DE4200049A1 - New monoclonal antibodies specific for tumour necrosis factor binding protein - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf monoklonale Antikörper gegen das TNF-bindende Protein I (TNF-BP I) und auf Hybridom-Zellinien, die diese sezernieren.The present invention relates to monoclonal Antibodies against TNF-binding protein I (TNF-BP I) and on hybridoma cell lines that secrete them.
Die zwei strukturell verwandten Zytokine Tumornekrosefaktor (TNF-α) und Lymphotoxin (TNF-β) wurden ursprünglich aufgrund ihrer zytotoxischen in vitro Aktivität gegen Tumorzellen und ihrer Fähigkeit, hämorrhagische Nekrosen von Tumoren in einem Mausmodell zu induzieren, entdeckt. Die Klonierung ihrer cDNAs und deren Expression in E .coli haben die Verfügbarkeit dieser Proteine in praktisch unbegrenztem Ausmaß und die Entwicklung hochspezifischer Antikörper und empfindlicher Immunoassays ermöglicht. Es existiert eine Fülle von Information über die biologischen Aktivitäten dieser Proteine, ihre physiologischen Rollen als pleotrope Mediatoren von entzündlichen Prozessen und ihre Beteiligung bei pathologischen Zuständen. Insbesondere wurde eine erhöhte Produktion von TNF-α mit der Pathogenese von z. B. septischem Schock, Gewebeschädigungen bei der "Graft-versus-host"- Erkrankung und der zerebralen Malaria sowie von Kachexie in Zusammenhang gebracht (Beutler, 1988; Paul und Ruddle, 1988; Beutler und Cerami, 1989).The two structurally related cytokines Tumor necrosis factor (TNF-α) and lymphotoxin (TNF-β) were originally due to their cytotoxic effects vitro activity against tumor cells and their ability to Hemorrhagic necrosis of tumors in a mouse model to induce discovered. The cloning of their cDNAs and their expression in E .coli have the availability of these proteins to an almost unlimited extent and the development of highly specific antibodies and sensitive immunoassays. It exists a wealth of information about biological Activities of these proteins, their physiological Roles as pleotropic mediators of inflammatory Processes and their involvement in pathological Conditions. In particular, increased production of TNF-α with the pathogenesis of e.g. B. septic Shock, tissue damage at the "graft versus host" - Disease and cerebral malaria as well as from Cachexia associated (Beutler, 1988; Paul and Ruddle, 1988; Beutler and Cerami, 1989).
Die möglichen unerwünschten Wirkungen von TNF-α haben zur Suche nach natürlichen Inhibitoren dieses Zytokins veranlaßt. Ein Protein, das an TNF-α bindet und dadurch dessen Aktivität inhibiert, wurde ursprünglich im Harn von Patienten mit Nierenversagen (Peetre et al., 1988) und von Fieberpatienten (Seckinger et al., 1988) identifiziert. Dieses Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ca. 30 kDa wurde zur Homogenität gereinigt, teilweise sequenziert (EP-A2 3 08 378) und die cDNA kloniert (Olsson et al., 1989; Engelmann et al., 1989; Himmler et al., 1990; Schall et al., 1990). Die Struktur der cDNA zeigte, daß dieses Protein mit der Bezeichnung TNF-BP das extrazelluläre Fragment eines TNF-Rezeptors (TNF-R) darstellt. (Es wurde angenommen, daß dieses Fragment durch proteolytische Spaltung freigesetzt wird.) Diese Ergebnisse wurden durch die Isolierung des intakten Membranrezeptors für TNF-α, die unabhängig davon von anderen Arbeitsgruppen durchgeführt wurde (Loetscher et al., 1990), bestätigt. Das gesamte Rezeptorprotein besteht aus 455 Aminosäuren (55-60 kDa); TNF-BP umfaßt den größten Teil der extrazellulären Domäne des Rezeptors und enthält alle drei N-Glykosylierungsstellen. Es wurde gefunden, daß aus Harn isoliertes TNF-BP am N-Terminus aufgrund proteolytischer Spaltung heterogen ist und daher eine Mischung von zwei molekularen Formen, bestehend aus 161 Aminosäuren (Hauptfraktion) bzw. 172 Aminosäuren, darstellt (Himmler et al., 1990). Kürzlich wurde die Existenz eines zweiten TNF-bindenden Proteins nachgewiesen, das ein Fragment eines zweiten TNF-Rezeptor-Typs mit einem höheren Molekulargewicht (75-80 kDa; Engelmann et al., 1990a; Smith et al., 1990; Kohno et al., 1990) darstellt. Die beiden Rezeptoren und Bindungsproteine wurden daraufhin TNF-R I/TNF-BP I und TNF-R II/TNF-BP ZI (für den 60 kDa bzw. 80 kDa Rezeptor) bezeichnet. Der Sequenzvergleich zeigte, daß die beiden Proteine strukturverwandt sind; insbesondere ist die Anzahl und Verteilung der Cysteinreste sehr ähnlich. Die beiden Rezeptoren unterscheiden sich jedoch immunologisch voneinander (Engelmann et al., 1990a; Brockhaus et al., 1990).Have the possible undesirable effects of TNF-α to search for natural inhibitors of this cytokine prompted. A protein that binds to TNF-α and thereby its activity was originally inhibited in the urine of patients with kidney failure (Peetre et al., 1988) and fever patients (Seckinger et al., 1988) identified. This protein with an apparent Molecular weight of approximately 30 kDa became homogeneous cleaned, partially sequenced (EP-A2 3 08 378) and the cDNA cloned (Olsson et al., 1989; Engelmann et al., 1989; Himmler et al., 1990; Schall et al., 1990). The structure of the cDNA showed that this protein with the designation TNF-BP the extracellular fragment a TNF receptor (TNF-R). (It was assumed that this fragment by proteolytic Cleavage is released.) These results were by isolating the intact membrane receptor for TNF-α, which is independent of other working groups was carried out (Loetscher et al., 1990). The entire receptor protein consists of 455 amino acids (55-60 kDa); TNF-BP covers most of the extracellular domain of the receptor and contains all three N-glycosylation sites. It was found that TNF-BP isolated from urine at the N-terminus due to proteolytic cleavage is heterogeneous and therefore a Mixture of two molecular forms consisting of 161 amino acids (main fraction) or 172 amino acids, (Himmler et al., 1990). Recently the Existence of a second TNF-binding protein demonstrated that a fragment of a second TNF receptor type with a higher molecular weight (75-80 kDa; Engelmann et al., 1990a; Smith et al., 1990; Kohno et al., 1990). The two Receptors and binding proteins were then identified TNF-R I / TNF-BP I and TNF-R II / TNF-BP ZI (for the 60 kDa or 80 kDa receptor). The Sequence comparison showed that the two proteins are structurally related; in particular the number and Distribution of cysteine residues very similar. The two However, receptors differ immunologically from each other (Engelmann et al., 1990a; Brockhaus et al., 1990).
Der humane 60 kDa TNF-Rezeptor spielt eine wesentliche Rolle bei der TNF-α-Signalübertragung. Die Aktivität des Rezeptors ist auf Proteinbasis mehreren regulatorischen Effekten unterworfen: Die Behandlung von Zellen mit Phorbolestern oder anderen Aktivatoren der Proteinkinase C hat eine rasche Verringerung in der Anzahl der zellulären Bindungsstellen für TNF-α zur Folge. Damit geht die Freisetzung des extrazellulären Teils des Rezeptors, entsprechend dem TNF-BP I, durch proteolytische Spaltung einher. Ähnliche Effekte, wenn auch mit unterschiedlicher Kinetik, werden durch verschiedene andere Substanzen, insbesondere durch die physiologischen Liganden TNF-α und TNF-β, hervorgerufen. Die Spaltstellen für die Protease auf dem humanen und dem Ratten-TNF-R I sind konserviert, sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Struktur von der Spezifität aller bekannten Proteasen. Es ist daher wahrscheinlich, daß ein hochspezifisches proteolytisches Enzym Bestandteil eines Regelkreises ist, der die Empfindlichkeit von Zellen gegenüber TNFs kontrolliert; der genaue Mechanismus dieser Ereignisse ist noch unbekannt. Kürzlich wurde dieses Phänomen auch in vivo beobachtet: Es wurde gefunden, daß die Verabreichung von TNF-α an Krebspatienten zu einer deutlichen Zunahme von TNF-BP I im Serum führt (Lantz et al., 1990a).The human 60 kDa TNF receptor plays an essential role Role in TNF-α signal transmission. The activity of the receptor is protein based subject to regulatory effects: Treatment of cells with phorbol esters or other activators the protein kinase C has a rapid decrease in the Number of cellular binding sites for TNF-α to Episode. This goes on to release the extracellular Part of the receptor, according to the TNF-BP I, through proteolytic cleavage. Similar effects if even with different kinetics, are by various other substances, in particular through the physiological ligands TNF-α and TNF-β, evoked. The cleavage sites for the protease the human and the rat TNF-R I are preserved, they differ in structure from the specificity of all known proteases. It is therefore likely to be a highly specific proteolytic enzyme part of a control loop is the sensitivity of cells to TNFs controlled; the exact mechanism of these events Is still unknown. Recently, this phenomenon has also been observed in vivo: It was found that the Administration of TNF-α to cancer patients at one time leads to a significant increase in TNF-BP I in the serum (Lantz et al., 1990a).
Die Konzentration von TNF-BP I in Kulturüberständen oder Körperflüssigkeiten ist daher ein Indikator für die Aktivierung des TNF-Rezeptor-Systems in vitro bzw. in vivo aufgrund von Wechselwirkungen mit den Liganden oder Transmodulation durch andere Mediatoren; die TNF-BP 1-Konzentration in Körperflüssigkeiten kann somit als nützlicher Marker für verschiedene Krankheiten angesehen werden.The concentration of TNF-BP I in culture supernatants or body fluids is therefore an indicator of the activation of the TNF receptor system in vitro or in vivo due to interactions with the ligands or transmodulation by other mediators; the TNF-BP 1 concentration in body fluids can thus as a useful marker for various Diseases are considered.
Es bestand daher der Bedarf nach effizienten, empfindlichen Nachweismethoden für TNF-BP I sowie nach Kits, die für derartige Nachweismethoden einsetzbar sind. There was therefore a need for efficient, sensitive detection methods for TNF-BP I as well as Kits that can be used for such detection methods are.
Es sind monoklonale Antikörper gegen TNF-R I beschrieben, die durch Immunisierung mit dem solubilisierten Rezeptor (Brockhaus et al., 1990; EP A2 334 165; Thoma et al., 1990) oder mit gereinigtem TNF-BP I (Engelmann et al., 1990b) hergestellt wurden; von diesen Antikörpern wurde jedoch nicht gezeigt, daß sie sich zur Verwendung in Immuno-Assays für TNF-BP I eignen.They are monoclonal antibodies against TNF-R I described by immunization with the solubilized receptor (Brockhaus et al., 1990; EP A2 334 165; Thoma et al., 1990) or with purified TNF-BP I (Engelmann et al., 1990b) were prepared; however, these antibodies have not been shown to they are suitable for use in immunoassays for TNF-BP I. own.
Lantz et al. (1990a) haben einen kompetitiven ELISA entwickelt, bei dem in einer dreistufigen Testmethode mit TNF-BP I beschichtete Testplatten, polyklonale Kaninchenantikörper gegen TNF-BP I, Biotin-markierte Ziegenantikörper gegen Kaninchen-Immunglobulin und Avidin-gekoppelte alkalische Phosphatase verwendet wurden. Mit Hilfe dieses Assays wurden die Gegenwart von TNF-BP I im Serum von normalen Spendern und erhöhte TNF-BP 1-Konzentrationen in Seren von Patienten mit Nierenversagen oder von Krebspatienten, die mit TNF-α behandelt wurden, nachgewiesen.Lantz et al. (1990a) have a competitive ELISA developed using a three-step test method test plates coated with TNF-BP I, polyclonal Rabbit antibody against TNF-BP I, biotin-labeled Goat antibody against rabbit immunoglobulin and Avidin-coupled alkaline phosphatase is used were. With the help of this assay, the present of TNF-BP I in serum from normal donors and increased TNF-BP 1 concentrations in sera from patients with Kidney failure or cancer patients with TNF-α have been treated.
In der EP A1 4 12 486 werden monoklonale Antikörper gegen TNF-BP I beschrieben. Einer dieser Antikörper wurde in einem Sandwich-ELISA als Beschichtungs- Antikörper verwendet; als zweiter Antikörper wurden polyklonale Kaninchen-Anti-TNF-BP-I-Antikörper, als dritter, enzymgekoppelter Antikörper polyklonale Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper verwendet.In EP A1 4 12 486 monoclonal antibodies against TNF-BP I. One of these antibodies was used in a sandwich ELISA as a coating Antibody used; as a second antibody polyclonal rabbit anti-TNF-BP-I antibodies, as third, enzyme-linked polyclonal antibody Goat anti-rabbit antibody used.
Die vorbekannten Assays sind vom Aufbau und der Durchführung her kompliziert, außerdem bedingt der Einsatz polyklonaler Antikörper die Verwendung von Tieren, die zu vermeiden man zunehmend bestrebt ist.The known assays are of the construction and the Implementation complicated, besides that Use of polyclonal antibodies Animals that one increasingly tries to avoid.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, monoklonale Antikörper mit Spezifität für humanes TNF-BP I bereitzustellen, die sich zur Verwendung in einem einfach durchzuführenden, hochempfindlichen Immunoassay zum Nachweis von TNF-BP I eignen.The present invention was based on the object monoclonal antibodies with specificity for human To provide TNF-BP I which is suitable for use in an easy to use, highly sensitive Immunoassay for the detection of TNF-BP I are suitable.
Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen humanes TNF-BP I der Bezeichnung tbp-1, tbp-2 und tbp-6, aktive Fragmente davon sowie die Hybridom-Zellinien TBP-1, TBP-2 und TBP-6, die diese Antikörper produzieren.The present invention relates to monoclonal Antibodies against human TNF-BP I of the name tbp-1, tbp-2 and tbp-6, active fragments thereof as well the hybridoma cell lines TBP-1, TBP-2 and TBP-6, which produce these antibodies.
Die Hybridomzellinien mit der Bezeichnung TBP-1 und TBP-2 wurden am 5. Juni 1991, die Zellinie mit der Bezeichnung TBP-6 am 28. November 1991 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC; Salisbury, Vereinigtes Königreich) nach dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke hinterlegt (TBP-1: Hinterlegungsnummer 91060555, TBP-2: Hinterlegungsnummer 9 10 60 556, TPB-6: Hinterlegungsnummer 9 11 12 811).The hybridoma cell lines with the designation TBP-1 and TBP-2 were released on June 5, 1991, the cell line with the Designation TBP-6 on November 28, 1991 at the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC; Salisbury, United Kingdom) under the Budapest Treaty on the deposit of microorganisms for Patent purposes filed (TBP-1: Filing number 91060555, TBP-2: Filing number 9 10 60 556, TPB-6: deposit number 9 11 12 811).
Die erfindungsgemäßen Hybridom-Zellinien wurden erhalten, indem Mäuse mit aus menschlichem Harn hochgereinigtem TNF-BP I (Olsson et al., 1989) nach an sich bekannten Methoden immunisiert und Milzzellen von Mäusen mit positiver Antikörper-Reaktion zur Fusionierung mit Myelomzellen verwendet wurden, um Hybridomzellen zu erhalten, die monoklonale Antikörper gegen TNF-BP I sezernieren. Die erste Zellfusion ergab zwei Kulturen, die monoklonale Antikörper gegen TNF-BP I produzieren; eine zweite Zellfusion ergab eine dritte Antikörper produzierende Kultur. Die erhaltenen Antikörper wurden mit tbp-1, tbp-2 und tbp-6 bezeichnet. Die Antikörper wurden gereinigt und charakterisiert: The hybridoma cell lines according to the invention were obtained by using mice made from human urine highly purified TNF-BP I (Olsson et al., 1989) according to known methods immunized and spleen cells from Mice with a positive antibody response Fusion with myeloma cells were used to Hybridoma cells to obtain monoclonal antibodies secrete against TNF-BP I. The first cell fusion resulted two cultures that have monoclonal antibodies against Produce TNF-BP I; a second cell fusion gave one third antibody-producing culture. The received Antibodies were raised with tbp-1, tbp-2 and tbp-6 designated. The antibodies were cleaned and characterized:
tbp-1 und tbp-6 sind IgG1-Antikörper, tbp-2 ist ein IgG2b-Antikörper. Alle drei Antikörper waren in der Lage, TNF-BP I in Western Blots zu erkennen, wobei tbp-1 die stärkste Reaktivität zeigte. tbp-2 reagierte schwächer, tbp-6 ergab die schwächste Färbung. Zur Charakterisierung der Epitope, die von den Antikörpern erkannt werden, wurden die drei Antikörper sowie ein vierter Antikörper mit der Bezeichnung H398, der durch Immunisierung mit solubilisiertem TNF-Rezeptor erhalten worden war (Thoma et al., 1990), untersucht. Die untersuchten Antikörper erkennen drei verschiedene Epitope auf dem TNF-BP 1-Molekül, wobei tbp-2 und H398 dasselbe oder überlappende Epitope erkennen. Die in Gegenwart von TNF-α in verschiedenen Anordnungen mit den Antikörpern durchgeführten Sandwich-ELISAs lassen den Schluß zu, daß die Epitope, die von H398 und tbp-2 erkannt werden, an der Bindung von TNF-α beteiligt sind, während die von tbp-1 und tbp-6 erkannten mit der Ligandenbindungsstelle nicht in Beziehung stehen. Es wurde überraschend festgestellt, daß bestimmte monoklonale Antikörper gegen TNF-BP I nicht nur TNF-BP I in Gegenwart von überschüssigem TNF-α binden können, sondern daß sie darüberhinaus die Schutzwirkung von TNF-BP I gegen die zytotoxische Aktivität von TNF-α und TNF-β deutlich erhöhen. Dieser Effekt wurde bei den beiden Antikörpern tbp-1 und tbp-6 beobachtet. (Diese beiden Antikörper gehören zur Gruppe von Antikörpern gegen TNF-BP I, die nicht mit TNF-α und TNF-β um die Bindung von TNF-BP I konkurrieren. Im Gegensatz dazu blockieren die Antikörper tbp-2 und H398, die mit TNF-α um die Bindung an TNF-BP I konkurrieren, die Wirkung von TNF-BP I).tbp-1 and tbp-6 are IgG1 antibodies, tbp-2 is an IgG2b antibodies. All three antibodies were in the Able to recognize TNF-BP I in Western blots, where tbp-1 showed the greatest reactivity. tbp-2 responded weaker, tbp-6 gave the weakest color. For Characterization of the epitopes by the antibodies were recognized, the three antibodies as well as one fourth antibody, designated H398, by Obtained immunization with solubilized TNF receptor had been examined (Thoma et al., 1990). The Antibodies examined recognize three different ones Epitopes on the TNF-BP 1 molecule, where tbp-2 and H398 recognize the same or overlapping epitopes. The in the presence of TNF-α in different arrangements let sandwich ELISAs run on the antibodies concluded that the epitopes of H398 and tbp-2 are involved in the binding of TNF-α are, while those recognized by tbp-1 and tbp-6 with the Ligand binding site are unrelated. It it was surprisingly found that certain monoclonal antibodies to TNF-BP I not only Bind TNF-BP I in the presence of excess TNF-α can, but that they also have the protective effect of TNF-BP I against the cytotoxic activity of TNF-α and significantly increase TNF-β. This effect was in the both antibodies tbp-1 and tbp-6 were observed. (These both antibodies belong to the group of antibodies against TNF-BP I who are not using TNF-α and TNF-β to get the Binding of TNF-BP I compete. In contrast to block the antibodies tbp-2 and H398, which with TNF-α compete for binding to TNF-BP I, the effect by TNF-BP I).
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die Verwendung von tbp-1 und/oder tbp-2 zum Nachweis von TNF-BP I in Körperflüssigkeiten oder Zellkulturüberständen mittels Immunoassay. (Unter die Bezeichnung tbp-1 oder tbp-2 fallen im Zusammenhang mit der Verwendung dieser Antikörper im folgenden auch ihre aktiven Fragmente, die an TNF-BP I binden. Dem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet sind Methoden zur Herstellung aktiver Antikörper-Fragmente (Fab-Fragmente), z . B. mittels Enzymverdau, geläufig).The present invention relates in a further Aspect the use of tbp-1 and / or tbp-2 for Detection of TNF-BP I in body fluids or Cell culture supernatants using an immunoassay. (Under the Designations tbp-1 or tbp-2 fall in connection with the use of these antibodies in the following also their active fragments that bind to TNF-BP I. The Methods are skilled in the relevant field for the production of active antibody fragments (Fab fragments), e.g. B. by enzyme digestion, common).
Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung von tbp-1 und tbp-6 zum Nachweis von TNF-BP I in Körperflüssigkeiten oder Zellkulturüberständen mittels Immunoassay. Die Antikörperkombination tbp-1/tbp-6 ist besonders geeignet für die Anwendung bei Proben, in denen sehr hohe TNF-α- und/oder TNF-β-Konzentrationen vorliegen, die die Bestimmung von TNF-BP I in anderen Testsystemen stören.The invention also relates to the use of tbp-1 and tbp-6 for the detection of TNF-BP I in Body fluids or cell culture supernatants using Immunoassay. The antibody combination is tbp-1 / tbp-6 particularly suitable for use with samples in which very high TNF-α and / or TNF-β concentrations are present that determine the determination of TNF-BP I in others Disrupt test systems.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung anwendbaren Immunoassays beruhen auf Standardmethoden, die dem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet geläufig sind und von denen ein großes Angebot zur Verfügung steht. Diese Methoden basieren auf der Bildung eines Komplexes zwischen der zu bestimmenden antigenen Substanz und einem oder mehreren Antikörpern. Einer oder mehrere der Komplexpartner ist dabei markiert, so daß das Antigen nachgewiesen und/oder quantitativ bestimmt werden kann. Die Markierung kann z. B. in Form eines gekoppelten Enzyms, Radioisotops, Metallchelats, oder einer fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder biolumineszierenden Substanz vorliegen.Those applicable in the context of the present invention Immunoassays are based on standard methods that the Are skilled in the relevant field and a wide range of which is available. These Methods are based on the formation of a complex between the antigenic substance to be determined and one or more antibodies. One or more of the Complex partner is marked so that the antigen can be demonstrated and / or quantified. The marking can e.g. B. in the form of a coupled Enzyme, radioisotope, metal chelate, or one fluorescent, chemiluminescent or bioluminescent substance.
Im Falle eines kompetitiven Immunoassays konkurriert das Antigen in der zu analysierenden Probe mit einer bekannten Menge von markiertem Antigen um die Bindung an die Antikörper-Bindungstellen. Die Menge von markiertem Antigen, gebunden an den Antikörper, ist daher verkehrt proportional zur Antigenmenge in der Probe.In the case of a competitive immunoassay competes the antigen in the sample to be analyzed with a known amount of labeled antigen around binding to the antibody binding sites. The amount of labeled antigen bound to the antibody therefore it is proportional to the amount of antigen in the Sample.
Bei Tests, in denen markierte Antikörper verwendet werden, ist die Menge an markiertem, gebundenem Antikörper direkt proportional zur Menge an Antigen.In tests in which labeled antibodies are used is the amount of labeled, bound Antibodies directly proportional to the amount of antigen.
Assays, die auf der Bildung eines Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexes basieren, wobei zwei Antikörper eingesetzt werden, die einander bei der Bindung an das Antigen nicht behindern, werden als "Sandwich"-Immunoassays bezeichnet.Assays based on the formation of a Antibody / antigen / antibody complex based, where two antibodies are used, which are mutually exclusive Binding to the antigen is not considered to be "Sandwich" immunoassays.
Da monoklonale Antikörper in unbegrenzter Menge in konstanter Qualität verfügbar sind, weisen Immunoassays unter Verwendung monoklonaler Antikörper aufgrund ihrer konstanten Qualität und Reproduzierbarkeit gegenüber Assays, die sich polyklonaler Antikörper bedienen, entscheidende Vorteile auf. Außerdem wird der mit polyklonalen Antikörpern verbundene Nachteil, für deren Herstellung laufend Tiere einsetzen zu müssen, vermieden.Since monoclonal antibodies in unlimited quantities immunoassays are of constant quality using monoclonal antibodies because of their constant quality and reproducibility Assays using polyclonal antibodies decisive advantages. In addition, the with polyclonal antibodies associated disadvantage, for their Manufacturing to continuously use animals, avoided.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in einem Sandwich-Immunoassay, insbesondere in einem Sandwich-ELISA verwendet.The monoclonal according to the invention are preferred Antibodies in a sandwich immunoassay, in particular used in a sandwich ELISA.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind in Sandwich-Immunoassays als Beschichtungs- und Markierungs-gekoppelte Antikörper einsetzbar und machen somit den Einsatz polyklonaler Antikörper überflüssig.The monoclonal antibodies according to the invention are in Sandwich immunoassays as coating and Label-coupled antibodies can be used and made thus the use of polyclonal antibodies is unnecessary.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Immunoassay-Kits, insbesondere Sandwich- Immunoassay-Kits, die tbp-1 und/oder tbp-2 enthalten. In another aspect, the present relates Invention immunoassay kits, especially sandwich Immunoassay kits containing tbp-1 and / or tbp-2.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Sandwich-Immunoassay-Kit, vorzugsweise ein Sandwich-ELISA-Kit, in dem tbp-1 den Beschichtungsantikörper und tbp-2 den markierten, vorzugsweise enzymgekoppelten Antikörper darstellt.A preferred embodiment of the present Invention is a sandwich immunoassay kit preferably a sandwich ELISA kit in which tbp-1 den Coating antibody and tbp-2 the labeled, preferably enzyme-linked antibody.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich, in einem Sandwich-Immunoassay tbp-1 oder tbp-2 durch einen anderen Antikörper zu ersetzen, der in der Lage ist, mit tbp-2 bzw. tbp-1 einen Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden.It is possible within the scope of the present invention in a sandwich immunoassay tbp-1 or tbp-2 to replace another antibody in the Is able to use tbp-2 or tbp-1 Form antibody / antigen / antibody complex.
Im Falle des Ersatzes von tbp-1 oder tbp-2 durch einen anderen Antikörper wird bevorzugt ein Antikörper verwendet, der jeweils dasselbe Epitop von TNF-BP I oder einen Bereich davon erkennt wie der zu ersetzende tbp-1 bzw. tbp-2.In case of replacement of tbp-1 or tbp-2 by one another antibody is preferably an antibody used, the same epitope of TNF-BP I or recognizes an area of it like the one to be replaced tbp-1 or tbp-2.
Antikörper, die sich in dem Immunoassay aufgrund ihrer Fähigkeit, mit tbp-2 bzw. tbp-1 einen Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden, als Ersatz für tbp-1 oder tbp-2 eignen, können mit Hilfe von Sandwich-Immunoassays ermittelt werden. Dabei werden Immunoassay-Platten mit tbp-1 oder tbp-2 beschichtet, das Antigen aufgegeben und die zu untersuchenden, markierten Antikörper aufgetragen. Antikörper, die mit tbp-1 bzw. tbp-2 einen Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex bilden können, was durch Messung der Markierung des Testantikörpers feststellbar ist, erkennen ein anderes Epitop auf dem Antigen als tbp-1 bzw. tbp-2. Antikörper, die nicht in der Lage sind, ein Sandwich mit tbp-1 bzw. tbp-2 zu bilden, weisen dieselbe oder überlappende Epitoperkennung auf wie diese Antikörper. Antibodies found in the immunoassay due to their Ability to use tbp-2 or tbp-1 Antibody / antigen / antibody complex to form as Replacement for tbp-1 or tbp-2 can be used with the help can be determined by sandwich immunoassays. Here become immunoassay plates with tbp-1 or tbp-2 coated, the antigen abandoned and the too investigating, labeled antibodies applied. Antibodies that have a tbp-1 or tbp-2 Can form antibody / antigen / antibody complex, what by measuring the label of the test antibody is detectable, recognize another epitope on the Antigen as tbp-1 or tbp-2. Antibodies that are not in are able to make a sandwich with tbp-1 or tbp-2 form, have the same or overlapping Epitope detection on how these antibodies.
Im Falle des Ersatzes eines der Antikörper tbp-1 oder tbp-2 im Sandwich-Immunoassay wird bevorzugt der Markierungs-gekoppelte Antikörper tbp-2 durch einen Antikörper ersetzt, der dieselbe oder überlappende Epitop-Spezifität aufweist wie tbp-2. Ein Beispiel für einen geeigneten Antikörper ist der von Thoma et al. (1990) beschriebene monoklonale Antikörper H398, von dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt werden konnte, daß er an ein identisches oder überlappendes Epitop bindet.In the event of replacement of one of the antibodies tbp-1 or tbp-2 in sandwich immunoassay is preferred Label-coupled antibody tbp-2 by a Antibody replaced, the same or overlapping Has epitope specificity like tbp-2. An example for a suitable antibody is that of Thoma et al. (1990) described monoclonal antibodies H398, from which are shown in the context of the present invention could think of an identical or overlapping Epitope binds.
Mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Sandwich-ELISAs auf Basis tbp-1/tbp-2 konnte TNF-BP I in Humanserum, Plasma, Harn und Zellkulturüberständen bei einer Empfindlichkeit von ca. 200 ng/l und einer Genauigkeit von mehr als 10 % nachgewiesen werden.With the help of a sandwich ELISA according to the invention Base tbp-1 / tbp-2 was able to TNF-BP I in human serum, Plasma, urine and cell culture supernatants in one Sensitivity of approx. 200 ng / l and an accuracy of more than 10% can be demonstrated.
Es wurde überraschend festgestellt, daß die natürlichen Liganden für den TNF-Rezeptor, TNF-α und TNF-β, die Aussagekraft des erfindungsgemäßen Immunoassays, in dem tbp-1 und tbp-2 eingesetzt werden, nicht beeinträchtigen: TNF-β übt keinen meßbaren Einfluß auf den Assay aus, TNF-α zeigt erst bei Konzentrationen von 10 µg/l eine meßbare Änderung des Signals. Da die TNF-α-Konzentrationen in gesunden Personen für gewöhnlich 20 ng/l betragen und selbst bei ernsten pathologischen Zuständen die TNF-α-Konzentrationen nur in seltenen Fällen 1 µg/l übersteigen (z. B. Lähdevirta et al., 1988; Offner et al., 1990), kann eine Beeinträchtigung des erfindungsgemäßen Immunoassays durch unter natürlichen Bedingungen ausgeschütteten endogenen TNF-α ausgeschlossen werden.It was surprisingly found that the natural Ligands for the TNF receptor, TNF-α and TNF-β, which Significance of the immunoassay according to the invention, in which tbp-1 and tbp-2 are used, not impair: TNF-β has no measurable influence the assay, TNF-α only shows at concentrations of 10 µg / l a measurable change in the signal. Since the TNF-α concentrations in healthy people for usually 20 ng / l and even serious ones pathological conditions the TNF-α concentrations only in rare cases exceed 1 µg / l (e.g. Lähdevirta et al., 1988; Offner et al., 1990), one Impairment of the immunoassay according to the invention by distributed under natural conditions endogenous TNF-α can be excluded.
Aufgrund seiner Empfindlichkeit ist ein Immunoassay auf Basis der monoklonalen Antikörper tbp-1/tbp-2 auch geeignet, nach unten von den Normwerten abweichende Konzentrationen von TNF-BP I nachzuweisen. Damit können Funktionsstörungen des Organismus diagnostisch erfaßt werden, die mit einer verminderten Produktion von TNF-BP I einhergehen.Because of its sensitivity, an immunoassay is up Basis of the monoclonal antibodies tbp-1 / tbp-2 too suitable, downward deviating from the norm values Detect concentrations of TNF-BP I. So that can Malfunctions of the organism are diagnosed with reduced production of TNF-BP I go hand in hand.
Außer für den Nachweis von TNF-BP I in Serum, Plasma und Harn sowie in Zellkulturüberständen können die monoklonalen Antikörper tbp-1 und tbp-2 auch für den Nachweis von TNF-BP I in anderen Körperflüssigkeiten, z. B. in der Zerebrospinalflüssigkeit oder in Bronchoalveolarsekreten, verwendet werden.Except for the detection of TNF-BP I in serum, plasma and urine as well as in cell culture supernatants monoclonal antibodies tbp-1 and tbp-2 also for Detection of TNF-BP I in other body fluids, e.g. B. in the cerebrospinal fluid or in Bronchoalveolar secretions.
In den im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuchen wurde überraschend festgestellt, daß das in einem Sandwich-ELISA mit der Kombination tbp-1/tbp-6 erhaltene Signal nicht einmal durch extrem hohe TNF-α- bzw. TNF-β-Konzentrationen im Bereich von 10 mg/l beeinträchtigt wurde.In the context of the present invention experiments carried out became surprising found that in a sandwich ELISA with the Combination tbp-1 / tbp-6 signal not even obtained due to extremely high TNF-α or TNF-β concentrations in Range of 10 mg / l was affected.
Die Antikörperkombination tbp-1/tbp-6 wird bevorzugt in einem Sandwich-Immunoassay, insbesondere in einem Sandwich-ELISA, eingesetzt, wobei tbp-1 und tbp-6 gleichermaßen als Beschichtungsantikörper und markierter Antikörper verwendet werden können.The antibody combination tbp-1 / tbp-6 is preferred in a sandwich immunoassay, especially one Sandwich ELISA used, with tbp-1 and tbp-6 equally as a coating antibody and labeled antibodies can be used.
Beispiele für die Anwendung des Antikörperpaares tbp-1/tbp-6 zum Nachweis von TNF-BP I sind Proben aus in vitro Experimenten, in denen Zellen, z. B. Leukozyten, mit Lipopolysacchariden stimuliert wurden, oder Serumproben von Versuchstieren, die mit großen Mengen von Lipopolysacchariden oder Bakterien behandelt wurden. Unter diesen Bedingungen wird TNF-α in extrem hohen Mengen ausgeschüttet.Examples of the application of the antibody pair tbp-1 / tbp-6 for the detection of TNF-BP I are Samples from in vitro experiments in which cells, e.g. B. leukocytes, stimulated with lipopolysaccharides were, or serum samples from experimental animals, which with large amounts of lipopolysaccharides or bacteria were treated. Under these conditions, TNF-α distributed in extremely high amounts.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung wird somit eine hochempfindliche Nachweismethode für TNF-BP I bereitgestellt, mit der die Aktivierung des TNF-Rezeptors durch seine physiologischen Liganden TNF-α und TNF-β sowie seine Transmodulation durch andere Mediatoren in verschiedenen pathologischen Zuständen oder in in vitro Modellen festgestellt werden kann. Der Nachweis von TNF-BP I in Körperflüssigkeiten dient somit vor allem zur Diagnose von pathologischen Zuständen, die mit einer erhöhten TNF-α-Produktion einhergehen bzw. zur Absicherung solcher Diagnosen.With the help of the present invention highly sensitive detection method for TNF-BP I provided with which the activation of the TNF receptor due to its physiological ligand TNF-α and TNF-β as well as its transmodulation by other mediators in different pathological Conditions or in in vitro models can. The detection of TNF-BP I in body fluids thus serves primarily for the diagnosis of pathological Conditions associated with increased TNF-α production go hand in hand or to confirm such diagnoses.
Ein Vorteil der TNF-BP I-Bestimmung gegenüber der TNF-α-Bestimmung ergibt sich dadurch, daß von TNF-BP I Normalwerte im Serum gefunden werden, wodurch eine Bestimmung auch geringfügig erhöhter Werte und damit eine Diagnose möglich ist.An advantage of the TNF-BP I determination over the TNF-α determination results from the fact that TNF-BP I Normal values can be found in the serum, causing a Determination of slightly increased values and thus diagnosis is possible.
Trotz des deutlichen Zusammenhanges zwischen der Induktion von TNF-α und dem Auftreten von septikämischen und endotoxämischen Reaktionen in Tieren brachte die Bestimmung von TNF-α in schwer an gram-negativen Infektionen erkrankten Patienten widersprüchliche Ergebnisse. Dies dürfte mit den Mechanismen in Zusammenhang stehen, die die Synthese und Ausscheidung von TNF-α kontrollieren. Nach Anregung durch einen geeigneten Stimulus wird TNF-α rasch von Makrophagen ausgeschüttet, im Anschluß daran dürften die Makrophagen gegen weitere Stimulierung resistent sein. Außerdem ist die Halbwertszeit im Plasma kurz, sie beträgt im Menschen nur 15 bis 17 min. Diese Phänomene dürften die Ursache dafür sein, daß das Auftreten von TNF-α im Blutkreislauf rasch und kurzlebig und daher schwierig nachweisbar ist (Michie et al., 1988). Wenn dem Patienten daher nicht rechtzeitig Blut abgenommen wird, ist es möglich, daß zum Zeitpunkt der Analyse die Erhöhung der TNF-α-Konzentration nicht mehr nachweisbar ist. Von Lantz et al. (1990a) wurde festgestellt, daß nach Infusion mit TNF-α der TNF-BP I-Spiegel im Serum wesentlich langsamer abfällt als der Serum-TNF-Spiegel. Dieser Befund zeigt, daß die Bestimmung von TNF-BP I-Konzentrationen als Grundlage für eine Diagnose insbesondere dann von Vorteil ist, wenn pathologische Zustände diagnostiziert werden sollen, die mit einer Aktivierung des TNF-Rezeptor-Systems, insbesondere durch TNF-α, verbunden sind und bei denen der TNF-α-Spiegel im Vergleich zum TNF-BP I-Spiegel rascher absinkt.Despite the clear connection between the Induction of TNF-α and the appearance of septicemic and endotoxemic reactions in animals introduced the determination of TNF-α in difficult gram-negative infections in sick patients conflicting results. This should work with the Mechanisms related to synthesis and control the excretion of TNF-α. After suggestion TNF-α is rapidly removed by a suitable stimulus Macrophages poured out, after that may the macrophages are resistant to further stimulation be. In addition, the plasma half-life is short, it is only 15 to 17 minutes in humans. These Phenomena may be the reason why Occurrence of TNF-α in the bloodstream quickly and is short-lived and therefore difficult to prove (Michie et al., 1988). So if the patient doesn't blood is drawn in time, it is possible that at the time of analysis the increase in TNF-α concentration is no longer detectable. From Lantz et al. (1990a) it was found that after Infusion with TNF-α of TNF-BP I serum levels falls much more slowly than the serum TNF level. This finding shows that the determination of TNF-BP I concentrations as the basis for one Diagnosis is particularly advantageous if pathological conditions should be diagnosed, with an activation of the TNF receptor system, in particular by TNF-α, and in which the TNF-α level compared to the TNF-BP I level sinks faster.
Beispiele für Erkrankungen, für deren Diagnose die Bestimmung von TNF-BP I herangezogen werden kann, sind gramnegative oder allgemeine bakterielle Infektionen, septischer Schock, Gewebeschädigungen bei der "Graft-versus-host"-Erkrankung und der zerebralen Malaria sowie Kachexie.Examples of diseases for the diagnosis of which Determination of TNF-BP I can be used gram negative or general bacterial infections, septic shock, tissue damage in the "Graft-versus-host" and cerebral disease Malaria and cachexia.
Die erfindungsgemäßen Immunoassays sind insbesondere bei der Diagnose von septischem Schock, der bei nicht rechtzeitig vorgenommener Therapie eine lebensbedrohende Erkrankung darstellt, von Vorteil.The immunoassays according to the invention are in particular in diagnosing septic shock, which is not in timely therapy represents a life-threatening disease.
Mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Immunoassays auf Basis der monoklonalen Antikörper tbp-1 und tbp-2 konnte TNF-BP I im Serum von normalen Spendern bei einer Durchschnittskonzentration von ca. 2 µg/l nachgewiesen werden. Erhöhte Werte wurden im Serum von Patienten mit schweren Verbrennungen bestimmt; sehr hohe Werte wurden in Dialysepatienten nachgewiesen, während die Seren von Patienten mit chronischer Polyarthritis keine erhöhten TNF-BP I-Konzentrationen aufwiesen. With the help of an immunoassay according to the invention Basis of the monoclonal antibodies tbp-1 and tbp-2 was able to contribute TNF-BP I in serum from normal donors an average concentration of approx. 2 µg / l be detected. Increased values were found in the serum of Patients with severe burns determined; very high values have been demonstrated in dialysis patients, while the sera from patients with chronic Polyarthritis no increased TNF-BP I concentrations exhibited.
Mit den erfindungsgemäßen Immunooassays wird außerdem erstmals eine einfache immunologische Nachweismethode für TNF-BP I im Harn bereitgestellt; in Harnproben von normalen Spendern wurde eine TNF-BP I- Durchschnittskonzentration von ca. 2 µg/l bestimmt.With the immunooassays according to the invention is also for the first time a simple immunological detection method provided for TNF-BP I in urine; in urine samples from normal donors were given a TNF-BP I Average concentration of approx. 2 µg / l determined.
Die erfindungsgemäßen Immunoassays können somit zur Diagnose von pathologischen Zuständen, bei denen eine Korrelation von erhöhten TNF-BP I-Konzentrationen im Harn und im Serum besteht, wie sie bei Nierenversagen festgestellt wurde, eingesetzt werden, indem die TNF-BP I-Konzentration im Harn bestimmt wird. Diese Methode bietet den Vorteil, auf eine Blutabnahme verzichten und die Diagnose aufgrund der für den Patienten wesentlich angenehmeren Harnanalyse erstellen zu können.The immunoassays according to the invention can thus Diagnosis of pathological conditions in which one Correlation of increased TNF-BP I concentrations in the Urine and serum exist as in kidney failure was determined to be used by the TNF-BP I urinary concentration is determined. These Method has the advantage of drawing blood dispense with and the diagnosis based on that for the Create a much more comfortable urine analysis for patients to be able to.
Unter den Begriff "Diagnose", für die die erfindungsgemäßen Immunoassays verwendet werden können, fällt auch die Überwachung des Verlaufs einer Erkrankung, die mit einer Aktivierung des TNF- Rezeptorsystems verbunden ist, bzw. des Verlaufs der Therapie zur Behandlung einer solchen Erkrankung, z. B. einer Therapie mit Antikörpern gegen TNF-α. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Immunoassays ist weiters zweckmäßig für die Überwachung des Verlaufs von Therapien, bei denen TNF-α oder TNF-β verabreicht werden. Im Zuge dieser diagnostischen Anwendungen wird im allgemeinen in regelmäßigen Zeitabständen die Probe einer Körperflüssigkeit aus dem Patienten entnommen und deren Gehalt an TNF-BP I bestimmt.Under the term "diagnosis" for which the immunoassays according to the invention can be used, monitoring of the course of a falls Disease associated with TNF activation Receptor system is connected, or the course of the Therapy to treat such a disease, e.g. B. therapy with antibodies against TNF-α. The Use of the immunoassay according to the invention further useful for monitoring the course of Therapies where TNF-α or TNF-β is administered will. In the course of these diagnostic applications generally the sample at regular intervals a body fluid from the patient and whose TNF-BP I content is determined.
Monoklonale Antikörper gegen TNF-BP I, die nicht mit TNF-α und/oder TNF-β um die Bindung an TNF-BP I konkurrieren und die die Schutzwirkung von TNF-BP I erhöhen, können erfindungsgemäß verwendet werden, um die Wirkung von TNF-BP I im Rahmen der Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine schädigende Wirkung von TNF-α und/oder TNF-β auftritt, zu verstärken. (Es wurde festgestellt, daß die Schutzwirkung von TNF-BP I gegenüber TNF-α relativ schwach ist (Lantz et al., 1990b, Loetscher et al., 1991)).Monoclonal antibodies to TNF-BP I that are not TNF-α and / or TNF-β to bind to TNF-BP I compete and the protective effect of TNF-BP I increase can be used according to the invention the effect of TNF-BP I in the treatment of Diseases in which a harmful effect of TNF-α and / or TNF-β occurs. (It was found that the protective effect of TNF-BP I is relatively weak compared to TNF-α (Lantz et al., 1990b, Loetscher et al., 1991)).
Um die Verstärkung der Schutzwirkung dieser Antikörper sowohl für endogenes TNF-BP I als auch für therapeutisch verabreichtes exogenes TNF-BP I auszunutzen, können die Antikörper für sich oder in Kombination mit TNF-BP I in geeigneten Zubereitungen als Therapeutikum eingesetzt werden.To enhance the protective effect of these antibodies for both endogenous TNF-BP I and for therapeutically administered exogenous TNF-BP I The antibodies can be used on their own or in Combination with TNF-BP I in suitable preparations can be used as a therapeutic.
Beispiele für solche Antikörper, die die Schutzwirkung von TNF-BP I gegen TNF-α und TNF-β verstärken, sind tbp-1 und tbp-6. Die diesbezügliche Eignung anderer Antikörper gegen TNF-BP I kann festgestellt werden, indem die Antikörper in Bioassays auf ihre Wirkung auf TNF-BP I untersucht werden. Die Dosierung der monoklonalen Antikörper wird nach der TNF-BP 1-Dosis bemessen, sie liegt, bezogen auf die TNF-BP 1-Menge, zweckmäßig im Bereich von äquimolar bis ca. 100facher molarer Überschuß.Examples of such antibodies that have the protective effect of TNF-BP I against TNF-α and TNF-β tbp-1 and tbp-6. The suitability of others in this regard Antibody to TNF-BP I can be found by measuring the effect of the antibodies in bioassays TNF-BP I are examined. The dosage of the monoclonal antibody is applied after the TNF-BP 1 dose dimensioned, based on the amount of TNF-BP 1, expedient in the range from equimolar to approx. 100 times molar excess.
Ein weiteres Anwendungsgebiet der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der monoklonalen Antikörper tbp-1, tbp-2 und tbp-6 in immobilisierter Form für die Reinigung von TNF-BP I mittels Affinitätschromatographie.Another area of application of the present Invention is the use of the monoclonal Antibodies tbp-1, tbp-2 and tbp-6 in immobilized Form for the cleaning of TNF-BP I by means of Affinity chromatography.
Weiters können die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, insbesondere tbp-1, für den Nachweis von TNF-BP I in Immunoblots verwendet werden. Furthermore, the monoclonal according to the invention Antibodies, especially tbp-1, for the detection of TNF-BP I can be used in immunoblots.
Fig. 1 ELISAs für TNF-BP I unter Verwendung monoklonaler Antikörper, Fig. 1 ELISAs for TNF-BP I monoclonal antibodies using,
Fig. 2 Repräsentative Eichkurven für TNF-BP I ELISAs von Serum- und Harnproben, Fig. 2 Representative calibration curves for TNF-BP I ELISA of serum and urine samples,
Fig. 3 Einfluß von TNF-α auf die Immunreaktivität von TNF-BP I, Fig. 3 Influence of TNF-α on the immunoreactivity of TNF-BP I,
Fig. 4 TNF-BP I-Konzentrationen in Humanserum und Harn, Fig. 4 TNF-BP I concentrations in human serum and urine
Fig. 5 Wirkung von TNF-α auf den Nachweis von TNF-BP I in Sandwich-ELISASs, Fig. 5 Effect of TNF-α on the detection of TNF-BP I in a sandwich ELISASs,
Fig. 6 Einfluß der monoklonalen Antikörper auf die Schutzwirkung von TNF-BP I im zytotoxischen Bioassay. Fig. 6 Influence of monoclonal antibodies on the protective effect of TNF-BP I in the cytotoxic bioassay.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:The invention is illustrated by the following examples explains:
3 ca. 6 Wochen alte weibliche BALB/c Mäuse wurden mit dem nach der in der EP A2 3 93 438 beschriebenen Methode zur Homogenität gereinigten TNF-BP I nach folgendem Schema immunisiert:3 female BALB / c mice about 6 weeks old were also included according to the method described in EP A2 3 93 438 TNF-BP I purified to homogeneity according to the following Scheme immunized:
- 1. Immunisierung: 9 µg TNF-BP I pro Maus in komplettem Freund′schem Adjuvans, intraperitoneal1. Immunization: 9 µg TNF-BP I per mouse in complete adjuvant of Freund’s, intraperitoneally
- 2. Immunisierung: 9 µg TNF-BP I pro Maus in inkomplettem Freund′ schem Adjuvans, intraperitoneal, 3 Wochen nach der 1. Immunisierung2. Immunization: 9 µg TNF-BP I per mouse in incomplete friend’s adjuvant, intraperitoneally, 3 weeks after 1. Immunization
- 3. Immunisierung: 9 µg TNF-BP I pro Maus in inkomplettem Freund′schem Adjuvans, intraperitoneal, 5 Wochen nach der 2. Immunisierung.3. Immunization: 9 µg TNF-BP I per mouse in incomplete Freund's adjuvant, intraperitoneally, 5 weeks after 2. Immunization.
8 Tage danach wurden den Mäusen Serumproben entnommen und mittels eines Sandwich-ELISA auf die Bildung von Antikörpern gegen TNF-BP I untersucht. Dazu wurde TNF-BP I an mit Kaninchenantikörpern gegen TNF-BP I beschichtete Testplatten gebunden und spezifische Antikörper mit Peroxidase-gekoppelten Kaninchenantikörpern gegen Mäuse-Immunglobulin nachgewiesen. Die Testseren wurden in Verdünnungen von 1 : 102, 1 : 103, 1 : 104 und 1 : 105 aufgelegt. Es zeigten alle drei Mäuse positive Reaktion (Absorption mehr als zweifacher Untergrund) bei bis zu 105facher Verdünnung. Die Maus mit dem höchsten Titer wurde ca. 8 Wochen nach der 3. Immunisierung an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit je 4 µg TNF-BP I in PBS geboostert; die Milzzellen dieser Maus wurden am folgenden Tag für die Fusion mit Hybridomzellen verwendet.8 days later, serum samples were taken from the mice and examined for the formation of antibodies against TNF-BP I by means of a sandwich ELISA. For this purpose, TNF-BP I was bound to test plates coated with rabbit antibodies against TNF-BP I and specific antibodies with peroxidase-coupled rabbit antibodies against mouse immunoglobulin were detected. The test sera were run in dilutions of 1:10, 1:103, 1:10 and 1:10. All three mice showed a positive reaction (absorption more than twice the background) with up to 10 5- fold dilution. The mouse with the highest titer was boosted approximately 8 weeks after the third immunization on three successive days with 4 μg TNF-BP I in PBS; the spleen cells from this mouse were used the following day for fusion with hybridoma cells.
In ähnlicher Weise wurde eine zweite Immunisierung durchgeführt mit dem Unterschied, daß die dazu verwendete Maus zusätzlich 8 Monate nach der dritten Immunisierung eine vierte Dosis TNF-BP I (15 µg) erhielt und 7 Wochen danach geboostert wurde. Similarly, a second immunization was carried out carried out with the difference that the used mouse an additional 8 months after the third Immunization of a fourth dose of TNF-BP I (15 µg) received and was boosted 7 weeks later.
Die Milz der Maus wurde einen Tag nach der letzten Injektion steril entnommen, mechanisch zerkleinert und mit serumfreiem Kulturmedium (RPMI 1640) gewaschen. Ca. 108 Milzzellen wurden nach der Methode von Köhler und Milstein (1975) in Gegenwart von PEG 4000 (Merck, 40% in serumfreiem Kulturmedium) mit ca. 5×107 P3X63Ag8.653 BALB/c-Myelomzellen (Kearney et al., 1979) fusioniert. Danach wurden die Zellen in HAT-Selektionsmedium (RPMI 1640 - komplettiert mit 100 U/ml Natrium-Penicillin G, 50 U/ml Streptomycin und 20% FCS - mit 10-4M Hypoxanthin, 4×10-7M Aminopterin und 1.6×10-5M Thymidin) suspendiert und in 16%-Loch- Mikrotiter-Platten, die peritoneale Mäusezellen als "Feeder Layer" enthielten, verteilt. Nach 11 Tagen wurden Überstände entnommen und auf Antikörperproduktion getestet. Von den 1500 Kulturen, die in selektives Medium ausgesät wurden, zeigten mehr als 90% Wachstum von Hybridomen.The mouse spleen was removed sterile one day after the last injection, mechanically crushed and washed with serum-free culture medium (RPMI 1640). Approx. 108 spleen cells were removed using the method of Köhler and Milstein (1975) in the presence of PEG 4000 (Merck, 40% in serum-free culture medium) with approx. 5 × 10 7 P3X63Ag8.653 BALB / c myeloma cells (Kearney et al., 1979) merged. The cells were then in HAT selection medium (RPMI 1640 - completed with 100 U / ml sodium penicillin G, 50 U / ml streptomycin and 20% FCS - with 10 -4 M hypoxanthine, 4 × 10 -7 M aminopterin and 1.6 × 10 -5 M thymidine) and distributed in 16% -hole microtiter plates containing peritoneal mouse cells as a "feeder layer". After 11 days, supernatants were removed and tested for antibody production. Of the 1,500 cultures sown in selective medium, more than 90% showed growth of hybridomas.
Sofern nicht anders angegeben, wurden für alle
ELISA-Versuche die folgenden Puffer verwendet:
Beschichtungspuffer: 0.05 M Natriumcarbonat pH 9.6
Waschmedium: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
pH 7.4 (PBS), enthaltend Tween 20 zu 0.5 g/l
Testpuffer: PBS mit Rinderserumalbumin (5 g/l) und
Tween 20 (0.5 g/l)
Substratlösung: Tetramethylbenzidindihydrochlorid
(0.1 g/l) und Natriumperborat (0.05 g/l) in
0.05 M Kaliumcitrat pH 5.0
Stopp-Lösung: 2 M Schwefelsäure.
Unless otherwise stated, the following buffers were used for all ELISA tests:
Coating buffer: 0.05 M sodium carbonate pH 9.6
Washing medium: phosphate-buffered saline pH 7.4 (PBS), containing Tween 20 at 0.5 g / l Test buffer: PBS with bovine serum albumin (5 g / l) and Tween 20 (0.5 g / l)
Substrate solution: tetramethylbenzidine dihydrochloride (0.1 g / l) and sodium perborate (0.05 g / l) in 0.05 M potassium citrate pH 5.0
Stop solution: 2 M sulfuric acid.
96-Loch-Immunoassay-Platten wurden mit Kaninchenantikörpern gegen TNF-BP I, teilweise gereinigt durch Ammoniumsulfat-Fällung (50% Sättigung), in Beschichtungspuffer bei einer Konzentration entsprechend einer 1 : 3000 Serumverdünnung (50 µl/Vertiefung, Inkubation über Nacht bei 4°C oder während einer Stunde bei 37°C) beschichtet. Die Platten wurden einmal gewaschen und eine Stunde lang mit Testpuffer bei Raumtemperatur blockiert. Daraufhin wurden Hybridomüberstände (50 µl) zusammen mit dem Antigen (50 µl, 10 µg TNF-BP 1/1 in Testpuffer) zugegeben und 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden einmal gewaschen, eine Lösung von Peroxidase-gekoppelten Kaninchenantikörpern gegen Maus-Immunglobuline (DAKO, Dänemark, Verdünnung 1 : 5000 im Testpuffer, 50 µl/Vertiefung) hinzugefügt und 2 h lang bei Raumtemperatur bebrütet. Daraufhin wurden die Platten 3×gewaschen und in jede Vertiefung 200 µl Substratlösung gegeben. Nach 20 bis 40 min wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 50 µl Stopp-Lösung unterbrochen. Die Absorption der Lösung wurde in einem ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm (Referenz: 690 nm) gemessen, wobei Kulturmedium als negative und verdünntes Mausimmunserum als positive Kontrolle verwendet wurden.96-well immunoassay plates were made with Rabbit antibodies to TNF-BP I, in part purified by ammonium sulfate precipitation (50% saturation), in coating buffer at a Concentration corresponding to a 1: 3000 serum dilution (50 µl / well, incubation overnight at 4 ° C or coated for one hour at 37 ° C). The plates were washed once and with for an hour Test buffer blocked at room temperature. Thereupon hybridoma supernatants (50 ul) together with the Antigen (50 µl, 10 µg TNF-BP 1/1 in test buffer) added and incubated for 2 hours at room temperature. The plates were washed once, a solution of Peroxidase-coupled rabbit antibodies against Mouse immunoglobulins (DAKO, Denmark, dilution 1: 5000 in the test buffer, 50 µl / well) added and Incubated for 2 h at room temperature. Thereupon were the plates washed 3 times and in each well Given 200 ul substrate solution. After 20 to 40 min the reaction by adding 50 µl stop solution interrupted. The absorption of the solution was measured in one ELISA reader at a wavelength of 450 nm (Reference: 690 nm) measured using culture medium as negative and diluted mouse immune serum as positive Control were used.
Nur zwei von den untersuchten Kulturen aus der ersten Immunisierung zeigten Antikörperproduktion (TBP-1 und TBP-2); die zweite Fusion ergab eine dritte Antikörper-positive Zellinie (TBP-6).Only two of the cultures examined from the first Immunization showed antibody production (TBP-1 and TBP-2); the second merger resulted in one third antibody positive cell line (TBP-6).
Die positiven Kulturen wurden nach ca. 25 Tagen von HAT-Medium in HT-Medium überführt, nach weiteren 10 Tagen auf normales Kulturmedium (RPMI 1640 komplett, 1% Antibiotika, 10% L-Glutamin, 10% FCS) umgestellt. The positive cultures were removed after about 25 days HAT medium transferred to HT medium, according to further 10 days on normal culture medium (RPMI 1640 complete, 1% antibiotics, 10% L-glutamine, 10% FCS).
Die positiven Kulturen wurden nach der Methode der limitierenden Verdünnung ("limiting dilution") kloniert. Dabei wurde derart verdünnt, daß 100 µl Kulturmedium 1 Zelle enthielten, worauf die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte mit diesem Volumen beschickt wurden (es wurden insgesamt 3 Platten angesetzt, die am Vortag je Vertiefung mit 100 µl Maus-Peritoneal-Makrophagensuspension beschickt worden waren). Die Kulturüberstände wurden mittels ELISA, wie oben beschrieben getestet; positive Klone jeder Kultur wurden gepoolt, expandiert und eingefroren.The positive cultures were by the method the limiting dilution cloned. It was diluted such that 100 ul culture medium contained 1 cell, whereupon the Wells of a 96-hole plate with this volume were loaded (there were a total of 3 plates the day before with each specialization 100 µl mouse peritoneal macrophage suspension had been). The culture supernatants were determined using ELISA tested as described above; positive clones every culture were pooled, expanded and frozen.
Zur Produktion von Antikörpern in vivo wurden von den Hybridomkulturen je ca. 107 Zellen intraperitoneal in BALB/c Mäuse injiziert, die 2 bzw. 3 Tage vorher mit 0.5 ml inkomplettem Freund′schem Adjuvans konditioniert worden waren. Nach ca. 10 bis 14 Tagen wurde die Ascitesflüssigkeit entnommen. Die gebildeten monoklonalen Antikörper wurden nach Ammonsulfatfällung mittels Affinitätschromatographie über trägergebundenes Protein-G gereinigt.For the production of antibodies in vivo, the Hybridoma cultures each approx. 107 cells intraperitoneally in BALB / c mice injected 2 or 3 days beforehand Conditioned 0.5 ml incomplete Freund's adjuvant had been. After about 10 to 14 days the Taken ascites fluid. The educated monoclonal antibodies were found after ammonium sulfate precipitation using affinity chromatography on carrier-bound Protein G cleaned.
Für die Antikörperproduktion in Zellkultur wurde fötales Kälberserum (FCS) durch Chromatographie auf Protein G Sepharose gereinigt, um Rinder-IgG zu entfernen; dieses Serumpräparat wurde in einer Konzentration von 5% für die Hybridomkulturen verwendet. Aus den Kulturüberständen wurden die Antikörper erneut über Protein-G-Sepharose isoliert. Alternativ wurden die Zellen in serumfreiem Medium (Serum-free and protein-free hybridoma medium, Fa. SIGMA, Kat.Nr. 5-2772; USA) gezüchtet und die Antikörper ebenso durch Chromatographie an Protein-G-Sepharose isoliert.For antibody production in cell culture fetal calf serum (FCS) by chromatography Protein G Sepharose purified to bovine IgG remove; this serum preparation was in a Concentration of 5% for the hybridoma cultures used. The culture supernatants became the Antibodies isolated again via Protein G Sepharose. Alternatively, the cells were in serum-free medium (Serum-free and protein-free hybridoma medium, SIGMA, cat.no. 5-2772; USA) bred and the antibodies also by chromatography Protein G Sepharose isolated.
Die Antikörper-Subisotypen wurden unter Verwendung von Peroxidase-gekoppelten Kaninchenantikörpern (Serotec, Oxford, GB) bestimmt: tbp-1 und tbp-6 sind IgG1-Antikörper, tbp-2 ist ein IgG2b-Antikörper.The antibody sub-isotypes were used of peroxidase-coupled rabbit antibodies (Serotec, Oxford, GB): tbp-1 and tbp-6 are IgG1 antibody, tbp-2 is an IgG2b antibody.
Im Western Blot erkannten alle drei Antikörper TNF-BP I; tbp-1 zeigte starke Reaktivität, tbp-2 reagierte schwächer, tbp-6 ergab nur eine sehr schwache Färbung.All three antibodies were recognized in the Western blot TNF-BP I; tbp-1 showed strong reactivity, tbp-2 reacted weaker, tbp-6 gave only one very weak coloring.
Zur Bestimmung der Epitope, die von den Antikörpern erkannt werden, wurden die drei Antikörper tbp-1, tbp-2 und tbp-6 sowie der von Thoma et al. (1990) durch Immunisierung mit solubilisiertem TNF-Rezeptor entwickelte Antikörper H398 an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt und mittels ELISA charakterisiert: Testplatten wurden jeweils mit einem der unmarkierten Antikörper (10 mg/l) beschichtet, worauf eine Verdünnungsserie des Antigens zugegeben und anschließend jeweils einer der Enzym-gekoppelten Antikörper aufgetragen wurde. Dieser Versuch wurde in allen möglichen Anordnungen durchgeführt (Fig. 1: A: tbp-1; B: tbp-2, C: tbp-6, D: H398. Die Symbole zeigen die Peroxidase-Konjugate: tbp-1 (gefüllte Kreise), tbp-2 (gefüllte Quadrate), tbp-6 (gefüllte Dreiecke), H398 (offene Kreise)). Es zeigte sich, daß keine der einzelnen Antikörper-Spezies in der Lage war, ein "Sandwich" zu bilden, was darauf hindeutet, daß das Antigen als Monomer vorliegt. Kombinationen der Antikörper tbp-1 mit tbp-2, tbp-6 oder H398 sowie Kombinationen von tbp-2 mit tbp-6 oder tbp-6 mit H398 waren in der Lage, dosisabhängige Signale zu geben, während tbp-2 in Kombination mit H398 nicht reagierte. Daraus wurde gefolgert, daß die Antikörper drei verschiedene Epitope auf dem TNF-BP 1-Molekül erkennen; tbp-2 und H398 binden an identische oder überlappende Epitope. Für die weitere Entwicklung wurde eine Testanordnung gewählt, in der tbp-1 den Beschichtungsantikörper und tbp-2 den Peroxidase gekoppelten Antikörper darstellt.To determine the epitopes recognized by the antibodies, the three antibodies tbp-1, tbp-2 and tbp-6 as well as that of Thoma et al. (1990) Antibody H398 developed by immunization with solubilized TNF receptor coupled to horseradish peroxidase and characterized by ELISA: Test plates were each coated with one of the unlabelled antibodies (10 mg / l), whereupon a dilution series of the antigen was added and then one of the Enzyme-linked antibody was applied. This experiment was carried out in all possible arrangements ( FIG. 1: A: tbp-1; B: tbp-2, C: tbp-6, D: H398. The symbols show the peroxidase conjugates: tbp-1 (filled circles) , tbp-2 (filled squares), tbp-6 (filled triangles), H398 (open circles)). It was shown that none of the individual antibody species was able to "sandwich", which indicates that the antigen is present as a monomer. Combinations of the antibodies tbp-1 with tbp-2, tbp-6 or H398 as well as combinations of tbp-2 with tbp-6 or tbp-6 with H398 were able to give dose-dependent signals, while tbp-2 in combination with H398 did not respond. It was concluded that the antibodies recognize three different epitopes on the TNF-BP 1 molecule; tbp-2 and H398 bind to identical or overlapping epitopes. For the further development, a test arrangement was chosen in which tbp-1 represents the coating antibody and tbp-2 represents the peroxidase-coupled antibody.
Im Hinblick auf die Anwendung der ELISAs zum Nachweis von TNF-BP I in Humanserum wurden zunächst verschiedene Medien auf ihre Eignung als Verdünnungsmedium für Proben und Standard untersucht. Während sowohl FCS als auch Kälberserum brauchbare Dosis -Wirkungskurven ergaben, zeigte gepooltes normales Humanserum einen sehr hohen Leerwert. Um zu überprüfen, ob dieses Phänomen auf unspezifische Reaktivität oder auf die Gegenwart von Antigen zurückzuführen ist, wurde humanes Serum über eine Affinitätssäule, enthaltend immobilisierten TNF-α, geschickt. Als der Durchfluß der Chromatographiesäule als Verdünnungsmedium verwendet wurde, betrug der Leerwert etwa gleich viel wie mit Kälberserum. Dies deutete darauf hin, daß normales Humanserum immunreaktives und biologisch aktives TNF-BP I enthält. Die Konzentration von TNF-BP I in dem verwendeten Serum-Pool wurde auf ca. 1 µg/l geschätzt. Standardkurven, die mit 50% Kälberserum erstellt wurden, wagen von denen mit 50% Humanserum, aus dem TNF-BP I entfernt worden war, nicht zu unterscheiden. Daher wurde das erstere Medium für alle folgenden Versuche verwendet (von allen verwendeten Lieferungen von Kälberserum, die von verschiedenen Firmen bezogen wurden, erwiesen sich nur zwei als geeignet; alle anderen zeigten niedrige Wiederfindung).With regard to the use of ELISAs for detection TNF-BP I in human serum were initially different Media for their suitability as a diluent for Samples and standard examined. While both FCS and Calf serum also has useful dose-response curves results, pooled normal human serum showed one very high blank value. To check if this Phenomenon on nonspecific reactivity or on the Presence of antigen is human Containing serum over an affinity column immobilized TNF-α. As the flow of the Chromatography column used as a dilution medium the blank value was about the same as with Calf serum. This indicated that normal Human serum immunoreactive and biologically active TNF-BP I contains. The concentration of TNF-BP I in the the serum pool used was estimated at approximately 1 µg / l. Standard curves created with 50% calf serum were daring, of those with 50% human serum from which TNF-BP I had been removed, indistinguishable. Therefore, the former became the medium for all subsequent ones Trials used (of all deliveries used from calf serum, obtained from various companies only two proved to be suitable; all others showed low recovery).
Die Etablierung und Durchführung der Tests erfolgte nach Standardmethoden.The tests were established and carried out according to standard methods.
Zunächst wurde in Vorversuchen für die Entwicklung eines Assays zur Bestimmung von TNF-BP I in Serum festgestellt, daß ein sog. "zweistufiger" Assay, das ist eine Methode, in der an die Inkubation der Probe ein Waschschritt angeschlossen wird und die Inkubation mit dem Antikörper-Enzymkonjugat getrennt durchgeführt wird, keinen Vorteil gegenüber der schnelleren und bequemeren "einstufigen" Methode bringt. In Vorversuchen wurde weiters die Konzentration des Beschichtungs-Antikörpers variiert, ebenso die Inkubationszeit für die Immunreaktion.First was in preliminary trials for development of an assay for the determination of TNF-BP I in serum found that a so-called "two-step" assay, the is a method in which to incubate the sample a washing step is connected and the incubation performed separately with the antibody-enzyme conjugate will have no advantage over the faster and brings more convenient "one-step" method. In The concentration of the Coating antibody varies, as does the Incubation period for the immune response.
Der optimierte Assay wurde für die Bestimmung von TNF-BP I im Serum wie folgt durchgeführt:The optimized assay was designed for the determination of TNF-BP I performed in serum as follows:
96-Loch-Immunoassayplatten wurden mit dem monoklonalen Antikörper tbp-1 bei einer Konzentration von 3 mg/l in Beschichtungspuffer beschichtet (über Nacht bei 4°C oder 1 h lang bei Raumtemperatur; 100 µl/Vertiefung). Die Vertiefungen wurden einmal gewaschen und die verbleibenden Bindungsstellen mit 200 µl Testpuffer 1 h lang bei Raumtemperatur blockiert. Nach einem weiteren Waschzyklus wurden die Vertiefungen der Reihen 2 und 11 mit 100 µl 50% Kälberserum/50% PBS befüllt. Eine Standardlösung TNF-BP I (vgl. Beispiel 1a, 20 µg/l in 50% Kälberserum/50% PBS, 100 µl) wurde in die Vertiefungen A2 und A11 pipettiert; serielle Verdünnungen im Verhältnis 1 : 2 wurden in den Reihen 2 und 11 direkt in den Vertiefungen vorgenommen. Alle anderen Vertiefungen erhielten 50 µl PBS, und die Serumproben wurden jeweils zweifach auspipettiert (50 µl/Vertiefung). In alle Vertiefungen wurden 50 µl einer Lösung von Peroxidase-gekoppeltem Antikörper tbp-2 in Testpuffer gegeben, nachdem in Vorversuchen die geeignete Verdünnung bestimmt worden war. (Die Kopplung der Antikörper mit Meerrettich- Peroxidase (Boehringer Mannheim) wurde nach der von Wilson und Nakane (1978) beschriebenen Methode durchgeführt). Die Platten wurden 3 h lang auf einem Platten-Schüttelgerät bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden daraufhin 3×gewaschen, Substratlösung hinzugefügt (200 µl), die Reaktion durch Zugabe von 50 µl Stopp-Lösung unterbrochen und die Absorptionswerte, wie oben angegeben, bestimmt. Die Konzentrationen von TNF-BP I in den Proben wurden mit Hilfe des Titercalc-Programms (Hewlett Packard) berechnet.96-well immunoassay plates were made with the monoclonal Antibody tbp-1 at a concentration of 3 mg / l in Coating buffer coated (overnight at 4 ° C or for 1 hour at room temperature; 100 µl / well). The wells were washed once and the remaining binding sites with 200 µl test buffer Blocked for 1 h at room temperature. After one Another wash cycle became the wells of the rows 2 and 11 filled with 100 µl 50% calf serum / 50% PBS. A standard solution TNF-BP I (cf. Example 1a, 20 µg / l in 50% calf serum / 50% PBS, 100 µl) was added to the Wells A2 and A11 pipetted; serial 1: 2 dilutions were made in rows 2 and 11 made directly in the wells. All other wells received 50 µl PBS, and the Serum samples were pipetted twice each (50 µl / well). In all the wells 50 µl of a solution of peroxidase-coupled Antibody tbp-2 placed in test buffer after in The appropriate dilution has been determined in preliminary tests was. (The coupling of the antibodies with horseradish Peroxidase (Boehringer Mannheim) was after the by Wilson and Nakane (1978) described the method carried out). The plates were placed on a for 3 hours Plate shaker incubated at room temperature. The Plates were then washed 3 ×, substrate solution added (200 µl), the reaction by adding 50 µl stop solution interrupted and the Absorbance values as determined above. The Concentrations of TNF-BP I in the samples were measured with Help from the Titercalc program (Hewlett Packard) calculated.
In analoger Weise wurde ein Assay für die Analyse von Zellkulturüberständen aufgebaut, mit dem Unterschied, daß bei der Erstellung der Eichkurve Zellkulturmedium mit einem Gehalt von 10% FCS eingesetzt und die Proben unverdünnt verwendet wurden.An assay for the analysis of Cell culture supernatants built up, with the difference that when creating the calibration curve cell culture medium containing 10% FCS and the samples were used undiluted.
Für die Bestimmung von TNF-BP I im Harn wurde eine modifizierte (zweistufige) Methode entwickelt. Die Notwendigkeit dafür ergab sich, weil der niedrige pH-Wert einiger Proben sowie andere, ungeklärte, Faktoren den Test störten. Der durch den pH-Wert bedingte Effekt konnte durch den Standard-Testpuffer aufgrund zu geringer Pufferkapazität nicht kompensiert werden. Es war ein starker Phosphatpuffer (0.5 M) erforderlich, um sicherzustellen, daß auch die sauersten Proben (pH 5) auf neutralen pH-Wert gebracht werden konnten. Diese Maßnahme war noch nicht ausreichend, weil einige Proben noch immer eine geringe Wiederfindung ergaben. Dieses Problem wurde durch Anwendung einer zweistufigen Testmethode (aufeinanderfolgende Inkubation von Proben und Konjugat) gelöst: Die Platten wurden beschichtet, blockiert und gewaschen, wie für den Serum-Assay beschrieben. Anschließend wurde eine Lösung, bestehend aus Rinderserumalbumin (5 µg/l) und Tween 20 (0.5 µg/l) in 0.5 molarem Natriumphosphatpuffer pH 7.4 in die Vertiefungen der Platte pipettiert (50 µl/Vertiefung). Die Eichkurve wurde mit derselben Lösung hergestellt. Daraufhin wurden Harnproben (50 µl/Vertiefung; 2fach-Bestimmung) hinzugefügt und die Platten auf einem Schüttelgerät 2 h lang inkubiert. Die Platten wurden anschließend gewaschen und 100 µl einer Lösung von Enzymkonjugat in Testpuffer zugegeben, worauf weitere 2 h inkubiert wurde. Die abschließende Behandlung der Platten und die quantitative Bestimmung von TNF-BP I wurden vorgenommen, wie oben für den Serumtest angegeben.One was used to determine TNF-BP I in urine modified (two-stage) method developed. The The need for this arose because of the low pH value of some samples as well as other, unsettled, Factors disrupted the test. The one by the pH conditional effect could be achieved through the standard test buffer not compensated due to insufficient buffer capacity will. It was a strong phosphate buffer (0.5 M) required to ensure that the acidic samples (pH 5) brought to neutral pH could become. This measure was not yet sufficient because some samples are still low Recovery resulted. This problem was solved by Use of a two-step test method (successive incubation of samples and Conjugate) dissolved: the plates were coated, blocked and washed as for the serum assay described. Then there was a solution from bovine serum albumin (5 µg / l) and Tween 20 (0.5 µg / l) in 0.5 molar sodium phosphate buffer pH 7.4 in the Pipette wells into the plate (50 µl / well). The calibration curve was made with the same solution. Urine samples (50 µl / well; 2-fold determination) added and the plates on one Incubate shaker for 2 h. The plates were then washed and 100 ul of a solution of Enzyme conjugate added in test buffer, followed by more Was incubated for 2 h. The final treatment of the Plates and the quantitative determination of TNF-BP I were made as above for the serum test specified.
Eine typische Eichkurve ist in Fig. 2 dargestellt (gefüllte Kreise: Serumproben; offene Kreise: Harnproben); sie erlaubt eine quantitative Bestimmung von TNF-BP I in einem Konzentrationsbereich zwischen 0.3 und 10 µg/l. Die nachweisbare Mindestmenge im Serum, definiert als Konzentration, die ein Signal entsprechend dem Blindwertsignal plus drei Standardabweichungen ergibt, wurde mit 0.2 µg/l bestimmt (Mittelwert, 4 unabhängige Assays). Bei Konzentrationen bis zu 1 mg/l (100facher Überschuß gegenüber dem normalen Testbereich) konnte kein "high-dose hook"-Effekt (Antigen im Überschuß) festgestellt werden. Die Empfindlichkeit des Tests für Harnproben war vergleichbar. Die Empfindlichkeit für Zellkulturproben liegt im Bereich von 0.1 µg/l, da diese Proben unverdünnt eingesetzt werden.A typical calibration curve is shown in FIG. 2 (filled circles: serum samples; open circles: urine samples); it allows a quantitative determination of TNF-BP I in a concentration range between 0.3 and 10 µg / l. The detectable minimum amount in the serum, defined as the concentration which gives a signal corresponding to the blank value signal plus three standard deviations, was determined to be 0.2 µg / l (mean, 4 independent assays). At concentrations up to 1 mg / l (100-fold excess compared to the normal test range), no "high-dose hook" effect (antigen in excess) was found. The sensitivity of the test for urine samples was comparable. The sensitivity for cell culture samples is in the range of 0.1 µg / l, since these samples are used undiluted.
Die Genauigkeit des Serum-Asssays wurde überprüft, indem Serumproben mit einem Gehalt an TNF-BP I bei Konzentrationen von 2 und 10 µg/l in sechs verschiedenen Tests analysiert wurden. Die Intra-Assay- Variationskoeffizienten betrugen 4.7% bzw. 5.9%; die Inter-Assay-Variationskoeffizienten 6.6% bzw. 7.5%. Die Linearität wurde bestimmt, indem eine Serie von externen Zwei Fachverdünnungen von TNF-BP I im Serum (Konzentrationen zwischen 0.3 und 10 µg/l) untersucht und die lineare Regression der experimentell bestimmten Werte gegenüber den erwarteten Werten berechnet wurde. In drei unabhängigen Versuchen wurden Korrelationskoeffizienten zwischen 0.998 und 1 erhalten.The accuracy of the serum assay was checked by adding serum samples containing TNF-BP I Concentrations of 2 and 10 µg / l in six various tests were analyzed. The intra-assay Variation coefficients were 4.7% and 5.9%, respectively; the Inter-assay variation coefficients 6.6% and 7.5%. The linearity was determined by a series of external Two specialist dilutions of TNF-BP I in serum (Concentrations between 0.3 and 10 µg / l) were examined and the linear regression of the experimentally determined Values compared to the expected values was calculated. In three independent trials Correlation coefficients between 0.998 and 1 received.
Die Wiederfindung von TNF-BP I mittels Serum-Assay wurde untersucht, indem exogenes TNF-BP I in zwei verschiedenen Konzentrationen (1 und 5 µg/l) dem Serum von 7 Normalspendern zugesetzt wurde. Dieser Versuch wurde dadurch erschwert, daß alle Proben endogenes TNF-BP I in verschiedenen Konzentrationen enthielten; diese Werte mußten daher vor der Berechnung der Wiederfindung abgezogen werden. Die durchschnittliche Wiederfindung wurde mit 83±15% bei 1 µg/l und mit 85±13% bei 5 µg/l (Bereich: 62-101% bzw. 65-105%) bestimmt.Recovery of TNF-BP I using a serum assay was examined by exogenous TNF-BP I in two different concentrations (1 and 5 µg / l) of the serum was added by 7 normal donors. This attempt was complicated by the fact that all samples were endogenous Contained TNF-BP I in various concentrations; these values therefore had to be calculated before calculating the Recovery will be deducted. The average Recovery was found with 83 ± 15% at 1 µg / l and with 85 ± 13% at 5 µg / l (range: 62-101% or 65-105%).
Die Wiederfindung von TNF-BP I mittels des modifizierten Harn-Assays in 14 Harnproben, denen exogenes TNF-BP I zugesetzt wurde, wurde analog wie für die Serumproben untersucht; die durchschnittliche Wiederfindung bei einer nominalen Konzentration von 5 µg/l betrug 83±15% (Bereich: 52-104%).The recovery of TNF-BP I using the modified urine assays in 14 urine samples, the exogenous TNF-BP I was added was analogous to that for examining the serum samples; the average Recovery at a nominal concentration of 5 µg / l was 83 ± 15% (range: 52-104%).
Um zu bestimmen, ob die physiologischen Liganden des TNF-Rezeptors die Wechselwirkung von TNF-BP I mit den Antikörpern beeinflussen, wurde der ELISA bei einer konstanten Konzentration von TNF-BP I (5 µg/l) in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen von rekombinantem TNF-α (Gray et al., 1984) und rekombinantem TNF-β (Pennica et al., 1984), jeweils aus E. coli und mit einer Reinheit von <9996, durchgeführt. Wie sich aus Fig. 3 ergibt (in C ist der Assay- Untergrund bei Fehlen von TNF-BP I dargestellt), inhibiert TNF-α die Reaktivität von TNF-BP I mit den Antikörpern bei Konzentrationen <10 µg/l; im Gegensatz dazu zeigte TNF-β keine Wirkung auch bei sehr hohen Konzentrationen (bis zu 100 mg/l).In order to determine whether the physiological ligands of the TNF receptor influence the interaction of TNF-BP I with the antibodies, the ELISA was carried out at a constant concentration of TNF-BP I (5 µg / l) in the presence of increasing concentrations of recombinant TNF -α (Gray et al., 1984) and recombinant TNF-β (Pennica et al., 1984), each from E. coli and with a purity of <9996. As can be seen from FIG. 3 (the assay background in the absence of TNF-BP I is shown in C), TNF-α inhibits the reactivity of TNF-BP I with the antibodies at concentrations <10 μg / l; in contrast, TNF-β had no effect even at very high concentrations (up to 100 mg / l).
Filtersterilisierte Proben von gepooltem Normalserum wurden 24 h lang bei verschiedenen Temperaturen gelagert; außerdem wurden die Proben mehreren Einfrier/Auftauzyklen unterworfen. Wie sich aus Tab. 1 ergibt, beeinträchtigten weder die Inkubation bei Temperaturen von 37°C noch das mehrfache Gefrieren und Wiederauftauen die Immunreaktivität von TNF-BP I. Die Proben bestanden aus gepooltem Humanserum mit einem Gehalt von endogenem TNF-BP I (Probe 1 : 1.2 µg/l) und derselben Serumprobe mit Zusatz von exogenem TNF-BP Z (Probe 2: Endkonzentration 5 µg/l). Filter-sterilized samples of pooled normal serum were at different temperatures for 24 hours stored; in addition, the samples were several Freeze / thaw cycles. As can be seen from Table 1 did not affect incubation Temperatures of 37 ° C still freezing and multiple Thaw the immunoreactivity of TNF-BP I. The Samples consisted of pooled human serum with a Content of endogenous TNF-BP I (sample 1: 1.2 µg / l) and the same serum sample with the addition of exogenous TNF-BP Z (Sample 2: final concentration 5 µg / l).
Die Versuche wurden durchgeführt, wie unter a) angegeben, wobei drei Proben untersucht wurden, die ein breites Spektrum von pH-Werten repräsentierten. Wie aus Tab. 1 hervorgeht, war TNF-BP I in allen Proben nach Gefrieren und Wiederauftauen stabil. Alle Proben konnten 24 h lang bei Temperaturen bis 37°C gelagert werden, ohne Aktivität einzubüßen. Die Harnproben stammten von drei verschiedenen Spendern (Probe 1: pH 5.1, 1.9 µg/l; Probe 2: pH 5.9, 4.0 µg/l; Probe 3: pH 7.2, 3.7 µg/l). "nd" bedeutet "nicht bestimmt".The experiments were carried out as indicated under a), whereby three samples were examined, which represented a broad spectrum of pH values. As can be seen from Table 1 , TNF-BP I was stable in all samples after freezing and thawing. All samples could be stored at temperatures up to 37 ° C for 24 hours without loss of activity. The urine samples came from three different donors (sample 1: pH 5.1, 1.9 µg / l; sample 2: pH 5.9, 4.0 µg / l; sample 3: pH 7.2, 3.7 µg / l). "nd" means "not determined".
Seren von 42 normalen Spendern (Blutspender und Laborpersonal) wurden mit Hilfe des in Beispiel 3 beschriebenen Serum-Sandwich-ELISAs untersucht. TNF-BP 1-Konzentrationen variierten zwischen 0.5 und 5.4 µg/l, bei einem Mittelwert von 2.1 µg/l (Standardabweichung 1.0 µg/l; Fig. 4). Von zwei Personen waren Serum, EDTA-Plasma, Citratplasma und Heparinplasma, gewonnen zum selben Zeitpunkt, verfügbar; die TNF-BP 1-Konzentrationen unterschieden sich nicht signifikant (Spender A: 1.7, 2.0, 1.6 und 1.9 µg/l; Spender B: 1.8, 1.8, 1.8 und 1.9 µg/l). Die TNF-BP 1-Konzentrationen in Seren von 15 Patienten mit chronischer Polyarthritis unterschieden sich nicht signifikant von denen gesunder Personen (2.3±0.79 µg/l; Bereich: 1.2-3.9 µg/l). Signifikant erhöhte Werte wurden in Seren von Patienten mit schweren Verbrennungen gefunden (6.5±1.7 µg/l; Bereich: 3.1-9.1 µg/l; n=10). Patienten mit Nierenversagen (n=6) zeigten bemerkenswert hohe Konzentrationen in einem Bereich von 20-69 µg/l (Mittelwert±Standardabweichung: 49±17 µg/l).Sera from 42 normal donors (blood donors and laboratory staff) were examined using the serum sandwich ELISA described in Example 3. TNF-BP 1 concentrations varied between 0.5 and 5.4 µg / l, with an average of 2.1 µg / l (standard deviation 1.0 µg / l; Fig. 4). Serum, EDTA plasma, citrate plasma and heparin plasma obtained at the same time were available from two people; the TNF-BP 1 concentrations did not differ significantly (donor A: 1.7, 2.0, 1.6 and 1.9 µg / l; donor B: 1.8, 1.8, 1.8 and 1.9 µg / l). The TNF-BP 1 concentrations in sera from 15 patients with chronic polyarthritis did not differ significantly from those of healthy people (2.3 ± 0.79 µg / l; range: 1.2-3.9 µg / l). Significantly increased values were found in sera from patients with severe burns (6.5 ± 1.7 µg / l; range: 3.1-9.1 µg / l; n = 10). Patients with renal failure (n = 6) showed remarkably high concentrations in a range of 20-69 µg / l (mean ± standard deviation: 49 ± 17 µg / l).
Unter Verwendung des in Beispiel 3 spezifisch für Harnproben entwickelten Sandwich-ELISA wurden die TNF-BP 1-Konzentrationen in Harnproben von 16 Normalspendern bestimmt. Sie variierten zwischen 0.78 und 4.3 µg/l (Mittelwert±Standardabweichung: 2.2±1.2 µg/l). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen weiblichen (2.1±1.4 µg/l; n = 9) und männlichen (2.2±1.0 µg/l; n=7) Spendern.Using the specific in Example 3 for The urine samples developed were sandwich ELISA TNF-BP 1 concentrations in urine samples from 16 normal donors determined. They varied between 0.78 and 4.3 µg / l (mean ± standard deviation: 2.2 ± 1.2 µg / l). There was no significant one Difference between female (2.1 ± 1.4 µg / l; n = 9) and male (2.2 ± 1.0 µg / l; n = 7) donors.
Um festzustellen, ob der entwickelte ELISA sich für den Nachweis von TNF-BP I eignet, das von humanen Zellkulturen produziert wird, wurde eine Reihe von Zellinien untersucht. Kulturmedien (mit einem Gehalt von 10% FCS) wurden von dichten Kulturen geerntet, im allgemeinen mehrere Tage nach Verdünnung mit frischem Medium oder nach Passage von adhärenten Zellen. Kulturmedium mit einem Gehalt von 10% FCS wurde als Standardverdünnungsmittel verwendet; die Assays wurden in der einstufigen Version durchgeführt. TNF-BP I war in Überständen der Zellinien A549 (Lungenkarzinom; 1.1 µg/l), HeLa (Zervixkarzinom; 0.38 µg/l) und Namalwa (Burkitt-Lymphom; 0.25 µg/l) nachweisbar, lag jedoch unterhalb der Nachweisgrenze (100 µg/l) in den Zellinien U937 (Histiozyten-Lymphom), EoL-3 (eosinophile Leukämie), Raji (Burkitt-Lymphom), HL-60 (myeloide Leukämie), U266 (Myelom) und LuKII (B-1ymphoblastoide Zellinie, immortalisiert durch Epstein-Barr Virus). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen (Lantz et al., 1990b) wurde beobachtet, daß HL-60-Zellen, die in Gegenwart von TNF-β (10 µg/l) kultiviert wurden, erhöhte Mengen von TNF-BP I freisetzten; nach 4 Tagen dieser Behandlung wurde eine Konzentration von 0.45 µg/l erreicht.To determine whether the developed ELISA is suitable for the Detection of TNF-BP I is suitable for that of human A number of cell cultures have been produced Cell lines examined. Culture media (with a salary of 10% FCS) were harvested from dense cultures, in generally several days after dilution with fresh Medium or after passage of adherent cells. Culture medium containing 10% FCS was called Standard diluent used; the assays were carried out in the one-stage version. TNF-BP I was in supernatants from cell lines A549 (lung carcinoma; 1.1 µg / l), HeLa (cervical cancer; 0.38 µg / l) and Namalwa (Burkitt lymphoma; 0.25 µg / l) was detectable, but was below the detection limit (100 µg / l) in the Cell lines U937 (histiocyte lymphoma), EoL-3 (eosinophilic leukemia), Raji (Burkitt's lymphoma), HL-60 (myeloid leukemia), U266 (myeloma) and LuKII (B-1ymphoblastoid cell line, immortalized by Epstein-Barr virus). In line with previous ones Results (Lantz et al., 1990b) have observed that HL-60 cells in the presence of TNF-β (10 µg / l) were cultivated, increased amounts of TNF-BP I release; after 4 days of this treatment, a Concentration of 0.45 µg / l reached.
Um festzustellen, ob TNF-α die Bindung der Antikörper an TNF-BP I beeinträchtigt, wurde ein einstufiger Sandwich-ELISA in mehreren verschiedenen Anordnungen durchgeführt. Dabei wurde jeweils einer der monoklonalen Antikörper als Beschichtungsantikörper zum Einfangen des Antigens, eine konstante Menge von TNF-BP I in Gegenwart von unterschiedlichen TNF-α- Konzentrationen und ein zweiter monoklonaler Antikörper, markiert mit Meerrettich-Peroxidase, verwendet. Die ELISAs wurden im wesentlichen durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben: Die Platten wurden mit 10 µg/ml Antikörper in Beschichtungspuffer beschichtet, gewaschen und mit Testpuffer blockiert. Die einstufige Inkubation mit TNF-BP I in einer Endkonzentration von 5 µg/ml (in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von TNF-α) und mit Peroxidase-gekoppeltem Antikörper wurde in Testpuffer bei Raumtemperatur während 3 h durchgeführt. Die Platten wurden daraufhin gewaschen, mit Substratlösung entwickelt, die Reaktion gestoppt und die Absorption bei 450 nm in einem Plattenleser gemessen, wobei die Absorption bei 690 nm abgezogen wurde. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 5 dargestellt: Die Tafeln A-D zeigen die Ergebnisse von Platten, die mit den Antikörpern tbp-1, tbp-2, tbp-6 bzw. H398 beschichtet waren; die Symbole stellen die Peroxidase-Konjugate der Antikörper tbp-1 (geschlossene Kreise), tbp-2 (offene Kreise), tbp-6 (geschlossene Vierecke) bzw. H398 (offene Vierecke) dar; bei C ist das Background-Signal (Abwesenheit von TNF-BP I) aufgetragen. Es zeigte sich, daß das mit Kombinationen der Antikörper tbp-1 und tbp-6 erhaltene Signal nicht einmal durch die höchsten TNF-α-Konzentrationen, die getestet wurden (10 µg/ml), beeinflußt wurde. Im Gegensatz dazu waren alle Kombinationen, die tbp-2 oder H398 enthielten, empfindlich auf TNF-α, wenn auch mit verschiedenen Dosis-Wirkung-Verhältnissen. (Diese Ergebnisse deuten darauf bin, daß H398 und tbp-2 Epitope erkennen, die mit der TNF-α-Bindungsstelle in Zusammenhang stehen, während tbp-1 und tbp-6 davon unabhängige Epitope definieren.)To determine whether TNF-α interferes with the binding of the antibodies to TNF-BP I, a one-step sandwich ELISA was carried out in several different arrangements. One of the monoclonal antibodies was used as a coating antibody to capture the antigen, a constant amount of TNF-BP I in the presence of different TNF-α concentrations and a second monoclonal antibody, labeled with horseradish peroxidase. The ELISAs were carried out essentially as described in Example 3: The plates were coated with 10 μg / ml antibody in coating buffer, washed and blocked with test buffer. The one-step incubation with TNF-BP I in a final concentration of 5 µg / ml (in the presence of different concentrations of TNF-α) and with peroxidase-coupled antibody was carried out in test buffer at room temperature for 3 h. The plates were then washed, developed with substrate solution, the reaction stopped and the absorption measured at 450 nm in a plate reader, the absorption at 690 nm being subtracted. The result of these experiments is shown in FIG. 5: the plates AD show the results of plates which were coated with the antibodies tbp-1, tbp-2, tbp-6 and H398; the symbols represent the peroxidase conjugates of the antibodies tbp-1 (closed circles), tbp-2 (open circles), tbp-6 (closed squares) and H398 (open squares); at C the background signal (absence of TNF-BP I) is plotted. It was found that the signal obtained with combinations of the antibodies tbp-1 and tbp-6 was not influenced even by the highest TNF-α concentrations that were tested (10 μg / ml). In contrast, all combinations containing tbp-2 or H398 were sensitive to TNF-α, albeit with different dose-response ratios. (These results indicate that H398 and tbp-2 recognize epitopes associated with the TNF-α binding site, while tbp-1 and tbp-6 define independent epitopes.)
Der Assay wurde mit den monoklonalen Antikörpern tbp-1 und tbp-6 für TNF-β durchgeführt, wie in a) beschrieben. Auch für TNF-β zeigte sich, daß Konzentrationen von 10 µg/ml den Assay nicht stören.The assay was carried out with the monoclonal antibodies tbp-1 and tbp-6 for TNF-β, as in a) described. TNF-β also showed that Concentrations of 10 µg / ml do not interfere with the assay.
Zytotoxischer Bioassay zur Bestimmung der biologischen Aktivität der monoklonalen Antikörper.Cytotoxic bioassay for the determination of biological Monoclonal antibody activity.
Die zytotoxische Aktivität von TNF-α wurde im wesentlichen nach der von Kramer und Carver, 1986, beschriebenen Methode bestimmt. Dazu wurden Maus-L-M- Zellen (ATCC CCL 1.2) über Nacht in Mikrotiterplatten gezüchtet, TNF-α-Präparationen wurden in seriellen Zwei Fachverdünnungen aufgegeben und Actinomycin D bei einer Endkonzentration von 1 µg/ml zugegeben. Die Platten wurden 1 bis 20 h lang bei 39°C inkubiert, die Zellen wurden mit 0.5% Kristallviolett gefärbt und die Absorption bei 540 nm bestimmt. (Zell-Kontrollen und Leerwerte wurden auf jeder Platte 4fach vorgesehen.) Definitionsgemäß enthält eine Lösung, die die Abtötung von 50% der Zellen bewirkt, 1 Einheit/ml. Unter den Assaybedingungen betrug die spezifische Aktivität des eingesetzten rekombinanten humanen TNF-α 5×107 Einheiten/mg Protein; das Referenzpräparat für TNF-α, 86/659 (NIBSC, England) mit einer festgesetzten Aktivität von 4×104 E/ml, zeigte eine Aktivität von 5×104 E/ml. Die Neutralisierungsassays wurden durchgeführt, indem Serienverdünnungen von TNF-BP I in Kulturmedium mit einer konstanten Menge TNF-α (Endkonzentration 20 E/ml) und/oder monoklonalen Antikörpern 1 h bei 37°C vorinkubiert wurden. Daraufhin wurde die Kulturflüssigkeit von der Platte entfernt und die vorinkubierte TNF-α/TNF-BP I/Antikörper-Lösung den Zellen in einer Menge von 100 µl beigegeben. Die Platten wurden inkubiert und gefärbt, wie oben beschrieben. TNF-BP I-Konzentrationen, die eine Schutzwirkung von 50% auf die Zellen zeigten (ED50), wurden graphisch ermittelt. Das Ergebnis des durchgeführten Bioassays ist in Fig. 6 dargestellt; die Symbole stellen folgende Ergebnisse dar: TNF-BP I allein (gefüllte Kreise; durchbrochene Linie), TNF-BP I in Kombination mit den Antikörpern bei 0.01 µg/ml (offene Dreiecke), 0.1 µg/ml (gefüllte Dreiecke), 1 µg/ml (offene Vierecke), 10 µg/ml (gefüllte Vierecke) oder 100 µg/ml (offene Kreise), dar.The cytotoxic activity of TNF-α was determined essentially according to the method described by Kramer and Carver, 1986. For this purpose, mouse LM cells (ATCC CCL 1.2) were grown overnight in microtiter plates, TNF-α preparations were applied in serial two-fold dilutions and actinomycin D was added at a final concentration of 1 μg / ml. The plates were incubated at 39 ° C. for 1 to 20 hours, the cells were stained with 0.5% crystal violet and the absorption at 540 nm was determined. (Cell controls and blanks were provided 4-fold on each plate.) By definition, a solution that kills 50% of the cells contains 1 unit / ml. Under the assay conditions, the specific activity of the recombinant human TNF-α used was 5 × 107 units / mg protein; the reference preparation for TNF-α, 86/659 (NIBSC, England) with a fixed activity of 4 × 104 U / ml showed an activity of 5 × 104 U / ml. The neutralization assays were carried out by pre-incubating serial dilutions of TNF-BP I in culture medium with a constant amount of TNF-α (final concentration 20 U / ml) and / or monoclonal antibodies for 1 h at 37 ° C. The culture fluid was then removed from the plate and the pre-incubated TNF-α / TNF-BP I / antibody solution was added to the cells in an amount of 100 μl. The plates were incubated and stained as described above. TNF-BP I concentrations, which showed a protective effect of 50% on the cells (ED50), were determined graphically. The result of the bioassay carried out is shown in FIG. 6; the symbols represent the following results: TNF-BP I alone (filled circles; broken line), TNF-BP I in combination with the antibodies at 0.01 µg / ml (open triangles), 0.1 µg / ml (filled triangles), 1 µg / ml (open squares), 10 µg / ml (filled squares) or 100 µg / ml (open circles).
Es wurde festgestellt, daß in Gegenwart einer konstanten Menge von TNF-α (400 pg/ml entsprechend 20 zytotoxischen Einheiten/ml) halbmaximaler Schutz bei TNF-BP I-Konzentrationen von 270±44 ng/ml (Mittelwert von 6 unabhängigen Tests) eintritt. Wenn der monoklonale Antikörper tbp-2 zusammen mit TNF-BP I zugegeben wurde, wurde die Schutzwirkung von TNF-BP I vermindert: Bei Antikörperkonzentrationen von 1, 10 oder 100 µg/ml erhöhten sich die für den halbmaximalen Schutz erforderlichen TNF-BP I- Konzentrationen auf 380, 1000 bzw. 12000 ng/ml. H398 verminderte die Schutzwirkung von TNF-BP I in ähnlichem Maße (Endwerte von 840, 3.800 und <20 000 ng/ml). (Die Behandlung der Zellen mit diesen Antikörpern in Mengen bis zu 100 µg/ml in Abwesenheit von TNF ergab keinerlei zytotoxische Wirkungen; darüber hinaus wurde festgestellt, daß die Antikörper die Zellen in Abwesenheit von TNF-BP I nicht gegen die Toxizität von TNF schützen).It was found that in the presence of a corresponding constant amount of TNF-α (400 pg / ml 20 cytotoxic units / ml) half maximum protection TNF-BP I concentrations of 270 ± 44 ng / ml (mean of 6 independent tests) occurs. If the monoclonal antibody tbp-2 together with TNF-BP I was added, the protective effect of TNF-BP I decreased: at antibody concentrations of 1, 10 or 100 µg / ml increased the for the half maximum protection required TNF-BP I- Concentrations to 380, 1000 or 12000 ng / ml. H398 reduced the protective effect of TNF-BP I in similar dimensions (final values of 840, 3,800 and <20,000 ng / ml). (Treating the cells with these Antibodies in amounts up to 100 µg / ml in the absence TNF showed no cytotoxic effects; it was also found that the antibodies the cells in the absence of TNF-BP I did not fight the Protect TNF toxicity).
Der Antikörper tbp-1 erhöhte hingegen überraschenderweise die Schutzwirkung von TNF-BP I. Bei Antikörperkonzentrationen hinunter bis zu 100 ng/ml wurden die Zellen durch TNF-BP I bei so niedrigen Dosen wie 40 ng/ml vollständig geschützt tbp-6 zeigte ähnliche, aber quantitativ geringere Aktivität (dieser Antikörper zeigte auch in den ELISAs geringere Aktivität und hat vermutlich geringere Affinität). In Gegenwart von großem Antikörperüberschuß (10 µg/ml) konnte halbmaximaler Schutz bei TNF-BP I- Konzentrationen von 7.3±0.5 ng/ml (tbp-1) bzw. 53±13 ng/ml (tbp-6), entsprechend einer ca. 40fachen bzw. 5fachen Verstärkung der Schutzwirkung (dazu wurden Titrationen in 4 Versuchen durchgeführt), festgestellt werden. In Kontrollversuchen, die bei derselben TNF-α-Konzentration in Abwesenheit von TNF-BP I durchgeführt wurden, zeigten die Antikörper keine Wirkung.The antibody tbp-1, however, increased Surprisingly, the protective effect of TNF-BP I. Bei Antibody concentrations down to 100 ng / ml the cells by TNF-BP I were at such low doses as 40 ng / ml showed fully protected tbp-6 similar but quantitatively lower activity (this Antibodies also showed lower levels in the ELISAs Activity and presumably has lower affinity). In Presence of a large excess of antibody (10 µg / ml) was able to achieve half-maximum protection with TNF-BP I- Concentrations of 7.3 ± 0.5 ng / ml (tbp-1) or 53 ± 13 ng / ml (tbp-6), corresponding to approximately 40 times or 5 times strengthening the protective effect (see titrations were carried out in 4 experiments), be determined. In control experiments carried out at same TNF-α concentration in the absence of TNF-BP I were performed, the antibodies showed no effect.
In dem Bioassay mit L-M-Zellen, der wie in a) beschrieben durchgeführt wurde, ist die zytotoxische Aktivität von TNF-β höher als die von TNF-α (300 E/ng gegenüber 50 E/ng). TNF-BP I zeigte gegen dieselbe zytotoxische Dosis von TNF-β (20 E/ml entsprechend 66 pg/ml) ebenfalls eine Hemmung des zytotoxischen Effektes, es wurden aber mindestens zehnmal so hohe Dosen benötigt (ED50 = 3.800 ng/ml, verglichen mit 270 ng/ml für TNF-α). Die Zugabe der Antikörper tbp-1 und tbp-6 (10 g/ml) verstärkte die Schutzwirkung in einem ähnlichen Ausmaß wie für TNF-α; halbmaximale Schutzwirkung wurde bei 53 ng/ml bzw. 500 ng/ml erzielt. In the bioassay with L-M cells, which, as in a) described is the cytotoxic Activity of TNF-β higher than that of TNF-α (300 U / ng versus 50 units / ng). TNF-BP I pointed against the same cytotoxic dose of TNF-β (20 U / ml accordingly 66 pg / ml) also inhibited the cytotoxic Effect, but it was at least ten times as high Doses required (ED50 = 3,800 ng / ml compared to 270 ng / ml for TNF-α). The addition of the antibody tbp-1 and tbp-6 (10 g / ml) enhanced the protective effect in an extent similar to that for TNF-α; half maximum Protective effect was at 53 ng / ml and 500 ng / ml achieved.
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Claims (26)
- a) die Probe mit trägergebundenem tbp-1 in Kontakt gebracht wird,
- b) der in a) gebildete Komplex mit tbp-2 oder einem Antikörper, der in der Lage ist, mit tbp-1 einen Antikörper/Antigen/Antikörper- Komplex zu bilden, in Berührung gebracht wird, wobei der in diesem Schritt eingesetzte Antikörper eine meßbare Markierung aufweist,
- c) die Menge des gebildeten Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexes durch Messung der Markierung bestimmt wird.
- a) the sample is brought into contact with carrier-bound tbp-1,
- b) the complex formed in a) is brought into contact with tbp-2 or an antibody which is able to form an antibody / antigen / antibody complex with tbp-1, the antibody used in this step being a has measurable marking,
- c) the amount of antibody / antigen / antibody complex formed is determined by measuring the label.
- a) die Probe mit trägergebundenem tbp-1 oder tbp-6 in Kontakt gebracht wird,
- b) der in a) gebildete Komplex mit tbp-6 oder mit tbp-1 in Berührung gebracht wird, wobei der in diesem Schritt eingesetzte Antikörper eine meßbare Markierung aufweist,
- c) die Menge des gebildeten Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexes durch Messung der Markierung bestimmt wird.
- a) the sample is brought into contact with carrier-bound tbp-1 or tbp-6,
- b) the complex formed in a) is brought into contact with tbp-6 or with tbp-1, the antibody used in this step having a measurable label,
- c) the amount of antibody / antigen / antibody complex formed is determined by measuring the label.
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