DE4313975A1 - Immunisierungsmittel und Affinitätschromatographie-Trägermaterial - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Konjugat aus einem Po­ lymerträger mit einem Antigen zur Immunisierung des menschli­ chen oder tierischen Körpers, zur Gewinnung menschlicher oder tierischer Antikörper oder zur Behandlung benigner oder malig­ ner Tumore. Die Erfindung betrifft ferner ein Affinitäts­ chromatographie-Trägermaterial, welches ein Konjugat aus einem Polymerträger mit einem Biomolekül enthält.

Die Bildung biochemischer Komplexe wird in weiten Bereichen der Technik angewandt, reichend von der chemischen bzw. bio­ chemischen Analytik über die Gewinnung und die Reinigung von Biomolekülen bis hin zur Behandlung von Krankheiten durch Mit­ tel, die eine Bildung eines biochemischen Komplexes hervorru­ fen. Als solche biochemischen Komplexe sind beispielsweise zu nennen die Komplexe zwischen Antikörper und Antigen, zwischen Enzym und Substrat, zwischen Nucleotidsequenz (DNA oder RNA) und komplementärer Nucleotidsequenz, zwischen Lektin und Koh­ lenhydrat, zwischen Rezeptor und Hormon sowie anderen Rezep­ tor-Ligand-Komplexen. Bei dieser Komplexbildung wird die au­ ßerordentlich spezifische Affinität mindestens eines Partners des Komplexes mit einem oder mehreren anderen Komplexpartnern zur Komplexbildung ausgenutzt, d. h. die Fähigkeit, sich gegen­ seitig zu erkennen und miteinander in Wechselwirkung zu tre­ ten.

Als eine Technik in der chemischen bzw. biochemischen Analytik und in der Gewinnung und Reinigung von Biomolekülen, wobei die genannte biospezifische Affinität zwischen passenden Komponen­ ten eines biochemischen Komplexes ausgenutzt wird, hat insbe­ sondere die Affinitätschromatographie große Bedeutung erlangt. Eine umfassende Beschreibung dieser Affinitätschromatographie­ technik wird in folgenden Übersichtsartikeln und -büchern ge­ geben: Trends in Biochemical Sciences, Bd. 9, Seite 44 bis 48 (1984); "Analytical Biochemistry", Bd. 124, Seiten 372 bis 379 (1982); "Affinity Chromatography", Upsala: Pharmacia 1974; Chaiken: "Analytic Affinity Chromatography", Boca Raton CRC Press 1988; Cooper: "Biochemische Arbeitsmethoden", Seiten 122 bis 241, Berlin: de Gruyter 1981; Dean et al.: "Affinity Chromatography - A Practical Approach", Oxford: IRL Press, 1985; Kirk Othmar (3.) Bd. 6, Seiten 35 bis 54.

Für die Durchführung der Affinitätschromatographie ist es not­ wendig, einen der Komplexpartner auf einem festen Träger zu immobilisieren, um somit ein Affinitätssorbens als stationäre Phase für das Trennverfahren bereitzustellen. Hierfür wurde insbesondere der Weg über eine kovalente Bindung des Komplexpartners an Trägermaterialien wie Dextran, Poly­ acrylamide oder Agarose gewählt. Mit Bromcyan aktivierte Aga­ rose (Sepharose™) reagiert insbesondere mit primären Amino­ gruppen, die sehr häufig in Biopolymeren vorkommen, unter Aus­ bildung kovalenter Bindungen. Andere aktivierte Träger enthal­ ten Thiol- oder Epoxygruppen. Kleine Liganden werden häufig über Brückenglieder, den sogenannten Spacern, die Kohlenwas­ serstoff-Ketten mit 6 bis 8 Kohlenstoffatomen aufweisen, z. B. 1,6-Diaminohexan oder 6-Aminohexansäure, an die Trägermatrix gekoppelt.

Diese Affinitätschromatographie-Trägermaterialien sind somit relativ aufwendig herzustellen. Ferner kann der Nachteil auf­ treten, daß das an das Trägermaterial gebundene Biomolekül durch die kovalente Modifizierung für die Bindung an den Kom­ plexpartner inaktiviert wird. Nicht-kovalente Bindungen von Biomolekülen an Trägermaterialien haben sich bisher in der Praxis nicht bewährt, was möglicherweise auf die schwache nicht-kovalente Bindung dieser Biomoleküle an das Trägermate­ rial zurückzuführen ist. Das Bereitstellen eines Affinitäts­ chromatographie-Trägermaterials, das auch eine nicht-kovalente Bindung zur Durchführung des Trennverfahrens zuläßt, wäre jedoch sehr wünschenswert.

Eine spezielle biochemische Komplexbildung, nämlich die zwi­ schen Antikörper und Antigen, kann für die Immunisierung von Organismen wie des menschlichen oder des tierischen Körpers angewandt werden. Die Bildung von spezifischen Antikörpern stellt die Hauptwirkung des Immunsystems von Mensch und Tier als Antwort auf die Aussetzung gegenüber einem Antigen dar. Dabei werden Antigene durch immunkompetente Zellen erkannt, gebunden und anschließend Antikörper-produzierenden Zellen präsentiert. Die Antikörper-produzierenden Zellen proliferie­ ren dann und sekregieren entsprechende Immunglobuline. Die da­ bei ablaufenden zellulären und molekularen Mechanismen sind gut bekannt. Diese Fähigkeit der Immunantwort ist die Basis für die Immunisierung von Mensch und Tier gegen Krankheiten oder Toxine.

Antikörper für die industrielle Anwendung, klinische Diagnose oder für die Forschung werden in großem Maße hergestellt durch Immunisierung von Tieren gegen bestimmte Antigene. Die diesen Antigenen gegenüber spezifischen Antikörper werden biochemisch aus dem Plasma des immunisierten Tieres extrahiert, beispiels­ weise mit Hilfe eines oben beschriebenen Affinitätschromato­ graphie-Trennverfahrens.

Viele Substanzen, die von großem Interesse sind, werden jedoch von dem Immunsystem des Menschen oder von Tieren nicht er­ kannt, da sie per se nicht antigen sind. Der menschliche oder tierische Körper toleriert die Substanz ohne Immunantwort. Um Antikörper gegen solche Substanzen zu erhalten, ist es erfor­ derlich, diese Substanz chemisch mit einem hochimmunogenen Mo­ lekül, beispielsweise Rinderserumalbumin oder Thyroglobulin, zu binden, um sogenannte Haptene zu erhalten. Durch Kopplung der entsprechenden Substanzen an die als Carrier wirkenden Proteine erwerben die Haptene die Immunogenität von Voll-Anti­ genen und können das Immunsystem des betreffenden Organismus zur Antikörper-Produktion anregen. In vielen Fallen reicht je­ doch die Haptenbildung nicht aus, um eine Immunantwort hervor­ zurufen, und es ist notwendig, die Immunisierung mit starken Stimulantien, den sogenannten Adjuvantien, wie Aluminiumhydro­ xid, Calciumphosphat-Gel oder dem Freund′schen Adjuvans, zu kombinieren.

Die Immunisierung wird üblicherweise durchgeführt, indem das Antigen bzw. das Hapten, ggf. mit entsprechenden Adjuvantien, intradermal oder intramuskulär injiziert wird. Dies führt zu einer mehr oder weniger stark ausgeprägten lokalen Entzündung. Der große Nachteil der sich durch die Immunisierung bildenden polyklonalen Antikörper liegt darin, daß sie neben den Anti­ körpern gegen das gewünschte Antigen auch Antikörper gegen das antigene Molekül bildet, an das das gewünschte Antigen zur Haptenbildung gebunden wurde. D.h., solche Antisera sind poly­ valent, indem sie verschiedene Antigenbereiche des Haptens er­ kennen. Für viele klinische Anwendungen ist es jedoch er­ wünscht, den menschlichen Körper gegen primär nicht-antigene Substanzen zu immunisieren. Der Weg zur Immunisierung von Men­ schen unter Verwendung von Haptenen oder Adjuvantien wie dem Freund′schen Adjuvants ist nicht gangbar, da unkontrollier­ bare, ungünstige oder gar fatale Reaktionen (anaphylaktische Schocks) hervorgerufen werden.

Auch in der Krebstherapie spielt die Immunisierung des Patien­ ten eine immer größere Rolle, speziell die Immunisierung gegen Tumorantigene. Die jüngsten Entwicklungen besitzen ihren Schwerpunkt in der Applikation von monoklonalen Antikörpern in therapeutischen Arzneimitteln. Eine direkte und aktive Immuni­ sierung des Patienten war aus den oben genannten Gründen bis­ her nicht praktikabel. Monoklonale Antikörper gegen Tumoranti­ gene müssen in hohen Konzentrationen angewandt werden, was diese Behandlungsmethode sehr teuer macht. Ferner bilden die immunologischen Reaktionen des Patienten gegen den monoklona­ len Antikörper ein Haupthindernis für diesen Behandlungsan­ satz.

Es wurde vorgeschlagen, zur Immunisierung von Tieren Antigene auf einem festen Träger zu immobilisieren und in den tie­ rischen Körper zu implantieren, um eine Immunantwort hervorzu­ rufen. Für diese Ansätze wurden Filterpapier oder Nitrocellu­ lose als feste Trägermaterialien vorgeschlagen, wie beispiels­ weise von Viamontes et al. in "Journal of Immunological Me­ thods", Bd. 94, Seiten 13 bis 17 (1986). Der Nachteil dieser Ansätze besteht darin, daß die Trägermaterialien, welche die Antigene tragen, von Natur aus hydrophil sind. Aus diesem Grund führen die bekannten Immunisierungs-Trägermaterialien leicht zu einer Störung der Immunantwort, insbesondere können sie die Ursache für toxische Reaktionen oder für Entzündungen sein. Ferner sind die Antigene in den bekannten Trägerkonjuga­ ten innerhalb dieser hydrophilen Träger eingebettet, so daß die Antigene schlecht erreichbar sind und demnach die Immunre­ aktion wenig effizient ausfällt.

Diese Probleme und Nachteile des Stands der Technik, in denen die Bildung biochemischer Komplexe, insbesondere die Antikör­ per-Antigen-Wechselwirkung zur Immunisierung, Anwendung fin­ det, gilt es mit der vorliegenden Erfindung zu vermeiden.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Konjugat aus einem Trägerma­ terial mit einem Biomolekül, insbesondere mit einem Antigen, zur Verfügung zu stellen, welches es ermöglicht, daß das Bio­ molekül gut mit einem zu dem Biomolekül affinen Material in Wechselwirkung treten kann, um einen biochemischen Komplex zu bilden, und welches es bei einem Konjugat des Trägers mit ei­ nem Antigen ermöglicht, eine für Anwendungszwecke ausreichende Immunantwort des menschlichen oder tierischen Körpers hervor­ zurufen.

Die Aufgabe wird mit einem Konjugat aus einem Polymerträger mit einem Antigen gelöst, welches gebildet ist durch Bindung des Antigens an die Oberfläche eines durch Erhöhung des Ober­ flächeninhalts aktivierten Kunststoffträgers. Dieses Konjugat eignet sich auf hervorragende Weise zur Immunisierung des men­ schlichen oder tierischen Körpers, insbesondere zur Behandlung gegen Infektionen eines Pathogens, zur Immunisierung gegen To­ xine, zur Behandlung benigner oder maligner Tumore und zur Ge­ winnung menschlicher oder tierischer Antikörper.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht in einem Affinitätschromatographie-Trägermaterials, welches ein Konjugat aus einem Polymerträger mit einem Biomolekül enthält, wobei das Konjugat gebildet ist durch Bindung des Biomoleküls an die Oberfläche eines durch Erhöhung des Oberflächeninhalts aktivierten Kunststoffträgers.

Die vorteilhaften Wirkungen der vorliegenden Erfindung beruht wesentlich auf der Bildung des Konjugats aufgrund der Bindung des Antigens bzw. Biomoleküls an die Oberfläche eines speziell aktivierten Kunststoffträgers. Aktivierung bedeutet, daß der Oberflächeninhalt des Kunststoffträgers erhöht worden ist, oder mit anderen Worten, daß die tatsächliche Oberfläche bzw. Ist-Oberfläche gegenüber der die Mantelfläche (die Einhüllende des Oberflächenprofils) des Kunststoffträgers vergrößert wurde. Dies kann durch mechanische oder chemische Mittel be­ wirkt werden. Ausführliche Erläuterungen zu der Art des zu verwendenden Kunststoffträgers sowie zu dessen Aktivierung werden in den anhängigen PCT-Anmeldungen des Anmelders PCT/EP92/02256 (Anmeldetag: 8. Oktober 1992) und PCT/EP92/02432 (Anmeldetag: 23. Oktober 1992) gegeben, deren Beschreibungen als Teil der Offenbarung vorliegender Anmeldung gelten.

Der verwendete Kunststoffträger besteht vorzugsweise aus einem hydrophoben Grundmaterial. Weiter bevorzugt ist dieses hydro­ phobe Grundmaterial ein Copolymer oder ein Polymerblend. Ein solches Material kann besonders leicht wie gewünscht aktiviert werden, insbesondere durch chemische Mittel. Als Copolymere oder Polymerblends können solche verwendet werden, die in den oben genannten PCT-Anmeldungen Nr. EP92/02256 und Nr. EP92/02432 genannt sind, insbesondere Copolymere von Styrol und Butadien oder Styrol und Chloropren oder Polymerblends von Polystyrol und Polybutadien oder Polystyrol und Polychloro­ pren.

Das Grundmaterial kann ggf. noch weitere, für Kunststoffträger übliche Zusätze enthalten, wie Farbstoffe, Prozessierhilfsmit­ tel, Stabilisatoren, Vernetzungsmittel, Weichmacher, Füll­ stoffe und dergleichen. Das Grundmaterial kann insbesondere Substanzen enthalten, die dazu dienen, daß das Trägerkonjugat im menschlichen oder tierischen Körper durch Ultraschall leicht beobachtet werden kann.

Der Kunststoffträger kann auf herkömmliche Weise geformt wer­ den, z. B. durch Spritzgießen, durch Extrusion, durch Granulie­ ren oder dergleichen. Der Kunststoffträger sollte nach der Formung keine oder im wesentlichen keine Porosität aufweisen.

Die gewünschte Aktivierung kann durchgeführt werden, indem das Grundmaterial für den Kunststoffträger mit einem Lösungsmittel behandelt wird. Zu diesem Zweck eignen sich beispielsweise Lö­ sungsmittel wie Ether, z. B. Diethylether, Ester, Alkohole, Ke­ tone, Aldehyde, Säuren, Basen, ungesättigte oder aliphatische (lineare, verzweigte oder cyclische) Kohlenwasserstoffe, aro­ matische Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe und ähnliche Materialien. Vorzugsweise wird dabei für das Grundmaterial ein Copolymer oder ein Polymerblend verwendet, wobei eine Polymerkomponente des Copolymers oder des Po­ lymerblends sich in einem geeigneten Lösungsmittel leichter löst als die andere bzw. die anderen Polykomponente(n) des Co­ polymers bzw. Polymerblends. Im Resultat ist die mit dem Lö­ sungsmittel behandelte Oberfläche des Kunststoffträgers in ih­ rer tatsächlichen Oberfläche bzw. Ist-Oberfläche erhöht und weist eine Mikroporenstruktur auf.

Alternativ dazu können auch mechanische Mittel zur Aktivierung herangezogen werden.

Der Kunststoffträger des erfindungsgemäßen Konjugats mit einem Antigen bzw. einem Biomolekül kann geeigneterweise in Form von Partikeln, Granulaten, Pellets, Streifen, Stäbchen, Fasern oder Plättchen vorliegen. Besonders gut geeignet sind im we­ sentlichen sphärische Partikel. Solche sphärische Partikel können einen Durchmesser in einem sehr weiten Bereich aufwei­ sen, beispielsweise vom Nanometerbereich bis hin zum Zentime­ terbereich. Bevorzugt liegt der Durchmesser der sphärischen Partikel im Bereich von 0,1 µm bis 1 cm.

Ggf. kann es auch erwünscht sein, daß nur ein Teil der Ober­ fläche des Kunststoffträgers aktiviert ist.

Die Konjugatbildung erfolgt auf einfache Weise durch Bindung des Antigens bzw. des Biomoleküls an die Oberfläche des Kunst­ stoffträgers. Dies kann bequemerweise durch Inkubation des Kunststoffträgers in der entsprechend gewünschten Gestalt in einer wäßrigen Lösung des Antigens bzw. des Biomoleküls erfol­ gen. Die Oberfläche des aktivierten Kunststoffträgers wird vorzugsweise vollständig mit dem Antigen bzw. Biomolekül überzogen oder gecoated, um die Bindungsstellen des Kunst­ stoffträgers abzusättigen. Falls nicht alle Bindungsstellen des Kunststoffträgers mit dem Antigen bzw. Biomolekül abgesät­ tigt sind, können die restlichen Bindungsstellen geblockt wer­ den, beispielsweise mit einem geeigneten Protein wie Rinderse­ rumalbumin.

Das Antigen bzw. das Biomolekül bindet besonders stark auf nicht-kovalente Weise an den aktivierten Kunststoffträger. D.h., eine kovalente Verknüpfung wird vermieden. Darüber hin­ aus ist das Antigen bzw. Biomolekül in dem gebildeten Konjugat in einem Zustand, in dem es sehr gut mit dem korrespondieren­ den Komplexpartner in Wechselwirkung treten kann, wie mit dem entsprechenden Antikörper oder anderen Komplexpartnern, wie sie zur Bildung der bereits genannten biochemischen Komplexe führen. Insbesondere wurde im Rahmen der Erfindung festge­ stellt, daß das erfindungsgemäße Konjugat des Kunststoffträ­ gers mit einem Antigen eine starke Immunantwort im biologi­ schen Organismus hervorruft. Dies dürfte darauf zurückzuführen sein, daß das Konjugat mit dem Antigen auf der Oberfläche des Trägers eine für die Immunantwort sehr günstige Präsentation für immunkompetente Zellen bildet.

Demnach ist das erfindungsgemäße Konjugat des aktivierten Kunststoffträgers mit einem Antigen zur Immunisierung des men­ schlichen oder tierischen Körpers hevorragend geeignet.

Wenn hydrophobe Trägermaterialien verwendet werden, sind diese inert und stabil. Ferner werden die Antigene auf der äußeren Oberfläche des Kunststoffträgers präsentiert. Dies führt bei der Immunisierung des menschlichen oder tierischen Körpers zu weniger ungünstigen Nebenreaktionen, wie sie für die eingangs genannten hydrophilen, porösen Trägermaterialien bekannt sind.

Für die Applikation des erfindungsgemäßen Konjugats zur Immu­ nisierung wird das Konjugat vorzugsweise in den menschlichen oder tierischen Körper implantiert, insbesondere subkutan, in­ traperitoneal, in die Milzkapsel, in einem Lymphknoten oder an einem ähnlich geeigneten Ort des Organismus. Solche Implantate können leicht überwacht und beobachtet werden, z. B. in einem Sonogramm eines Ultraschallgerätes. Ferner können sie, falls erforderlich oder gewünscht, entfernt werden, was mit bisher bekannten Immunisierungstechniken nicht möglich war. Der er­ findungsgemäße Immunisierungsansatz gewährleistet ferner ein direktes Aussetzen von lokal sehr hoch konzentriertem Antigen gegenüber immunkompetentem Gewebe. Da nur eine geringe oder überhaupt keine Diffusion des Antigens stattfindet, ist eine Degradation des Antigens im Organismus minimiert. Darüber hin­ aus wird die Immunantwort weiter stimuliert und optimiert, da Makrophagen lokal infiltrieren können und somit die Immunant­ wort unterstützen und nicht zuletzt sind die durch die Immuni­ sierung gebildeten Antikörper spezifischer, da das Antigen nicht haptenisiert oder auf andere Weise chemisch modifiziert ist, und Adjuvantien, wie das Freund′sche Adjuvants für die Immunisierung nicht erforderlich ist.

Das beschriebene, erfindungsgemäße Konjugat ist besonders gut geeignet zur Immunisierung gegen Toxine. Die besonders starke Bindung des Toxin-Antigens an den Kunststoffträger führt dazu, daß die toxischen Substanzen nicht schädlich wirken können, da sie fest an dem aktivierten Kunststoffträger anhaften.

Eine weitere, sehr gute Anwendungsmöglichkeit für das erfin­ dungsgemäße Konjugat liegt in der Immunisierung gegen Patho­ gene, beispielsweise Viren, Bakterien, Würmer, Parasiten und andere infektiöse Agentien.

Das erfindungsgemäße Konjugat eignet sich ferner besonders gut in der Krebstherapie zur Behandlung benigner oder maligner Tu­ more. Bei diesem Ansatz werden entsprechende Tumorantigene an den aktivierten Kunststoffträger zur Konjugatbildung gebunden, und der menschliche oder tierische Körper wird wie oben be­ schrieben mit diesem Konjugat behandelt, insbesondere durch Implantierung, wie bereits erläutert. Diese Maßnahme ruft eine Immunantwort gegen benigne oder maligne Tumorzellen hervor, was schließlich eine Abtötung der jeweiligen Tumorzellen be­ wirkt.

Eine weitere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung des erfindungsgemäßen Konjugats zur Gewin­ nung menschlicher oder tierischer Antikörper, welche wiederum in weiteren Anwendungsmöglichkeiten genutzt werden können, beispielsweise zur Therapie, zur Diagnostik oder zu For­ schungszwecken. Hierzu wird der jeweilige gewünschte Orga­ nismus wiederum mit dem Konjugat aus dem aktivierten Kunst­ stoffträger mit dem jeweiligen, gewünschten Antigen behandelt, und die spezifischen Antikörper werden auf herkömmliche Weise aus dem Blutplasma gewonnen.

Eine weitere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Affinitätschromatographie-Träger­ materials, welches ein Konjugat aus dem oben beschriebenen, aktivierten Kunststoffträger mit einem beliebigen Biomolekül enthält. Das auf dem Kunststoffträger adsorbierte Biomolekül stellt eine Komponente des biochemischen Komplexes dar, wie sie oben genannt sind, wodurch der oder die weitere(n) Bin­ dungspartner des Komplexes mit dem Affinitätschromatographie- Trägermaterial analysiert, isoliert, gereinigt oder gewonnen werden kann. Hierzu kann nach einem der herkömmlichen Verfah­ ren zur Durchführung der Affinitätschromatographie, wie sie in den eingangs genannten Literaturstellen beschrieben sind, ver­ fahren werden. Dabei kann es gelegentlich erwünscht sein, insbesondere dann, wenn nicht alle Bindungsstellen des Kunststoffträgers mit dem adsorbierten Biomolekül gesättigt sind, zu der flüssigen Phase ein Detergenz, insbesondere ein nichtionisches Detergenz wie Tween 20 (Polyoxyethylen-Sor­ bitanmonolaurat), Tween 80 (Polyoxyethylen-Sorbitanmonooleat), Triton (Alkyl-Polyether-Alkohol-Gemische), Brÿ 35 (Polyoxyethylenlaurylether), Nonidet P-40 (Polyoxyethylen- Octylphenol-Ether), Lubrol PX (Polyethylenoxid-Alkylether- Adukt), Berol EMO 043 (C-16, C-18-Fettalkohol mit 10 Oxyethy­ leneinheiten), Triton X-100 und dergleichen. Die in diesem Fall zu verwendende Konzentration des Detergenz kann auf den jeweiligen Bedarfsfall angepaßt werden, beispielsweise in einem Bereich von 0,01% bis 2%, insbesondere 0,05% bis 1%.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand von Beispie­ len näher erläutert.

Beispiel 1 Immunisierung eines Kaninchens gegen das Peptid Neurophysin

Antikörper gegen Neurophysin sind beispielsweise für diagno­ stische Anwendungen und Forschungszwecke sehr nützlich. Neuro­ physin ist ein Neurohypophysiales Peptid, welches vom Organis­ mus normalerweise nicht als Antigen erkannt wird. Es findet also keine oder keine erkennbare Immunantwort statt.

100 µg Neurophysin wurde in 1 ml steriler, 0,9%iger Salzlö­ sung aufgelöst. Davon getrennt wurden Pellets eines aus Poly­ styrol und Polychloropren bestehenden Polymerblends mit 4 mm Durchmesser durch Behandlung mit Aceton für 1 Minute bei Raum­ temperatur aktiviert. Die aktivierten Pellets wurden mit ste­ rilem Wasser gewaschen. Die so behandelten Pellets wurden dann in die Neurophysinlösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur ein­ getaucht. Danach wurden die Pellets mit steriler, isotoner Salzlösung gewaschen und in dieser Lösung bei 4°C aufbewahrt.

Diese Antigen-Kunststoffträger-Konjugate in Form von Pellets wurden in die Milzkapsel von jungen, ausgewachsenen Kaninchen implantiert.

In zeitlichen Abständen nach der Implantation wurde Blut aus den Ohrvenen entnommen, und der Immunoglobulingehalt wurde durch bekannte standardisierte Immundiffusions- und Immunpreziptationstechniken bestimmt.

Nach einer Woche wies das Blut einen spezifischen Immunoglobulintiter von 1 : 1000 und nach 3 Wochen einen Titer von 1 : 5000 auf. Dieser hohe Titer blieb bis zum Ende der Beobachtungszeit von 3 Monaten konstant.

Beispiel 2 Immunisierung und Gewinnung von Antikörpern gegen Bromdesoxyuridin (BrdU)

Bromdesoxyuridin (BrdU) ist als Markierungssubstanz zur Detek­ tion und Charakterisierung in Nucleinsäure-Sonden-Assays weit verbreitet. Bisher wurden lediglich monoklonale Antikörper ge­ gen BrdU bereitgestellt. Monoklonale Antikörper haben jedoch den Nachteil, daß sie nicht-präzipitierend sind, so daß sie für viele immunochemische Nachweistechniken ungeeignet sind, beispielsweise zur nicht radioaktiven Sequentierung von DNA. Daneben ist BrdU cytotoxisch und hat in hohen Dosen, die nach herkömmlichen Ansätzen zur Immunisierung notwendig wären, einen sehr negativen Einfluß auf das Immunsystem. BrdU ist ferner mutagen. Daher kann BrdU nicht für eine direkte in vivo-Immunisierung verwendet werden.

Polystyrolstäbchen mit 2 mm Durchmesser und 10 mm Länge wurden durch Behandlung mit Xylol während 30 s aktiviert. Dann wurde der Kunststoffträger in isotonischer Salzlösung gewaschen. 1 mg BrdU-Triphosphat wurde in 1 ml isotonischer Salzlösung ge­ löst, und die aktivierten Stäbchen wurden mit dieser Lösung für 1 Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Stäbchen gewa­ schen. Dann wurde das Stäbchenkonjugat in junge, ausgewachsene Mäuse implantiert, und zwar in den peritonealen Hohlraum. Nach einer Woche wurde Blut aus der Schwanzvene gesammelt, und der Immunglobulingehalt wurde durch bekannte Immunodiffusions- und Immunoprezipitationstechniken bestimmt.

Der spezifische Immunglobulintiter betrug nach einer Woche 1 : 2000 und blieb bis zum Ende der Beobachtungszeit von 3 Monaten auf diesem hohen Niveau.

Beispiel 3 Gewinnung von Antikörpern gegen Virusantigen durch Immunisierung von Hühnern

Zur Gewinnung von Antikörpern gegen das HIV-Antigen T24 wurde mit einem entsprechenden Immunisierungskonjugat ein Huhn immu­ nisiert, um über deren gelegte Eier spezifische Antikörper aus den Eidottern isolieren zu können.

Zunächst wurden Pellets eines aus Polystyrol und Polychloro­ pren bestehenden Polymerblends mit 4 bis 5 mm Durchmesser durch Behandlung mit Aceton für 1 Minute bei Raumtemperatur aktiviert. Die aktivierten Pellets wurden mit sterilem Wasser gewaschen. 100 µg T24-Antigen wurden in 1 ml steriler, 0,9%iger Salzlösung aufgelöst. Die aktivierten Trägerpellets wurden zur Bindung des Antigens für 5 Minuten bei Raumtempera­ tur mit der T24-Lösung inkubiert. Danach wurden die Pellets mit steriler, isotoner Salzlösung gewaschen.

Dieses Immunisierungskonjugat wurde in den intraperitonealen Hohlraum eines Huhns implantiert. Nach erfolgter Implantation wurde die Bildung von Antikörpern gegen T24-Antigen im Dotter von gelegten Eiern beobachtet. 4 Wochen nach Implantation zeigte sich bereits ein Antikörpergehalt im Dotter von 1 : 800. Die so gebildeten Antikörper konnten nach herkömmlichen Metho­ den aus den Eidottern gewonnen werden.

Claims (18)

1. Konjugat aus einem Polymerträger mit einem Antigen zur Immunisierung des menschlichen oder tierischen Körpers, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat gebildet ist durch Bindung des Antigens an die Oberfläche eines durch Erhöhung des Oberflächeninhalts aktivierten Kunststoffträgers.

2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoffträger aus einem hydrophoben Grundmaterial besteht.

3. Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophobe Grundmaterial ein Copolyiner oder Polymerblend ist.

4. Konjugat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Grundmaterial ein Copolymer von Styrol und Butadien oder von Styrol und Chloropren oder ein Polymerblend von Polystyrol und Polybutadien oder von Polystyrol und Polychloropren ist.

5. Konjugat nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Erhöhung des Oberflächeninhalts durch Behandlung des Kunststoffträgers mit einem Lösungsmittel bewirkt ist.

6. Konjugat nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoffträger die Form von im wesentlichen sphärischen Partikeln, von Granulaten, von Pellets, von Streifen, von Stäbchen, von Fasern oder von Plättchen aufweist.

7. Konjugat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoffträger die Form von im wesentlichen sphärischen Partikeln mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von 0,1 µm bis 1 cm aufweist.

8. Konjugat nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Immunisierung gegen Toxine.

9. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Immunisierung gegen Pathogene.

10. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Behandlung benigner oder maligner Tumore.

11. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Gewinnung menschlicher oder tierischer Antikörper.

12. Affinitätschromatographie-Trägermaterial, enthaltend ein Konjugat aus einem Polymerträger mit einem Biomolekül, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat gebildet ist durch Bindung des Biomoleküls an die Oberfläche eines durch Erhöhung des Oberflächeninhalts aktivierten Kunststoffträgers.

13. Affinitätschromatographie-Trägermaterial nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoffträger aus einem hydrophoben Grundmaterial besteht.

14. Affinitätschromatographie-Trägermaterial nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophobe Grundmaterial ein Copolymer oder Polymerblend ist.

15. Affinitätschromatographie-Trägermaterial nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Grundmaterial ein Copolymer von Styrol und Butadien oder von Styrol und Chloropren oder ein Polymerblend von Polystyrol und Polybutadien oder von Polystyrol und Polychloropren ist.

16. Affinitätschromatographie-Trägermaterial nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Erhöhung des Oberflächeninhalts durch Behandlung des Kunststoffträgers mit einem Lösungsmittel bewirkt ist.

17. Affinitätschromatographie-Trägermaterial nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoffträger die Form von im wesentlichen sphärischen Partikeln, von Granulaten, von Pellets, von Streifen, von Stäbchen, von Fasern oder von Plättchen aufweist.

18. Affinitätschromatographie-Trägermaterial nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoffträger die Form von im wesentlichen sphärischen Partikeln mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von 0,1 µm bis 1 cm aufweist.