DE3843534A1

DE3843534A1 - Neue tnf-polypeptide

Info

Publication number: DE3843534A1
Application number: DE19883843534
Authority: DE
Inventors: Lothar Dr Daum; Thoams Dr Doerper; Heinz Dr Hillen; Achim Dr Moeller; Klaus Dr Schollmeier; Nigel Dr Walker; Gerhard Dr Keilhauer
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1988-12-23
Publication date: 1990-07-12
Also published as: WO1990007579A1; CA2005053A1; EP0423252A1

Description

Die Erfindung betrifft neue, vom Tumor Nekrose Faktor (TNF) abgeleitete Polypeptide, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.

Von Carswell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3666, 1975) wurde berichtet, daß das Serum von Endotoxin-behandelten Tieren, die zuvor mit dem Mycobacterien-Stamm Calmette-Guerin (BCG) infiziert worden waren, eine hämorrhagische Nekrose bei verschiedenen Tumoren in der Maus bewirkte. Diese Aktivität wurde dem Tumor Nekrose Faktor zugeschrieben. TNF zeigt auch eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung gegenüber einer Vielzahl von transformierten Zellinien in vitro, während normale menschliche und tierische Zellinien davon nicht betroffen werden (Lymphokine Reports Vol. 2, pp 235-275, Academic Press, New York, 1981). Kürzlich wurde die biochemische Charakterisierung und das Gen für menschlichen TNF beschrieben (Nature 312, 724, 1984; J. Biol. Chem. 260, 2345, 1985; Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).

Aus diesen Daten läßt sich folgende Proteinstruktur für das reife humane TNF ableiten:

Weiterhin wurde das TNF-Gen von Rind, Kaninchen und Maus beschrieben (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986).

Neben seinen zytotoxischen Eigenschaften ist TNF einer der Hauptbeteiligten an entzündlichen Reaktionen (Pharmac. Res. 5, 129, 1988). Im Tiermodell konnte die Beteiligung von TNF beim septischen Schock (Science 229, 869, 1985) und der Graft versus Host Disease (J. Exp. Med. 166, 1280, 1987) gezeigt werden.

Es wurde nun gefunden, daß bestimmte Polypeptide, die sich vom TNF ableiten, günstigere Eigenschaften besitzen.

Gegenstand der Erfindung sind TNF-Polypeptide der Formel

worin jedoch mindestens eine Aminosäure in den Positionen 9, 10, 11, 15, 26, 35, 46, 52, 54, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 78, 87, 95, 98, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 144, 150, 156 und/oder 157 durch eine andere natürliche α-Aminosäure ersetzt und/oder deletiert ist und N-terminal 1 bis 7 Aminosäuren fehlen können, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.

Insbesondere sind Gegenstand der Erfindung die TNF-Polypeptide, in denen mindestens eine der folgenden Veränderungen vorliegt:

Position 9: Ser ersetzt durch A
Position 10: Asp ersetzt durch A
Position 11: Lys ersetzt durch A
Position 15: His ersetzt durch B oder C
Position 26: Leu ersetzt durch C
Position 35: Ala ersetzt durch C
Position 46: Asn ersetzt durch A
Position 52: Ser ersetzt durch A
Position 54: Gly ersetzt durch C
Position 56: Tyr ersetzt durch C
Position 57: Leu ersetzt durch C
Position 59: Tyr ersetzt durch C
Position 60: Ser ersetzt durch C
Position 61: Gln ersetzt durch C
Position 62: Val ersetzt durch C
Position 78: His ersetzt durch C oder B
Position 87: Tyr ersetzt durch C
Position 95: Ser ersetzt durch C
Position 98: Lys ersetzt durch B
Position 119: Tyr ersetzt durch C oder A
Position 121: Gly ersetzt durch C
Position 133: Ser ersetzt durch C
Position 136: Ile ersetzt durch C
Position 137: Asn ersetzt durch A
Position 138: Arg ersetzt durch A oder B
Position 139: Pro ersetzt durch A, C oder B
Position 140: Asp ersetzt durch A, C oder deletiert
Position 141: Tyr ersetzt durch A oder deletiert
Position 142: Leu ersetzt durch C
Position 144: Phe ersetzt durch C oder A
Position 150: Val ersetzt durch C
Position 156: Ala ersetzt durch C
Position 157: Leu ersetzt durch B,

worin A eine Aminosäure mit geladener Seitenkette, B eine Aminosäure mit polarer ungeladener Seitenkette und C eine Aminosäure mit hydrophober Seitenkette bedeuten. A ist also Arg, His, Lys, Glu oder Asp; B Gln, Asn, Gly, Met, Cys, Ser oder Thr und C Phe, Leu, Ile, Trp, Tyr, Pro, Val oder Ala.

Vorzugsweise sind in dem TNF-Molekül nicht mehr als 10 Aminosäuren ab Position 9 deletiert oder verändert.

Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen: Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesäure, Glucuronsäure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin.

Zur Herstellung der neuen Polypeptide geht man von der cDNA des humanen TNFs aus, die man gemäß Nature 312, 724, 1984 erhält und in ein Plasmid einbaut. Dieses rekombinante Plasmid, das die genetische Information für humanes TNF trägt, dient als Ausgangspunkt für die Herstellung der neuen TNF-Muteine.

Um die beabsichtigten Veränderungen in das Gen für den humanen TNF gezielt einzuführen, wird das TNF-cDNA-Fragment durch aufeinanderfolgende Spaltung mit Restriktionsenzymen und anschließende Elektrophorese durch ein Agarosegel rein hergestellt. Dieses TNF-Gen enthaltende Fragment wird in einen Polylinker eines Bakteriophagenvektors eingebaut (Gene 19, 269-276).

Durch Transformation von E.coli mit diesem rekombinanten Vektor werden schließlich Phagen erhalten, die den codierenden Strang des humanen TNF-Gens tragen.

Zur gezielten Mutagenese des TNF-Gens werden Oligodesoxynukleotide chemisch synthetisiert, die partiell komplementär zur TNF-Sequenz sind. Diese Oligonukleotide besitzen eine durchschnittliche Länge von 23 Nukleotiden. Am 5′-Ende ist ein Bereich von etwa 10 Nukleotiden, der perfekt komplementär zum TNF-codierenden Strang ist. Anschließend folgt ein Abschnitt von 3 Nukleotiden, der nicht komplementär ist und die gewünschte Veränderung des TNF-Gens trägt. An diesen Abschnitt schließt sich ein etwa 10 Nukleotide langer Teil an, der wiederum perfekt komplementär zum TNF-codierenden Strang ist.

Deletionen werden erzeugt, indem man Oligodesoxynukleotide verwendet, die genau vor und hinter der zu deletierenden Gensequenz Komplementarität besitzen; dadurch wird ein Heteroduplex gebildet, in dem die zu deletierende Gensequenz einzelsträngig vorliegt.

Die so konstruierten Oligonukleotide werden mit der rekombinanten TNF-DNA hybridisiert. Anschließend wird mit einer Polymerase und Desoxynukleosidtriphosphaten der Heteroduplex zum vollständigen doppelsträngigen DNA-Molekül aufgefüllt und mit dem Enzym T4 DNA-Ligase kovalent verknüpft.

Mit diesem DNA-Molekül werden kompetente E.coli Zellen transformiert und die so erhaltenen Phagen werden durch in situ Plaque-Testung untersucht (Science 196, 180, 1977).

Dazu wird die auf Nitrocellulose überführte Phagen-DNA mit Hilfe des zur Mutagenese verwendeten Oligonukleotids, das radioaktiv markiert ist, durchgetestet.

Unter hochstringenten Bedingungen werden diejenigen Phagen durch Hybridisierung identifiziert, die die gewünschte Veränderung im TNF-Gen tragen. Die Bestätigung der Mutation erfolgt durch DNA-Sequenzierung.

Anschließend kann das mutierte TNF-Gen mittels Spaltung mit Restriktionsenzymen aus dem rekombinierten TNF-Vektor herausgelöst und mittels Gelelektrophorese in reiner Form isoliert werden. Zur Expression dieses veränderten TNF-Gens in E.coli muß das TNF-Genfragment mit prokaryontischen Signalen wie Promotoren, Terminatoren, ribosomalen Bindungsstellen versehen werden (Winnacker, Gene und Clone, Verlag Chemie 1984, Seite 192ff). Anschließend wird mit diesem TNF-Expressionsvektor ein E.coli-Stamm transformiert. Der so erhaltene rekombinante E.coli-Stamm wird zur Produktion eines TNF-Muteins verwendet, indem man ihn in einem geeigneten Nährmedium züchtet. Danach werden die Bakterien geerntet und lysiert. So erhält man ein lösliches Gemisch aus E.coli-Proteinen, aus dem das gewünschte TNF-Mutein durch bekannte Methoden der Proteinreinigung wie Ammoniumsulfatpräzipitation, Ionenaustauschchromatographie und Umkehrphasenchromatographie in reiner Form isoliert werden kann.

Die neuen Muteine zeigen zum Teil gute zytotoxische Eigenschaften. Ein anderer Teil der Muteine besitzt eine hohe Affinität für den zellulären TNF-Rezeptor, ohne jedoch eine zytotoxische Aktivität zu besitzen. Sie stellen also TNF-Antagonisten dar. Sie binden in Konkurrenz zu natürlichem TNF an den zellulären TNF-Rezeptor und unterdrücken so die TNF-Wirkung. Die neuen Muteine erweisen sich als wertvolle Arzneimittel, die zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen eingesetzt werden können. Durch einfache Experimente kann geklärt werden, welche Wirkungsweise die einzelnen Muteine besitzen. Mit einer TNF-sensitiven Zelle wird die Zytotoxizität des Muteins durch Inkubation der Zellinie in Gegenwart des Muteins bestimmt. In einem zweiten Versuchsansatz inkubiert man die Zellinie mit dem entsprechenden Mutein in Gegenwart einer letal wirkenden TNF-Menge. Dadurch kann die TNF-antagonisierende Wirkung nachgewiesen werden. Außerdem wird durch ein in vitro Bindungsexperiment die Affinität des Muteins zum zellulären TNF-Rezeptor bestimmt.

Die biologische Charakterisierung der neuen Muteine auf ihre agonistische oder antagonistische Wirkung erfolgte in folgenden Testsystemen:

I. Zytotoxizitätstest auf TNF-sensitiven Indikatorzellen,
II. Kompetition-Zytotoxizitätstest auf TNF-sensitiven Indikatorzellen,
III. Kompetition-Rezeptorbindungstest auf TNF-Rezeptor exprimierenden Indikatorzellen.

I. Zytotoxizitätstest

Die agonistische Bewertung der neuen Muteine basiert auf deren zytotoxischer Wirkung auf TNF-sensitiven Zellen (z. B. L929, MCF-7, A204, U937). Der Test mit L929 und MCF-7 wurde wie folgt durchgeführt:

1. 100 µl Kulturmedium mit 3 bis 5×10³ frisch trypsinierten, sich im exponentiellen Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw. MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer 96-Loch-Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf gesättigte Luft im Brutschrank enthielt 5 Vol-% CO₂.
Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle 1× (Boehringer, Mannheim), 50 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) foetales Kälberserum (FCS), 50 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren, 3 ml 1M Hepes-Puffer pH 7,2 und 50 ml Gentamycin (50 mg/ml).
Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco 1× (Boehringer, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS, 5 ml L-Glutamin und 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren.
2. Am folgenden Tag wurden 100 µl der zu prüfenden Mutein-Lösung zu den Zellkulturen gegeben und seriell 2fach titriert. Zusätzlich wurden einige Zellkontrollen (d. h. nicht mit Mutein-Verdünnung behandelte Zellkulturen) und einige rhu-TNF-Kontrollen (d. h. mit rekombinanten humanen TNF behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol.-% CO₂ inkubiert.
3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Mutein-Verdünnung behandelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung bestimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung wurden 50 µl Kristallviolettlösungen pipettiert.
Die Kristallviolettlösung hatte folgende Zusammensetzung: 3,75 g Kristallviolett
1,75 g NaCl
161,5 ml Ethanol
43,2 ml 37% Formaldehyd
ad 500 ml WasserDie Kristallviolettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die Platten jeweils 5mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen. Der zellgebundene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 µl Reagenzlösung (50% Ethanol, 0,1% Eisessig, 49,9% Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert.
4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder Vertiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösung in den einzelnen Vertiefungen bei 540 nm gemessen.
5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle, der 50% Zytotoxizitätswert definiert und der Kehrwert der Probenverdünnung, die zu 50% Zytotoxizität führt, als zytotoxische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.

II. Kompetition-Zytotoxizitätstest

Die antagonistische Bewertung der Muteine basiert auf deren Eigenschaft, die zytotoxische Wirkung von rhu-TNF auf TNF-sensitiven Zellen (z. B. L929, MCF-7, A204, U937) zu kompetitieren. Der Kompetition-Zytotoxitätstest mit L929 und MCF-7-Zellen wurde wie folgt durchgeführt:

1. 100 µl Kulturmedium mit 3 bis 5×10³ frisch trypsinierten, sich im exponentiellen Wachstum befindenden L929-Zellen (Maus) bzw. MCF-7-Zellen (Mensch) wurden in die Vertiefungen einer 96-Loch-Flachboden-Kulturplatte pipettiert. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die mit Wasserdampf gesättigte Luft im Brutschrank enthielt 5 Vol-% CO₂.
Das L929-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Earle 1× (Boehringer, Mannheim), 50 ml für 30 min bei 56°C hitzeinaktiviertes FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren, 3 ml 1M Hepes-Puffer pH 7,2 und 500 µl Gentamycin (50 mg/ml).
Das MCF-7-Kulturmedium enthielt 500 ml MEM Dulbecco 1× (Boehringer, Mannheim), 100 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS, 5 ml L-Glutamin (200 mM) und 5 ml 100× nichtessentielle Aminosäuren.
2. Am nächsten Tag wurden 100 µl der zu prüfenden Mutein-Lösung zu den Zellkulturen zugegeben und seriell 2fach titriert. Zu diesen Zellkulturen wurden dann 100 µl einer rhu-TNF-Verdünnung in Kulturmedium, die in der Endkonzentration in der Zellkultur eine 80-100% zytotoxische Wirkung hat, zugegeben. Zudem wurden einige Zellkontrollen (d. h. nicht mit Mutein-Lösung und nicht mit rhu-TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) und einige rhu-TNF-Kontrollen (=nur mit rhu-TNF-Lösung behandelte Zellkulturen) mit angelegt. Die Kulturplatte wurde 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre aus wasserdampf-gesättigter Luft mit 5 Vol.-% CO₂ inkubiert.
3. Der Prozentsatz überlebender Zellen in den mit Substanzlösung behandelten Kulturen wurde mittels der Kristallviolettfärbung bestimmt. Dazu wurden die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Abschlagen der Testplatte entfernt. In jede Vertiefung wurden 50 µl Kristallviolettlösungen pipettiert.
Die Kristallviolettlösung hatte die in II.3 angegebene Zusammensetzung:
Die Kristallviolettlösung blieb 20 min in den Vertiefungen und wurde dann ebenfalls abgeschlagen. Anschließend wurden die Platten jeweils 5mal durch Eintauchen in Wasser gewaschen, um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen. Der zellgebundene Farbstoff wurde durch Zugabe von 100 µl Reagenzlösung (50% Ethanol, 0,1% Eisessig, 49,9% Wasser) in jede Vertiefung aus den Zellen extrahiert.
4. Durch Schütteln der Platten für 5 min erhielt man in jeder Vertiefung eine gleichmäßig gefärbte Lösung. Zur Bestimmung der überlebenden Zellen wurde die Extinktion der Färbelösung in den einzelnen Vertiefungen bei 540 nm gemessen.
5. Danach wurde, bezogen auf die Zellkontrolle und die rhu-TNF-Kontrolle der 50% Kompetitionswert definiert und die Probenkonzentration, die bei der vorgelegten rhu-TNF-Konzentration zu 50% Kompetition der rhu-TNF-Zytotoxität führt, als antagonistische Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.

III. Kompetition-Rezeptorbindungstest

Sowohl die agonistische als auch die antagonistische Wirkung von Muteinen setzt voraus, daß letztere an den TNF-Rezeptor binden. Das bedeutet, daß Muteine mit agonistischer bzw. antagonistischer Wirkung und rhu-TNF um die Bindung am TNF-Rezeptor auf TNF-sensitiven Indikatorzellen (z. B. U937) konkurrieren. Der Kompetition-Rezeptorbindungstest wurde wie folgt durchgeführt:

1. 100 µl Medium mit verschiedenen Konzentrationen des zu prüfenden Muteins sowie des rhu-TNF (=Kontrolle) wurden in die Reaktionsgefäße pipettiert. Das Medium enthielt 500 ml PBS (Boehringer, Mannheim), 10 ml hitzeinaktiviertes (30 min, 56°C) FCS und 100 mg Natriumazid.
2. Anschließend wurden 100 µl Medium mit 1 ng ¹²⁵Jod-markiertem rhu-TNF (Lactoperoxidase-Methode nach Bolton) in die Reaktionsgefäße gegeben und gemischt. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung (NSB) wurde in den Reaktionsgefäßen das ¹²⁵Jod-markierte rhu-TNF (1 ng ¹²⁵J-rhu-TNF in 100 µl Medium) mit dem 200fachen Überschuß an nicht radioaktiv markiertem rhu-TNF (200 ng rhu-TNF in 100 µl Medium) gemischt.
3. Dann wurden 100 µl Medium mit 2×10⁶ U937-Zellen (Mensch) in die Reaktionsgefäße pipettiert und gemischt. Die Reaktionsgefäße (Testvolumen 300 µl) wurden 90 min bei 0°C inkubiert. Nach 45 min wurden die Reaktionsansätze nochmals durchmischt.
4. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen 5 min bei 1800 rpm und 4°C zentrifugiert, 3mal mit Medium gewaschen, quantitativ in Zählröhrchen überführt und die zellgebundene Radioaktivität in einem Clini Gamma Counter 1272 (LKB Wallac) bestimmt.
5. Nach Korrektur der Meßwerte um die unspezifische Bindung wurde, bezogen auf die Gesamtbindung, der 50% Kompetitionswert definiert und die Probenkonzentration, die bei der vorgelegten ¹²⁵J-rhu-TNF-Konzentration zu 50% Kompetition der ¹²⁵J-rhu-TNF-Bindung führt, als kompetitive Aktivität der untersuchten Probe ermittelt.

Beispiel A. Herstellung eines Vektors, der die cDNA des humanen TNFs trägt

Ausgangsmaterial war das 578 bp lange TNF-cDNA-Fragment, das für die Aminosäuren 8 bis 157 codiert (Aval-Hind3-Fragment).

Dieses TNF-cDNA-Teilfragment wurde mit einem chemisch synthetisierten Adaptor, der für die Aminosäuren 1 bis 7 codiert, verknüpft und in einen geeigneten Vektor eingebaut.

Als Adaptor diente ein doppelsträngiges DNA-Molekül folgender Sequenz:

CGATACTACTATG(N)_x
TATGATGATAC(M)_xGGCT,

worin
x 0 oder eine durch 3 teilbare Zahl von 3 bis 21,
N A, G, C oder T und
M das jeweils komplementäre Nukleotid zu N sind.

Durch Variation der Adaptoren konnte die Sequenz am 5′-Ende der TNF-cDNA beeinflußt und somit nach erfolgter Genexpression der Aminoterminus des TNF-Proteins verändert werden.

Wurde für N₂₁ GTCAGATCATCTTCTCGAACC eingesetzt, so erhielt man die cDNA für die gesamte reife Form des humanen TNF (1-157), wobei vor der Aminosäure 1 ein Methionin eingebaut ist.

Für x gleich 0 erhielt man einen Adaptor, der nach Verknüpfung mit der TNF-cDNA für ein TNF-Protein codierte, bei dem die ersten 7 Aminosäuren am Aminoterminus deletiert sind. Weiterhin konnten durch Variation von N alle Deletionen zwischen 1 und 7 Aminosäuren am Aminoterminus des TNF erzeugt werden.

Die Adaptoren wurden durch vollautomatische chemische Synthese (Applied Biosystems 380A) hergestellt und durch präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt.

Als Vektor diente ein 4,3 kb langes DNA-Molekül, das aus pBR322 durch Spaltung mit Cla1 und Hind3 erhalten wurde.

0,2 pMol des 587 bp langen TNF-Fragmentes wurden mit 0,5 pMol des entsprechenden Adapters und 0,1 pMol des Vektors mit Hilfe des Enzyms T4-DNA Ligase verknüpft. Mit dieser DNA wurden der E.coli-Stamm W3110 (ATCC 27 325) transformiert und ein Klon mit der entsprechenden DNA-Sequenz isoliert.

B. Herstellung eines Einzelstrangvektors mit der codierenden Sequenz des humanen TNF

Der oben beschriebene TNF-cDNA-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen EcoR1 und Hind3 gespalten. Man erhielt das 0,6 kb große TNF-cDNA-Fragment durch Gelelektrophorese und anschließende Extraktion aus dem Gel in reiner Form. 100 ng dieses Fragments wurden mit 1 µg des M13mp8-EcoR1-Hind3-Vektorfragments in 20 µl 50 mM TrisHCl (pH=7,4), 10 mM MgCl₂ 25 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP in Gegenwart von 5 Einheiten T4-DNA-Ligase gemischt und über Nacht bei 14°C inkubiert.

Mit diesem Gemisch wurde E.coli JM103 (erhältlich von der Firma Pharmacia) transformiert. Man isolierte durch Ausstanzen aus den Kulturplatten mehrere Plaques, die durch DNA-Sequenzierung auf TNF-cDNA-Insertion untersucht wurden. Der rekombinierte Phage mit dem codierenden Strang der TNF-cDNA wird M13-TNF genannt.

C. Herstellung von Vektoren mit veränderter TNF-Sequenz

Der oben beschriebene M13-TNF war das Ausgangsmolekül für die gezielte Mutagenese des TNF-Gens. Um die beabsichtigten Veränderungen einzuführen, benötigte man Oligodesoxynukleotide, die partiell komplementär zum TNF-codierenden Strang sind ("antisense Oligonukleotide"). Diese Oligonukleotide besitzen eine Länge zwischen 15 und 30 Nukleotiden; bevorzugt verwendet wurden Oligonukleotide mit einer Länge von 23 Nukleotiden. Dabei waren die ersten 10 Nukleotide perfekt komplementär zum TNF-codierenden Strang, dann folgte ein nicht-komplementärer Bereich, der die beabsichtigte Veränderung im TNF-Gen trug, und anschließend folgte wieder ein perfekt komplementärer Bereich von 10 Nukleotiden. Das antisense Oligonukleotid für den Austausch der Aminosäure Nr. 9 Serin gegen Asparaginsäure war

pCAGGCTTGTCGTCCGGGGTTCGA.

Das antisense Oligonukleotid für die Deletion der Aminosäure Nr. 140 Asparaginsäure war

pAGTCGAGATAGGGCCGATTG:

Die für die Mutagenese verwendeten Oligonukleotide sind in Tab. 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Diese Oligonukleotide wurden mittels konventioneller Methoden synthetisiert. Zum Gebrauch bei der Mutagenese wurden 10 pMol des Oligonukleotids 30 min bei 37°C in 10 µl 50 mM TrisHCl (pH=7,5), 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂ 10 mM Dithiothreitol, 0,1 mM ATP in Gegenwart von 5 Einheiten T4 Polynukleotid-Kinase phosphoryliert.

Zum Gebrauch als Probe (s. unten) wurden 2 pMol des synthetischen Oligonukleotids wie oben angegeben phosphoryliert, nur daß anstatt 0,1 mM ATP 1 µm q-³² P-ATP verwendet wurde.

Die spezifische Aktivität lag im Bereich von 5 · 10⁶ cpm pro pMol Oligonukleotid.

Die Hybridisierung der Oligonukleotide mit der einzelsträngigen DNA von M13-TNF ergab nach Kettenverlängerung eine Heteroduplex-DNA, bei der ein Strang die mutierte DNA beinhaltete.

Zur partiellen Heteroduplexbildung wurden 300 ng M13-TNF DNA mit 1 pMol des phosphorylierten Oligonukleotids in 20 µl 10 mM TrisHCl (pH=7,5), 0,1 mM EDTA, 50 mMol NaCl auf 80°C (2 min), 50°C (5 min) und Raumtemperatur (5 min) erwärmt. Die Kettenverlängerung wurde durch Zugabe von 30 µl 50 mM TrisHCl (pH=8,0), 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 0,7 mM ATP, 0,07 mM dATP, 0,2 mM an dGTP, dTTP, dCTP, 2 Einheiten E.coli Polymerase I (großes Fragment) und 20 Einheiten T4 DNA-Ligase gestartet.

Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch 4 h bei 37°C inkubiert und anschließend bei 4°C über Nacht inkubiert. Aliquots wurden mit Phenol extrahiert, die DNA mit Ethanol ausgefällt und in 15 µl Wasser gelöst. Die DNA dieser Aliquots wurde zur Transformation von E.coli JM 103 benutzt.

Bakterienkulturschalen (15 cm Durchmesser), die einige Hundert rekombinante Phagen-Plaques enthalten, wurden durch in situ Plaque-Hybridisierung (Science 196, 180, 1977) auf den mutierten Genotyp hin untersucht, indem man das entsprechende radioaktiv markierte Oligonukleotid (die Probe) und Nitrocellulosefilterabzüge der Phagen-Plaques hybridisierte (etwa 10⁶ cpm pro Filter). Die Hybridisierung geschah über Nacht bei 50°C, 40% Formamid und 5 · SSC (1 · SSC=0,1 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat pH=7,2).

Die Filter wurden bei 45°C in 2 · SSC, 0,02% Natriumdodecylsulfat gewaschen, an der Luft getrocknet, auf einen Röntgenfilm aufgebracht und bei -70°C exponiert.

Es war notwendig, die Stringenz der Hybridisierung (durch Veränderung der SSC-Konzentration beim Waschen der Filter) für das entsprechende Oligonukleotid individuell einzustellen; jede Mutante variierte je nach Anzahl und Art der ausgetauschten oder deletierten Nukleotide in ihrer Fähigkeit, mit dem Oligonukleotid zu hybridisieren.

Ein mit der radioaktiv markierten Probe hybridisierender Phage wurde aus der Bakterienkulturplatte ausgestanzt und als Inokulum zur Infektion von E.coli JM 103 verwendet.

Aus dem Kulturüberstand wurde die einzelsträngige DNA, aus dem Zellniederschlag die doppelsträngige DNA präpariert.

Die einzelsträngige DNA wurde nach der Didesoxymethode (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 5463, 1977) sequenziert, um die Mutation zu bestätigen. Dann konnte aus der doppelsträngigen DNA durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen Cla1 und Hind3 und anschließende Gelelektrophorese das Gen für das TNF-Mutein isoliert werden.

D. Produktion der TNF-Muteine

Das in den obigen Beispielen hergestellte Gen für ein TNF-Mutein wurde an seinem 5′-Ende (Cla1) mit Promotorsequenzen, wie z. B. lac-Promotor oder trp-Promotor und ribosomalen Bindungsstellen verknüpft. An seinem 3′-Ende (Hind3) enthielt das Gen einen Transkriptionsterminator, wie den trpA-Terminator. Diese DNA-Sequenzen sind alle kommerziell erhältlich (Pharmacia-LKB, Freiburg).

Das so mit den nötigen Expressionssignalen versehene Gen für das TNF-Mutein wurde in einen Vektor wie z. B. pBR322 eingebaut. Mit diesem Vektor wurde der E.coli Stamm W3110 transformiert und die erhaltenen Klone auf TNF-Mutein-Produktion getestet. Dazu wurde der Bakterienüberstand nach Verdünnung in einem biologischen Test untersucht. Positive Bakterienklone werden bei 37°C in 10 l LB-Nährmedium gezüchtet.

E. Reinigung der Proteine

1 l Fermentationsbrühe eines eine neue Substanz produzierenden E.coli-Stamms wurden 30 min bei 3000 g zentrifugiert. Der Rückstand wurde in 200 ml 0,4 M Argininhydrochlorid, 20 mM Natriumphosphat pH 8,5 aufgenommen und 30 min mit Ultraschall behandelt. Die Suspension wurde mit 6 ml 2M MnCl₂ versetzt und 45 min bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit verdünnter NH₃-Lösung auf pH 8,9 gebracht und mit festem Ammoniumsulfat auf 60% Sättigung eingestellt.

Das Proteinpräzipitat wurde in 0,2 M Argininhydrochlorid pH 7,5 suspendiert und gegen 0,4 M Argininhydrochlorid pH 7,5 dialysiert. Nach 16 h wurde mit verdünnter NH₃-Lösung auf pH 8,5 eingestellt und auf das 5fache Volumen mit Wasser verdünnt.

Diese Lösung wurde über eine mit 0,01 M Argininpuffer pH 8,5 äquilibrierte ®R-Sepharose-Säule (Pharmacia) chromatographiert. Die Elution erfolgte mit 0,02 M Na-Phosphat, 0,06 M NaCl. Das Eluat wurde nach dem Verdünnen auf das 2,5fache über eine mit 0,02 M Na-Phosphat pH 8,0 äquilibrierte ®S-Sepharose-Säule (Pharmacia) chromatographiert. Nach Waschen der Säule mit Äquilibrierungspuffer erhielt man durch Elution mit 0,05 M Na-Phosphat, 0,1 M NaCl, 0,1 M Arginin pH 8,6 SDS-Polyacrylamidgel-elektrophoretisch reines Protein.

So wurden durch Mutagenese mit den in Tabelle 1 aufgeführten Oligonukleotiden in der angegebenen Reihenfolge folgende TNF-Proteine hergestellt (Die Positionen geben die Stellung im TNF an, die verändert ist):

Position 9: Ser ersetzt durch Asp
Position 10: Asp ersetzt durch Lys
Position 10: Asp ersetzt durch Arg
Position 11: Lys ersetzt durch Glu
Position 15: His ersetzt durch Phe
Position 15: His ersetzt durch Asn
Position 26: Leu ersetzt durch Phe
Position 35: Ala ersetzt durch Leu
Position 46: Asn ersetzt durch Asp
Position 52: Ser ersetzt durch Asp
Position 54: Gly ersetzt durch Ala
Position 54: Gly ersetzt durch Val
Position 56: Tyr ersetzt durch Phe
Position 57: Leu ersetzt durch Ala
Position 59: Tyr ersetzt durch Phe
Position 60: Ser ersetzt durch Ala
Position 61: Gln ersetzt durch Ile
Position 62: Val ersetzt durch Ile
Position 62: Val ersetzt durch Leu
Position 78: His ersetzt durch Phe
Position 78: His ersetzt durch Asn
Position 87: Tyr ersetzt durch Phe
Position 87: Tyr ersetzt durch His
Position 95: Ser ersetzt durch Val
Position 98: Lys ersetzt durch Gln
Position 119: Tyr ersetzt durch Phe
Position 119: Tyr ersetzt durch Arg
Position 121: Gly ersetzt durch Ala
Position 121: Gly ersetzt durch Val
Position 133: Ser ersetzt durch Val
Position 136: Ile ersetzt durch Val
Position 137: Asn ersetzt durch Asp
Position 138: Arg ersetzt durch Asp
Position 138: Arg ersetzt durch Gly
Position 139: Pro ersetzt durch Asp
Position 139: Pro ersetzt durch Ile
Position 139: Pro ersetzt durch Gly
Position 140: Asp ersetzt durch Pro
Position 140: Asp deletiert
Position 141: Tyr ersetzt durch His
Position 141: Tyr deletiert
Position 142: Leu ersetzt durch Phe
Position 144: Phe ersetzt durch Ala
Position 144: Phe ersetzt durch Glu
Position 144: Phe ersetzt durch His
Position 144: Phe ersetzt durch Arg
Position 150: Val ersetzt durch Leu
Position 150: Val ersetzt durch Ile
Position 156: Ala ersetzt durch Val
Position 157: Leu ersetzt durch Gly.

Claims

1. TNF-Polypeptide der Formel worin jedoch mindestens eine Aminosäure in den Positionen 9, 10, 11, 15, 26, 35, 46, 52, 54, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 78, 87, 95, 98, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 144, 150, 156 und/oder 157 durch eine andere natürliche α-Aminosäure ersetzt und/oder deletiert ist und N-terminal 1 bis 7 Aminosäuren fehlen können, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.

2. TNF-Polypeptide gemäß Anspruch 1, in denen mindestens eine der folgenden Veränderungen vorliegt: Position 9: Ser ersetzt durch A
Position 10: Asp ersetzt durch A
Position 11: Lys ersetzt durch A
Position 15: His ersetzt durch B oder C
Position 26: Leu ersetzt durch C
Position 35: Ala ersetzt durch C
Position 46: Asn ersetzt durch A
Position 52: Ser ersetzt durch A
Position 54: Gly ersetzt durch C
Position 56: Tyr ersetzt durch C
Position 57: Leu ersetzt durch C
Position 59: Tyr ersetzt durch C
Position 60: Ser ersetzt durch C
Position 61: Gln ersetzt durch C
Position 62: Val ersetzt durch C
Position 78: His ersetzt durch C oder B
Position 87: Tyr ersetzt durch C
Position 95: Ser ersetzt durch C
Position 98: Lys ersetzt durch B
Position 119: Tyr ersetzt durch C oder A
Position 121: Gly ersetzt durch C
Position 133: Ser ersetzt durch C
Position 136: Ile ersetzt durch C
Position 137: Asn ersetzt durch A
Position 138: Arg ersetzt durch A oder B
Position 139: Pro ersetzt durch A, C oder B
Position 140: Asp ersetzt durch A, C oder deletiert
Position 141: Tyr ersetzt durch A oder deletiert
Position 142: Leu ersetzt durch C
Position 144: Phe ersetzt durch C oder A
Position 150: Val ersetzt durch C
Position 156: Ala ersetzt durch C
Position 157: Leu ersetzt durch B,worin A eine Aminosäure mit geladener Seitenkette, B eine Aminosäure mit polarer ungeladener Seitenkette und C eine Aminosäure mit hydrophober Seitenkette bedeuten.

3. DNA codierend für ein TNF-Polypeptid gemäß Anspruch 1.

4. Vektor enthaltend eine DNA gemäß Anspruch 3.

5. Wirtsorganismus enthaltend einen Vektor gemäß Anspruch 4.

6. Verfahren zur Herstellung eines TNF-Polypeptids gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wirtsorganismus nach Anspruch 5 züchtet und das TNF-Polypeptid daraus isoliert.

7. TNF-Polypeptide gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.

8. Verwendung der TNF-Polypeptide gemäß Anspruch 1 zur Bekämpfung von neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen.