbar zugänglich; gewöhnlich sind Leckwiderstände von mehr als 10 GΩ zu erreichen, ohne daß die Glasmikropipetten hitzepoliert sind, mit Leichtigkeit werden mit polierten Pipetten 50 GΩ erreicht. Als natürlich vorkommender Ionenkanal residiert neben einem hochleitenden, spezifischen K⁺-Kanal in der Tropfenmembran (Permeabilitätsverhältnis P_Na/P_K < 0.01) auch ein Cl⁻-Kanal (ca. 20 pS).

Elektrophysiologische Charakterisierung

Für Einzelkanalmessungen werden Kapillaren aus Hartglas (auch mit eingeschmolzenem Filament) mit Hilfe eines Elektrodenziehgeräts zu Mikropipetten mit einem Öffnungsdurchmesser von 1 µm oder kleiner ausgezogen. Pipetten mit eingeschmolzenem Filament lassen sich schneller und luftblasenfrei mit Salzlösung füllen. Zur Ableitung makroskopischer Ströme eignen sich Mikropipetten mit größeren Öffnungsdurchmessern. Die Komposition der Pipettenlösung soll dem gewünschten Meßprotokoll entsprechen.

Im Regelfall bildet sich ein sogenanntes gigaseal ohne nach Kontakt der Pipette mit dem cytoplasmatischen Tropfen einen Unterdruck an der Pipetteninnenseite anzulegen.

Die Tropfenmembran erträgt in der attached-cell-Konfiguration Pipettenspannungen zwischen -100 und mehr als +200 mV.

Beispiel für exprimiertes artfremdes Membranprotein

a) Klonierte mRNA, die für Connexin CX32 (gap junction-Protein) in Mausleberzellen kodiert, wurde Chara corallina injiziert. Nach 2 Tagen konnten Stromfluktuationen durch Einzelkanäle gemessen werden, die zweifellos von exprimiertem Connexin herrührten. Grund zu dieser Annahme war dadurch gegeben, daß erst nach Kontakt zwischen exzidierten Vesikeln in outside-out-Konfiguration mit dem zurückgebliebenen unversehrten Tropfen Cs⁺-Ströme durch eine hohe Leitfähigkeit gemessen werden konnten. Normalerweise ist die Tropfenmembran für Cs⁺ impermeabel, ohne Membran- Membran-Kontakt konnte kein Strom beobachtet werden. Gleichzeitig wurde die Unversehrtheit der Meßkonfiguration (kein erhöhter Leckstrom) durch Invertierung der Pipettenspannung gezeigt. In diesem Fall trat nur der zu Versuchsbeginn gemessene geringe Leckstrom auf.
b) Klonierte mRNA, die für den nicotinischen Acetylcholin-Rezeptor (nAChR) in Zellen des Rattenmuskels kodiert, wurde in Chara corallina injiziert. Etwa 24 Stunden später konnte Kanalaktivität gemessen werden, die zweifellos von exprimiertem nAChR herrührte. Grund zu dieser Annahme waren Einzelkanalfluktuationen, die durch Carbamoylcholinchlorid (= Carbachol) induziert werden konnten. Der exprimierte nAChR zeigte die typische Charakteristik einer Desentisierung durch erhöhte Carbachol- Konzentrationen, ein kooperatives Verhalten im gating (Hill-Koeffizient n∼2) und Tubocurarin-Empfindlichkeit.

Die beigefügte Abbildung veranschaulicht das Ergebnis

A. Stromfluktuationen durch einen ACh-Rezeptor, der in Chara corallina exprimiert wurde (αβγδ-Untereinheiten). Rechts neben den Fluktuationsspuren sind die Carbachol- Konzentrationen (in mmol·m^-3) notiert, die die Kanalaktivität hervorriefen, die unterste Spur demonstriert die Kanalblockierung durch d-Tubocurarin (200 mmol·m^-3). Der Geschlossenzustand des nAChR ist jeweils am rechten Rand der Spuren markiert
B. Amplitudenhistogramme der in A. gezeigten Aufnahmen (aus je 20 s Spurlänge). In den Diagrammen sind die jeweiligen Konzentrationen des applizierten Carbachol angegeben (in mmol·m^-3), bzw. das Histogramm für die Tubocurarin-Applikation (Cur).
C. Hill-plot zum kooperativen Verhalten der Carbachol-Bindung an den nAChR. Dargestellt ist das Verhältnis zwischen Offen- und Geschlossenwahrscheinlichkeit des Kanals als Funktion der Carbachol-Konzentration.

Neben der Bildung von exprimierten Membranproteinen im Tonoplasten cytoplasmatischer Tropfen können auch wäßrig-lösliche Proteine exprimiert werden. Nach Überexpression in Algenzellen könnten diese Proteine mit biochemischen Methoden aufgearbeitet und in klinischen Tests erprobt werden.

Injizierte Algenzellen sind als lebende Zellen oder als tiefgefrorene Präparate versandfähig, sie überstehen in einfachster Verpackung ohne Kühlung mehrere Tage.

Die Expression von Biomolekülen in genetisch manipulierten Wirtsorganismen spielt eine wesentliche Rolle bei der Gewinnung hochwertiger Substanzen mit Spezialwirkung. Eine solche wird erfindungsgemäß mittels eines bislang nicht eingesetzten Biosystems (genetisch manipulierte Algen) erreicht.

Von besonderem Nutzen ist dabei die Expression von speziellen Membranproteinen animalischen Ursprungs in der Membran cytoplasmatischer Tropfen, die sich für Untersuchungen des Wirkstofftransports in Organzellen mit Spezialfunktion eignen. Diese Möglichkeit erscheint insbesondere für Untersuchungen zur zellselektiven Einschleusung bestimmter Wirkstoffe von erheblicher Bedeutung.

Von permanent transfizierten Zellen, d. h. von solchen, denen der fremde genetische Code stabil eingebaut wurde, kann die genetische Information und damit Expressionsfähigkeit bei Zellteilung an die nachfolgenden Tochterzellen weitergegeben werden. Von besonderem Interesse dürfte hierbei sein, daß zur Kultivierung größerer Algenmengen aus solchen manipulierten Zellen keine zusätzlichen Energiequellen herangezogen werden müssen, da die Grünalgen autotroph sind, und auch das Problem der Sterilität nicht aufkommt (wie z. B. bei Mikroorganismen-Kulturen).

Ein weiterer Nutzen kann die umfassende Erläßlichkeit von Tierversuchen sein, wenn die Alge als Expressionssystem genutzt wird.

Auf diese Weise erlangen die an sich bekannten Transportuntersuchungen mit Hilfe von cytoplasmatischen Tropfen von Characeen (H. Lühring, 1986, Protoplasma 133: 19-28) eine besondere Zweckdienlichkeit.

Claims

1. Verfahren zur Expression von genetisch modifizierten Molekülen in Wirtszellen durch Einschleusung der entsprechend kodierten mRNA oder rekombinanten DNA, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtszellen Characeae-Zellen verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in die Zellen artfremde mRNA injiziert.

3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man rekombinante DNA oder mRNA für die Polypeptidsynthese von Membran- Transportproteinen injiziert

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen mit rekombinanter DNA permanent transfiziert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Tochterzellen aus permanent transfizierten Zellen verwendet werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5 zur Gewinnung von hochwertigen Polypeptiden durch Expression, dadurch gekennzeichnet, daß man das exprimierte Material vom Zellmaterial separiert.

7. Characeae-Zellen mit exprimierten Membranproteinen, ggf. in gefriergetrockneter Form.

8. Verwendung von Characeae-Zellen mit exprimierten Membranproteinen nach Anspruch 2-7 für pharmakologische Untersuchungen.