DE4026992A1 - Verfahren zur herstellung von traegersystemen fuer biologisch aktive materialien - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Trägersystemen für biologisch aktive Materialien mit kovalenter Bindung an die polymer-beschichtete Oberfläche der Trägermaterialien.

Stand der Technik

Die europäische Patentschrift Nr. 00 71 704 stellt "Oberflächenreiche Systeme zur Fixierung von nucleophile Gruppen enthaltenden Substraten" vor. Die reaktiven Einheiten zur Bindung der die nucleophilen Systeme enthaltenden Substrate sind dabei Bestandteil eines durch Emulsionspolymerisation hergestellten Polymerlatex, der aus 0,03 bis 6 µm großen Latexteilchen aufgebaut ist und wobei der Polymerlatex selbst zu einem oberflächenreichen System aggregiert und/oder an einem oberflächenreichen Trägermaterial fixiert ist.

Sofern die Verbindung der einzelnen Latexteilchen untereinander nicht durch Filmbildung erfolgt, kann bei der EP-C die Verknüpfung untereinander bzw. zum Träger durch kovalente Bindungen geschehen. Gegebenenfalls kann die kovalente Verknüpfung der Latexteilchen auch durch den Einsatz von multifunktionellen Nucleophilen verstärkt werden. Auch der Zusatz untergeordneter Mengen einer weichen, filmbildenden Substanz, z. B. Latexteilchen mit niedrigerer Glastemperatur wird erwähnt. Als besonders bevorzugt hat die Ausfällung mittels der zu fixierenden, biologisch wirksamen Einheiten selbst zu gelten. In der genannten EP werden die funktionellen Gruppen X als Bestandteile von Monomeren Z′-(R_n)-X genau definiert, wobei die Gruppen X im physiologisch sinnvollen pH- Bereich (etwa pH 5,0-9,0), bei Temperaturen unterhalb 40 Grad C und in wäßrigem Milieu mit den nucleophilen Gruppen, insbesondere den Amino-, Hydroxy- und Thiolgruppen der zu fixierenden biologisch aktiven Materialien kovalent zu reagieren vermögen.

Die DE-A 20 16 729 sieht ein Verfahren zur Herstellung unlöslicher Enzyme in aktiver Form vor, bei dem ein Mischpolymerisat mit einer Enzymlösung behandelt und eine Quervernetzung des Enzym-Polymerkomplexes und/oder eine Neutralisation der restlichen reaktionsfähigen chemischen Gruppen durchgeführt wird. Die Lehre dieser Offenlegungsschrift umfaßt die Auflösung jeglicher Partikelstruktur - soweit von der Herstellung her vorhanden - durch Auflösung der Mischpolymerisate in Lösungsmitteln. Damit entfällt die Voraussetzung für das Vorhandensein einer Partikelstruktur bei der Verfilmung. Soweit unlösliche Niederschläge oder Präcipitate den Gegenstand der Lehre bilden, sind sie nicht das unmittelbare Ergebnis des Polymerisationsverfahrens, sondern Folgeprodukte einer (externen) Vernetzung des gebildeten polymeren Materials, welche die Zugänglichkeit eher herabsetzt.

Der Stand der Technik die Immobilisierung von biologisch aktiven Materialien an polymeren Trägern betreffend, ist in nicht wenigen Übersichtsartikeln behandelt worden (vgl. Encyclopädia of Polymer Science and Engineering, Vol. 2, pg. 55 -59, John Wiley, 1985; Characterization of Immobilized Biocatalysts, Ed. K. Buchholz, Dechema-Monographien, No. 1724- 1731, Vol. 84, Verlag Chemie, 1984; Methods in Enzymology, Ed. W. B. Jokoby, Vol. 104, pg. 3-369, Academic Press, 1984; Biotechnology, Ed. H. J. Rehm & G. Reed, Vol. 7a, pg. 347-464, Verlag Chemie, 1987).

Aufgabe und Lösung

In der letztgenannten Literaturstelle wird darauf hingewiesen, daß ungeachtet des großen Angebots an Immobilisationstechniken keine spezifische Technik für sich in Anspruch nehmen kann, mit idealem Ergebnis universell anwendbar zu sein. Führt die Immobilisation zum Eingebundensein (Entrapment) der biologisch aktiven Einheiten innerhalb der Trägermatrix, dann muß mit erschwerter Zugänglichkeit infolge des Diffusionswiderstandes für die Substrate gerechnet werden; ein Effekt, der neben anderen die (scheinbare) Michaeliskonstante deutlich beeinflußt. Das klassische "Entrapping" ist daher wirkungsgemäß begrenzt auf niedermolekulare Substrate und Produkte, bei denen sich der Widerstand gegen den Massentransport in Grenzen hält. Interne Diffusionseffekte spielen verständlicherweise eine maßgebliche Rolle, wenn es sich um im Innern eines porenhaltigen Trägersystems fixierte Enzyme handelt.

In "Biotechnology" (loc. cit. pg. 353) werden die Vorteile und Nachteile poröser und nicht-poröser Träger einander gegenübergestellt. Bei nicht porösen Trägern wird der Vorteil der geringen diffusionsbedingten Beschränkungen durch den Nachteil der geringen aktiven Oberfläche und in der Folge geringen Enzymbeladung, dem Zwang zur Benutzung kleiner Trägerpartikeln und den Schwierigkeiten bei der Handhabung insbesondere im kontinuierlichen Betrieb aufgewogen.

Bei porösen Trägern schlägt zwar die große innere Oberfläche und hohe Enzymbeladung und der relative Schutz vor externer Wirkungsbeeinträchtigung zu Buche, dagegenzuhalten sind aber die mit der großen inneren Oberfläche verbundenen Diffusionsprobleme, die hohen Kosten, die u. a. mit der unabdingbaren Kontrolle der Hohlraumdimensionen zu tun haben und gegebenenfalls Flüssigkeits-Druckprobleme, die mit der Tendenz zur Gelbildung zusammenhängen.

Idealerweise sollten die biologisch aktiven Strukturen an einem Träger mit möglichst großer Oberfläche so fixiert sein, daß möglichst wenige der biologisch aktiven Strukturen von der Wechselwirkung mit den Substraten ausgeschlossen bleiben bzw. daß optimale Zutrittsmöglichkeiten für die Substratmoleküle bestehen.

Die Lösung des obengenannten europäischen Patents stellt eine Annäherung an dieses Ideal dar, insofern Träger mit großer Oberfläche zur Verfügung gestellt werden, welche die Bindungsfunktionen für die Fixierung des biologisch aktiven Materials, insbesondere von Enzymen, Antikörpern usw. in Oberflächennähe aufweisen. Eine ebenfalls interessante Lösung stellt die US-A 47 10 525 dar, die redispergierbare Polymerlatices mit Kern-Schale-Aufbau beschreibt, die in der Schale die funktionellen Gruppen zur kovalenten Fixierung der biologisch aktiven Materialien besitzen.

Es bestand dessen ungeachtet die Aufgabe, noch leistungsfähigere polymere Trägersysteme zur kovalenten Fixierung von biologisch aktiven Materialien zur Verfügung zu stellen, die eine möglichst optimale Nutzung der in der Regel teuren biologisch aktiven Materialien gewährleisten. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Trägersystemen zur kovalenten Bindung von biologisch aktivem Material mit polymer-beschichteter Oberfläche, wobei das Polymer die zur kovalenten Bindung geeigneten funktionalen Gruppen enthält, und wobei ein an sich bekanntes Supportmaterial mit einer Mischung einer filmbildenden Polymerdispersion FD und einer nicht- filmbildenden Polymerdispersion NFD beschichtet wird.

Das Supportmaterial

Als Supportmaterialien eignen sich die gemäß dem Stand der Technik entwickelten Träger (vgl. Biotechnology, Vol. 7A, loc. cit. pg. 351-367; 411-412; Dechema-Monographien, Vol. 84, loc. cit. pg. 49-72). Dabei kommen sowohl anorganische als organische Supportmaterialien in Frage. Als Träger anorganischer Provenienz seien beispielsweise genannt: Aluminiumoxid, Zirkondioxid, Magnesia, Siliciumdioxid, Glas, Mineralien in verschiedenen Modifikationen, z. B. Tone wie Attapulgit, Bentonit, sowie Kieselgur, Bimsstein u. ä., keramische Materialien, Sand, Titandioxid, Metalle, wie z. B. ferromagnetisches Material, und zwar in gepfropftem wie im ungepfropftem Zustand. Weiter sind organische Träger- Materialien natürlichen Ursprungs von Bedeutung, wie z. B. Polysaccharide (Cellulose, Dextrane, Stärke, Agar, Agarose, Alginate, Carragenate, Chitin, Chitosan) sowie Proteine wie Collagen, Gelatine, Albumin, Seide u. ä., ferner verschiedene Modifikationen der Kohle.

Als synthetische polymere Träger seien Polystyrol, Polyacrylate und -amide, Maleinsäureanhydrid- Polymere, Vinyl- und Allyl-Polymere und Polyamide genannt. Für Geometrie der Träger haben sich in der Technik gewisse Präferenzen herausgebildet. Erwähnt sei z. B. die gut zu handhabende Kugelform, etwa mit Durchmesser 1-10 mm, insbesondere um 6 mm.

In diesem Zusammenhang sind Polystyrolkugeln besonders bevorzugt.

Als beschichtbare Oberflächen im Sinne der vorliegenden Erfindung müssen aber auch diejenigen von Körpern nicht kugelförmiger oder strikt regelmäßiger Gestalt betrachtet werden, z. B. von Granulen, Sticks, sowie im Hinblick auf einen hohen Oberflächenanteil z. B. als Katalysatorträger entwickelte Massen, z. B. mit Wabenstruktur, ebenfalls Gefäßoberflächen, wie z. B. Glasoberflächen. Ferner Flächengebilde, auf Cellulose oder auch textiler (z. B. Seide)basis, z. B. beschichtete Papiere.

Im allgemeinen genügen die etablierten Supportmaterialien der Voraussetzung unter den Bedingungen der Fixierung chemisch inert (bzw. in eindeutigem Sinne aktivierbar) zu sein. Bei Anwendung für diagnostische Zwecke empfiehlt sich auch für die vorliegende Erfindung Perlen bzw. Kugeln mit ca. 0,01 bis 10 mm Durchmesser, vorzugsweise der Perlbereich 0,1 bis 0,6 mm, sowie die diagnostisch bereits verwendeten Größen 0,01-10 mm, insbesondere im Bereich 6-7 mm, einzusetzen.

Auf die Fläche berechnet sollten Flächen des Trägers von 1 mm² bis 100 cm², vorzugsweise 10 mm² bis 10 cm², zur Verfügung stehen. Bei Anwendung planer Träger kann von quadratischen oder rechteckigen Formen ausgegangen werden, es können aber auch Rundformen zur Anwendung kommen, z. B. die an sich bekannten Filterplättchen. Auch irreguläre Formen sind möglich.

Als Anforderungen, welche die erfindungsgemäß zu verwendenden Trägermaterialien mit denen des Standes der Technik gemeinsam hat; sei erwähnt: Mechanische Stabilität, insbesondere unter Scherbeanspruchung. Die Materialien sollen bei den üblichen Manipulationen wie Filtrieren, Rühren, Schütteln, sowie beim Transport und bei der Lagerung ausreichende Stabilität besitzen und keinen störenden Abrieb entwickeln. Zur Erleichterung der Handhabung ist eine Fixierung in Haltern möglich.

Die Polymerdispersionen

Die Polymerdispersionen und zwar die nichtfilmbildende Dispersion NFD wie die filmbildende Dispersion FD können in an sich bekannter Weise nach den Regeln der Emulsionspolymerisation gewonnen werden. (Vgl. H. Rauch-Puntigam, Th. Völker, "Acryl- und Methacrylverbindungen" pg. 217-230, Springer-Verlag, 1967, Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, 4. Auflage, Bd. 14/1, pg. 133-390, Georg Thieme-Verlag 1961). Die praktische Durchführung kann z. B. in Anlehnung an DE-OS 18 04 159, DE-OS 19 10 488 und DE-OS 19 10 532 erfolgen. Die gewünschte Größe der Latex-Teilchen wird praktisch durch die Emulgatorkonzentration zu Beginn der Polymerisation eingstellt. Im allgemeinen liegt die Emulgatorkonzentration zu Beginn der Emulsionspolymerisation zwischen 0,005 und 0,5 Gew.-%, bezogen auf den gesamten Polymerisationsansatz. Es ist auch möglich, die gewünschte Teilchengröße durch Zusatz einer definierten Menge eines feinteiligen Saatlatex einzustellen. Die Größe der Latex-Teilchen soll zwischen 0,03 und 6 µm liegen, vorzugsweise zwischen 0,03 und 1 µm. Als Emulgatoren können die bekannten anionischen und nichtionischen Emulgatoren verwendet werden, beispielsweise Fettalkoholsulfate und -sulfonate, -phosphate und -phosphate, Alkalisalze langkettiger Fettsäuren, langkettige Sarkoside sowie oxathylierte Fettalkohole, substituierte Phenole, die zum Teil sulfiert sein können, sowie andere in der Emulsionspolymerisation verwendete Emulgatoren (Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Bd. XIV/I, loc. cit).

Die Verwendung kationischer Tenside empfiehlt sich nur insoweit als sich diese von tertiären oder quartären Ammoniumsalzen ableiten. Des weiteren können auch einpolymerisierbare Emulgatoren verwendet werden. Als Initiatoren können ebenfalls die allgemein bei Emulsionspolymerisation üblichen verwendet werden (vgl. J. Brandrup. E. H. Immergut, "Polymer Handbook" second Edition, J. Wiley & Sons; H. Rauch-Puntigam, Th. Völker, "Acryl- und Methacrylverbindungen", Springer-Verlag 1967). Genannt seien Peroxide, Hydroperoxide, Persäuren und Azoverbindungen, z. B. Kaliumperoxidisulfat, Wasserstoffperoxid u. a. m. Die Konzentration der Initiatoren liegt in der Regel im üblichen Bereich, beispielsweise bei 0,01 bis 1,0 Gew.-%, bezogen auf die Monomeren. Der Feststoffgehalt der Dispersion kann je nach Teilchengröße zwischen 10 und 60 Gew.-% liegen.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Polymer-Dispersionen können im Prinzip aus den bekannten, der Emulsionspolymerisation zugänglichen Monomeren aufgebaut sein. Genannt seien z. B. Polymerisate auf Basis von

• - Acrylaten bzw. Methacrylaten
• - Styrol und Styrolderivaten
• - Vinylfettsäureestern wie Vinylacetat, Vinylpropionat,
• - Vinylhalogenverbindungen wie z. B. Vinylchlorid, Tetrafluorethylen
• - Vinylidenverbindungen

sowie Misch-Copolymerisate wie z. B. Copolymerisate des Styrols mit Butadien, Polyvinyliden-Copolymerisate mit Vinylacetat u. a. Im allgemeinen ist die Polymerisation radikalisch initiiert.

Das Molekulargewicht der Polymerisate (Bestimmung durch Gelpermeations-Chromatographie; vgl. Encyclopedia of Polymer Science & Engineering, Bikales, Overberger and Menges, 2nd Ed. Vol. 10, pg. 1-19; J. Wiley 1987) hat sich als nicht eigentlich kritisch erwiesen. Unter praktischen Gesichtspunkten liegen die Molekulargewichte der Polymerisate im Bereich 10 000 bis 2×10⁶, vorzugsweise oberhalb 50 000. Ein unabdingbarer Bestandteil mindestens eines der verwendeten Polymertypen ist ein Minimum an funktionalen Gruppen X, die zur kovalenten Bindung mit den biologisch aktiven Materialien geeignet sind. Vorzugsweise sind die funktionalen Einheiten X Bestandteil der nichtfilmbildenden Dispersionen NFD. Dabei kann es sich um eine aktivierbare Gruppe (Gruppe X′) handeln, die eines zusätzlichen aktivierenden Reagenzes Q bedarf, vorzugsweise ist die funktionale Gruppe X aber unmittelbar zur Reaktion mit nucleophilen Gruppen des biologisch aktiven Materials geeignet, zweckmäßigerweise unter Bedingungen, welche biologisch akzeptabel sind, d. h. welche die biologische Aktivität im Endeffekt nicht beeinträchtigen. Als derartige Bedingungen sind z. B. ein physiologisch sinnvoller pH-Bereich des wäßrigen Mediums, z. B. der pH-Bereich 5,0-9,0, insbesondere Pufferlösungen, ferner die Abwesenheit von Agenzien, welche die biologische Aktivität beeinträchtigen und ein geeigneter Temperaturbereich, der die Inaktivierung der Proteine vermeidet, z. B. unterhalb 60 Grad C, insbesondere unterhalb 40 Grad C zu betrachten.

Am Träger T befindliche Carboxylgruppen können beispielsweise analog den Methoden der Peptidsynthese mit den Aminogruppen der biologisch aktiven Materialien kovalent verknüpft werden, beispielsweise mit der Carbodiimidmethode. Amidfunktionen lassen sich mittels Glutardialdehyd aktivieren oder durch Hydrazinolyse und Diazotierung, letzteres gilt auch für Ester. Auch aromatische Aminogruppen am Träger lassen sich durch Diazotierung aktivieren. Aliphatische Aminogruppen können z. B. mittels Glutaraldehyd, mit D-Cyclopenta-dialdo-1,4-furanose oder mittels Thiophosgen kovalent mit den Aminogruppen des biologisch aktiven Materials verknüpft werden.

Für Hydroxygruppen eignet sich die Umsetzung mit halogenierten Triazinen oder mit 1,1′-Carbonyldiimidazol zur Aktivierung und bei Glykol-Konfiguration die Reaktion mit Bromcyan zum Imidocarbonat (vgl. Biotechnology, Ed. H. J. Rehm & Reed, Vol. 7a, loc. cit.).

Bevorzugt stellt, wie bereits erwähnt, die Gruppe X eine aktivierte, unmittelbar zur Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der biologisch aktiven Materialien geeignete Funktion dar.

X hat somit vorzugsweise die Bedeutung einer Sulfonsäurehalogenid-, einer Thioisocyanatgruppe, eines aktivierten Esters, einer Thiocarbonyldioxy-, Carbonylimidoyldioxy-, Haloethoxy-, Haloacetoxy-, Oxiran-, Aziridin-, Formyl-, Keto-, Acryloyl- oder Anhydridgruppe. Als Sulfonsäurehalogenide kommen die Chloride und Bromide, als Haloacetoxy die Fluoro-, Chloro- und Bromoverbindungen, als Esterkomponente der aktivierten Ester solche von Hydroxylaminverbindungen, wie des N-Hydroxysuccinimids oder des N-Hydroxyphthalimids, von (mittels elektronenanziehenden Gruppen) aktivierten Phenolen, wie von Halogenphenolen, wie Trichlorphenol oder von Nitrophenolen, von heterocyclischen Lactamen, wie Pyridon in Frage.

Besonders bevorzugt sind Oxiran-, Keto-, Formyl-, Sulfonsäurechlorid-, Thioisocyanatgruppen sowie aktivierte Carbonsäureester sowie Carbonsäureanhydride.

Die funktionalen Gruppen tragenden Monomeren entsprechen vorzugsweise der Formel

Z-(R)_n-X

worin
X die oben angegebene Bedeutung besitzt,
R für einen chemischen inerten Abstandshalter (Spacer) zwischen der funktionalen Einheit und der polymerisierbaren Einheit,
n für 0 oder 1 und
Z für eine polymerisationsfähige Einheit steht.

Größe und Typ des Abstandshalters R sind vergleichsweise unkritisch. Typische Vertreter von derartigen Abstandshaltern sind beispielsweise Alkylengruppen von C₁ bis C₂₀, vorzugsweise C₂ bis C₁₂, wobei gegebenenfalls Kohlenstoffatome durch Ätherbrücken ersetzt sein oder auch Alkylverzweigungen und/oder Substitution z. B. mit einer Hydroxyfunktion vorliegen können. Vorzugsweise ist jedoch R linear. Darüber hinaus andere ursprünglich (d. h. vor dem Einbau) bifunktionelle Gruppen enthaltende Einheiten, wobei sowohl am polymerständigen als am funktionalen Ende eine Verknüpfung über Amid-, Ester-, Äther-, Thioäther-, Harnstoff-, Urethan-, Sulfonamid- und ähnliche Gruppen erfolgen kann. Im allgemeinen bringt der Abstandhalter eine Distanz der funktionellen Gruppen X von der Polymerhauptkette im Bereich von 0,5-4 nm. In einer Reihe von Beispielen kann die Gruppe R ganz fehlen, d. h. n kann auch den Wert 0 besitzen.

Radikalisch polymerisationsfähige Einheiten I sind z. B. Vinylgruppen, wobei Z beispielsweise die Bedeutung

besitzt, worin R₁ für Wasserstoff oder Methyl bzw. für CH₂-COOR₂, CH₂-CONHR₂ oder CH₂-CON(R₂)₂ steht, wobei R₂ einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet. Des weiteren kann Z sich von der Maleinsäure ableiten:

Als reaktionsfähige und zugleich polymerisierbare Einheiten sind ferner Maleinsäureanhydrid und Itaconsäureanhydrid geeignet.

Zur Verdeutlichung des Formelschemas Z-R-X seien die folgenden Beispiele aufgeführt:

(Polymerisierbarer aktivierter Ester mit Spacer)

CH₂=C(-CH₃)-CO-O-C₆H₂Cl₃

(2,4,5-Trichlorphenylmethacrylat) R=O

CH₂=C(CH₃)-COO-CH₂-CH₂-Br

(2-Bromäthylmethacrylat)

CH₂=CH-COO-CH₂-CH₂-O-CSNH-(CH₂)₆-N=C=S

(Anlagerungsprodukt von Acrylsäure-2-Hydroxyethylester an 1,6- Hexandiisothiocyanat)

CH₂=CH-O-CO-CH₂-Cl

(Chloressigsäurevinylester)

CH₂=C(CH₃)-COO-C₆H₄-SO₂-CH₃

(4-Methylsulfinylphenyl)-methacrylat)

CH₂-CH-COO-CH₂-C=C-H

(Propargylacrylat)

Dispersionen vom Polyacrylattyp

Die Polymer-Dispersionen vom Acrylattyp sind in der Regel aufgebaut aus (Meth)acrylat-Monomeren der Formel

worin R₁ die oben bezeichneten Bedingungen besitzt und worin R₃ für einen gegebenenfalls verzweigten Alkylrest mit 1-18 Kohlenstoffatomen, insbesondere mit 1-8 C-Atomen oder einem Cycloalkylrest mit 3 bis 12 Ringgliedern steht, speziell einen Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, vor allem einen n-Butyl- oder einen 2-Ethylhexylrest steht (vgl. H. Rauch-Puntigam, Acryl- und Methacrylverbindungen, Springer Verlag, 1967, pg. 217-230).

Als im wesentlichen hydrophobe Comonomere kommen u. a. Diene wie Butadien, Chlorpropen, Isopren in Frage. Ferner können aktivierte Vinylverbindungen wie Vinylester von Fettsäuren wie Vinylacetat und Vinylpropionat, Vinylether, Allylether und Allylester, Acrolein, Vinylmethylketon, vinylgruppenhaltige Heterocyclen wie Vinylimidazol, Vinylpyrroliden, Vinylpyridin, Vinylcarbazol und Styrol und seine Derivate, insbesondere alkylierte Derivate wie α-Methylstyrol, Vinyltoluol u. ä. copolymerisiert werden, wobei jedoch darauf zu achten ist, daß die Copolymerisate in (unerwünschte) gruppenbedingte Wechselwirkungen mit den zu fixierenden, biologisch aktiven Materialien treten können. Unter dem Gesichtspunkt einer möglichen Haptenwirkung kann es z. B. in bestimmten Fällen zweckmäßig sein, von der Verwendung aromatenhaltiger Monomeren ganz abzusehen.

Im allgemeinen überwiegt der Anteil der obengenannten (Meth)acrylatmonomeren an den die Dispersion FD bzw. NFD vom Acrylattyp bildenden Polymeren. In der Regel beträgt deren Anteil über 50 Gew.-% und - sofern sie nicht-funktionalisierte Polymerkomponenten darstellen - bis zu 99,9 Gew.-%, vorzugsweise bis zu 99 Gew.-%.

Wenigstens eine der beiden Dispersionen FD und NFD enthält die bereits vorstehend beschriebenen Monomeren mit funktionalen Gruppen X oder mit aktivierbaren Gruppen X′. Der Anteil an Monomeren mit funktionalen Gruppen X an den Polymeren der Dispersionen FD bzw. NFD kann 0,1 bis 80 Gew.-% betragen. Im allgemeinen beträgt der Anteil der (Meth)acrylat-Monomeren der obigen Formel 1 bis 40 Gew.-%.

Außer den funktionalisierten Monomeren können die Polymerisate noch andere Comonomere enthalten, z. B. deutlich hydrophile Monomere, insbesondere der Formel

worin R₁ die oben bezeichneten Bedeutungen besitzt und Q für die Reste -CH, COOR₄, worin R₄ Wasserstoff-, Natrium-, Kalium- oder Ammoniumionen bedeutet oder

worin R₅ und R₆ für Wasserstoff oder für einen R₃ entsprechenden Alkylrest stehen oder unter Einbeziehung des Stickstoffatoms einen, gegebenenfalls noch weiteren Stickstoff oder Sauerstoff enthaltenden, 5- oder 6gliedrigen Heterocyclus bilden oder für einen gegebenenfalls verzweigten Alkylrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, der mindestens eine, vorzugsweise endständige -OH- oder -NR₅R₆-Gruppe mit den oben bezeichneten Bedeutungen aufweist.

Der Anteil der hydrophilen Monomeren an den Polymerisaten, die gegebenenfalls verbesserte Haftfestigkeit und verbesserte Eignung bei spezialisierten Anwendungen mit sich bringen können, liegt, sofern überhaupt vorhanden, bei 0,5 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise bei 1 bis 20 Gew.-% (bezogen auf die eingesetzten Monomeren).

Neben den oben beschriebenen Monomerkomponenten können die Polymerisate noch vernetzende Monomere enthalten. Unter "vernetzende Monomeren" werden wie üblich z. B. solche Monomere verstanden, die zwei oder mehrere reaktive Doppelbindungen im Molekül enthalten, wie z. B. mit der Acrylsäure oder vorzugsweise der Methacrylsäure veresterte Di- oder Polyole sowie Allylverbindungen, wie z. B. Allylmethacrylat, Triallylcyanurat u. a.

Genannt seien z. B. Ethylenglykoldimethacrylat, 1,4- Butandioldimethacrylat, Triglykoldimethacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat.

Der Anteil an Vernetzer liegt in der Regel zwischen 0 und 50 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20, insbesondere 5-20 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtheit der Monomeren. Der Gehalt der Dispersionen FD bzw. NFD an Polymerisat liegt in der Regel bei 10 bis 60 Gew.-%.

Dispersionen vom Polystyroltyp

Die Herstellung von Styroldispersionen ist in Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, 4. Auflage, Bd. XIV/1, Georg Thieme Verlag, 1961, S. 834-839, ausführlich beschrieben. Als Emulgatoren eignen sich insbesondere die Fettseifen, wie z. B. Natriumoleat, ferner Harzseifen sowie Alkylsulfonate und kationenaktive Emulgatoren, normalerweise in Mengen von 2 bis 6 Gew.-% bezogen auf die Wassermenge.

Als Initiatoren kommen auch hier vor allem wasserlösliche z. B. vom Typ der Peroxydisulfatsalze in Frage, ferner Redoxsysteme, gewöhnlich in Mengen von 0,01 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf die Monomeren. Als Regler können die üblicherweise verwendeten, z. B. Schwefelregler angewendet werden, normalerweise in Mengen von 0,05 bis 2 Gew.-% bezogen auf die Monomeren.

Vorteilhaft wählt man für die Startreaktion mit Peroxydisulfaten ein schwach saures Milieu (pH 3-6). Vorteilhafterweise bemüht man sich bei der Polymerisation um den Ausschluß von Luftsauerstoff, z. B. durch Arbeiten unter einem Schutzgas wie Stickstoff.

Als Comonomeren für Styrol bzw. die an sich bekannten radikalisch polymerisationsfähigen Styrolderivaten können die unter "Dispersionen vom Acrylattyp" genannten Monomeren zur Anwendung kommen, wobei sinngemäß die Rolle der (Meth)acrylatmonomeren durch Styrol und/oder seine Derivate übernommen wird und umgekehrt.

So wird im allgemeinen der Anteil an Styrol bzw. Styrolderivaten an den Polymeren mehr als 50 Gew.-% und bis zu 100 Gew.-% betragen. Von Interesse sind insbesondere auch Copolymerisate vom Styrol-Butadientyp. Beim Styrol-Butadientyp kann in bekannter Weise ausgehend von einem 1 : 1-Gew.- Verhältnis durch Variation der Anteile das Eigenschaftsspektrum in Richtung "härter" (höherer Styrolanteil) oder "weicher" verschoben werden (vgl. zum Beispiel Houben-Weyl, 4. Auflage, loc. cit. Bd. XIV/1, pg. 147, 327).

Dispersionen vom Polyvinylfettsäureester-Typ

Als Monomere dieses Typs kommen solche der Formel

in Frage, worin R₇ für einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere 1 bis 2 Kohlenstoffatomen steht, d. h. Vinylacetat und -propionat.

Als Comonomere kommen beispielsweise gegebenenfalls halogenierte Olefine wie Ethylen, Vinylchlorid, andere Vinylester wie Vinylphosphonsäurediester, (Meth)acrylate der bereits genannten Art (s. Dispersionen vom Polyacrylattyp) (Meth)acrylnitril u. ä. (vgl. Houben-Weyl, loc. cit. 4. Auflage, Bd. 14/2, pg. 704, Bd. 14/1, pg. 911-918). Die Polymerisation lehnt sich im allgemeinen an die bereits genannten Verfahren an, beispielsweise in bezug auf die Emulgatoren, Initiatoren und Regler. Vorteilhaft ist die Polymerisation im pH-Bereich 4 -5.

Von besonderem Interesse sind Polyvinyliden-Copolymerisate.

Dispersionen vom Polyvinylhalogentyp

Als Monomere dieses Typs kommen vor allem Vinylchlorid und insbesondere Vinylidenchlorid in Frage (Houben-Weyl, loc. cit. pg. 887, 891-905). Als Acrylat-Komponenten seien der Acrylsäuremethylester, -ethylester, -butylester, -octylester, -nonylester, -2-ethylhexylester, -3,5,5-trimethylhexylester sowie der Methacrylsäuremethylester und das Methacrylsäureamid genannt. Im allgemeinen beträgt der Anteil an Comonomeren vom Acrylattyp und/oder an (Meth)acrylnitril, Vinylester (oder Vinylchlorid) bei den Vinyliden-Copolymeren 10-20 Gew.-%, wobei die Erweichungstemperatur i. a. auf einen erwünschten Wert sinkt.

Auch die Polymerisation der halogenierten Vinylverbindungen schließt an die bereits erwähnten Verfahrensweisen an. Als Emulgatoren eignen sich insbesondere Alkalisalze von Fettsäuren bzw. Alkyl- oder Acrylsulfonaten sowie nichtionogene Polyethylenoxid-Emulgatoren. Als Initiatoren eignen sich übliche Perverbindungen, insbesondere Redoxinitiatoren.

Die filmbildende Dispersion FD

Die filmbildende Dispersion FD zeichnet sich dadurch aus, daß im Zuge der Trocknung, d. h. während des Verdampfens des flüssigen Mediums, in der Regel eines wäßrigen Mediums, die Glastemperatur Tg überschritten wird.

Die Glastemperatur Tg ist in erster Näherung mit der Glastemperatur des getrockneten Polymerisats gleichzusetzen, solange das Polymerisat kein hydroplastisches Verhalten zeigt, d. h. aufgrund seiner Zusammensetzung durch Wasser weichgemacht wird. (Die Glastemperatur Tg eines Copolymerisats läßt sich aus den Beiträgen der Monomeren ableiten [vgl. R. Vieweg, F. Esser, Kunststoff-Handbuch, Bd. IX, Polymethacrylate, pg. 333-342, Carl Hanser Verlag, 1975; H. F. Mark et al., Ed. Encyclopedia of Polymer Science & Technology, Vol. 7, pp. 531, 544, John Wiley, 1987; T. G. Fox, Bull. Am. Phys. Soc., 1, 123, 1956]).

Im allgemeinen genügt jedoch die Kenntnis der minimalen Filmbildungstemperatur MFT zur Auswahl geeigneter Polymerdispersionen bzw. der darin enthaltenen Monomeren. Im Einklang mit dem Wissen des Fachmanns (demzufolge die MFT die maßgebliche Kenngröße für die Filmbildungseignung einer Polymerdispersion darstellt, deren Wert [in Grad C] bei der Trocknung überschritten werden muß), ist die MFT der filmbildenden Dispersion FD zweckmäßig unter 60 Grad C, vorzugsweise <40 Grad C, insbesondere <30 Grad C anzusetzen.

Die Bestimmung der MFT wird nach DIN 35 787 vorgenommen. Besonders bevorzugt sind filmbildende Dispersionen FD auf Basis von (Meth)acrylat-Dispersionen, die den oben erläuterten Bedingungen genügen (vgl. Houben-Weyl, 4. Auflage, Bd. XIV/1, loc. cit. pg. 1048).

Die filmbildende Dispersion FD kann aus den vorstehend erläuterten Polymerklassen ausgewählt werden, vorausgesetzt, das Polymer genügt den vorstehend dargelegten Regeln. In der Praxis wird die Glastemperatur Tg der Polymeren den Wert 30 Grad C nicht überschreiten, d. h., es handelt sich um relativ "weiche" Polymerisate. (Werte für die Glastemperaturen Tg von Homopolymerisaten finden sich z. B. in Brandrup-Immergut, Polymer Handbook, 2nd, Ed. J. Wiley). Durch Copolymerisation entsprechender Monomerer läßt sich ein weites Spektrum von Latices mit kontinuierlich abgestuften Filmhärten herstellen. Besonders genannt seien Dispersionen FD mit folgender Polymerzusammensetzung: Methacrylsäureester von C₁-C₄- Alkoholen, insbesondere Methylmethacrylat in Anteilen von 20 bis 80 Gew.-%, speziell 20-60 Gew.-%, sowie Acrylsäureester von C₁-C₄-Alkoholen in Anteilen von 80 bis 20 Gew.-% bezogen auf die Gesamtheit des Polymeren.

Die nicht-filmbildende Dispersion NFD

Die wäßrige nicht-filmbildende Dispersion hat die grundlegende Eigenschaft, daß die Einfriertemperatur der Polymerisate über der Filmbildungstemperatur liegt. Nach üblichem Sprachgebrauch kann man das Polymerisat der nicht- filmbildenden Dispersion als "hart" bezeichnen. Voraussetzung dafür ist das Überwiegen sogenannter "harter" Monomerer, ablesbar an den Erweichungspunkten der Homopolymerisate (vgl. Houben-Weyl, 4. Auflage, loc. cit. Bd. XIV/1, pg. 1034). Polymethacrylsäureester sind bekanntlich "härter" als Polyacrylsäureester. Die "Härte" nimmt mit steigender Größe der Alkoholreste zunächst ab und steigt dann nach dem n- Dodecyl in der Methacrylesterreihe und dem n-Octylester in der Acrylesterreihe wieder an. Als "harte" Monomere haben z. B. das Methylmethacrylat und das Styrol und seine Derivate zu gelten.

Alternativ zu der Anwendung "harter" Monomerer, etwa vom Typ des Methylmethacrylats oder des Styrols und seiner Derivate kann die nicht-filmbildende Dispersion auch so aufgebaut sein, daß an sich "weiche" Monomere mit höheren Gehalten an vernetzenden Monomeren, beispielsweise mit mindestens 5 Gew.-% und bis zu 50 Gew.-% kombiniert werden. Solche Polymerisate bilden keine geschlossenen Filme aus.

Vorzugsweise stellen die nicht-filmbildenden Dispersionen NFD Polymere mit <60 Gew.-% "harter" Monomerer wie Methylmethacrylat bzw. Styrol und seiner Derivate dar. Der Gehalt der Dispersionen an Polymerisat liegt in der Regel im Bereich 10 bis 60 Gew.-%.

Die nichtfilmbildende Dispersion NFD weist im allgemeinen Teilchengrößen im Bereich von 0,03 bis 5 µ, vorzugsweise 0,1 bis 2 µ, auf. Die filmbildende Dispersion FD hat im allgemeinen Teilchengrößen im Bereich von 0,02 bis 5 µ, vorzugsweise 0,04 bis 0,5 µ. Die Bestimmung der Teilchengröße wird mit Hilfe der Photonenkorrelationsspektroskopie mit dem Nano-Sizer TDM der Firma Coulter Electronics, Ltd., Luton Beds., vorgenommen. Als eine praktische Bemessungsregel kann gelten, daß die Teilchen der nicht-filmbildenden Dispersion jeweils im Durchschnitt um einen Faktor 1,2 bis 20 größer sein sollen als die der filmbildenden Dispersion, vorzugsweise 1,5- bis 10mal, speziell 2- bis 5mal so groß.

Das quantitative Verhältnis der beiden Dispersionstypen bei der erfindungsgemäßen Anwendung liegt vorteilhafterweise bei 50 : 50 Gew.-Teile bis 99 Gew.-Teile nicht-filmbildende Dispersion NFD zu 1 Gew.-Teil filmbildende Dispersion FD, insbesondere 60 Gew.-Teile NFD zu 40 Gew.-Teile FD bis 95 Gew.-Teile NFD zu 5 Gew.-Teile FD, speziell 65 Gew.-Teile NFD zu 35 Gew.-Teile FD bis 90 Gew.-Teile NFD zu 10 Gew.- Teilen FD bezogen auf das trockene Polymerisat. Daraus läßt sich der folgende überraschende Befund ableiten: Der aus theoetischen Betrachtungen abgeleitete Wert für eine sinnvolle Obergrenze der filmbildenden Polymerkomponente (FE- Polymer) im Gemisch liegt bei ca. 26 Vol.-%. (In erster Näherung können für die hier vorliegende Betrachtung Vol.-% und Gew.-% gleichgesetzt werden.)

Mit wachsendem Unterschied in der Teilchengröße ist zu erwarten, daß sich das real existierende System der Idealform der dichtesten Kugelpackung der NFD-Teilchen annähert, wobei die FD-Teilchen in den Zwickeln sitzen. Daher wäre zu folgern, daß mit steigendem Faktor im Verhältnis der Teilchengröße der Anteil der filmbildenden Komponente unter die theoretisch anzunehmende Grenze von 26 Vol.-% zu senken ist im Interesse der Bildung eines porösen Materials bzw. um das völlige Ausgefülltwerden der geometrisch möglichen Hohlräume zu vermeiden. Faktisch hat es sich aber gezeigt, daß der obengenannte Wert von ca. 26 Vol.-% an FD-Polymer drastisch überschritten werden kann, ohne daß der Ausschluß-Effekt eintritt, vermutlich weil das real existierende System von der Idealform der dichtesten Kugelpackung signifikant abweicht.

Herstellung der Trägersysteme

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Trägersysteme zur kovalenten Bindung von biologisch aktivem Material geschieht durch Beschichtung des Supportmaterials mit einer Mischung der filmbildenden Polymerdispersion FD und der nicht-filmbildenden Polymerdispersion NFD, vorzugsweise in den oben angegebenen Verhältnissen. Die Beschichtung kann in an sich bekannter Weise, z. B. durch Sprühen oder Tauchen, vorgenommen werden, vorzugsweise im Gemisch, aber auch der Einzelauftrag ist möglich (sequentielles Sprühen).

Besonders bewährt hat sich beispielsweise das Aufbringen des Dispersionsgemisches mittels einer Sprüheinrichtung. Eine besonders günstige Ausführungsform sieht das Versprühen der Dispersionsgemische auf perl- oder kugelförmiges Supportmaterial (s. dort), vorteilhafterweise in einer Dragiertrommel unter gleichzeitiger Zuführung von Luft, vor.

Die Beschichtung kleinerer Teilchen erfordert eine besonders intensive Trocknung, so daß ein Verkleben der Teilchen vermieden wird. Dafür eignen sich spezielle Geräte mit hohem Luftdurchsatz, z. B. Wirbelschichtgeräte oder Coatingapparaturen mit durchlöcherten Trommeln. Für den Überzugsprozeß sind die Verfahrensparameter, z. B. Sprühgeschwindigkeit, Zuluftmenge, Zuluftparameter, den jeweiligen Eigenschaften von Kernmaterial und Dispersionsmischung anzupassen.

Ausgehend von einer Definition "Schicht" gleich "Dicke eines Monolayer" haben sich folgende Bemessungsgrenzen bewährt: ca. eine Schicht bis 1000 Schichten, bevorzugt eine Schicht bis 100 Schichten. Als Daumenregel kann man auch das Verhältnis der Massen von Supportkörper und Beschichtung anwenden, demzufolge ein Massenverhältnis Supportmaterial zu Beschichtung (in getrocknetem Zustand) von 1 : 50 bis 10 000 : 1 zu brauchbaren Resultaten führt.

Die biologisch aktiven Materialien

Die biologisch aktiven Materialien, deren Fixierung an festen Trägern unter vielerlei Gesichtspunkten in Wissenschaft und Technik betrieben wird, fallen in viele verschiedene Klassen. So ist beispielsweise eine Einteilung nach chemischen Gesichtspunkten möglich, z. B. nach funktionalen Gruppen, wie in Aminosäuren, Peptiden und Proteinen, in Nucleoside, Nucleotide und Polynucleotide (Saccharide), wobei - wie ersichtlich wiederum - nieder- und hochmolekulare Verbindungstypen zu unterscheiden wären.

Besonderes Interesse können polymere Verbindungen beanspruchen, an erster Stelle Proteine, Lipoproteine, Polysaccharide (Mucopolysaccharide), Nucleinsäuren wie DNA und RNA, Lipoide.

In vielen Fällen wird durch die Art der funktionalen Gruppen auch die Auswahl der zur Verfügung stehenden Fixierungsmechanismen wie z. B. kovalent, polar (ionisch), komplexchemisch, hydrophob oder durch Occlusion bestimmt. Des weiteren ist eine Einteilung nach der biologischen Wirksamkeit sinnvoll: Danach lassen sich z. B. Biokatalysatoren wie Enzymkomplexe, Blutfaktoren, Hormone (Messenger- Substanzen), immunologisch aktive Materialien wie Antigene und Antikörper (z. B. Monoclonale Antikörper) unterscheiden.

Weiter sind der Fixierung auch morphologisch (und meist auch funktionell) definierbare Einheiten zugänglich wie Organellen, z. B. Mitochondrien, Viren, ganze Zellen und Zellbestandteile, Zellhybride, z. B. Bakterienzellen, eukariotische Zellen u. ä. Schließlich bietet sich auch eine Klassifizierung der immobilisierten Materialien nach der vorgesehenen technischen Verwendung an. So ist z. B. außer der Anwendung von Biokatalysatoren der Einsatz in der Diagnostik und in der (Affinitäts)chromatographie von Interesse.

Die immobilisierten Biokatalysatoren können z. B. zur Produktion bzw. der Umwandlung sehr verschiedenartiger Substrate wie Aminosäuren, Peptide und Enzyme von Zuckern organischen Säuren, Antibiotika, Steroiden, Nucleosiden und Nucleotiden, Lipiden, Terpenoiden und organischen Grundchemikalien dienen (vgl. Ullmann, 5. Auflage, Bd. 9A, loc. cit. S. 389-390).

Als immunologisch aktive Materialien seien z. B.:
Mikroorganismen, wie gram-positive und gram-negative Bakterien, Spirochäten, Mycoplasma, Mycobacterien, Vibrionen, Actinomyceten, Protozoen, wie intestinale Protozoen, Amöben, Flagellaten, Sporozoen, intestinale Nematoden und Gewebenematoden (Würmer), Trematoden (Schistosomen, Egel), Cestoden, Toxoplasma, sowie Pilze, wie Sporotrichum, Cyptocoecus, Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides, Candida, Viren und Rickettsien, wie Hunde-Hepatitis, Shope-Pappillome, Influenza A+B, Hühnerpest, Herpes-Simplex, HIV, Adenoviren, Polyane, Rous-Sarkom, Impfpocken, Pliovirus, Masern, Hundestaupe, Leukämie, Mumps, Newcastle-Krankheit, Sendai, ECHO, Maul- und Klauenseuche, Psittacosis, Rabies, Extromelia, Baumviren, weiter Gewebe-Antigene, Enzyme, wie Pancreas- Chymotrypsinogen, Procarboxypeptidase, Glucose-Oxidase, Lactatdehydrogenase, Uricase, Aminosäure-Oxidase, Urease, Asparaginase, Proteasen, Blutzellen-Antigene, Blutgruppensubstanzen und andere Isoantigene, wie Blutplättchen, Leucozyten, Plasma-Proteine, Milch-Proteine, Speichel-Proteine, Urin-Proteine, Antikörper einschließlich Auto-Antikörper genannt. Erwähnt seien insbesondere monoklonale Antikörper, die gegen Antigene beispielsweise der folgenden Art gerichtet sind.

Antigen-Klassen
antigen
Bakteriell
Tetanus-Toxoid, H. influoenza Typ b Polysaccharid, Diphterie-Toxin, Chlamydia trachomatis, M. leprae, Lipopolysaccharid/Endotoxin, Pneumokokken, LPS von P. aeruginosa, Exotoxin von P. aeruginosa, Streptokokken Gruppe A Kohlehydrat
Viral	X31 Influenza-Virus-Nukleoprotein, Masern-Virus, HSV Glykoprotein D, Masern-Virus, Nukleocapsid, Zytomegalie-Virus, Influenza-A-Viren, Röteln-Virus-Antigene, HTLV I, Varizella-Zoster, HBsAg
Autoimmun	doppelsträngige DNA, Inselzellen (Diabetes mellitus), Myasthenia gravis, Antiidiotypen, Thyreotropin-Rezeptor, Rheuma-Faktor, Acetylcholin-Rezeptor, Schilddrüse, Sperma
Tumor	Mamma-Ca, Prostata-Ca, Lungen-Ca, Magen-Ca, Melanom, BD2 (humanes Melanom), Gliom, Rectum-Ca, Leukämie, Cervix-Ca
Gewebe/Blut	Rhesus D, Blutgruppenantigen A, HLA-A, B, C, DR, Intermediäre Filamente
Andere	Malaria, Forssman-Antigen, Schaferythrozyten, Nitrophenol, Dinitrophenol, Trinitrophenol, Keyhole limpet hemocyanin (KLH), Rheumafaktor, Insulin

Besonders genannt seien die Immunoglobuline aller Klassen, speziell die oligomeren Typen, insbesondere IgM, IgE und IgA.

Die Fixierung der biologisch aktiven Materialien - kovalente Fixierung

Die kovalente Fixierung der biologisch aktiven Materialien setzt das Intaktsein der reaktiven Gruppen X in den Polymerisaten der Dispersionen FD und NFD und somit eine entsprechend schonende Herstellung und Handhabung voraus. Eine solche schonende Herstellung wird z. B. in der EP-A 00 71 704 beschrieben.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiele Beispiel 1 a) Herstellung eines Saatlatex für Polymerdispersionen Saatlatex A

In ein 2-l-Polymerisationsgefäß, ausgestattet mit Rückflußkühler, Rührer und Thermometer, gibt man

2,90 g Methylmethacrylat
2,90 g Isobutylmethacrylat
0,30 g Glykoldimethacrylat
3,60 g Ammoniumperoxydisulfat
0,72 g Natriumlaurylsulfat

in 1482 g doppeldestilliertem Wasser und erwärmt auf 80 Grad C. Zu diesem Gemisch gibt man eine Mischung aus

171,00 g Methylmethacrylat
171,00 g Isobutylmethacrylat
 18,00 g Glykoldimethacrylat

bei 80 Grad C während 2 Stunden tropfenweise unter Rühren zu. Das Rühren bei 80 Grad C wird noch zusätzlich 2 Stunden lang fortgesetzt. Dann wird das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Man erhält eine Dispersion, die im wesentlichen frei von Koagulat ist mit einem Feststoffgehalt von ca. 20 Gew.-%, einer Viskosität (bestimmt nach DIN 53 018) von 4 mPa · s und einem durchschnittlichen Partikalradius von 120 nm (bestimmt mit "Coulter Nanosizer").

b) Herstellung eines Saatlatex für Polymerdispersionen

In einem Witt'schen Topf wurde die Vorlage unter Rühren auf 80 Grad C erhitzt, der Initiator (Ammoniumperoxodisulfat oder das Natriumsalz der 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure)) zugegeben und anschließend der Zulauf als Emulsion oder Monomerengemisch innerhalb einer bestimmten Zeit zudosiert. 15 min nach Zulaufende wurde die Dispersion auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert.

Saatlatex B

Vorlage:
1478,0 g Wasser
   2,9 g Isobutylmethacrylat
   2,9 g Methylmethacrylat
   0,3 g Glykoldimethacrylat
   3,6 g Ammoniumperoxodisulfat

Zulauf (über 20 min):
168,1 g Isobutylmethacrylat
168,1 g Methylmethacrylat
 17,7 g Glykoldimethacrylat

Feststoffgehalt: 21,1 Gew.-%; pH = 2,4; Viskosität: 5 mPa · s; Teilchendurchmesser: 480 nm.

Saatlatex C

Es wurde verfahren wie in Beispiel 1b), nur:

Vorlage:
1485,0 g Wasser
   0,72 g Natriumlaurylsulfat
   3,6 g Ammoniumperoxodisulfat

Feststoffgehalt: 21,4 Gew.-%; pH 2,3; Viskosität 5 mPa · s; Teilchendurchmesser: 270 nm.

Saatlatex D

Vorlage:
427,0 g Wasser
540,0 g Saatlatex B
  9,0 g Titrisollösung pH 7 (Merck)
  0,35 g 4,4′-Azobis-(4-canovaleriansäure), Na-Salz

Zulauf:
585,0 g Wasser
  0,88 g Natriumlaurylsulfat
  2,12 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
119,7 g Isobutylmethacrylat
119,7 g Methylmethacrylat
 12,6 g Glykoldimethacrylat

Feststoffgehalt: 21,2 Gew.-%, pH = 62,2, Viskosität: 5 mPa · s; Teilchendurchmesser: 730 nm.

Beispiel 2 Herstellung der filmbildenden Polymerdispersion FD mit Epoxygruppen als funktionalen Gruppen X

Zu einem 2-l-Polymerisationsgefäß mit Rückflußkühler, Rührer und Thermometer wird eine Lösung, bestehend aus

  7,50 g Phosphatpuffer, pH = 7,0
  0,29 g Natriumsalz der 4,4′-Azobis-(4-cyano)-Valeriansäure
  0,48 g Natriumlaurylsulfat
150,00 g eines Saatlatex gemäß Beispiel 1 (= Saatlatex A)
275,00 g destilliertes Wasser

hergestellt und auf 80 Grad C erwärmt.

Zu dieser Lösung gibt man tropfenweise und unter Rühren eine Emulsion bestehend aus

210,00 g Ethylacrylat
 75,00 g Methylmethacrylat
 15,00 g Glycidylmethacrylat
  1,76 g Natriumsalze der 4,4′-Azobis-(4-Cyano)valeriansäure
  0,73 g Natriumlaurylsulfat und
933,00 g destilliertes Wasser bei 80 Grad C innerhalb 4 St.

Die Dispersion rührt man weitere 15 Minuten, läßt auf Raumtemperatur abkühlen und filtriert. Man erhält eine völlig koagulatfreie Dispersion mit einem Feststoffgehalt von ca. 20 Gew.-%, einem pH-Wert von 7,0, einer Viskosität von 6 mPa · s und einem durchschnittlichen Partikelradius von ca. 240 nm.

Beispiel 3 Herstellung einer nichtfilmbildenden wäßrigen Polymerdispersion NFD mit Epoxygruppen als funktionalen Gruppen X

In ein Polymerisationsgefäß, wie in Beispiel 1 beschrieben, gibt man ein Gemisch aus

  7,50 g Phosphatpuffer pH = 7,0
  0,29 g Natriumsalz der 4,4′-Azobis-(4-cyano)-Valeriansäure
 30,00 g Saatlatex A gemäß Beispiel 1

und 340 g doppelt destilliertes Wasser und erwärmt auf 80 Grad C. Zu dieser Mischung gibt man während 4 Stunden bei 80 Grad C eine Emulsion, hergestellt aus

180,00 g Methylmethacrylat
105,00 g Ethylacrylat
 15,00 g Glycidylmethacrylat
  1,76 g Natriumsalz der 4,4′-Azobis-(4-cyano)-Valeriansäure
  0,73 g Natriumlaurylsulfat
865,00 g doppelt destilliertes Wasser

Die Dispersion wird weitere 15 Minuten bei 80 Grad C gerührt, wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Man erhält eine koagulatfreie Dispersion mit einem Feststoffgehalt von ca. 20 Gew.-% und einen pH-Wert von 7,0, einer Viskosität von 6 mPa · s und einen Partikelradius von ungefähr 400 nm.

Beispiel 4 Herstellung einer filmbildenden Polymerdispersion FD mit Epoxygruppen als funktionalen Gruppen X

Vorlage:
272,0 g Wasser
  0,48 g Natriumlaurylsulfat
  7,5 g Titrisollösung pH 7 (Merck)
150,0 g Saatlatex C
  0,29 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz

Zulauf (über 240 min):
932,0 g Wasser
  0,73 g Natriumlaurylsulfat
  1,76 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
210,0 g Ethylacrylat
 75,0 g Methylmethacrylat
 15,0 g Glycidylmethacrylat

Feststoffgehalt: 20,2 Gew.-%, pH = 7,3; Viskosität 5 mPa · s; Teilchendurchmesser 560 nm, MFT: 5 Grad C.

Beispiel 5 Herstellung einer nichtfilmbildenden Polymerdispersion NFD mit epoxygruppenhaltigen funktionalen Gruppen X

Der Zulauf besteht aus Emulsion 1 und Emulsion 2 im Verhältnis 70 : 30, die nacheinander zugetropft werden.

Vorlage:
407,0 g Wasser
  9,0 g Tritrisollösung, pH 7 (Merck)
 36,0 g Saatlatex C
  0,35 g 4,4-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz

Emulsion 1 (über 168 min):
726,0 g Wasser
  0,61 g Natriumlaurylsulfat
  1,48 g 4,4-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
163,8 g Methylmethacrylat
 75,6 g Ethylacrylat
 12,6 g Allylmethacrylat

Emulsion 2 (über 72 min):
311,0 g Wasser
  0,27 g Laurylsulfat
  0,64 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
 64,8 g Ethylacrylat
 43,2 g Glycidylmethacrylat

Feststoffgehalt: 20,8 Gew.-%, pH: 7,3; Viskosität: 5 mPa · s; Teilchendurchmesser: 760 nm, MFT < 50 Grad C.

Beispiel 6 Herstellung einer filmbildenden Polymerdispersion FD

Vorlage:
560,0 g Wasser
  1,12 g Natriumlaurylsulfat
  0,98 g 4,4′-Azobis-(4′-cyanovaleriansäure), Na-Salz

Zulauf (über 240 min):
860,0 g Wasser
  4,2 g Natriumlaurylsulfat
  0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), 420,0 g Ethylacrylat
180,0 g Methylmethacrylat

Feststoffgehalt: 27,7 Gew.-%, pH = 7,6; Viskosität: 6 mPa · s, Teilchendurchmesser: 82 nm, MFT: 8 Grad C.

Beispiel 7 Herstellung einer nichtfilmbildenden Polymerdispersion NFD

Vorlage:
1411,0 g Wasser
  37,5 g Titrisollösung, pH 7 (Merck)
1200,0 g Saatlatex D
   1,18 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz

Nach Zugabe des Initiators wird zuerst innerhalb von 120 min eine Emulsion, bestehend aus

1830,0 g Wasser
   2,92 g Natriumlaurylsulfat

Zulauf 1:
   5,29 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
 313,5 g Isobutylmethacrylat
 313,5 g Methylmethacrylat
  33,0 g Glykoldimethacrylat

zugetropft und dann innerhalb von 60 min gleichzeitig a) ein Monomergemisch aus

 126,0 g Glycidylmethacrylat
 102,0 g Methylmethacrylat
  12,0 g Glykoldimethacrylat

und b) eine Lösung aus

Zulauf 2:
 601,0 g Wasser
  60,0 g Methacrylamid
   1,77 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz

Feststoffgehalt: 20,8 Gew.-%, pH = 7,7, Viskosität: 5 mPa · s; Teilchendurchmesser: 1120 nm; MFT < 60 Grad C.

Beispiel 8 Herstellung einer nichtfilmbildenden Polymerdispersion NFD

Der Zulauf besteht aus Emulsion 1 und Emulsion 2 im Verhältnis 4 : 1, die nacheinander zugetropft werden.

Vorlage:
559,0 g Wasser
  0,42 g Natriumlaurylsulfat
  0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz

Emulsion 1 (über 192 min):
679,0 g Wasser
  3,36 g Natriumlaurylsulfat
  0,78 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
456,0 g Methylmethacrylat
 24,0 g Allylmethacrylat

Emulsion 2 (über 48 min):
177,0 g Wasser
  0,84 g Natriumlaurylsulfat
  0,2 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
 84,0 g Ethylacrylat
 36,0 g Methylmethacrylat

Feststoffgehalt: 29,6 Gew.-%, pH: 6,7; Viskosität 5 mpa · s; Teilchendurchmesser: 204 nm, MFT < 50 Grad C.

Beispiel 9 Herstellung einer filmbildenden Polymerdispersion FD

Vorlage:
560,0 g Wasser
  1,12 g Natriumlaurylsulfat
  0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz

Zulauf (über 240 min):
860,0 g Wasser
  4,2 g Natriumlaurylsulfat
  0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
420,0 g Ethylacrylat
180,0 g Methylmethacrylat

Feststoffgehalt: 28,7 Gew.-%, pH: 6,7, Viskosität: 6 mPa · s; Teilchendurchmesser: 82 nm, MFT: 8 Grad C.

Beispiel 10 Herstellung einer filmbildenden Polymerdispersion FD

In einem Witt'schen Topf werden

920 g Wasser
 29 g eines ethoxylierten Isononylphenols (Ethoxylierungsgrad 100)
346 g Ethylacrylat
146 g Methylmethacrylat und
  6 g Methacrylsäure

vorgelegt und durch die Apparatur mit N₂ gespült. Die Polymerisation wurde durch Zugabe von 0,5 g Ammoniumperoxidisulfat, 0,7 g Natriumpyrosulfit und 0,01 g Eisen-(II)-Sulfat ausgelöst. Nach Überschreiten der Temperaturspitze wurde auf 40 Grad C abgekühlt und

100 g des oben genannten Emulgators
346 g Ethylacrylat
146 g Methylmethacrylat und
  6 g Methacrylsäure

zugefügt und die Polymerisation durch Zusatz von 0,7 g Natriumpyrosulfit und 0,5 g Ammoniumperoxodisulfat erneut ausgelöst. Nach Überschreiten des Temperaturmaximums wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt und mit Wasser auf 30% F.G. verdünnt.

Feststoffgehalt: 30%, Teilchendurchmesser: 160 nm, Viskosität: 20 mPa · s, MFT: 7 Grad C.

Beispiel 11 Herstellung der anwendungsfähigen Mischungen aus filmbildender Dispersion FD und nichtfilmbildender Dispersion NFD

Anwendungsfähige Mischungen erhält man durch Mischen der Polymerdispersionen aus den Beispielen 2 und 3 in Verhältnissen (angegeben in Gew.-%), die aus den folgenden Tabellen 1-7 zu entnehmen sind. 34 ml der Dispersionsmischungen werden mit entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 200 ml verdünnt.

Beispiel 12 Beschichten von Polystyrolperlen mit einer Polymersuspension

• a) Das Sprühaggregat wird mit 6-8 ml der anwendungsfähigen Mischungen aus Beispiel 11 gefüllt.
• b) Ein Dragierkessel (Durchmesser 145 mm, zwei Verteilerplatten) wird mit 150 Polystyrolkugeln (Spherotech-Kugeln, bezogen von Spherotech-Vertriebs GmbH, Fulda, Bundesrepublik Deutschland) mit einem Durchmesser von 6,35 mm beschickt. Die Rotation des Kessels lief mit 50-70 rpm an, wobei 5-7 ml der anwendungsfähigen Mischung auf die Kugeln aufgesprüht werden, während sie innerhalb des Dragierkessels in Bewegung waren. Der Sprühprozeß wurde bei Raumtemperaturen während ca. 30 Minuten durchgeführt, währenddessen wird ein nichtgeheizter Luftstrahl (elektr. Föhn) in den Dragierkessel geblasen, um die Feuchtigkeit zu verdampfen.
• c) Nach Abschluß des Beschichtungsschritts werden die beschichteten Perlen in einer geschlossenen Polystyrolflasche bei -15 Grad C aufbewahrt bis zu ihrer Anwendung z. B. zur Immobilisierung von Antikörpern.

Beispiel 13 Immobilisierung von monoklonalen Antikörpern an mit den Dispersionen NFD/FD beschichteten Polystyrolperlen

• a) 1000 µg eines monoklonalen Antikörpers aus der Maus (gerichtet gegen ein menschliches Polypeptidhormon vom Molekulargewicht ca. 30 000) wurden in 20 ml einer 0,3molaren Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH=8,0) gelöst.
• b) Diese Antikörper-Präparation wird auf 100 in einem Becherglas befindliche beschichtete Perlen gemäß Beispiel 12 aufgebracht.
• c) Man läßt dieses Gemisch bei 23 Grad C über Nacht stehen ohne Bewegung.
• d) Der wäßrige Anteil dieses Gemischs wird durch Vakuumabsaugen entfernt, und die zurückbleibenden Perlen werden dreimal mit je 80 ml PBS (Standardpuffer, mit Kochsalzzusatz pH=7,2) gewaschen. Der Waschvorgang besteht in fünfminütigem schwachem Schütteln, gefolgt vom Absaugen der wäßrigen Phase, wobei die Perlen in dem verwendeten Gefäß zurückbleiben.
• e) Nach dem dritten Waschgang gibt man 20 ml einer Pufferlösung, die 1 Gew.-% an Serumalbumin in PBS (pH=7,2) enthält, auf die Perlen auf. Diese Mischung läßt man über Nacht bei 23 Grad C ohne zu schütteln stehen.
• f) Das Waschen erfolgt wie unter b) beschrieben.
• g) Die beladenen Perlen bewahrt man im Kühlschrank bei +5 Grad C auf bis zum Gebrauch.

Beispiel 14 Radio-immunometrische Bestimmung des Antigens (menschliches Polypeptidhormon, Molgewicht ca. 30 000)

• a) Die Polystyrolkugeln, die gemäß Beispiel 13 gewonnen worden waren, werden in Teströhrchen mit Kalottenboden (9,6 mm Durchmesser) abgefüllt, und zwar eine Perle pro Reagenzglas.
• b) Dazu gibt man 100 µl eines radioaktiven Tracers (verschiedener monoklonaler Antikörper, der gegen das oben genannte Antigen gerichtet ist und mit ¹²⁵J markiert wurde in der Größenordnung von ca. 50 000 Counts per Minute).
• c) Unmittelbar nach der Zugabe des Tracers gibt man 100 µl des Antigens zu in den untenstehend (s. Tabelle) angegebenen Konzentrationen.
• d) Die Mischung wird bei Raumtemperatur (21 Grad C) mittels einer Orbital-Schüttelmaschine bei 300 Umdrehungen pro Minute 3 Stunden lang geschüttelt.
• e) Der wäßrige Anteil des Inkubationsansatzes wird durch Vakuumabsaugen beseitigt.
• f) Jedes Reagenzglas mit seiner Perle wird dreimal mit je 1 ml Pufferlösung gewaschen (2 Gew.-% Rinderserumalbumin in 0,2molarem Trispuffer vom pH 8,5 und 1,2 Gew.-% an ^R-Tween-20-Emulgator).
• g) Die Teströhrchen werden in einem Gamma-Szintillationszähler ausgezählt (Typ Multi Crystal Gamma Counter LB 2103).

Die so erhaltenen Resultate sind in den Tabellen 1-7 (s. unten) wiedergegeben.

Diskussion der Resultate

Wie die Werte in den Tabellen 1-7 zeigen, ergibt das erfindungsgemäße Überziehen der Polystyrolkugeln bzw. -perlen mit dem Gemisch der Dispersionen FD und NFD eine erhebliche Verbesserung, nämlich einen Abfall des Variationskoeffizienten parallel zu einem gewissen Anstieg (9585 cpm : 16 636 cpm) im Bereich der Testergebnisse bei den höchsten angewendeten Konzentrationen.

Bei den niedrigen Konzentrationen des Analyten schlägt sich hingegen der Unterschied zwischen der Beschichtung mit ausschließlich der filmbildenden Dispersion FD gegenüber dem Gemisch aus filmbildender und nichtfilmbildender Dispersion NFD nicht in einem deutlichen Anstieg der Testempfindlichkeit nieder.

Die besten Ergebnisse ergeben Perlen, die erfindungsgemäß mit dem Latex aus einem Dispersionsgemisch, das 10-20 Gew.-% der filmbildenden Dispersion FD enthält, beschichtet sind.

Verglichen mit nichtbeschichteten Polystyrolperlen (die als Stand der Technik zu gelten haben) weisen mit dem Gemisch der filmbildenden Dispersion FD und nichtfilmbildenden Dispersion NFD beschichtete Polystyrolperlen einen mindestens vierfachen Anstieg der gemessenen Counts-per-minute (cpm)-Werte im unteren und mittleren Konzentrationsbereich des Analyten auf, der sogar noch bis in die zweithöchste Konzentration hineinreicht. Selbst bei der höchsten Konzentration ergibt sich ein Anstieg der gemessenen cpm-Werte um den Faktor ca. 2,5. Der erfindungsgemäß erzielte Fortschritt in der Technik des Festkörper-Immunoassays kann somit als eindeutig nachgewiesen gelten.

Tabelle 1

Ergebnisse mit unbeschichteten Polystyrolperlen

Tabelle 2

Ergebnisse mit Polystyrolperlen, die nur mit der nichtfilmbildenden Dispersion NFD (gemäß Beispiel 3) beschichtet wurden

Tabelle 3

Ergebnisse mit Polystyrolperlen, die mit einem Gemisch aus den Dispersionen NFD (gemäß Beispiel 3) FD (gemäß Beispiel 2) im Verhältnis 90 : 10 Gew.-% beschichtet werden

Tabelle 4

Ergebnisse mit Polystyrolperlen, die mit einem Gemisch der Dispersionen NFD und FD im Gew-.Verhältnis 80 : 20 beschichtet worden waren (vgl. Beispiele 2 und 3).

Tabelle 5

Ergebnisse mit Polystyrolperlen, die mit einem Gewicht aus je 50 Gew.-% der Dispersionen FD und NFD beschichtet wurden (vgl. Beispiele 2 und 3)

Tabelle 6

Ergebnisse mit Polystyrolperlen, die mit einem Gemisch aus den Dispersionen FD und NFD im Gewichtsverhältnis 80 : 20 beschichtet wurden (vgl. Beispiele 2 und 3)

Tabelle 7

Ergebnisse mit Polystyrolperlen, die ausschließlich mit der Dispersion FD gemäß Beispiel 2 beschichtet wurden

Beispiel 15 Überziehen des inerten Trägermaterials in Form von Polymerperlen

700 g PMMA-Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 310 µm wird im Wirbelschichtgerät (Uniglatt, Fa. Glatt) mit folgender Dispersionsmischung überzogen:

Nichtfilmbildende Dispersion gemäß Beispiel 7|1225 g
filmbildende Dispersion gemäß Beispiel 10 (auf 20% Trockensubstanz verdünnt)	525 g
	1750 g

Verhältnis Kern/Schale = 2 : 1

Verfahrensbedingungen:
Sprühdruck 1,8 bar
Zulufttemperatur 40 Grad C
Ablufttemperatur 23-25 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 8,75 g/min

Das erhaltene Produkt wird 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Es ist freifließend, nach einer Teilchengrößenanalyse mittels Rüttelsieb liegen 81,4% (Gew.) der Ausbeute im Bereich von 0,3-0,6 mm.

Aktivität nach Bindung von Trypsin:
BAEE: 0,7 U/g
Casein: 0,3 U/g

Beispiel 16 Überziehen des inerten Trägermaterials in Form von Polymerperlen

900 g PMMA-Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 310 µm wird im Wirbelschichtgerät (Uniglatt, Fa. Glatt) mit folgender Dispersionsmischung überzogen.

Nichtfilmbildende Dispersion gemäß Beispiel 7|3150 g
filmbildende Dispersion gemäß Beispiel 4	1350 g
	4500 g

Verhältnis Kern/Schale = 1 : 1

Verfahrensbedingungen:
Sprühdruck 1,8 bar
Zulufttemperatur 40-50 Grad C
Ablufttemperatur 19-23 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 11,84 g/min

Das erhaltene Produkt wird 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Es ist freifließend, 85,8% (Gew.) der Ausbeute liegen im Korngrößenbereich von 0,3 bis 0,6 mm.

Aktivität nach Bindung von Trypsin:
BAEE: 3,9 U/g
Casein: 1,04 U/g

Beispiel 17 Bindung von Trypsin an Produkt aus Beispiel 16

500 mg Trypsin (vom Ring, Art. No. 24 579, 40 v/mg; E. Merck, D-6100 Darmstadt) werden in 10 ml 1 M Kalium-Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und zu 5 g PT 9376-43 gegeben.

Die Mischung wird 10 sec. lang leicht geschüttelt und bei +23 Grad C 72 Stunden lang stehen gelassen. Danach wäscht man siebenmal mit jeweils 10 Volumen deionisiertes Wasser und dreimal mit jeweils 10 Volumen 0,1 M Phosphatpuffer (enthält 500 ppm p-Hydroxybenzoesäure zur Konservierung und 2% 2-Propanol).

Gewaschen (auf Fritte über Vakuum) erhält man eine Feuchtausbeute: 5,6 g.

Aktivität gegenüber
BAEE: 3,2 U/g
Casein: 0,36 U/g

Aktivität im Vergleich zum Stand der Technik:
(siehe Tabelle unten) ergibt keinen Aktivitätsverlust durch Dragierung (Essenz der Erfindung).

Aktivitätsbestimmung Aktivität gegenüber Casein (hochmolekulares Substrat) Substrat

Auf 20 g Casein nach Hammarstein (Art. No. 2242, E. Merck, D-6100 Darmstadt) gibt man 350 ml deionisiertes Wasser und 32 mol 0,5 M NaOH und rührt so lange bei 60 Grad C, bis das Casein gelöst ist. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird der pH-Wert durch Zugabe von 0,1 M HCl auf pH 8,0 eingestellt. Dann wird das Volumen mit deionisiertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt. (Es sollte beachtet werden, daß auf Grund der Aggregation von Casein die Lösung immer etwas trübe ist.)

Bestimmung

20 ml Substratlösung und 2 g Produkt nach Beispiel 17 werden bei 37 Grad C, pH 8,0, in einem thermostatisierten Reaktionsgefäß mit pH-Stat.-Einheit gerührt. Gleichzeitig wird die Menge an hydrolysiertem Substrat über den Verbrauch an 0,01 N NaOH gegen die Zeit aufgezeichnet.

Nach 10 min der Inkubation wird das Produkt in einer Glasfritte (Porosität No 2) aufgefangen, und dasselbe Produkt wird für weitere 10 min inkubiert. Für die Deklaration der Aktivität wird der 4. Cyclus herangezogen.

Aktivität gegenüber N-Benzoyl-L-argininethylesterhydrochlorid (BAEE, niedermolekulares Substrat) Substrat

1% BAEE-Lösung (Art. No. 1672; E. Merck, D-6100 Darmstadt) wird in 0,05 M Kalium-Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst.

Inkubation

20 ml Substratlösung und 2 g Produkt nach Beispiel 17 (Feuchteinwaage) werden bei 37 Grad C und pH 7,5 mit 0,1 M NaOH titriert.
Inkubationszeit: 10 min.
Für die Deklaration der Aktivität wird der 4. Cyclus herangezogen.

Beispiel 18 Überziehen des inerten Trägermaterials in Form von Polymerperlen

900 g PMMA-Perlpolymerisat mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 310 µm wird im Wirbelschichtgerät (Uniglatt, Fa. Glatt) mit 1575 g der Dispersion aus Beispiel 5 überzogen.

Verhältnis Kern/Schale: 3 : 1

Verfahrensbedingungen:
Sprühdruck 1,8 bar
Zulufttemperatur 40-45 Grad C
Ablufttemperatur 20-23 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 8,75 g/min

Das erhaltene Produkt wird 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Es ist freifließend, 62,2% (Gew.) der Ausbeute liegt im Korngrößenbereich von 0,3-0,6 mm.

Aktivität nach Bindung von Trypsin:
BAEE: 0,3 U/g
Casein: 0,9 U/g

Beispiel 19 Überziehen des inerten Trägermaterials in Form von Polymerperlen

775 g PMMA-Perlpolymerisat (PLEXIDON® M 449) mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 100 µm wird im Wirbelschichtgerät (Uniglatt, Fa. Glatt) mit folgender Dispersionsmischung überzogen:

Dispersion aus Beispiel 6|1803,33 g
Dispersion aus Beispiel 8	775,00 g
	2583,33 g

Verhältnis Kern/Schale: 1 : 1

Verfahrensbedingungen:
Sprühdruck 2 bar
Zulufttemperatur 40-45 Grad C
Ablufttemperatur 22-25 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 10,5 g/min
Trocknung 24 Stunden im Vakuum

Das erhaltene Produkt ist freifließend und weiß. Der mittlere Teilchendurchmesser liegt bei 189 µm.

Claims (21)

1. Verfahren zur Herstellung von Trägersystemen zur kovalenten Bindung von biologisch aktivem Material, bestehend aus einem an sich bekannten festen Supportmaterial mit polymerbeschichteter Oberfläche, wobei das Polymer die zur kovalenten Bindung geeigneten funktionalen Gruppen enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Supportmaterial mit einer Mischung einer filmbildenden Polymerdispersion FD und einer nichtfilmbildenden Dispersion NFD beschichtet wird, wobei mindestens eine der beiden Polymerdispersionen die zur kovalenten Bindung geeigneten funktionalen Gruppen besitzt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein anorganisches Supportmaterial verwendet wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein organisches Supportmaterial verwendet wird.

4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß kugelförmige Partikel verwendet werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Kugeln mit einem Durchmesser im Bereich 0,01 bis 10 mm verwendet werden.

6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß Flächengebilde auf Cellulose- oder textiler Basis bzw. Glasfaser verwendet werden.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Polymerdispersionen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Polyacrylaten, Polystyrol und Polymerisaten aus Alkylstyrol, Polyvinylester, Polyvinylhalogenverbindungen sowie Mischpolymerisaten.

8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerdispersionen einen Gehalt an funktionale Gruppen tragenden Monomeren der Formel Z-(R)_n-Xworin
X für eine Sulfonsäurehalogenid-, Thioisocyanat-, Thiocarbonyldioxy-, Carbonyl-imidoyldioxy-, Haloethoxy-, Aziridin-, Epoxy-, Formyl-, Keto-, Acryloyl-, Anhydrid- oder aktivierte Estergruppe als funktionale Gruppen
R für einen chemisch inerten Abstandhalter (Spacer),
n für 0 oder 1 und
Z für eine polymerisationsfähige Einheit steht,
besitzen.

9. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die zur kovalenten Bindung geeigneten funktionalen Gruppen Bestandteil der nichtfilmbildenden Dispersion NFD sind.

10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7-9, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an funktionalen Monomeren im Polymerisat 0,1 bis 80 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtheit der Monomeren, beträgt.

11. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerdispersionen Polyacrylate bestehend zu mindestens 50 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtheit der Monomeren, aus Monomeren der Formel worin
R₁ für Wasserstoff oder Methyl oder eine Gruppe CH₂-COOR₂ steht, worin R₂ einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet und
R₃ für einen gegebenenfalls verzweigten Alkylrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen oder einem Cycloalkylrest mit 3 bis 12 Ringgliedern steht
darstellen.

12. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die filmbildende Dispersion FD eine minimale Filmbildungstemperatur (nach DIN 53 787) von unter 60 Grad C, vorzugsweise unter 40 Grad C besitzt.

13. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Einfriertemperatur des die nichtfilmbildende Dispersion NFD bildenden Polymerisats über der Filmbildungstemperatur liegt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Einfriertemperatur der nichtfilmbildenden Dispersion NFD bei mindestens 30 Grad C liegt.

15. Verfahren gemäß den Ansprüchen 7 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel der filmbildenden Dispersion FD eine durchschnittliche Teilchengröße im Bereich 0,02 bis 5 µ besitzen.

16. Verfahren gemäß den Ansprüchen 7 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel der nichtfilmbildenden Dispersion NFD eine durchschnittliche Teilchengröße im Bereich 0,04 bis 5 µm besitzen.

17. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1, 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel der nichtfilmbildenden Dispersion NFD durchschnittlich um einen Faktor 1,2 bis 20 größer sind als die der filmbildenden Dispersion FD.

18. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7-17, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Applikation die nichtfilmbildende Dispersion NFD zur filmbildenden Dispersion FD im Verhältnis 50 Gew.-Teile : 50 Gew.-Teile bis 99 Gew.-Teile zu 1 Gew.-Teil steht.

19. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Supportmaterial durch Tauchen oder Sprühen mit der filmbildenden Polymerdispersion FD und der nichtfilmbildenden Polymerdispersion beschichtet wird.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß beim Tauchen oder Sprühen das Gemisch der Polymerdispersionen verwendet wird.

21. Verwendung der gemäß den Verfahrensansprüchen 1-20 hergestellten Trägersystemen zur kovalenten Bindung von biologisch aktivem Material.