DE4009392A1 - PROCESS FOR PREPARING PILOCARPINE FROM IN VITRO CULTURES OF PILOCARPUS - Google Patents
PROCESS FOR PREPARING PILOCARPINE FROM IN VITRO CULTURES OF PILOCARPUSInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pilocarpus aus Suspensions- oder ausdifferenzierten in- vitro-Pflanzenkulturen der Gattung Pilocarpus. Die vor allem in Südamerika beheimatete Gehölzpflanze der Gattung Pilocar pus mit ihren wichtigsten Vertretern P. jaborandi und P. microphyllus enthält unter anderem das Imidazol-Alkaloid Pilocarpin.The invention relates to a process for the preparation of Pilocarpus from suspension or differentiated in vitro plant cultures of the genus Pilocarpus. The most of all in South America native woody plant of the genus Pilocar pus with their main representatives P. jaborandi and P. microphyllus contains, among other things, the imidazole alkaloid Pilocarpine.
Pilocarpin wird als Pharmazeutikum bzw. Therapeutikum eingesetzt. Es ist ein direkt wirkendes Parasympathomimetikum. Es wirkt muscarin- und acetylcholinartig mit dem Vorteil, daß es nicht von Cholinesterase abgebaut werden kann. Es fördert die Sekretion der Schweiß- und Speichel drüsen und regt die glatte Muskulatur des Darmes und der Bronchien an. Das fast alleinige Anwendungsgebiet ist heute die Ophthalmologie. Da es als Miotikum den intraokulären Druck herabsetzt, wird es vorzugsweise zur Behandlung des grünen Stars (Glaukom) eingesetzt.Pilocarpine is used as a pharmaceutical or therapeutic agent used. It is a direct-acting parasympathomimetic. It acts muscarinic and acetylcholine-like with the Advantage that it will not be broken down by cholinesterase can. It promotes the secretion of sweat and saliva glands and excites smooth muscle of the intestine and the Bronchi. The almost sole field of application is today the ophthalmology. As it acts as a miotic the intraocular Reduces pressure, it is preferably used to treat the green stars (glaucoma) used.
Die chemische oder biochemische Gewinnung von Pilocarpin hat sich als schwierig und bislang unökonomisch herausgestellt. So wird der Bedarf an Pilocarpin weitgehend aus der Pflanze selbst durch Isolierung und Aufreinigung des Alkaloids gedeckt. Wie aber bei vielen anderen tropischen Pflanzen auch, bewahren die Samen von Pilocarpus ihre Keimfähigkeit nur sehr kurze Zeit. Innerhalb weniger Wochen ist die Keimrate um mehr als 90% zurückgegangen. Dies bedeutet, daß die Kultivierung von Pilocarpus-Sämlingen nur in der Nähe der natürlichen Standorte erfolgreich durchgeführt werden kann. Ein weiterer Nachteil ist das langsame Wachstum von Sämlingen unter Gewächshausbedingungen.The chemical or biochemical extraction of pilocarpine has proved to be difficult and so far uneconomical. Thus, the need for pilocarpine is largely eliminated from the plant even by isolation and purification of the alkaloid covered. As with many other tropical plants Also, the seeds of Pilocarpus preserve their germination capacity only a very short time. Within a few weeks, that is Germination rate decreased by more than 90%. This means that the cultivation of pilocarpus seedlings only in the vicinity the natural sites are successfully completed can. Another disadvantage is the slow growth of Seedlings under greenhouse conditions.
Andererseits schlugen Versuche bislang fehl, Pilocarpus in- vitro zu kultivieren. Überhaupt ist der Erfolg einer in- vitro-Kultivierung von Gehölzpflanzen, insbesondere aus Kallus, nur in Ausnahmefällen sichergestellt und dies auch nur bei relativ unproblematischen, anspruchslosen Arten (Bonga u. Durzan (1987), Cell and Tissue Culture in Fore stry, Vol. 1-3, Martinus Nÿhoff Publishers; Chalupa (1987) in: Bonga u. Durzan (1987), 1. c.; Wann (1988), Horticultural Reviews 10, 153). Neben der schwierigen in-vitro-Kultivie rung als solche ist es überdies auch äußerst fragwürdig, ob die so erhaltenen in-vitro-Kulturen noch in der Lage sind, das gewünschte Naturprodukt - in diesem Fall Pilocarpin - in akzeptablen Mengen zu synthetisieren. Zahlreiche solcher Kulturen haben sich als nicht praktikabel erwiesen.On the other hand, attempts have so far failed to make Pilocarpus to cultivate in vitro. In general, the success of a in vitro cultivation of woody plants, in particular from Callus, only in exceptional cases, and this too only in relatively unproblematic, undemanding species (Bonga and Durzan (1987), Cell and Tissue Culture in Fore stry, Vol. 1-3, Martinus Nÿhoff Publishers; Chalupa (1987) in: Bonga u. Durzan (1987), 1c .; When (1988), Horticultural Reviews 10, 153). In addition to the difficult in vitro cultivar Moreover, as such, it is extremely questionable whether the resulting in vitro crops are still able to the desired natural product - in this case pilocarpine - in to synthesize acceptable levels. Many such Cultures have proved impractical.
Es bestand somit die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung von Pilocarpin aus Pflanzenmaterial auf Basis einer zur Alkaloidbildung befähigten in-vitro-Kultur zu entwickeln, so daß die oben genannten Nachteile bezüglich der Standort- und Wachstumsbedingungen vermieden werden können. It was therefore the task of a process for the preparation of pilocarpine from plant material based on a Alkaloid formation capable of developing in vitro culture, so that the above-mentioned disadvantages in terms of location and Growth conditions can be avoided.
Es wurde nun gefunden, daß eine vermehrungsfähige und zur Bildung von Pilocarpin befähigte in-vitro-Gewebekultur aus Explantaten von Organfragmenten von Samen und insbesondere jungen Keimlingen von Pilocarpus hergestellt werden kann. Es lassen sich sowohl Suspensions- als auch ausdifferenzierte Kulturen gewinnen. Dabei ist es als erfindungswesentlich anzusehen, daß bei der Herstellung der genannten Kulturen eine ganz bestimmte Zusammensetzung und Abfolge von Hormonen bzw. hormonhaltigen Nährmedien eingehalten werden muß.It has now been found that a replicable and zur Formation of pilocarpine enabled in vitro tissue culture Explants of organ fragments of seeds and in particular young seedlings of Pilocarpus can be produced. It can be both suspension and differentiated Win cultures. It is essential to the invention to be considered that in the production of said cultures a very specific composition and sequence of hormones or hormone-containing culture media must be complied with.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Pilocarpin durch Isolierung und Aufreinigung aus Pilocarpus, dadurch gekennzeichnet, daß man in vitro gezogene Kulturen einsetzt.The invention thus provides a method for Production of pilocarpine by isolation and purification from pilocarpus, characterized in that in vitro used crops.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein entsprechendes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Gewinnung der in-vitro-Kultur einen aus Organexplantaten stammenden Kallus auf einem geeigneten Nährboden herstellt, die Sproßdifferenzierung des Kallus auf unterschiedliche, hintereinander folgende, jeweils spezifische Hormone enthaltende Nährböden induziert und die so gewonnenen Zellen in einer Nährlösung oder nach Induzierung der Wurzelbildung als ausdifferenzierte Pflanze kultiviert.The invention is in particular a corresponding Process characterized in that one has Obtaining the in vitro culture from organ explants originating callus on a suitable nutrient medium, the shoot differentiation of the callus to different, one after another, each containing specific hormones Culture media induced and the cells thus obtained in a nutrient solution or after induction of rooting as cultured differentiated plant.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise wie folgt durchgeführt.The process according to the invention is preferably as follows carried out.
Zur Kultivierung von Pilocarpus eignen sich vorzugsweise die Arten Pilocarpus jaborandi und Pilocarpus microphyllus, insbesondere aber P. microphyllus. Zunächst wird eine Kalluskultur in an sich bekannter Weise hergestellt. Man kann hierzu entweder Samen oder Organexplantate aus Keimlingen von Pilocarpus verwenden.For cultivating Pilocarpus are preferably the Species Pilocarpus jaborandi and Pilocarpus microphyllus, but especially P. microphyllus. First, a Callus culture prepared in a conventional manner. you For this purpose, either seed or organ explants from seedlings from Pilocarpus use.
Die Kallusbildung aus Keimlingen ist allerdings bevorzugt, da die aus Samen hergestellten Kalli in der Regel nicht befähigt sind, ausreichend Sprossen zu bilden. Die Sproßvermehrung ist aber essentiell für das erfindungsgemäße Verfahren. Zur Gewinnung von Kallus aus Explantaten von Keimlingen werden vorzugsweise Keimlinge von 8 bis 12 cm Länge als Ausgangsmaterial eingesetzt. Als Primärexplantate eignen sich beispielsweise Sproßspitzenexplantate oder Blattstielsegmente. Aufgrund der größeren Regenerationsakti vität ist jedoch der Einsatz von Sproßspitzenexplantaten zur Kallusbildung im besonderen Maß bevorzugt. Die Explantate bzw. Keimlinge werden in an sich bekannter Weise präpariert bzw. sterilisiert und unter Belichtung auf ein festes Nährmedium bei Temperaturen zwischen 22°C und 27°C, vor zugsweise 25°C, gegeben und nach Standardmethoden mehrere Wochen lang kultiviert. Diese Kultivierungsbedingungen sind auch für das gesamte erfindungsgemäße Verfahren maßgebend. Als Basis-Nährmedien können Medien verwendet werden, die für Gehölzpflanzen besonders geeignet sind, so beispielsweise das Woody Plant Medium (WPM) (LLoyd u. McCown (1980), Proc. Inter. Plant Prop. Soc. 30, 421) oder Varianten davon. Die qualitative und quantitative Zusammensetzung dieses Grund mediums (ohne Hormone) können in einem gewissen Bereich variiert werden, ohne daß das erfindungsgemäße Verfahren wesentlich beeinflußt wird. Insbesondere läßt sich die Menge an Zucker in einem größeren Bereich verändern (10-40 g/l, vorzugsweise 20 g/l). Das Basalmedium eignet sich sowohl für flüssige Medien als auch für feste Nährböden (Hinzugabe von Gelbildnern wie beispielsweise Agar oder Gelrite). Eine detaillierte Zusammensetzung ist in den Ausführungsbei spielen angegeben. Erfindungswesentlich ist unter anderem die qualitative und quantitative Zusammensetzung der Hormon bestandteile, die dem Basalmedium zugeführt werden müssen, damit eine optimale vegetative Vermehrung der Pilocarpusex plantate einsetzen kann.However, callus formation from seedlings is preferred, because the calli made from seeds usually does not are capable of forming sufficient sprouts. The Sproßvermehrung is essential for the invention Method. To obtain callus from explants of Seedlings are preferably seedlings of 8 to 12 cm Length used as starting material. As primary explants For example, sprout explants or Petiole segments. Due to the larger regeneration act However, the use of shoot tip explants for Callus formation in a particular degree preferred. The explants or seedlings are prepared in a conventional manner or sterilized and exposed to a solid Nutrient medium at temperatures between 22 ° C and 27 ° C, before preferably 25 ° C, and given by standard methods several Cultivated for weeks. These cultivation conditions are also decisive for the entire process according to the invention. As basic nutrient media, media can be used for Woody plants are particularly suitable, such as Woody Plant Medium (WPM) (LLoyd and McCown (1980), Proc. Inter. Plant Prop. Soc. 30, 421) or variants thereof. The qualitative and quantitative composition of this reason mediums (without hormones) can be in a certain range can be varied without the inventive method is significantly affected. In particular, the amount can be to change sugar over a larger range (10-40 g / l, preferably 20 g / l). The basal medium is suitable for both liquid media as well as for solid nutrient media (addition of Gelling agents such as agar or gelrites). A detailed composition is in the embodiment play specified. Essential to the invention is inter alia the qualitative and quantitative composition of the hormone components that must be supplied to the basal medium, thus an optimal vegetative propagation of the Pilocarpusex can use plantate.
Die Bildung von insbesondere organogenem Kallusgewebe aus den Pilocarpusexplantaten wird erfindungsgemäß durch die Zugabe der drei Homone α-Naphthylessigsäure, N⁶-Dimethylal lyladenine und Zeatin zu dem WPM-Basalmedium bewirkt. Die Konzentration beträgt für Naphthylessigsäure 0,75 bis 1,25 mg/l, vorzugsweise 1,0 mg/l, für Dimethyladenine 0,3 bis 0,7 mg/l, vorzugsweise 0,5 mg/l und für Zeatin ebenfalls 0,3 bis 0,7 mg/l, vorzugsweise 0,5 mg/l. Die Kultivierung auf dem hormonhaltigen Medium (M3-Medium) bewirkt eine Kallusbildung durchweg mit Organstrukturen verschiedenster Differenzierung. Überraschenderweise können durch die entsprechende Hormongabe unter anderem ausdifferenzierte somatische Embryonen induziert werden. Dies ist bislang bei kallusvegetativen Pflanzenteilen aus Gehölzen nicht bzw. nicht in dem Ausmaß beobachtet worden. Auf dem M3-Medium werden aus dem organogenen Kallusgewebe vorzugsweise mehrere Subkulturen in an sich bekannter Weise hergestellt. Das Medium fördert im Zusammenwirken mit der Belichtung die Bildung von Organen in großer Zahl. Der Kallus besitzt auf diesem Medium eine hohe induzierte embryogene Potenz. Allerdings kann mit Hilfe des M3-Mediums keine ausreichende Entwicklung von Sprossen erzielt werden. Das Sproßwachstum ist jedoch für die weitere Entwicklung einer funk tionsfähigen in-vitro-Kultur von großer Bedeutung.The formation of particular organogenic callus tissue Pilocarpus explants according to the invention by the Addition of the three homones α-naphthylacetic acid, N⁶-dimethylal lyladenine and zeatin to the WPM basal medium causes. The Concentration for naphthylacetic acid is 0.75 to 1.25 mg / l, preferably 1.0 mg / l, for dimethyladenines 0.3 to 0.7 mg / l, preferably 0.5 mg / l and for zeatin as well 0.3 to 0.7 mg / l, preferably 0.5 mg / l. The cultivation on the hormone-containing medium (M3 medium) causes a Callus formation consistently with organ structures of various kinds Differentiation. Surprisingly, by the appropriate hormone supplement among other things differentiated somatic embryos are induced. This is so far kallusvegetativen plant parts from woody plants or not been observed to that extent. On the M3 medium Preferably, several of the organogenic callus tissue Subcultures prepared in a conventional manner. The Medium promotes the interaction with the exposure Formation of organs in large numbers. The callus is on This medium has a high induced embryogenic potency. However, with the help of the M3 medium can not be sufficient Development of sprouts can be achieved. The shoot growth However, for the further development of a radio of in vitro culture of great importance.
Die Sproßbildung kann nun überraschend durch Umsetzen des organogenen Kallusgewebes auf ein Nährmedium mit geänderter Hormonzusammensetzung bewirkt werden. Als Basalmedium ist beispielsweise wiederum das WPM-Medium in gleicher oder variierter Zusammensetzung, oder vergleichbare andere Medien geeignet. Anstelle der Hormonzusammensetzung des M3-Mediums enthält nach dem erfindungsgemäßen Verfahren das Folgemedium lediglich 6-Benzylaminopurin in einer Konzentration zwischen 0,3 und 0,8 mg/l, vorzugsweise aber zwischen 0,4 und 0,6 mg/l. Das Sproßwachstum teilweise bis zu Sproßbüscheln und die Sproßstreckung wird durch dieses hormonhaltige Medium (Betulamedium) induziert und/oder deutlich gefördert. Dabei tritt der Effekt in der Regel erst bei der zweiten und folgenden Subkultur verstärkt in Erscheinung. Generell beläuft sich die Dauer einer Subkultur auf 30 bis 60 Tage, vorzugsweise auf 40 Tage, je nach Pflanzenmaterial und äußeren Bedingungen, wie Temperatur, Beleuchtung usw. Der vorteilhafte Effekt der erfindungsgemäßen Hormonzugabe läßt sich insbesondere durch die Tatsache verdeutlichen, daß bei Rücksetzung der auf im zweiten Schritt Betulamedien angezogenen Kulturen, das Sproßwachstum sehr rasch auf ein Fünftel bis ein Zehntel reduziert wird.The sprouting can now surprisingly by implementing the organogenic callus tissue on a nutrient medium with altered Hormone composition can be effected. As a basal medium For example, in turn, the WPM medium in the same or varied composition, or similar other media suitable. Instead of the hormone composition of the M3 medium Contains the following medium by the process according to the invention only 6-benzylaminopurine in a concentration between 0.3 and 0.8 mg / l, but preferably between 0.4 and 0.6 mg / l. The shoot growth partly up to tufts and the sprouting is caused by this hormone Medium (Betulamedium) induced and / or significantly promoted. The effect usually occurs only at the second and subsequent subculture in appearance. As a general rule the duration of a subculture is 30 to 60 days, preferably to 40 days, depending on the plant material and external conditions, such as temperature, lighting, etc. The advantageous effect of the hormone addition according to the invention leaves in particular by the fact that at Resetting of Betulamedien in the second step Cultures, the shoot growth very quickly to one-fifth until one tenth is reduced.
Nach mehreren Subkulturen wird die so differenzierte Kultur gegebenenfalls auf ein neues, vorzugsweise WPM-Medium gesetzt, welches die Hormone 6-Benzylaminopurin und Indol-3- essigsäure enthält (DKW-Medium), 6-Benzylaminpurin wird dabei in einer Konzentration von 0,3 bis 0,8 mg/l, vorzugs weise von 0,4 bis 0,6 mg/l, und Indol-3-essigsäure in einer Konzentration von 0,05 bis 0,2 mg/l, vorzugsweise von 0,08 bis 0,15 mg/l eingesetzt. Das DKW-Medium verstärkt weiter die Sproßvermehrung und konditioniert überdies die Sprossen für eine spätere Bewurzelung. Eine solche Bewurzelung ist notwendig um in einem weiteren Verfahrensschritt eine ausdifferenzierte Pflanzenkultur zu erhalten. Zur Herstellung einer reinen Suspensionskultur, für die eine Bewurze lung der Sproßbündel unwesentlich ist, kann auch für die Umsetzung der Kultur vom Betula- auf das DKW-Medium verzichtet werden, ohne daß dabei entscheidende Nachteile entstehen. Umgekehrt kann auch zur Herstellung einer ausdifferen zierten Pflanzenkultur notfalls auf das Betulamedium ver zichtet werden. In jedem Fall ist für das erfindungsgemäße Verfahren wesentlich, daß die Medium-/Hormon-Reihenfolge M3/Betula oder M3/DKW, vorzugsweise aber in allen Fällen die Mediensequenz M3/Betula/DKW eingehalten wird. Der Einsatz des M3-Mediums als Primärmedium ist in jedem Fall essentiell, da eine Kultivierung der Explantate ausschließlich auf Betula oder DKW zur Folge hat, daß nicht ausreichende Kallusmasse gebildet bzw. diese aufgebraucht wird. Zur Herstellung von Suspensionskulturen werden die entsprechenden Betula- oder DKW-Medien ohne Gelbildner eingesetzt.After several subcultures the so differentiated culture becomes optionally on a new, preferably WPM medium which contains the hormones 6-benzylaminopurine and indole-3 contains acetic acid (DKW medium), 6-Benzylaminpurin is while in a concentration of 0.3 to 0.8 mg / l, preferably from 0.4 to 0.6 mg / l, and indole-3-acetic acid in one Concentration of 0.05 to 0.2 mg / l, preferably 0.08 used to 0.15 mg / l. The DKW medium continues to strengthen the sprouting and also conditions the sprouts for a later rooting. Such a rooting is necessary in a further process step a to get differentiated plant culture. For the production a pure suspension culture for which a Bewurze tion of the bundles of shoots is immaterial, can also for the Implementation of the culture of betula on the DKW medium omitted without causing any significant disadvantages. Conversely, can also for the production of a different if necessary planted on the Betulamedium ver be canceled. In any case, for the inventive Procedure essential that the medium / hormone order M3 / Betula or M3 / DKW, but preferably in all cases Media sequence M3 / Betula / DKW is complied with. The use the M3 medium as a primary medium is essential in any case, as a cultivation of the explants exclusively on Betula or DKW has the consequence that insufficient Callus mass formed or this is used up. to Production of suspension cultures will be the corresponding Betula or DKW media used without gelling agent.
Die bekannten Methoden zur Bewurzelung von Sproßkulturen durch Anreicherung der Kulturmedien mit Auxinen führt bei Pilocarpus nicht zum Erfolg. Überraschenderweise kann die Bewurzelung aber durch folgende Verfahrensschritte induziert werden. Die Sprossen werden unter sterilen Bedingungen maximal 3 mm tief in eine wäßrige Auxinlösung getaucht. Es muß eine extrem hohe Auxinkonzentration von 0,8 bis 1,5 g/l, vorzugsweise 1,0 bis 1,2 g/l, eingesetzt werden. Als Auxine eignen sich beispielsweise Indolessigsäure, Indolbuttersäure oder α-Naphthylessigsäure. Besonders bevorzugt ist jedoch Indolbuttersäure. Die Eintauchdauer beträgt drei bis sechs Minuten, vorzugsweise 5 Minuten. Die so behandelte Sproßkultur wird vorzugsweise auf dem DKW-Medium vorkulti viert und anschließend auf ein hormonfreies Medium, bei spielsweise WPM mit einem Gelbildner umgesetzt. Hierbei ist Gelrite gegenüber Agar bevorzugt, da es die Wurzelbildung der Pilocarpuskultur etwa um den Faktor 3 bis 5 erhöht. Ferner wird durch die Wurzelinduktion das Sproßwachstum gefördert. Die so erhaltenen ausdifferenzierten Pilocarpus- in-vitro-Kulturen lassen sich über zahlreiche Subkultur passagen auf einem geeigneten Nährboden, vorzugsweise DKW, kultivieren. Sie können aber auch nach mehreren Subkultur passagen in Erde umgesetzt werden und unter geeigneten Gewächshausbedingungen in an sich bekannter Weise aufgezogen werden.The known methods for rooting shoot cultures by enrichment of the culture media with auxins leads Pilocarpus not to success. Surprisingly, the Rooting but induced by the following process steps become. The sprouts are under sterile conditions 3 mm deep immersed in an aqueous auxin solution. It must have an extremely high auxin concentration of 0.8 to 1.5 g / l, preferably 1.0 to 1.2 g / l, are used. As auxine Indolacetic acid, indolebutyric acid, for example, are suitable or α-naphthylacetic acid. However, it is particularly preferred Indole butyric acid. The immersion period is three to six Minutes, preferably 5 minutes. The so treated Sprout culture is preferably pre-cultivated on the DKW medium fourth and then on a hormone-free medium, at For example, WPM reacted with a gelling agent. Here is Gelrite prefers agar as it causes rooting the Pilocarpus culture increased by a factor of 3 to 5. Furthermore, the root induction causes shoot growth promoted. The differentiated pilocarpus In vitro cultures can be found across many subcultures passages on a suitable nutrient medium, preferably DKW, cultivate. But you can also look for several subculture passages are implemented in soil and under suitable Greenhouse conditions reared in a conventional manner become.
Die Gewinnung von Pilocarpin kann erfindungsgemäß sowohl aus den Suspensionskulturen als auch aus den ausdifferenzierten Kulturen erfolgen. Die Isolierung und Aufreinigung des Alkaloids geschieht nach Standardmethoden und ist in den Ausführungsbeispielen näher dargelegt. Der Gehalt an aufge reinigtem Alkaloid beträgt bei den ausdifferenzierten Kulturen 0,01 bis 0,2% (w/w) bezogen auf das Gesamtgewicht des eingesetzten Pflanzenmaterials, meist 0,05 bis 0,1%. Das entspricht etwa einem Fünftel bis einem Zwanzigstel der Alkaloidmenge von natürlich aufgewachsenem Pilocarpus am Heimatstandort. Bei Suspensionskulturen liegt der Alkaloid gehalt noch etwa um den Faktor zehn tiefer als bei den ausdifferenzierten in-vitro-Kulturen, also zwischen 0,001% und 0,05%, insbesondere zwischen 0,005 bis 0,02% (w/w). Dies bedeutet, daß aus etwa 1 kg Suspensionskultur durch schnittlich 100 mg Pilocarpin isoliert werden können.The production of pilocarpine can according to the invention both from the suspension cultures as well as from the differentiated Cultures are done. The isolation and purification of the Alkaloids happens according to standard methods and is in the Embodiments set forth in more detail. The content of up Purified alkaloid is in the differentiated Cultures 0.01 to 0.2% (w / w) based on the total weight of the plant material used, usually 0.05 to 0.1%. That is about one fifth to one twentieth of the Alkaloid amount of naturally grown pilocarpus on Home base. In suspension cultures, the alkaloid is still about ten times lower than the differentiated in vitro cultures, ie between 0.001% and 0.05%, especially between 0.005 to 0.02% (w / w). This means that from about 1 kg suspension culture by 100 mg pilocarpine can be isolated.
Pilocarpus microphyllus liefert nach dem erfindungsgemäßen Verfahren schneller und leichter geeignete in-vitro-Kulturen mit entsprechend höheren Ausbeuten an Alkaloid als P. jaborandi.Pilocarpus microphyllus provides according to the invention Process faster and easier suitable in vitro cultures with correspondingly higher yields of alkaloid than P. jaborandi.
Samen von P. microphyllus werden 2 Stunden in einer wäßrigen Natriumhypochloritlösung (5%) sterilisiert. Nachfolgend erfolgt 3maliges Waschen mit einem sterilen 1 : 1-Gemisch aus Leitungs- und entionisiertem Wasser 10, 20 und 30 Minuten lang. Die Samenschale wird abgeschält und die geschälten Samen werden längs halbiert und die Spalthälften werden mit der Schnittfläche auf ein M3-Medium (Zusammensetzung in Beispiel 2) gelegt und die Samen quer halbiert. Die Inkuba tion erfolgt im Dunkeln im Brutschrank bei 25-27°C. Nach 7 Wochen werden gebildete Kallusstücke vom Primärexplantat (Wundränder) abgeschnitten und auf ein frisches M3-Medium gegeben. Die Kulturen werden bei etwa 25°C im 16-Stundentag belichtet (3-4 K Lux Mischlicht aus Tageslicht- und Warmton leuchter), herangezogen bis nach mehreren Subkulturpassagen (4-5 Wochen/Passage) eine grüne, sproßorganogene Kalluskultur vorliegt.Seeds of P. microphyllus are 2 hours in an aqueous Sodium hypochlorite solution (5%) sterilized. following 3 times washing with a sterile 1: 1 mixture Tap and deionized water for 10, 20 and 30 minutes long. The seed coat is peeled off and the peeled Seeds are halved lengthwise and the split halves are with the cut surface on a M3 medium (composition in Example 2) and halved the seeds transversely. The Inkuba In the dark, incubate in the incubator at 25-27 ° C. To 7 weeks are formed callus pieces from the primary explant (Wound edges) and cut to a fresh M3 medium given. The cultures are at about 25 ° C in the 16-hour day exposed (3-4 K Lux mixed light of daylight and warm tone candlestick), used until after several subculture passages (4-5 weeks / passage) a green, shoot-organic callus culture is present.
Samen von Pilocarpus microphyllus werden in einem TKS/Sand gemisch unter Warmhausbedingungen zum Keimen gebracht. Nach Erreichen einer Höhe von ca. 10 cm werden die Keimlinge etwa 1 cm über der Erde abgeschnitten. Die Teile werden zur Dekontamination in 70% Ethanol 20 Sekunden lang und anschließend 12 Minuten lang in 5%iger NaOCl-Lösung, der 1 Tropfen Tween 20 zugesetzt ist, getaucht. Es folgt 3maliges Waschen mit sterilem Wasser 2mal 10 Minuten und 1mal 30 Minuten lang. Von den Pflanzenteilen werden Sproßspitzen oder Sproßsegmente von 1 bis 3 mm Größe abgeschnitten und auf das unten angegebene M3-Medium gesetzt. Die Kulturen werden bei Licht im 16-Stundentag (3-4 K Lux Mischlicht aus Tageslicht- und Warmtonleuchter) bei 25°C gehalten. Nach 10-12 Wochen bilden sich grünliche Kallusklumpen, die mehrfach in Subkultur genommen werden. Alle Arbeiten werden unter sterilen Bedingungen vorgenommen. Eine Subkultur passage dauert 4-5 Wochen. Die Kallusmenge nimmt ständig zu. Der Kallus besitzt teilweise ausgeprägte Organanlagen, unter anderem auch ausdifferenzierte somatische Embryonen. Sproßwachstum ist jedoch kaum vorhanden.Seeds of Pilocarpus microphyllus are found in a TKS / sand mixed under hot house conditions to germinate. To Reaching a height of about 10 cm, the seedlings are about Cut off 1 cm above the ground. The parts become the Decontamination in 70% ethanol for 20 seconds and then 12 minutes in 5% NaOCl solution, the 1 drop of Tween 20 is added, dipped. It follows 3 times Wash with sterile water 2 times 10 minutes and 1 time For 30 minutes. The plant parts become sprout tips or shoot segments cut from 1 to 3 mm in size and set to the M3 medium indicated below. The cultures in light in the 16-hour day (3-4 K Lux mixed light off Daylight and Warmtonleuchter) maintained at 25 ° C. To 10-12 weeks greenish callus lumps form be subcultured several times. All work will be under sterile conditions. A subculture passage takes 4-5 weeks. The callus quantity is constantly increasing. The callus possesses partly pronounced organ plants, under other also differentiated somatic embryos. Sprout growth, however, is scarce.
WPM-Medium (hormonfrei):WPM medium (hormone-free):
Organische Bestandteile:Organic ingredients:
M3-Medium:
WPM-Medium (hormonfrei)M3 medium:
WPM medium (hormone-free)
-
a) Die gemäß Beispiel 1 oder 2 hergestellte organogene
Kalluskultur wird unter sterilen Bedingungen auf ein
flüssiges Betulamedium (ohne Agar oder Gelrite) gesetzt
und in mehreren Subkulturpassagen (ca. 2-4 Wochen/
Passage) unter den in Beispiel 1 und 2 angegebenen Bedin
gungen sowie unter ständigem leichten Schütteln kulti
viert. Es setzt eine intensive Sproßentwicklung und
-vermehrung ein.
Betula-Medium:
WPM-Medium (hormonfrei, analog Beispiel 2, ohne Agar)6-Benzylaminopurin 0,5 mg/l
WPM medium (hormone-free, analogous to Example 2, without agar)6-benzylaminopurine 0.5 mg / l -
b) Die gemäß Beispiel 3a erhaltene Suspensionskultur wird
auf ein flüssiges DKW-Medium gesetzt und in mehrfachen
Subkulturpassagen kultiviert.
DKW-Medium:
WPM-Medium (hormonfrei, analog Beispiel 2, ohne Agar+ zusätzlich 10 g/l Saccharose)6-Benzylaminopurin 0,5 mg/l Indol-3-essigsäure 0,1 mg/l
WPM medium (hormone-free, analogous to Example 2, without agar + additionally 10 g / l sucrose)6-benzylaminopurine 0.5 mg / l Indole-3-acetic acid 0.1 mg / l
- a) Die gemäß Beispiel 1 oder 2 hergestellte Kalluskultur wird unter sterilen Bedingungen auf ein Betulamedium (analog Beispiel 3a+Agar) gegeben und in mehreren Subkulturpassagen (ca. 4-5 Wochen/Passage) unter den in Beispiel 1 und 2 angegebenen Bedingungen kultiviert. Es setzt eine intensive, zu Büscheln neigende Sproßent wicklung und -vermehrung ein.a) The callus culture prepared according to Example 1 or 2 is placed on a Betulamedium under sterile conditions (analogously to Example 3a + agar) and in several Subculture passages (about 4-5 weeks / passage) among the in Cultivated Example 1 and 2 conditions. It sets an intense, tufted Sproßent winding and multiplication.
- b) Die gemäß a) hergestellten Sproßkulturen werden auf ein DKW-Medium (analog Beispiel 3b+Agar) gesetzt und mehrfach wie unter a) subkultiviert. Die Kulturen sind jetzt für die Bewurzelung konditioniert.b) The shoot cultures prepared according to a) are placed on a DKW medium (similar to Example 3b + agar) set and repeatedly subcultured as under a). The cultures are now conditioned for rooting.
-
c) Die gemäß Beispiel 3b oder 4b hergestellten Sproß
kulturen werden wie folgt behandelt:
- - 5 Minuten langes Eintauchen der äußeren Spitze (ca. 2-3 mm) der Sprossen in eine wäßrige Lösung von Indolbuttersäure (1000 mg/l).
- - Anziehen einer Sproßvorkultur analog Beispiel 4b,
- - Umsetzen auf hormonfreies WPM-Medium mit Gelrite 3 g/l bei einer Sproßgröße von 15 bis 20 mm,
- - gegebenenfalls Umsetzen in Erde und allmähliche Gewöhnung an nicht sterile Bedingungen.
- - Dip the outer tip (about 2-3 mm) of the sprouts into an aqueous solution of indolebutyric acid (1000 mg / l) for 5 minutes.
- Growing a seed culture according to Example 4b,
- - converting to hormone-free WPM medium with Gelrite 3 g / l with a shoot size of 15 to 20 mm,
- - if necessary, transplant into soil and gradually get used to non-sterile conditions.
320 g des gemäß Beispiel 4 gewonnenen Pflanzenmaterials wird bei 30°C getrocknet und anschließend fein gemahlen. Man nimmt das Material in 400 ml Chloroform und 25 ml 10%iger Ammoniaklösung auf und rührt 20 Minuten lang. Danach filtriert man durch einen Wattebausch in einen Scheidetrichter, der 250 ml 5%ige Schwefelsäure enthält, und schüttelt ca. 1 Minute lang. Nach Phasentrennung wird die Chloroformphase verworfen. Der wäßrige drogenhaltige Rückstand wird nochmals mit 250 ml frischem Chloroform extrahiert, über einen Wattebausch filtriert und mit 250 ml 5%iger Schwefelsäure ausgeschüttelt. Die wäßrige Lösung wird am Rotationsverdampfer vorsichtig auf etwa die Hälfte des Volumens eingeengt. In der Kälte beginnt Pilocarpinhydrochlorid auszukristalli sieren. Ausbeute 285 mg.320 g of the plant material obtained according to Example 4 is dried at 30 ° C and then finely ground. you takes the material in 400 ml of chloroform and 25 ml of 10% Ammonia solution and stirred for 20 minutes. After that filtered through a cotton ball into a separating funnel, containing 250 ml of 5% sulfuric acid, and shake approximately For 1 minute. After phase separation, the chloroform phase discarded. The aqueous drug-containing residue is again extracted with 250 ml of fresh chloroform, over a Wadding pad filtered and with 250 ml of 5% sulfuric acid shaken. The aqueous solution is on a rotary evaporator carefully concentrated to about half of the volume. In the cold, pilocarpine hydrochloride begins to crystallize out Sieren. Yield 285 mg.
Der analytische Nachweis erfolgt über HPLC:Analytical detection is by HPLC:
Säule: LiChrocart 125-4-RP-Select B®, mit
LiChrospher 60®, 5 µm (Fa.
E. Merck, Darmstadt, FRG)
Eluens: 5%ige wäßrige KH₂PO₄-Lösung, pH 2,5
Säulentemperatur: 45°C
Fließgeschwindigkeit: 2 ml/Minute
Detektion: 216 nmColumn: LiChrocart 125-4-RP-Select B®, with LiChrospher 60®, 5 μm (from E. Merck, Darmstadt, FRG)
Eluent: 5% aqueous KH₂PO₄ solution, pH 2.5
Column temperature: 45 ° C
Flow rate: 2 ml / minute
Detection: 216 nm
Claims (11)
- - α-Naphthylessigsäure, N⁶-Dimethylallyladenin und Zeatin,
- - 6-Benzylaminopurin und/oder
- - 6-Benzylaminopurin und Indol-3-essigsäure
- α-naphthylacetic acid, N⁶-dimethylallyladenine and zeatin,
- 6-Benzylaminopurine and / or
- 6-Benzylaminopurine and indole-3-acetic acid
- - α-Naphthylessigsäure, N⁶-Dimethylallyladenin und Zeatin und
- - 6-Benzylaminopurin
- α-naphthylacetic acid, N⁶-dimethylallyladenine and zeatin and
- 6-Benzylaminopurine
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