DE4005025A1 - Improving transformation rate for Bacillus licheniformis host - by incubating foreign DNA with host cell modifying enzyme before transfer - Google Patents
Improving transformation rate for Bacillus licheniformis host - by incubating foreign DNA with host cell modifying enzyme before transferInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das es erlaubt, solche Mikro organismen, die über ein enzymatisches Restriktions-/Modifikations- System verfügen, mit höherer Trefferquote durch Einführung von Fremd-DNA zu transformieren.The invention relates to a method that allows such micro organisms that have an enzymatic restriction / modification System with a higher hit rate by introducing Transform foreign DNA.
Aus den US-Patentschriften 42 37 224, 44 68 464 und 47 40 470 sind Methoden und Mischungen bekannt, die es erlauben, exogene Gene in Mikroorganismen zu replizieren und zu exprimieren. Wenngleich diese Methoden in vielen Fällen mit Erfolg angewandt werden können, so treten doch insbesondere dann Schwierigkeiten auf, wenn die zu transformierenden Mikroorganismen über ein Restriktions-/Modifi kations-System verfügen. U.S. Patent Nos. 4,237,224, 4,468,464 and 4,740,470 Methods and mixtures known that allow exogenous genes to be found in To replicate and express microorganisms. Although this Methods can be applied successfully in many cases, so Difficulties arise especially when they are closed transforming microorganisms via a restriction / modification cation system.
Derartige Restriktions- und Modifikations-Systeme sind in der Natur weit verbreitet. Sie dienen dem Organismus dazu, Fremd-DNA durch Restriktionsenzyme unter Spaltung abzubauen und eigene DNA durch die Wirkung von Modifikationsenzymen zu modifizieren, wodurch sie Sta bilität gegenüber den Restriktionsenzymen erhalten.Such restriction and modification systems are in nature widespread. They serve the organism through foreign DNA To break down restriction enzymes under cleavage and own DNA through the Modify the effect of modification enzymes, thereby Sta maintenance of the restriction enzymes.
Aufgrund der Wirkungsweise derartiger Modifikations- und Restrik tions-Systeme ist es schwierig in Mikroorganismen, die eine derar tige enzymatische Ausstattung enthalten, Fremd-DNA einzuschleusen. An der eingeschleusten Fremd-DNA findet Modifikation und Restriktion in konkurrierender Weise statt, so daß nur dann Transformanten ent stehen können, wenn die Modifikation der Fremd-DNA schneller ablief als die Restriktion.Because of the mode of action of such modification and restriction tion systems, it is difficult in microorganisms that are one of them contain enzymatic equipment to inject foreign DNA. Modification and restriction take place on the introduced foreign DNA in a competing manner, so that only then transformants ent can stand if the modification of the foreign DNA was faster than the restriction.
Aus der Veröffentlichung von Vehmaanperä in FEMS (Microbiology Let ters 49 (1988) 101-105) ist es bekannt, einen zellfreien Extrakt aus Bacillus amyloliquefaciens herzustellen, der dazu verwendet werden kann, DNA in vitro zu modifizieren und deren Transformier barkeit dadurch zu verbessern. Dazu werden Zellen durch Behandlung mit dem Enzym Lysozym zu Protoplasten umgeformt und diese durch ei nen osmotischen Schock lysiert. Nach Entfernung der Zelltrümmer (Zentrifugation) wird die DNA der lysierten Zellen durch einen Fäl lungsschritt mit Streptomycin-Sulfat entfernt. Die anschließende Dialyse gegen Puffer, der u.a. EDTA enthält, führt dann zu dem zellfreien Extrakt, der die Restriktions-/Modifikations-Enzyme ent hält.From the publication of Vehmaanperä in FEMS (Microbiology Let ters 49 (1988) 101-105) it is known to be a cell-free extract from Bacillus amyloliquefaciens used can be modified DNA in vitro and its transformation to improve the availability. This is done by treating cells transformed with the enzyme lysozyme into protoplasts and these by ei lysed an osmotic shock. After removing the cell debris (Centrifugation) the DNA of the lysed cells is precipitated removed with streptomycin sulfate. The subsequent one Dialysis against buffer, which among other things EDTA contains then leads to that cell-free extract that ent the restriction / modification enzymes holds.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der Erfindung, die Transfor mierbarkeit von Mikroorganismen der Art Bacillus licheniformis, die über ein Restriktions-/Modifikations-System verfügen, durch einen einfachen Verfahrensschritt zu verbessern. Against this background, it is the task of the invention, the Transfor Miscibility of microorganisms of the species Bacillus licheniformis, the have a restriction / modification system through a to improve simple process step.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Zell-Lysat mit Methylase-Aktivität aus einem Stamm B. licheniformis DSM 641, DSM 3406 und/oder DSM 3407 bzw. deren Mutanten und Varianten bereitzu stellen.Another object of the invention is to use a cell lysate Methylase activity from a strain B. licheniformis DSM 641, DSM 3406 and / or DSM 3407 or their mutants and variants put.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Erhöhung der Anzahl von Transformanten bei der Übertragung von Fremd-DNA auf ei nen Empfänger-Mikroorganismus mit einem enzymatischen Restrikti ons-/Modifikations-System, dadurch gekennzeichnet, daß manThe invention therefore relates to a method for increasing the Number of transformants in the transfer of foreign DNA to egg NEN recipient microorganism with an enzymatic restriction ons / modification system, characterized in that one
- - die Restriktions- und Modifikationsenzyme aus Zellen eines Empfänger-Mikroorganismus der Art Bacillus licheniformis freisetzt,- The restriction and modification enzymes from one cell Receiver microorganism of the species Bacillus licheniformis releases,
- - die Restriktionsenzyme inhibiert, sodann- Inhibits the restriction enzymes, then
- - die Modifikationsenzyme in vitro auf die Fremd-DNA in Gegenwart eines Cofaktors einwirken läßt und hernach die so modifizierte DNA in bekannter Weise auf den gleichen Empfänger-Mikroorganismus überträgt.- The modification enzymes in vitro on the foreign DNA in Presence of a cofactor and then the modified DNA in a known manner on the transmits the same recipient microorganism.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Zell-Lysat mit Me thylaseaktivität aus Bacillus licheniformis DSM 641, DSM 3406 und/oder DSM 3407 und/oder deren Mutanten und/oder Varianten, die über ein Restriktions-/Modifikations-Enzymsystem verfügen, hergestellt durch Anzüchten von Zellen, mechanischem oder enzymatischem Auf schluß und Abtrennung gröberer Bestandteile oder höhermolekularer Produkte durch Filtration und/oder Zentrifugation.Another object of the invention is a cell lysate with Me thylase activity from Bacillus licheniformis DSM 641, DSM 3406 and / or DSM 3407 and / or their mutants and / or variants that via have a restriction / modification enzyme system by growing cells, mechanical or enzymatic Auf conclusion and separation of coarser components or higher molecular weight Products by filtration and / or centrifugation.
Schließlich ist Gegenstand der Erfindung eine isolierte DNA, ent haltend ein- oder mehrfach die ErkennungssequenzFinally, the invention relates to an isolated DNA, ent holding the recognition sequence one or more times
5′...GCNGC...3′ (N=A,G,C oder T)5 ′ ... GCNGC ... 3 ′ (N = A, G, C or T)
in vitro methyliert mit dem Zell-Lysat.in vitro methylated with the cell lysate.
Nach der erfindungsgemäßen Lehre wird somit vorgeschlagen, bei der Transformation von Mikroorganismen, die ein Restriktions-/Modifi kations-System enthalten oder bei denen dies vermutet wird, vor dem eigentlichen und an sich bekannten Transformationsschritt zunächst eine gewisse Menge der Biomasse des Empfänger-Organismus herzustel len, die Mikroorganismen aufzuschließen, Zelltrümmer und dergleichen abzutrennen, und das so gewonnene Lysat nach Inhibierung des Re striktionsenzyms gewünschtenfalls in Gegenwart eines Cofaktors auf eine beliebige Fremd-DNA einwirken zu lassen, von der man beabsich tigt, sie in diesen Mikroorganismus einzuführen.According to the teaching of the invention, it is thus proposed that Transformation of microorganisms that a restriction / modifi cation system or where this is suspected, before actual and known transformation step first to produce a certain amount of the biomass of the recipient organism len to unlock the microorganisms, cell debris and the like separate, and the lysate thus obtained after inhibition of Re striction enzyme if desired in the presence of a cofactor to allow any foreign DNA to take effect from which one is looking introduces them into this microorganism.
Nach einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird von solchen Mi kroorganismem ausgegangen, die als Modifikationssystem über Methyla sen verfügen. In diesem Falle werden als Cofaktoren Methylgruppen donatoren eingesetzt. Erfindungsgemäß werden die Cofaktoren in Men gen von 80 µm eingesetzt. Ein geeigneter und bevorzugter Methyl gruppendonator ist S-Adenosylmethionin.According to a preferred variant of the method, such Mi kroorganismem assumed that as a modification system on methyl sen. In this case, methyl groups are used as cofactors donors used. According to the cofactors in Men gene of 80 µm used. A suitable and preferred methyl group donor is S-adenosylmethionine.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man die Emp fänger-Mikroorganismen zunächst in üblicher Weise anzüchten. Vor zugsweise wird dann zunächst vom Nährmedium abgetrennt und in einem anderen Medium resuspendiert. Suspendiert werden kann beispielsweise in einem Puffermedium, so z.B. in einem Trispuffer bei einem pH um den Neutralbereich. Die Zerstörung der Zellen erfolgt dann in an sich bekannter Weise mechanisch oder enzymatisch/osmotisch. So kann man die Mikroorganismen-Suspension zur Erzeugung hoher Scherkräfte unter Druck durch enge Düsen pressen ("French Press") oder durch schnell-laufende Rührwerke homogenisieren. Auch die Anwendung von Ultraschall ist möglich. Die Suspension der aufgebrochenen Zellen wird dann einem Reinigungsschritt unterzogen. Dazu kann filtriert werden oder bevorzugt zentrifugiert werden.To carry out the method according to the invention, the Emp Cultivate catcher microorganisms in the usual way. Before it is then preferably first separated from the nutrient medium and in one other medium resuspended. Can be suspended, for example in a buffer medium, e.g. in a Tris buffer at pH around the neutral range. The cells are then destroyed in on mechanically or enzymatically / osmotically known manner. So can the microorganism suspension to generate high shear forces press under pressure through narrow nozzles ("French Press") or through Homogenize high-speed agitators. Even the application of Ultrasound is possible. The suspension of the broken cells is then subjected to a cleaning step. This can be filtered are or preferably centrifuged.
Im Rahmen der Erfindung ist es bevorzugt, Zelltrümmer und derglei chen durch Ultrazentrifugation abzutrennen. Geeignete Bedingungen liegen beispielsweise bei 40 000 g unter einer Zentrifugationszeit von 30 min.In the context of the invention it is preferred to keep cell debris and the like separated by ultracentrifugation. Suitable conditions are, for example, 40,000 g less than a centrifugation time from 30 min.
Die so hergestellten gereinigten Lysate enthalten sowohl das Modi fikations- als auch das Restriktionsenzymsystem. Es hat sich jedoch gezeigt, daß das Restriktionsenzymssystem in einfacher Weise inhi biert werden kann. Dazu wird erfindungsgemäß ein Inhibitor beigege ben. Es ist bevorzugt, den Inhibitor schon von vornherein der Puf ferlösung zuzusetzen. Als geeignete Inhibitoren sind hier Komplex bildner einzusetzen. Unter den Komplexbildnern ist EDTA (Ethylendi amtetraessigsäure) bevorzugt. Erfindungsgemäß werden die Komplex bildner in Konzentration von 10 bis 100 mM eingesetzt.The purified lysates so produced contain both the modes fiction as well as the restriction enzyme system. However, it has demonstrated that the restriction enzyme system inhi in a simple manner can be beer. According to the invention, an inhibitor is added to this ben. It is preferred to inhibit the puf from the outset add solution. Complex are suitable inhibitors here to use educators. Among the complexing agents is EDTA (ethylenedi amtetraacetic acid) preferred. According to the complex Formers used in a concentration of 10 to 100 mM.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet, wenn man als Empfänger-Mikroorganismus einen Restriktions-/Modifikations-System enthaltenden Stamm Bacillus licheniformis einsetzt. Geeignete Stämme sind hier B. licheniformis DSM 641, DSM 3406 und/oder DSM 3407 und/oder deren Mutanten und Varianten, soweit sie ebenfalls über dieses Restriktions-Modifikations-System verfügen.The method according to the invention is particularly suitable if Recipient microorganism a restriction / modification system containing strain Bacillus licheniformis. Suitable strains here are B. licheniformis DSM 641, DSM 3406 and / or DSM 3407 and / or their mutants and variants, insofar as they also have this Restriction modification system.
Das Vorhandensein eines entsprechenden Restriktions-/Modifkations- System kann der Fachmann feststellen, indem er ein fremdes Plasmid bekannter Zusammensetzung in den Stamm transformiert, Transformanten anzüchtet und aus diesen Transformanten das Plasmid reisoliert. Es wird dann überprüft, ob geeignete Restriktions-Enzyme das reisolierte Plasmid im Vergleich zu dem Ausgangsplasmid noch an allen Erkennungsstellen spalten können. Ist dies nicht der Fall, so besitzt der untersuchte Stamm ein spezifisches Restriktions-Modifi kations-System.The presence of a corresponding restriction / modification The person skilled in the art can determine the system by using a foreign plasmid known composition transformed into the strain, transformants grown and the plasmid reisolated from these transformants. It it is then checked whether suitable restriction enzymes re-isolated plasmid compared to the starting plasmid can split all recognition points. If this is not the case, then the strain under investigation has a specific restriction modification cation system.
Im einzelnen wird dazu beispielsweise ein Plasmid, das eine oder mehrere Schnittstellen für das Restriktionsenzym BbvI aufweist und aus einem Organismus stammt, der nicht zur Art Bacillus licheniformis gehört, beispielsweise Bacillus subtilis, in Bacillus licheniformis DSM 641 transformiert. Dazu werden zunächst Proto plasten hergestellt, indem man die Murein-Zellwand mit geeigneten Enzymen auflöst, und danach das Plasmid zusammen mit Polyethylenglykol auf die Protoplasten einwirken läßt. Dazu wird vorzugsweise in Pufferlösungen gearbeitet. Die Protoplasten werden dann auf einem Regenerierungsmedium weiter gezüchtet und die so er haltenen intakten Mikroorganismen, die das Plasmid enthalten, durch ein Selektionsverfahren (Antibiotikaresistenz) isoliert.For example, a plasmid containing one or has several interfaces for the restriction enzyme BbvI and comes from an organism that is not of the Bacillus species licheniformis belongs, for example Bacillus subtilis, in Bacillus licheniformis DSM 641 transformed. To do this, Proto plastic by making the murein cell wall with suitable Enzymes dissolves, and then the plasmid along with Polyethylene glycol can act on the protoplasts. This will preferably worked in buffer solutions. The protoplasts are then grown on a regeneration medium and so he kept intact microorganisms containing the plasmid by a selection process (antibiotic resistance) isolated.
Das transformierte Plasmid wird aus Bacillus licheniformis reisoliert und mit BbvI geschnitten. Durch die Modifikation an den Erkennungsstellen für BbvI wird das Plasmid nicht mehr gespalten.The transformed plasmid is derived from Bacillus licheniformis reinsulated and cut with BbvI. By modifying the The plasmid is no longer cleaved for recognition sites for BbvI.
Alternativ kann das Vorhandensein eines Restriktions-/Modifika tions-Systems auch durch Inkubation der zu transformierenden DNS mit dem erfindungsgemäß hergestellten Zellextrakt aus dem zu untersu chenden Stamm festgestellt werden. Nach Transformation der inku bierten DNA in den zu untersuchenden Stamm ist die Anzahl der Transformanten im Vergleich zu unbehandelter DNA signifikant erhöht.Alternatively, the presence of a restriction / modifier tion system by incubating the DNA to be transformed with the cell extract produced according to the invention from the to be examined appropriate strain. After transformation of the inku DNA in the strain to be examined is the number of Transformants significantly increased compared to untreated DNA.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Zell-Lysat mit Methylaseakti vität aus B. licheniformis DSM 641, DSM 3406 und/oder DSM 3407 und/oder deren Mutanten oder Varianten, die über ein Restriktions und Modifikationssystem verfügen. Das Zell-Lysat wird bevorzugt nach der o.g. Methode hergestellt, d.h. die Zellen werden mechanisch oder enzymatisch aufgeschlossen, größere Zellstücke werden durch Zentri fugation oder auch durch Filtrationsmethoden abgetrennt. Gewünsch tenfalls kann dem Zell-Lysat ein Inhibitor, etwa ein Komplexbildner und insbesondere EDTA beigegeben werden, so daß dann nur noch die Modifikationsenzyme, nicht mehr hingegen die Restriktionsenzyme, aktiv sind.The invention further relates to a cell lysate with methylase reactions vity from B. licheniformis DSM 641, DSM 3406 and / or DSM 3407 and / or their mutants or variants which have a restriction and modification system. The cell lysate is preferred after the above Method, i.e. the cells become mechanical or enzymatically digested, larger pieces of cell are separated by centri fugation or separated by filtration methods. Desire If necessary, the cell lysate can be inhibited, such as a complexing agent and in particular EDTA, so that only the Modification enzymes, but no longer the restriction enzymes, are active.
Derartige Zell-Lysate sind in der Lage, in der Gegenwart von Cofak toren, nämlich Methylgruppendonatoren, wie beispielsweise S-Adeno sylmethionin DNA zu methylieren und können dazu eingesetzt werden. So können lineare oder cyclische DNA-Stücke, die in die o.g. Mikro organismen-Stämme Bacillus licheniformis DSM 641, DSM 3406 und/oder DSM 3407 oder deren Mutanten oder Varianten eingeführt werden sol len, mit dem Zell-Lysat inkubiert werden. Durch die dabei ablaufende Methylierungsreaktion wird die Fremd-DNA praktisch inert gegen die Restriktionsenzyme der Stämme, so daß die Stämme mit einer Vielzahl von Plasmiden zu stabilen Transformanten umgeformt werden können.Such cell lysates are able to methylate in the presence of cofactors, namely methyl group donors such as S-adenosylmethionine DNA and can be used for this purpose. Thus, linear or cyclic pieces of DNA which are to be introduced into the above-mentioned microorganism strains Bacillus licheniformis DSM 641 , DSM 3406 and / or DSM 3407 or their mutants or variants can be incubated with the cell lysate. As a result of the methylation reaction taking place, the foreign DNA becomes practically inert to the restriction enzymes of the strains, so that the strains can be transformed into stable transformants with a large number of plasmids.
Die so methylierte Fremd-DNA wird von B. licheniformis nicht als fremd erkannt und daher nicht gespalten. Das genannte Zell-Lysat ist jedoch auch geeignet, um Schnittstellen, zum Beispiel Schnittstellen der Restriktionsendonuclease BbvI zu blockieren.The foreign DNA so methylated is not considered by B. licheniformis recognized by others and therefore not split. The cell lysate mentioned is however also suitable for interfaces, for example interfaces the restriction endonuclease BbvI.
Im einzelnen wird dazu beispielsweise Bacillus licheniformis DSM 641 in 50 ml HPG-Medium (1% Pepton; 0,5% Hefeextrakt; 0,5% NaCl; 0,5% Glukose) über Nacht angezüchtet. Die Zellen werden abzentri fugiert und der Zellniederschlag in 20 ml 0,9% NaCl resuspendiert. Der Waschvorgang wird ein zweites Mal wiederholt, worauf die gewa schenen Zellen in 10 ml Puffer (50 mM Tris/HCl pH 8,0; 5 mM Mercap toethanol; 5% Glycerin, 100 mM EDTA) aufgeschwemmt werden. Die Zellen werden sodann durch zweimaliges Passieren durch eine French press bei maximalem Druck aufgebrochen und die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 40 000×g für 30 min. abgetrennt. Der so erhal tene klare Zellextrakt kann entweder direkt für die in vitro Methy lierung einer DNA verwendet werden oder für die weitere Verwendung bei -20°C tiefgefroren werden.In detail, for example, Bacillus licheniformis DSM 641 in 50 ml HPG medium (1% peptone; 0.5% yeast extract; 0.5% NaCl; 0.5% glucose) grown overnight. The cells become centric fugiert and the cell precipitate in 20 ml 0.9% NaCl resuspended. The washing process is repeated a second time, after which the waa cells in 10 ml buffer (50 mM Tris / HCl pH 8.0; 5 mM Mercap toethanol; 5% glycerol, 100 mM EDTA) can be suspended. The Cells are then passed through a French twice press broken open at maximum pressure and the cell debris through Centrifugation at 40,000 x g for 30 min. separated. The so get This clear cell extract can either be used directly for in vitro methy DNA can be used or for further use be frozen at -20 ° C.
Zur Methylierung einer DNA geht man beispielsweise von 5 µg zu transformierender DNA aus. Sie wird mit Ethanol gefällt, getrocknet und 50 µl Zellextrakt mit 80 µM S-Adenosylmethionin resuspendiert. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C wird die DNA erneut mit Ethanol gefällt, einmal mit 80% Ethanol gewaschen und in 50 µl eines ge eigneten Puffers, z.B. 10 mM Tris/HCl pH 7.6; 1 mM EDTA resuspen diert. In dieser Form wird die DNA für die Transformation einge setzt.For example, 5 µg is used to methylate a DNA transforming DNA. It is precipitated with ethanol, dried and 50 µl cell extract resuspended with 80 µM S-adenosylmethionine. After 1 hour incubation at 37 ° C, the DNA is again with ethanol precipitated, washed once with 80% ethanol and in 50 µl of a ge suitable buffers, e.g. 10 mM Tris / HCl pH 7.6; Resuspend 1mM EDTA dated. In this form, the DNA is used for the transformation puts.
Claims (13)
- - die Restriktions- und Modifikationsenzyme aus Zellen eines Empfänger-Mikroorganismus der Art Bacillus licheniformis freisetzt,
- - die Restriktionsenzyme inhibiert, sodann
- - die Modifikationssysteme in vitro auf die Fremd-DNA in Gegenwart eines Cofaktors einwirken läßt und hernach die so modifizierte DNA in bekannter Weise auf den gleichen Empfänger-Mikroorganismus überträgt.
- releases the restriction and modification enzymes from cells of a recipient microorganism of the species Bacillus licheniformis,
- - Inhibits the restriction enzymes, then
- - The modification systems in vitro can act on the foreign DNA in the presence of a cofactor and then transfers the modified DNA in a known manner to the same recipient microorganism.
5′...GCNGC...3′ (N=A,G,C oder T)
in vitro methyliert mit einem Zell-Lysat gemäß den Ansprüchen 11 und 12.13. Isolated DNA, containing the recognition sequence one or more times
5 ′ ... GCNGC ... 3 ′ (N = A, G, C or T)
methylated in vitro with a cell lysate according to claims 11 and 12.
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