DE3853819T2

DE3853819T2 - Virales vektorsystem zum einführen fremder dns-expressionserzeugnisse in gallinaceenvögeln.

Info

Publication number: DE3853819T2
Application number: DE3853819T
Authority: DE
Inventors: Pradip Bandyopadhyay; Sandra Martin
Original assignee: Synergen Inc
Current assignee: Amgen Boulder Inc
Priority date: 1987-03-19
Filing date: 1988-03-21
Publication date: 1995-09-21
Anticipated expiration: 2008-03-22
Also published as: EP0351418A1; JPH02502693A; AU1578788A; WO1988007088A1; DE3853819D1; EP0351418B1; EP0351418A4; ATE122720T1; AU619181B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einbringen eines Gens von Interesse in einen hühnerartigen Vogel und ein Verfahren zur Herstellung eines viralen Vektors, der ein funktionelles Gen von Interesse in einen hühnerartigen Vogel einführen kann. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor zum Exprimieren eines Gens von Interesse in einem hühnerartigen Vogel. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Herpes Virus aus Truthahn (HVT) zum Einbringen und Exprimieren von fremden Genen in hühnerartigen Vögeln und zum Induzieren von Immunität gegen Mareks-Krankheit.
Das Herpes Virus aus Truthahn, insbesondere der HVT-Stamm FC126, wird gegenwärtig in der Geflügelindustrie als Impfstoff verwendet, um Schutz gegen das onkogene, die Marek-Krankheit hervorrufende Virus (MDV) zu verleihen. Fast alle Brathähnchen sind mit HVT am Tag 1 nach dem Schlüpfen infiziert. HVT ist ein natürlich vorkommendes Virus, isoliert aus Truthahn, und ist weder für Hühner noch für Truthahn onkogen. HVT induziert normalerweise eine Virämie in Hühnern, und die Antwort gipfelt zwischen 8 und 15 Tagen nach der Inokulation. Obwohl es Hinweise dafür gibt, daß im Verlauf der Zeit eine allmähliche Abnahme in dem Titer von HVT in infizierten Vögeln erfolgt, besaßen 58 % der Hühner in einer Studie 76 Wochen nach der Impfung noch wiedergewinnbare Spiegel an HVT, wie berichtet von Phillips und Biggs, J. Natl. Cancer Inst. 49: 1367-1373, 1972.
Das Verbleiben des Virus in dem Huhn macht es sehr wahrscheinlich, daß Produkte von exogenen Genen, die während der Infektion exprimiert werden könnten, ebenfalls dem Wirt für eine lange Zeitspanne verfügbar wären, möglicherweise über die Lebensdauer der Brathähnchen hinaus. Somit legen zwei Gründe die Verwendung von HVT als einen viralen Vektor nahe. Erstens, HVT ist bereits weit verbreitet innerhalb der Industrie, um gegen Mareks-Krankheit zu schützen. Zweitens, HVT stellt ein vernünftiges Mittel bereit zum Erzielen einer kontinuierlichen Versorgung mit einem nicht-viralen Genprodukt in Geflügel.
WO 87/04463 offenbart ein Verfahren, das die Verabreichung von hybridem Herpes Virus eines nicht-Primaten an einen tierischen Wirt umfaßt, worin dieses Virus eine Fremd-DNA-Sequenz umfaßt, die an die Expression in dem Wirt angepaßt ist. In Beispiel 15 ist die Herstellung eines hybriden HVT offenbart durch Einfügen des β-Gal-Gens unter der Kontrolle des PRV-gpX-Promotors in die XhoI-Stelle in BamHI#16 (einzigartiger, langer Bereich von HVT).
Roizman & Jenkins (Science, Band 229, Seiten 1208 bis 1214 (1985)) stellen einen Übersichtsartikel bereit, der Verfahren zum gentechnischen Manipulieren von großen DNA-Viren betrifft, wobei unter anderem die allgemeine genomische Organisation des HSV-1-Genoms (Figur 1) und bestimmte Stellen offenbart werden, von denen gezeigt worden ist, daß sie für das Wachstum und die Zellkultur nicht wesentlich sind, einschließlich "verschiedene Anteile der Domäne des TK-Gens".
Cebrian et al. (PNAS, Band 79, Seiten 555 bis 558 (1982)) offenbaren einen Vergleich zwischen dem Marek-Krankheit-Virus und dem Herpes Virus aus Truthahn, die biologisch ähnlich sind zu Herpes Viren der Gruppe, umfassend Epstein-Barr-Virus, H. saimiri, H. ateles. Jedoch ist hinsichtlich der genomischen Struktur von Marek-Krankheit-Virus und dem Herpes Virus aus
Truthahn gezeigt worden, daß sie "inverted repeats" enthalten, und daß sie somit Herpes Viren der Subfamilie der Alpha-Herpes- Virinae ähneln, wobei diese Subfamilie Herpes simplex-Virus (HSV) umfaßt.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, virale Vektoren bereitzustellen, die als Impfstoff gegen Mareks-Krankheit dienen können, und die auch zum Einbringen eines funktionellen Gens von Interesse (GOI) in einen hühnerartigen Vogel dienen können. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstellung dieser viralen Vektoren bereitzustellen.
Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in Teilen der vorliegenden Beschreibung ausgeführt, oder sie können bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung erkannt werden. Die Aufgaben und Vorteile können erkannt und erzielt werden mit Hilfe der Angaben, wie sie insbesondere in den angefügten Ansprüchen ausgeführt werden.
Zum Lösen der Aufgaben in Übereinstimmung mit dem Zweck der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Einbringen eines Gens von Interesse in einen hühnerartigen Vogel offenbart.
Dieses Verfahren umfaßt das Einfügen des Gens von Interesse in eine Stelle in einer nicht-essentiellen Region eines Herpes Virus aus Truthan (HVT), das in hühnerartigen Vögeln nicht onkogen ist, und das als Impfstoff gegen Mareks-Krankheit verwendet werden kann. Der so hergestellte virale Vektor wird verwendet zum Infizieren eines hühnerartigen Vogels, wobei dies die Expression des Gens von Interesse verursacht.
Zwei Verfahren, das Rückwärts(backwards)- und Vorwärts-(forwards)-Verfahren, zum Herstellen dieser viralen Vektoren werden offenbart. Bei dem Vorwärtsverfahren wird ein viraler Vektor, der ein funktionelles Gen von Interesse in einen hühnerartigen Vogel einbringen kann, erzeugt durch:
a) Lokalisieren einer Stelle in einer nicht-essentiellen Region in dem Genom eines Herpes Virus aus Truthahn (HVT), wobei die nicht-essentielle Stelle lokalisiert ist in dem 6,25 kb SalI-Fragment, gezeigt in Figur 1;
b) Einfügen des Gens von Interesse in diese Stelle in der nicht-essentiellen Region des viralen Genoms, um einen viralen Vektor zu erzeugen.
Das Rückwärtsverfahren für die Erzeugung eines viralen Vektors, der ein funktionelles Gen von Interesse in einen hühnerartigen Vogel einführen kann, umfaßt:
a) Identifizieren eines lebenden Herpes Virus aus Truthahn (HVT), das einen genomischen Defekt aufweist, der sich in einem identifizierbaren Phänotyp manifestiert; und
b) Einfügen des Gens von Interesse, gekoppelt an eine DNA- Sequenz, die den viralen Defekt reparieren kann, in eine Stelle in dem 6,25 kb SalI-Fragment des Virus, gezeigt in Figur 1, um einen viralen Vektor zu erzeugen.
Selbstverständlich ist die folgende ausführliche Beschreibung der vorhergehenden allgemeinen Beschreibung nur beispielhaft und erläuternd, und nicht beschränkend für die beanspruchte Erfindung. Die beigefügten Zeichnungen, die in die Beschreibung eingefügt sind und einen Teil dieser Beschreibung darstellen, erläutern eine erfindungsgemäße Ausführungsform und dienen zusammen mit der Beschreibung zur Erläuterung des Prinzips der Erfindung.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1: Physikalische Karte der Region der DNA, die HVT-TK kodiert. Die Lage der SalI-Restriktionsendonuklease-Spaltstellen für den Phagenklon EMBL3 E11 sind angegeben. Die Fragmente sind ungefähr im richtigen Größenverhältnis angegeben, wobei die Gesamtlänge des Inserts ungefähr 21 Kilobasenpaare beträgt. Die zwei Endstellen stammen aus dem Vektor und nicht aus dem HVT-DNA-Insert. Das 6,25 kb SalI-Fragment ist vergrößert dargestellt, um die Lage der kan-Insertionen darzustellen, die in viraler DNA aufgefunden wurden. Insertionen an den Stellen 1 bis 4 können aufgefunden werden folgend der Selektion von HVT, das in der Anwesenheit von AraT wächst (Vorwärtsselektion). Insertionen an den Stellen 5 bis 9 werden gefunden folgend auf das Beheben des AraT-Wachstumsdefekts (Rückwartsselektion). Die genauen Lagen der Stellen 1 bis 6 sind aus DNA-Sequenzdaten bekannt, die Lagen der Stellen 7 bis 9 stammen aus Restriktionskartierung. Die Stellen sind wie folgt: 1. HpaI, 2. XbaI, 3, SspI, 4. SspI, 5. SspI, 6. SspI, 7. ClaI, 8. NsiI, 9. SnaBI. Die Region, für die eine DNA-Sequenz angegeben wird (Figur 3), ist angezeigt, und die vergrößerte Region zeigt die Lage von zwei offenen Leserastern. ORF 1 ist vermutlich der HVT-Thymidinkinaselocus, der in dieser Anmeldung auch als Locus X bezeichnet wird.
Figur 2: Die Region aus 11A, die die AraT-Resistenz trägt, ist vermutlich TK. Das 6,25 kb SalI-Fragment aus 11A ist gezeigt mit einer asymmetrischen EcoR1-Stelle, die es in 2,0 und 4,25 kb-Segmente unterteilt. Oben angegeben ist das Segment der DNA, das erforderlich ist zum Wiederherstellen des Wildtyp-Phänotyps gegenüber ATRº. Unten sind die Endpunkte der verschiedenen EMBL3-Klone gezeigt, die alle einen Teil von 11A und die Region von DNA enthalten, die in einer Reihe von Deletionsmutanten verbleibt, die wir in dem ursprünglichen 11A-Subklon eingeführt haben.
Figur 3: DNA-Sequenz von 2720 Basenpaaren in der Region, die HVT-TK kodiert. Klone von den großen und kleinen EcoR1-SalISubfragmenten wurden in dem Bakteriophagen M13 erzeugt. In dem kleinen Fragment, 2026 Basenpaare, wurde die DNA-Sequenz von beiden Strängen ermittelt durch Klonieren des Fragments in beiden Orientierungen in M13mp18, dann Erzeugen einer Serie von Deletionen, ausgehend von der Sequenzierprimerstelle unter Verwendung des Verfahrens von Henikoff (Gene 28, 351 bis 359, 1984). 3' von der EcoRI-Stelle (Figur 1) ist eine DNA-Sequenz erhalten worden unter Verwendung einer Reihe von Primern, um entlang einem M13mp18-Subklon des hte 4,25 kb EcoRI-SalI- Subfragments, beschrieben in Figur 2, zu wandern. Die Sequenz ist ermittelt worden unter Verwendung der Dideoxy-Methode (Sanger et al., J. Mol. Biol. 143, 161 bis 178, 1980).

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Im folgenden wird auf die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung Bezug genommen. Wie oben ausgeführt, betrifft die Erfindung die Verwendung der beschriebenen viralen Vektoren in sämtlichen hühnerartigen Vögeln. Jedoch wird zum Zwecke der vorliegenden Diskussion auf Hühner Bezug genommen als ein Beispiel für hühnerartige Vögel. Weiterhin, während HVT hierin ausführlich als die gegenwärtig bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform beschrieben wird, ist die Verwendung von anderen Viren als Vektoren ebenfalls denkbar. Diese anderen Viren umfassen Viren (1), die in den hühnerartigen Vogelwirten nicht onkogen sind; (2) die mindestens eine "nicht-essentielle" Stelle enthalten, in die Fremd-DNA eingefügt werden kann; und (3), die als ein Impfstoff gegen Mareks-Krankheit verwendet werden können. Somit umfassen die von der vorliegenden Erfindung umfaßten Viren, ohne auf HVT beschränkt zu sein, beliebige weitere Viren, die einen Schutz gegenüber Mareks-Krankheit verleihen können, wie Mareks-Krankheit-Virus (MDV) Serotyp 2 oder MDV-Serotyp 1, abgeschwächt.
Vor einer ausführlichen Diskussion dieser Erfindung werden Definitionen für bestimmte, in der Diskussion verwendete Begriffe gegeben. "Nicht-essentiell" bezieht sich auf einen Teil des viralen Genoms, der nicht notwendig ist für die Virusvermehrung. "Fremd-DNA" bedeutet eine DNA, die für ein Gen kodiert, das in dem viralen Vektor natürlicherweise nicht aufgefunden wird.
HVT enthält ein DNA-Genom von ungefähr 180 Kilobasenpaaren (180 kbp) und besitzt das Potential zum Tragen einer Vielzahl von bereitzustellenden rekombinanten Genen. Im allgemeinen müssen die Fremdgene in Regionen des viralen Genoms eingefügt werden, die nicht-essentiell für das virale Wachstum sind, um die Fremdgene in einem viralen Vektor zu exprimieren und sicherzustellen, daß das Virus weiterhin wächst. Der Locus X, der in der Karte in einem Teil des HVT-viralen Genoms in Figur 1 gezeigt ist, wurde als eine solche Region ausgewählt, da von ihm gefunden wurde, daß er nicht-essentiell ist für das Viruswachstum. Während die vorliegenden Erfinder glauben, daß der Locus X der Thymidinkinaselocus ist, ist dies bisher noch nicht abschließend bewiesen worden. Jedoch wird zum Zwecke der Diskussion hierin der Locus X, gezeigt in Figur 1, als der Thymidinkinase (TK)-Locus bezeichnet.
Weitere Möglichkeiten umfassen einige der verschiedenen Glykoproteingene, von denen angenommen wird, daß sie nicht-essentiell sind, da von analogen Proteinen gefunden worden ist, daß sie nicht-essentiell in den Herpes simplex- und Pseudorabies- Viren sind, und insbesondere wird von dem HVT-Protein A angenommen, daß es nicht essentiell für das Wachstum und für den Schutz gegen Mareks-Krankheit ist. Weiterhin wäre der Thymidinkinaselocus (TK), falls er verschieden ist von Locus X, ebenfalls eine brauchbare Insertionsstelle, da von TK gezeigt worden ist, daß es nicht-essentiell ist in anderen großen DNA- Viren, einschließlich Herpes simplex-, Pseudorabies- und Vaccinia-Viren.
Verschiedene Fremd-DNA-Moleküle, im folgenden auch als "Gene von Interesse" oder "GOI" bezeichnet, kommen ebenfalls zum Einfügen in den viralen Vektor in Betracht. Zum Beispiel können Antigene in den Vektor eingefügt und verwendet werden zum Induzieren von Immunität gegen andere Geflügelkrankheiten. Diese Antigene umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Antigene aus anderen Viren, Coccidia-Antigene und und Paramyosin, ein Muskelprotein, das allen Invertebratparasiten gemein ist, insbesondere Shistosomen. Weiterhin sind Analoga von Somatostatin zur Verwendung vorgeschlagen worden, um die Wachstumsgeschwindigkeit des Geflügels zu steigern. Weiterhin können Hormone, wie Wachstumspromotoren und Immunregulatoren, die das Wachstum stimulieren oder einen Schutz gegen Krankheit verleihen können, verwendet werden.
Assays für die in vivo- und in vitro-Expression der Gene von Interesse kommen auch in Betracht. Diese umfassen Radioimmuno- Assays (RIAs) oder Enzym-gekoppelte Immunadsorptions-Assays (ELISAs), die verwendet werden zum Nachweis von Fremdprotein in kultivierten Zellen, wie auch in Hühnerserum. Auch umfaßt sind Tests auf in vivo-IgA- und IgG-Antikörperspiegel gegen Fremdproteine.
Zwei allgemeine Schemen kommen in Betracht für die Herstellung der erfindungsgemäßen viralen Vektoren. Das erste, im folgenden bezeichnet als "Vorwärts"-Schema, umfaßt das Einfügen eines GOI in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms. Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird dieses Verfahren verwendet zum Einfügen eines GOI in die TK-Region des Genoms. Dies führt zu einem viralen Vektor, der einen AraT- resistenten Phänotyp zeigt.
Bei einem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren, im folgenden bezeichnet als "Rückwärts"-Verfahren, wird ein Virus, das lebensfähig ist, aber einen genomischen Defekt aufweist, der sich in einer identifizierbaren Weise manifestiert, verwendet. Das GOI, das in dieses defekte oder "verkrüppelte" Virus eingebracht wird, ist an eine DNA-Sequenz gekoppelt, die den viralen Defekt reparieren kann. Zum Beispiel ist in einem Virus, das eine defekte TK-Region besitzt und deshalb AraT-Resistenz zeigt, das GOI gekoppelt an eine DNA-Sequenz, die TK wiederherstellen kann. Somit führt die erneute Herstellung von TK zu AraT-Sensitivität und zeigt das Einführen des GOI in den viralen Vektor an. Es sollte angemerkt werden, daß Viren mit Defekten in dem TK-Gen im allgemeinen langsamer wachsen als das Wildtyp-Virus. Somit führt eine erfolgreiche Wiederherstellung von TK zu einem viralen Vektor, der einen Wachstumsvorteil gegenüber dem Mutantenstamm aufweist.
Obwohl HVT vielfach verwendet worden ist als ein Impfstoff gegen Mareks-Krankheit seit 1972, war HVT tatsächlich auf der molekularen und genetischen Ebene vor der vorliegenden Erfindung nicht wirklich charakterisiert. Somit mußten viele Mittel und Techniken als Voraussetzung für die Herstellung eines rekombinanten HVT, das ein Fremdgen exprimieren könnte, entwickelt werden. Diese umfassen Vermehren von HVT, Herstellen von viraler DNA, Herstellen von klonierten DNA-Banken des HVT- Genoms, Herstellen von infektiöser, viraler DNA für die Transfektionen und Entwicklung eines Selektionsmittels zur Verwendung bei der Identifizierung der gewünschten viralen Rekombinanten. Ein Erfolg auf jedem dieser Gebiete hat die Erfinder in die Lage versetzt, Regionen in der viralen HVT-DNA zu definieren, in denen die Insertion von Fremd-DNA die ursprüngliche Funktion von HVT nicht beeinträchtigt. Die Verfahren und Mittel, die verwendet wurden zum Entwickeln einer jeden dieser Voraussetzungen, sind unten kurz beschrieben. Diese Verfahren und Mittel können unter Anwendung der dem Fachmann aus dem Stand der Technik geläufigen Verfahren angepaßt werden im Lichte der hierin enthaltenen Lehre, um die notwendigen Mittel zu entwickeln zur Entwicklung der weiteren viralen Vektoren, die von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der erfindungsgemäßen Lehre und beschränken den Umfang nicht. Verschiedene weitere Modifikationen und Äquivalente der Beispiele werden dem Fachmann leicht ersichtlich, insbesondere nach der Herausgabe des vorliegenden Patents, ohne sich vom Geiste der Erfindung zu entfernen.

Beispiele

Beispiel 1

Molekulare und genetische Charakterisierung von HVT und Definition der TK-Region

Primärkulturen von Hühnerembryofibroblasten (CEF) wurden hergestellt gemäß dem Verfahren, wie beschrieben in Culture of Animal Cells von Freshney, R.I. (Alan R. Liss Inc., New York, 1983), das hierin per Bezugnahme eingebaut ist, und diese wurden in Medium M199, ergänzt mit fötalem Rinderserum, kultiviert. Die Zellen wurden dann infiziert mit Herpes Virus aus Truthahn (HVT), Stamm FC126, der in der Industrie verwendet wird zum Impfen von Geflügel gegen Mareks-Krankheit. FC126 kann bezogen werden von Salsbury Labs, Charles City, Iowa. Wenn die Zellen eine Zytopathie von ungefähr 70 % zeigten, wurden sie geerntet, und DNA mit hohem Molekulargewicht wurde isoliert gemäß den Verfahren wie beschrieben von Maniatis et al. in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor, New York), das insbesondere per Bezugnahme hierin eingebaut wird. HVT-DNA repräsentierte ungefähr 1 bis 10 % der gesamten DNA der infizierten Zellen.
Diese HVT-DNA wurde partiell verdaut mit Restriktionsendonuklease Sau3AI, und DNA-Fragmente in dem Bereich von 15 bis 20 x 10³ Basenpaare Länge wurden isoliert gemäß dem Verfahren, beschrieben von Maniatis et al., siehe oben. Die größenselektionierten DNA-Fragmente wurden in Bakteriophagen-Lambdavektoren EMBL3 ligiert, der zuvor verdaut worden war mit der Restriktionsendonuklease BamHI. Die ligierte DNA wurde in vitro verpackt, unter Verwendung von gewerblich erhältlichen Verpackungsextrakten, erhalten von Vector Kloning Systems (San Diego, California) gemäß den Herstellerangaben.
Die verpackte DNA wurde zum Infizieren von dem bakteriellen Stamm Q359 verwendet, der dann auf LB-Agar ausplattiert wurde. Aus den erhaltenen Plaques erhaltene DNA wurde auf Nitrozellulosefilter übertragen und mit ³²P-markierter HVT-DNA hybridisiert (³²P-markierte HVT-DNA wurde erhalten durch Nick- Translation von elektrophoretisch gereinigter HVT-DNA in der Anwesenheit von Alpha ³²PdCTP gemäß den Verfahren wie beschrieben von Maniatis et al., siehe oben). Positive Plaques in der Hybridisierung wurden abgenommen. Sie bilden die rekombinante HVT-DNA-Bank, die in den folgenden Experimenten verwendet wurde. Die rekombinante HVT-DNA-Bank besteht aus überlappenden Sequenzen von HVT-DNA in dem Bakteriophagen-Lambda.
DNA mit hohem Molekulargewicht, isoliert aus mit HVT infizierten CEF, wurde verwendet zum Transfektieren nicht-infizierter CEF unter Verwendung der Calciumphosphat-Präzipitationstechnik, wie beschrieben von Graham, F.L. und Van der Eb, A.J., Virology
52: 456 bis 467 (1973), das hierin per Bezugnahme eingebaut ist. Infektiöses Virus wurde vier bis fünf Tage nach der Transfektion gewonnen.

1. Identifizierung des HVT-TK-Gens

Das Einfügen von Fremd-DNA in das HVT-Genom hängt ab von dem relativ seltenen Vorgang der homologen Rekombination zwischen infektiöser viraler DNA und einem Plasmid, das das Gen von Interesse trägt, eingebettet zwischen HVT-Sequenzen, und folgend auf die Co-Transfektion der zwei DNAs. Somit mußte ein Verfahren entwickelt werden, welches erlaubt, zwischen der eingebrachten infektiösen DNA und den gewünschten Rekombinanten in der unvermeidbaren gemischten Population an Plaques, die aus der Co-Transfektion resultiert, zu unterscheiden.

2. Locus-X-AraT-resistente Variante von TK&supmin;

a. Selektion einer AraT-resistenten Variante von HVT

Es wurde gezeigt, daß mit HVT infizierte CEF in signifikanter Weise mehr ¹²&sup5;J-Desoxycytidin (¹²&sup5;JDC) in DNA einbauen als Mockinfizierte Zellen (Tabelle 1). In HSV-infizierten Zellen wird ¹²&sup5;JDC nur in DNA eingebaut, nachdem es durch die virale TK phosphoryliert worden ist, wie beschrieben von Summers and Summers, J. Virol. 24: 314 bis 318 (1977), das hierin per Bezugnahme eingebaut wird. Weiterhin wird das Wachstum von HVT in CEF gehemmt durch den Wirkstoff AraT, wohingegen nicht-infizierte CEF unbeeinflußbar zu sein scheint. AraT (1-Beta-D- arabinofuranosylthymin, erhalten von Calbiochem) ist lethal für Zellen, sobald es einmal in die DNA eingebaut ist, wo es den Kettenabbruch bewirkt. Wiederum in Analogie zu HSV beruht die AraT-Resistenz vermutlich auf Mutationen in dem Thymidinkinasegen. Tabelle 1 MOI cpm/mg Protein CEF, nicht-infiziert Vero, nicht-infiziert *
12-Loch-Platten wurden 3 Stunden vor der Infektion mit Zellen angeimpft. Die Zellen wurden infiziert mit verschiedenen Stärken (multiplicities) der Infektion (MOI). ¹²&sup5;J-Joddesoxycytidin wurde dem Medium 2 Stunden nach der Infektion zugesetzt in Konzentrationen von 5 x 10&sup5; cpm/ml. Die Markierungsphase betrug 16 Stunden.
Die Zellen wurden geerntet durch Präzipitation auf den Platten mit kalter 5 %-TCA (Trichloressigsäure). Die Löcher wurden dreimal mit 5 %-TCA gewaschen. Das Zellmaterial wurde hydrolysiert in 0,5 N NaOH, dann wurden Aliquots entnommen zum Auszählen und zur Proteinbestimmung.
* Vero-Zellen, infiziert mit HSV-1, werden als Vergleich aufgeführt.
Die Sensitivität von Wildtyp-HVT gegenüber AraT legt nahe, daß es machbar sein könnte, den TK-Locus in HVT durch Selektion einer AraT-resistenten Variante zu identifizieren.

3. Isolierung von AraT-resistentem HVT

AraT-resistente Varianten treten spontan in Populationen von FC126 auf, und sie werden isoliert durch Kultivieren von zellfreiem Virus, wie beschrieben von Calnek et al., Avian Dis. 16: 52 bis 56 (1972), das hierin per Bezugnahme eingebaut wird, in CEF in der Anwesenheit von 100 ug/ml AraT. Insbesondere werden 150 mm Gewebekulturplatten beimpft mit 2 x 10&sup7; Zellen von sekundären CEF. Zwei Stunden später wird das Medium entfernt, und 2 x 10 &sup4; pfu von zellfreiem HVT werden für 30 Minuten adsorbiert. Nach der Adsorption werden 30 ml Medium, enthaltend 100 ug/ml AraT, zugesetzt. Die Flüssigkeit der Zellen wird alle zwei Tage gewechselt, immer mit AraT, und Monolayer werden abgesucht nach Plaques 4 bis 5 Tage nach der Infektion mit einer 40-fachen Vergrößerung unter Verwendung eines umgekehrten Mikroskops. Eine AraT-resistente Variante ATRº wurde gefunden in ursprünglich abgesuchten 2 x 10&sup5; pfu. Anschließende Experimente ergaben AraT-resistente HVT mit mindestens dieser Häufigkeit. ATRº verbleibt stabil für mindestens neun Passagen in der Abwesenheit von AraT. Tabelle 2 Einbau von ¹²&sup5;J-Desoxycytidin (¹²&sup5;JdC) in CEF-Zellen, infiziert mit Wildtyp oder ATRº-HVT cpm/mg Protein Mock-infiziert Wildtyp HVT ATRº-HVT
ATRº kann ebenfalls nicht ¹²&sup5;JdC in DNA einbauen (Tabelle 2), wie es für einen TK&supmin;-Virus erwartet wird.
Die Fähigkeit von ATRº, in Kultur in der Anwesenheit von FMAU (1-(2-Fluor-2-beta-D-arabinofuranosyl)-5-methyluracil) zu wachsen, ist untersucht worden. Diese Verbindung wird üblicherweise als ein Anti-Herpes-Virusmittel verwendet und ist bekannt dafür, spezifisch für virale TK in dem Falle von HSV zu sein. Von einer TK&supmin;-Rekombinante wurde erwartet, daß sie in der Anwesenheit dieses Wirkstoffs wächst, während der Wirkstoff das Wachstum von Wildtyp-HVT hemmen würde. ATRº wächst in FMAU, aber schlechter als Wildtyp-HVT in der Abwesenheit des Wirkstoffs (Tabelle 3). Auch wächst ATRº langsamer als das Wildtyp- Virus in der Abwesenheit von AraT oder FMAU. Die verringerte Wachstumsrate und die Virusausbeute von ATRº machten es entscheidend für die Bestimmung der Fähigkeit von ARTº, Hühner gegen Mareks-Krankheit zu schützen. Ein begrenztes Tierexperiment wurde durchgeführt, dessen Ergebnisse in Tabelle 4 gezeigt werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß ATRº Hühner gegen Mareks- Krankheit schützt. Somit schien es sinnvoll zu sein, die Region an DNA, die AraT-Resistenz verleiht (Locus X, vermutlich TK), als eine Stelle zu verfolgen, an der Fremd-DNA eingefügt werden kann. Tabelle 3 Assay des Wildtyp-HVT und ATRº auf Hühnernierenzellen* Virus FMAU Foci
* Zellfreies Virus wurde auf Hühnernierenzellen geimpft in der Anwesenheit oder Abwesenheit von FMAU. Agar wurde überschichtet einen Tag nach der Infektion und Plaques wurden fünf Tage nach der Infektion gezählt. Tabelle 4 Assay mit ATRº in Hühnern zum Schutz gegen Mareks-Krankheit Anzahl der Vögel mit Mareks-Krankheit 9 Wochen nach der Konfronation Impfstoff¹ Konfrontation² Anzahl Vögel HVT-Viraemie Verstorben Überlebende mit Läsionen Gesamt Mareks % Kein Wiltyp ATRº
¹ Genetisch empfänglich, Pathogen-frei, P2-Hühner wurden geimpft durch subcutane Injektion mit infizierten CEF. Das Wildtyp- (Stamm FC126)-Inokulum hatte 238 pfu/Dosis, und das ATRº-Inokulum hatte 3400 pfu/Dosis.
² 10 Tage nach der Impfung wurden konfrontierte Hühner in eine getrennte Isolationseinheit überführt und erhielten eine intraabdominale Injektion von 500 pfu von Zell-assoziiertem Virusstamm JM-10 (virulente Mareks-Krankheit).
³ nicht durchgeführt
&sup4; Signifikanter Schutz (p 0,001, Chi-Quadrat-Test)
Mehrere, weitere AraT-resistente Mutanten von HVT wurden anschließend isoliert. Drei davon, die getestet worden sind, konnten ebenfalls ¹²&sup5;JdC nicht in DNA einbauen. Diese AraT- resistenten Mutanten, wie ATRº, schienen langsamer zu wachsen als der Wildtyp HVT. Die Plaques sind klein und ergeben übereinstimmend geringere Titer.

4. Identifizierung der DNA-Region. die den AraT-resistenten Phänotyp kodiert

Sämtliche der AraT-resistenten Mutanten wurden charakterisiert aufgrund ihrer Fähigkeit, Plaques in der Anwesenheit von AraT (das vollständig die Plaque-bildende Fähigkeit des Wildtyp-HVT hemmt) auszubilden, und aufgrund ihrer Unfähigkeit, ¹²&sup5;J- Desoxycydidin (¹²&sup5;JdC) in DNA einzubauen. Weiterhin besitzt Wildtyp-HVT einen Wachstumsvorteil gegenüber den AraT- resistenten Varianten. Diese Unterschiede zwischen dem Wildtyp- HVT und HVT, das AraT-resistent ist, bilden die Grundlage für einen Marker-Rescue-Assay, der die Identifizierung der Region der DNA, und somit des Gens, erlaubt, die Resistenz gegenüber AraT verleiht. DNA aus dem AraT-resistenten HVT (10 ug der gesamten DNA der infizierten Zellen) wird co-transfektiert mit einzelnen DNA-Klonen (200 ng Plasmid-DNA oder 1 ug Phagen-DNA), die das Genom von HVT repräsentieren. Zwei Tage nach der DNA- Transfektion werden die Zellen von einem Medium mit 5 % Serum auf ein Medium mit 2 % Serum überführt. Am Tag 5 werden die transfektierten Zellen aufgeteilt von ihren 60 mm-Platten auf 100 mm-Platten, und 1 x 10&sup6; frische, sekundäre CEF werden zugesetzt. An Tag 8 werden die Monolayer unter dem Mikroskop nach Plaques abgesucht und, falls vorhanden, wird zellfreies Virus hergestellt. 0,2 ml des zellfreien Virus wird an frische Monolayer von CEF auf 60 mm-Platten adsorbiert. 40 bis 45 Stunden nach der Infektion wird das Medium ersetzt mit 2 ml 2 %-Serum in M199 (Gibco), enthaltend 1,36 uCi/ml ¹²&sup5;JdC (Amersham). Nach 24 Stunden in der Anwesenheit von ¹²&sup5;JdC werden die Zellen und Plaques in 50 % Methanol fixiert und mit 0,4 % Kristallviolett in 50 % Methanol angefärbt. Die Platten wurden getrocknet und dann autoradiographiert. DNA aus den Klonen, enthaltend die Wildtyp-Version der AraT-Resistenz- Region, Rekombinieren mit der infektiösen viralen AraTR-DNA, und die resultierenden Viren erlangen wieder das Wildtyp- Wachstum, einschließlich der Fähigkeit, ¹²&sup5;JdC in DNA einzubauen, und eine Sensitivität gegenüber AraT.
Die Ergebnisse dieses Assays, wie in Tabelle 5 ausgeführt, identifizierten unzweifelhaft ein 6,3 kb SalI-Fragment aus dem EMBL3-Klon 11 als das Stück DNA, das in den AraT-resistenten Mutanten verändert ist. Deletionenen in diesem Stück DNA haben die Lage der Mutation weiterhin auf eine 1000-Basenpaar-Region der DNA in diesem Fragment charakterisiert (Figur 2). Tabelle 5 Marker-Rescue von ATRº durch verschiedene DNAs ¹²&sup5;JdC-Einbau in Plaques
¹ Diese Klone repräsentieren kartierte HVT-DNA. Die positiven Phagenklone haben eine DNA-Region gemeinsam, wie in Figur 2 gezeigt.
² Sämtliche der Plasmide enthalten Deletionen in 11A, wie in der Karte in Figur 2 gezeigt.

5. Die DNA-Seauenz

Die DNA-Sequenz von 2720 Nukleotiden ist ermittelt worden unter Verwendung von dem standardmäßigen Didesoxysequenzierverfahren (Figur 3). Die bekannte Sequenz umfaßt das 2 kb SalI bis EcoRI- Fragment (Figur 1) und setzt sich fort in weiteren 69 Nukleotiden auf der rechten Seite der EcoRI-Stelle. Die Analyse dieser Sequenz unter Verwendung von Programmen, die bezogen wurden von International Biotechnologies, Inc., zeigen zwei lange offene Leseraster, von denen der am weitesten rechts gelegene (ORF 1, Figur 1) eine Konservierung zwischen der erhaltenen Proteinsequenz und HSV, wie auch anderen Thymidinkinasegenen zeigt. Unter Verwendung ähnlicher Suchparameter wird weder Homologie zwischen ORF 2 (der am weitesten links gelegene ORF, Figur 1) und HSV-TK oder anderen viralen TK-Genen nachgewiesen, noch gibt es eine nachweisbare Homologie zwischen ORF 1 und ORF 2 in der HVT-Sequenz. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz von ORF 2 besitzt jedoch signifikante Homologie zu einer vorhergesagten Proteinsequenz, die in der analogen Region von HSV-2-DNA gefunden wird. Die Funktion dieses HSV-Proteins ist unbekannt, obwohl Mutationen in dieser Region verringerte Virusausbeuten aus HSV-1-infizierten Zellen verursachen. Basierend auf den DNA-Sequenzhomologien und den genetischen Daten, die die AraT- Resistenz und die den ¹²&sup5;JdC-Einbau verleihenden Sequenzen in der gleichen Region lokalisieren, erwarten wir, daß ORF 1 das Thymidinkinasegen von HVT ist.

Beispiel 2

Einfügen von Fremd-DNA in HVT unter Verwendung des "Vorwärts"- Selektionsprotokolls

Das 1,3 kb Kanamycingen (Kan) von TN 903 aus pUC4K (erhalten von Pharmacia) wurde in 4 Restriktionsendonukleasespaltstellen eingefügt, die innerhalb des offenen TK-Leserasters liegen. Diese Plasmide wurden einzeln co-transfektiert in CEF mit infektiöser Wildtyp-HVT-DNA. Kulturen wurden zur Vermehrung einmal passagiert, dann wurde zellfreies Virus auf frischen CEF adsorbiert, und AraT wurde dem Medium zugesetzt, folgend auf die Adsorption. Plaques, die in der Anwesenheit von AraT wuchsen, wurden gereinigt und vermehrt, und virale DNA wurde analysiert für das Einfügen von Kan in HVT. Insertionen an den vier Stellen, an HpaI, XbaI und zwei SspI-Stellen (1 bis 4 in Figur 1), ergaben AraT-resistentes HVT. Dies zeigt, daß es möglich ist, Fremd-DNA in diese Region des HVT-Genoms unter Verwendung von AraT-Resistenz als Selektion einzubringen, und gereinigte Mutanten, die bis zum heutigen Tage isoliert worden sind, zeigen ein schlechteres Wachstum als der Wildtyp. Im Falle der Insertionen an den HpaI, XbaI und der nächsten der zwei SspI-Stellen (1 bis 3 in Figur 1) wird angenommen, daß die Kan-Insertionen ein anderes Gen zusätzlich zu TK (ORF2) beeinflussen. Es scheint, daß die Expression von ORF 2 in diesen Insertionsmutanten verringert ist, und daß dies einen schädlichen Effekt auf die HVT-Virusproduktion besitzt.

Beispiel 3

Einfügen von Fremd-DNA in HVT unter Verwendung des Rückwärts- Selektionsschemas

Insertionen des Kan-Gens aus Tn903, die 3' von der kodierenden Region von HVT-TK liegen, sind co-transfektiert worden mit ATRº-DNA. Wegen des starken Wachstumsvorteils von Wildtyp (WT) gegenüber AraTº ist es möglich, das gesteigerte Wachstum in den Rekombinanten als ein Selektionsmittel einzusetzen. Wenn die Fremd-DNA mit der den Defekt behebenden (rescuing) DNA verknüpft ist, ist es auch möglich, die Insertion von Kan zusammen mit der den Defekt beseitigenden DNA (rescue) aus AraTº co-zutransduzieren, wenn die Insertion von Kan nicht die Produktion eines benachbarten, wesentlichen Genprodukts beeinflußt. Sechs Insertionsstellen für Kan, die 3' von dem Terminationscodon, das den Carboxyterminus von TK definiert, liegen, sind getestet worden, fünf von diesen führten zu der Insertion von Kan, wie auch zu der Behebung des AraT-Wachstumsdefekts (an Stellen 5 bis 9 in Figur 1). Diese Insertionen überspannen eine 1 kb- Region der DNA, die für das normale HVT-Wachstum in CEF nicht essentiell zu sein scheint. Weiterhin zeigen sie, daß es möglich ist, HVT mit Fremd-Genen von Interesse zu gewinnen unter Verwendung der Rückwärts-Selektionsstrategie, wobei HVT mit einem defekten TK-Gen repariert wird durch das Einfügen von DNA, enthaltend Wildtyp-TK und benachbarte Fremd-DNA. Diese Strategie kann ausgedehnt werden auf eine beliebige, nichtessentielle Stelle in dem HVT-Genom unter Verwendung von infektiöser DNA aus einem Virus, das ein defektes (vorzugsweise eine große Deletion, um eine spätere Rekombination zu vermeiden) TK trägt und von einem Plasmid, das ein gutes HVT-Gen und ein Gen von Interesse trägt, das zwischen die nicht-essentiellen HVT- Sequenzen eingebettet ist.

Beispiel 4

Expression von Fremd-DNA in HVT

Das HSV 1-TK-Gen, das seinen eigenen Promotor trägt (das BamHI- Fragment von pHSV-106, BRL), wurde eingefügt in die HpaI-Stelle (Stelle 1 in Figur 1) in dem TK-Gen von HVT. Dieses Plasmid wurde co-transfektiert mit ATRº-DNA, und Plaques mit Wildtyp- Wachstumseigenschaften wurden isoliert. DNA aus diesen Plaques zeigt das erwartete Muster für die Insertion des HSV-TK-Gens in HVT. In diesem Fall muß funktionelle TK von dem HSV-Gen hergestellt werden.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Modifikationen und Variationen in dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden können. Somit ist es beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung diese Modifikationen und Variationen umfaßt, vorausgesetzt, sie liegen im Umfang der beigefügten Ansprüche und ihrer Äquivalente.

Claims

1. Verfahren zum Einbringen eines Gens von Interesse in einen hühnerartigen Vogel, umfassend:

(a) Einfügen des Gens von Interesse in eine Stelle in einer nicht-essentiellen Region eines Herpes-Virus aus Truthahn (HVT), um einen viralen Vektor zu erzeugen; wobei diese Stelle in dem 6,25 kb Sal I Fragment, gezeigt in Fig. 1, vorhanden ist;

(b) Infizieren eines hühnerartigen Vogels mit dem viralen Vektor; und

(c) Veranlassen, daß das Gen von Interesse exprimiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der hühnerartige Vogel ein Huhn ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der nicht-essentielle Bereich in dem Gen, das TK-Resistenz kodiert, liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die nicht-essentielle Region bei einer Position des Genoms zwischen zwei DNA-Sequenzen liegt, die Gene kodieren.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die nicht-essentielle Region 3' von dem Gen liegt, das AraT-Resistenz kodiert.

6. Verfahren zum Erzeugen eines viralen Vektors, der ein funktionelles Gen von Interesse in einen hühnerartigen Vogel einbringen kann, umfassend:

(a) Lokalisieren einer Stelle innerhalb eines nicht-essentiellen Regions in dem Genom eines Herpes-Virus von Truthahn (HVT), wobei die nicht-essentielle Region in dem 6,25 kb Sal I Fragment, gezeigt in Fig. 1, liegt;

(b) Einfügen des Gens von Interesse in diese Stelle innerhalb der nicht-essentiellen Region des viralen Genoms, um einen viralen Vektor zu erzeugen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Gen von Interesse in die TK-Region des HVT-Virus eingefügt wird.

8. Verfahren zum Erzeugen eines viralen Vektors, der ein funktionelles Gen von Interesse in einen hühnerartigen Vogel einbringen kann, umfassend:

(a) Identifizieren eines lebensfähigen Herpes-Virus von Truthan (HVT), das einen genomischen Defekt besitzt, der in einer identifizierbaren Weise manifestiert ist; und

(b) Einfügen des Gens von Interesse, gekoppelt an eine Sequenz, die den viralen Defekt reparieren kann, in eine Stelle in dem 6,25 kb Sal I Fragment des Virus, gezeigt in Fig. 1, um einen viralen Vektor zu erzeugen.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Stelle 3' von Nukleotid 2026 aus Fig. 3 gelegen ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Gen von Interesse in eine Stelle eingefügt wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Stellen 5, 6, 7, 8 und 9 aus Fig. 1.

11. Vektor zum Exprimieren eines Gens von Interesse in einem hühnerartigen Vogel, wobei sich der Vektor zusammensetzt aus einem Herpes-Virus aus Truthahn (HVT), dem Gen von Interesse, das in eine Stelle in einer nicht-essentiellen Region des Virus eingefügt ist, wobei diese Stelle in dem 6,25 kb Sal I Fragment, gezeigt in Fig. 1, liegt.

12. Vektor nach Anspruch 11, worin der hühnerartige Vogel ein Huhn ist.

13. Vektor nach Anspruch 11, worin die nicht-essentielle Region in dem Gen, das TK-Resistenz kodiert, gelegen ist.

14. Vektor nach Anspruch 11, worin die nicht-essentielle Region an einer Position in dem Genom zwischen zwei DNA-Sequenzen gelegen ist, die Gene kodieren.

15. Vektor nach Anspruch 14, worin die nicht-essentielle Region 3' von dem Gen, das AraT-Resistenz kodiert, gelegen ist.