DE4339352A1 - Verfahren zur Markierung von Zellen, mit diesem Verfahren markierte Zellen, Verwendung des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus zur Markierung von Zellen und Testkits zum Nachweis des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus in Zellen - Google Patents
Verfahren zur Markierung von Zellen, mit diesem Verfahren markierte Zellen, Verwendung des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus zur Markierung von Zellen und Testkits zum Nachweis des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus in ZellenInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Markierung von Zellen, bei dem die Zellen genetisch dadurch
markiert werden, daß diese Zellen mit einem Virus infiziert
werden, das in die DNA der zu markierenden Zellen integriert
wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Zellen ex vivo
markiert werden und es wird hierdurch ermöglicht, das
weitere Schicksal dieser Zellen, insbesondere nach
Rückführung der Zellen in den Spenderorganismus zu
verfolgen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird zur genetischen
Markierung der zu markierenden Zellen das sogenannte Adeno-
assoziierte Virus eingesetzt. In besonders bevorzugter Weise
werden Virusstämme vom Wildtyp eingesetzt, d. h. diese
Virusstämme werden nicht genetisch manipuliert durch
Veränderung des Virus.
Das Adeno-assoziierte Virus ist bereits bekannt. In der
Veröffentlichung von Srivastava et al., Journal of Virology,
Februar 1983, Vol. 45, S. 555-564, wird die Nukleotidsequenz
und die Organisation des Adeno-assoziierten Virusgenoms
offenbart. Auf die in dieser Veröffentlichung offenbarte
Nukleotidsequenz wird ausdrücklich Bezug genommen und diese
Sequenz wird hiermit zum Gegenstand der vorliegenden
Anmeldung gemacht.
Bei dem Adeno-assoziierten Virus handelt es sich um ein
Virus vom DNA-Typ, das normalerweise eine Co-Infektion mit
einem zweiten Virus benötigt, um eine Infektion zu erzielen.
Deshalb wird das Adeno-assoziierte Virus zu den defekten
Parvoviren gerechnet. Als Helferviren fungieren das
Adenovirus oder das Herpes-Simplex-Virus, die eine
effiziente Replikation des Adeno-assoziierten Virus in vitro
ermöglichen. Obwohl es sich bei dem Adeno-assoziierten Virus
um ein menschliches Virus handelt, ist dessen Wirtsbereich
für das lytische Wachstum unüblich breit. Vermutlich jede
Säugerzelle, die bisher getestet wurde, einschließlich
menschliche Zellen, Kaninchenzellen, Rinderzellen oder
Nagerzellinien können mit dem Adeno-assoziierten Virus (im
folgenden kurz AAV) infiziert werden, vorausgesetzt ein
geeignetes Helfervirus wird verwendet. Die Helferviren
müssen natürlich zu den Wirtszellen passen. Trotz des weiten
Wirtsbereichs wird durch das AAV weder bei Menschen noch bei
Tieren eine Erkrankung beobachtet.
Obwohl ein bestimmter Prozentsatz der menschlichen
Bevölkerung mit AAV infiziert ist, deuten neuere
Erkenntnisse darauf hin, daß das AAV nur in bestimmte Zellen
integrieren kann. Bekannt ist, daß sich das AAV in das
Chromosom 19 der Epithelzellen des Respirationstraktes
integrieren kann. Bei anderen Zellen wurde nur in äußerst
geringen Prozentsätzen (unter 2%) eine natürliche
Integration des AAV-Virus beobachtet. Diese Erkenntnis
ermöglicht die Verwendung von AAV als genetischen Marker, da
eine Infektion von anderen als den natürlicherweise
befallenen Zellen nur dadurch erzielt werden kann, daß in
vitro gezielt eine Infektion durchgeführt wird.
Insbesondere die hämatopoetischen Vorläuferzellen werden
durch das AAV in vivo bei bis zu etwa 98% der Bevölkerung
nicht infiziert. Wenn also derartige Zellen in vitro mit AAV
infiziert werden, dann integriert dieses Virus stabil in das
Chromosom der Zellen und diese Zellen sind dann markiert
durch den Gehalt des AAV-Genoms im Genom der markierten
Zellen.
Mit Hilfe dieser genetischen Markierung kann das Schicksal
der markierten Zellen weiterverfolgt werden. Da sich das AAV
in das Chromosom der markierten Zellen integriert, wird es
auch bei der Vermehrung der Zellen mit vermehrt und die sich
aus den markierten Zellen entwickelnden Klone können anhand
der Markierung erkannt werden. Dies ist besonders
vorteilhaft bei der Forschungsarbeit, da das weitere
Schicksal der markierten Zellen und der daraus abgeleiteten
Nachfahren verfolgt werden kann.
Vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß
lediglich Wildtyp-Adeno-assoziierte Viren verwendet werden,
die anerkanntermaßen apathogen sind. Eine Integration des
AAV in das Wirtsgenom läßt also keine Krankheiten oder
sonstigen Nachteile für den Empfängerorganismus erwarten.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäß verwendeten
Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus ist, daß sich das Virus
zwar ins Wirtsgenom integrieren kann, aber von dort nicht
mehr mobilisiert werden kann. Das heißt, das Virus vermehrt
sich nicht selbständig und infiziert dann andere Zellen, was
zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen könnte.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist,
daß die Wildtyp-Adeno-assoziierten Viren gentechnisch nicht
verändert sind oder verändert werden müssen und, daß daher
keine Komplikationen mit dem Gentechnikgesetz zu befürchten
sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann grundsätzlich bei
Säugern und bei Menschen eingesetzt werden, wobei die
Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens beim Menschen,
insbesondere bei der klinischen Forschung und bei der
Therapie bevorzugt ist. Auch bei der Forschung mit
Tiermodellen läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren gut
einsetzen.
Angewendet werden kann das erfindungsgemäße Verfahren
beispielsweise bei Patienten, die nicht mit dem
entsprechenden Subtyp der Adeno-assoziierten Viren infiziert
sind. Sofern eine Infektion in einem Adeno-assoziierten
Virusstamm vorliegt, kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren
ein anderer Wildtyp-Stamm verwendet werden, wobei jedoch
darauf zu achten ist, daß ausreichende Unterschiede in den
Nukleotidsequenzen vorliegen, so daß eine Unterscheidung
zwischen dem zur Markierung eingesetzten Wildtypstamm und
dem Stamm des Adeno-assoziierten Virus möglich ist, mit dem
die zu untersuchenden Patienten infiziert sind.
Es hat sich herausgestellt, daß das erfindungsgemäße
Markierungsverfahren besonders geeignet ist, wenn es zur
Markierung von mobilisierten Blutstammzellen verwendet wird.
Insbesondere bei Tumorerkrankungen können periphere
Blutstammzellen durch Chemotherapie und eine anschließende
Behandlung mit verschiedenen Wachstumsfaktoren mobilisiert
und ex vivo expandiert werden. Dieses Verfahren ist
beispielsweise beschrieben in Brugger et al., Blood, 1993,
Vol. 81, S. 2579-2582.
Wenn also periphere Blutstammzellen ex vivo expandiert
werden, können die hierbei gewonnenen Blutstammzellen mit
dem Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus transduziert werden.
Die Transduktion der zu infizierenden Blutstammzellen
erfolgt in Zellkulturmedium, in bevorzugter Weise in
Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium. In bevorzugter Weise
ist das Zellkulturmedium mit autologem Patientenplasma
supplementiert. Weiterhin enthält das Zellkulturmedium in
bevorzugter Weise Wachstumsfaktoren, wobei die rekombinant
hergestellten Wachstumsfaktoren Interleukin-1, Interleukin-
3, Interleukin-6, Erythropoetin und Stammzellfaktor
bevorzugt sind. Die Konzentrationen der einzelnen
Wachstumsfaktoren liegen bei 50 bis 200 ng/ml, bevorzugt bei
100 ng/ml. Das Medium mit Zellen und Viren wird bei 37°C
über sechs Stunden inkubiert. Das AAV liegt vor in einem
Virusstock von verpackten AAV-Partikeln, die in Zellkulturen
hergestellt wurden. Die Herstellung von AAV erfolgt nach
allgemein bekannten Verfahren. Diese Partikel sind zur
einmaligen Infektion der Zellen in der Lage. Da die
Wildtypviren die genetische Information zur Mobilisierung
der Viren nicht besitzen, ist eine weitere Infektion der
markierten Zellen nach dem Transduktionsschritt nicht mehr
möglich.
Um das erfindungsgemäße Verfahren auswerten zu können,
müssen Nachweismethoden zur Verfügung gestellt werden, die
Auskunft darüber geben, ob die zu untersuchende Zelle vor
der Infektion mit Adeno-assoziiertem Virus infiziert war
oder nicht. Weiterhin ist es zur Auswertung erforderlich,
daß nach der Markierung der Zellen die markierten Zellen von
den nicht markierten Zellen unterschieden werden können.
Eines der Nachweisverfahren ist die an sich wohlbekannte
Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Zur Durchführung dieser
PCR-Reaktion müssen geeignete Oligonukleotide synthetisiert
werden, die als Primer für die PCR-Reaktion dienen. Die
Sequenz der Oligonukleotidsequenzen kann anhand der im
Journal of Virology (1983, Vol. 45, S. 555-564) offenbarten
Nukleotidsequenz festgelegt werden. Üblicherweise wird man
zur Durchführung der PCR-Reaktion solche
Oligonukleotidsequenzen auswählen, die an den Enden der
Genomsequenz des AAV lokalisiert sind.
Eine andere Möglichkeit stellt die in situ-Hybridisierung
oder die Durchführung von Southern Blots dar. Bei den an
sich bekannten Southern Blots (Southern-Analyse) werden
elektrophoretisch aufgetrennte DNA-Fragmente auf spezielle
Filter oder Membranen übertragen. Durch anschließende
Hybridisierung mit homologen DNA-Sonden können Aussagen über
Vorkommen, Kopiezahl, Größe und Nukleotidsequenz gemacht
werden.
Zum Nachweis der Markierung von Zellen wird daher
erfindungsgemäß die DNA aus den markierten Zellen isoliert,
elektrophoretisch in einem Agarosegel aufgetrennt und die
DNA wird durch Alkalibehandlung des Gels und anschließende
Neutralisierung des Gels in Salzlösung denaturiert. Nun wird
die DNA auf Nitrozellulose oder Nylonfilter übertragen und
an den Filter gebunden. Diese Bindung wird dann durch Hitze
(Einbacken) oder UV-Bestrahlung stabilisiert. Nach
Prähybridisierung zur Absättigung von unspezifischen
Bindungen und anschließendem Waschen werden die Filter mit
einer markierten DNA-Sonde hybridisiert. Die DNA-Sonden
können radioaktiv markiert sein oder auch andere
Markierungen tragen. Für die markierten DNA-Sonden werden
aus der bekannten DNA-Sequenz geeignete Bereiche ausgewählt
und in bevorzugter Weise synthetisch hergestellt. Diese DNA-
Sonden hybridisieren dann mit dem AAV-Genom, sofern dieses
in die markierte Zelle integriert wurde. Wenn kein
Hybridisierungssignal erhalten wird, ist die Zelle nicht
markiert.
Wenn die expandierten peripheren Blutstammzellen erfolgreich
retransplantiert wurden, kann der Nachweis der mit AAV
markierten Zellen durch die beim erfolgreichen Angang des
Transplantats von diesen Stammzellen gebildeten reifen
peripheren Blutzellen verschiedener Zellinien nachgewiesen
werden. In bevorzugter Weise erfolgt die Anfärbung von auf
Objektträgern fixierten Einzelzellen gleichzeitig,
einerseits durch "Fluorescent In Situ Hybridization" (FISH)
für Teile des Genoms von AAV und andererseits mit Hilfe
gefärbter Antikörper für zellinienspezifische
Oberflächenmarker. Auf diese Weise können einerseits die
untersuchenden Zellen identifiziert werden mit Hilfe der
Antikörper für die zellinienspezifischen Oberflächenmarker
und andererseits kann durch die Fluorescent In Situ
Hybridization festgestellt werden, ob diese Zellen markiert
sind oder nicht markiert sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Zellen, die
mit Wildtyp-Adeno-assoziiertem Virus markiert sind, wobei
diese Zellen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
erhalten werden können. In besonders bevorzugter Form
handelt es sich bei diesen Zellen um menschliche periphere
Blutstammzellen, die die Markierung mit Wildtyp-Adeno
assoziiertem Virus tragen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Testkits,
die zum Nachweis des Adeno-assoziierten Virus in Zellen
geeignet sind. Diese Testkits weisen Nukleotidsequenzen auf,
die zu der DNA-Sequenz von Wildtyp-Adeno-assoziiertem Virus
komplementär sind. Bei diesen Testkits kann es sich um
Zusammenstellungen handeln, die zur Durchführung der an sich
wohlbekannten Polymerase-Kettenreaktion geeignet sind und
die als Primer Oligonukleotid-Sequenzen aufweisen, die
spezifisch sind für AAV. Durch die Polymerase-Kettenreaktion
kann dann nachgewiesen werden, ob sich AAV in den zu
untersuchenden Zellen befindet oder nicht.
Ein weiteres Testkit kann eine Zusammenstellung betreffen,
die zur in situ-Hybridisierung geeignet ist. Wesentlicher
Bestandteil dieser Zusammensetzung ist dann eine markierte
DNA-Sequenz, die zu der Sequenz von AAV komplementär ist.
Weiterhin kann es sich bei den erfindungsgemäßen Testkits um
eine Zusammenstellung handeln, die zur Durchführung des an
sich bekannten Southern Blots geeignet ist. Diese
Zusammenstellung enthält eine DNA-Sequenz, die komplementär
zur DNA-Sequenz von AAV ist. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform weist das Testkit die Reagenzien auf, die
einerseits zur Fluorescent In Situ Hybridization für Teile
des Genoms von AAV erforderlich sind und andererseits mit
Farbe markierte Antikörper für zellinienspezifische
Oberflächenmarker.
Darüber hinaus weisen die Zusammenstellungen diejenigen
Komponenten auf, die zur Durchführung des jeweiligen
Testverfahrens benötigt werden, wie Puffer, Enzyme etc.
Vorteilhaft bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß das
Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus gleichzeitig Vektor und
Marker in einem ist. Man spart sich also den Schritt der
Klonierung des Markers in den Vektor. Außerdem ist das
erfindungsgemäß verwendete Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus
nachgewiesenermaßen apathogen. Vorteilhaft ist auch, daß
sich das Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus spezifisch an einer
bekannten Stelle in das Chromosom 19 integriert und, daß
daher keine "Random"-Mutagenese erfolgt oder, daß das
Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus kein tumorgenes Potential
entfaltet, wie das beispielsweise bei den Retroviren der
Fall ist. Weiterhin ist vorteilhaft, daß das AAV
zellzyklusunhabhängig ist und mit sehr hoher Effizienz in
die zu markierenden Zellen integriert. Da die zu
markierenden Zellen keinen Behandlungsschritten ausgesetzt
werden müssen, die den Stoffwechsel beeinträchtigen können,
wie beispielsweise Bestrahlung, sind die Zellen in ihrer
Leistungs- und Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele näher
erläutert.
Durch Leukapherese wurden humane CD 34⁺-angereicherte
periphere Blutstammzellen gewonnen. Die gewünschten Zellen
lagen in einer Konzentration von 1 × 10⁶ und in einer
Reinheit von 50% vor. Die PBSC-Zellen wurden in 2 ml
vorgewärmtem Expansionsmedium resuspendiert. Bei dem
Expansionsmedium handelte es sich um Iscove′s Modified
Dulbecco′s Medium, das angereichert war mit 2% autologem
ACD-Plasma und je 100 ng/ml der Zytokine rhSCF, rhIL-1,
rhIL-3, rhIL-6 und EPO. Nun wurden die Zellen mit AAV-
Wildtyp-Virus-Stocks versetzt und für zwei Stunden bei 37°C
im Wasserbad belassen, wobei mit 5% CO₂ in Luft begast
wurde. Nach einer Inkubationsdauer von einer Stunde wurden
die Zellen aufgeschüttelt. Schließlich wurde mit 10 ml
Expansionsmedium aufgefüllt und anschließend zweimal mit
Expansionsmedium gewaschen, wobei die Zellen bei 800 g für
fünf Minuten abzentrifugiert wurden. Das Pellet wurde
resuspendiert und die Zellzahl bestimmt. Als Kontrolle wurde
ein Zytospin durchgeführt. Hierbei werden die Zellen
nebeneinander auf Glasobjektträger aufgebracht, wobei sie
gut angefärbt werden können.
Humane allogene Knochenmarks-Langzeitkulturen, die ein
konfluentes Stroma aufweisen und 3-4 Wochen alt sind, werden
in 10 ml Kulturflaschen mit 15 Gy Cs-gamma bestrahlt. Die
Dosisrate beträgt 3-5 Gy/min.
Zunächst werden diese Zellen zweimal mit PBS gespült und
dann mit je 5 × 10⁴ Zellen des Infektionsansatzes in
Langzeitkulturmedium inokuliert. Bei dem Langzeitmedium
handelt es sich um Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium, das
10% FCS, 10% Pferdeserum und 5 × 10-7 M Hydrocortison
enthält.
Jede Woche wird die Hälfte des Kulturmediums durch neues
Medium ersetzt. Vom Überstand wird die Zellzahl bestimmt und
eine Bestimmung der Anzahl der koloniebildenden Zellen
erfolgt in 0,9% Methylcellulose, 20% FCS, 100 ng/ml rhIL-3
und 100 ng/ml rhGM-CSF.
Die Zellen des Überstandes werden auf Glasobjektträger
nebeneinander aufgebracht, wodurch eine gute Anfärbbarkeit
gewährleistet ist (Zytospin-Preps).
Die Analyse der Virusintegration erfolgt durch Southern
Blot, wobei die DNA von 5 × 10⁵ bis 2 × 10⁶ Zellen isoliert
wird. Diese DNA wird mit dem Restriktionsenzym Bgl II
verdaut und elektrophoretisch aufgetrennt. Als Nachweissonde
dient ein 1,8 kB langes Fragment aus dem Adeno-assoziierten
Virus-rep-Gen, das mit den Restriktionsendonukleasen XbaI
und XhoI ausgeschnitten werden kann.
Alternativ hierzu wird eine in situ-Hybridisierung der
Zellen auf Objektträgern durchgeführt.
Claims (15)
1. Verfahren zur Markierung von Zellen, dadurch
gekennzeichnet, daß die Zellen mit Wildtyp-Adeno-
assoziiertem Virus inkubiert werden und, daß dabei die
Zellen von dem Virus infiziert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei den Zellen um Säugerzellen handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei den Zellen um menschliche Zellen handelt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um periphere Blutzellen handelt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus
apathogen ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus in
das Wirtsgenom integrieren kann, aber, daß es von dort nicht
mehr mobilisiert werden kann.
7. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Wildtyp-
Adeno-assoziiertem Virus markiert ist.
8. Zelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie
erhältlich ist nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6.
9. Zelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich um eine periphere Blutstammzelle handelt.
10. Verwendung eines Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus zur
Markierung von Zellen.
11. Testkit zum Nachweis des Wildtyp-Adeno-assoziierten
Virus in Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine
Zusammenstellung zur Durchführung des Testes handelt, die
wenigstens ein Nukleotidfragment enthält, das im
wesentlichen komplementär ist zu einem Teil des Wildtyp-
Adeno-assoziierten Virus-Genoms.
12. Testkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich um eine Zusammenstellung zur Durchführung der
Polymerase-Kettenreaktion handelt, die Oligonukleotide mit
einer Sequenz enthält, die spezifisch ist für Wildtyp-Adeno-
assoziiertes Virus.
13. Testkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich um eine Zusammenstellung zur in situ-Hybridisierung
handelt, die zu der DNA-Sequenz von Wildtyp-Adeno-
assoziiertem Virus komplementäre DNA-Sequenzen enthält.
14. Testkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich um eine Zusammenstellung zur Durchführung des
Southern Blots handelt, die eine zu der Nukleotid-Sequenz
von Adeno-assoziiertem Virus komplementäre, markierte DNA-
Sequenz oder mehrere derartige DNA-Sequenzen enthält.
15. Testkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich um eine Zusammenstellung handelt, die einerseits mit
Fluoreszenzfarbstoff markierte Nukleotidsequenzen enthält,
die komplementär zum Genom von Wildtyp-Adeno-assoziiertem
Virus sind und andererseits markierte Antikörper aufweist,
die spezifisch sind für zellinienspezifische
Oberflächenmarker.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| DE4339352A DE4339352A1 (de) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | Verfahren zur Markierung von Zellen, mit diesem Verfahren markierte Zellen, Verwendung des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus zur Markierung von Zellen und Testkits zum Nachweis des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus in Zellen |
| PCT/EP1994/003727 WO1995014232A1 (de) | 1993-11-18 | 1994-11-11 | Verfahren zur markierung von zellen, mit diesem verfahren markierte zellen, verwendung des wildtyp-adeno-assoziierten virus zur markierung von zellen und testkits zum nachweis des wildtyp-adeno-assoziierten virus in zellen |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| DE4339352A DE4339352A1 (de) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | Verfahren zur Markierung von Zellen, mit diesem Verfahren markierte Zellen, Verwendung des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus zur Markierung von Zellen und Testkits zum Nachweis des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus in Zellen |
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| DE4339352A1 true DE4339352A1 (de) | 1995-05-24 |
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Family Applications (1)
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| DE4339352A Withdrawn DE4339352A1 (de) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | Verfahren zur Markierung von Zellen, mit diesem Verfahren markierte Zellen, Verwendung des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus zur Markierung von Zellen und Testkits zum Nachweis des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus in Zellen |
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| WO (1) | WO1995014232A1 (de) |
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