DE4018325A1 - Determining clearance rate of lipoprotein and apoprotein in e.g. serum - by injecting biotinylated low density lipoprotein(s), used to evaluate risk factors for sudden death associated with atherosclerosis - Google Patents
Determining clearance rate of lipoprotein and apoprotein in e.g. serum - by injecting biotinylated low density lipoprotein(s), used to evaluate risk factors for sudden death associated with atherosclerosisInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Abbaurate von Lipoproteinen geringer Dichte und Apoproteinen sowie die Herstellung und Verwendung hierfür geeigneter Verbindungen.The invention relates to a method for determining the Degradation rate of low density and lipoproteins Apoproteins and the production and use thereof suitable connections.
Durch Atherosklerose bedingte Krankheiten stellen in den westlichen Ländern seit langem die häufigste Todesursache dar. In der Bundesrepublik Deutschland waren 1985 51% aller Todesfälle durch Krankheiten des Kreislaufsystems verursacht, gefolgt von 23% aller Todesfälle durch maligne Gewebsveränderungen.Diseases caused by atherosclerosis pose in the Western countries have long been the leading cause of death in the Federal Republic of Germany in 1985 were 51% of all deaths from diseases of the circulatory system caused by followed by 23% of all deaths malignant tissue changes.
Ein Hauptrisikofaktor für die oben genannten Erkrankungen ist die Hypercholesterinämie mit dem Wirkungsmodus, daß auf der Zelloberfläche sitzende Rezeptoren für die Einschleusung des Plasmacholesterins und für dessen Verstoffwechslung verantwortlich sind. A major risk factor for the diseases mentioned above is the hypercholesterolemia with the mode of action that receptors for the Introduction of plasma cholesterol and for it Metabolism are responsible.
Diese Rezeptoren binden die Lipoproteine geringer Dichte ("low density proteins′, LDL), die die Haupttransportform für Cholesterin im Plasma darstellen. Sie sind die eigentlichen atherogenen Lipoproteine.These receptors bind the low density lipoproteins ("low density proteins ′, LDL), which is the main form of transport for cholesterol in plasma. You are the actual atherogenic lipoproteins.
Für die Aufnahme der LDL-Partikel aus dem Plasma ist primär die Leber verantwortlich, ebenso wie hier die Aufnahme des Cholesterins komplex reguliert wird: Wird das Cholesterin zellulär gestaut, bildet die Zelle weniger Rezeptoren. Damit kommt es zum Rückstau der LDL im Plasma und zu einer Erhöhung des Atherosklerose- Risikos.For the absorption of the LDL particles from the plasma primarily responsible for the liver, just like here Cholesterol intake is complexly regulated: Will the cholesterol is jammed in the cell, forms the cell fewer receptors. This causes the LDL to backflow in plasma and to increase atherosclerosis Risks.
Sinkt hingegen die zelluläre Cholesterin-Konzentration, wird die Anzahl der Zellmembran-ständigen LDL-Rezeptoren erhöht und das Plasma-LDL-Cholesterin sinkt. Dies kann durch ein vermindertes Angebot an Cholesterin oder durch eine verstärkte Umwandlung des Cholesterins in Gallensäuren bedingt sein.However, if the cellular cholesterol concentration drops, is the number of cell membrane-standing LDL receptors increases and the plasma LDL cholesterol decreases. This can through a reduced supply of cholesterol or through an increased conversion of cholesterol into Bile acids may be caused.
Sind also nur wenige oder keine intakte LDL-Rezeptoren vorhanden, erhöht sich drastisch die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung des Kreislaufsystems.So there are few or no intact LDL receptors if present, the probability increases drastically a circulatory system disorder.
Insgesamt führt eine Erhöhung des Serum gesamtcholesterinspiegels zu einem gesteigerten Herzinfarktrisiko, während andererseits eine inverse Beziehung zwischen dem Serum-HDL-Cholesteringehalt und der Gefahr der Atherosklerose besteht.Overall, an increase in serum results total cholesterol levels increased Heart attack risk while on the other hand an inverse Relationship between serum HDL and cholesterol there is a risk of atherosclerosis.
Die Behandlung der Erkrankungen des Kreislaufsystems kann mittels einer Reihe von Verfahren und Arzneimittel erfolgen. So konnte durch Anwendung des Ionen austauschers Cholestyramin die Zahl der Herzinfarkte, des plötzlichen unerwarteten Herztodes, der Angina-Pectoris- Anfälle, der notwendigen Bypass-Operationen und der peripheren Verschlußkrankheiten drastisch verringert werden (LRC-CPPT-Studies, Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial, JAMA 251, 351-364, (1984)). Durch das Cholestyramin wird die Anzahl der LDL- Rezeptoren auf den Leberzellen deutlich vermehrt, so daß ein Absinken des LDL-Cholesterinspiegels im Plasma erfolgt.Treatment of diseases of the circulatory system can through a range of procedures and medicines respectively. So by using the ion exchanger cholestyramine the number of heart attacks, the sudden unexpected cardiac death, angina pectoris Seizures, the necessary bypass operations and the peripheral occlusive diseases drastically reduced (LRC-CPPT-Studies, Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial, JAMA 251, 351-364, (1984)). Cholestyramine reduces the number of LDL Receptors on the liver cells increased significantly, so that a decrease in plasma LDL cholesterol he follows.
Eine Vermehrung der Rezeptoren - und damit die Verringerung der LDL-Konzentration - ist auch mit den Inhibitoren der HMG-CoA-Reduktase, wie etwa Lovastatin, Simvastatin und Pravastatin möglich.An increase in the receptors - and thus the Reducing the LDL concentration - is also with the HMG-CoA reductase inhibitors, such as lovastatin, Simvastatin and Pravastatin possible.
Die oben genannten Pharmaka erbringen ihre Wirkung über eine Stimulierung der LDL-Rezeptordichte der Leber wie mittels der Bestimmung der sogenannten "Fractional Catabolic Rate" (FCR) nachgewiesen werden konnte. Mit der "Fractional Catabolic Rate" bezeichnet man die zeitabhängige Abbaurate von Proteinen und insbesondere die Abbaurate von Lipoproteinen geringer Dichte.The pharmaceuticals mentioned above have an effect a stimulation of liver LDL receptor density such as by determining the so-called "fractional Catabolic Rate "(FCR) could be demonstrated. With the "Fractional Catabolic Rate" is the name given to the time-dependent degradation rate of proteins and in particular the degradation rate of low density lipoproteins.
Nach diesem Verfahren werden radioaktiv markierte (in der Regel Markierung des Proteinanteils mit 131J oder 125J) Lipoproteine geringer Dichte intravenös injiziert und die Abnahme der Radioaktivität aus dem Blut in Abhängigkeit von der Zeit gemessen (Grundy, S. M. , Vega G. L. , Journal of Lipid Research, 1464-1475 (1985)). Dieses Verfahren erlaubt sowohl den Nachweis einer verringerten Abbaurate ("Clearance") von LDL bei Patienten, aber auch die Demonstration eines therapeutischen Effekts nach Behandlung mit den oben genannten Lipidsenkern.According to this method, radioactively labeled (usually labeling the protein portion with 131 J or 125 J) low density lipoproteins are injected intravenously and the decrease in radioactivity from the blood is measured as a function of time (Grundy, SM, Vega GL, Journal of Lipid Research, 1464-1475 (1985)). This method allows both the detection of a reduced rate of clearance ("clearance") of LDL in patients, but also the demonstration of a therapeutic effect after treatment with the lipid-lowering agents mentioned above.
Diese Methode ist allerdings mit erheblichen Nachteilen behaftet: Da die Patienten durch die radioaktive Strahlung belastet werden, wird dieses Verfahren in vielen Ländern, so auch in der BRD, nicht durchgeführt. However, this method has considerable disadvantages afflicted: Because the patient is burdened by the radioactive radiation will be used in many countries, so too in the FRG, not carried out.
In jedem Fall ist vor der Injektion der jodierten Proteine und während der "Clearance-Phase" eine Absätti gung der Schilddrüse mit nicht-radioaktivem Jod notwendig.In any case, before iodine injection Proteins and a saturation during the "clearance phase" the thyroid with non-radioactive iodine necessary.
Solche Untersuchungen können auch nur in nuklearmedizini schen Kontrollbereichen von Kliniken durchgeführt werden, wobei Urin und Faeces der Patienten zwecks Abklingen der Radioaktivität gesammelt und mehrere Wochen gelagert werden müssen.Such examinations can only be done in nuclear medicine control areas are carried out by clinics, with the patient's urine and faeces for the purpose of subside Radioactivity collected and stored for several weeks Need to become.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Methode zu entwickeln, bei der eine Belastung der Patienten durch radioaktive Strahlung vermieden wird.The invention is therefore based on the object To develop procedures and a method in which a Exposure of patients to radioactive radiation is avoided.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von biotinylierten Lipoproteinen geringer Dichte für die Bestimmung der "Fractional Catabolic Rate", d. h. der Abbaurate der Proteine.This problem is solved by using biotinylated low density lipoproteins for the Determination of the "Fractional Catabolic Rate", i. H. the Degradation rate of the proteins.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß es möglich ist, die Abbaurate von Proteinen zu bestimmen, indem die Proteine selbst an Biotin mittels Kohlenwasserstoffen mittlerer Kettenlänge gekoppelt werden und anschließend die Abbaurate bestimmt wird. Surprisingly, it has now been found that it is possible is to determine the rate of protein degradation by the Proteins themselves on biotin using hydrocarbons medium chain length and then coupled the degradation rate is determined.
Durch das neue Verfahren werden alle Nachteile der zuvor beschriebenen Methode vollständig vermieden. Bei biotinylierten LDL handelt es sich um Lipoproteine geringer Dichte, an die über einen Spacer Biotin kovalent gebunden ist, wobei die hohe Affinität des Streptavidins, ein Protein aus dem Streptobacillus avidinii, für vier Biotingruppierungen für die Bestimmung des biotinylierten LDL genutzt wird.The new process eliminates all the disadvantages of the previous one described method completely avoided. At biotinylated LDL are lipoproteins low density to which covalent via a spacer biotin is bound, the high affinity of streptavidin, a protein from the Streptobacillus avidinii, for four Biotin groupings for the determination of the biotinylated LDL is used.
Biotin selbst ist Vitamin H, chemisch 3,4(2′-Ketoimidazolid) -2-(w-Carboxybutyl)-Thiophan. Als Spacer dienen Kohlenwasserstoffverbindungen mittlerer Kettenlänge, die die Verbindung zwischen dem Protein und dem Biotin bilden. Die Erfindung besitzt darüberhinaus den Vorteil, daß auf die bei der Verwendung radioaktiv markierter Proteinen notwendige Trichloressigsäure- Präzipitation verzichtet werden kann.Biotin itself is vitamin H, chemical 3,4 (2'-ketoimidazolide) -2- (w-carboxybutyl) thiophane. As Spacers are used for medium-sized hydrocarbon compounds Chain length, which is the link between the protein and form the biotin. The invention also has the advantage of being radioactive when used labeled proteins necessary trichloroacetic acid Precipitation can be dispensed with.
Weiterhin ist es überraschend, daß mit der erfindungsgemäßen Methode auch Abbauraten anderer Plasmaproteine mit genügender Genauigkeit bestimmt werden können. So kann etwa mit den erfindungsgemäßen biotinylierten Proteinen die Bestimmung der Fractional Catabolic Rate von Albumin und den Proteinanteilen von Lipoproteinen (Apoproteinen) wie apoAI, apoAII, apoAIV und apoE erfolgen.Furthermore, it is surprising that with the method according to the invention also degradation rates of others Plasma proteins can be determined with sufficient accuracy can. For example, with the invention biotinylated proteins determining the fractional Catabolic rate of albumin and the protein content of Lipoproteins (apoproteins) such as apoAI, apoAII, apoAIV and apoE.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet darüberhinaus den Vorteil, sehr kleine Mengen bestimmen zu können. So liegt die untere Nachweisgrenze der Methode für biotinylierte LDL bei etwa 1 ng/ml, entsprechend 2 pmol/l auf den Apoproteinanteil (apoB) der LDL.The inventive method also offers the The advantage of being able to determine very small quantities. So lies the lower detection limit of the method for biotinylated LDL at about 1 ng / ml, corresponding to 2 pmol / l on the Apoprotein portion (apoB) of the LDL.
Die biotinylierten Apoproteine können dabei auch in Liposomen integriert sein, um eine Standardisierung der FCR-Bestimmungsmethodik für die klinische Routineanalytik von Rezeptoraktivitäten zu erreichen. Die in Liposomen integrierten biotinylierten Apoproteine haben darüber hinaus den Vorzug, leicht sterilisierbar zu sein.The biotinylated apoproteins can also in Liposomes can be integrated to standardize the FCR determination methodology for routine clinical analysis of receptor activities. The one in liposomes have integrated biotinylated apoproteins above it the advantage of being easy to sterilize.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren nach folgendem Schema durchgeführt:.The process according to the invention is preferably carried out according to following scheme :.
Zuerst werden Mikrotiterplatten (ELISA-Platten), die in der klinischen Routineanalytik bereits breite Anwendung für sogenannte "Enzyme-linked immunosorbent Assays (ELISA)" finden, mit kommerziell erhältlichem biotinyliertem Rinderserumalbumin beschichtet, die nicht besetzten Plastikstellen der ELISA-Platte mit Rinderserumalbumin abgesättigt und kommerziell erhältliches Streptavidin an die freien Biotingruppen gekoppelt.First, microtiter plates (ELISA plates), which are in in routine clinical analysis already widely used for so-called "enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) "with commercially available biotinylated bovine serum albumin that is not coated occupied plastic parts of the ELISA plate with Bovine serum albumin saturated and commercial Streptavidin available to the free biotin groups coupled.
Danach werden mehrfach biotinylierte LDL (aus den Plasmaproben nach Injektion von biotinylierten LDL) an die freien Streptavidinbindungsstellen gekoppelt und anschließend wird ein Streptavidin-Enzym-Konjugat an die freien Biotingruppen gekoppelt, die an Lipoproteine geringer Dichte gebunden sind. Die gebundene Enzymaktivität und damit der Plasmagehalt an biotinylierten LDL wird über spezifische Nachweisreaktionen mengenmäßig bestimmt.Then multiple biotinylated LDL (from the Plasma samples after injection of biotinylated LDL) the free streptavidin binding sites coupled and then a streptavidin-enzyme conjugate is attached to the free biotin groups coupled to lipoproteins low density are bound. The bound Enzyme activity and thus the plasma content biotinylated LDL is about specific Detection reactions determined quantitatively.
Das Verfahren wird schematisch durch die Abbildung 1 erläutert.The process is illustrated schematically by Figure 1 .
Durch die nachstehenden Beispiele und Versuche wurde gesichert, daß biotinylierte LDL ebenso wie native an LDL-Rezeptoren binden, die katabolischen Eigenschaften der LDL-Partikel also nicht signifikant verändert werden. Ebenso wurde nachgewiesen, daß biotinylierte LDL keine antigenen Eigenschaften besitzen.Through the examples and experiments below assured that biotinylated LDL as well as native to LDL receptors bind the catabolic properties the LDL particles are not significantly changed. It was also demonstrated that biotinylated LDL none possess antigenic properties.
Für das nachstehende Beispiel wurden Lipoproteine geringer Dichte (LDL) nach dem standarisierten Verfahren von Havel et al. (Havel R.J., Eder H.A., Bragdon J.H., Clin. Invest. 34, 1345 (1955)) mittels Ultrazentifugation präpariert. For the example below, lipoproteins were used low density (LDL) according to the standardized procedure by Havel et al. (Havel R.J., Eder H.A., Bragdon J.H., Clin. Invest. 34, 1345 (1955)) by means of ultracentrifugation prepared.
2 mg Biotin-Amidocaproate-N-Hydroxysuccinimidester (Sigma) wurde in 40 µl Dimethylformamid gelöst und mit Phosphatpuffer auf 20 ml aufgefüllt (9 g NaCl, 0,4 g Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA) und 0,3 g Dinatriumhydrogenphosphat pro Liter bidestilliertem Wasser, pH=7,4). Ein Teil der obigen Lösung wurde mit einem Teil LDL (Proteinkonzentration im Bereich 1,5- 4 mg/ml) zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die so biotinylierten LDL wurden gegen obigen Puffer bei 4-8°C intensiv dialysiert und anschließend mittels 0,2 µm-Einwegfilter-halter sterilfiltriert. Ihre Haltbarkeit beträgt unter Kühlung mindestens vier Wochen, ohne daß eine Veränderung der katabolischen Eigenschaften erkennbar ist.2 mg biotin amidocaproate N-hydroxysuccinimide ester (Sigma) was dissolved in 40 ul dimethylformamide and with Make up the phosphate buffer to 20 ml (9 g NaCl, 0.4 g Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) and 0.3 g disodium hydrogen phosphate per liter of double distilled Water, pH = 7.4). Part of the above solution was made with a part of LDL (protein concentration in the range 1.5- 4 mg / ml) stirred for two hours at room temperature. The LDL thus biotinylated were added to the above buffer 4-8 ° C intensely dialyzed and then by means of 0.2 µm disposable filter holder sterile filtered. Your Shelf life is at least four weeks when refrigerated, without changing the catabolic properties is recognizable.
Konfluente Zellmonolayer von menschlichen Hepatomazellen (HepG2-Zellen, American Type Culture Collection, ATCC) wurden unter Eiskühlung mit radiojodierten LDL (10 µg/ml, spezifische Aktivität 200-400 cpm 125J/ng Protein, Darstellung nach McFarlane A. S. , Nature, No. 4627, 53, (1958) ) in Gegenwart verschiedener Mengen (10-1000 µg/ml) biotinylierter LDL bzw. nativer LDL für 0,5 h inkubiert. Nach intensiver Waschung der Zellmonolayer mit oben beschriebenem Phosphatpuffer und Solubilisierung der Zellen in Natronlauge (1 mol/l), wurde die an Zellen gebundene Radioaktivität im Gammazähler bestimmt und nachgewiesen, daß die zuvor hergestellten biotinylierten LDL radiojodierte LDL in gleichem Ausmaß vom Rezeptor verdrängen, wie dies nicht markierte LDL bewirken. Confluent cell monolayers of human hepatoma cells (HepG2 cells, American Type Culture Collection, ATCC) were cooled under ice with radioiodinated LDL (10 µg / ml, specific activity 200-400 cpm 125 J / ng protein, presentation according to McFarlane AS, Nature, No. 4627, 53, (1958)) in the presence of different amounts (10-1000 µg / ml) of biotinylated LDL or native LDL for 0.5 h. After intensive washing of the cell monolayer with the phosphate buffer described above and solubilization of the cells in sodium hydroxide solution (1 mol / l), the radioactivity bound to cells was determined in the gamma counter and it was demonstrated that the previously produced biotinylated LDL displaced radioiodinated LDL to the same extent from the receptor as this causes unlabeled LDL.
Untersucht wurden Kaninchenplasmen von Tieren, die 4mal einer FCR-Bestimmung innerhalb von 8 Versuchswochen mit der unten beschriebenen Methode unterzogen wurden. Der angestrebte Nachweis wurde mittels einer Standard- Immundiffusionstechnik (Ouchterlony, Ö., Arkiv Kemi 1, 43 (1949)) erbracht.Rabbit plasmas from animals were examined 4 times an FCR determination within 8 test weeks with were subjected to the method described below. The the desired evidence was verified using a standard Immunodiffusion technology (Ouchterlony, Ö., Arkiv Kemi 1, 43 (1949)).
Dabei werden in Gelvertiefungen auf 1%ig- Agarosegelplatten Antigen (biotinylierte Proteine) und die auf Antikörpergehalt zu untersuchende Plasmen in 1 cm Abstand aufgetragen. Die Proben diffundieren dann im Gel über zwei Tage. Bei den verwendeten Plasmaproben konnte zu keinem Zeitpunkt eine Präzipitationsbande zwischen den beiden Auftragsstellen gegen biotinylierte LDL (vom Kaninchen bzw. Menschen) und biotinyliertes Albumin beobachtet werden. Das fehlen dieser Bande schließt eindeutig die Anwesenheit von Antikörpern aus.In gel wells, 1% Agarose gel plates antigen (biotinylated proteins) and the plasmas to be examined for antibody content in 1 cm Distance plotted. The samples then diffuse in the gel over two days. When using the plasma samples at no time a precipitation band between the two agencies against biotinylated LDL (from Rabbits or humans) and biotinylated albumin to be watched. The lack of this gang closes clearly the presence of antibodies.
Mit Cholesterindiät vorbehandelte Weiße-Neuseeländer- Kaninchen wurden nach Randomisierung in zwei Gruppen zu je 6 Tieren aufgeteilt: Über vier Tage wurde der Verumgruppe täglich 5 mg/kg 17α-Ethinylöstradiol, gelöst in Propylenglycol, subkutan appliziert, während den Tieren der Kontrollgruppe nur das Lösungsmittel verabreicht wurde.White New Zealanders pre-treated with cholesterol diet Rabbits were randomized into two groups divided into 6 animals: The verum group received 5 mg / kg daily for four days 17α-ethynyl estradiol, dissolved in propylene glycol, subcutaneously applied, while the animals in the control group only Solvent was administered.
Am vierten Behandlungstag wurde jedem Tier 400 µg (= 200 µl) biotinylierte LDL intravenös (linke Ohrvene) verabreicht und Blutproben (Antikoagulanz: 3 mg/ml EDTA) der rechten Ohrvene zu folgenden Zeitpunkten entnommen: 5, 15 Minuten, 1, 2, 3, 4, 6, 24 und 30 Stunden nach Applikation der biotinylierten LDL. On the fourth day of treatment, each animal received 400 µg (= 200 µl) biotinylated LDL intravenously (left ear vein) administered and blood samples (anticoagulant: 3 mg / ml EDTA) of the right ear vein at the following times taken from: 5, 15 minutes, 1, 2, 3, 4, 6, 24 and 30 hours after Application of the biotinylated LDL.
Aus den Vollblutproben wurde das EDTA-Plasma durch 10minütige Zentrifugation bei 800×g gewonnen und die Biotinbestimmung mit je 50 µl Plasma (3 Bestimmungen pro Zeitpunkt und Tier) wie folgt durchgeführt:The EDTA plasma was obtained from the whole blood samples by centrifugation at 800 × g for 10 minutes and the biotin determination was carried out with 50 μl plasma ( 3 determinations per time point and animal) as follows:
ELISA-Mikrotiterplatten wurden mit 100 µl einer Lösung (10 µg/ml) von biotinyliertem Rinderserumalbumin (Sigma) in Trispuffer 24 h inkubiert, dann 2mal mit je 200 µl obigen Trispuffers unter Zusatz von 0,1% Rinderserumalbumin (= Waschpuffer) mittels eines Mikrotiterplatten-Waschgerätes gewaschen und mit 100 l einer Streptavidinlösung (10 µg/ml in Trispuffer (0,05 mol/l Tris(hydroxymethyl)-aminomethan; 0,15 mol/l NaCl; pH=7,4)) zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneuter 2maliger Waschung wurden freie Plastikstellen der ELISA-Platten durch eine 2stündige Inkubation mit 100 µl einer 1%igen Rinderserumalbuminlösung in Trispuffer bei 4°C abgesättigt. Nach 2maliger Waschung wurden die zu bestimmenden Plasmaproben (50 µl) zupipettiert - die Bindung der biotinylierten LDL erfolgte über 18 Stunden bei 4°C. Zur Detektion der gebundenen biotinylierten LDL wurden nach 2maliger Waschung 100 µl einer Streptavidin β-Galaktosidase-Arbeitslösung (0,5 µg/ml Streptavidin, 0,05 µg/ml Streptavidin-β-Galaktosidase (Sigma) in Trispuffer) zupipettiert und die ELISA-Platten 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte eine 5malige Waschung zur Entfernung nicht gebundenen Enzyms und die Zugabe von 100 µl der Substratlösung (4-Methylumbelliferyl-β-D-Galaktosid (Sigma), 20 mg/ml in Trispuffer gelöst). Die enzymatische Reaktion wurde nach 30 Minuten durch Zugabe von 100 µl einer Laktoselösung (35 mg/ml in Trispuffer) gestoppt und die Fluoreszenz in einem Mikrotiterplatten-Fluorometer (Fa. Flow) bestimmt: Anregungswellenlänge: 355 nm, Emissionswellenlänge: 460 nm. Für die Auswertung der Biotingehalten im Plasma wurde die gleiche Methode wie für radiojodierte LDL angewandt (Matthews, C.M.E., Rhys. Med. Biol. 2, 36-53 (1957)). ELISA microtiter plates were mixed with 100 ul of a solution (10 µg / ml) of biotinylated bovine serum albumin (Sigma) incubated in Tris buffer for 24 h, then twice with 200 µl each Tris buffer above with the addition of 0.1% Bovine serum albumin (= wash buffer) using a Microtiter plate washer washed and with 100 l a streptavidin solution (10 µg / ml in Tris buffer (0.05 mol / l tris (hydroxymethyl) aminomethane; 0.15 mol / l NaCl; pH = 7.4)) incubated for two hours at room temperature. To After two more washes, there were free plastic spots of the ELISA plates by a 2 hour incubation with 100 µl of a 1% bovine serum albumin solution in Tris buffer saturated at 4 ° C. After washing twice, they became too determining pipette (50 µl) - the The biotinylated LDL was bound for 18 hours at 4 ° C. For the detection of bound biotinylated LDL became 100 ul of a streptavidin after two washes β-galactosidase working solution (0.5 µg / ml streptavidin, 0.05 µg / ml streptavidin-β-galactosidase (Sigma) in Pipette) and the ELISA plates for 30 minutes incubated at room temperature. A 5 times followed Wash to remove unbound enzyme and the Add 100 µl of the substrate solution (4-Methylumbelliferyl-β-D-galactoside (Sigma), 20 mg / ml in Tris buffer released). The enzymatic reaction was after 30 minutes by adding 100 µl of a lactose solution (35 mg / ml in Tris buffer) and the fluorescence in a microtiter plate fluorometer (from Flow) determines: Excitation wavelength: 355 nm, emission wavelength: 460 nm. For the evaluation of the biotin levels in the plasma, the same method as used for radio iodized LDL (Matthews, C.M.E., Rhys. Med. Biol. 2, 36-53 (1957)).
Hierzu wird der Biotingehalt der 5-Minuten-Abnahmen als 100% (Initialdosis) definiert und die abnehmenden Biotingehalte der nachfolgenden Zeitwerte prozentual auf diese Initialdosis bezogen. Das Ergebnis ist in Abbildung 2 wiedergegeben.For this purpose, the biotin content of the 5-minute decreases is defined as 100% (initial dose) and the decreasing biotin content of the subsequent time values is related as a percentage to this initial dose. The result is shown in Figure 2 .
Folgende Streptavidin-Enzym-Konjugate wurden ebenfalls erfolgreich getestet: Streptavidin-Peroxidase - Enzymaktivitätsnachweis mit z. B. Phenylendiamine (Voller, A. et al. , The enzyme linked immunosorbent assay, Vol. 1, Dynatech Europe, 1979) Streptavidin-Alkalische-Phosphatase-Konjugat - Enzymaktivitätsnachweis mit z. B. p-Nitrophenolphosphat (Synder, S. L. et al. , Biochimie et Biophysica Acta, 258, 178-187, 1972)The following streptavidin-enzyme conjugates were also made successfully tested: Streptavidin peroxidase - Enzyme activity detection with e.g. B. Phenylenediamines (Voller, A. et al., The enzyme linked immunosorbent assay, Vol. 1, Dynatech Europe, 1979) Streptavidin-alkaline phosphatase conjugate - Enzyme activity detection with e.g. B. p-nitrophenol phosphate (Synder, S.L. et al., Biochimie et Biophysica Acta, 258, 178-187, 1972)
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1023052B1 (en) * | 1997-10-17 | 2003-09-10 | Dds Drug Delivery Service Gesellschaft Zur Förderung Der Forschung In Pharmazeutischer Technologie Und Biopharmazie Mbh | Medicament excipient particles for tissue-specific application of a medicament |
-
1990
- 1990-06-08 DE DE19904018325 patent/DE4018325A1/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1023052B1 (en) * | 1997-10-17 | 2003-09-10 | Dds Drug Delivery Service Gesellschaft Zur Förderung Der Forschung In Pharmazeutischer Technologie Und Biopharmazie Mbh | Medicament excipient particles for tissue-specific application of a medicament |
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