DE3850260T2

DE3850260T2 - Herstellung von 7-beta-Hydroxy-4-pregnen-3,20-dion-Derivaten.

Info

Publication number: DE3850260T2
Application number: DE3850260T
Authority: DE
Inventors: Nobuo Miyata; Masamichi Nakakoshi; Koji Tamura; Makoto Yoshihama
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1987-02-06
Filing date: 1988-02-05
Publication date: 1994-09-22
Anticipated expiration: 2008-02-06
Also published as: ATE69236T1; EP0391503A2; WO1988005782A1; EP0301102A1; EP0301102B1; US5028722A; DE3866047D1; EP0301102A4; EP0391503A3; DE3850260D1; EP0391503B1; ATE107363T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Derivaten des Pregnen, die als Intermediate für die Synthese von Derivaten des Progesteron, die eine die Ovulation inhibierende Aktivität aufweisen, verwendet werden. Von einer Gruppe dieser Verbindungen erwartet man, daß sie im medizinischen Bereich verwendet wird. Für einen Teil dieser Verbindungen ist außerdem eine Zell-Differenzierungs-Aktivität gefunden worden, und deshalb erwartet man auch die Verwendung dieser Verbindungen als Wirkstoffe auf diesem Gebiet.
Diese Anmeldung ist eine Teilungsanmeldung aus der europäischen Anmeldung (EP-A 0 301 102), auf die hier unter der Bezeichnung Stammanmeldung Bezug genommen wird.
Derivate von 7β-Hydroxy-4-pregnen-3,20-dion sind mittels verschiedener Verfahren hergestellt worden. J. Steroid Biochem. 17(4), Seiten 443-6 (1982) (Mukherjee et al) beschreibt die Isolierung des 15β-Hydroxy-Derivats nach dem Metabolismus von Progesteron durch A. fumigatus. Auch Int. Conf. Chem. Biotechnol. Biol. Act. Nat. Prod. (Proc.) 1st 1981, 3(2), Seiten 155- 7 (Mukherjee et al) beschreibt den Metabolismus von Progesteron von einem Aspergillus-Stamm, der das 15β-Hydroxy-Derivat ergibt. Außerdem betrifft auch Chem. Pharm. Bull (Tokio) 8, Seiten 626-8 (1960) (K Tsuda et al) ein Verfahren zur Herstellung des 15β-Derivats mittels mikrobiologischer Hydroxylierung von Progesteron durch Diplodia tubericola.
7β-Hydroxy-4-pregnen-3,15,20-trion kann auch mittels Oxidation oxidierter Pregnene, die aus Sipha novaboracensis isoliert worden sind, hergestellt werden, wie es in Journal of Chemical Ecology, Bd. 13, Nr. 1, Januar 1287, Seiten 35-38 (J. Meinwald et al) beschrieben worden ist.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Wirkungsweise von Mikroorganismen, die der Spezies Acremonium, z. B. einem Stamm von Schimmelpilzen, angehören, auf das Substrat 4- Pregnen-3,20-dion untersucht. Als Ergebnis haben sie herausgefunden, daß zwei bestimmte Derivate des Pregnen hergestellt werden. Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Derivates von 7β-Hydroxy-4-pregnen-3,20-dion, dargestellt durch die Formel (I):
wobei X = O oder αHβOH und Y = αH, zur Verfügung gestellt. Das vorliegende Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Spezies Acremonium mit 4-Pregnen-3,20-dion in Berührung gebracht wird.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben darüber hinaus gefunden, daß auch Ester der Pregnen-Derivate erhalten werden können.
Die Derivate des Pregnen können als Intermediate für die Herstellung von Derivaten des Progesteron verwendet werden. Diese Derivate des Pregnen einschließlich der oben erwähnten Ester weisen außerdem eine Zell-Differenzierungs-Aktivität auf.
Ein spezielles Derivat des Pregnen, das mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellt worden ist, hat den chemischen Namen 7β-Hydroxy-4-pregnen-3,15,20-trion.
Die Fig. 1 bis 4 betreffen eine Verbindung, die von einem Mikroorganismus hergestellt worden ist, nämlich 7β, 15β, 17α- Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion. Fig. 1 zeigt ein EI Massenspektrum. Fig. 2 zeigt ein Infrarot-Absorptionsspektrum. Figur 3 zeigt ein magnetisches Protonen-Kernresonanz-Spektrum. Fig. 4 zeigt ein ¹³C magnetisches Kernresonanz-Spektrum.
Die Fig. 5 bis 7 betreffen 7β-Hydroxy-4-pregnen-3,15,20- trion, eine Verbindung, die nach dem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung hergestellt worden ist. Fig. 5 zeigt ein EI Massenspektrum. Fig. 6 zeigt ein magnetisches Protonen-Kernresonanz-Spektrum. Fig. 7 zeigt ein ¹³C magnetisches Kernresonanz-Spektrum.
Die vorliegende Erfindung soll ein Derivat des Pregnen zur Verfügung stellen, das als ein Intermediat für die Herstellung von Derivaten des Progesteron, die die Aktivität von Progesteron aufweisen wie eine die Ovulation inhibierende Aktivität, verwendet werden und das zusätzlich eine Zell-Differenzierungs-Aktivität aufweist. Die vorliegende Erfindung wird im nachfolgenden anhand der Beispiele genauer beschrieben.

Kultur von Mikroorganismen und Umwandlung des Substrats durch die Mikroorganismen

Acremonium strictum NN106, gelagert in dem Hungarian National Institute of Hygiene (FERM P-9143), der ein Stamm von Schimmelpilzen ist, wurde unter Schütteln in einem Medium kultiviert, das Kohlenstoffquellen wie Malzextrakt, Pepton, Stickstoffquellen wie Sojabohnenmehl und anorganische Salze enthält. Während der Kultivierung wurde der Stamm auf 100 ml eines Kulturmediums, das z. B. eine der unten beschriebenen Zusammensetzungen aufwies, in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Die Kultur wurde inkubiert und gleichzeitig in einem Inkubator mit einer Umlaufschüttelmaschine mit 200 U/min 48 Stunden lang bei 24ºC geschüttelt.
Malzextrakt 30 g
Pepton 20 g
Sojabohnenmehl 10 g
Kaliumphosphat, monobasisch 5 g
Magnesiumsulfat 5 g
gereinigtes Wasser 1000 ml
Der oben genannte Stamm wurde am 21. Januar 1987 unter der Bezeichnung FERM P-9143 bei dem Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt.
4-Pregnen-3,20-dion wurde als ein Substrat vorab in Dimethylformamid gelöst, so daß eine Konzentration des Substrates von 0,1 g/ml erhalten wurde.
Zu der oben erhaltenen Kulturlösung wurden 2 ml der oben genannten Substratlösung zugegeben. 24 bis 48 Stunden lang wurde unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben eine Reaktion durchgeführt.
Nach Beendigung der Reaktion wurden die festen Bestandteile und Zellen mittels Zentrifugation aus der resultierenden Kulturlösung abgetrennt und entfernt. Der resultierende Überstand wurde dreimal extrahiert, wobei jedes Mal ein Drittel des Gesamtvolumens an Ethylacetat verwendet wurde. Das Lösungsmittel wurde von der extrahierten Lösung mittels eines Rotationsverdampfers entfernt.
Eine so erhaltene Rohfraktion wurde in einer kleinen Menge Chloroform (oder Methanol) gelöst und über eine Silicagel- Säule HPLC (20 mm Durchmesser · 300 mm Länge) gegeben. Die adsorbierten Fraktionen wurden mit einem Lösungsmittelgemisch (Chloroform/Methanol 98 : 2) eluiert und fraktioniert.
Das Eluat konnte zumindest in zwei Fraktionen unterteilt werden. Eine in einer der Fraktionen enthaltene Komponente wurde anhand der unten beschriebenen physikochemischen Eigenschaften, die als Ergebnis der Strukturanalysen erhalten wurden, als 7β,15β,17α-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion (eine Verbindung gemäß der Stammanmeldung) identifiziert. Die Ausbeute betrug 9,6 mg.
Ein in einer anderen Fraktion enthaltener Bestandteil, der vorher, z. B. nach 6 Minuten im Vergleich zu nach 26 Minuten für die oben beschriebene Verbindung, eluiert wurde, wurde an Hand derselben Methode wie oben als 7β-Hydroxy-4-pregnen-3,- 15,20-trion (eine Verbindung gemäß vorliegender Erfindung) identifiziert.
7β,15β,17α-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion wird durch die chemische Formel (II) dargestellt:
Die Verbindung kann anhand der folgenden physikochemischen Eigenschaften identifiziert werden.
(1) Aussehen Weißes Pulver
(2) Molekulargewicht 362
(3) Summenformel C&sub2;&sub1;H&sub3;&sub0;O&sub5;
(4) Schmelzpunkt 248-250ºC
(5) Spezifische Rotation [α]D = + 41,4º
(6) EI Massenspektrum m/Z = 362 Siehe Fig. 1
(7) Infrarot-Absorptionsspektrum Siehe Fig. 2
(8) Magnetisches Protonen- Kernresonanzspektrum Siehe Fig. 3
(9) ¹³C magnetisches Kernresonanz- Spektrum Siehe Fig. 4
7β-Hydroxy-4-pregnen-3,15,20-trion wird durch die chemische Formel (III) dargestellt:
Die Verbindung kann anhand der folgenden physikochemischen Eigenschaften identifiziert werden.
(1) Aussehen Weißes Pulver
(2) Molekulargewicht 344
(3) Summenformel C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub8;O&sub4;
(4) Schmelzpunkt 254-256ºC
(5) EI Massenspektrum m/Z = 344 Siehe Fig. 5
(6) Magnetisches Protonen- Kernresonanzspektrum Siehe Fig. 6
(5) ¹³C magnetisches Kernresonanz- Spektrum Siehe Fig. 7
Derivate des Pregnen können verestert werden. Z. B. kann die Verbindung 7β,15β,17α-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion als ein Intermediat für die Synthese von Derivaten des Progesteron mit einer die Ovulation inhibierenden Aktivität verwendet werden. Sie können mittels Reaktion mit Essigsäureanhydrid in Pyridin in 7β,15β-Diacetyl-17α-hydroxy-4-pregnen-3,20-dionumgewandelt werden, wobei dieses acetylierte Derivat in einer Ausbeute von 96% erhalten wird.
Gemäß den oben erwähnten Verfahren werden das Derivat der Dibernsteinsäureester oder Diglutarsäureester mittels Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid oder Glutarsäureanhydrid anstelle von Essigsäureanhydrid erhalten.
Progesteron und die unten beschriebene Verbindung, die nach dem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung zu erhalten ist, ließ man jeweils 48 Stunden lang auf myelogene Leukämie M1- Zellen, erhalten von einer SL Maus, einwirken.
Die Zell-Differenzierungs-Aktivität wurde durch Beobachtung der morphologischen Veränderungen der Zellen unter einem Mikroskop gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten dargestellt.

Tabelle

Zell-Differenzierungs-Aktivität auf M1 Zellen

Progesteron -7β-Hydroxy-4-pregnen-3,15,20-trion 50%
Angaben über Mikroorganismen, hinterlegt gemäß Regel 13 bis.
Hinterlegungsstelle: Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology
Adresse: 1-3, Higashi-1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan
Hinterlegungsnummer: FERM P-9143
Datum der Hinterlegung: 21. Januar 1987

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Derivates von 7β-Hydroxy-4-pregnen-3,20-dion, dargestellt durch die Formel (I):

wobei X = O oder αHβOH und Y = αH, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Spezies Acremonium mit 4-Pregnen-3,20-dion in Berührung gebracht wird.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei X = O, so daß die Verbindung der Formel (I) 7β-Hydroxy-4-pregnen-3,15,20- trion ist.