DE4320597A1

DE4320597A1 - Verwendung von Polyphosphaten zur antiviralen Therapie und als Immunmodulatoren

Info

Publication number: DE4320597A1
Application number: DE19934320597
Authority: DE
Inventors: Heinz C Prof Dr Dr Schroeder; Igor S Prof Dr Kulaev; Werner E G Prof Dr Mueller
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-06-22
Filing date: 1993-06-22
Publication date: 1995-01-05

Description

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen erfolgversprechenden Weg zur Bekämpfung von AIDS bzw. ARC mit Hilfe von Polyphosphaten aufzuzeigen.

AIDS wird durch das Human Immunodeficiency Virus (HIV), auch genannt Human-T-Cell Leukemia/Lymphotropic Virus vom Typ III (HTLV-III) oder Lymphadenopathy-Associated Virus (LAV), verursacht. HIV gehört zum Typ der RNA-Viren. Der Virusbefall ist die Hauptursache für ein Spektrum immunologischer Störungen, von denen AIDS sich am schwersten in Form des Kaposi-Sarcoms (KS) oder des ARC klinisch manifestiert. Eine wirksame therapeutische Behandlung von AIDS oder ARC war bis jetzt noch nichtmöglich.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten zur Bekämpfung von AIDS oder des ARC sehr geeignet sind. Basis dieser Erfindung ist der Nachweis, daß Polyphosphate (1) einen anti-HIV Effekt und (2) einen immunmodulierenden Einfluß bewirken.

Die erfindungsmäßig zur Anwendung kommenden Verbindungen werden im allgemeinen zu pharmazeutischen Mitteln verarbeitet, die als Dosiseinheiten vorliegen und systemisch also oral, rektal oder parenteral (intramuskulär, intravenös und subkutan), verabreicht werden können.

Die Mittel enthalten eine zur Behandlung, Eliminierung, Linderung oder Verbesserung von AIDS oder ARC wirksame oder immundefekt-beseitigende Menge wenigstens einer Verbindung aus der Klasse der Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und Hilfsstoffen. Beispielsweise enthalten derartige pharmazeutische Mittel 0,5 bis 98 Gew.-% mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung zusammen mit einem pharmazeutischen Träger.

Wenn das Mittel in Form einer Dosiseinheit vorliegt, enthält diese vorzugsweise 50 bis 500 mg der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung.

Die pharmazeutischen Mittel können zur oralen Verabreichung in fester Form, beispielsweise als Tabletten, Pastillen, Kapseln, Pulver, oder in flüssiger Form, beispielsweise als wäßrige oder ölige Suspension, Sirup, Elixier, Lösung oder mit Flüssigkeit gefüllte Kapseln vorliegen.

Bevorzugte orale Mittel liegen in Form von Tabletten oder Kapseln vor und können übliche Träger, wie Bindemittel (z. B. Sirup, Akazia, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon), Füllstoffe (z. B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Kartoffelstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin), Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talk, Polyethylenglykol oder Siliciumoxid), Disintegrationsmittel (z. B. Stärke) und Netzmittel (z. B. Natriumlaurylsulfat), enthalten.

Mittel zur parenteralen Verabreichung liegen im allgemeinen in Form einer Lösung oder Suspension der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung zusammen mit üblichen pharmazeutischen Trägern vor, beispielsweise in Form einer wäßrigen Lösung für intravenöse Injektion oder einer öligen Suspension für die intramuskuläre Injektion. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Mittel erhält man, indem man 0,1 bis 10 Gew.-% der erfindungsgemäßen Verbindung in Wasser oder einem Träger, der aus einem aliphatischen Polyalkohol, wie Glycerin, Propylenglykol oder Polyäthylenglykolen oder einer Mischung davon besteht, löst. Die Polyäthylenglykole bestehen aus einer Mischung nicht flüchtiger, gewöhnlich flüssiger Polyäthylenglykole, die sowohl in Wasser als auch in organischen Flüssigkeiten löslich sind und deren Molekulargewichte von 200 bis 1500 reichen.

Pharmazeutische Mittel zur rektalen Verabreichung liegen in Form von Suppositorien vor, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen einer geeigneten Suppositoriengrundlage, wie Kakaobutter, gehärtete Fette, Polywachse oder Polyethylenglykole, in einer Menge von 1 bis 10 Gew.-% einverleibt sind.

Die Herstellung der pharmazeutischen Mittel erfolgt anhand üblicher Verfahren, beispielsweise durch Tablettieren, Einverleiben der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in eine Suppositoriengrundlage, Sterilfiltration und Abfüllen in Ampullen oder Tropfflaschen einer Lösung der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in Injektionswasser zusammen mit üblichen Zusätzen, wie Natriumchlorid, Natriumhydrogenphosphat, Dinatrium-EDTA (Ethylendiaminotetraessigsäuredinatriumsalz), Bezylalkohol oder Natriumhydroxyd zur Einstellung des pH.

Das Verfahren zur Behandlung von AIDS oder ARC umfaßt die Verabreichung einer therapeutisch (antiviral oder immunomodulierenden oder prophylaktisch) wirksamen Menge an Polyphosphaten mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten an Patienten, die dieser Behandlung bedürfen.

Die Dosierung hängt in erster Linie von der spezifischen Verabreichungsform und vom Zweck der Therapie ab. Die Größe der Einzeldosen sowie das Verabreichungsschema können am besten anhand einer individuellen Beurteilung des jeweiligen Krankheitsfalles durch den Arzt bestimmt werden, wobei das Alter, das Gewicht und der Zustand des Empfängers, der Verabreichungsweg und die Art und die Schwere der Krankheit berücksichtigt werden müssen. Im allgemeinen beträgt die Tagesdosis 2-20, vorzugsweise 3-10, insbesondere 6-7 mg/kg Körpergewicht.

Die Dauer der Behandlung richtet sich nach Art und Schwere der Erkrankung. Sie erstreckt sich im allgemeinen über mehrere Wochen, beispielsweise 4 bis 8 Wochen.

Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen wirken auf vielfältige Weise gegen das Human Immunodeficiency Virus (HIV) und sie wirken stimulierend auf das Immunsystem, so daß die körpereigenen Abwehrkräfte gegen AIDS, ARC und verwandte Erkrankungen gestärkt werden. Diese Verbindungen sind deshalb zur therapeutischen und prophylaktischen Behandlung der durch das AIDS-Virus verursachten Erkrankungen brauchbar.

Die Aktivität der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen werden nachfolgend am Beispiel von Polyphosphaten mit einer Kettenlänge von 2 [ab jetzt abgekürzt mit Poly P_n=2], 3 [= Poly P_n=3] bzw. 13-18 Phosphateinheiten [= Poly P_n=13-15] erläutert. Diese Substanzen wurden von der Fa. Sigma Chemie (Deisenhofen; Deutschland) bezogen.

Die Polyphosphate wurden anhand pharmakologischer in vitro- Testsysteme untersucht.

Beispiele: Pharmakologische Wirkungen von Polyphosphaten Beispiele

1) Nachweis der anti-HIV-Aktivität von Polyphosphaten;
2) Nachweis der immunodulierenden Aktivität von Polyphosphaten.

1. Nachweis der anti-HIV-Aktivität von Polyphosphaten

Dabei kam die Zellinie H9 zur Anwendung, bei der es sich um eine klonierte OKT4+ T-Zellinie handelt, in der sich das AIDS- Virus der Isolatbezeichnung HIV-IIIB (ehemals HTLV-IIIB genannt) vermehrt (M. Popovic, M.G. Sarngadharan, E.Reed und R.C. Gallo; Science 224, 497-500 (1984)).

Versuchsdurchführung

Reinigung von HIV-1 Reverser Transkriptase und Assaybedingungen:

Die für die vorliegenden Versuche verwendete HIV-1 Reverse Transkriptase (Herstellung nach dem Verfahren von: P.S. Sarin, y. Taguchi, D. Yun, A. Thornton, R.C. Gallo, B. Oeberg; Biochem. Pharmacol. 34, 4075 4079; 1985) wurde mittels sequentieller Chromatographie an DEAE-Cellulose, Phosphocellulose und Hydroxylapaptit gereinigt. Das gereinigte Enzym wurde in 50 mM Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl-aminomethan) (pH 7.5), 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,01% Triton X-100 und 20% Glycerin aufbewahrt. Die Versuchsansätze auf Reverse Transkriptase wurden in einer Reaktionsmischung (50 µl) durchgeführt, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT, 10 mM MgC12 , 100 mM Kaliumchlorid, 0,01 Triton X-100 (C₈H₁₇-C₆H₄- (OCH₂CH₂)9-10-OH) oder NP40 (nicht-ionisches Detergens Nonidet P 40, Produktbezeichnung der Fa. Sigma, d.i. Octylphenolethylenoxid-Kondensat), 10 µg/ml (dT)₁₅·(A)_n (Hybridpolymere aus den Oligo- bzw. Polynucleotiden Oligodesoxythymidylsäure und Polyadenylsäure) als Templateprimer und ³H-Desoxythymidintriphosphat (³H-dTTP) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 37°C inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µg Hefe-tRNA und 2 ml einer 10%-igen Trichloressigsäurelösung (TCA), die 1 mM Natriumpyrophosphat enthielt, gestoppt. Die Proben wurden über Milliporefilter (0,45 µm) filtriert, zuerst mit 5%-iger TCA- Lösung (5x) und anschließend mit 2 ml 70%-igem Ethanol gewaschen. Die Filter wurden unter einer Heizlampe getrocknet, anschließend wurde Scintillationsflüssigkeit zugegeben und die Radioaktivität in einem β-Scintillationzähler bestimmt.

HIV-Infizierung von H9-Zellen

H9-Zellen (M: Popovic, M.G. Sarngadharan, E. Reed, R.C. Gallo, Science: 224, 497-500, 1984) wurden mit Polybren (im Handel erhältliches Hexadimethrinbromid; 2 µg/ml) 30 Min. bei 37°C behandelt, polybrenfrei gewaschen und mit 200 000 000 HIV-IIIB- Virusteilchen (isoliert aus H9-Zellenkulturen nach M. Popovic, vgl. oben) pro 4 × 100 000 H9-Zellen infiziert. Ein nicht mit Arzneimittel behandelter Teil dieser Proben wurde als posivite Kontrollprobe verwendet, wohingegen zu den Testproben unterschiedliche Konzentrationen an zu testender Verbindung (Polyphosphate) gegeben wurden. Die HIV-IIIB Reverse Transkriptase-Aktivität dieser Kulturen wurde wie oben beschrieben analysiert.

Immunofluoreszenz-Assay

Die Immunofluoreszenz-Assays wurden an Methanol:Aceton (1 : 1)- fixierten Zellen unter Verwendung monoklonaler Antikörper (aus der Maus) gegen HIV-IIIB p17 (Gag-Protein mit MG = 17 000) und p24 (Gag-Protein mit MG = 24 000) durchgeführt. Diese beiden Proteine sind Markerproteine, welche die Anwesenheit von Viruspartikeln ihn den Zellen anzeigen. Die HIV-IIIB infizierten Zellen wurden mit oder ohne Arzneimittelbehandlung an Toxoplasmose-Slides fixiert. Nach der Fixierung mit Methanol- Aceton (1 : 1) während 30 Min. bei Raumtemperatur, wurden die Slides in versiegelten Plastikbehältern bei -20°C bis zum Gebrauch aufbewahrt. Die monoklonalen Antikörper wurden auf die Zellen gegeben, bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer 1 h inkubiert mit PBS (Phosphatpuffer), der 0.25% Triton X-100 enthält, 2 h gewaschen. Die Zellen wurden dann 1 h mit Fluorescein (FICT) markiertem Ziege-Antimaus IgG (Capell Labs.) behandelt, und mit PBS-Puffer, der 0,25% Triton X-100 enthält, über Nacht gewaschen. Auf die Slides wurde 50%-iges Glycerin gegeben und die Zellfluoreszenz wurde mit einem Zeiss- Fluoreszenzmikroskop bestimmt.

Untersuchungsparaleter 1. Zellwachstum

H9-Zellen sowie mit HIV-IIIB infizierte H9-Zellen wurden in einer Konzentration von 0,2 × 1 000 000 Zellen/ml Kultur-medium zum Beimpfen eines Kulturmediums verwendet. Nach 4-tägiger Inkubation betrug die Dichte der H9-Zellen 1,3 × 1 000 000 Zellen/ml, während die Dichte der mit HIV-IIIB infizierten H9- Zellen lediglich 0,5 × 1 000 000 Zellen/ml war; diese beiden Werte bildeten die Kontrollwerte.

Dann wurden Proben von H9-HIV-IIIB-Zellen 0,2 × 1 000 000 Zellen/ml 4 Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen von Polyphosphaten behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Es ist ersichtlich, daß Poly Pn=2 keinen antiviralen (cytoprotektiven) Effekt zeigt. Dagegen steigen die Wachstumsraten von H9-HIV-IIIB-Zellen in Anwesenheit von Polyphosphaten mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten bei Konzentrationen von zwischen 10 und 50 µg/ml auf Werte an, die im Bereich der Kontrolle, nämlich der H9-Zellen ohne HIV-IIIB liegen.

2. Inhibierung der Produktion von Reverser Transkriptase durch H9-HIV-IIIB-Zellen, die mit Polyphosphaten behandelt wurden

Es wurde untersucht, ob die 4-tägige Zugabe von Polyphosphaten zu H9-HIV-IIIB-Zellen die Produktion von HIV-IIIB-Viren einstellt. Als Maß für die Virusmenge im Kulturmedium wurde die Reverse Transkriptase gewählt. Also die Hemmung der Reversen Transkriptase zeigt Hemmung der Virusproduktion an. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:

Es ist ersichtlich, daß im Überstand der H9-HIV-IIIB-Zellen, die nicht mit Polyphosphaten behandelt wurden, eine beträchtliche Aktivität an Reverser Transkriptase vorlag. Die Zugabe von Poly P_n=2 bewirkte keine Änderung. Jedoch Zugaben von Poly P_n=3 und Poly P_n=13-15 bewirkten eine dosisabhängige Verringerung der Reversen Transkriptase-Aktivität im Überstand. Bereits bei der Dosis von 10 µg/ml wurde eine beträchtliche Inhibierung beobachtet. Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen, Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten, sind deshalb in der Lage, die Virusreplikation beinahe vollständig bei Dosen zu inhibieren, bei denen verschiedene in vitro-Parameter, beispielsweise das Zellwachstum, praktisch nicht nachteilig beeinflußt werden.

3. Inhibierung der HIV-IIIB p15 und p24 Expression in H9-HIV- IIIB durch Polyphosphate

Es hat sich gezeigt, daß Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten eine stark inhibierende Wirkung auf die Expression von HIV p15 und p24 in infizierten H9-Zellen besitzt. Wenn die Target H9-Zellen mit dem HIV-IIIB- Isolat behandelt und ohne die zu testende Verbindung kultiviert wurden, wurden die H9-Zellen infiziert und es kam, wie mittels indirekten Immunofluoreszenz-Assays festgestellt, zur Expression des p15 und p24-Proteins. Nach Inkubierung der H9- HIV-IIIB-Zellen mit den zu testenden Verbindungen wurde ein beinahe vollständiger Schutzeffekt beobachtet. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Es ist ersichtlich, daß Poly P_n=2 keine Änderung im Vergleich zur Kontrolle zeigt. Dagegen bewirken Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten eine signifikante Reduktion der Expression der HIV-IIIB-Proteine p15 und p24.

2) Nachweis der immuniodulierenden Aktivität von Polyphosphaten

Kultivierung von menschlichen peripheren Blut Lymphozyten Periphere Blutlymphozyten wurden von gesunden Probanden nach der bekannten Ficoll-Hypaque Methode gewonnen. Nachdem sie gewaschen waren, wurden sie in einer Konzentration von 5 000 000 Zellen/ml in RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Kälberserum in 1-ml Ansätzen inkubiert (G. Leyhausen et al., Antimicrob. Agents Chemother. 26 : 752, 1984).

Behandlung der Lymphozyten

Zur Bestimmung des Einflusses von Polyphosphaten auf das Wachstumsverhalten von Lymphozyten wurde der Einfluß dieser Substanzen auf die Inkorporation von radioaktivmarkiertem Thymidin (³H-dThd) in die DNA bestimmt. Die Versuchsbedingungen wurden wie früher beschrieben, durchgeführt (G. Leyhausen et al.; s. o.). Die Hemmkonzentration, durch die die Inkorporationsrate von ³H-dThd auf 50% reduziert wird, wurde durch das Logit-Regressions-Verfahren bestimmt (L. Sachs. Angewandte Statistik; Springer Verlag, Berlin; 1984).

Der Einfluß von Polyphosphaten auf die Produktion von Interferon-gamma (IFN-gamma) wurde wie folgt bestimmt. 1-ml Kulturen wurden für 0-72 Std. in Anwesenheit verschiedener Polyphosphat-Konzentrationen alleine oder zusammen mit dem Mitogen Phytohaemagglutinin A (PHA) inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen abzentrifugiert, der Überstand gesammelt und der IFN-gamma-Titer bestimmt.

Interferon Nachweis

Die Menge an IFN-gamma wurde nach dem Verfahren von H. Gallati (J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 20 : 907, 1982) auf der Basis eines Enzyme-Immuno-Assays bestimmt. In Kürze, 96er Kulturplatten wurden mit monoklonalen Antikörpern, gerichtet gegen IFN-gamma, beschichtet. Dann wurden 50 µl Kulturüberstand in die einzelnen Vertiefungen der Kulturplatten gegeben. Anschließend wurde Peroxidase-markiertes anti-Mensch IFN-gamma hinzugegeben: Nach erfolgter Waschung wurde die Menge an gebundener Peroxidase bestimmt. Die Höhe der Peroxidase- Aktivität wurde über eine Eichkurve mit der INF-gamma-Menge korreliert. Die IFN-gamma-Menge wird angegeben in NIH-units/ml Kulturüberstand.

Untersuchungsparameter 1. Einfluß von Polyphosphaten auf die Inkorporationsrate von ³H-dThd in Lymphozyten

In Abwesenheit von Polyphosphaten wurde in Lymphozyten eine Inkorporationsrate von 1300 Zerfälle pro Minute × 1 000 000 Zellen gemessen.

Die ED₅₀-Werte in den Ansätzen mit Polyphosphaten wurden wie folgt ermittelt:

Polyphosphate
ED₅₀ Wert (µg/ml)
Poly P_n=2
< 150
Poly P_n=3	< 150
Poly P_n=13-15	< 150

Bei Konzentrationen an Polyphosphaten unterhalb von 150 µg/ml wurden keine Effekte auf die Inkorporationsraten gemessen.

Diese Untersuchungsreihe zeigt, daß Polyphosphate erst in sehr hohen Dosen zytostatisch wirken.

2. Induktion von IFN-gamma in Lymphozyten-Kulturen nach Inkubation mit Polyphosphaten

Die Kulturen wurden wie folgt mit den Polyphosphaten für 72 Std. behandelt:

Aus diesen Befunden wird deutlich, daß Poly P_n=2 keinen Effekt zeigt. Jedoch Poly P_n=3 und Poly P_n=13-15 induzieren in dem sehr niederigen Konzentrationsbereich von 0,05 bis 3 µg/ml signifikante Mengen an IFN-gamma.

3. Induktion von IFN-gamma durch Polyphosphate in Kombination mit dem Mitogen PHA

Auch diese Untersuchungen wurden in dem oben beschriebenen Lymphozyten-Ansatz während einer Inkubationsperiode von 72 Std. durchgeführt.

Aus diesen Experimenten muß der Schluß gezogen werden, daß Polyphosphate mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten den INF-gamma induzierenden Effekt von PHA potenzieren.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung Beispiele für pharmazeutische Mittel

In den nachfolgenden Formulierungsbeispielen kann als Wirkstoff jeweils eine der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen einzeln oder im Gemisch mit einer anderen erfindungsgemäßen Verbindung eingesetzt werden.

Beispiel a

Tablettenformulierung:
Wirkstoff 10 mg
Lactose 18 mg
Kartoffelstärke 38 mg
Gelatine 2 mg
Talkum 2 mg
Magnesiumstearat 0,1 mg

Beispiel b

Tablettenformulierung:
Wirkstoff 10 mg
Kartoffelstärke 40 mg
Polyvinylpyrrolidon 5 mg
Die Tabletten werden mit einer gefärbten Zuckerschicht überzogen.

Beispiel c

Kapselformulierung:
Wirkstoff 10 mg
Maisstärke 90 mg
Lactose 50 mg
Talkum 2 mg
Diese Mischung wird in Gelatinekapseln gefüllt.

Beispiel d

Flüssige orale Formulierung:
Wirkstoff 2 g
Saccharose 250 g
Glucose 300 g
d-Sorbit 150 g
Agar-agar 0,15 g
Methylparaben 0,5 g
Propylparaben 0,05 g
Geschmacksstoff (Orangengeschmack) 10 g
Tartazin gelb
Gereinigtes Wasser auf 1000 ml

Beispiel f

Flüssige orale Formulierung:
Wirkstoff 2 g
Tragacanth 7 g
Glycerin 50 g
Saccharose 400 g
Methylparabren 0,5 g
Propylparabren 0,05 g
Geschmacksstoff (Geschmack von schwarzer Johannisbeere)
Roter Farbstoff Nr. 2C.E.184 0,02 g
Gereinigtes Wasser auf 1000 ml

Beispiel g

Flüssige orale Formulierung:
Wirkstoff 2,4 g
Saccharose 400 g
Tinktur von Bitterorangenschalen 20 g
Tinktur von Süßorangenschalen 15 g
Gereinigtes Wasser auf 1000 ml.

Claims

1. Verwendung von Polyphosphaten mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten als Arzneimittel.

2. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Polyphosphaten mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten.

3. Verwendung von Polyphosphaten mit einer Kettenlänge von größer als 3 Phosphateinheiten zur antiviralen und/oder immuntherapeutischen Behandlung von AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom) bzw. ARC (AIDS-related Complex).