DE3873353T2

DE3873353T2 - Reinigung von monomerem interferon.

Info

Publication number: DE3873353T2
Application number: DE8888909257T
Authority: DE
Inventors: D Clark; Andrea J D; J Tarnowski
Original assignee: Interferon Sciences Inc
Current assignee: Interferon Sciences Inc
Priority date: 1987-10-06
Filing date: 1988-10-03
Publication date: 1993-03-18
Anticipated expiration: 2008-10-04
Also published as: EP0396555B1; ATE78698T1; EP0396555A1; JPH03500410A; EP0396555A4; CA1329307C; DE3873353D1; WO1989003225A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Isolierung der voll oxidierten Form von homogenem Human-Leukocyten-Interferon-Monomer. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung der voll oxidierten Form von Alpha- Interferon durch eine Folge von Reinigungsschritten, die Immunaffinitäts-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie (reverse phase chromatography) Kationenaustausch- Chromatographie und Gelfiltrations-Chromatographie einschließen.
Die Alpha-2-Subspezies von Human-Leucozyten-Interferon (IFN-alpha-2) ist eine 165 Aminosäuren umfassende Polypeptidkette mit einer Sekundärstruktur, die durch zwei intramolekulare Disulfid-Brücken gekennzeichnet ist (CYS¹-CYS&sup9;&sup8; und CYS²&sup9;-CYS¹³&sup8;) [G. Bodo und I. Fogy, "Characterization of Different Molecular Species in Affinity Purified Recombinant Human Interferon Alpha 2", The Interferon System, Seiten 23 - 27 (1985); R. Wetzel, et al., "Properties of a Human Alpha-Interferon Purified From E.coli Extracts", J. Interfer. Res. 1, Seiten 381 - 390 (1981)]. Jedoch fanden Bodo und Fogy in dem durch Affinitäts-Chromatographie gereinigten Polypeptid auch Spezies von IFN-alpha-2, in denen die Disulfid-Bindungen falsch gepaart waren oder in denen die kritischen Cystin-Reste teilweise oder vollständig reduziert waren.
Bestimmte Formen dieser Formen können eine niedrigere spezifische Aktivität aufweisen [vgl. H. Moorehead et al., "Roles of the 29-138 Disulfide Bond of Subtype A of Human α Interferon in Its Antiviral Activity and Conformational Stability", Biochemistry. 23, Seiten 2500 - 2507 (1984)]. Alternativ dazu können sie zu einer Konformation führen, die verschieden von der des nativen Moleküls ist, so daß infolge einer Verabreichung eine nachteilige Reaktion zustande kommen könnte. Teilweise oder vollständig reduzierte Formen sind weniger stabil und können zu weiter verdrehten Molekülen führen.
Die Literatur unterscheidet langsam wandernde Monomere (slow-moving monomers; SSM) mit wenigstens einer freien Sulfhydryl-Gruppe (teilweise oder vollständig reduzierte Form) und ein schnell wanderndes Monomer (fast-moving monomer; FMM) mit zwei Disulfid- Bindungen (vollständig oxidierte Form). Die freien Sulfhydryl-Gruppen von SMM führen durch die Bildung intermolekularer Disulfid-Bindungen zur Bildung von Oligomeren. Diese Oligomere haben eine niedrigere spezifische Aktivität und können nachteilige Reaktionen im Menschen hervorrufen [vgl. S. Pestka und S.J. Tarnowski, "Purification Of The Interferons"; Pharmac. Ther., 29, Seiten 299 - 319 (1986)]. Tests auf Oligomere des Interferons sind bekannt [S. Pestka et al., " Specific Immunoassay for Protein Dimers, Trimers, and Higher Oligomers," Anal. Biochem . . 132, Seiten 328 - 333 (1983); S. Pestka, et al., "Procedures For Measurement Of Interferon Dimers And Higher Oligomers By Radioimmunoassay", Meth. Enzymol., 119, Seiten 588 - 593 (1986)].
Berücksichtigt man alle möglichen Kombinationen von Disulfid-Bindungen und freien Sulfhydryl-Gruppen, existieren theoretisch 10 monomere Formen von IFN-alpha-2.
Bei extensiver Reinigung des Proteins isolierten D.R. Thatcher und N. Panayotatos rekombinantes IFN-alpha-2, welches sie so charakterisierten, daß es eine größere Komponente mit einem pI von 5,9 umfaßte, die von drei geringer anodischen Banden begleitet war ["Purification of Recombinant Human IFN-α", Meth. Enzymology. 119, Seiten 166 - 177 (1986)]. Entsprechend den Aufführungen von Thatcher und Panayotatos ist die Reinigung von korrekt gefaltetem, vollständig oxidiertem Monomer nicht einfach, da diese "Konformationsvarianten" Eigenschaften aufweisen, die sehr ähnlich den Eigenschaften des nativen Moleküls sind. Außerdem legt ihre Arbeit nahe, daß Konformations-Varianten daraus entstehen können, daß die intracelluläre Umgebung von Wirts-Mikroorganismen insgesamt ein Reduzieren des Redoxpotential aufweist, das die Herstellung der reduzierten Form des Monomeren begünstigt. Die von ihnen beobachteten Konformations-Varianten können aus dem reduzierten Monomer entstehen.
Im Hinblick auf die klinische Wichtigkeit der reinen, vollständig oxidierten Form von IFN- alpha-2 wurden Versuche unternommen, das schnell wandernde Monomer (FMM) von anderen Formen des Proteins zu isolieren. Es wurden zahlreiche Verfahrensweisen für die Reinigung von IFN in der Literatur beschrieben. Die europäische Patentanmeldung 108 585 betrifft die Entfernung beider Oligomere und langsamer Monomere aus einer Interferon- Zubereitung durch Inkubation bei saurem pH-Wert und erhöhten Temperaturen über eine längere Zeit. A.M. Felix et al., "Analysis Of Different Forms of Recombinant Human Leukocyte Interferons by High Performance Liquid Chromatography, Methods in Enzylmology. 119, Seiten 242 - 248 (1986)" berichteten über die Abtrennung des langsam wandernden Monomeren (SMM) von dem schnell wandernden Monomeren (FMM) durch Modifikation des Metallchelat-Chromatographieverfahrens von J. Porath et al. ["Metal Chelate Affinity Chromatography, A New Approach to Protein Fractionation", Nature (London), 258, Seiten 598 - 599 (1975)].
Das US-Patent 4,432,895 betrifft die Umwandlung von oligomerem Interferon in monomeres Interferon durch Behandlung mit einem Redox-Reagenz. Keine der Druckschriften hat jedoch ein Verfahren zum Abtrennen der vollständig oxidierten, schnell wandernden Monomeren dokumentiert.
Im Hinblick auf die Schwierigkeiten bei der Isolation von homogenem FMM in seiner nativen Konformation in hohen Mengen besteht nach wie vor ein Bedürfnis für ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Die vorliegende Erfindung löst das oben angesprochene Problem dadurch, daß sie ein Mittel zum Isolieren dies schnell wandernden Monomeren (FMM) in im wesentlichen reiner, nativer Form bereitstellt. Genauer gesagt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Abtrennen von FMM von Nicht-Interferon-Proteinen, oligomerem Interferon und SMM bereit. Außerdem führt das vorliegende Verfahren zur Trennung der verschiedenen FMM-Formen voneinander, d. h. FMM&sub1; von FMM&sub2;.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren wird das schnell wandernde Monomer (FMM) von anderen Interferon-(IFN-)Formen und Nicht-Interferon-Verunreinigungen durch verschiedene Reinigungsschritte abgetrennt. Insbesondere umfaßt das Verfahren eine Reinigung durch Immunoaffinitäts-Chromatographie, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC. Die beiden FMM- Formen, FMM&sub1; und FMM&sub2;, können voneinander nicht durch SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) getrennt werden, da sie in ihrer Größe identisch sind. Sie wurden jedoch auf Grundlage ihrer Hydrophobizität und Ladung getrennt, wobei man Umkehrphasen-HPLC bzw. Kationenaustausch-Chromatographie einsetzte. Entsprechend dem vorliegenden Verfahren kann das FMM&sub2; dann durch Gelfiltration bis zur Homogenität gereinigt werden.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 das Reinigungsverfahren zur Herstellung der vollständig oxidierten Form (schnell wanderndes Monomer) von rekombinantem Alpha-2-Interferon (FMM&sub2;);
Fig. 2 ein typisches Umkehrphasen-(RP-)HPLC-Elutionsprofil des Eluats aus der Immunoaffinitäts-Chromatographie (A); das Kationenaustausch-Chromatographie- Elutionsprofil der FMM-Fraktion aus dem RP-HPLC-Schritt (B); ein zweites Kationenaustausch-Chromatographie-Elutionsprofil der FMM-Fraktion aus dem RP- HPLC-Schritt (C); und das SephadexR G-50-Gelfiltrations-Elutionsprofil von FMM&sub2; aus dem Schritt der Kationenaustausch-Chromatographie (D);
Fig. 3 die verbesserte Umkehrphasen-(RP-)HPLC-Trennung des FMM&sub1; von FMM&sub2;, die sich bei einer Erhöhung der Säulen-Betriebstemperatur von 25ºC auf 40ºC ergab;
Fig. 4 die Umkehrphasen-(RP-)HPLC-Analyse der bei der Reinigung von rekombinantem IFN-alpha-2 (FMM&sub2;) entstehenden Intermediate;
Fig. 5 einen Vergleich der RP-HPLC-Ergebnisse von rekombinantem IFN-alpha-2- FMM&sub1; und -FMM&sub2; mit IntronR A;
Fig. 6 einen Vergleich der RP-HPLC-Ergebnisse von rekombinantem IFN-alpha-2- FMM&sub2; mit IntronR A und RoferonR A; und
Fig. 7 das Mapping (Kartierung) des typischen Abbaus von FMM&sub1; und FMM&sub2;.
Das vorliegende Verfahren nutzt in vorteilhafter Weise die Unterschiede der beiden FMM- Formen hinsichtlich Hydrophobie und Ladung, so daß Einzelisomere unter Herstellung der reinen und stabilen, vollständig oxidierten Monomere voneinander getrennt werden können. Das Eluat aus der Antikörpersäule, das rekombinantes IFN-alpha-2 enthält (das Produkt des ersten Schritts des Reinigungsverfahrens), enthält auch die FMM-Formen, langsam wandernde Monomere, Fragmente, Dimere und höhere Oligomere wie auch Nicht-IFN- Proteine. Diese Proteinmischung wird an eine Umkehrphasensäule (The Separations Group, Hesperia, CA) hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen gebunden, und die Proteine werden durch mehrfache isocratische (d. h. mit einer einzigen Lösungsmittelkonzentration erfolgende) Elutionsschritte chromatographiert. Die die FMM-Formen enthaltende Fraktion wird danach an eine Kationenaustauschsäule gebunden. Der Kationen-Austauschschritt ermöglicht die Trennung von Proteinmolekülen auf der Grundlage der Unterschiede in ihrer positiven Netto-Ladung bei einem speziellen pH-Wert. Unter Verwendung einer isocratischen, gepufferten Salzlösung werden die FMM-Isomere isoliert. Auf der Grundlage der Reihenfolge ihrer Elution aus der Kationenaustauschsäule werden diese Isomere mit "FMM&sub1;", und "FMM&sub2;", bezeichnet. Eine auf der Grundlage des Ausschlusses nach Größe arbeitende Säule wird als letzter Schritt eingesetzt, um einen Puffer-Austausch zu bewirken und alle Rest-Oligomere von dem Monomer abzutrennen. Das am Ende erhaltene, gereinigte FMM&sub2; wird als einzelne Spezies durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), isoelektrisch fokussierende Gelelektrophorese (IEF) und analytische; Umkehrphasen Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (RP-HPLC) charakterisiert.
Die vorliegenden Verfahrensschritte können auf rekombinantes Alpha-2-Interferon wie auch auf natürliches Alpha-2-Interferon, das von Leucozyten erhalten wurde, oder auf Alpha-2- Interferon angewandt werden, das durch organische Synthese hergestellt wurde. Sie können auch zum Erhalt monomerer Formen anderer Alpha-Interferone geeignet sein.
Bei der Reinigung von aus natürlichen Quellen abgeleiteten oder durch gentechnische Verfahren hergestellten (d. h. rekombinanten) Proteinen besteht eine Möglichkeit, daß das native Protein post-translational modifiziert wird, zusätzlich zu einer möglichen Modifikation als Folge des Reinigungsverfahrens. Diese Modifikationen können in Form von chemischen Reaktionen an Aminosäure-Seitenketten auftreten, die beispielsweise zu einer Umwandlung von Methionin in Methioninsulfoxid oder zu einer Deaminierung von Aminosäureresten wie beispielsweise Asparagin und Glutamin führen. Auch sind die Entfernung von Carboxy- oder Aminoterminalen Resten durch Exopeptidasen mögliche Mechanismen einer Modifikation des natürlichen Proteins.
Das vorliegende Reinigungsverfahren erlaubt wenigstens im Fall von IFN-alpha die Gewinnung des biologisch aktiven, reinen Monomers in seinem nativen oder natürlichen Zustand. Eine erhöhte Reinheit verbessert die Stabilität, kann die Gefahr von nachteiligen Reaktionen gegenüber Verunreinigungen verringern und erhöht die spezifische Aktivität des resultierenden Produktes.
Das gemäß den Verfahrensweisen der vorliegenden Erfindung gereinigte FMM kann unter Anwendung bekannter Verfahrensweisen zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher Zubereitungen formuliert werden. Solche Zubereitungen schließen vorzugsweise auch herkömmliche, pharmazeutisch annehmbare Träger ein und können Hilfsstoffe, Vehikel oder andere medizinische Mittel einschließen. Die resultierende Formulierung enthält eine Menge an FMM, die bei der intravenösen, parenteralen oder topischen Behandlung mit IFN-alpha wirksam sein soll.
Das FMM&sub2; gemaß der vorliegenden Erfindung kann selektiv mit proteolytischen Enzymen oder chemischen Reagenzien unter Erhalt von aktiven Fragmenten des FMM&sub2; behandelt werden. Es kann auch kovalent oder auf andere Weise an Polypeptide oder andere Substanzen unter Schaffung größerer Proteine oder Proteinkonjugate geknüpft werden.
Die gemäß den Verfahrensweisen der vorliegenden Erfindung gereinigten FMM-Formen können in einer Vielzahl von Formen eingesetzt werden. Die bevorzugte Form hängt von der beabsichtigten Verabreichungsweise und therapeutischen Anwendung ab. Es wird beispielsweise auf das US-Patent 4,680,175 (Vehikel für die topische Verabreichung) bezug genommen. Die Dosierung und Dosisrate hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, die für die zu behandelnde Krankheit spezifisch sind. Damit die vorliegende Erfindung noch besser verstanden wird, werden nachfolgend einige Beispiele angegeben. Diese Beispiele werden ausschließlich zum Zweck der Veranschaulichung der Erfindung angegeben und sollen nicht als Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung verstanden werden.

Beispiel I

In diesem Beispiel wird ein Verfahren zur Gewinnung von rekombinantem Leucozytenalpha-IFN-FMM&sub2; aus Hefezellen-Lysat beschrieben, das im wesentlichen frei ist von Hefeproteinen, Interferonfragmenten und abweichenden Formen des Interferon-Moleküls.

Expression von rekombinantem Alpha-2-Interferon

Rekombinante DNA-Verfahren wurden eingesetzt, um das IFN-Gen in Hefe (Saccharomyces cerevisiae) zu klonieren und exprimieren. Dazu wurde der Expression-Vektor CGS 281 verwendet, der von Collaborative Research, Inc. (Lexington, Massachusetts) erhalten wurde. Dieser ist bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland hinterlegt (ATCC Nr. 20663).
Das Ausgangsprodukt für die Immunoaffinitätssäule war ein zellfreies, geklärtes Lysat, das von einem Fermentat unter Einschluß von Hefeproteinen erhalten worden war. Man erhielt das geklärte Lysat durch eine viele Schritte umfassendes Verfahren einschließlich der Homogenisierung und einer Kombination von Zentrifugation und tangentialer Mikrofiltration. Dies führt zu einem klaren Lysat, das dann auf eine SepharoseR-Säule mit einem Anti-IFN-alpha-2-monoclonalen Antikörper aufgegeben wurde. Das nachfolgend erhaltene Eluat enthielt die IFN-Monomere und -Oligomere, jedoch nur eine kleine Menge an Nicht- IFN-Protein-Verunreinigungen (wie beispielsweise nicht spezifisch adsorbierte Hefeproteine). Das Reinigungsverfahren wird nachfolgend genauer beschrieben.

Immunoaffinitäts-Chromatographie

Man sammelte die durch gentechnische Verfahren erhaltenen Hefezellen und brach sie auf, um das rekombinante IFN-alpha-2 freizusetzen und entfernte die nicht aufgebrochenen Zellen sowie Zellfragmente mittels Zentrifugation und tangentialer Mikrofiltration. Man gab das resultierende, geklärte Lysat auf eine Immunoaffinitäts-Matrix auf, die einen Anti-IFN-alpha- 2-monoclonalen Antikörper ("LIT1") an SepharoseR gebunden umfaßte. Der LIT1- monoclonale Antikörper war von der Firma Interferon Sciences, Inc. erhalten worden. Anstelle dessen können jedoch auch andere Anti-alpha-2-Interferon-Antikörper eingesetzt werden (vgl. beispielsweise US-Patent 4,423,147; europäische Patentanmeldung 91,543; britisches Patent 2,111,527).
Das Lysat wurde durch die Immunoaffinitäts-Matrix-Säule (nachfolgend als "LIT1/S" bezeichnet) gegeben, um das rekombinante IFN-alpha an die Matrix zu binden und die Mehrzahl anderer Lysat-Komponenten und -Proteine zu eliminieren. Die Säule wurde mit einer Phosphat-gepufferten Lösung (pH 7,4), die 1,5 M NaCl und 50% (v/v) Ethylenglykol enthielt, gewaschen. Eine zweite Phosphat-gepufferte Lösung (pH 7,4), die 0,15 M NaCl enthielt, wurde angewendet, bis sich der Wert des O.D. 280-Nachweises der auslaufenden Flüssigkeit dem Wert 0 näherte. Nachdem die LIT1/S-Matrix sorgfältig gewaschen worden war, wurde das gebundene IFN durch Elution mit einem sauren Puffer entfernt, der aus 0,3 M NaCl enthaltender 0,2 M Citronensäure (pH 2,0) bestand. Ein Essigsäure- oder Glycin- Puffer wären als Eluenz genauso wirksam.
Der Schritt der Immunoaffinitäts-Chromatographie könnte aus dem Gesamt-Reinigungsverfahren weggelassen werden, wenn Änderungen bei der anfänglichen Behandlung des rohen Lysats durchgeführt würden. Beispielsweise könnte das Rohlysat chargenweise an eine geeignete Umkehrphase oder an Ionenaustausch-Medien adsorbiert werden. Teilweise gereinigtes IFN könnte dann entweder chargenweise oder säulenweise entfernt werden, und das IFN könnte dann weiter wie nachfolgend beschrieben gereinigt werden.

Umkehrphasen-Chromatographie (Reverse phase chromatography: RPC)

Danach wurde RPC eingesetzt, um die IFN-FMM-Formen von den -SMM-Formen, dimeren und höheren Oligomeren sowie Nicht-IFN-Kontaminations-Proteinen zu trennen. Die Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (RP-HPLC) wurde an einem Waters Binary HPLC-System durchgeführt, das mit einer automatischen Gradientenkontroll- Vorrichtung, 2 HPLC-Pumpen, einem LC-Spektrophotometer und einem Recorder/Integrator ausgerüstet war. Die C-4-Säule (22 mm auf 250 mm; Teilchengröße: 10 um; Porengröße: 300 Å (300 · 10&supmin;¹&sup0;m)) wurde in 0,1%iger (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (HPLC- Qualität) equilibriert. Das IFN wurde an die Umkehrphasensäule dadurch gebunden, daß man das LIT1/S-Eluat unmittelbar durch Pumpe A aufgab. Die gebundenen Proteine wurden von der C-4-Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 18 ml/min entsprechend dem folgenden programmierten Gradienten eluiert: Zeit % B Krümmung linear
Lösung B bestand aus 0,1%iger TFA (v/v) in Acetonitril (CH&sub3;CN). Die gebundenen Proteine, die aufeinanderfolgend von der C-4-Säule eluiert wurden, wurden als Einzelfraktionen gewonnen, und die benachbarten, FMM&sub1; und FMM&sub2; entsprechenden Peaks wurden für weitere Reinigungsschritte zusammengefaßt.
Es wird nun Bezug auf Fig. 2A genommen. Die Fraktionen mit Elutionszeiten zwischen 15,5 Minuten und 18,0 Minuten enthielten die FMM-Formen. Diese Fraktionen stellen einen relativen Flächenanteil von etwa 25% der gesamten Protein-Beladung dar. Für diese besondere Säule und die angegebenen Betriebsbedingungen wurden FMM&sub1; und FMM&sub2; zu etwa 46% B eluiert. Das Verhältnis von FMM zu FMM betrug etwa 50 zu 50, bezogen auf die relativen Flächenprozente. Dieses Verhältnis kann jedoch auch bis zu 10 : 90 (FMM&sub1; : FMM&sub2; variieren. Der Peak, der bei einer Elutionszeit von 14,55 Minuten erschien, steht für eine Fraktion, die Nicht-Interferon-Proteine aus Hefe enthielt.
Gegebenenfalls könnte Hydrophobie-Wechselwirkungs-Chromatographie (hydrophobic interaction chromatography; HIC) den RPC-Schritt ersetzen. Dadurch wird die Verwendung organischer Lösungsmittel entbehrlich. Beim Übertragen des Umkehrphasen-Chromatographie-Schritts auf größere Verfahrensdimensionen könnte auch ein Säulenpackungsmaterial mit größerer Teilchengröße verwendet werden. Dies erlaubte die Anwendung von Niederdruck-Chromatographie und macht dadurch die notwendige Verwendung der teuren HPLC-Anlage überflüssig. Außerdem ermöglicht dies einen eher wartungsfreien Betrieb und eine leichtere Automatisierung des Gesamtsystems.
Eine weitere Modifikation des RP-HPLC-Schritts könnte folgende Varianten einschließen: Verwendung von Lösungen mit einem Gradienten und/oder von isocratischen Lösungen; eine Erhöhung oder Erniedrigung der Fließgeschwindigkeiten; die Verwendung organischer Modifiziermittel außer Acetonitril wie beispielsweise n-Propanol, 2-Propanol, Methanol, Ethanol, Dioxan oder anderer Substanzen, die als eluierende Lösungsmittel verwendet werden; die Verwendung anderer, Ionenpaare liefernder Mittel als TFA, beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Phosphorsäure oder Perchlorsäure oder Perchloratsalze; eine erhöhte (d. h. größer als 0,1% (v/v)) oder verringerte Menge des Ionenpaare liefernden Mittels; die Verwendung einer stationären Phase mit anderen immobilisierten hydrophoben Gruppen wie beispielsweise C&sub3;, C&sub5;, C&sub8;, C&sub1;&sub8; oder Phenyl; und Betrieb bei Temperaturen im Bereich von 0 ºC bis 56 ºC. Eine Änderung in Bezug auf einen oder mehrere der oben genannten Parameter sollte die Optimierung der Auflösung bei der Trennung von FMM&sub2; und anderen Komponenten zum Ziel haben.
Die Wirkung einer Variation der Teilchengröße in den C&sub4;-Säulenpackungen wurde untersucht. Es wurde gefunden, daß die Verringerung der Auflösung zwischen den Monomerspecies mit steigender Teilchengröße unter Verwendung der oben beschriebenen Elutionsbedingungen größer wurde, daß jedoch die Trennung des Monomers von anderen rekombinanten alpha-2-Formen noch durchgeführt werden kann, wenn die Teilchengrößen im Bereich von 5 bis 30 um variiert wurden.
FMM&sub1; und FMM&sub2; können durch Umkehrphasen-Techniken auf der Grundlage von Hydrophobieunterschieden zwischen den beiden Species getrennt werden, beispielsweise durch Ändern der Säulentemperatur. Fig. 3 vergleicht zwei Chromatogramme, die durch Regeln der Säulentemperatur auf 25 ºC (Abbildung A) und 40 ºC (Abbildung B) erzeugt wurden. Die Auflösung zwischen FMM&sub2; und FMM&sub1; bei 40 ºC ist weit besser (Trennung der Peaks über etwa 3 Minuten) als die Auflösung, die bei 25 ºC erzielt wurde (Trennung der Peaks über etwa 1 Minute).
In dieser Verfahrensstufe wurde auch ein S-200-Gelfiltrations-Schritt getestet. Man entschloß sich jedoch, statt dessen die C-4-Säule zu verwenden. Dies geschah aus verschiedenen Gründen: (1) Bei Verwendung von S-200 wären große Säulen erforderlich; (2) die Probe müßte vor der Aufgabe auf die S-200-Säule aufkonzentriert werden; (3) die Probe würde während der Gelfiltration verdünnt; (4) die S-200-Säule weist eine begrenzte Kapazität auf; (5) die Entwicklung des S-200-Chromatogramms dauerte länger (über einen Zeitraum von 24 Stunden); und (6) die Auflösung zwischen Oligomeren, Monomeren und Fragmenten durch die S-200-Säule wäre im Vergleich zur Trennung, die durch Umkehrphasen- Chromatographie erreicht werden kann, schlechter.

Kationenaustausch-Chromatographie

Mittels Kationenaustausch-Chromatographie wurden die FMM&sub1;- und FMM&sub2;-Monomere auf der Basis der Unterschiede ihrer positiven Nettoladung bei einem pH-Wert von 5,2 getrennt. Die Kationenaustauschsäule wurde mit 0,05 M Ammoniumacetat bei einem pH-Wert von 5,2 nach Austausch des Natriumgegenions des CM-SepharoseR CL-6B-Gels gegen Ammonium equilibriert. Obwohl das Acetonitril und die Trifluoressigsäure aus der Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) durch Dialyse, Phasentrennung oder Lyophilisierung entfernt werden können, wird bevorzugt, die organische, die FMM-Formen enthaltende Fraktion zu verdünnen. Die Fraktion wurde etwa 8-fach mit 0,05 M Ammoniumacetat (pH 5,2) verdünnt und unmittelbar auf die equilibrierte CM-SepharoseR CL-6B-Säule (2,54 cm · 14 cm) bei einer linearen Geschwindigkeit von 25 cm/h aufgegeben. Die Säule wurde danach mit etwa 2 Säulenvolumina 0,05 M Ammoniumacetat (pH 5,2) gewaschen und danach mit 0,15 M Ammoniumacetat (pH 5,2) bei einer linearen Geschwindigkeit von 9,0 cm/h eluiert. Nachdem die Fraktionen der aufgelösten FMM&sub1;- und FMM&sub2;-Monomerpeaks gewonnen worden waren, wurden festgebundene Oligomere unter Verwendung von 1,0 M Ammoniumacetatlösung (pH 6,0) mit einer linearen Geschwindigkeit von 25 cm/h eluiert. Obwohl eine Salzgradientenelution wie beispielsweise eine 0,2 M bis 0,3 M Ammoniumacetatlösung (pH 5,0) annehmbar ist, wird die Verwendung dieser isocratischen Salzelution insbesondere für die Herstellung in großem Maßstab bevorzugt.
Es wird nun auf Fig. 2B Bezug genommen. Der FMM&sub1;-Peak wird zwischen 4 und 5 Säulenvolumina eluiert, während der FMM&sub2;-Peak zwischen 5,5 und 7 Säulenvolumina eluiert wird.
Der Kationenaustausch-Chromatographie-Schritt könnte weiter modifiziert werden durch Absenken oder Erhöhen der linearen Geschwindigkeit, Verändern des pH-Wertes und/oder der Ionenstärke des Elutionsmittels, Verwendung eines anderen Puffers und Gegenions als Ammoniumacetat, beispielsweise Natriumsuccinat oder Natriumacetat, Ändern der Säulengeometrie, Betrieb bei höheren Temperaturen (bis zu 56 ºC), Anwendung einer Gradientenelution oder isocratischen Elution, Verwendung einer Ionenaustauschmatrix mit einem unterschiedlichen Liganden oder unterschiedlicher Ligandendichte wie beispielsweise CM-SepharoseR-Fast Flow, SP-SephadexR, CM-SephadexR, CM-TrisacrylR M oder SP- TrisacrylR M, oder Verwendung einer mechanisch festeren Trägermatrix als Weichgel- SepharoseR, beispielsweise CM-Fast Flow oder CM-Silica. Änderungen im vorgeschlagenen Verfahrensablauf gemäß dem Beispiel sollten natürlich eingeführt werden, um die Auflösung zwischen FMM&sub2; und den anderen Komponenten, hautsächlich FMM&sub1; zu erhöhen.

Gelfiltrations-Chromatographie

Als nächstes wurde der FMM&sub2;-Peak aus der Behandlung mit der CM-SepharoseR-Säule durch Ultrafiltration auf eine Proteinkonzentration von etwa 2 mg/ml aufkonzentriert. Die Lösung wurde auf eine 2,5 cm · 80 cm dimensionierte Gelfiltrationssäule (SephadexR G-50- Superfine) gegeben, die mit 0,05 M Succinatpuffer (pH 5,0) equilibriert worden war. Danach wurde mit einer linearen Geschwindigkeit von 3 cm/h unter Verwendung von Succinatpuffer eluiert, da er ein akzeptierter Träger für parenteral verabreichbare Arzneimittel ist.
Es wird auf Fig. 2D Bezug genommen. Die zwei aufgelösten Peaks, die nach der Behandlung mit der Säule erschienen, stellen Dimere bzw. FMM&sub2; dar. Die zu dem FMM&sub2;- Peak gehörende Lösung wurde aufgefangen und durch ein nichtbindendes Filter mit einer Porenweite von 0,22 um filtriert, wobei man ein gereinigtes Arzneimittelkonzentrat mit einer Proteinkonzentration von etwa 0,5 bis 1,0 mg/ml in 0,05 M Succinatpuffer (pH 5,0) erhielt. Es wurde beobachtet, daß das FMM&sub2; des Eluats aus der Gelfiltration auf einem mit Silber gefärbten SDS-PAGE-Gel homogen erschien.
Jede beliebige Gelfiltrationssäule könnte in diesem Schritt verwendet werden, die in dem passenden Molekulargewichtsbereich fraktioniert. Beispiele sind Gelfiltrationsmatrizen des Typs SephacrylR S-200 Superfine, SuperoseR 12, FractogelR 50 S, UltragelR ACA 54 und TSK-250. Außerdem könnte eine Ultrafiltration den Gelfiltrationsschritt ersetzen, um die Betriebsgeschwindigkeit zu erhöhen. Da es jedoch unwahrscheinlich ist, daß mittels Ultrafiltration restliche Mengen an Dimer entfernt wurden, wird die Gelfiltration bevorzugt. Letztendlich kann für jeden Verfahrensschritt die Verfahrenszeit dadurch verringert werden, daß man die Fließgeschwindigkeit erhöht.
Tabelle I gibt summarisch die wiedergefundene Menge und Ausbeute pro Reinigungsschritt für rekombinantes IFN-alpha-2-FMM&sub2;-Protein an, wobei mit der Elution mit der Antikörpersäule begonnen wird. Die insgesamt gewonnene Masse (in Prozent) beträgt 5,8%. Die gewonnene Menge, bezogen auf den FMM&sub2;-Gehalt in dem Eluat der Säule mit dem monoklonalen Antikörper beträgt 48,6%. Tabelle I Schritt Gesamtmenge Protein (mg)+) % gewonnene Menge (gesamt) (jeweiliger Schritt) Immunoaffinitäts-Chromatographie Umkehrphasen-Chromatographie Kationenaustausch-Chromatographie Konzentration Gelfiltrations-Chromatographie
Anmerkung: +) abgeschätzt anhand der optischen Dichte bei 280 nm
Als nächstes wurde ein Test auf die cytopathische Wirkung (cytopathic effect assay; CPE) durchgeführt, um die spezifische Aktivität des gereinigten FMM&sub2; zu bestimmen. Dazu kam das Verfahren von S. Rubenstein et al. zum Einsatz ["Convenient Assay for Interferons", Journal of Virology. 37, Seiten 755 - 758 (1981)]. Als erstes wurden Zellen, von denen bekannt war, daß sie gegenüber Interferon empfindlich sind, mit einer Reihenverdünnung der Probe inkubiert, deren Titer bestimmt werden sollte. Ein Testvirus (challenge virus) wurde jeder Verdünnung zugesetzt. Nach erneutem Inkubieren wurde die Verdünnung festgestellt, bei der eine 50%ige Verringerung der viralen cytopathischen Wirkung auf die Zellen erzielt wurde. Konzentrationen auf der Grundlage von Standardeinheiten wurden dadurch bestimmt, daß man den Test gleichzeitig an internationalen Standardproben durchführt, beispielsweise solchen Proben, wie sie von den National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, etabliert wurden.
Es wurde beobachtet, daß die spezifische Aktivität von FMM&sub2; etwa 2,3 · 108 Einheiten/mg Protein war, verglichen mit etwa 1,0 · 108 U/mg Protein bei nicht fraktioniertem rekombinantem alpha-IFN, das einfach durch Immunoaffinitäts-Chromatographie (d. h. LIT1/S) gereinigt worden war.

Beispiel II

In diesem Beispiel wurde die Verfahrensweise zur Klärung des Lysats vereinfacht, indem nur eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit durchgeführt wurde. Das Ergebnis war, daß das Material für die Aufgabe auf die Immunoaffinitätssäule ein trübes Lysat war. Es wurde ein Fließbettreaktor für die Immunoaffinitäts-Chromatographie verwendet, um das resultierende Lysat zu verarbeiten. Es wurde auch ein dreiteiliges isocratisches Elutionsprogramm für den RPC-Schritt eingeschlossen, da das resultierende LIT1/S-Eluat erhebliche Mengen (bis zu 35%) an Nicht-IFN-Proteinverunreinigungen enthielt, wie beispielsweise Hefeproteine. Der erste Schritt entfernte im wesentlichen die kontaminierenden Hefeproteine. Der zweite Schritt führte zur Elution der IFN-FMM-Formen für die weitere Reinigung durch Kationenaustausch-Chromatographie. Im dritten Schritt wurde die Hauptmenge an IFN-SMM-Formen, Oligomeren und Fragmenten entfernt.
Nach Behandeln über dem LIT1/S-Fließbett wurden etwa 600 mg rekombinantes IFN-alpha- 2 in der Elutionsfraktion gewonnen, was etwa 50% des rekombinanten IFN-alpha-2 in dem Rohlysat darstellt. Das LIT1/S-Eluat (7,2 Liter) wurde über eine 0,45 um-Membran filtriert und in acht Teilmengen auf eine präparative Vydac C-4-Umkehrphasensäule (Dimensionierung: 22 mm · 250 mm) gegeben. Jede Aufgabemenge wurde mit einem isocratischen Mehrschrittgradienten von Acetonitril gemäß nachfolgender Aufstellung eluiert: Zeit (min) Krümmung linear
Die FMM-Fraktion aus jedem Durchlauf, die die eluierte Menge aus der Zeit zwischen etwa 24,5 und 26,0 Minuten darstellt, wurde gesammelt. Es wurden aus dem LIT1/S-Säuleneluat 105 mg FMM gewonnen, was 92% der theoretischen Ausbeute von 115 mg darstellt. Dies wurde durch analytische RP-HPLC bestimmt.
Die FMM-Fraktion wurde mit 0,05 M Ammoniumacetatlösung (pH 5,2) auf 6% (v/v) in Acetonitril verdünnt. Die Verdünnung wurde auf eine 200 ml-Kationenaustauschsäule (CM- SepharoseR CL-6B) (Dimension: 4,4 · 14 cm) gegeben. Die Säule wurde isocratisch mit 0,14 M Ammoniumacetat (pH 5,2) eluiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 2C gezeigt. Der leichte Abfall der Molarität des Ammoniumacetatpuffers (0, 15 M auf 0, 14. M) verbesserte die Auflösung zwischen FMM&sub1; und FMM&sub2; gegenüber früheren Trennungen (vgl. Beispiel I). Die den FMM&sub2;-Peak wiedergebenden Fraktionen wurden vereinigt und auf eine Konzentration von etwa 5 mg Protein/ml unter Verwendung von Ultrafiltration aufkonzentriert. Das konzentrierte FMM&sub2; wurde auf eine SephadexR G-50 Superfine-Gelfiltrationssäule aufgegeben, um Spuren von Oligomeren zu entfernen und Ammoniumacetat gegen einen 0,05 M Succinatpuffer (pH 5,0) auszutauschen. Die Proteinkonzentration des FMM&sub2;-Eluats aus der Gelfiltrationssäule betrug etwa 1 mg/ml. Das Eluat hatte eine spezifische Aktivität von etwa 2,2 · 10&sup8; Einheiten/mg Protein.
Tabelle II gibt summarisch die wiedergewonnenen Menge und Ausbeuten pro Reinigungsschritt für FMM&sub2; an. Die Gesamtmenge an gewonnenem Produkt, bezogen auf Proteinmasse, betrug 7,3% (bezogen auf das Gesamtprotein) und etwa 50%, bezogen auf die Gesamtmenge an FMM&sub2;, das in dem Eluat der LIT1/S-Säule enthalten war. Tabelle II Schritt Gesamtmenge Protein % gewonnene Menge (gesamt) (jeweiliger Schritt) Spezifische Aktivität LIT1-monoklonaler Antikörper Umkehrphasen-Chromatographie Kationenaustausch-Chromatographie Gelfiltrations-Chromatographie
Anmerkung: +) abgeschätzt anhand der optischen Dichte bei 280 nm
Fig. 4 zeigt einen Vergleich der analytischen RP-HPLC-Proflle für jede Zwischenstufe des Reinigungsverfahrens und bestätigt die Homogenität des gereinigten, letzten Endes erhaltenen FMM&sub2;-Arzneimittelkonzentrats.

Beispiel III

Charakterisierung von FMM&sub1; und FMM&sub2;

Es wurden Proben von FMM&sub2; zur Charakterisierung entsprechend der obigen Beschreibung hergestellt. Zur Herstellung des FMM&sub1; wurden die Proben durch erneutes Chromatographieren der FMM&sub1;-Kationenaustausch-Fraktion mittels RP-HPLC und Sammeln der Fraktionen des Peaks, der FMM&sub1; entsprach, weiter gereinigt, um Reste von FMM&sub2; oder SMM zu entfernen. Bei Durchführung der Analysen nebeneinander wurde gefunden, daß die spezifische Aktivität von FMM&sub1; etwa die gleiche war wie die von FMM&sub2; (etwa 200 · 10&sup6; U/mg).

(A) Isoelektrische Fokussierung - Gelelektrophorese (IEF)

Proben wurden unter Verwendung einer Modifikation der Verfahrensweise analysiert, wie sie beschrieben ist von A. Winter ["Analytical Electrofocusing in Thin Layers of Polyacrylamide Gels", LKB Application Note 250 (1977)]. Die Proben wurden gegen 5 mM Tris-HCl (pH 8,0) diafiltriert und in einer Amicon CentriconR-Einheit konzentriert, die mit einer 10.000 MWCO-Membran ausgestattet war. Mit einer LKB (Bromma, Schweden) analytischen Elektrofokussierungseinrichtung unter Verwendung horizontaler, vorgegossener LKB AmpholineR PAG-Platten (pH 3,5 bis 9,5) wurde eine Elektrofokussierung durchgeführt. Vor der Aufbringung von etwa 10 ul jeder Probe (ungefähr 5 bis 10 ug Protein) wurde das Gel 0,5 Stunden bei 50 Watt und konstanter Stromstärke vorfokussiert. Die Elektrophorese wurde für eine Zeit von 1 bis 2 Stunden unter Kühlen oder solange durchgeführt, bis konstanter Stromfluß erreicht worden war. Die Marker für den isoelektrischen Punkt wurden von der Firma Pharmacia Fine Chemical, Inc. (Piscataway, NJ) erhalten. Das Gel wurde über Nacht bei Raumtemperatur in einer Lösung aus 30% Methanol, 3,5% Sulfosalicylsäure und 11,5 Trichloressigsäure fixiert. Das Gel wurde danach bei 60 ºC 10 Minuten unter Verwendung von 0,1% (w/v) Coomassie Brilliantblau R-250 in 8% Essigsäure in 25% Methanol gefärbt. Am Ende wurde das Gel bis zu einem klaren Hintergrund durch Diffusion in einer Lösung von 8% Essigsäure in 25% Methanol entfärbt.
Die Ergebnisse der IEF-Gelelektrophorese zeigten, daß FMM&sub1; einen pI von etwa 5,85 aufwies, während der pI-Wert von FMM&sub2; etwa 6,06 betrug.
Es wird nicht angenommen, daß der Unterschied der isoelektrischen Punkte bei FMM&sub1; und FMM&sub2; auf die Methionin-Sulfoxid-Reste zurückzuführen ist, da die Peptidkartierungen der Abbauprodukte nach Behandlung mit Cyanogenbromid der beiden Monomere nicht unterscheidbar waren.

(B) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Proben wurden in 5 mM Tris-HCl (pH 8,3) entsprechend dem Verfahren von U. K. Laemmli ["Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4", Nature (London) 227 Seiten 680 - 685 (1970)] analysiert. Eine Volumenmenge des Konzentrats, das 5 bis 10 ug Protein umfaßte, wurde mit einer Volumenmenge Probenpuffer unter Erhalt einer Endkonzentration von 0,1% SDS (w/v), sowie mit 10% Glycerin (v/v) in 10 mM Tris-HCl (pH 6,8) gemischt. Die Proben wurden danach auf 95 ºC drei Minuten lang erhitzt. Wenn reduzierte Proben erforderlich waren, wurde 2-Mercaptoethanol den Proben bis zu einer Endkonzentration von 10% (v/v) zugesetzt. Die Proben wurden in vorgebildete Vertiefungen in einem 4%igen Polyacrylamid-Stapelgel (1,0 · 18 · 0,75 cm) aufgetragen und über einem 14,5%igen Polyacrylamid-Auflösegel (16 · 18 · 0,75 cm) elektrophoretisch behandelt. Jedes der Gele enthielt 0, 1% (w/v) SDS.
Die Elektrophorese wurde bei konstantem Strom von 30 mA unter Kühlen durchgeführt, bis die Leitfarbstoff-Front (Bromphenolblau) bis zum unteren Teil des Gels gewandert war (etwa 3 Stunden). Das Gel wurde fixiert und etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 0,1% (w/v) Coomassie-Brilliantblau R-250 in Isopropanol/Essigsäure/Wasser (25 : 10 : 65) gefärbt und danach bis zum Erreichen eines klaren Hintergrunds durch Diffusion mit Methanol/Essigsäure/Wasser (5 : 10 : 85) entfärbt. Wenn es erforderlich war, die Empfindlichkeit des Färbeprozesses zu erhöhen, oder wenn die Menge des auf das Gel aufgegebenen Proteins unterhalb der Bestimmungsgrenze für eine Coomassie-Blau-Färbung lag, wurden die Gele mit einer 0,012 M Silbernitrat(AgNO&sub3;)-Lösung gefärbt, entsprechend der Verfahrensweise von C. Merril et al., ["Simplified Protein Detection and Image Enhancement Methods in Polyacrylamide Gels", Electrophoresis. 3, Seiten 17 - 23, (1982)]. Bei der SDS-PAGE- Analyse wurde gefunden, daß sowohl unter nichtreduzierenden als auch unter reduzierenden Bedingungen FMM&sub1; und FMM&sub2; nicht unterscheidbar sind. Unter nichtreduzierenden Bedingungen wanderten beide Verbindungen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 19.000 Dalton.

(C) Aminosäure-Zusammensetzung

Die Konzentration der Aminosäurereste wurde unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure zur Hydrolyse einer Menge zwischen 0,5 und 1,0 nMol einer Probe bei Standardbedingungen von etwa 100 ºC über 24 Stunden bestimmt. Die Bestimmung wurde durchgeführt entsprechend der Verfahrensweise von J. W. Eveleigh und G. D. Winter ["Amino Acid Composition Determination", Protein Sequence Determination, Seiten 91 - 95 (1970)]. Zur Bestimmung der Konzentrationen an MET- und CYS-Resten wurde eine Hydrolyse mit Perameisensäure durchgeführt. Die Analyse der Aminosäuren der resultierenden Hydrolysate erfolgte unter Verwendung eines Durram-Aminosäureanalysators, Modell D-500, wobei man Ninhydrin und die resultierende Fluoreszenz zur Bestimmung heranzog.
Insgesamt wurden jeweils 8 Proben von FMM&sub2; und FMM&sub1; analysiert. Der Mittelwert und die Standardabweichung sind in Tabelle in angegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß es in Bezug auf die Aminosäurezusammensetzung keinen signifikanten Unterschied zwischen FMM&sub1; und FMM&sub2; gibt. Tabelle III Aminosäure-Analyse (± Standardabweichung) Rest FMM&sub1; FMM&sub2; Vorausgesagt*)
Anmerkungen:
*) Nach Bestimmung der cDNA-Nucleotidsequenz des geklonten IFN-alpha-2-Gens und der mutmaßlichen Aminosäuresequenz.
**) Bestimmt durch IBA-(Iodosobenzoesäure-)Spaltung und Mapping im wesentlichen in Übereinstimmung mit der Verfahrensweise von A. Fontana, Biochemistry, 20, Seiten 6997 - 7004 (1981).

(D) N-terminale Sequenzierung von FMM&sub1; und FMM&sub2;

Etwa 0,5 bis 1,0 nMol einer S-carboxymethylierten Probe wurden in TFA gelöst und in einem 470 A-Gasphasensequencer (Firma: Applied Biosystems) unter Anwendung eines laufenden automatisierten Edman-Abbauverfahrens sequenziert [M. W. Hunkapiller und L. E. Hood, "Analysis of Phenylthiohydantoins by Ultrasensitive Gradient High Performane Liquid Chromatography", Methods in Enzymology. 91, Seiten 486 - 493, (1983)]. Die PTH- Aminosäuren wurden durch RP-HPLC auf einem Waters (Modell 6000)-Gradientensystem mit einem WISP-Autosampler und einem fixierten Wellenlängendetektor analysiert. Die Analyse der Meßdaten erfolgte unter Verwendung von Nelson Analytical-Software auf einem IBM-Computer.
Die Ergebnisse für FMM&sub2;:
Die N-terminale Sequenz von FMM&sub2; entspricht genau der Sequenz, die für das reife rekombinante alpha-2-IFN veröffentlicht wurde [D. V. Goeddel, et al., "The Structure of Eight Distinct Clone Human Leukocyte Interferon cDNAs", Nature. 290, Seiten 20 - 26 (1981)]. Ausnahme ist die Position 23, für die Goeddel einen LYS-Rest voraussagt. Die Aminosäurereste in Klammern stehen für nicht ganz sichere Ergebnisse in der Analyse.
Die Ergebnisse für FMM&sub1;: Es war nicht möglich, Sequenzdaten unter Verwendung der normalen Verfahrensweise des Edman-Abbaus zu erhalten. Es wurde daher gefolgert, daß das Protein an seinem N- terminalen Ende blockiert ist.

(E) Bestimmung der Sulfhydrylgruppen

Die Sulfhydrylgruppen in einer Reinzubereitung von FMM&sub1; und FMM&sub2; wurden unter Verwendung von Ellmann's Reagenz (5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure) (DTNB), unter Einsatz einer Modifikation der Verfahrensweise nach Habeeb gemessen [A. F. S. A. Habeeb, "Reaction of Protein Sulfhydryl Groups with Ellman's Reagent", Methods in Enzymology. 25, Seiten 457 - 464 (1972)]. 666 ul einer 6 M Gu-HCl-Lösung (pH 8,3), die 20 mM EDTA enthielt, etwa 10 nMol des Probenproteins in 327 ul 0,5 M Tris-HCL (pH 8,3; 20 mM EDTA) und 90 ul 10 mM DTNB in Wasser wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang leicht durchmischt. Es wurde die Absorption bei 412 nm unter Verwendung frisch zubereiteter Cysteinlösung (2 mM) in 20 mM EDTA (pH 8,3) als Standard gemessen. Der molare Extinktionskoeffizient unter diesen Bedingungen lag im Bereich von 13.000 bis 13.600. Dies stimmte gut mit dem publizierten Wert überein.
Die Ergebnisse sowohl für FMM&sub1; als auch für FMM&sub2; zeigen weniger als 0, 1 Mole SH pro Mol Protein. Dies bedeutet, daß sowohl FMM&sub1; als auch FMM&sub2; vollständig oxidiert waren.

(F) Analytische Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (RP-HPLC)

RP-HPLC wurde durchgeführt an einem (Waters) Binary HPLC-System, das mit einem automatischen Datencontroller (Modell 680), zwei Pumpen (Modell 510), einem LC- Spektrophotometer (Modell 481), einem Rheodyne Injektor, einem Waters Säulentemperatur- Kontrollmodul und einem Shimatzu Recorder-/Integrator ausgerüstet war.
Proben von wenigstens 20 ug wurden mit einer Vydac C-4-Umkehrphasensäule (4,6 mw · 25 cm; Teilchengröße: 5 um), die bei einer konstanten Temperatur von 40 ºC gehalten wurde, analysiert. Die Säule war mit 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser equlibriert. Eine Gradientenelution erfolgte mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min Fließgeschwindigkeit mit Acetonitril (CH&sub3;CN) in 0,1% (v/v) TFA (Lösungsmittel B) gemäß dem folgenden Programm: Zeit % B Krümmung linear
Die aus der Säule ausfließende Flüssigkeit wurde in Bezug auf ihre Absorption bei 280 nm überwacht. Unter diesen chromatographischen Bedingungen wurde beobachtet, daß FMM&sub2; und FMM&sub1; jeweils im wesentlichen als ein einzelner symmetrischer Peak mit einer Retentionszeit von 27,6 Minuten (vgl. Fig. 4, Schritt 5) bzw. 30,4 Minuten (Daten nicht gezeigt) wandern.

(G) Mapping nach tryptischem Abbau von FMM&sub1; und FMM&sub2;

TPCK-behandeltes Trypsin wurde entsprechend der Verfahrensweise von Rovery [Methods in Enzymology, Band XI, Seiten 231 - 239 (1967)] gereinigt. Etwa 2 nMol 5-carboxyamidomethylierte Probe wurden zweimal im Gewichtsverhältnis 1 : 75 des gereinigten Trypsins zu Protein (FMM&sub1; oder FMM&sub2; abgebaut. Der Abbau wurde durchgeführt in 0, 1 M NH&sub4;HCO&sub3; (pH 8,0) im Verlauf von 2 Stunden bei 37 ºC. Nach dem Abbau wurde der pH- Wert der Peptidmischung mit 2%iger TFA in Wasser auf 2,0 eingestellt. Die Peptidmischung wurde getrocknet und zweimal erneut in 0, 1%iger TFA in Wasser gelöst und wieder getrocknet. Am Ende wurde die Peptidmischung in einem bekannten Volumen einer 0,1 %igen wäßrigen TFA aufgenommen.
Es wurden Kartierungen des typischen Abbaus unter Verwendung von RP-HPLC erzeugt. Etwa 2 nMol jedes Abbauproduktes wurden getrennt auf eine Umkehrphasensäule gegeben (Vydac C-18; Teilchengröße: 5 um; Porenweite: 300 A (300 · 10&supmin;¹&sup0; m); Dimensionen der Säule: 4,6 mm · 250 mm), die mit 95% Wasser, 5% Acetonitril und 0,1% TFA equilibriert worden war. Die Peptide wurden bei 30 ºC mit einem linearen Gradienten aus 0,23% Acetonitril pro Minute von 5 bis 50% Acetonitril eluiert. Das Auftreten von Peaks bei 215 nm wurde überwacht.
Als Kontrollreagenzien ließ man die folgenden Reagenzien laufen: (a) Trypsin allein unter Anwendung derselben Bedingungen, wie sie für die Peptidmischung eingesetzt wurden; (b) nicht abgebautes FMM&sub1; oder FMM&sub2;; und (c) alkyliertes, nicht abgebautes FMM&sub1; oder FMM&sub2;.
Es wurde gefunden, daß sich die Vergleichsläufe nicht mit den Peptidkarten überlagern, wie sie in Fig. 7 wiedergegeben sind. Es wurde beobachtet, daß bestimmte Unterschiede zwischen dem FMM&sub1;-Monomer und dem FMM&sub2;-Monomer auftreten (siehe Fig. 7).

Beispiel IV

Vergleich von rekombinantem alpha-2-FMM&sub2; mit IntronR A (Firma Schering-Plough) und RoferonR A (Firma Hoffman LaRoche)

IntronR A und RoferonR A wurden von einer örtlichen Apotheke erhalten und hinsichtlich der jeweiligen Interferonzusammensetzung analysiert. Dies erfolgte unter Verwendung eines Schnelltests zur Bestimmung von rekombinantem Leukocycten-Interferon-alpha-2 in komplexen Mischungen. Der Test beruht auf der Verwendung einer Hochleistungs- Affinitätssäule mit einem monoklonalen Antikörper in Reihe mit einer Umkehrphasen- HPLC-Säule [L. Rybacek et al., "Rapid Dual-Column Chromatographic Assay for Recombinant Leukocyte Interferon Alpha-2", J. Chromatography. 397, Seiten 355 - 364 (1987)].
Nach Auffangen des Interferons aus dem Schnelltestsystem wurde entweder das HSA-freie IntronR A oder RoferonR A auf eine analytische Vydac-C-4-Säule aufgegeben (Dimensionierung: 4,6 mm · 250 mm; Teilchengröße: 5 um). Das Chromatogramm wurde mit einem schrittweisen Gradienten bis 44% Acetonitril in 0, 1% Trifluoressigsäure bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min entwickelt. Es wird Bezug auf Fig. 5A genommen. Man beobachtete, daß IntronR A als ein Peak mit einer Retentionszeit von 16,7 min eluiert wird. Eine Mischung aus rekombinantem IFN-alpha-2-FMM&sub1; und -FMM&sub2; wurde danach unter identischen Bedingungen chromatographiert. Das FMM&sub2; wurde bei einer Retentionszeit eluiert, die nahe der von IntronR A war (16,8 min), während FMM&sub1; eine Minute später bei 17,8 min (Fig. 5 B) eluiert wurde.
In einer weiteren Studie wurden Mischungen gleicher Mengen von IntronR A und rekombinantem IFN-alpha-2-FMM&sub1; und gleiche Mengen von IntronR A und rekombinantem IFN-alpha-2-FMM&sub2; wie oben beschrieben einer Umkehrphasen-Chromatrographie unterworfen. Es wird Bezug auf Fig. 5C genommen. Man fand, daß FMM&sub2; und IntronR A gleichzeitig von der Umkehrphasensäule eluiert wurden, während FMM&sub1; und IntronR A einzigartige Retentionszeiten zeigten (Fig. 5D).
In einem getrennten Experiment wurden die Umkehrphasen-Chromatogramme für RoferonR A, IntronR A und rekombinantes IFN-alpha-2-FMM&sub2; verglichen. Es wird Bezug auf Fig. 6 genommen. Die Hauptpeaks in jeder Probe hatten nahe beieinander liegende entsprechende Retentionszeiten. RoferonR A (Fig. 6 C) enthielt jedoch eine nachschleppende Schulter am Hauptpeak. Diese Ergebnisse legen nahe, daß RoferonR A heterogener ist oder daß es mehr Abbauprodukte enthält als rekombinantes Alpha-2-FMM&sub2; (Abbildung A) oder IntronR A (Abbildung B).
Es wurden auch rekombinantes IFN-alpha-2-FMM&sub2; mit IntronR A und RoferonR A unter Einsatz von isoelektrischer Fokussierung-Gelelektrophorese verglichen. Die Ergebnisse zeigen, daß rekombinantes IFN-alpha-2-FMM&sub2; die geringste Anzahl isoelektrischer Spezies hatte. IntronR A zeigte wenigstens zwei isoelektrische Formen, und RoferonR A wies wenigstens vier isoelektrische Formen auf, während FMM&sub2; nur eine Form zeigte. Auch hatte die Hauptbande von RoferonR A einen isoelektrischen Punkt, der verschieden ist von den isoelektrischen Punkten von FMM&sub2; und IntronR A. Dieser Unterschied kann auf den Unterschied in der Primärstruktur zwischen alpha-2- und alpha-A zurückgeführt werden, welcher in einem Ersatz eines Argininrestes durch Lysin in Position 23 der Polypeptidkette besteht.
In einer anderen Untersuchung wurden FMM&sub2; und IntronR A sowie RoferonR A nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese sowohl unter nichtreduzierenden als auch unter reduzierenden Bedingungen verglichen. Die Ergebnisse Wigten an, daß die Produkte in Bezug auf die Größe nicht unterscheidbar waren, mit der Ausnahme, daß IntronR A Spurenmengen von Dimeren enthielt, und RoferonR A einige nicht identifizierte Proteine mit hohem Molekulargewicht enthielt.

Beispiel V

Stabilität von gereinigtem Konzentrat von rekombinantem IFN-alpha-2-FMM&sub2;

Gereinigtes Konzentrat von rekombinantem IFN-alpha-2-FMM&sub2; (SpA 2,3 · 10&sup8; U/mg) wurde in einer Konzentration von 0,48 mg/ml in einem 0,05 M Succinatpuffer (pH 5,0) bei verschiedenen Temperaturen (-20 ºC, 4 ºC, 25 ºC und 37 ºC) vier Wochen lang gelagert. Die Mischung jedes Temperaturpunktes wurde hinsichtlich der Aktivität in dem CPE-Test und hinsichtlich des Abbaus mit SDS-PAGE bewertet. Selbst nach vier Wochen bei 37 ºC war die spezifische Aktivität unverändert und erreichte einen Mittelwert von etwa 2,5 · 10&sup5; U/mg. Außerdem führte nach sieben Wochen bei 37 ºC eine Analyse von FMM&sub2; durch SDS-PAGE auf einem mit Silber gefärbten Gel nicht zur Entdeckung von Oligomeren oder Abbauprodukten niederen Molekulargewichts in der nichtreduzierten Probe. In der reduzierten Probe ergab sich eine Spur von Material mit niedrigem Molekulargewicht.
Vorstehend wurde eine ganze Anzahl von Ausführungsformen der Erfindung vorgestellt. Es ist offensichtlich, daß die Basiskonstruktion geändert werden kann, um zu weiteren Ausführungsformen zu führen, die die Verfahrensweisen und Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung nutzen. Es ist daher erkennbar, daß der Umfang der vorliegenden Erfindung durch die anliegenden Ansprüche definiert werden soll und nicht durch die besonderen Ausführungsformen, die nur in Form von Beispielen präsentiert wurden.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung der voll oxidierten Form von schnell wanderndem Human-alpha-2-Interferon-Monomer (FMM), das im wesentlichen frei von teilweise oder vollständig reduzierten Formen von langsam wandernden Monomeren (SMM) und Oligomeren von Leukocyten-Interferon und von Nicht-Interferon-Proteinen ist, umfassend:

(a) Auftragen des ungereinigten Human-alpha-2-Interferons (IFN-alpha-2), das die voll oxidierte Form von rasch wanderndem Human-alpha-2- Interferon-Monomer enthält, auf eine Niederalkyl-Reverse Phase-Säule und Eluieren;

(b) Auftragen des Produktes aus Schritt (a) auf eine Kationenaustauschersäule und Eluieren;

(c) Auftragen des Produktes aus Schritt (b) auf eine Gelfiltrationssäule und Eluieren; und

(d) Rückgewinnen des rasch wandernden Monomers in gereinigter Form.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das IFN-alpha-2 zuerst durch Immunoaffinitäts-Chromatographie gereinigt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem IFN-alpha-2 von der Immunoaffinitäts-Säule durch einen sauren Puffer eluiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Reverse Phase-Säule eine C-4- Säule ist und das FMM mit 0,1% Trifluoressigsäure und 46% CH&sub3;CN eluiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Kationenaustauscher-Säule eine immobilisierte Carboxymethyl-Säule ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das FMM von der Gelfiltrations- Säule beginnend bei der 0,45-Fraktion des Gesamtsäulenvolumens gesammelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Reverse Phase-Chromatographie von Schritt (a) auf einer C-4-Säule, die Ionenaustauschchromatographie von Schritt (b) auf einer carboxymethylierten Säule durchgeführt wird, das Elutionsmittel von Schritt (a) Trifluoressigsäure in Acetonitril ist und das Elutionsmittel von Schritt (b) Ammoniumacetat ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Elution von Schritt (a) unter isokratischen Bedingungen durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem unterschiedliche FMMs von alpha-2- interferon auf der Grundlage von Ladung und Hydrophobizität getrennt werden.