DE3885668T2

DE3885668T2 - Kluyveromyces als Wirtsstamm.

Info

Publication number: DE3885668T2
Application number: DE88201632T
Authority: DE
Inventors: Krijn Dr Rietveld; Den Berg Johannes A Dr Van; Ooyen Albert J J Dr Van
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1987-07-28
Filing date: 1988-07-28
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2008-07-29
Also published as: ATE97446T1; EP0301670A1; DK175203B1; ES2061632T5; GR3034358T3; CN1040052A; FI883540A0; FI107939B; ES2061632T3; KR890002407A; FI883540L; NZ225597A; HUT47637A; DK422188D0; IL87258A; DE3885668D1; NO883347L; NO302485B1; DE3885668T3; IE62458B1

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Kluyveromyces für die Erzeugung von interessierenden Polypeptiden, die bevorzugt in das Wachstumsmedium sekretiert werden. Die Erfindung wird mit Beispielen belegt durch Sequenzen, die bei der Produktion von Chymosin und Vorläufern davon, Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) und menschlichem Serumalbumin (HSA) in Kluyveromyces brauchbar sind.

Hintergrund der Erfindung

Die glänzenden Hoffnungen auf die Produktion von Peptiden in Mikroorganismen sind durch eine Anzahl von Faktoren getrübt worden. In vielen Fällen, in denen das Peptid in dem Cytoplasma produziert und zurückgehalten worden ist, haben sich Einschlusskörper gebildet, wodurch die Denaturierung und Renaturierung des Proteins erforderlich wurde, häufig mit nur teilweisem oder geringem Erfolg. In anderen Fällen war das Peptid wesentlichem Abbau ausgesetzt worden, so dass nicht nur die Ausbeuten niedrig sind, sondern auch komplizierte Gemische erhalten werden, die sich schwer trennen lassen. Als potentielle Lösung für diese Schwierigkeiten ist die Möglichkeit der Sekretion des gewünschten Peptides in das Nährmedium untersucht worden. Die Sekretion hat beschränkten Erfolg gehabt, da gefunden wurde, dass nicht alle Proteine zur Sekretion in den Wirten, die verwendet worden sind, befähigt sind. Selbst wenn das Peptid sekretiert wird, kann die Prozessierung des Peptids zu einem Produkt führen, das von der Zusammensetzung und/oder Konformation des gewünschten Peptides verschieden ist. Es besteht daher ein wesentliches Interesse daran, fähig zu sein, Systeme für die effiziente und wirtschaftliche Produktion von aktiven Peptiden unter Bedingungen, die die Verwendung der Peptide in einer grossen Vielfalt von Milieus sowohl in vitro als auch in vivo erlauben, zu entwickeln.

Relevante Literatur

Die europäische Patentanmeldung (EP-A) 0 096 430 offenbart Kluyveromyces als einen Wirt für die Klonierung und Expression von Fremdgenen. Jedoch wurde die Fähigkeit zum Sekretieren von Proteinen in das Wachstumsmedium nicht erwähnt.
Die Signalsequenz von Amyloglucosidase für Aspergillus wird beschrieben von Boyle et al., EMBO J. (1984) 3:1581-1585 und Innis et al., Science (1985) 228:21-26. Lactasepromotoren werden beschrieben von Breunig et al., Nucleic Acids Res. (1984) 12:2327-2341. Die Verwendung von Signalpeptiden in Verbindung mit Paarungstyp-α-Faktor und der Enzyme Invertase und saure Phosphatase zum Steuern der Sekretion von heterologen Proteinen in Saccharomyces ist in der EP-A-0 123 544 und von Sinith et al., Science (1985) 229: 1219 beschrieben worden.
Die Produktion von Präprochymosin, Prochymosin und Chymosin in Saccharomyces wurde studiert von Mellor et al., Gene (1983) 24:1-14. Wenn Prochymosin intrazellulär in Saccharomyces hergestellt wird, ist nur ein niedriger Prozenzsatz des erhaltenen Prochymosins aktivierbar. Siehe Moir et al. in Developments in Industrial Biology (1985) 26: 75-85; Mellor et al., Gene (1983) 24:1-14; Kingsman et al. in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews Bd. 3 (1985) 376-418. Das aggregierte Prochymosin, das von Saccharomyces erzeugt wurde, erforderte komplizierte Methoden der Denaturierung und Renaturierung, um das Prochymosin löslich zu machen. Siehe WO 83/04 418 und EP-A-0 114 506.

Zusammenfassung der Erfindung

Es werden Peptidproduktionssysteme zur Verfügung gestellt, die Kluyveromyces-Wirtsstämme, Expressionskassetten, die effiziente Initiations- und Terminationsregionen für die Transkription einschliessen, für die Verwendung in Kluyveromyces und ein Gen, das gegebenenfalls eine Signalsequenz für die Sekretion enthält, unter der Transkriptions- und Translationsregulation der regulatorischen Regionen aufweisen. Die Kassetten werden in den Kluyveromyces-Wirtsstamm unter Bedingungen eingeführt, unter denen die resultierenden Transformanten die Expressionskassetten stabil vererben. Natürlich vorkommende DNA und synthetische. Gene können für die Produktion von interessierenden Peptiden verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 ist eine Darstellung des Plasmids pGBTe418;
Figur 2 ist eine Darstellung des Plasmids pGB901;
Figur 3 ist eine Beschreibung der synthetisierten Oligonucleotide der Signalsequenz, die an die Amyloglucosidasesignalsequenz angepasst ist;
Figur 4 ist eine Beschreibung einer synthetischen Signalsequenz;
Figur 5 ist ein Immunoabdruck, der die Sekretion von Prochymosin durch K. lactis zeigt;
Figur 6 ist die Sequenz des gesamten BamHI-Insertionselementes aus pDM100Pc einschliesslich des Fusionspeptids des α-Faktors von S. cerevisiae und des Prochymosins sowie der Regulationsregionen der Transkription;
Figur 7 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pKS105;
Figur 8 zeigt die Strategie, die angewandt wurde, um Oligonucleotidsonden zu entwerfen, die zum Identifizieren von K. lactis-α-Faktor-DNA verwendet werden;
Figur 9 ist die vollständige Sequenz eines DNA- Fragmentes, das für den K. lactis-α-Faktor codiert;
Figur 10 ist eine Beschreibung des Plasmids, das für die Expression der Fusion der (α-Faktor-Signalsequenz und des Prochymosin-Strukturgens verwendet wird;
Figur 11 zeigt die Sequenzen um das Verbindungsstück in α-Faktor/Prochymosin-Fusionen herum;
Figur 12 ist die Sequenz des BamHI/SalI-Insertionselementes von pAB309;
Figur 13 stellt die Sequenzen der Primer für die Mutagenese von K. lactis-(α-Faktor-Signal-DNA dar;
Figur 14 ist eine Darstellung des Plasmids puCG418;
Figur 15 ist eine Darstellung des Plasmids pGBtPA1;
Figur 16 zeigt die Sekretion von menschlichem t-PA durch K. lactis, wie sie auf einem SDS-Polyacrylamidgel, das mit einem Plasminogen/Fibrin-Agarosegel überschichtet ist, analysiert wurde;
Figur 17 ist eine Darstellung des Plasmids pGBtPA2;
Figur 18 ist eine Darstellung des Plasmids pGBHSA3;
Figur 19 zeigt die Sekretion von HSA durch K. lactis, wie sie auf einem 10%-igen Polyacrylamidgel analysiert wurde.

Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen

Gemäss der vorliegenden Erfindung werden Expressionskassetten zur Verfügung gestellt, die die effiziente und wirtschaftliche Produktion von Polypeptiden durch Kluyveromyces-Hefezellen erlauben. Die Expressionskassetten haben Regulationssequenzen der Transkription und Translation, die in einer Kluyveromyces- Wirtszelle funktionsfähig sind, und einen offenen Leseraster, der für ein interessierendes Peptid codiert unter der Transkriptions- und Translationskontrolle der Regulationsregionen. Der offene Leseraster kann auch eine Signalsequenz einschliessen, die von dem Kluyveromyces-Wirt erkannt wird und die für die Sekretion des Polypeptids in das Wachstumsmedium sorgt. Die verwendeten Kluyveromyces-Zellen können entweder Laboratoriumsoder industrielle Stämme sein.
Die Expressionskassette enthält in der 5'-3'- Richtung der Transkription eine Regulationsregion für die Initiation der Transkription und Translation, einen offenen Leseraster, der für ein interessierendes Peptid codiert, wünschenswerterweise mit einer Signalsequenz für die Sekretion, die durch Kluyveromyces erkannt wird, und eine Terminationsregion für die Translation. Die Expressionskassette weist ferner eine Regulationsregion für die Termination der Transkription auf. Die Regulationsregionen für die Initiation und Termination sind in Kluyveromyces funktionsfähig und sorgen für die effiziente Expression des interessierenden Peptids ohne unerwünschte Wirkungen auf die Lebensfähigkeit und Fortpflanzung des Kluyveromyces-Wirts.
Die Regulationsregion für die Initiation der Transkription und Translation kann homolog oder heterolog in bezug auf Kluyveromyces sein. Von besonderem Interesse sind Initiationsregionen für die Transkription aus Genen, die in Kluyveromyces oder anderen Hefespezies, wie Saccharomyces, zum Beispiel cerevisiae, Schizosaccharomyces, Candida usw., oder anderen Pilzen, zum Beispiel Fadenpilzen, wie Aspergillus, Neurospora, Penicillium usw., vorhanden sind. Die Regulationsregionen für die Initiation der Transkription können zum Beispiel erhalten werden aus Genen in der Glycolyse, wie Alkoholdehydrogenase, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Phosphoglucoisomerase, Phosphoglyceratkinase usw., oder regulierbaren Genen, wie saure Phosphatase, Lactase, Glucoamylase usw.
Jede beliebige Sequenz aus einer Anzahl von regulatorischen Sequenzen kann in einer speziellen Situation bevorzugt werden in Abhängigkeit davon, ob dauernde oder induzierte Transkription erwünscht ist, von der speziellen Effizienz des Promotors in Verbindung mit dem interessierenden offenen Leseraster, von der Fähigkeit, einen starken Promotor mit einer Kontrollregion aus einem anderen Promotor zu verbinden, was eine induzierbare Transkription erlaubt, von der Leichtigkeit der Konstruktion und dergleichen. Diese Regulationsregionen haben reichlich Präzedenzfälle in der Literatur. Siehe zum Beispiel die EP-A-0 164 566, die in diesen Text durch Hinweis eingefügt wird.
Die Sekretion von heterologen Proteinen in genetisch modifizierten Mikroorganismen wird im allgemeinen durch eines von zwei Verfahren erzielt. Bei dem ersten ist die Signalsequenz homolog in bezug auf das Protein; bei dem zweiten ist die Signalsequenz homolog in bezug auf den Wirtsorganismus. Andere Alternativen von besonderem Interesse bei der vorliegenden Erfindung für die Sekretion von heterologen Proteinen in Kluyveromyces schliessen die Verwendung einer Signalsequenz, die heterolog im bezug auf sowohl Kluyveromyces als auch auf das interessierende Peptid sind, oder einer spezifisch kreierten synthetischen Signalsequenz ein. Die DNA, die für die erstere Signalsequenz codiert, kann durch Isolierung erhalten oder synthetisch hergestellt werden. Somit umfasst der offene Leseraster gewöhnlich ein Wildtyp- oder mutiertes Gen, wobei die Signalsequenz normalerweise mit dem Rest der codierenden Sequenz verbunden ist, einen Hybrid- oder chimären offenen Leseraster, wobei die Signalsequenz normalerweise nicht mit dem restlichen Teil des offenen Leserasters verbunden ist, oder eine synthetische Sequenz, wobei die Signalsequenz und der Rest des offenen Leserasters synthetisiert werden, um für bevorzugte Codons, günstige Restriktionsschnittstellen, neue Aminosäuresequenzen und dergleichen oder Kombinationen davon zu sorgen. Signalsequenzen, die verwendet werden können, können erhalten werden aus Genen, wie α-Faktor, Invertase, Amyloglucosidase, nativen oder Wildtypsignalsequenzen, die in Strukturgenen vorhanden sind und durch Kluyveromyces, Saccharomyces, andere Pilze, zum Beispiel Neurospora, Aspergillus und andere Eukaryoten, erkannt werden.
Von besonderem Interesse ist die Verwendung einer Signalsequenz, die für die Sekretion des interessierenden Peptides in das Nährmedium statt in den periplasmatischen Raum sorgt. In den meisten Fällen ist die Signalsequenz der 5'-Terminus des offenen Leserasters. Jedoch kann es in einigen Situationen erwünscht sein, dass die Signalsequenz intern in bezug auf den offenen Leseraster ist. Für die Verwendung von internen Signalsequenzen für die Sekretion siehe das US-Patent Nr. 4 338 397 und Perara und Lingappa, J. Cell Biology (1985) 101:2292-2301. Gene, in die der interessierende offene Leseraster inseriert werden kann, umfassen stark exprimierte, dauernd exprimierte Gene, zum Beispiel Gene, die für Enzyme der Glycolyse codieren, oder stark exprimierte regulierbare Gene, wie Lactase, Amyloglucosidase oder dergleichen.
Es wurde gefunden, dass die Nucleotidsequenzen, die das Initiationscodon ATG für die Translation umgeben, für die optimale Genexpression in Hefezellen und in tierischen Zellen wichtig sind. Zum Beispiel hat M. Kozak, Microbiol. Revs. (1983) 47:1-45 die Wirkung dieser Regionen auf die Expression von Insulin in COS- Zellen extensiv studiert. In ähnlicher Weise werden spezifische Nucleotide häufiger in stark exprimierten Hefeproteinen gefunden als andere, was auf die wichtige Wirkung dieser Nucleotide auf die Stärke der Expression dieser Gene hinweist.
Für die optimale Genexpression von exogenen Genen ist es wichtig, die Nucleotidsequenzen, die das Initiationscodon ATG umgeben, zu modifizieren. Dies kann durch ortsspezifische Mutagenese oder durch Fusion des exogenen Gens im Raster an ein endogenes Kluyveromyces- Gen, vorzugsweise ein stark exprimiertes Gen, wie das Lactasegen, geschehen.
Normalerweise ist es erwünscht, dafür zu sorgen, dass das Signalpeptid während des Sekretionsprozesses von dem interessierenden Peptid gespalten wird statt nach dem Sekretionsprozess, obgleich jede Verfahrensweise Anwendung finden kann. Gewöhnlich ist das verwendete Prozessierungssignal das natürlich mit der Signalsequenz vorkommende Prozessierungssignal oder ein Prozessierungssignal, das aus dem natürlich vorkommenden modifiziert worden ist und das noch wirksam ist, um ein Peptidsignal zu liefern, das zu der hydrolytischen Spaltung des Signalpeptids und Prozessierungssignalpeptids von dem interessierenden Peptid führt. Verschiedene Prozessierungssignale sind sequenziert und definiert worden, wie der α-Faktor (siehe zum Beispiel das US-Patent Nr. 4 546 082, das durch Hinweis in diesen Text eingefügt wird), Amyloglucosidase, α-Amylase usw. In manchen Fällen können andere, durch Peptidase erkannte Sequenzen verwendet werden, die eine anschliessende Spaltung für die Isolierung des gewünschten Peptids erfordern können. Diese Sequenzen umfassen zweibasische Peptide, zum Beispiel KR, (D)&sub4;Kund EA, die durch KEX2, Rinderenterokinase bzw. eine Hefemembranpeptidase gespalten werden.
Das interessierende Peptid kann natürlich vorkommend in bezug auf den Wirt oder heterolog sein, wobei es von prokaryotischen oder eukaryotischen Quellen stammt, welche eukaryotischen Quellen Pilze, Einzeller, Wirbeltiere, Wirbellose und dergleichen umfassen können. Die Peptidprodukte können Enzyme, wie Lactase, α- Amylase, β-Amylase, Amyloglucosidase, Chymosin usw., Säugerpeptide, wie Hormone, Interleukine, Cytokine, Cachexin, Wachstumsfaktoren, zum Beispiel von Thrombocyten stammender, epidermaler, das Skelett betreffender usw., Wachstumshormone, follikelstimulierendes Hormon, Interferone (α-, β- und γ-), Blutfaktoren, wie Faktor V, VI, VII, VIII (vW oder C), IX, X, XI oder XII, Plasminogenaktivator (Gewebe- oder Harn-), Serumalbumin, zum Beispiel menschliches Serumalbumin, Koloniewachstumsfaktoren (zum Beispiel GM), Erythropoietin, Thaumatin, Insulin usw., umfassen.
Diese Strukturgene können in einer Vielzahl von Weisen erhalten werden. Wenn die Aminosäuresequenz bekannt ist, kann das Strukturgen ganz oder teilweise synthetisiert werden, insbesondere dann, wenn es erwünscht ist, von Hefe bevorzugte Codons zur Verfügung zu stellen. Somit kann der ganze oder ein Teil des offenen Leserasters unter Verwendung von Codons, die von Kluyveromyces bevorzugt werden, synthetisiert werden. Bevorzugte Codons können durch diejenigen Codons bestimmt werden, die in den Proteinen gefunden werden, die in der grössten Menge durch den Kluyveromyces-Wirt erzeugt werden, zum Beispiel glycolytische Enzyme. Methoden zur Synthetisierung von Sequenzen und zum Zusammenbringen der Sequenzen sind in der Literatur gut eingeführt. Wenn ein Teil des offenen Leserasters synthetisiert wird und ein Teil aus natürlichen Quellen stammt, kann die synthetisierte Portion als Brücke zwischen zwei natürlich vorkommenden Portionen dienen oder kann einen 3'-Terminus oder einen 5'-Terminus zur Verfügung stellen. Besonders wenn die Signalsequenz und der offene Leseraster, der für das Peptid codiert, aus verschiedenen Genen stammen, werden gewöhnlich synthetische Adaptoren verwendet. In anderen Fällen können Linker verwendet werden, wobei die verschiedenen Fragmente bei verschiedenen Restriktionsschnittstellen inseriert werden können oder eine Sequenz in dem Linker ersetzen können.
Grösstenteils stammt etwas des offenen Leserasters oder der gesamte offene Leseraster aus einer natürlichen Quelle. Methoden zum Identifizieren von interessierenden Sequenzen haben in der Literatur extensive Belegung durch Beispiele gefunden, obgleich in individuellen Situationen verschiedene Schwierigkeitsgrade auftreten können. Verschiedene Methoden umfassen die Verwendung von Sonden, wenn mindestens ein Teil der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz bekannt ist, wobei genomische oder cDNA-Bibliotheken nach komplementären Sequenzen abgesucht werden können. Alternativ kann eine charakteristische Transkription nachgewiesen werden, wenn das interessierende Gen induziert werden kann oder wenn Zellen aus dem gleichen Wirt stammen, aber mit verschiedener Differenzierung, indem man die erzeugten Boten-RNA's vergleicht. Andere Methoden sind ebenfalls mit Beispielen belegt worden.
Die Terminationsregion kann aus der 3'-Region des Gens, aus dem die Initiationsregion erhalten wurde, oder aus einem anderen Gen stammen. Eine grosse Anzahl von Terminationsregionen sind bekannt und haben sich als befriedigend in einer Vielzahl von Wirten aus den gleichen und verschiedenen Gattungen und Spezies erwiesen. Die Terminationsregion wird gewöhnlich eher aus Bequemlichkeit als wegen irgend einer speziellen Eigenschaft gewählt. Vorzugsweise stammt die Terminationsregion aus einem Hefegen, insbesondere Saccharomyces oder Kluyveromyces.
Bei der Entwicklung der Expressionskassette können die verschiedenen Fragmente, die die Regulationsregionen und den offenen Leseraster aufweisen, verschiedenen Prozessierungsbedingungen unterworfen werden, wie Ligation, Restriktion, Resektion, in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Verwendung von Linkern und Adaptoren und dergleichen. Somit können Nucleotidtransitionen, -transversionen, -insertionen, -deletionen oder dergleichen mit der DNA ausgeführt werden, die in den Regulationsregionen und/oder dem offenen Leseraster verwendet werden.
Während der Konstruktion der Expressionskassette werden die verschiedenen Fragmente der DNA gewöhnlich in einem geeigneten Klonierungsvektor kloniert, der die Expansion der DNA, die Modifikation der DNA oder die Manipulation durch Verbinden oder Entfernen der Sequenzen, Linker oder dergleichen erlaubt. Normalerweise sind die Vektoren fähig zur Replikation in mindestens einer relativ hohen Kopienzahl in E. coli. Eine Anzahl von Vektoren für die Klonierung sind leicht erhältlich, einschliesslich solcher Vektoren wie pBR322, pACYC184, pUC7-19, M13, Charon 4A und dergleichen.
Die Klonierungsvektoren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie ein effizientes Replikationssystem haben, das in E. coli funktionsfähig ist. Auch hat der Klonierungsvektor mindestens eine nur einmal vorhandene Restriktionsschnittstelle, gewöhnlich eine Vielzahl von nur einmal vorhandenen Restriktionsschnittstellen, und kann auch mehrmals vorkommende Restriktionsschnittstellen einschliessen, insbesondere zwei der gleichen Restriktionsschnittstellen für die Substitution. Zusätzlich hat der Klonierungsvektor einen oder mehrere Marker, die für die Selektion auf Transformanten sorgen. Die Marker sorgen normalerweise für Resistenz gegen cytotoxische Mittel, wie Antibiotika, Schwermetalle, Toxine oder dergleichen, Komplementation eines auxotrophen Wirts oder Immunität gegen einen Phagen. Durch geeignete Restriktion des Vektors und der Kassette und gegebenenfalls Modifizierung der Enden durch Abschneiden oder Auffüllen in überhängenden Enden, um für glatte Enden zu sorgen, durch Addition von Linkern durch Anhängen, können komplementierende Enden für die Ligation und die Verbindung des Vektors mit der Expressionskassette oder einer Komponente davon zur Verfügung gestellt werden.
Nach jeder Manipulation der DNA bei der Entwicklung der Kassette wird das Plasmid kloniert und isoliert und wird erforderlichenfalls die spezielle Kassettenkomponente auf ihre Sequenz analysiert, um zu gewährleisten, dass die richtige Sequenz erhalten worden ist. In Abhängigkeit von der Natur der Manipulation kann die gewünschte Sequenz aus dem Plasmid ausgeschnitten und in einen anderen Vektor eingeführt werden, oder das Plasmid kann geschnitten und die Expressionskassettenkomponente manipuliert werden, wie zweckmässig.
In manchen Fällen wird ein Schaukelvektor verwendet, wobei der Vektor zur Replikation in verschiedenen Wirten, die verschiedene Replikationssysteme erfordern, befähigt ist. Dies kann zusätzliche Marker, die in den beiden Wirten funktionsfähig sind, erfordern oder nicht. Wenn derartige Marker erforderlich sind, können sie in den Vektor eingeschlossen werden, wobei das Plasmid, das die Kassette, die beiden Replikationssysteme und den oder die Marker enthält, je nachdem vom einen Wirt zu einem anderen transferiert werden kann. In der vorliegenden Situation würde das zweite Replikationssystem ein Replikationssystem sein, das in Kluyveromyces funktionsfähig ist. Die Replikationssysteme, die verwendet werden können, können von Plasmiden, zum Beispiel pKD1 aus Kluyveromyces drosophilarum, Viren oder dem Chromosom von Kluyveromyces oder anderen Spezies, insbesondere einer mit Kluyveromyces zusammenhängenden, wie Saccharomyces, stammen. Somit umfassen Replikationssysteme das Replikationssystem des 2-Mikronplasmids, das in Saccharomyces gefunden wird, und ein Gen mit einer autonom replizierenden Sequenz (ARS), zum Beispiel dann, wenn es in Verbindung mit einer Centromersequenz verwendet wird, oder dergleichen. Gewünschtenfalls können Regionen der Homologie zur Verfügung gestellt werden, um die Integration der Expressionskassette in das Genom des Kluyveromyces-Wirts zu fördern.
Von speziellem Interesse in den Konstrukten der vorliegenden Erfindung ist eine Sequenz, die aus Kluyveromyces-DNA-Chromosomen stammt und als KARS bezeichnet wird, die für eine hohe Transformationsfrequenz sorgt. Das KARS-Gen kann durch Durchtesten einer Bibliothek von Kluyveromyces-DNA-Fragmenten auf gesteigerte Transformationseffizienz erhalten werden. Auf diese Weise können Fragmente erhalten werden, die KARS- Sequenzen enthalten, welche Fragmente durch Restriktion, Resektion oder Primerreparatur weiter modifiziert werden können, um ein Fragment von annäherungsweise 200 bp und nicht mehr als ca. 5000 bp, üblicher von ca. 200 bp bis 2000 bp, zur Verfügung zu stellen, das für eine gesteigerte Transformationseffizienz sorgt. Das Vorhandensein des KARS-Gens kann für die Transformation von auxotrophen K. lactis-Spezies zu Prototrophie mit einer Frequenz von mindestens ca. 10³ pro Mikrogramm DNA, gewöhnlich mit einer Frequenz von 10&sup4; pro Mikrogramm DNA oder höher, sorgen.
Die Art der Transformation von E. coli mit den verschiedenen DNA-Konstrukten (Plasmiden und Viren) für die Klonierung ist für diese Erfindung nicht entscheidend. Konjugation, Transduktion, Transfektion oder Transformation, zum Beispiel durch Calciumchlorid oder Phosphat vermittelte Transformation, können angewandt werden. Im Gegensatz dazu hat der grösste Teil des Standes der Technik für Hefe sich auf die Transformation von Protoplasten unter Verwendung von Kombinationen von Calciumionen und Polyethylenglycol von ca. 2000 bis 8000, gewöhnlich 4000 bis 7000 Dalton verlassen.
Eine alternative Methode der Transformation umfasst das Kultivieren von Kluyveromyces in einem Standardhefenährmedium bis zu einer Zelldichte von 1 bis 25, wünschenswerterweise 4 bis 10 0.D.&sub6;&sub1;&sub0;. Die Kluyveromyces-Zellen werden dann gesammelt, gewaschen und mit chaotropen Ionen vorbehandelt, insbesondere den Alkalimetallionen Lithium, Caesium oder Rubidium, insbesondere als Chlorid oder Sulfat, spezieller den Lithiumsalzen, bei Konzentrationen von ca. 2-millimolar bis 1- molar, vorzugsweise ca. 0,1-molar. Nach Inkubieren der Zellen mit dem bzw. den chaotropen Ion(en) wird die DNA zugesetzt und die Inkubation während eines kurzen Zeitraums bei einer mässigen Temperatur, im allgemeinen von ca. 20ºC bis 35ºC, ca. 5 bis 60 Minuten lang verlängert. Dann wird Polyethylenglycol zugesetzt, zweckmässig bei einer Konzentration von ca. 25 bis 50%, wobei das gesamte Medium verdünnt werden kann, indem man ein gleiches Volumen eines Polyethylenglycolkonzentrats zusetzt, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen. Das Polyethylenglycol hat eine Molekülgrösse von 2000 bis 8000 Dalton, vorzugsweise ca. 4000 bis 7000 Dalton. Die Inkubation erfolgt im allgemeinen während einer verhältnismässig kurzen Zeit, im allgemeinen ca. 5 bis 60 Minuten. Zweckmässig wird das Inkubationsmedium einer Wärmebehandlung von ca. 1 bis 10 Minuten bei ca. 35ºC bis 45ºC, vorzugsweise ca. 42ºC, unterworfen.
Für die Selektion kann jeder beliebige brauchbare Marker verwendet werden, obgleich die Anzahl der mit Kluyveromyces brauchbaren Marker geringer ist als die der für Saccharomyces verwendeten Marker. Zweckmässig sind Resistenz gegen Kanamycin und das Aminoglycosid G418 von Interesse sowie die Komplementation eines Gens in dem Tryptophanstoffwechsel, insbesondere TRP1, oder in dem Lactosestoffwechsel, insbesondere LAC4.
Obgleich ein Marker für die Selektion aus praktischen Erwägungen höchst erwünscht ist, sind andere Verfahrensweisen für das Durchtesten von transformierten Zellen beschrieben worden. Siehe zum Beispiel G. Reipen et. al., Current Genetics (1982) 5:189-193. Neben der Verwendung eines Indikatorenzyms, wie β- Lactamase, können transformierte Zellen mittels der spezifischen Produkte, die sie herstellen, getestet werden. Im Falle von Chymosin kann zum Beispiel die Synthese des Produktes durch eine immunologische oder eine enzymatische Methode bestimmt werden.
Der verwendete Vektor kann zur extrachromosomalen Erhaltung in Kluyveromyces fähig sein oder zur Integration in das Kluyveromyces-Gen führen. Es wurde gefunden, dass das 2-Mikronplasmid-Replikationssystem aus Saccharomyces für extrachromosomale Erhaltung in Kluyveromyces sorgt. Zusätzlich kann man eine Kombination eines Centromers, wie das Saccharomyces CEN3, und einer Sequenz mit hoher Transformationsfrequenz, wie ARS oder KARS, verwenden. Wenn selektive Erhaltung erzielt wird, wie Komplementation oder Resistenz gegen ein Antibiotikum, für das Kluyveromyces empfindlich ist, genügen die ARS-ähnlichen Sequenzen gewöhnlich für extrachromosomale Erhaltung.
Für die Fermentation in grossem Massstab beeinflusst sogar ein kleiner Verlust an Plasmidstabilität die Endausbeute an dem gewünschten Protein stark. Um die Stabilität von rekombinanten Molekülen in Wirtszellen, zum Beispiel Kluyveromyces, zu erhöhen, kann die Integration der rekombinanten Moleküle in das Wirtschromosom angewandt werden.
Wenn Integration erwünscht ist, ist es im allgemeinen zweckmässig, eine Sequenz zu haben, die in bezug auf eine Sequenz des Chromosoms des Wirtes homolog ist, so dass homologe Rekombination eintreten kann. Es versteht sich, dass auch zufällige Integration auftritt, so dass die homologe Sequenz fakultativ ist. Wenn eine homologe Sequenz verwendet wird, hat die homologe Sequenz gewöhnlich mindestens ca. 200 bp und kann 1000 bp oder mehr haben. Ausserdem kann man, wenn eine Integration eine Rolle spielt, wünschen, eine Amplifikation des Strukturgens zu haben. Die Amplifikation wurde erzielt, indem man für ein mit dem gewünschten Strukturgen hintereinander geschaltetes Gen sorgt, das für einen Selektionsvorteil für den Wirt in einem Selektionsmedium sorgt. Somit haben sich die Gene, die Dihydrofolatreduktase, Metallothioneine, Thymidinkinase usw. exprimieren, in einer Vielzahl von Wirten als brauchbar erwiesen, um für Amplifikation zu sorgen, wobei das Gen Schutz vor einem Toxin, wie Methotrexat, Schwermetalle, wie Kupfer und Quecksilber, und dergleichen, verschafft.
Interessierende Vektoren, die für eine stabile Replikation sorgen, umfassen KARS-Vektoren, die aus K. lactis stammen, zum Beispiel pKARS12 und pKARS2, welche Plasmide eine K. lactis-DNA-Fragment aufweisen, das die KARS12- oder KARS2-Sequenz in dem S. cerevisiae-Plasmid YRp7 enthalten. Ein für die Integration verwendeter Vektor ist zum Beispiel pL4, ein Hybridplasmid des ARS1-tragenden Plasmids YRp7 und des K. lactis-XhoI- DNA-Fragments, das das LAC4-Gen trägt. Siehe EP-A-0 096 430.
Plasmide von besonderem Interesse umfassen Plasmide, die das 2-Mikron-Plasmid-Replikationssystem, das LAC4-Gen, das Tn601- und Tn5-Kanamycinresistenzgen, das auch Resistenz gegen das Antibiotikum G418 in Kluyveromyces verschafft [Jimenez und Davis, Nature (1980) 287:869-871], enthalten. Dieses Plasmid sorgt für autonome Replikation in Kluyveromyces, und man kann darauf selektionieren durch Resistenz gegen G418 auf Regenerationsplatten, die Glucose, Sorbit und 0,2 ug/ml G418 enthalten, während man erhöhte Konzentrationen von KCl vermeidet, das die Empfindlichkeit von Kluyveromyces gegen G418 beeinträchtigt. Bevorzugte Plasmide enthalten das TRP1-Gen, insbesondere aus S. cerevisiae, das LAC4-Gen, speziell aus K. lactis, das KanR-Gen aus Tn5, das für Resistenz gegen das Antibiotikum G418 sorgt, oder dergleichen.
Die vorliegenden Vektoren und Konstrukte werden für die Klonierung und Expression der gewünschten Strukturgene in einen geeigneten Wirt eingeführt. Nach der Transformation erscheinen normalerweise innerhalb von ca. 5 bis 6 Tagen Kolonien auf einem Regenerationsmedium. Wenn ein Antibiotikum für die Selektion verwendet wird, sollten die Kolonien durchgetestet werden, um die Abwesenheit von spontaner Mutation zu einem resistenten Stamm zu gewährleisten. Bei Anwendung der Plasmide und der Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass ca. 5% resistente Kolonien das Plasmidkonstrukt enthalten, was für mindestens ca. 4 Transformanten pro ug Plasmid-DNA sorgt. Wenn die Selektion auf dem Vorhandensein des LAC4-Gens beruhte, wobei Platten verwendet wurden, die Lactose als einzige Kohlenstoffquelle und 0,6-molares KCl als osmotischen Stabilisator enthielten, wurde gefunden, dass alle überlebenden Kolonien Transformanten und keine spontanen Revertanten waren. Ca. 20 Transformanten wurden nach ca. 4 bis 5 Tagen Inkubation bei mässiger Temperatur, zum Beispiel 30ºC, erhalten.
Ein Wirtsorganismus, Kluyveromyces, ist besonders geeignet für die Produktion von heterologen Proteinen, zum Beispiel für die Produktion und Extraktion des Enzyms Chymosin und seiner Vorläufer Präprochymosin, Pseudochymosin und Prochymosin, von menschlichem Serumalbumin (HSA), Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) und Thaumatin und seinen Vorläuferformen. Obgleich andere Organismen, wie Saccharomyces, Prochymosin in vernünftigen Mengen erzeugen, kann das erzeugte Prochymosin nicht in einer aktiven oder aktivierbaren Form extrahiert werden. Wir haben überraschenderweise gefunden, dass mehr als 90% der Gesamtmenge an Prochymosin, die durch Kluyveromyces erzeugt wird, mit sehr einfachen Standardtechniken in einer aktiven Form extrahiert werden kann.
Beliebige der vielen Kluyveromyces-Spezies können verwendet werden. Entweder Laboratoriums- oder industrielle Stämme, vorzugsweise industrielle, können verwendet werden. Unter industriellen Spezies werden Kluyveromyces-Stämme aus Organismen verstanden, die aus natürlichen Quellen isoliert werden können oder von Hinterlegungsstellen oder anderen Quellen erhältlich sind oder durch Modifikation, zum Beispiel Mutation, derartiger Stämme erhalten sind. Die industriellen Stämme sind dadurch gekennzeichnet, dass sie gegen genetischen Austausch resistent sind, wobei sie prototroph sind oder prototroph gemacht werden durch ein einziges Gen, das in den Wirtsstamm eingeführt wird, und werden gewöhnlich gewählt für verbesserte Produktion von Peptiden. Unter den Kluyveromyces-Spezies, die Verwendung finden können, sind K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans, K. marxianus usw.. Es sollte ferner beachtet werden, dass die Kluyveromyces-Organismen sich auf der GRAS-(Generally Recognized As Safe)-Liste befinden. Ihre Verwendung für die Produktion von Produkten, die in vivo verwendet werden sollen oder normalerweise eingenommen werden sollen, erfordert keine spezielle Ueberprüfung und Genehmigung durch die Regierung.
Sowohl Wildtyp- als auch Mutanten-Kluyveromyces, insbesondere Kluyveromyces lactis oder Kluyveromyces fragilis, können als Wirte verwendet werden. Wirte von besonderem Interesse umfassen K. lactis SD11 lac4 trpl und K. lactis SD69 lac4 und den Wildtyp-Stamm CBS 2360 (siehe EP-A-0 096 430).
Zur Aufrechterhaltung von selektivem Druck auf die Transformanten zur Beibehaltung der Plasmide können Selektionsmedien verwendet werden, wie Yeast Nitrogen Base Medium, 2% Lactose anstelle von Glucose, für K. lactis SD69 lac4 (PTY75-LAC4) und für K. lactis SD69 lac4 (pL4) und ein Yeast Nitrogen Base Medium (Difco) plus 2% Glucose für K. lactis SD11 lac4 trpl (pKARS12). Siehe für die erwähnten Transformanten EP-A-0 096 430. In ähnlicher Weise können Stämme, die Plasmide enthalten, die Antibiotikaresistenz verleihen, zum Beispiel gegen G418, in einem das genannte Antibiotikum enthaltenden Medium kultiviert werden.
Wenn die Hybridplasmide für die Produktion des gewünschten Proteins in grossem Massstab verwendet werden, würde es im allgemeinen nützlich sein, mindestens im wesentlichen alle bakteriellen DNA-Sequenzen aus den Hybridplasmiden zu entfernen.
In Abhängigkeit von der Natur des interessierenden Strukturgens kann das Expressionsprodukt in dem Cytoplasma der Wirtszelle bleiben oder sekretiert werden. Es wurde gefunden, dass nicht nur die Proteine, die in der Zelle bleiben, sondern auch diejenigen, die sekretiert werden, löslich sind. Wenn das Expressionsprodukt in der Wirtszelle bleiben soll, kann es im allgemeinen erwünscht sein, eine induzierbare Transkriptionsinitiationsregion zu haben, so dass wenig oder keine Expression des gewünschten Produktes eintritt, bis der Transformant eine hohe Zelldichte erreicht hat. Nach genügend Zeit für die Bildung des Expressionsproduktes können die Zellen mittels herkömmlicher Methoden, zum Beispiel Zentrifugieren, isoliert, lysiert und das interessierende Produkt isoliert werden. In Abhängigkeit von der Natur und Verwendung des Produktes kann das Lysat verschiedenen Reinigungsmethoden unterworfen werden, wie Chromatographie, Elektrophorese, Lösungsmittelextraktion, Kristallisation oder dergleichen. Der Reinheitsgrad kann von ca. 50% bis 90% oder höher bis zu im wesentlichen Reinheit variieren.
Wenn das Produkt sekretiert werden soll, können sowohl permanente als auch nicht permanente Transkriptionsinitiationsregionen verwendet werden in Abhängigkeit von dem Fermentationsprozess, der für die Produktion des interessierenden Proteins oder Polypeptids angewandt wird. Das Expressionsprodukt kann in das Kulturmedium sekretiert und auf kontinuierlicher Basis erzeugt werden, wobei das Medium teilweise abgezogen wird, das gewünschte Produkt extrahiert wird, zum Beispiel durch Affinitätschromatographie oder dergleichen, und das verbrauchte Medium verworfen oder im Kreislauf geführt wird, indem man wesentliche Komponenten ergänzt.
Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt sind, sind Anzeichen für das Niveau des Könnens der Fachleute auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört. Alle Publikationen und Patentanmeldungen werden durch Hinweis in diesen Text im gleichen Ausmass eingefügt, als wenn jede individuelle Publikation oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als durch Hinweis eingefügt bezeichnet worden wäre.
Die folgenden Beispiele werden als Erläuterung und nicht als Einschränkung geboten.

EXPERIMENTELLES

Beispiel 1

Konstruktion von Chymosin exprimierenden Plasmiden, die eine lange Lactasepromotersequenz enthalten

A. Konstruktion von pUCla56

Chromosomale DNA wurde aus Kluyveromyces lactis Stamm CBS 2360 isoliert [Das und Hollbenberg, Current Genetics (1982) 5:123-128], mit XhoI gespalten und auf einem Saccharosegradienten der Grösse nach getrennt. Die Fraktionen, die das Lactasegen enthielten, wurden mit einer LAC4-Sonde aus Plasmid pK16 nachgewiesen nach Tüpfeln der DNA auf einem Nitrocellulosefilter (siehe EP-A-0 096 430, Beispiel 16.C2). DNA, die das LAC4-Gen enthielt, wurde in die SalI-Schnittstelle von Plasmid pPA153-215 kloniert [Andreoli, Mol. Gen. Genet. (1985) 199:372-380] und ergab das Plasmid pPA31. Ein XbaI- Fragment von pPA31, das das Lactasegen enthielt, wurde in die XbaI-Schnittstelle von pUC19 subkloniert [Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33:103-119], was das Plasmid pUCla56 ergibt.

B. Einführung des G418-Resistenzgens in den Terminator des Lactasegens

Das Terminatorfragment, das den G418-Resistenzmarker enhielt, wurde aus dem Plasmid pGBTeG418 erhalten. E. coli, der pGBTeG418 enthielt, wurde am 26. Februar 1987 beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures unter der Nummer CBS 184.87 hinterlegt. Das Plasmid pGBTeG418 (siehe Figur 1) besteht aus dem Plasmid pPA153-215, wie oben beschrieben, und einem 5,6 kb- Fragment, bestehend aus dem 3,7 kb-BamHI K. lactis- Lactaseterminatorfragment [Breuning et al., Nucl. Acid Res. (1984) 12:2327-2341] und dem Tn5-Gen [Reiss et al., EMBO J. (1984) 3:3317], das Resistenz gegen G418 unter der Kontrolle des Alkoholdehydrogenase I-Promotors (ADH) aus Hefe verleiht, ähnlich dem durch Bennetzen und Hall, J. Biol. Chem. (1982) 257:3018-3025 beschriebenen.

C. Konstruktion von Plasmid pGB900, enthaltend das G418-Resistenzgen und für Prochymosin codierende DNA

Das 3,6-kb-HindIII-XbaI-Fragment aus Plasmid pBGTeG418, enthaltend das G418-Resistenzgen (siehe Beispiel 1B), und das SalI-HindIII-Fragment, enthaltend das Prochymosingen aus pGB123 (siehe EP-A-0 096 430), wurden in pUC19 ligiert, das zuvor mit SalI und XbaI geschnitten wurde. Dies ergab das Plasmid pGB900.

D. Konstruktion von Plasmid pGB901 (siehe Figur 2)

Das Plasmid pGB901 wurde konstruiert durch Ligieren der folgenden vier Fragmente:
(1) ein 3,6 kb-XbaI-HaeII-Fragment, das aus pUCla56 isoliert war, mit dem Lactasepromotor ungefähr bei Position -90 vom Lactase-ATG-Startcodon,
(2) ein HaeII-SalI-Fragment, das sich von der obigen HaeII-Schnittstelle zu einer SalI-Schnittstelle erstreckt und das bei Position -26 ligiert worden war in einem ähnlichen Bal31-Experiment, wie beschrieben in Beispiel 16.C2 von EP-A-0 096 430. Jedoch wurde in diesem Experiment nur ein SalI-Linker verwendet. Dieses Fragment hat die folgende Sequenz:
(3) das 5,1 kb-SalI-Xbal-Fragment, das das Prochymosingen und das G418-Resistenzgen aus pGB900 (siehe Beispiel 1C) enthielt,
(4) pUC19, geschnitten mit XbaI.
Während der Konstruktion des Plasmides wurde die CG-Sequenz aus der HaeII-Schnittstelle unabsichtlich entfernt, wodurch bei dieser Position eine HindIII- Schnittstelle erzeugt wurde.
Für Prochymosin codierende DNA ist in dem Plasmid pGB901 vorhanden. Diese kann leicht in Plasmide mit Präprochymosin-, Pseudochymosin- oder Chymosin-DNA übergeführt werden, indem man die SalI-BglII-Fragmente aus pGB 131, 122 bzw. 124 verwendet (siehe EP-A- 0 096 430).

Beispiel 2

Sekretion von Prochymosin aus Kluyveromyces lactis-Transformanten

Zur Steuerung der Synthese von Prochymosin in Kluyveromyces wurde das Plasmid pGB901 verwendet, um die K. lactis-Stämme SD11 und CBS 2360 mit ähnlichen Resultaten zu transformieren. Die Transformation wurde im wesentlichen ausgeführt wie in den Beispielen 4 und 14 der EP-A-0 096 430 beschrieben durch Verwendung von intakter Plasmid-DNA oder Plasmid-DNA, die mit Restriktionsendonucleasen geschnitten war. In dem letzteren Falle wurden Restriktionsendonucleasen verwendet, die in der Promotorregion schneiden, zum Beispiel SacII, NdeI, SnaBI oder SpeI, oder in der Terminatorregion schneiden, zum Beispiel EcoRV, oder sowohl in der Promotorregion als auch in der Terminatorregion schneiden.
K. lactis Stamm CBS 2360 wurde in 100 ml YEPD- Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose), die 2,5 ml einer Lösung von 6,7% Yeast Nitrogen Base (Difco) enthielten, bis zu einer O.D.610 von ca. 7 kultiviert. Die Zellen wurden aus 10 ml der Kultur durch Zentrifugieren gesammelt, mit TE-Puffer (10 mMol/l Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mMol/l EDTA) gewaschen und erneut in 1 ml TE- Puffer suspendiert. Ein gleiches Volumen 0,2-molares Lithiumacetat wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde in einem Schüttelwasserbad eine Stunde lang bei 30ºC inkubiert. Das Plasmid pGB901 (15 ug) wurde an der nur einmal vorhandenen SacII-Schnittstelle in dem Lactasepromotor geschnitten, mit Ethanol ausgefällt und erneut in 15 ul TE-Puffer suspendiert. Diese DNA-Präparation wurde zu 100 ul der vorinkubierten Zellen zugesetzt, und die Inkubation wurde um 30 Minuten verlängert. Dann wurde ein gleiches Volumen 70%-iges PEG 4000 zugegeben, und das Gemisch wurde eine Stunde lang bei der gleichen Temperatur inkubiert, gefolgt von einem Wärmeschock von 5 Minuten bei 42ºC. Dann wurde 1 ml YEPD-Medium Zugesetzt, und die Zellen wurden in einem Schüttelwasserbad von 30ºC 1,5 Stunden lang inkubiert. Schliesslich wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt, erneut in 300 ul YEPD suspendiert und auf Agarplatten aufgestrichen, die 15 ml YEPD-Agar mit 300 ug/ml G418 enthielten und mit 15 ml YEPD-Agar ohne G418 überschichtet waren (1 Stunde vor der Verwendung). Die Kolonien wurden 3 Tage lang bei 30ºC kulitiviert. K. lactis Stamm SDII wurde in ähnlicher Weise transformiert, nur wurde die Anfangs-G418-Konzentration in den Selektionsplatten auf 150 ug/ml gesenkt. In einem der Experimente wurden Transformanten von CBS 2360 bei 30ºC in YEP-Medium, das 2% Galactose enthielt, kultiviert. Nach 60 Stunden wurden Zellen und Medium durch Zentrifugieren getrennt. Die Zellen wurden durch Behandlung mit Glasperlen zerstört. Das Kulturmedium und der Zellextrakt wurden bei pH = 2 behandelt, ehe auf Chymosinaktivität analysiert wurde [siehe Foltman, Methods in Enzymology (1970) 19:421-426].
Die Zellen wurden aus den Kulturen durch Zentrifugieren entfernt, und die resultierenden Ueberstände wurden durch Zugabe von 1-molarer H&sub2;SO&sub4; bis pH = 2 angesäuert und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösungen wurden dann durch Zugabe von 2- molarer Tris-Base bis pH = 6 neutralisiert. Ein 50 ul- Volumen einer geeigneten Verdünnung wurde zu einer Suspension von 12% fettfreier Trockenmilch in 10-millimolarem CaCl&sub2; zugesetzt und bei 37ºC inkubiert, bis sich ein Klumpen bildete. Eine Einheit der Chymosinaktivität ist definiert als die Menge an aktivem Chymosin, die erforderlich ist, um unter diesen Bedingungen in 10 Minuten einen Klumpen zu bilden. Der Ueberstand enthielt Milchgerinnungsaktivität infolge der Produktion und Sekretion von Prochymosin durch K. lactis- Transformanten, obgleich keine Signalsequenz für die Proteinsekretion an Prochymosin angehängt wurde. Ca. 30 bis 60% des gesamten erzeugten Prochymosins wurden in dem Medium gefunden, wie durch den oben beschriebenen Milchgerinnungsversuch bestimmt. Aehnliche Resultate wurden erhalten, wenn K. lactis Stamm SD11 verwendet wurde.

Beispiel 3

Lactase-Chymosin-Fusionsproteine die erhöhte Chymosin-Produktion geben

Durch Verwendung verschiedener SnaBI-SalI-Fragmente (aus einem Bal31-Experiment, das ähnlich war wie das in Beispiel 16.C2 oder EP-A-0 096 430 beschriebene, aber unter Verwendung nur eines einzigen SalI-Linkers) wurden Varianten von pGB901 erhalten, die eine Fusion zwischen der Lactase und den Chymosinproteinen enthielten (Tabelle 1). Die zusätzlichen Aminosäuren, die durch Lactase-DNA und Linkersequenzen verschafft werden, können zusammen mit der Pro-Sequenz von Prochymosin durch Behandlung mit Säure entfernt werden. Es wurde beobachtet, dass eine Fusion, die 4 Aminosäuren aus der für Lactase codierenden Sequenz (pGB902) ent hielt, zu erhöhter Chymosinproduktion führte. Tabelle 1 Nucleotidsequenz an dem Verbindungsstück zwischen dem Lactasepromotor und Prochymosin in pGB901 und pGB902 Lactasepromotor Prochymosin Lactase
Die Proteinsynthese beginnt an dem eingekästelten ATG- Codon.

Beispiel 4

Expression von Präprochymosin durch Kluyveromyces- Transformanten

Die SalI-Schnittstelle aus dem Polylinker von pGB902 (siehe Beispiel 3) wurde aus praktischen Erwägungen entfernt. pGB902 wurde mit SalI partiell gespalten, gefolgt von einer kurzen Inkubation mit Bal31 (Boehringer). Lineare Fragmente wurden aus einem Agarosegel isoliert, ligiert und in E. coli transformiert. Ein korrektes Plasmid, pGB903, wurde erhalten. Die Restriktionsanalyse zeigte, dass bei diesem Plasmid auch die XbaI- und HindIII-Schnittstellen aus dem Polylinker entfernt sind.
Um ein Plasmid zu konstruieren, das Präprochymosin enthielt und exprimierte, wurde das Plasmid pGB903 mit den Restriktionsendonucleasen SalI und BglII gespalten. Das 11 kb-DNA-Fragment wurde aus einem Agarosegel durch Elektroelution isoliert. In ähnlicher Weise wurde das Plasmid pGB124, das das Präprochymosingen enthielt (siehe EP-A-0 096 430, Beispiel 16), gespalten und das 0,3 kb-SalI-BglII-Fragment isoliert, das den N- terminalen Teil des Präprochymosingens enthielt.
Die 11 kb- und 0,3 kb-DNA-Fragmente wurden gemischt, mit DNA-Ligase ligiert und in E. coli transformiert. Das Plasmid pGB904 wurde isoliert, das das Präprochymosingen an einen kleinen Teil des Lactasegens fusioniert enthielt (Tabelle 2) Tabelle 2 Nucleotidsequenz an dem Verbindungsstück zwischen dem Lactasepromotor und Präprochymosin in pGB904 Lactase Präprochymosin
Die Proteinsynthese beginnt an dem eingekästelten ATG- Codon.
K. lactis CBS 2360-Zellen wurden mit pGB904 transformiert, das mit SacII linearisiert worden war. Transformanten wurden selektioniert, kultiviert und auf Chymosinaktivität analysiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. In der folgenden Tabelle 3 wird ein Vergleich gemacht zwischen der Sekretion von Prochymosin aus K. lactis CBS 2360-Zellen, die mit pGB902 (siehe Beispiel 3) und mit pGB904 transformiert sind. Die (Pro)Chymosin-Produktion ist ausgedrückt in willkürlichen Einheiten pro ml Zellen bei einem O.D.610 von 200. Tabelle 3 Sekretion von Prochymosin durch mit pGB902 und pGB904 transformierte K. lactis-Zellen Transformant Ueberstand Niederschlag

Beispiel 5

Sekretion von Prochymosin durch Kluyveromyces unter Verwendung von heterologen Signalsequenzen

A. Chemische Synthese einer Amyloglucosidasesignalsequenz und Konstruktion eines Plasmids, das die genannte Signalsequenz enthält

Die Signalsequenz von Amyloglucosidase (AG) aus Aspergillus awamori wurde von Innis et al, Science (1985) 228:21-26 publiziert. Auf Basis der Proteinsequenz wurden Oligonucleotide abgeleitet, um die Insertion der Signalsequenz vor dem Prochymosingen zu erlauben (siehe Figur 3).
Die Oligonucleotide wurden mit einem Applied Biosystems-DNA-Synthesizer synthetisiert. Die Oligonucleotide wurden durch Elektrophorese auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel gereinigt, dann aus dem Gel elektroeluiert.
Das Plasmid pGB903 (siehe Beispiel 4) wurde an der nur einmal vorhandenen SalI-Schnittstelle geschnitten. Die Oligonucleotide wurden bei 65ºC, 50ºC und 37ºC eine Stunde lang jeweils in 2xSSC hybridisiert. Die Oligonucleotide hatten kein Phosphat an dem 5'-Ende, um Bildung von Multimeren zu verhindern. Die DNA wurde in die SalI-Schnittstelle unter Verwendung von T4-Polynucleotidligase ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in E. coli HB101 transformiert. Vierundzwanzig der Kolonien wurden kultiviert, und Plasmid-DNA wurde isoliert. Es wurde durch Restriktionsenzymanalyse gezeigt, dass eines der Plasmide, pGB905, die korrekte Orientierung der Oligonucleotide hatte. Das Plasmid pGB905 wurde in K. lactis CBS 2360 transformiert. Die (Pro)Chymosin- Produktion wurde gemäss der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrensweise analysiert. Die Resultate der (Pro)Chymosin-Produktion in willkürlichen Einheiten pro ml Zellen bei einem O.D.&sub6;&sub1;&sub0; von 200 sind in der folgenden Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Sekretion von Prochymosin durch mit pGB902 und pGB905 transformierte K. lactis-Zellen Transformant Ueberstand Niederschlag

B. Chemische Synthese einer neuen synthetischen Signalsequenz und Konstruktion eines Plasmids. das die neue synthetische Signalsequenz enthält.

Eine synthetische Signalsequenz wurde hergestellt, die eine Sequenz hat, die von jeder beliebigen bekannten Signalsequenz verschieden ist. Unter Verwendung dieser Signalsequenz wurde alles synthetisierte Prochymosin von Kluyveromyces sekretiert, wie unten gezeigt.
Diese synthetische Signalsequenz wurde gemacht unter Verwendung von häufig vorkommenden Aminosäuren von Position -6 bis +2 von der Signalsequenz-Spaltstelle [Von Heyne, Eur. J. Biochem. (1983) 133:17-21]. Häufig vorkommende Hefecodons wurden ebenfalls verwendet, und zusätzliche Nucleotide wurden vor der ATG- Sequenz eingebaut, um die Deletion von 26 Nucleotiden in pGB902 auszugleichen. Die verwendeten Oligonucleotide und die resultierende Signalsequenz sind in Figur 4 gezeigt.
Die DNA der synthetischen Signalsequenz wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems DNA Synthetizer synthetisiert. Die resultierenden Oligonucleotide liess man auf einem 40 cm langen, 1 mm dicken Polyacrylamidgel laufen, das TBE-Puffer (50 mMol/l Tris, 50 mMol/l Borat, 1 mMol/l EDTA, pH 8,3) und 7 Mol/l Harnstoff enthielt, bis der Bromphenolblau-Marker 2/3 der Gellänge gewandert war. Die DNA wurde sichtbar gemacht, aus dem Gel eluiert und mit Ethanol gefällt.
Ebenfalls aus pGB901 wurde ein Derivat gemacht mit einer Deletion um die SalI-Schnittstelle herum, die aus dem Polylinker von pUC19 resultierte. Dies wurde getan, indem man das 0,5 kb-SnaBI-BglII-Fragment aus pGB903 durch das entsprechende Fragment aus pGB901 ersetzte. Das resultierende Plasmid wurde an der nur einmal vorhandenen SalI-Schnittstelle geschnitten. Die Oligonucleotide wurden bei 65ºC, 50ºC und 37ºC eine Stunde lang jeweils in 2xSSC hybridisiert. Die DNA wurde in die SalI-Schnittstelle unter Verwendung von T4- Polynucleotidligase ligiert. Das Plasmid wurde dann in E. coli HB101 transformiert. Von den erhaltenen Kolonien wurden 24 kultiviert, und Plasmid-DNA wurde isoliert. Es wurde durch Restriktionsenzymspaltung gezeigt, dass eines des Plasmide, pGB906, die Oligonucleotide in der korrekten Orientierung hatte. Es wurde gefunden, dass K. lactis CBS 2360, der mit pGB906 transformiert war, mehr als 95% des erzeugten Prochymosins sekretierte.

C. Analyse von Chymosinprotein erzeugt durch K. lactis, der mit pGB905 transformiert war.

K. lactis CBS 2360 (pGB905)-Transformanten wurden drei Tage lang bei 30ºC kultiviert, und Proben wurden aus dem Ueberstand der Kulturen gesammelt. Die Proteinproben wurden auf einem Polyacrylamidgel gemäss Laemmli [Nature (1970) 227:680-685] elektrophoretisiert. Die Proteine wurden auf ein Nitrocellulosefilter geblottet gemäss der Methode von Towbin et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:4350-4354]. Chymosinprotein wurde nachgewiesen durch Inkubieren des Filters mit einem polyklonalen Antiserum gegen Chymosin (Chr. Hansen), gefolgt von Esel- Antikaninchen-Antikörpern, die an eine Peroxidase (Amersham) gekoppelt waren, und schliesslich mit 0,6 mg/ml 4-Chlornaphtol und 0,015% Wasserstoffperoxid in einer Pufferlösung (50 mMol/l Tris-HCl pH 7,5, 0,9% NaCl), die 40% Methanol enthielt. Das durch die AG-Signalsequenz exkretierte Prochymosin ist korrekt gespalten nach pH = 2-Behandlung, wie durch diese Analyse bewiesen wird (Figur 5). Aehnliche Resultate wurden mit K. lactis CBS 2360 (pBG906)-Transformanten erhalten.

Beispiel 6

Konstruktion von Plasmiden, die die Saccharomyces cerevisiae-α-Faktorsequenz für eine effiziente Sekretion enthalten

A. Saccharomyces-α-Faktor-Expressionsplasmide

1. Konstruktion von Plasmiden

pDM100-PC: Das Ausgangsmaterial war das Plasmid pGB163 (siehe EP-A-0 096 430, Beispiel 16.C1). Das Plasmid pGB163 wurde mit BamHI gespalten und an XbaI- BamHI-Adaptor für α-Faktor-Leader-Prochymosin ligiert. Das resultierende Gemisch wurde dann mit PstI behandelt, und ein 96 bp-Fragment, das für die Stelle, an der der Pro-α-faktor prozessiert wird, und die N-terminale Region von Prochymosin codiert, wurde isoliert. Ein 1900 bp-Fragment, das für Rinderprochymosin codiert, wurde aus dem Plasmid pJS111 nach Spaltung mit PstI und SalI isoliert. Das Plasmid pJS111 ist eine pBR322-Derivat, das das Prochymosingen aus pGB163 unter der regulatorischen Kontrolle des ADH-2-Promotors und den Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAPDH)-terminator enthält. Das 1900 bp-PstI bis SalI-Fragment, das entfernt wurde, enthält das Prochymosingen und den GAPDH-Terminator. Der Promotor und der Transkriptionsterminator des Hefegens GAPDH 49 sind im wesentlichen wie von Travis, J. Biol. Chem. (1985) 260:4384-4389 beschrieben.
Das Plasmid pDM100, das eine Fusion des GAPDH- Promotors, des S. cerevisiae-α-Faktor-Leaders und eines synthetischen Gens für menschliches γ-Interferon, flankiert von XbaI- und SalI-Schnittstellen und dem α-Faktor-Terminator, enthielt, wurde mit XbaI und SalI gespalten, mit alkalischer Phosphatase behandelt, dann an die oben beschriebenen 96 bp- und 1900 bp-Fragmente ligiert. Der α-Faktor-Leader und -Terminator sind im wesentlichen wie-von Brake, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 4642-4646 beschrieben. Das resultierende Plasmid pDM100-PC wurde isoliert und enthielt eine Fusion des GAPDH-Promotors, des α-Faktor-Leaders und des Prochymosingens. Die vollständige Sequenz des eingesetzten BamHI-Fragmentes ist in Figur 6 gezeigt.
Um eine Selektion von Hefetransformanten zu erlauben, wurden zwei Plasmide, pKS100 und pAB3oo, konstruiert.
pKS100: Das Plasmid pKS100 wurde konstruiert durch Insertion in pDM100-PC eines 1170 bp-HindIII- Fragmentes aus YEp24, das das S. cerevisiae-URA3-Gen enthält.
pAB300: Das Plasmid pAB300 wurde konstruiert durch Insertion in pDM100-PC eines 3500 bp-HindIII- SalI-Fragmentes aus pGB901, das die 3'-Region des K. lactis LAC4-Gens und den G418-Resistenzmarker enthält. Das eingesetzte GAPDH/α-Faktor/Prochymosin-BamI-Fragment in pDM100-PC wird in Figur 6 erläutert.

2. Transformation von K. lactis und S. cerevisiae

Das Plasmid pKS100 wurde an der BglII-Schnittstelle in der für Prochymosin codierenden Region gespalten und verwendet, um K. lactis Stamm KRN201-6 zu transformieren. Dieser Stamm ist ein Derivat des Stammes 2UV21 (a lac4 trp1 ura3 [kilº]), in dem das lac4-Gen durch die LAC4-Promotor-Prochymosingenfusion aus pGB901 ersetzt worden ist. Die Integration von pKS100 ist somit zielgerichtet auf die integrierte für Prochymosin codierende Region. Das Plasmid pKS100 wurde auch verwendet, um S. cerevisiae Stamm AB110 (α ura3 leu2 his4 pep4-3 [cirº]) zu transformieren, in diesem Falle zielgerichtet auf die SacII-Schnittstelle in der 3'-Region des GAPDH-Gens.
Die resultierenden Transformanten wurden bis zur Sättigung in flüssigem YEPD-Medium kultiviert, und die Kulturüberstände und Zelllysate wurden nach Aktivierung bei pH = 2 auf Chymosinaktivität analysiert. Wie durch die in Tabelle 5 unten zusammengefassten Resultate gezeigt, sekretierten die K. lactis-Transformanten effizient Prochymosin in das Medium, wogegen die S. cerevisiae-Transformanten nur einen kleinen Bruchteil des erzeugten Prochymosins sekretierten. Tabelle 5 Prochymosinproduktion in K. lactis- und S. cerevisiae-Transformanten Chymosinaktivität (relative Einheiten/ml Kultur) Stamm Zellextrakt Kulturüberstand
Das Plasmid pAB300 wurde verwendet, um K. lactis Stamm 2UV21 zu G418-Resistenz zu transformieren, wobei die Integration auf die EcoRV-Schnittstelle in der 3'- Region des LAC4-Gens zielte. Es wurde gefunden, dass diese Transformanten auch effizient Prochymosin in das Kulturmedium sekretieren, wie in Tabelle 6 unten gezeigt. Tabelle 6 Prochymosinsekretion aus α-Faktor/Prochymosin-Fusionen Wirtsstamm Transformierendes Plasmid Sekretierte Chymosinaktivität (relative Einheiten/ml Kultur)

B. Konstruktion von LAC4-Promotor/α-Faktor-Leader/Prochymosin-Fusionen

Um diese Fusion zu produzieren, wurden zwei Plasmid-Zwischenprodukte konstruiert. Das Plasmid pDM100-PC wurde partiell mit PstI gespalten, mit einem SalI-PstI- Adaptor, der für einen Teil des α-Faktor-Leaders und 26 bp der 5'-Region des LAC4-Gens codierte, ligiert und dann mit HindIII gespalten. Ein 1500 bp-Fragment wurde aus diesem Gemisch isoliert und dann in pUC18 kloniert, das mit HindIII und SalI geschnitten wurde, um pKS102 zu produzieren.
Ein synthetischer E. coli-lac-Operator wurde in die SalI-Schnittstelle ligiert, die direkt in 5'-Richtung vor der für die α-Faktor-Signalsequenz codierenden Sequenz in pKS102 gelegen ist, um das Plasmid pKS103 zu produzieren. Dies wurde getan, weil die LAC4-Promotor/α-Faktor-Leader/Prochymosin-Fusion für E. coli toxisch sein kann.
Ein 490 bp SalI-BglII-Fragment aus pKS103 wurde isoliert und mit mit SalI-BglII gespaltenem pJD15R ligiert. Das Plasmid pJD15R wird aus pGB901 erhalten durch Deletion der SalI-Schnittstelle in dem pUC19-Polylinker durch Auffüllen, um pJD15 zu produzieren, und anschliessendes erneutes Klonieren des 8800 bp-XbaI- Fragments in der entgegengesetzten Orientierung. Aus dieser Reaktion wurde das Plasmid pKS105 isoliert. Diese Plasmide sind in Figur 7 erläutert.
Das Plasmid pKS105 wurde dann verwendet, um K. lactis Stamm CBS 2360 zu G418-Resistenz zu transformieren unter Verwendung der SacII-Schnittstelle in der LAC5-5'-Region als Zielstelle für die integrierende Transformation. Die Chymosinproduktion wird in Einheiten pro ml Zellen bei einem O.D.&sub6;&sub1;&sub0; von 200 ausgedrückt, siehe Tabelle 7 unten. Tabelle 7 Sekretion von Prochymosin durch mit pKS105 transformierte K. Lactis-Zellen* Transformant Ueberstand Niederschlag * Chymosinaktivität in relativen Einheiten/ml Kultur.

Beispiel 7

Konstruktion von Plasmiden, die die Kluyveromyces lactis-α-Faktorsequenz für eine effiziente Sekretion enthalten

A. Isolierung und Verwendung von K. lactis-α-Faktorsignalseauenz

Biologische Analysen von Kulturüberständen wurden ausgeführt wie beschrieben [Julius et al., Cell (1983) 32:839), wobei als Testerstamm der S. cerevisiae Mat a sst2-3 Stamm RC687 verwendet wurde. K. lactis Stamm CBS 141(α) wurde in einem Medium kultiviert, das aus 0,5% Glucose, 0,17% Yeast Nitrogen Base ohne Ammoniumsulfat (Difco) und 0,002% Ammoniumsulfat bestand. Nach Entfernung der Zellen durch Zentrifugieren wurde Essigsäure zu dem Kulturüberstand zugesetzt bis zu einer Konzentration von 0,1 Mol/l, und der Ueberstand wurde über eine Säule von Bio-Rex 70 (Biorad) geleitet. Die Säule wurde mit 0,1-molarer Essigsäure gewaschen, und dann wurde der u-Faktor mit 80% Ethanol/10 mMol/l HCl eluiert. Das Eluat wurde zur Trockene eingedampft und dann in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)/20% Acetonitril gelöst und auf eine Umkehrphasen-HPLC-Vorsäule aufgebracht. Die Säule wurde stufenweise mit Lösungen gewaschen, die 0,1% TFA und 20%, 40%, 60% und 80% Acetonitril enthielten. Die 60%-Fraktion, die die α-Faktor-Aktivität enthielt, wurde dann auf eine analytische C-18 HPLC-Säule aufgebracht und mit einem Gradienten von 20% bis 80% Acetonitril in 0,1%-iger TFA eluiert. Fraktionen wurden gesammelt und auf α-Faktor-Aktivität analysiert. Die Fraktionen, die α-Faktor-Aktivität enthielten, wurden getrocknet und der Aminosäuresequenzanalyse unterworfen.

B. Durchtesten von Plasmidbibliotheken via Hybridisierungsmethode

Mischungen von Oligonucleotiden wurden markiert unter Verwendung von γ-[³²P]-ATP und T4-Polynucleotidkinase. Diese Oligonucleotidsonden wurden verwendet, um Southern Blots oder Bakterienkolonien bei 42ºC in der folgenden Hybridisierungslösung zu sondieren: 4xSSC, 50 mMol/l KH&sub2;PO&sub4; pH 7, 1% Sarkosyl, 10% Dextransulfat, 200 ug/ml beschallte, denaturierte Lachssperma-DNA. Die Filter wurden in 2xSSC, 0,1% SDS bei 42ºC gewaschen.
Eine Plasmidbibliothek im Vektor pJS109 enthält DNA-Fragmente einer unvollständigen Sau3AI-Spaltung genomischer DNA von K. lactis Stamm SDII (a trp1 lac4). Diese DNA-Fragmente wurden der Grösse nach fraktioniert, um Stücke > 5000 bp zu reinigen, die als Sonden verwendet werden konnten zum Durchtesten von Transformanten von E. coli Stamm HB101, was durch Ausplattieren von 500 bis 2000 Kolonien auf L-Agarplatten mit 100 g/ml Ampicillin (Durchmesser 80 mm) geschah. DNA wurde aus den Kolonien auf Nitrocellulosefilter transferiert, und diese Filter wurden wie oben beschrieben hybridisiert. Flächen auf den ursprünglichen Platten, die Bereichen von Hybridisierungssignalen auf den Filtern entsprachen, wurden ausgewählt und dann erneut ausplattiert und erneut durch Hybridisierung durchgetestet, um einzelne Kolonien mit Plasmiden, die hybridisierende Sequenzen enthielten, zu isolieren. Positive Kolonien wurden durch Southern Blotting-Analyse von DNA, die aus kleinen Kulturen gereinigt worden war, weiter getestet.
Plasmide, die aus hybridisierungspositiven Kolonien gereinigt worden waren, wurden mit einer Vielzahl von Restriktionsenzymen gespalten, und die resultierenden Fragmente wurden durch Southern Blotting-Analyse unter Verwendung der gleichen Hybridisierungssonden analysiert, um Restriktionsfragmente mit einer Grösse zu identifizieren, die für die DNA-Sequenzanalyse geeignet ist. Auf diese Weise identifizierte Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und in geeignete MP18- und MP19-Vektoren kloniert. Die DNA- Sequenzanalyse wurde dann ausgeführt.

C. Isolierungh von Kluyveromyces-α-Faktor

Die ersten 10 Aminosäuren des K. lactis-α-Faktors zeigten eine eindeutige Homologie zu denjenigen aus S. cerevisiae mit 6 identischen Resten. Diese Sequenz wird unten angegeben:
Trp-Ser-Trp-Ile-Thr-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln
Diese Proteinsequenz wurde verwendet, um einen Satz von Oligonucleotiden zu entwerfen, von dem gefolgert wurde, dass er zu dem Strukturgen, wie es in Fig. 8 gezeigt ist, komplementär wäre. Oligonucleotide, die alle möglichen Codons für ein Segment des α-Faktorpeptids einschlossen, wurden als zwei Mischungen von 96 und 48 verschiedenen Molekülen synthetisiert.
Diese beiden Mischungen wurden unter Verwendung von γ[³²P]-ATP und T4-Polynucleotidkinase radioaktiv markiert und wurden jeweils verwendet, um einen Southern Blot einer Restriktionsspaltung von K. lactis- DNA zu sondieren. Mischung # 2 ergab eine starke Hybridisierung an ein einziges Fragment und eine viel schwächere Hybridisierung an ein zweites Fragment in mehreren verschiedenen Spaltungen. Somit wurde Mischung 2 gewählt, um Plasmidbibliotheken von genomischer DNA von K. lactis durchzutesten.
Die Verwendung dieser Sonden durch Durchtesten von Plasmidbibliotheken führte zu der Isolierung einer Anzahl von hybridisierenden Klonen. Die DNA-Sequenzanalyse eines dieser Klone, αfk18b, zeigte, dass er für ein mit α-Faktor verwandtes Peptid codierte, das eine starke Aehnlichkeit mit dem Vorläufer des S. cerevisiae-α-Faktorpeptids aufwies. Das hybridisierende Segment befand sich auf einem PstI-EcoRI-Fragment von ca. 1000 bp. Die Sequenz dieses Fragmentes ist in Fig. 9 gezeigt. Der K. lactis-Vorläufer enthält nur zwei Stellen für die Addition von N-gebundenen Kohlehydratketten. Ausserdem sind die Zwischenstücke der K. lactis- Wiederholungen länger als diejenigen der S. cerevisiae- Wiederholungen und zeigen eine unterschiedlichere Sequenz mit dem Muster X-Ala/Pro statt der Glu/Ala-Pro- Sequenzen, die in S. cerevisiae gefunden werden. Ein Vergleich der DNA-Sequenzen zeigt auch einen starken Grad von Homologie durch die ganze codierende Region hindurch.

D. Konstruktion von Plasmiden

Eine Reihe von Plasmiden (in Fig. 10 gezeigt) wurden konstruiert, um eine Fusion der K. lactis-α-Faktor-Signalsequenz an Prochymosin zu erzielen, das unter der Transkriptionskontrolle eines starken Promotors exprimiert wurde.
pAB307: Ein 673 bp-SspI-EcoRI-Fragment aus αfk18b (Fig. 9) wurde modifiziert durch Auffüllen des überhängenden EcoRI-Endes durch Klenow-Enzym und Addition von BgIII-Linkern an die glatten Enden. Dieses Fragment wurde dann inseriert in eine BglII-Schnittstelle, die die Promotor- und Terminatorregionen des S. cerevisiae- Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Gens (GAPDH) verbindet. Diese Kassette wurde als BamHI-Fragment in pUC18 kloniert, was pAB307 ergab.
pAB309: Die Fusion von Sequenzen, die für die α- Signalsequenz und Rinderprochymosin codierten, wurde dann ausgeführt. Zuerst wurde pAB307 mit NcoI gespalten, und die klebrigen Enden wurden durch Behandlung mit Mung Bean Nuclease glatt gemacht. Das resultierende Produkt wurde dann mit SalI gespalten. An dieses wurde ein 2000 bp-ECoRV-SalI-Fragment ligasiert, das Sequenzen enthielt, die für Prochymosin und die S. cerevisiae-Transkriptionsterminations-Region codierten. Dieses Fragment stammte aus dem Plasmid pJS111, in dem ein XbaI-BamHI-Adaptor an das 5'-Ende eines Fragmentes addiert worden war, das Prochymosin-cDNA enthielt, fusioniert mit der S. cerevisiae-GAPDH-Transkriptionsterminations-Region. Dieses Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli Stamm HB101 zu transformieren, und ein Transformant, der das Plasmid pAB309 trug, wurde isoliert. Die Sequenzen um das Verbindungsstück dieser Fusion herum sind in Fig. 11 gezeigt, und die Sequenz des gesamten eingesetzten BamHI-SalI-DNA-Fragments von pAB309 ist in Fig. 12 gezeigt.
pAB312: Um Transformation von K. lactis-Stämmen zu erhalten, wurde ein 3560 bp-HindIII-Fragment, das aus pGB901 stammte, in pAB309 inseriert, wodurch das Plasmid pAB312 produziert wurde. Das HindIII-Fragment enthält die 3'-Region des K. lactis-LAC4-Gens und eine Fusion des S. cerevisiae-ADH1-Promotors an das bakterielle G418-Resistenz-Strukturgen.
pAB313 und pAB314: Ein 1900 bp-SacI-HindIII-Fragment wurde aus pAB309 isoliert und kloniert in MP19 [Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33:103]. Einzelsträngige Phagen-DNA wurde hergestellt und als Matrize für die in vitro-Mutagenese mit einem der beiden in Figur 13 gezeigten Oligonucleotidprimer verwendet. Die M13-Phagen MP19/αk11.5 und MP19/αk12.2 wurden unter Verwendung von Primer #1 bzw. Primer #2 hergestellt.
Doppelsträngige RF-DNA wurde aus diesen Phagen hergestellt, und 1100 bp-SacI-StuI-Fragmente wurden aus jeder isoliert. Diese Fragmente wurden ligiert mit einem 7100 bp-SacI-StuI-Fragment aus pAB312. Die resultierenden Plasmide pAB313 und pAB314 wurden mit den in Figur 13 erläuterten Sequenzänderungen isoliert.

E. Transformation von Kluyveromyces

Das Plasmid pAB312 wurde gespalten mit EcoRV (zur gezielten Integration in die LAC4-Region des K. lactis- Genoms) und wurde dann verwendet, um K. lactis Stamm 2UV21 (a ura3 trp1 lac4 [kilº] zur Erzielung von G418- Resistenz zu transformieren. Die Plasmide pAB313 und pAB314 wurden verwendet, um Stamm 2UV21 zur Erzielung von G418-Resistenz zu transformieren. Kulturen der Transformanten 2UV21::pAB312, 2UV21::pAB313 und 2UV21::pAB314 wurden kultiviert, und Kulturüberstände wurden wie oben auf Chymosinaktivität getestet.
Eine Anzahl dieser Transformanten sowie ein nicht transformierter Kontrollstamm wurden 36 Stunden lang in 1 ml Medium kultiviert, das aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose, 0,17% Yeast Nitrogen Base, 50 ug/ml Tryptophan und 50 ug/ml Uracil bestand. Die Kulturüberstände wurden dann auf Chymosinaktivität nach Säureaktivierung analysiert. Es wurde gefunden, dass alle Transformanten aktivierbares Chymosin sekretierten. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Sekretion von Prochymosin in Kluyveromyces Stamm Wirt Plasmid Chymosinaktivität (relative Einheiten/ml Kultur)
Es wurde gefunden, dass jeder der Transformanten eine einzige mit Prochymosin verwandte Spezies sekretierte, wie durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von mit Trichloressigsäure gefällten Kulturüberständen beurteilt wurde. Das mit Prochymosin verwandte Protein, das von pAB312-Transformanten sekretiert wurde, schien ein geringfügig höheres Molekulargewicht zu haben als diejeinigen, die von pAB313- und pAB314-Transformanten sekretiert wurden, wie bestimmt durch die elektrophoretische Mobilität.
Die hauptsächlichen Spezies, die durch KRN303-1 und KRN304-4 sekretiert wurden, wurden durch präparative SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt und der Gasphasenaminosäuresequenzanalyse unterworfen. Die N-terminalen Sequenzen dieser Spezies sind unten angegeben:
Diese Resultate zeigen, dass die mit Prochymosin verwandte Spezies, die durch KRN303-1 sekretiert wird, keine Prozessierung der aminoterminalen Abstandhaltersequenz erfahren hat, während die aus KRN303-4 sekretierte Spezies den authentischen reifen Prochymosin- Aminoterminus hat.

Beispiel 8

Sekretion von t-PA durch Kluyveromyces lactis unter Verwenduna einer Amyloglucosidase-Signalsequenz

A. Klonierung von Gewebeplasminogenaktivator-cDNA

Eine cDNA, die für Gewebeplasminogenaktivator (t- PA) codiert, wurde in ähnlicher Weise erhalten wie von Pennica et al. [Nature (1983) 301:214] beschrieben. DNA-Sequenzanalyse und Kartierung durch Restriktionsenzyme bestätigte die Authentizität der t-PA-cDNA. Für Expressionsstudien wurde das 2,0 kb-BglII-Fragment (siehe Pennica et al.) verwendet, das fast die gesamte codierende Region für das reife Protein und die 3'- nicht codierende Region enthielt.

B. Einführung des G418-Resistenzmarkers in pUC19

Ein DNA-Fragment, das das Tn5-Gen aufweist [Reiss et al., EMBO J. (1984) 3:3317], das Resistenz gegen G418 unter der Kontrolle des Alkoholdehydrogenase I- (ADHI)-Promotors aus S. cerevisiae verleiht, ähnlich dem von Bennetzen und Hall, J. Biol. Chem. (1982) 257: 3018 beschriebenen, wurde in die SmaI-Schnittstelle von pUC19 [Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33:103] integriert. Das erhaltene Plasmid, pUCG418, ist in Figur 14 gezeigt. E. coli, der pUCG418 enthält, wurde am 4. Dezember 1987 beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures unter CBS 872.87 hinterlegt.

C. Konstruktion von pGBtPA1

In einigen Klonierungsstufen wurde pGBtPA1 konstruiert (siehe auch Figur 15 und Tabelle 9), das die folgenden Elemente enthielt:
(1) pUCG418 (siehe oben) geschnitten mit XbaI und HindIII;
(2) das XbaI-SalI-Fragment aus pGB901, das den Lactasepromotor enthält;
(3) synthetische DNA, die für die Signalsequenz von Amyloglucosidase codiert, aus Aspergillus awamori [Innis et al., Science (1985) 228:21]. Die Sequenz vor dem Startcodon wurde gewählt, um die SalI-Schnittstelle am Ende des Lactasepromotorsfragmentes zu entfernen, und weist ferner einen Teil der 5'-nicht codierenden Region des Lactasegens auf;
(4) das 2,0 kb-BglII-Fragment aus der t-PA-cDNA (siehe oben);
(5) synthetische DNA, die einen Teil der 3'-nicht codierenden Region des Lactasegens aufweist. Tabelle 9 Schematische Darstellung von Plasmid pGBtPA1 lactase promoter
Die Proteinsynthese beginnt am unterstrichenen ATG-Codon.

D. Transformation von Kluyveromyces lactis und Analyse der Transformanten

Die Transformation von K. lactis Stamm CBS 2360 mit pGBtPA1 wurde wie in Beispiel 2 beschrieben ausgeführt. Die Transformanten und der Kontrollstamm CBS 2360 wurden ca. 64 Stunden lang bei 30ºC in YEPD-Medium kultiviert. Die Zellen wurden von dem Kulturmedium durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Zellen wurden erneut in einer physiologischen Salzlösung bei einem O.D.&sub6;&sub1;&sub0; von 300 suspendiert und zerstört durch Schütteln mit Glasperlen während 3 Minuten auf einem Vortex- Schüttler bei maximaler Geschwindigkeit. Die Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugieren entfernt.
Ein Test zum Auflösen von Blutkoagulaten gemäss Wallen et al. [Biochim. Biophys. Acta (1982) 719:318) wurde in Mikrotitrierplatten ausgeführt. Eine Lösung wurde hergestellt, die 15 mMol/l Phosphatpuffer (pH = 7,3), 0,2 CU/ml Plasminogen, 1,5 mg/ml Fibrinogen und 0,04% Gelatine enthielt. In jede Vertiefung einer Mikrotitrierplatte wurden 10 ul Thrombin (13,9 NIH-Einheiten/ml), 25 ul Probe und 65 ul der Plasminogen/Fibrinogenlösung gemischt. Die Reaktion wurde verfolgt durch Messen des des O.D.&sub4;&sub5;&sub0; alle 30 Minuten. t-PA aus Melanomzellen (Kabi Vitrum) wurde verwendet, um eine Eichkurve innerhalb jeder Mikrotitrierplatte zu verschaffen.
Tabelle 10 zeigt das Ergebnis einer typischen Analyse von 10 Transformanten. Es wird bewiesen, dass t-PA in dem Kulturmedium von K. lactis, der mit pGBtPA1 transformiert worden war, gefunden wurde. Tabelle 10 Test zum Auflösen von Blutkoagulaten der Kulturen aus mit CBS 2360 und aus mit pGBtPA1 transformiertem CBS 2360 Transformant t-PA-Aktivität im Ueberstand In einigen der Zellextrakte wurde eine geringe t-PA- Aktivität (≤ 3 ug/l) gefunden.
Eine Analyse wurde auch auf SDS-Polyacrylamidgelen ausgeführt, die mit einem Plasminogen/Fibrin- Agarosegel gemäss Granelli-Piperno und Reich [J. Exp. Med. (1978) 148:223] überschichtet waren. 200 ul des Ueberstandes einer Kultur von CBS 2360 oder CBS 2360, der mit pGBtPA1 transformiert war, wurden mit Ethanol gefällt und erneut in 20 ul Probenpuffer (62,5 mMol/l Tris-HCl pH 6,8, 2% Natriumdodecylsulfat, 10% Glycerin, Bromphenolblau) suspendiert. Die Proben wurden auf die Gele geschichtet ohne vorhergehendes Kochen. Die Resultate (in Figur 16 gezeigt) beweisen die Sekretion von menschlichem tPA durch K. lactis. Ferner ist es klar, dass der grösste Teil des sekretierten Materials glycosyliert ist.
Die Sekretion von t-PA wurde auch bestätigt durch Anwendung eines ELISA mit einem monoklonalen Antikörper gegen menschlichen t-PA (ESP5, der von Biopool gekauft wurde) und durch eine Analyse auf chromogene Aktivität (ein handelsüblicher Test von Kabi Vitrum).

Beispiel 9

Sekretion von t-PA durch Kluyveromyces lactis unter Verwendung der Signalsequenz aus menschlichem Serumalbumin

A. Konstruktion von pGBtPA2

In einigen Klonierungsstufen wurde pGBtPA2 konstruiert (siehe Figur 17 und Tabelle 11), das die folgenden Elemente enthielt:
(1) pUCG418, geschnitten mit XbaI und HindIII;
(2) das XbaI-SalI-Fragment aus pGB901, das den Lactasepromotor enthält;
(3) synthetische DNA, die für die Präpro-Region von menschlichem Serumalbumin codiert;
(4) das 2,0 kb-BglII-Fragment aus der t-PA-cDNA (siehe Beispiel 8);
(5) synthetische DNA, die einen Teil der 3'-nicht codierenden Region des Lactasegens aufweist. Tabelle 11 Schematische Darstellung von Plasmid pGBtPA2 lactase promoter
Die Proteinsynthese beginnt am unterstrichenen Codon.

B. Transformation von K. lactis und Analyse der Transformanten

Die Transformation von CBS 2360 mit pGBtPA2 wurde wie im Beispiel 8 beschrieben ausgeführt. Die Transformanten und der Kontrollstamm wurden wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben kultiviert und behandelt. Die Resultate des Tests zum Auflösen von Blutkoagulaten sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Tabelle 12 Test zum Auflösen von Blutkoagulaten der Kulturen von CBS 2360 und mit pGBtPA2 transformiertem CBS 2360 Transformant In einigen der Zellextrakte wurde eine geringe t-PA- Aktivität (≤ 3 ug/l) gefunden.

Beispiel 10

Sekretion von menschlichem Serumalbumin durch Kluyveromyces lactis

A. Synthese und Klonierung der HSA-cDNA

cDNA, die für menschliches Serumalbumin codiert, wurde hergestellt nach der Methode von Okayama und Berg [Mol. Cell. Biol. (1982) 2:161] unter Verwendung von mRNA, die aus menschlicher Leber hergestellt war. Die cDNA wurde in einem Vektor kloniert, der von pBR322 stammte, und in E. coli transformiert. Das Durchtesten der Transformanten wurde unter Verwendung eines Oligodesoxyribonucleotids ausgeführt, das basierte auf der Sequenz des HSA-cDNA-Klons von Lawn et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:6103. Der selektionierte cDNA-Klon wurde teilweise sequenziert und verglichen mit der Sequenz von Lawn et al. Dies zeigte, dass die ersten fünf Nucleotide der für preproHSA codierenden Region abwesend waren, aber die BstEII-Schnittstelle an den Nucleotiden 9 bis 15 der codierenden Region wurde noch gefunden. Diese BstEII-Schnittstelle und die HindIII- Schnittstelle in der 3'-nicht codierenden Region (siehe Lawn et al., oben zitiert) wurden für die Subklonierung in Expressionsvektoren verwendet.

B. Konstruktion von pGBHSA1

In einigen Klonierungsstufen wurde pGBHSA1 konstruiert, das die folgenden Elemente enthielt:
(1) pUCG418 (siehe Beispiel 8) geschnitten mit XbaI und HindIII;
(2) das XbaI-SalI-Fragment aus pGB901 (siehe Beispiel 1);
(3) synthetische DNA (SalI-HindIII-Fragment), die einen Teil der 3'-nicht codierenden Region des Lactasegens aufwies. Die Sequenz dieses Fragmentes ist in Tabelle 13 angegeben. Tabelle 13 Sequenz des SalI-HindIII-Fragmentes von pGBHSA1

C. Konstruktion von pGBHSA2

pGBHSA1 wurde mit SalI und EcoRV geschnitten, und synthetische DNA wurde inseriert:
Das unterstrichene ATG-Codon gibt das Initiationscodon in dem endgültigen Expressionskonstrukt an (pGBHSA3, siehe unten).
Das resultierende Plasmid wurde pGBHSA2 genannt.

D. Konstruktion von pGBHSA3

Der HSA-cDNA-Klon wurde geschnitten mit HindIII, und das klebrige Ende wurde aufgefüllt unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase I. Anschliessend wurde die DNA geschnitten mit BstEII, und das BstEII-HindIII- Fragment (Schnittstelle aufgefüllt), das fast die gesamte für HSA codierende Region enthielt, wurde gereinigt. pGBHSA2 wurde mit XhoI gespalten, die klebrigen Enden wurden aufgefüllt unter Verwendung von Klenow- DNA-Polymerase I, und die Spaltung mit BstEII wurde ausgeführt. In den resultierenden Vektor wurde das für HSA codierende Fragment [BstEII-HindIII (Schnittstelle aufgefüllt)] inseriert. Das erhaltene Plasmid, pGBHSA3, ist in Figur 18 gezeigt.

E. Transformation von Kluyveromyces lactis und Analyse der Transformanten

Die Transformation von K. lactis Stamm 2360 mit pGBHSA3 wurde wie in Beispiel 2 beschrieben ausgeführt. Die Transformanten und der Kontrollstamm CBS 2360 wurden ca. 64 Stunden lang bei 30ºC in YEPD-Medium kultiviert. Die Zellen wurden von dem Kulturmedium durch Zentrifugieren abgetrennt. Proben von 30 ul wurden aus den Ueberständen entnommen und durch Elektrophorese auf einem 10%-igen Polyacrylamidgel gemäss Laemmli [Nature 227, 680 (1970)] analysiert. Die in Figur 19 gezeigten Resultate beweisen, dass HSA durch K. lactis-Zellen, die mit pGBHSA3 transformiert sind, in das Kulturmedium sekretiert wird. Es gibt auch ein Anzeichen dafür, dass die Sekretion von anderen Proteinen in den HSA-erzeugenden Zellen verringert ist.
Die obigen Resultate beweisen, dass man eine effiziente, gewünschte Expression von exogenen Genen in Kluyveromyces-Stämmen erhalten kann. Ferner zeigt es sich, dass die Kluyveromyces-Stämme besonders brauchbar für die Verschaffung einer hoch effizienten Sekretion und Prozessierung einer grossen Vielfalt von Proteinen sind, wie die Resultate mit Prochymosin erläutern. Es werden Konstrukte und Vektoren zur Verfügung gestellt, die die Einführung eines exogenen Gens unter der regulatorischen Kontrolle von effizienten Promotoren in Kluyveromyces und wie gewünscht die Verbindung mit Signalsequenzen, die für die Translokation des exogenen Gens, insbesondere die Sekretion, sorgen, erlauben. Somit wird ein Fermentationssystem für die kommerzielle Produktion einer grossen Vielfalt von exogenen Proteinen in einer aktiven oder aktivierbaren Form zur Verfügung gestellt.
Die folgenden Organismen wurden am 30. Juni 1987 bei der American Type Culture Collection hinterlegt: 2UV21, ATCC Accession No. 20855; KRN201-6, ATCC Accession No. 20854; HB101 pAB307, ATCC Accession No. 67454; HB101 pAB312, ATCC Accession No. 67455.
Obgleich die vorstehende Erfindung in gewissen Einzelheiten durch Erläuterung und Beispiel zum Zwecke der Klarheit des Verständnisses beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, dass gewisse Aenderungen und Modifizierungen innerhalb des Rahmens der beigefügten Patentansprüche praktiziert werden können.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines interessierenden Polypeptids in einer Kluyveromyces-Wirtszelle, wobei das Verfahren umfasst:

das Einführen in die genannte Wirtszelle einer DNA-Sequenz, die für das genannte interessierende Polypeptid codiert, und

das Kultivieren der genannten Wirtszelle, die die genannte DNA-Sequenz aufweist, in einem Kulturmedium, wodurch das genannte interessierende Polypeptid oder ein Teil davon in das Kulturmedium sekretiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die genannte DNA-Sequenz Bestandteil eines DNA-Konstrukts ist, das in die genannte Wirtszelle eingeführt wird und das in der Transkriptionsrichtung eine Regulationsregion für die Initiation der Transkription, die in der genannten Wirtszelle funktionsfähig ist; eine Signalsequenz für die Sekretion, die in Bezug auf die genannte Wirtszelle oder in Bezug auf das genannte interessierende Polypeptid oder in Bezug auf den genannten Wirt und in Bezug auf das genannte interessierende Polypeptid heterolog ist und im Leseraster mit dem 5'-Terminus der genannten DNA-Sequenz verbunden ist; wobei die genannte DNA-Sequenz für das genannte interessierende Polypeptid codiert; und eine Regulationsregion für die Termination der Transkription, die in der genannten Wirtszelle funktionsfähig ist; aufweist, wodurch das genannte interessierende Polypeptid durch die genannte Wirtszelle sekretiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte interessierende Polypeptid ein Enzym ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Enzym Chymosin oder ein Vorläufer davon ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Enzym Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) oder Mutantenformen davon ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte interessierende Polypeptide menschliches Serumalbumin (HSA) ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Wirtszelle ein industrieller Stamm von Kluyveromyces ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Wirtszelle K. lactis oder K. fragilis ist.

9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte DNA-Konstrukt ferner einen Selektionsmarker und/oder ein Replikationssystem für die autonome Replikation der genannten DNA-Sequenz und/oder eine die Transformationseffizienz steigernde Sequenz aufweist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Replikationssystem eine autonom replizierende Sequenz (ARS) ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte autonom replizierende Sequenz eine autonom replizierende Kluyveromyces-Sequenz (KARS) ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker Resistenz gegen G418 ist.

13. Verwendung von Kluyveromyces als Wirt für die Transformation und Expression von Fremdgenen und die Sekretion des Polypeptids, für das das genannte Gen codiert, oder die Sekretion eines Teils des genannten Polypeptids.

14. Transformierte Kluyveromyces-Wirtszelle, die eine Expressionskassette aufweist, die in der Transkriptionsrichtung eine Regulationsregion für die Initiation der Transkription, die in der genannten Wirtszelle funktionsfähig ist, eine Signalsequenz für die Sekretion, die in der genannten Wirtszelle funktionsfähig ist und im Leseraster mit einer DNA-Sequenz verbunden ist, die für ein interessierendes Polypeptid codiert, und eine Regulationsregion für die Termination der Transkription, die in der genannten Wirtszelle funktionsfähig ist, aufweist.

15. Zelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Signalsequenz heterolog in Bezug auf die genannte Wirtszelle oder in Bezug auf das genannte interessierende Polypeptid oder in Bezug auf die genannte Wirtszelle und in Bezug auf das genannte interessierende Polypeptid ist.

16. Zelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Signalsequenz die α-Faktorsignalsequenz aus Saccharomyces cerevisiae ist.

17. Zelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Signalsequenz die Amyloglucosidasesignalsequenz aus Aspergillus awamori ist.

18. Zelle nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte interessierende Polypeptid Chymosin oder ein Vorläufer davon, t-PA oder HSA ist.

19. Zelle nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass mit der genannten Expressionskassette ein Selektionsmarker und/oder ein Replikationssystem für die autonome Replikation der genannten DNA-Sequenz und/oder eine die Transformationseffizienz steigernde Sequenz verbunden ist.

20. Zelle nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Replikationssystem eine autonom replizierende Sequenz (ARS) ist.

21. Zelle nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte autonom replizierende Sequenz eine autonom replizierende Kluyveromyces-Sequenz (KARS) ist.

22. Zelle nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Selektionsmarker Resistenz gegen G418 ist.

23. DNA-Konstrukt für die Verwendung in einer Kluyveromyces-Wirtszelle, gekennzeichnet durch:

in der Transkriptionsrichtung eine Regulationsregion für die Initiation der Transkription, die in der genannten Wirtszelle funktionsfähig ist; eine Signalsequenz für die Sekretion, die in der genannten wirtszelle funktionsfähig ist und im Leseraster mit einer DNA- Sequenz verbunden ist, die für ein interessierendes Polypeptid codiert; und eine Regulationsregion für die Termination der Transkription, die in der genannten Wirtszelle funktionsfähig ist.

24. DNA-Konstrukt nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Signalsequenz heterolog in Bezug auf die genannte Wirtszelle oder in Bezug auf das genannte interessierende Polypeptid oder in Bezug auf die genannte Wirtszelle und in Bezug auf das genannte interessierende Polypeptid ist.

25. DNA-Konstrukt nach Anspruch 23 oder 24, ferner gekennzeichnet durch:

einen Selektionsmarker und/oder ein Replikationssystem für die autonome Replikation des genannten DNA- Konstrukts und/oder eine die Transformationseffizienz steigernde Sequenz.

26. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Fragment, das für die Signalsequenz codiert, und die DNA-Sequenz, die für das interessierende Polypeptid codiert, im Leseraster mit einem Gen fusioniert sind, das in Kluyveromyces exprimiert wird.

27. DNA-Konstrukt nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, das die genannte DNA-Sequenz mit einer zweiten DNA-Sequenz fusioniert ist, die für mindestens vier Aminosäuren des N-Terminus des Lactasegens codiert.

28. Plasmid, das aus der Gruppe gewählt ist, die besteht aus:

pKS105 mit einer physikalischen Karte, wie sie in der beiliegenden Figur 7 dargestellt ist, das eine LAC4- Promotor/α-Faktor-Signalsequnez/Prochymosin-Fusion aufweist,

pGB901 mit einer physikalischen Karte, wie sie in der beiliegenden Figur 2 dargestellt ist, das einen Lactasepromotor, ein Gen, das für Prochymosin codiert, einen Lactaseterminator und ein Gen, das für den G418- Antibiotikumresistenzmarker codiert, aufweist, pGBTPA1 mit einer physikalischen Karte, wie sie in der beiliegenden Figur 15 dargestellt ist, das ein Gen, das für den G418-Antibiotikumresistenzmarker codiert, ein Fragment aus pGB901, das den Lactasepromotor enthält, synthetische DNA, die für die Signalsequenz von Amyloglucosidase aus Aspergillus awamori codiert, ein 2,0 kb-BglII-Fragment aus der t-PA-cDNA und synthetische DNA, die einen Teil der 3'-nichtcodierenden Region des Lactasegens aufweist, aufweist, und pGBHSA3 mit einer physikalischen Karte, wie sie in der beiliegenden Figur 18 dargestellt ist, das ein Gen, das für den G418-Antibiotikumresistenzmarker codiert, ein Fragment aus pGB901, das den Lactasepromotor enthält, ein cDNA-Fragment, das für PreproHSA codiert, und synthetische DNA, die einen Teil der 3'-nichtcodierenden Region des Lactasegens aufweist, aufweist.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte interessierende Polypeptid oder ein Teil davon aus dem Kulturmedium isoliert wird.