DE4408032A1 - Verfahren zur Ionisierung von gelösten Atomen oder Molekülen aus Flüssigkeiten durch elektrisches Versprühen - Google Patents

Description

Umfeld der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf eine Verbesserung des sogenannten "Elektro-Sprüh- Verfahrens" (englisch "electro spray ionization", häufig abgekürzt ES oder ESI) zur Ionisierung großer, gelöster Moleküle. Neu ist, daß es durch eine sehr feine Spitze der verwendeten Kapillaren gelingt, Tröpfchen mit etwa 200 Nanometer Durchmes­ ser zu erzeugen, gegenüber ein bis zwei Mikrometern Durchmesser bei herkömm­ lichen Verfahren. Tröpfchen dieser Größenordnung verdunsten bereits auf einer Wegstrecke von ein bis zwei Millimetern, und die geladen als Ionen zurückbleiben­ den großen Moleküle können durch eine feine Öffnung in der Gegenelektrode fast vollständig in das Vakuumsystem eines Massenspektrometers überführt werden. Daher sinkt der Probenverbrauch um mehr als zwei Zehnerpotenzen.

Stand der Technik

Das Elektro-Sprüh-Verfahren (ESI = electro spray ionization) wurde in der Arbeits­ gruppe von Professor John B. Fenn an der Yale Universität in Connecticut erarbeitet (Erstveröffentlichung: M. Yamashita und J. B. Fenn, J. Phys. Chem. 88, 4451 (1984)) und hat sich in den vergangenen Jahren außerordentlich schnell verbreitet, weil es eine Methode zur Ionisation von großen Molekülen ohne den Zwang zu vorheriger Verdampfung darstellt, und sich mit verschiedenartigen Massenspektrometern sehr günstig koppeln läßt.

Die Methode wurde praktisch zeitgleich auch von M. L. Aleksandrow und Mitar­ beitern entwickelt (M. L. Aleksandrow et al. Dokl. Nauk SSSR 277, 379 (1984); M. L. Aleksandrow et al. Bioorg. Khim. 10, 710 (1984)).

Ein guter Überblick über die Methode und den heutigen Stand der Technik ist in folgendem Review-Artikel gegeben: J. B. Fenn, M. Mann, C. K. Meng, S. F. Wong und C. M. Whitehouse; Spectr. Rev. 9, 37 (1990).

Zwischen einer Metallkapillare und einer ebenen Fläche, die einen Abstand von etwa 20 bis 50 Millimeter voneinander haben, liegt eine Spannung von mehreren Kilovolt an. Eine Flüssigkeit in der Kapillare wird dabei unter der Wirkung des elektrischen Feldes am Ende der Kapillare dielektrisch polarisiert und zu einem Konus ausgezogen, dem sogenannten Taylor-Konus. Am spitzen Ende dieses Konus kann die Oberflächenspannung der Flüssigkeit der ziehenden Kraft des elektrischen Feldes nicht mehr standhalten, daher reißt hier ein kleines Tröpfchen ab, das wegen der dielektrischen Polarisierung elektrisch aufgeladen ist. Das geladene Tröpfchen fliegt unter der Wirkung des inhomogenen elektrischen Feldes zunächst stark beschleunigt auf die ebene Gegenelektrode zu, wird aber in der umgebenden Luft abgebremst. Während des Fluges tritt von der Oberfläche des Tröpfchens eine starke Verdunstung ein. Befinden sich in der Flüssigkeit einige größere Moleküle, die sich durch Elektronenentzug, durch Protonierung oder sonst leichter laden (ionisieren) lassen als die Moleküle der Flüssigkeit, so können im günstigen Falle nach vollstän­ diger Verdampfung der Flüssigkeit die größeren Moleküle in ionisierter Form zurückbleiben. Die ionisierten Moleküle fliegen dabei unter der Wirkung des elektrischen Feldes durch den bekannten Prozeß der "Ionenmobilität" weiter auf die Gegenelektrode zu, und können durch eine feine Öffnung oder durch eine Kapillare in das Vakuumsystem eines Massenspektrometers überführt werden.

Das Abreißen der Tröpfchen findet, abhängig vom Nachschub der Flüssigkeit in der Kapillare, außerordentlich häufig statt, so daß gewöhnlich ein kontinuierlicher Ionenstrom entsteht. Der Nachschub wird durch eine sehr gleichmäßig arbeitende Pumpe, meist eine Spritzenpumpe, aufrechterhalten.

Die größeren Moleküle werden bei diesem Vorgang meist nicht nur einfach geladen, sondern vielfach. Als grobe Regel gilt, daß die mittlere Ladungszahl umso größer ist, je größer das Molekül ist. Die Ladung ist zumeist nicht eine einfache Ionisierung, sondern eine Protonierung, also eine Bindung mit einem geladenen Wasserstoffatom H+. Daher hängt die Ionisierung auch stark von der Wasserstoff-Ionen-Konzen­ tration (also vom pH-Wert) der Lösung ab. Um die mittlere Ladungszahl herum gibt es meist eine breite Verteilung mit verschiedenen Anzahlen von Ladungen.

Die mehrfache Ladung eines größeren Moleküls und die breite Ladungsverteilung sind besonders günstig für den Nachweis. Da die meisten Massenspektrometer einen beschränkten Massenbereich haben (genauer ausgedrückt: einen beschränkten Bereich der Massen-zu-Ladungs-Verhältnisse), kann man trotz dieser Beschränkung noch sehr große Moleküle weit jenseits des Massenbereichs, der für einfach geladene Ionen definiert ist, nachweisen, da die Elektro-Sprüh-Ionen vielfach geladen sind. Durch die breite und regelmäßige Verteilung der Anzahl der Ladungen auf die Molekülionen gleicher Masse ist es außerdem leicht möglich, die Molekularmasse rechnerisch zu bestimmen (M. Mann, C. K. Meng und J. B. Fenn, Anal. Chem. 61, 1702 (1989)).

Die Tröpfchen haben beim Abreißen einen sich selbst einstellenden Durchmesser von ein bis zwei Mikrometern, gegeben durch Dielektrizitätskonstante, Viskosität, Flußrate und Oberflächenspannung der Flüssigkeit.

Leider ist es nun so, daß Tröpfchen dieser Größe auf dem Wege zur Gegenelektrode nicht vollständig verdampfen, obwohl, wie bekannt, mit dem Kleinerwerden des Tröpfchens der Dampfdruck des Lösemittels steigt. Die Tröpfchen werden aber durch den Energieentzug bei der endothermen Verdunstung so stark gekühlt, daß die hierdurch bewirkte Erniedrigung des Dampfdrucks stärker ist als die Erhöhung des Dampfdrucks durch den kleiner werdenden Tröpfchenradius. Es war daher ein wesentlicher Durchbruch für die Verwendung dieser Methode, die Tröpfchen durch einen Gegenstrom mit erhitztem Gas zu einer verbesserten Verdunstung zu bringen.

Es ist nun ohne weiteres einzusehen, daß es für das Verfahren günstig wäre, wesent­ lich kleinere Tröpfchen zu erzeugen, die sich - schon wegen des erhöhten Dampf­ drucks bei kleinerem Durchmesser - viel leichter vollständig verdampfen ließen. Die Theorie nach Taylor (G. Taylor, "Disintegration of water drops in an electrical field", Proc. Roy. Soc. A 280, 383, (1964)), die dem Fachmann bekannt ist, läßt aber eine Verkleinerung der Tröpfchen nicht in einfacher Weise zu. Insbesondere ist der Tröpfchen-Durchmesser nach dieser Theorie nicht durch eine Verringerung des Kapillardurchmessers beeinflußbar. Der Taylor-Konus hat am spitzen Ende, wenn keine Tröpfchen gebildet werden, immer einen Winkel von genau 49,3°, unabhängig vom Kapillardurchmesser. Dieser Winkel bestimmt auch die Formung des inhomo­ genen elektrischen Feldes. Das Abreißen der Tröpfchen am Ende des Taylor-Konus geschieht immer an einer Stelle gleichen Durchmessers des Taylor-Konus, im wesentlichen bestimmt durch ein Gleichgewicht aus auseinanderreißendem elektrischem Zug und zusammenhaltender Oberflächenspannung, und hängt daher nicht vom Basis-Durchmesser des Taylor-Konus ab, und damit auch nicht vom Durchmesser der verwendeten Kapillare. Auch die Ausbildung des inhomogenen Feldes an der Spitze des Taylor-Konus hängt nicht vom Kapillardurchmesser ab.

Die Größe der Tröpfchen hängt aber von der Flußrate ab, mit der die Flüssigkeit nachgeliefert wird. Versuche zur Verringerung der Flußrate, die bei herkömmlichen und auch schon kommerziell erhältlichen Geräten minimal etwa 1 Mikroliter pro Minute beträgt, schlugen aber bisher fehl, da sich dann keine stabilen Verhältnisse einstellen ließen. Die Flußrate wird bei konventioneller Methode immer durch eine Pumpe bestimmt.

Eine Verbesserung des Verfahrens wurde daher eher darin gesehen, die Lösung mit Hilfe einer koaxialen Kapillare mit einer zweiten Flüssigkeit anderer Oberflächen­ spannung zu umgeben, um dadurch zu kleineren Tröpfchen zu kommen (USP 5 122 670). Auch die weitere koaxiale Zuführung eines besonderen additiven Sprühgases für eine pneumatische Unterstützung des Versprühens wurde vorgeschlagen (USP 5 170 053).

Eine weitere Verbesserung ist die Unterstützung des Sprühvorgangs durch Ultra­ schall, das ebenfalls zu etwas kleineren Tröpfchen führt.

Nachteile des jetzigen Standes der Technik

In der Biochemie und Medizin sind häufig nur geringste Substanzmengen für Ana­ lysen verfügbar (zum Teil nur Mengen von sehr wenigen Femtomol). Die untere Grenze für den Verbrauch an Substanz liegt aber bei etwa 100 Femtomol pro Minute, legt man eine untere Konzentration von etwa 0,1 Picomol pro Mikroliter, und eine minimale Flußrate von einem Mikroliter pro Minute zugrunde. Die Spektrenauf­ nahme, zumal bei MS/MS-Verfahren, dauert meist mehrere Minuten. Es werden also mehrere Hundert Femtomol Substanz benötigt. In Routineverfahren liegen diese Werte noch um Faktoren 10 bis 100 höher; es werden daher regelmäßig Mengen weit über einem Picomol benötigt.

Es ist aber bekannt, daß bei dem konventionellen Verfahren des Elektro-Sprühens Substanz regelrecht verschwendet wird. Die lange Strecke, die zur Verdampfung der Tröpfchen notwendig ist, führt notwendigerweise zu einer großen Aufweitung des Ionenstrahls durch Raumladungsabstoßung, so daß nur ein kleiner Teil der Ionen (etwa 1/100 bis 1/1000) durch die feine Öffnung des Massenspektrometers aufgenommen werden kann.

Das bisherige Elektro-Sprühen ist durch sehr viele Parameter der verwendeten Lösung zu beeinflussen, und für die meisten Parameter bestehen sehr enge Toleranz­ grenzen, außerhalb derer ein stabiler Betrieb nicht möglich ist. Beispielsweise kann kein reines Wasser versprüht werden, da sein elektrischer Widerstand zu groß ist. Andererseits ist die Zugabe von Salzen, die zur Erhöhung der Leitfähigkeit dienen, außerordentlich kritisch. Normalerweise wird mit Salzkonzentrationen unter einem Millimol pro Liter gearbeitet. Salzlösungen über 10 Millimol pro Liter können nicht mehr verwendet werden.

Auch können wäßrige Lösungen mit stärkeren Anteilen an organischen Lösemitteln, wie sie etwa bei Trennvorgängen mit Flüssigkeitschromatographie oder Gel- Chromatographie anfallen, mit der konventionellen Methode nicht versprüht werden.

Auch der Bereich der pH-Werte der Lösung ist stark eingeschränkt, im wesentlichen auf den leicht sauren Bereich. Wegen dieser Einschränkung der pH-Werte ist ein negatives Sprühen, wie es für Nukleotide erforderlich ist, überhaupt nicht möglich.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine feldinduzierte Sprühmethode zu finden, die beim Abriß der Flüssigkeit wesentlich kleinere Tröpfchen bildet als die bisher üblichen Methoden, und die einen so feinen Ionenstrahl bildet, daß praktisch alle Ionen von der feinen Öffnung des MS aufgenommen werden können. Die Sprüh­ methode soll außerdem sehr viel stabiler sein, weniger beeinflußbar durch Salz­ konzentrationen oder pH-Werte. Sie soll positives wie negatives Sprühen zulassen.

Grundgedanke und Erfolg der Erfindung

Es wurden für das Elektro-Sprüh-Verfahren Kapillaren aus Glas benutzt, die in einer automatisch arbeitenden Ziehapparatur, wie sie für die Herstellung sehr feiner Kapillarspitzen für Zellinjektionen verwendet werden, zur sehr feinen Spitzen mit Öffnungsdurchmessern von nur etwa 2,5 Mikrometer ausgezogen. Der äußere Durchmesser der Spitze betrug etwa 4 Mikrometer. Die Kapillaren wurden an Spitzen und Schaft durch Sputtering im Vakuum mit einer dünnen Goldschicht überzogen, um sie außen gut leitend zu machen. Die Goldschicht war sehr gleich­ mäßig.

Die Experimente mit diesen sehr spitz ausgezogenen Kapillaren führten über­ raschend zu Ergebnissen, die den Erwartungen aus den oben angeführten theo­ retischen Betrachtungen nicht entsprechen.

Die Glaskapillaren lieferten, in völlig stabilem Betrieb, Tröpfchen von etwa 200 Nanometern Durchmesser (wahrscheinlich noch geringer). Der Durchmesser war also mindestens um Faktoren 5 bis 10, die Masse der Tröpfchen mindestens um Faktoren 125 bis 1000 kleiner als bei der konventionellen Methode.

Mit niederviskosen Flüssigkeiten (Wasser mit Methylalkohol) konnte der Nachschub an Lösung allein durch die elektrischen Ziehkräfte bewältigt werden, wodurch sich eine Selbstregulierung des Nachflusses mit der Folge eines sehr konstanten Ionen­ stroms ergab. Bei höherviskosen Flüssigkeiten genügte ein leichter Gas-Überdruck am Ende der Kapillare, um zu einem selbstregulierenden Nachfluß zu kommen.

Die Sprühspannung betrug nur etwa 600 bis 800 Volt, was eine sehr viel einfachere Spannungsversorgung zur Folge hat.

Der optimale Abstand zwischen Spitze und Gegenelektrode betrug nur 1,5 Milli­ meter. Die Tröpfchen verdampften, wie indirekt geschlossen werden konnte, auf einer Strecke von nur etwa einem Millimeter und zeigten eine Strahlverbreiterung von nur etwa 200 Mikrometern, so daß sie praktisch vollständig durch eine Kapillare ins Vakuum des Massenspektrometers überführt werden konnten.

Verglichen mit einer konventionellen Elektro-Spray-Einrichtung, die mit einer Lösung gleicher Konzentration arbeitete, war der Ionenstrom im Massenspektro­ meter etwa zwei- bis dreimal höher. Der Lösungsmittelfluß, und damit der Substanzverbrauch, lag aber um den Faktor 40 niedriger als der niedrigste Fluß, der sich in konventionellen Verfahren noch stabil einstellen läßt.

Mit der außerordentlich geringen Konzentration von nur 0,05 Picomol pro Mikroliter konnten bei einer Flußrate von nur 25 Nanolitern pro Minute gute Protein-Spektren aufgenommen werden. Das entspricht einer Substanzflußrate von nur 1,3 Femtomol pro Minute, mehr als 70 mal geringer als bei den geringsten Werten für die konven­ tionelle Technik.

Aus Tröpfchendurchmesser, Flußrate und Konzentration läßt sich berechnen, daß pro Tröpfchen nur etwa ein Proteinmolekül vorhanden ist, das dann die gesamte Ladung des Tröpfchens übernimmt. Die Spektren unterschieden sich praktisch nicht von denen der konventionellen Elektro-Spray-Technik.

Es konnte abgeschätzt werden, daß je 10 000 eingesetzten Molekülen in der Lösung etwa 8 Moleküle als Ionen den Detektor des Massenspektrometers erreichten. Die Bildung kleinerer Tröpfchen mit dieser Methode konnte inzwischen auch theo­ retisch verstanden werden (M. S. Wilm und M. Mann, "Electro Spray and Taylor Cone Theory, Dole′s Beam of Macromolecules At Last?", wird zur Veröffentlichung eingereicht). Die Größe der Tröpfchen ist nach dieser Theorie auch von der Flußrate abhängig. Die stabile Erzeugung einer sehr kleinen Flußrate scheint aber, aus noch nicht voll verstandenen Gründen, bei größeren Kapillaren nicht möglich zu sein. Bei den sehr dünnen Kapillarspitzen des hier vorgestellten Verfahrens stellt sich die Flußrate jedoch selbstregulierend und außerordentlich stabil durch den Zug der elektrischen Spannung von selbst ein. Die Stabilität ist so gut, daß auch nichtopti­ male Lösungsparameter noch zu guten Erfolgen führen.

Weitere Vorteile der Erfindung

Der Kapillareinlaß eines Massenspektrometers für konventionelle Elektro-Sprüh- Ionisierung beträgt etwa ein Liter Umgebungsgas pro Minute. Meist wird Stickstoff verwendet, so daß etwa ein Gramm Gas pro Minute eingeführt wird. Der Lösungs­ mittelfluß von 25 Nanolitern entspricht aber einem Massenfluß von nur 25 Mikro­ gramm pro Minute. Selbst wenn das gesamte Lösungsmittel mit in das Massen­ spektrometer eingeführt würde, entspräche es nur einer Gewichtskonzentration von 0,0025%.

Ein besonderer Gegenstrom reinen Gases zum Fernhalten großer Mengen des Löse­ mittels aus dem Massenspektrometer kann damit entfallen. Der Gegenstrom ist nur dann angebracht, wenn letzte Spuren des Lösemittels ferngehalten werden müssen, oder wenn die letzten Reste der Solvathüllen entfernt werden müssen. Letzteres ist nicht bei allen Massenspektrometern erforderlich, beispielsweise kann in Ionen­ fallen-Massenspektrometern die Solvathülle in der Falle selbst entfernt werden. Die Entfernung der Solvathülle gelang auch schon in geheizten Einlaßkapillaren des Massenspektrometers.

Mit 1/2 Mikroliter Füllung in einer Kapillare, und mit einer Konzentration von 0,05 Picomol Protein pro Mikroliter, also mit einer Substanzmenge von nur 25 Femtomol Protein, läßt sich etwa 1/2 Stunde ununterbrochen arbeiten. In dieser Zeit können durch Verwendung von MS/MS-fähigen Massenspektrometern selbst komplizierte Aminosäuren-Sequenzanalysen vorgenommen werden.

Routinemäßig, das heißt ohne besondere Maßnahmen zur optimalen Justierung aller Parameter, lassen sich Lösungen mit Konzentrationen von etwa 0,1 bis 0,5 Picomol pro Mikroliter versprühen.

Das Sprüh-Verfahren ist sehr stabil und nur wenig von Salzkonzentrationen abhän­ gig. So konnten Salzkonzentrationen von 100 Millimol pro Liter leicht versprüht werden (Siehe Abb. 2). Natürlich treten die Salze als Ionen im Spektrum auf, trotzdem können die Spektren gut interpretiert werden.

Auch die pH-Werte beeinflussen den Sprühvorgang kaum. Es konnten Lösungen im Bereich von pH = 1 bis 12,5 verarbeitet werden. Damit ist auch negatives Sprühen zur Erzeugung von negativ geladenen Ionen möglich, wie sie für Nukleotide günstig sind.

Auch wäßrige Lösungen mit größeren Anteilen an organischen Lösemitteln, bei­ spielsweise 30% Acetonitril oder Methanol, ließen sich mit dieser Methode ver­ sprühen.

Der Substanzverbrauch läßt sich aber bei Verwendung bestimmter Massenspektro­ meter noch weiter verringern, da sich der Ionenstrahl mit dieser neuen Methode sehr leicht an- und abstellen läßt. So hört der Ionenstrahl durch ein Absenken der Spannungsdifferenz um etwa 200 Volt vollkommen auf, und kann durch Erhöhen der Potentialdifferenz auf den ursprünglichen Wert wieder in vormaliger Höhe eingeschaltet werden. An- und Abschalten kann in weniger als je einer Millisekunde durchgeführt werden. Für speichernde Massenspektrometer, wie Ionen-Cyclotron- Resonanz-Spektrometer (ICR) oder Ionenfallen, läßt sich mit dieser Schalttechnik eine nochmals verbesserte Ausnutzung geringer Substanzmengen erreichen.

Die Kapillaren können leicht und reproduzierbar zu Spitzen ausgezogen werden, wenn automatisch arbeitende Geräte benutzt werden, wie sie für die Herstellung feinster Kapillarspitzen für Zell-Injektionen entwickelt worden sind. Die leichte Herstellbarkeit legt die Einmalverwendung dieser Kapillaren nahe, zumal die Analyse von Lösungen mit außerordentlich niedrigen Konzentrationen extreme Reinigungsverfahren verlangen würde. Es bietet sich eine industrielle Herstellung der Kapillaren an.

Wegen der geringen Abstände zwischen der Kapillarenspitze und der feinen Öffnung zum Massenspektrometer läßt sich die Kapillare sehr leicht justieren. Es hat sich als ausreichend erwiesen, nur eine mechanische Justierung vorzunehmen, ohne gleichzeitige Beobachtung des Ionenstroms. Damit eignet sich das Verfahren in besonderer Weise für eine automatische Zuführung der Proben.

Einen besonderen Vorteil bildet auch die niedrige Potentialdifferenz von unter 1000 Volt, da sich diese Spannungen relativ leicht schaltbar und regelbar herstellen lassen.

Bevorzugte Ausführungsformen

Ein bevorzugtes Verfahren besteht aus folgenden Schritten: Es werden Sprüh-Kapillaren von 500 Mikrometer Außendurchmesser, 300 Mikro­ meter Innendurchmesser und 50 Millimeter Länge benutzt. Entsprechendes Kapillar­ glas wird nach sorgfältiger Reinigung auf einem Gerät für die Herstellung von Zell- Injektions-Pipetten zu einer feinen Spitze ausgezogen, die einen äußeren Durch­ messer von 4 Mikrometer und eine feine Öffnung von 2,5 Mikrometer aufweist. Die Sprüh-Kapillaren werden anschließend im Vakuum mit einer sehr dünnen Gold­ schicht von weniger als 1/10 Mikrometer Dicke versehen, die durch Ionenzerstäu­ bung (Sputtering) aufgebracht wird.

Die Sprüh-Kapillaren können ohne jede weitere Reinigung benutzt werden. Das Ausziehen zu einer Spitze stellt bereits ein sehr gutes Reinigungsverfahren dar. Es kann die innere Oberfläche aber auch mit üblichen Verfahren silanisiert werden, um der Adsorption der Untersuchungsmoleküle vorzubeugen. Auch andere Methoden, die die Oberfläche adsorptions-inert machen, können angewendet werden.

Die Sprüh-Kapillaren werden mit einer Mikropipette befüllt, die einen Außendurch­ messer von etwa 200 Mikrometer hat. Die Lösung wird bis in den Innenkonus hineingedrückt, der durch die ausgezogene Spitze gebildet wird.

Die gefüllte Sprüh-Kapillare wird dann sofort mit der Rückseite in einer Dichtungs­ durchführung eines kleinen Gehäuses befestigt und durch Anziehen einer Dich­ tungsschraube in üblicher Weise gedichtet. In diesem Gehäuse befindet sich am Boden etwas Lösemittel, daher ist das Gas in diesem Gehäuse mit Lösemittel gesättigt. Die Sättigung mit Lösemittel dient dazu, ein Austrocknen der Sprüh- Kapillare von der Rückseite her auch bei längerem Betrieb und auch in Betriebs­ pausen zu vermeiden. Das Gehäuse wird dann über eine Gaszuführung mit Druck beaufschlagt, der die Lösung in der Sprüh-Kapillare bis in die vorderste Front der Spitze treibt. Das Gas kann anschließend etwas entspannt werden, ohne daß sich die Lösung aus der Spitze zurückzieht.

Ein Austrocknen der Sprüh-Kapillare an der Vorderseite ist nicht zu befürchten, da hier die Flüssigkeitsoberfläche um mehr als 4 Zehnerpotenzen kleiner ist.

Die Dichtung der Sprüh-Kapillare im Gehäuse ist so ausgeführt, daß sie einen elek­ trischen Kontakt zu der Metallschicht der Spitze herstellt. Die Spitze kann also mit einer Spannung beaufschlagt werden.

Als Druckgas kann Luft verwendet werden, bei oxidationsempfindlichen Substan­ zen empfiehlt sich ein inertes Gas, beispielsweise Stickstoff.

Die Sprüh-Kapillare wird in dem Gehäuse so befestigt, daß ihre Spitze genau um einen Abstand aus dem Gehäuse herausragt, der auf etwa 0,1 Millimeter genau toleriert ist.

Das Gehäuse wird dann auf einer Präzisionsführung an die ebene Gegenelektrode herangeführt. Ein Anschlag arretiert das Gehäuse genau dann, wenn sich die Spitze genau 1,5 Millimeter von der Gegenelektrode entfernt befindet. Durch die Präzi­ sionsführung ist die Spitze automatisch auf die Öffnung in der Gegenelektrode zentriert. Die Toleranz für die Zentrierung beträgt etwa 1/20 Millimeter, die Zentrierung ist also nicht extrem kritisch.

Ein optimaler Eintritt in das Massenspektrometer ist durch eine etwa 20 Zentimeter lange Einlaß-Kapillare aus isolierendem Material gegeben, mit einer Kapillaröffnung von etwa 500 Mikrometer und an beiden Enden mit einer Metallschicht versehen, die die Stirnfläche und einen Teil des zylindrischen Teils umfaßt. Diese Einlaß- Kapillaren werden bereits bei der herkömmlichen Art der Elektro-Sprüh-Ionisierung benutzt.

Das Einschalten der Spannung zwischen Spitze der Sprüh-Kapillare und Gegen­ elektode startet den Tröpfchen- und Ionenstrahl. Die Sprühspannung beträgt etwa 600 bis 800 Volt. Die Spannung ist nur geringfügig vom Abstand Spitze-Gegen­ elektrode abhängig, sehr wohl aber von der Art des Lösemittels. Die Einrichtung des Massenspektrometers zur Messung des Totalionenstromes kann dazu benutzt werden, die richtige Spannung einzustellen. Eine andere Justierung des Verfahrens ist nicht notwendig.

Routinemäßig können bei dieser Art der Analyse von Proteinmolekülen Konzentra­ tionen von etwa 0,1 bis 0,5 Picomol pro Mikroliter benutzt werden. Der Verbrauch an Lösung beträgt etwa 25 Nanoliter pro Minute. Mit einem halben Mikroliter Lösung, also mit Substanzmengen von 50 bis 250 Femtomol, kann etwa 1/2 Stunde ununterbrochen gearbeitet werden. Der Substanzverbrauch ist somit etwa einen Faktor 100 niedriger als bei herkömmlichen Elektro-Sprüh-Verfahren.

Bei Verwendung von ionenspeichernden Massenspektrometern wie ICR oder Ionen­ fallen kann der Substanzverbrauch nochmals erniedrigt werden. Diese Massen­ spektrometer arbeiten mit zyklischen Beladungsphasen, die dann durch Phasen mit der eigentlichen Spektrenaufnahme unterbrochen werden. Die Beladungsphasen dauern durchschnittlich 5 bis 20 Millisekunden, die Spektrenaufnahmen etwa 1 Sekunde. Da sich der Ionenstrahl dieser neuen Methode des Elektro-Sprühens sehr schnell ein- und ausschalten läßt, braucht der Ionenstrom nur in der Beladungsphase eingeschaltet zu werden. Der Substanzverbrauch erniedrigt sich dabei nochmals um einen Faktor 50. Dieses Schalten läßt sich bei der herkömmlichen Methode des Elektro-Sprühens nicht durchführen.

Eine Reinigung der benutzten Sprüh-Kapillaren ist kritisch, da trotz sorgfältiger Reinigung der Röhrchen durch andere pH-Werte der Lösung sehr leicht wand­ adsorbierte Moleküle früherer Proben gemessen werden, da die verwendeten Konzentrationen extrem gering sind. Es ist daher zweckmäßig, die Sprüh-Kapillaren nur einmal zu verwenden.

Weitere Verbesserungen des Verfahrens betreffen die Automatisierung der Proben­ zuführung. Dabei kann die Probe sowohl von einem separierenden Chromato­ graphen aus (Flüssigkeits-Chromatographie, Gel-Chromatographie, Elektrophorese) wie auch durch Nachschub gefüllter Sprüh-Kapillaren zugeführt werden.

Beschreibung der Bilder

Abb. 1 zeigt eine Kapillare, wie sie für dieses Verfahren verwendet wurde. Eine normale Glaskapillare wurde in einem automatisch arbeitenden Gerät zu einer Spitze ausgezogen. Dieses Ausziehen ist sehr reproduzierbar. Die Kapillaren werden an der Spitze anschließend im Vakuum durch Ionenzerstäuben (Sputtering) mit Gold belegt. Die Goldbelegung reicht bis in den zylindrischen Teil, um einen Spannungskontakt herstellen zu können. Die Zeichnung zeigt das Prinzip, sie ist nicht proportional gezeichnet.

Abb. 2 zeigt ein normales Massenspektrum eines Peptids, das mit einer Konzentration von 0,5 Picomol pro Mikroliter und einer Gesamtmenge von 0,5 Mikroliter gleich 250 Femtomol aufgenommen wurde. Es wurde für die Spektren nur ein kleiner Teil der eingesetzten Menge verbraucht.

Abb. 3 zeigt ein MS/MS-Spektrum des Peptids, dessen Massenspektrum in Abb. 1 gezeigt wurde. Dieses Tochterionen-Spektrum wurde aus derselben Menge von 250 Femtogramm des Peptids aufgenommen. Es zeigt die vollständige Analyse der Sequenz aus 16 Aminosäuren: MDMSKDESVDYVPMLD. Das Molekulargewicht ist 1873,8 u.

Abb. 4 zeigt das Massenspektrum eines Peptids, das aus einer 100-millimo­ laren Natriumchloridlösung heraus aufgenommen wurde. Ein solches Spektrum kann mit der konventionellen Elektro-Sprüh-Methode nicht aufgenommen werden. Das Spektrum unterscheidet sich sehr stark von konventionell aufgenommenen Spektren, die Identifizierung ist jedoch leicht durchzuführen. Die Möglichkeit, aus solchen Lösungen heraus Spektren bekommen zu können, ist außerordentlich wichtig, weil viele separierende Verfahren nicht ohne Puffersalze oder Elektrolyte auskommen und Reinigungsschritte oft schwierig sind.

Claims (24)

1. Verfahren zur Ionisierung von gelösten Atomen oder Molekülen, wobei sich die Lösung in einer beidseitig offenen Kapillare befindet, durch zeitlich fortgesetztes Herausziehen vieler geladener Lösungströpfchen aus der Lösungsoberfläche am vorderen Ende der Kapillare durch die Einwirkung eines starken elektrischen Feldes, das durch eine Potentialdifferenz zwischen dem vorderen Ende der Kapillare und einer flachen Gegenelektrode gebildet wird, mit anschließendem Eintrocknen der abgezogenen Tröpfchen, so daß die vormals gelösten Atome oder Moleküle im wesentlichen lösemittelfrei durch die Übernahme der Ladungen als Ionen zurück­ bleiben, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare an der Vorderseite eine schlanke Spitze mit einem Öffnungsdurchmesser unter 5 Mikrometer und einem äußerem Durchmesser unter 20 Mikrometer besitzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die flache Gegen­ elektrode im wesentlichen eben ist.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die Tröpfchenbildung im wesentlichen bei Atmosphärendruck geschieht.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die geladenen Tröpfchenreste, Atome oder Moleküle durch eine Öffnung in der flachen Gegenelektrode in den evakuierten Teil eines Massenspektrometers eingebracht werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die Kapillare mit ihrer Spitze aus Glas oder Quarzglas gezogen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Spitze sehr reproduzierbar in einem automatisch arbeitenden Gerät (einem sogenannten "Puller") gezogen ist, wie es zum Ausziehen der Spitzen für Zellinjektionskapillaren benutzt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil der Kapillare nach dem Ziehen der Spitze außen mit einer Metallschicht überzogen wird, die die Spitze und einen Teil des zylindrischen Kapillarteils gleichmäßig und dünn belegt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallschicht aus Gold besteht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Kapillarspitze und die Öffnung in der Gegenelektrode zentriert gegenüber­ stehen.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß Kapillarspitze und Gegenelektrode einen Abstand kleiner als 3 Millimeter voneinander haben.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die felderzeugende Potentialdifferenz kleiner als ein Kilovolt ist.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Nachschub der Lösung zur Spitze der Kapillare im wesentlichen durch den Zug des elektrischen Feldes erzeugt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachschub der Lösung zur Spitze der Kapillare durch die Kombination des Zuges des elektrischen Feldes und eines unterstützenden Druckes am Ende der Kapillare erzeugt wird, wobei der Druck am Ende der Kapillare so gering gehalten wird, daß er ohne den elektrischen Zug kein selbständiges Ausfließen der Lösung aus dem vorderen Teil der Kapillare erzeugt.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Ionenerzeugung durch Umschalten des felderzeugenden Potentials an- und abgeschaltet wird.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß ein rückwärtiges Eintrocknen der Lösung in der Kapillare dadurch verhin­ dert wird, daß das Gas in der Umgebung des hinteren Endes der Kapillare mit dem Dampf des Lösungsmittels gesättigt wird.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß der hintere Teil der Kapillare durch einen abgedichteten, geschlossenen Raum umgeben ist.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die innere Oberfläche der Kapillare durch eine Belegung mit organischen oder metall-organischen Molekülen gegen eine Adsorption der gelösten Atome oder Moleküle inert gemacht wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Belegung der inneren Oberfläche chemisch an diese gebunden ist.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die Kapillaren mit Spitze und Metallschicht so maßhaltig hergestellt wer­ den, daß bei Austausch der Kapillare die richtige Zentrierung und der richtige Abstand der Kapillarenspitze zur Gegenelektrode durch eine mechanische Halte­ rung ohne Nachjustierung gewährleistet ist.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die Kapillare mit einem Flüssigkeitschromatographen verbunden ist.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß ein Gas im Gegenstrom zu den fliegenden Tröpfchen oder Ionen zugeführt wird.

22. Kapillare für die Elektro-Sprüh-Ionisierung mit einem zylindrischen Teil von mindestens 20 Millimeter Länge, charakterisiert durch eine fein ausgezogene Spitze von mindestens 5 Millimeter Länge, mit einem Innendurchmesser der Öffnung in der Spitze von maximal 5 Mikrometer, und einem Außendurchmesser der Spitze von maximal 20 Mikrometer, und durch eine die Spitze umschließenden äußeren Metallschicht, die mindestens bis in den zylindrischen Teil der Kapillare reicht.

23. Kapillare nach Anspruch 22, dadurch charakterisiert, daß sie aus Glas oder Quarzglas besteht.

24. Kapillare nach einem der Ansprüche 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallschicht aus Gold besteht.