DE4224509A1 - Wirkstoff zur Hemmung der Proliferationsrate von Leberzellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Wirkstoff zur Hemmung der Proliferationsrate von Leberzellen.

Die Rate der Leberzellproliferation ist in erwachsenen Säugetieren normalerweise sehr niedrig. Wird jedoch bei jungen Versuchstieren ein Teil der Leber entfernt (Teilhepatektomie), steigt die Proliferationsrate sprunghaft auf das Zehn- bis Zwanzigfache an, um nach Erreichen der ursprünglichen Zellzahl (d. h. nach sechs bis acht Tagen) wieder auf den Normalwert abzufallen. Dieser Verlauf der Leberregeneration (Hepatopoese) ist bereits häufig untersucht worden.

Die Erforschung der molekularen Mechanismen dieses Regelkreises führte zur Identifizierung einer ganzen Reihe wachstumsfördernder und -hemmender Faktoren (vgl. die Zusammenfassung in: MICHALOPOULOS, G.K., "Liver Regeneration: Molecular Mechanisms of Growth Control"; FASEB J.4 (1990), S. 176-187). Ein solcher wachstumsfördernder Faktor, der in den siebziger Jahren isoliert wurde, ist das Hormon Hepatopoetin (vgl. die DE-PS 28 14 981, 29 14 903, 30 37 600).

In der Folge zeigte es sich, daß das Hepatopoetin auch im Ascites des Rattenlebertumors YOSHIDA AH 130 enthalten ist (S. VOGL et al., J. Hepatol. 11, Suppl. 2 (1990), S. 118). Danach hat es den Anschein, daß dieser Leberzelltumor sein eigenes Proliferationshormon dauernd erzeugt. Andere Versuche ergaben, daß die Injektion eines hepatopoetinhaltigen Extrakts in Mäuse, deren Leberzellen durch Galaktosamin geschädigt waren, zu einer zusätzlichen Schädigung führt, so daß die Dosis Letalis 50 des Galaktosamins vermindert ist. Offensichtlich wird eine vorhandene Leberschädigung durch eine Leberzellproliferation noch vergrößert.

Man hat ferner festgestellt, daß ein dem Hepatopoetin sehr ähnlicher Faktor aus dem Blutplasma von Patienten, die an Leberkrebs oder chronischer Hepatitis leiden, nachgewiesen werden kann (TOPIC, E. et al., Fresenius J. of Anal. Chemistry, in Druck). Das deckt sich mit der Tatsache, daß Leberkrebs offenbar in engem Zusammenhang mit Hepatitis und Leberzirrhose steht (Okuda, K., Hepatol. 15 (1992), S. 948-963).

Es ist auch bekannt, daß sich menschliche Hepatozyten in Gewebekultur sehr ähnlich wie tierische Zellen verhalten (vgl. ISMAIL, T. et al., J.Biol. Chem. 14 (1991), S. 1076-1082).

Die Suche nach einem Hemmstoff, der an dem oben beschriebenen Hepatopoese-Regelkreis beteiligt ist, führte zur Isolierung des Tetrapeptids N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro (N-Ac-SDKP; LOMBARD, M.-N. et al., Cell Tissue Kinet. 23 (1990), S. 99-103). Die Hemmwirkung wurde jedoch nur bei teilhepatektomierten erwachsenen Ratten und bei Jungtieren nachgewiesen (a.a.O.).

Es ist bekannt (THIERRY, J. et al., J. Med. Chem. 33 (1990), S. 2122-2127), daß das Tripeptid Ser-Asp-Lys (entsprechend SDK in der nachfolgend benutzten Nomenklatur, vgl. z. B. KARLSON, "Kurzes Kehrbuch der Biochemie", Georg Thieme Verlag Stuttgart, 12. Aufl. 1984, S. 23) die Rosettenbildung aufgrund einer Wechselwirkung von menschlichen T-Zellen (weiße Blutkörperchen) und Schaferythrozyten verhindert. Hinweise auf eine andere Wirksamkeit des SDK gibt es jedoch nicht.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Wirkstoff zur Hemmung der Proliferationsrate von Leberzellen zu schaffen. Er soll sowohl die Hepatopoese nach einer Teilhepatektomie als auch das Wachstum von Leberzelltumoren hemmen.

Die Lösung der Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Wirkstoffs in Form des freien Tripeptids Ser-Asp-Lys (SDK) oder eines Salzes desselben, insbesondere mit einem Äquivalent einer salzbildenden Säure, wie Essigsäure, Zitronensäure oder einer anorganischen Säure.

Das Tripeptid kann sowohl in seiner freien Form als sog. Zwitterion (die COOH-Gruppe wirkt als Säure, die NH₃-Gruppe als Base) als auch in kristalliner Form als Salz der Essigsäure, Zitronensäure oder einer anorganischen Säure dargestellt und eingesetzt werden. Ein besonders gut kristallisierendes Salz ist leichter auf zureinigen und zu lösen.

Das Tripeptid SDK zeigt, anders als das Tetrapeptid SDKP, überraschenderweise schon bei geringen Konzentrationen eine stark proliferationshemmende Wirkung. Es entfaltet diese Wirkung nicht nur im Tierversuch an teilhepatektomierten Ratten, sondern auch an YOSHIDA-Lebertumorzellen. Das bedeutet, daß Lebertumorzellen, soweit sie autokrin Hepatopoetin erzeugen, durch das Tripetid SDK in ihrer Proliferation sehr stark gehemmt werden. In Gewebekulturen menschlicher Hepatomzellen konnte eine signifikante proliferationshemmende Wirkung nachgewiesen werden. Der mögliche Zusammenhang zwischen Leberkrebs, Hepatitis und Leberzirrhose stützt außerdem die These, daß bei all diesen Krankheiten das Tripetid SDK wirksam sein könnte.

Im folgenden werden die Versuche, die zu den genannten Ergebnissen führten, unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher beschrieben. Es stellen dar:

Fig. 1 die Wirkung des bekannten Tetrapeptids SDKP;

Fig. 2 die Wirkung des Tripeptids gemäß der Erfindung.

1. Einfluß des bekannten Tetrapeptids SDKP auf die Proliferationsrate von Leberzellen in teilhepatektomierten Ratten

Für die Versuche wurden weibliche, 100 g schwere Wistar-Ratten verwendet, die aus dem SPF-Bereich des Tierhauses des MPI für Biochemie in W-8033 Martinsried bezogen wurden.

Sieben Gruppen von Ratten wurden einer 66%igen Teilhepatektomie unterzogen. Je Versuchsgruppe wurden 4 Tiere verwendet. Die Ratten wurden in leichter Abänderung der Methode von Higgins und Anderson (Higgins, G.M., Anderson, R.M., Archives of Pathology 12 (1931), S. 186-202) zwischen 13.00 und 13.30 Uhr teilhepatektomiert. Je drei Gruppen wurde das in 1 ml 0,9% NaCl gelöste, auf übliche Weise synthetisierte Tetrapeptid SDKP sofort nach der Operation bzw. 10 Stunden nach der Operation in verschiedenen Mengen (500 µg, 8 µg, 1 µg) intraperitoneal (i.p.) injiziert. Die siebte Gruppe diente als Kontrollgruppe und erhielt nur das Lösungsmittel. Nach 19 Stunden (ab 8.00 Uhr des nächsten Tages) wurde den Ratten i.p. 50 µl 6-³H-Thymidin (1,85 MBq) i.p. appliziert. Exakt eine Stunde später wurden die Tiere mittels Diethylether (Äther) getötet und die Restleber in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lebern wurden bis zur Bestimmung der spezifischen Radioaktivität der DNA der Leberzellkerne bei -20°C aufbewahrt.

Diese spezifische Radioaktivität diente als Marker für das Proliferationsverhalten der Leberzellen: Thymidin wird nur in DNA eingebaut (und nicht z. B. in RNA), und eine signifikante DNA-Synthese findet nur während der Zellproliferation statt. Die spezifische Radioaktivität der DNA (in dpm/µg DNA) ist der Quotient aus dem Ergebnis der Radioaktivitätsmessung einer Probe (in dpm, d. h. Zerfälle pro Minute) und dem DNA-Gehalt dieser Probe (in µg) Die proliferationsfördernde bzw. proliferationshemmende Eigenschaft des Peptids (abhängig von der Applikationsdosis und dem Zeitpunkt der Verabreichung nach der Teilhepatektomie) wurde dadurch bestimmt, daß die spezifische Radioaktivität der DNA der Leberzellkerne der Versuchsgruppe mit der spezifischen Radioaktivität der bei jedem Versuch mitgefahrenen Kontrollgruppe prozentual ins Verhältnis gesetzt wurde.

Zur Bestimmung der spezifischen Radioaktivität wurde zuerst die DNA aus der Leber extrahiert. Dazu wurde jede Leber mit der 7fachen Menge einer Saccharoselösung (0,32 M Saccharose, 3 mM MgCl₂, pH 7,3) gepottert (12 Schläge/1200 rpm), d. h. homogenisiert. Nach Filtrierung durch einen 150 µ-Gazefilter wurde 1 ml des Homogenats in der Minifuge (Heraeus-Christ, Osterrode/Harz) bei 800 rpm (120×g) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 200 µl der Saccharoselösung aufgenommen und in ein Eppendorfröhrchen überführt. Dann wurde je 1 ml einer 60%igen Saccharoselösung dazugegeben und 5 min in einer Eppendorfzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 3×1 ml 0,25 M Perchloressigsäure (PCA) suspendiert und in ein Glasröhrchen überführt. Dann wurde mindestens 30 min bei 4°C gekühlt. Anschließend wurde 15 min in der Minifuge bei maximaler Drehzahl (V_max) zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zum Pellet wurde 1 ml 0,5 M NaOH gegeben und 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurde kurz gemischt und der Inhalt auf zwei Röhrchen verteilt. Zu je 0,5 ml (d. h. zu jedem Röhrchen) wurde 4,5 ml 0,5 M PCA gegeben (ein Röhrchen diente als Reserve). Die Proben wurden mindestens 30 min (oder über Nacht) bei 4°C gehalten und dann 15 min in der Minifuge bei höchster Drehzahl (V_max) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Zum Pellet wurde je 3 ml 0,5 M PCA gegeben und 20 min bei 95°C im Wasserbad gekocht. Nach dem neuerlichen Abzentrifugieren wurden beide Überstände zu einer Probe vereinigt und gemischt.

Für die Radioaktivitätsmessung wurde 1 ml des Extrakts mit 5 ml Szintillationsflüssigkeit versetzt und auf ³H gemessen. Der DNA-Gehalt des Extrakts wurde nach Burton gemessen (Burton, K., Biochem. 62 (1956), S. 315-323). Zur Herstellung der Farbreaktionsmischung wurde 1,5 g Diphenylamin mit wenig Eisessig gelöst, dann 1,5 ml H₂SO₄ dazugegeben. Darauf wurde auf 100 ml mit Eisessig aufgefüllt. Kurz vor Gebrauch wurde 0,5 ml einer Acetaldehydlösung dazugegeben. Zur Herstellung der Acetaldehydlösung wurde 2 ml Acetaldehyd mit H₂O_dest bei 4°C auf 100 ml aufgefüllt. Zu 0,5 ml des Extrakts wurde 1 ml der Farbreaktionsmischung gegeben. Danach wurden die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt und nach 22-24 h bei 590 nm gemessen.

Sowohl für die Radioaktivitätsmessung als auch für die DNA-Messung wurden je Probe drei Parallelmessungen durchgeführt.

Die in Fig. 1 dargestellte Analyse zeigt, daß das bekannte Tetrapeptid SDKP stark proliferationsfördernd wirkt, wenn es direkt nach der Operation injiziert wird (zwischen 20 und 50%). 10 Stunden nach der Operation injiziert wirkt es in hohen Mengen (500 µg) proliferationsfördernd, in niedrigen Mengen (8 µg) leicht proliferationshemmend und in noch geringeren Mengen (1 µg) so gut wie gar nicht (vgl. Fig. 1).

2. Einfluß des Tripeptids SDK nach der vorliegenden Erfindung auf die Proliferationsrate von Leberzellen in teilhepatektomierten Ratten

Sechs Gruppen von Ratten wurden einer 66%igen Teilhepatektomie unterzogen. Jedem Tier wurde 1 µg des in 1 ml 0,9% NaCl gelösten, auf übliche Weise synthetisierten Tripeptids SDK injiziert, und zwar bei der ersten Gruppe direkt nach der Operation, bei den weiteren Gruppen jeweils 1 Stunde, 3 Stunden, 6 Stunden und 10 Stunden nach der Operation. Die sechste Gruppe diente als Kontrollgruppe und erhielt nur das Lösungsmittel. Der Versuchsablauf entsprach genau dem unter Punkt 1 beschriebenen Schema.

Die in Fig. 2 dargestellte Analyse zeigt, daß das Tripeptid SDK zwar eine leicht proliferationsfördernde Wirkung hat, wenn es direkt nach der Operation injiziert wird. Bei Wahrung eines gewissen Zeitabstands ergibt sich jedoch eine hemmende Wirkung, die mit wachsendem Zeitabstand zunimmt. Zehn Stunden nach der Operation beträgt die Minderung der Proliferation etwa fünfzig Prozent (vgl. Fig. 2).

Der Vergleich beider Figuren zeigt also deutlich die überraschend unterschiedliche Wirkung des Tetrapeptids SDKP und des Tripeptids SDK auf die Leberzellproliferation von teilhepatektomierten Ratten. Das Tripeptid SDK wirkt praktisch proliferationshemmend, und zwar schon in geringsten Konzentrationen.

3. Einfluß des Tripeptids SDK auf die Entwicklung des YOSHIDA- Ascites AH 130 in Ratten

Zwei Gruppen von je fünf weiblichen, zirka hundert Gramm schweren Wistar-Ratten wurden mit den YOSHIDA-Ascites AH 130 einer 8 Tage zuvor infizierten Ratte geimpft. Jedem Tier wurden 0,5 ml Ascites-Flüssigkeit intraperitoneal (i.p.) injiziert. Ab dem siebten Tag der Ascites-Überimpfung wurde einer Gruppe (fünf Ratten) vier Tage lang je ein 1 µg SDK pro Tier (gelöst in je 1 ml 0,9% NaCl-Lösung) i.p. injiziert. Darauf wurden die Tiere beider Gruppen getötet.

Es wurden folgende Parameter bestimmt:

• a) Gewicht bzw. Volumen der Ascitesflüssigkeit
  Die toten Ratten wurden gewogen, dann der Ascites möglichst vollständig abgesaugt und die Tiere wieder gewogen. Die Differenz der beiden Wägungen entsprach dem Ascites-Volumen (1 g ≈ 1 ml).
• b) Anzahl der Tumorzellen im Ascites
  Pro Tier wurden 2 ml des abgesaugten Ascites in ein EDTA-Röhrchen gegeben, um ein Verklumpen der Zellen zu vermeiden. Mit einem Aliquot davon wurde in einem Coulter-Counter die Tumor-Zellzahl gemessen und auf das Gesamtvolumen hochgerechnet.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Die erste Spalte zeigt das Volumen der Ascitesflüssigkeit als Differenz des Gewichts der Ratten vor und nach dem Absaugen, jedoch abzüglich der 2 ml, die für die Messung der Zellzahl benötigt wurden. In der dritten und vierten Spalte sind jeweils die Ergebnisse von Doppelmessungen aufgeführt.

Aus einem Vergleich der Ergebnisse ergibt sich: Es kommt zu einer dramatischen Verringerung sowohl der Gesamtzahl der Tumorzellen als auch der Ascitesmenge. Die mittlere Zahl der Tumorzellen beträgt bei den mit dem Tripeptid SDK behandelten Ratten nur 19,1% der bei den Kontrolltieren gefundenen Zahl.

4. Einfluß des Tripeptids SDK auf menschliche Tumorzellen in der Gewebekultur

Die Wirkung des Tripeptids auf menschliche Tumorzellen wurde in einem In-vitro-Modell untersucht. Dazu dienten Hep G2-Zellen. Bei dieser Zellinie handelt es sich um ein menschliches Hepatom aus der Tumorzellbank des deutschen Krebsforschungszentrums Heidelberg, das als Monolayer in 90% DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium)/10% FKS (fötales Kälberserum) in einem Subkulturintervall von drei bis fünf Tagen kultiviert wird. Es wurden je sechzig Schalen Versuchs- und Kontrollkultur eingesetzt. Eine Lösung von 20 mg SDK in 0,2 ml 0,9% NaCl diente als Stammlösung, die dann je nach Bedarf mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt wurde.

Einen Tag nach dem Passagieren der Zellen wurden pro 10 ml Nährmedium 0,2 ml in 0,9% NaCl gelöstes Tripeptid SDK (Konzentration: 1 µg/ml) zugegeben. Die Kontrollschalen erhielten 0,2 ml Lösungsmittel. Die Beobachtungszeit betrug sieben Tage. Dabei wurde in den Versuchschalen eine fünf- bis zehnprozentige Hemmung des Zellwachstums im Vergleich zu den Kontrollschalen beobachtet.

Damit ist auch eine signifikante Wirkung des Tripeptids SDK auf menschliche Zellen nachgewiesen.

Claims (4)

1. Wirkstoff zur Hemmung der Proliferationsrate von Leberzellen, dadurch gekennzeichnet, daß er durch ein freies Tripeptid der Zusammensetzung- SDK (Serin-Asparaginsäure- Lysin) oder ein Salz desselben gebildet wird.

2. Wirkstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er durch ein Salz des Tripeptids der Zusammensetzung SDK (Serin-Asparaginsäure-Lysin) mit einem Äquivalent Essigsäure, Zitronensäure oder anorganischer Säure gebildet wird.

3. Medikament, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff das Tripeptid SDK (Serin-Asparaginsäure-Lysin) oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon enthält.

4. Medikament nach Anspruch 3 zur Behandlung von Leberkrebs, Leberzirrhose und chronischer Virushepatitis.