DE3788684T2

DE3788684T2 - Peptide.

Info

Publication number: DE3788684T2
Application number: DE3788684T
Authority: DE
Inventors: Liselotte Langkjaer; Jan Markussen; Kjeld Norris
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1986-07-21
Filing date: 1987-07-20
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2007-07-21
Also published as: DE3788684D1; NO873018L; NO170978B; FI873185A7; PT85355B; NO873018D0; EP0254516A3; DE10075024I1; FI873185L; EP0254516B1; EP0254516A2; NZ221130A; ZA875295B; NL300018I1; YU135387A; DK347086D0; AU7591687A; ATE99699T1; HU203371B; FI873185A0

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Insulinverbindungen und neuartige injizierbare Lösungen mit verlängerter Insulinwirkung
In der Behandlung von Diabetes mellitus sind viele Arten von Insulinzubereitungen vorgeschlagen und verwendet worden. Einige dieser Zubereitungen sind schnellwirkend und andere Zubereitungen haben mehr oder weniger verlängerte Wirkungen. Solch eine verlängerte Wirkung kann durch Verabreichen des Insulins als eine Suspension von Insulinkristallen erhalten werden. Die kristallinen Zubereitungen können durch Kristallisation von Insulin in der Gegenwart von Zink (wie etwa Lente®, siehe Schlichtkrull: Insulin Crystals, Chemical and Biological Studies on Insulin Crystals and Insulin Zinc Suspensions, Munksgaard, 1958) oder durch Kristallisation von Insulin in der Gegenwart von Zink und Protamin (wie etwa NPH-Insulin, siehe Rep. Steno Mem. Hosp. 1 (1946) 60) erhalten werden.
Ein Nachteil in der Verwendung der bekannten Suspensionen von Zink-Insulin-Kristallen oder von Zink-Protamin-Insulin ist die Notwendigkeit, die Ampulle zu schütteln, um sicherzustellen, daß die richtige Menge an Insulin injiziert wird, und um sicherzustellen, daß die Insulin-Konzentration in der Ampulle während ihrer Verwendung konstant bleibt. In Penfill®-Patronen, wo keine Luft vorhanden sein darf, erfordern Insulinsuspensionen mit Langzeitwirkung die Einbeziehung eines Festkörpers in der Patrone, um Bewegung zu ermöglichen. Das Schütteln von Insulinsuspensionen und Insulinlösungen mit Luft ist in sich selbst ein unerwünschter Vorgang, da Insulin eine Neigung besitzt, unter Bildung von Fibrillen an Wasser/Luft- Grenzflächen zu denaturieren. Folglich sind Lösungen von Insulinen mit verlängerter Wirkung wünschenswert.
Lösung von Insulinderivaten mit einer verlängerten Wirkung wurden aus Insulin erhalten, das in seinen Aminogruppen durch Reaktion mit Phenylisocyanat modifiziert worden war (sogenanntes Iso-Insulin, siehe Hallas-Moeller: Chemical and Biological Insulin Studies based upon the Reaction between Insulin and Phenylisocyanate, Kopenhagen 1945). Ahnlich wurde berichtet, daß A1,B29-di-Boc-substituiertes Insulin (Boc bezeichnet tertiäres Butyloxycarbonyl) eine verlängerte Insulinwirkung nach subkutaner Verabreichung zeigt (siehe Geiger & Enzmann in: Proinsulin, Insulin, C-peptide; Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide, Tokushima 1978; Amsterdam-Oxford 1979, 306-310). Es wurde festgestellt, daß das A1,B29-di-Boc-substituierte Insulin eine zu geringfügig verlängerte Wirkung zeigt, um klinisch brauchbar zu sein.
Lösungen von nicht-modifizierten Insulinen erfordern große Mengen von Zink-Ionen (z. B. 0,4-1 mg/U Insulin), um eine verlängerte Wirkung zu zeigen (siehe J.Pharmacol. 55 (1935), 206). Injektion solcher großen Dosen von Zink-Ionen wird wahrscheinlich Schmerzen verursachen und solche Lösungen sind daher nie in der Therapie eingesetzt worden.
Der isoelektrische Punkt von Insulin liegt bei etwa 5,5, und Versuche sind unternommen worden, die Löslichkeit von Insulinderivaten bei neutralem pH durch Verschieben des isoelektrischen Punktes nach oben abzusenken, z. B. durch Additionen, im N-Terminus der B-Kette, von basischen Aminosäuren wie Lysin oder Arginin (siehe z. B. deutsche Offenlegungsschrift Nr. 2,042,299) oder mit dem basischen Dipeptid Arginyl-Arginin (siehe Geiger & Enzmann, oben zitiert). Nahe seinem isoelektrischen Punkt war jedoch die Löslichkeit von ArgB(-1)-ArgB0-Insulin viel höher als diejenige des Ursprungsinsulins.
Die japanische Patentveröffentlichung No. 55-144032 betrifft Analoge zu Human-Insulin, in denen die B30-Aminosäure durch eine Aminosäure mit wenigstens fünf Kohlenstoffatomen ersetzt worden ist, und Amide und Ester derselben. Diese Insulin-Analoge sollten in Patienten verwendet werden, die Antikörper gegen Säugetier-Insuline entwickelt hatten. In der japanischen Patentanmeldung werden sechs spezifische Verbindungen beschrieben, von denen bei keiner angegeben war, daß sie verlängerte Wirkung besaß. Keine spezifischen injizierbaren Zubereitungen wurden in der japanischen Patentanmeldung beschrieben.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 84108442.9 betrifft Insulin-Analoge, in denen eine basische, organische Gruppe an die B30-Aminosäure gebunden ist, wodurch eine positive Ladung bei neutralem pH eingeführt wird. In diesen Analogen ist die B30-Aminosäure neutral und vorzugsweise Threonin wie in Human-Insulin. Die deutsche Patentanmeldung Nr. 3,327,709.5 betrifft eine Suspension von Kristallen der in der obengenannten europäischen Patentanmeldung beschriebenen Derivate, sowie eine aromatische Hydroxyverbindung. Die deutsche Patentanmeldung Nr. 3,326,473.2 betrifft ein Medikament, das eine Mischung von Insulinverbindungen enthält, von denen wenigstens eine in der obengenannten europäischen Patentanmeldung beschrieben ist.
Die europäische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 194.864, die die Priorität vom 12. März 1985 in Anspruch nimmt, betrifft Insulin-Derivate, in denen der C-terminale B30-Rest immer durch eine Amido- oder Estergruppe blockiert ist und in denen die A21-Aminosäure immer Asparagin ist wie in Human- Insulin.

KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfaßt neuartige Analoge von Human- Insulin, die sich von Human-Insulin folgendermaßen unterscheiden:
a) fakultatives Vorhandensein eines Amid- oder Esterrestes an der C-terminalen Carboxylgruppe der B-Kette,
b) Aufweisen von wenigstens einer Ladung mehr als Human-Insulin bei pH 7, vorzugsweise nicht mehr als vier Ladungen mehr als Human-Insulin bei pH 7,
c) daß der C-terminale Asparaginrest der A-Kette, AsnA21, ersetzt ist durch irgendeine andere natürlich auftretende Aminosäure, die durch Nucleotidsequenzen kodiert werden kann,
d) wenn eine Ladungsveränderung durch Blockieren der Carboxyl-Gruppe in der B30-Aminosäure erreicht wird, ist der A21-Aminosäurerest verschieden von einem Asparagin-Rest.
Die Ladungsveränderung wird erreicht durch Ersetzen einer oder mehrerer der Aminosäurereste, verglichen mit Human-Insulin, und, falls gewünscht, durch das Blockieren der Carboxyl-Gruppe in der B30-Aminosäure.
Genauer sind die Verbindungen, die für die praktische Umsetzung dieser Erfindung von Interesse sind, wie folgt charakterisierbar: Eine oder mehrere der vier Glutaminsäure-Reste an A4, A17, B13, B21 sind ersetzt durch einen anderen natürlich auftretenden neutralen Aminosäurerest, vorzugsweise einem Glutamin-Rest; und/oder der Threonin-Rest an B27 ist statt dessen ein natürlich auftretender basischer Aminosäurerest, vorzugsweise ein L-Arginin- oder L-Lysin-Rest; und/oder der Threonin- Rest an B30 ist ersetzt durch eine oder zwei basische Aminosäurereste, wobei einer bevorzugt ist; die C-terminale Carboxyl-Gruppe der B-Kette kann geschützt sein und der Asparagin-Rest an A21 ist ersetzt durch einen L-Aminosäurerest.
Die Erfindung umfaßt auch Lösungen der unten angegebenen Verbindungen von Formel I, die fakultativ einen kontrollierten Gehalt an Zink-Ionen darin enthalten. Der Grad der Verlängerung der Insulinwirkung wird dadurch erhöht und kontrolliert.

DETAILLIERTE PRAXIS DIESER ERFINDUNG

Es ist überraschenderweise festgestellt worden, daß injizierbare Lösungen mit einer kombinierten kurzen und verlängerten Insulinwirkung hergestellt werden können, indem, als der aktive Bestandteil, ein einziges Insulin-Derivat mit der allgemeinen Formel I verwendet wird (A-Kette) (B-Kette)
wobei die Buchstaben A und B, gefolgt von Zahlen in Klammern, die Peptidfragmente der A- bzw. B-Ketten bezeichnen, angegeben durch die Zahlen in Klammern, E¹, E², E³ und E&sup4; identisch oder verschieden sind, wobei jedes einen Glutaminsäure-Rest oder einen neutralen Aminosäure-Rest darstellt&sub1; der durch Nucleotidsequenzen kodiert werden kann, x einen L-Threonin-, L-Arginin- oder L-Lysin-Rest darstellt, Y und Z identisch oder verschieden sind und jedes einen Aminosäurerest darstellt, in dem jede Seitenkettenaminogruppe acyliert sein kann und in dem jede Seitenkettenhydroxygruppe alkyliert sein kann, m und n identisch oder verschieden sind und jedes Null oder Eins darstellt, R Hydroxy oder einen Amido- oder Ester-Rest darstellt, der die C-terminale Carboxyl-Gruppe der B-Kette blockiert, und W einen Aminosäurerest darstellt, ausgenommen Asparagin, mit der weiteren Maßgabe, daß wenigstens einer der sechs Aminosäurereste E¹, E², E³, E&sup4;, W und X verschieden von den Aminosäureresten ist, die an den entsprechenden Positionen in Human-Insulin vorliegen, und daß wenigstens einer der acht Aminosäurereste E¹, E², E³, E&sup4;, W, X, Y, Z und die Gruppe R so ausgewählt sind, daß die Verbindung von Formel I wenigstens eine Ladung mehr als Human-Insulin bei einem pH-Wert von 7 besitzt.
Eine Untergruppe von Verbindungen von Formel I sind neuartige Verbindungen mit der allgemeinen Formel I, wobei die Buchstaben A und B, gefolgt von Zahlen in Klammern, die Peptidfragmente der A- bzw. B-Ketten bezeichnen, angegeben durch die Zahlen in Klammern, E¹, E², E³ und E&sup4; identisch oder verschieden sind, wobei jedes einen Glutaminsäurerest oder einen neutralen Aminosäurerest kodiert, der durch Nucleotidsequenzen kodiert werden kann, X einen L-Threonin-, L-Arginin- oder L-Lysin-Rest darstellt, Y und Z identisch oder verschieden sind und jedes einen Aminosäurerest darstellt, in dem jede Seitenkettenaminogruppe acyliert sein kann und in dem jede Seitenkettenhydroxygruppe alkyliert sein kann, m und n identisch oder verschieden sind und jedes Null oder Eins darstellt, R einen Amido- oder Esterrest darstellt, der die C-terminale Carboxyl-Gruppe der B-Kette blockiert, und W von einem Asparagin-Rest verschieden ist.
Verglichen mit Human-Insulin, wird die Ladungsveränderung durch Ersetzen des Threonin-Restes in der B27-Position durch einen Arginin- oder Lysin-Rest und/oder durch Ersetzen einer der vier Glutaminsäure-Reste in der A4-, A17-, B13- und B21- Position durch einen neutralen Aminosäurerest, vorzugsweise durch einen Glutamin-Rest, erhalten. Zusätzlich kann die C-terminale Carboxylgruppe der B-Kette durch eine Estergruppe oder Amidgruppe blockiert sein, wodurch die negative Ladung der Carboxylgruppe eliminiert ist. Außerdem kann eine positive Ladung durch einen basischen Aminosäurerest in der B30- und/oder B31-Position eingeführt werden.
Da Verbindungen von Formel I in der Klinik als Lösungen mit einer verlängerten Wirkung eingesetzt werden können, kann eine Abnahme in der Immunisierungsstärke auftreten, verglichen mit den üblicherweise verwendeten Suspensionen von Schweine- oder Human-Insulin.
Der Grad der Verlängerung kann durch Zugabe von Zink-Ionen erhöht und kontrolliert werden.
Hauptsächliche Parameter, die den Grad der Verlängerung der Insulinwirkung kontrollieren, sind, die Zinkkonzentration und die Wahl der Verbindung von Formel I. Der Bereich für bevorzugten Zinkgehalt erstreckt sich von 0 bis etwa 2 mg/ml, vorzugsweise von 0 bis 200 ug/ml Zink bei Substitution in der B13- und/oder B27-Position und vorzugsweise von etwa 20 bis 200 ug/ml bei anderen Analogen in einer Zubereitung, die 240 nmol einer Verbindung von Formel I pro ml enthält. Bei Verwendung anderer Konzentrationen der Verbindung von Formel I muß der Zinkgehalt entsprechend eingestellt werden.
Die verlängerte Wirkung von Lösungen von Verbindungen von Formel I in der Gegenwart von Zink-Ionen wird der niedrigen Löslichkeit solcher Verbindungen bei neutralem pH zugeschrieben.
Der pH der injizierbaren Lösung dieser Erfindung sollte vorzugsweise unter dem physiologischen pH liegen, wobei die obere Grenze der pH ist, wo Ausfällung auftritt. Bei dem physiologischen pH-Wert besitzen Verbindungen von Formel I dieser Erfindung eine niedrige Löslichkeit. Stabile Lösungen, die etwa 240 nmol/ml von Verbindungen von Formel I pro ml enthalten, sind bei einem pH von etwa 5,5 erhalten worden. Die obere Grenze hängt ab von den Bestandteilen der Lösung, d. h. Isotonikum, Konservierungsstoff und Zinkkonzentration, und von der Wahl der Verbindung von Formel I. Es gibt keine untere pH-Grenze der Lösungen und die chemische Stabilität der Verbindungen von Formel I, in denen W von Asparagin verschieden ist, ist hoch, sogar bei pH 3. Der bevorzugte pH-Bereich für die injizierbaren Lösungen dieser Erfindung reicht von etwa 2,5 bis 8,5, bevorzugter von etwa 4,5 bis 8. Insbesondere bevorzugt sind pH-Bereiche von etwa 2,5 bis 5,5, am bevorzugtesten etwa 3 bis 4,5.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist, daß sie verbesserte Flexibilität für die Patienten zur Verfügung stellt. Mit zwei wässerigen Lösungen, von denen eine eine Verbindung von Formel I enthält und die andere ein Zinksalz enthält, kann der Patient durch Vermischen der zwei Lösungen in geeigneter Weise einen gewünschten Grad an verlängerter Wirkung und ein gewünschtes Profil erhalten. So hat der Patient durch Verwendung von zwei Vorratslösungen die Möglichkeit eine Wirkung und ein Profil für die Morgeninjektion und eine andere Wirkung und ein anderes Profil für die Abendinjektion zu wählen. Vorzugsweise enthält die Zinklösung dieser Erfindung zwischen etwa 2 ug und 20 mg Zink pro ml. Alternativ können beide Vorratslösungen Zink enthalten, entweder in derselben oder verschiedenen Konzentrationen, und/oder beide Vorratslösungen können eine Verbindung von Formel I enthalten, entweder dieselbe oder verschiedene Verbindungen.
Vorzugsweise besitzen die injizierbaren Lösungen dieser Erfindung eine Stärke von etwa 60 und 6000 nmol der Verbindung von Formel I pro ml.
Wenn W nicht L-Asparagin ist, kann es eine neutrale L-Aminosäure sein, z. B. Valin, Glutamin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Tyrosin, Methionin oder vorzugsweise Glycin, Serin, Threonin, Alanin oder Homoserin. W kann eine saure Aminosäure sein, nämlich Glutaminsäure oder vorzugsweise Asparaginsäure, oder eine basische Aminosäure, nämlich Lysin, Arginin oder vorzugsweise Histidin.
Die neutrale Aminosäure (E¹ bis E&sup4;) ist z. B. Glycin, Valin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Tyrosin, Methionin oder vorzugsweise Asparagin, Glutamin, Alanin, Serin oder Threonin.
Beispiele für R sind Estereinheiten, z. B. Niederalkoxy, vorzugsweise Methoxy, Ethoxy und am bevorzugtesten tertiäres Butoxy.
Außerdem kann R eine Gruppe der allgemeinen Formel -NR¹R² sein, wobei R¹ und R² identisch oder verschieden sind und jedes Wasserstoff oder Niederalkyl darstellen. Im weiteren bezeichnet der Ausdruck "Nieder", daß die fragliche Gruppe weniger als 7 Kohlenstoffatome, vorzugsweise weniger als 5 Kohlenstoffatome enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist R -NH&sub2;. Außerdem kann R ein Lactam-Rest sein, der vorzugsweise weniger als 8 Atome im Lactamring enthält, z. B. ein Lactam einer Diaminocarbonsäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist R ungeladen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung sind die mit Y und Z bezeichneten Aminosäurereste Reste von L-Aminosäuren, die durch Nucleotidsequenzen kodiert werden.
Jede Seitenkettenaminogruppe in den mit Y und Z bezeichneten Aminosäureresten können durch eine Säure acyliert sein, die von 2 bis 18 Kohlenstoffatomen enthält, vorzugsweise eine Fettsäure, die von 6 bis 18 Kohlenstoffatome enthält, z. B. Laurinsäure. So kann Ym-Zn-R -Lys(Lau)-NH&sub2; sein.
Beispiele für bevorzugte alkylierte Hydroxygruppen sind Methoxy, Ethoxy und tertiäres Butoxy.
In einer Gruppe vor bevorzugten Verbindungen von Formel I ist Y und/oder Z ein basischer Aminosäurerest, wobei die Seitenkettenaminogruppe fakultativ acyliert ist (m = 1).
In einer anderen Gruppe von bevorzugten Verbindungen von Formel I ist n Null und Y ist ein basischer Aminosäurerest (m = 1).
In einer weiteren Gruppe von bevorzugten Verbindungen von Formel I sind Y und Z beide basische Aminosäurereste (m = 1, n = 1).
Eine andere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung sind Zubereitungen, die eine Verbindung von Formel I enthalten, wobei E¹, E², E³ und/oder E&sup4; ein Glutamin-Rest ist und/oder X Lys oder Arg ist und W Gly, Ser, Thr, Ala, His, Asp oder hSer ist, und in dieser Unterklasse von Verbindungen von Formel I sind eine weitere bevorzugte Ausführungsform Zubereitungen, die eine Verbindung von Formel I enthalten, in der die Gruppe -Ym-Zn-R -Thr-NH&sub2; oder -Lys-NH&sub2; ist.
Besonders bevorzugte Verbindungen von Formel I sind jede der folgenden: Human-Insulin,
Eine andere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung sind Zubereitungen, die eine Verbindung von Formel I enthalten, in der m Eins ist, n Null ist, Y Thr, Ala oder Ser ist, R Hydroxy ist und W Gly, Ser, Thr, Ala, His oder Asp ist, und Beispiel für solche Verbindungen sind wie folgt: Human-Insulin, Human-Insulin,
In einer Gruppe von bevorzugten Verbindungen von Formel I ist E² und E³ ein Glutamin-Rest.
In einer anderen Gruppe von bevorzugten Verbindungen von Formel I ist X ein Arginin- oder Lysin-Rest.
In einer weiteren Gruppe von bevorzugten Verbindungen von Formel I ist W Gly, Ser, Thr, Ala, His, Asp oder hSer.
Wie auf diesem Gebiet gut bekannt ist, sind nicht alle der Aminosäurereste in Human-Insulin wesentlich für die Insulinwirkung.
Tatsächlich sind Schweine-Insulin und Rinder-Insulin, die sich von Human-Insulin in Aminosäureresten unterscheiden, eingesetzt worden, um Diabetiker zu behandeln. Beträchtliche Variationen von Spezies zu Spezies existieren im Insulin-Molekül. So können viele Aminosäurereste im Human-Insulin-Molekül ohne übermäßige Verringerung in der Insulinaktivität verändert werden, einschließlich einiger Reste, die den isoelektrischen Punkt des Moleküls beeinflussen.
Es ist offensichtlich, daß die Gruppen, die mit E¹, E², E³, E&sup4;, R, W, X, Y und Z bezeichnet sind, so ausgewählt werden müssen, daß die resultierende Wirkung von Formel I pharmazeutisch annehmbar ist.
In den bekannten zweiphasigen Insulinzubereitungen ist es üblich, schnellwirkendes, lösliches Insulin mit kristallinem Insulin mit Langzeitwirkung in derselben Injektion zu kombinieren. Unter Verwendung von Verbindungen von Formel I dieser Erfindung kann eine ähnliche kombinierte Kurz- und Langzeitwirkung mit einer Lösung einer einzigen Verbindung von Formel I erhalten werden. Das Verhältnis zwischen Kurz- und Langzeitwirkung nimmt ab, wenn die Konzentration an Zink-Ionen in der Lösung erhöht wird.
Verbindungen von Formel I können durch eine Transpeptidierungsreaktion hergestellt werden, in der eine biosynthetische Vorläuferverbindung mit den richtigen Insulin-Disulfidbrücken mit der allgemeinen Formel II:
wobei A und B, gefolgt von Zahlen in Klammern, die geeigneten Peptidfragmente der A- bzw. B-Ketten bezeichnen, wie angegeben durch die Zahlen in Klammern, Q eine Peptidkette mit q Aminosäuren ist, q eine ganze Zahl von 0 bis 33, T Lys oder Arg ist, r Null oder Eins ist und E¹, E², E³, E&sup4;, W und X jedes wie oben definiert ist, mit einer Aminoverbindung der allgemeinen Formel III:
H-Ym-Zn-R,
wobei Y, Z, R, m und n jedes wie oben definiert ist und wobei Seitenkettenaminogruppen und -hydroxygruppen in Y und Z fakultativ mit Amino- und Hydroxy-Schutzgruppen blockiert sind, unter Verwendung von Trypsin oder einem trypsinähnlichen Enzym als einem Katalysator in einer Mischung von Wasser und organischen Lösungsmitteln in analoger Weise zur Reaktion gebracht werden, wie in U.S.-Patent No. 4,343, 898 beschrieben. Wenn W hSer ist, werden Nucleotide, die für Met kodieren, an der A21- Stelle in das Gen eingeführt. Im exprimierten Protein wird Konversion von Met zu hSer durch Cyanbromid erreicht. Bevorzugte Verbindungen von Formel III zur Verwendung in diesem Verfahren sind Thr-NH&sub2;, Lys(Boc)-NH&sub2;, Thr(But)-OBut, Thr-OBut, Ala-NH&sub2; und Arg(Boc)-NH&sub2;. Aminogruppen können durch Acylierung mit einer Fettsäure derivatisiert werden. Hydroxygruppen können durch Alkylierung geschützt werden. Wenn Y und Z Gruppen enthalten, die reversibel durch Amino-Schutzgruppen blockiert sind, können diese Gruppen in einem späteren Stadium entfernt werden, nachdem die aminogeschützte Zwischenstufe vom Trypsin oder trypsinähnlichen Enzym abgetrennt worden ist. Von den trypsinähnlichen Enzymen ist Lysyl-Endopeptidase aus Achromobacter lyticus brauchbar.
Die Verbindung von Formel II kann in einem Wirtsorganismus exprimiert werden, wie etwa Hefe, ähnlich zur Beschreibung in der europäischen Patentanmeldung-Veröffentlichungs-Nr. 163,529, unter Verwendung eines Gens mit den richtigen Codons für die fragliche Aminosäure. Das Gen, das das neuartige Insulinderivat kodiert, wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert, der, wenn transferiert in Hefe, die gewünschte Verbindung exprimieren kann. Das exprimierte Produkt wird dann aus den Zellen oder der Kulturbrühe isoliert, abhängig davon, ob es aus den Zellen sekretiert wird oder nicht.
Ein Beispiel einer reversiblen Amino-Schutzgruppe ist tertiäres Butoxycarbonyl und eine reversible Hydroxy-Schutzgruppe ist tertiäres Butyl. Solche Gruppen werden unter Bedingungen entfernt, die keine unerwünschte Veränderung in der Verbindung von Formel I bewirken, z. B. durch Trifluoressigsäure.
Änderungen in der A4-, A17-, A21-, B13-, B21- oder B27-Position können in geeigneter Weise gentechnologisch eingeführt werden, was es trypsinkatalysierter Semisynthese überläßt, den gewünschten C-terminalen Rest der B-Kette einzuführen.
Der Vorteil, die zusätzlichen positiven Ladungen innerhalb des Rahmens der 51 Aminosäuren des Insulinmoleküls einzuführen, um die neuartigen Verbindungen von Formel I zu bilden, statt durch Verlängerung der B-Kette über die 30 Reste der Säugetier-Insuline hinaus, betrifft die Einfachheit in der Darstellung. In der semisynthetischen Transpeptidierung wird ein großer molarer Überschuß des Aminosäureamids oder Aminosäureesters verwendet. Wenn ein Dipeptidamid oder -ester in der Transpeptidierungsreaktion verwendet werden soll, stehen entweder der Preis oder die Löslichkeit oder beides einer Verwendung in großem Oberschuß entgegen und folglich wird die Ausbeute des Produktes niedriger. Selbst wenn derselbe äquimolare Überschuß an z. B. Lys(Boc)-NH&sub2; oder Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH&sub2; in der Transpeptidierungsreaktion unter ähnlichen Bedingungen verwendet wird, wird die Ausbeute mit dem Aminosäureamid beträchtlich höher als mit dem Dipeptidamid.
Insulinzubereitungen dieser Erfindung werden hergestellt, indem eine Verbindung von Formel I in einem wäßrigen Medium bei leicht sauren Bedingungen, z. B. in einer Konzentration von 240 oder 600 nmol/ml gelöst wird. Das wäßrige Medium wird isotonisch gemacht, z. B. mit Natriumchlorid, Natriumacetat oder Glycerin. Außerdem kann das wässerige Medium Zink-Ionen in einer Konzentration von bis zu etwa 30 ug Zn&spplus;&spplus; pro nmol von Verbindung von Formel I, Puffer, wie etwa Acetat, Citrat und Histidin, und Konservierungsstoffe, wie etwa m-Cresol, Nipagin oder Phenol, enthalten. Der pH-Wert der endgültigen Insulinzubereitung hängt von der Anzahl Ladungen, die in der Verbindung von Formel I geändert worden sind, der Konzentration an Zink- Ionen, der Konzentration der Verbindung von Formel I und der ausgewählten Verbindung von Formel I ab. Der pH-Wert wird auf einen zur Verabreichung geeigneten Wert eingestellt, wie etwa 2,5-4,5, was Ausfällung verhindert. Die Insulinzubereitung wird durch Sterilfiltration steril gemacht.
Die Insulinzubereitungen dieser Erfindung werden ähnlich zur Verwendung der bekannten Insulinzubereitungen verwendet.
Jedes neue Merkmal oder jede neue Kombination von Merkmalen, die hier beschrieben ist, wird als wesentlich für diese Erfindung angesehen.
Die hierin für die Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind diejenigen, die in J. Biol. Chem. 243 (1968), 3558 angegeben sind. Die hierin angegebenen Aminosäuren sind in L-Konfiguration. In Formel I und anderswo hierin ist A(1-3) Gly-Ile-Val, A(5-6) ist Gln-Cys etc., vgl. die Aminosäuresequenz von Human- Insulin. Sofern nicht anders angegeben, sind die hierin angegebenen Spezies von Insulinen menschlich.

Synthese der Insulinverbindungen

Die Insulinquelle war ein Insulinvorläufer, exprimiert in Hefe, wie beschrieben in der europäischen Patentanmeldung-Veröffentlichungs-Nr. 163. 529.
Die Insulinvorläufer wurden aus den Fermentationsbrühen durch Adsorption an LiChroprep® RP-18 gewonnen, wie in Beispiel 7 derselben europäischen Patentanmeldung beschrieben. Die Vorläufer wurden aus der Säule mit 0,2 M KCl, 0,001 M HCl in 33% (v/v) Ethanol eluiert. Die Insulinvorläufer wurden aus dem Pool durch sukzessive Zugaben von Wasser (1 Volumenteil pro Volumenteil Pool), festem Trinatriumcitrat, um eine Molarität von 0,05 M zu erhalten, und schließlich Zinkacetat, um eine Molarität von 0,006 M zu erreichen, auskristallisiert. Der pH-Wert wurde auf 6,8 eingestellt und die Mischung wurde über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Die Kristalle wurden durch Zentrifugation isoliert, mit Wasser gewaschen und in vacuo getrocknet.
Geschützte Aminosäuren und geschützte Peptide für enzymatische Semisynthese wurden entweder durch Standardmethoden hergestellt oder entweder von Nova Biochem oder Bachem, beide Schweiz, bezogen (Kundensynthese).
Der Buchstabe ® nach einem Namen gibt an, daß er ein Warenzeichen ist.
Im Ausgangsmaterial in denen Beispielen 1 bis 14 wurde (Qq-T)r von Formel II als Ala-Ala-Lys gewählt und konstruiert, wie für Hefeplasmid pMT610 in Beispiel 10 in der europäischen Patentanmeldung-Veröffentlichungs-Nr. 163,529 beschrieben. Nucleotide, die für GlnB13, GlnA17, ArgB27, LysB27, AspA21, GlyA21, HisA21, SerA21 und ThrA21 kodieren, wurden in pMT610 durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung der Vorgehensweise in Nucl. Acids. Res. 11 (1983), 5103-5112, substituiert.

Beispiel 1

Synthese von Gln¹³, ArgB27-Human-Insulin

Zu einer Suspension von 5 g GlnB13, ArgB27, B(1-29)-Ala-Ala-Lys- A(1-21)-Insulinvorläufer in 50 ml 2 M Thr-OBut, CH&sub3;COOH (L-Threonin-tert.butylester-Hydroacetatsalz) in DMF wurden 25 ml 25,5% (v/v) Wasser in DMF (25,5 ml Wasser, DMF auf 100 ml), zugegeben. Die Suspension wurde auf 12ºC unter Rühren abgekühlt. Eine Lösung von 0,5 g Schweine-Trypsin in 12,5 ml einer 0.05 M wäßrigen Lösung von Calciumacetat wurde zugegeben. Rühren wurde bis zur Auflösung fortgesetzt. Nach 48 Stunden bei 12ºC wurden die Proteine durch Gießen der Lösung in 600 ml Aceton ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation isoliert, einmal mit 200 ml Aceton gewaschen, durch Zentrifugation isoliert und in einem Stickstoffstrom getrocknet. Der Niederschlag wurde in 100 ml 0,04 N Salzsäure gelöst, der pH-Wert wurde auf 2,5 eingestellt und die Lösung wurde auf eine 5 · 30 cm-Säule für präparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie (im weiteren als HPLC bezeichnet) aufgebracht, die mit Silica-Teilchen gepackt war, die mit Octadecyldimethylsilyl substituiert waren (mittlere Teilchengröße 15 Micron, Porengröße 100 Ångstrom). Die Säule wurde mit Ethanol/0,3 M wäßrige Lösung von Kaliumchlorid, 0,001 N Salzsäure, in einem Verhältnis von 35,5/64,5 (Volumenteile) äquilibriert. Die Proteine wurden aus der Säule mit denselben Puffer bei einer Rate von 2 Liter/h eluiert.
GlnB13, ArgB27, ThrB30-OBut-Human-Insulin wurde in einem Peak gefunden, der aus der Säule zwischen 55 und 100 min austrat. Das GlnB13, ArgB21, ThrB30-OButt-Human-Insulin wurde aus dem Pool durch sukzessive Zugaben von Wasser, um eine Ethanolkonzentration von 15% (v/v) herzustellen, festem Trinatriumcitrat, um eine Molarität von 0,05 M bezüglich Citrat zu erhalten, und festem Zinkchlorid, um eine Molarität von 0,006 M bezüglich Zink zu erhalten, isoliert. Der pH-Wert wurde auf 6,8 eingestellt und nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde die Kristallisation bei 4ºC für 24 Stunden unter Rühren fortgesetzt. Die Kristalle wurden abzentrifugiert, zweimal mit 20 ml eiskaltem Wasser gewaschen, abzentrifugiert und in vacuo getrocknet. Ausbeute: 2,51 g GlnB13, ArgB27, ThrB30-OBut-Human-Insulin.
GlnB13, ArgB27, ThrB30-OBut-Human-Insulin wurde in 100 ml Trifluoressigsäure gelöst und für 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Trifluoressigsäure wurde durch Lyophilisation entfernt. Das Lyophilisat wurde in 100 ml Wasser gelöst, der pH-Wert auf 2,5 eingestellt und 20 g Natriumchlorid wurden zugegeben. Der Salzkuchen, der aus GlnB13, ArgB27-Human-Insulin bestand, wurde durch Zentrifugation isoliert. Der Salzkuchen wurde in 850 ml Wasser gelöst und GlnB13, ArgB27-Human-Insulin wurde durch sukzessive Zugaben von 150 ml Ethanol, 14,7 g Trinatriumcitrat-Dihydrat und 0,82 g Zinkchlorid, gefolgt von Einstellung des pH-Wertes auf 6,8, auskristallisiert. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde die Kristallisation bei 4ºC für 24 Stunden unter vorsichtigem Rühren fortgesetzt. Die Kristalle wurden abzentrifugiert, zweimal mit 20 ml eiskaltem Wasser gewaschen, abzentrifugiert und in vacuo getrocknet. Ausbeute: 1,71 g GlnB13, ArgB27-Human-Insulin, entsprechend 36% entspricht.
Die Aminosäurezusammensetzung war in Obereinstimmung mit der Theorie, wobei Arginin 2 Reste/Molekül waren. Das Produkt war in DISC-PAGE-Elektrophorese rein, wobei die Wanderungsgeschwindigkeit 55% derjenigen von Human-Insulin betrug, was einer Differenz in den Ladungen von etwa 2 entspricht. Wegen Details der DISC-PAGE-Elektrophorese siehe Horm. Metab. Res. Supplement Series No. 5 (1974), 134. Der Zinkgehalt in den Kristallen betrug 0,42% (Gewicht/Gewicht).

Beispiele 2-6

Synthese von GlnB13, GlnA17-Human-Insulin, GlnA17, ArgB27-Human-Insulin, ArgB27-Human-Insulin, LysB2-Human-Insulin und HisA21, ArgB27 Human-Insulin

Die 5 Titelverbindungen wurden aus den entsprechenden einzelkettigen Insulinvorläufern synthetisiert, nämlich
unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Ausbeuten, Ladungen relativ zu Human-Insulin, Wanderungsgeschwindigkeiten relativ zu Insulin in DISC-PAGE-Elektrophorese bei pH 8,9 und Abweichungen in den Aminosäurezusammensetzungen von Human-Insulin erscheinen aus Tabelle I unten. Beispiele 7-13 Synthese von Human-Insulin,
Der 7 Titelverbindungen wurden synthetisiert aus den entsprechenden einzelkettigen Insulinvorläufern, nämlich
durch tryptische Transpeptidierung in organischer wäßriger Lösung in der Gegenwart von Thr-NH&sub2;, wie beschrieben in der europäischen Patentanmeldung-Veröffentlichungs-Nr. 194.864, Beispiele 4 und 6. Ausbeuten, Ladungen relativ zu Human-Insulin, Wanderungsgeschwindigkeiten relativ zu Insulin in DISC-PAGE-Elektrophorese bei pH 8,9 und Abweichungen in den Aminosäurezusammensetzungen von Human-Insulin erscheinen aus Tabelle I.

Beispiel 14

Synthese von AspA21, ArgB27, LysB30-NH&sub2;-Human-Insulin

Die Titelverbindung wurde synthetisiert aus dem entsprechenden einzelkettigen Insulinvorläufer, nämlich AspA21, ArgB27, B(1-29)- Ala-Ala-Lys-A(1-21) durch tryptische Transpeptidierung in organischer wäßriger Lösung in der Gegenwart von Lys(Boc)-NH&sub2;, Reinigung der Zwischenstufe, Lys(Boc)B30-NH&sub2;-Human-Insulin, gefolgt von Entfernen der Boc-Schutzgruppe durch TFA, wie beschrieben in der europäischen Patentanmeldung-Veröffentlichungs-Nr. 194.864, Beispiele 5 und 7. Ausbeute und analytische Daten sind in Tabelle I dargestellt. Tabelle I Substitution in Human-Insulin Ausbeute, Ladung relativ zu Human-Insulin bei pH 7 Wanderungsgeschwindigkeit bei pH 8,9, % relativ zu Human-Insulin Abweichungen in den Aminosäurezusammensetzungen von Human-Insulin nach Säurehydrolyse, Reste/Molekül keine

Beispiel 15

Herstellung von injizierbaren Lösungen von Verbindungen von Formel I

Sterile injizierbare Lösungen der Verbindungen von Formel I zur Testung des Grades an verlängerter Wirkung wurden hergestellt unter Verwendung von 1,6% (w/v) Glycerin als dem Isotonikum, unter Verwendung von 0,3% (w/v) m-Cresol als dem Konservierungsstoff und unter Pufferung mit 0,01 M Natriumacetat. Die Konzentration an Zink-Ionen betrug 8 oder 80 ug/ml. Die pH-Werte der Lösungen wurden genügend weit weg vom isoelektrischen Punkt der Verbindungen von Formel I eingestellt, um die Lösungen bei Lagerung bei 4ºC klar zu halten. Die Lösungen enthielten 240 nmol/ml der Verbindungen von Formel I. Die Konzentration von 240 nmol/ml wurde ermittelt durch Messung der Extinktion bei 276 nm einer konzentrierteren Vorratslösung, die frei von m-Cresol war, unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für Schweine-Insulin von 6100 für diese Derivate (siehe Handbuch der Inneren Medizin, Bd. 7/Teil 2A, Herausgeber: Oberdisse, 1975, 113). Für die Monokomponente Schweine-Insulin beträgt die ermittelte Potenz 28,5 U/mg Trockensubstanz (siehe Diabetes Care, Vol. 6/Supplement 1 (1983), 4), nämlich 1 U entspricht 5,95 nmol.
Injizierbare Lösungen, die 240 nmol/ml der Verbindungen von Formel I enthielten, wie in Tabelle II angegeben, und mit den PH-werten und Zinkgehalten, die darin angegeben sind, wurden hergestellt.

Test auf Verlängerung der Insulinwirkung

Die Verlängerung der hypoglykämischen Wirkung, die durch die injizierbaren Lösungen von Insulin bewirkt wird, wurde gemäß British Pharmacopoeia 1980, A 142, in gefasteten Kaninchen getestet. Jede Testlösung wurde subkutan in einer Dosis von 14,3 nmol pro Kaninchen 12 Tieren verabreicht, die 3-4 kg wogen, und der Verlauf der Hypoglykämie wurde über 6 Stunden verfolgt. Zum Vergleich wurden die schnellwirkende Zubereitung Actrapid®-Schweine-Insulin und das mittelwirkende Monotard®- Human-Insulin in die Tests einbezogen. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle II dargestellt. Tabelle II Verbindung von Formel I Glucose in % vom Anfangswert Human-Insulin Actrapid®-Schweine Insulin Monotard®-Human-Insulin
Die Potenzen von Insulinverbindungen wurden im Mäuseblut-Zuckermangeltest (British Pharmacopoeia 1980, A 141 - A 142) ermittelt. Um das Problem der Schätzung der Potenz von Insulinen mit einem vom Standard unterschiedlichen Timing zu minimieren, wurden Insulinlösungen für Potenzbestimmungen ohne Zugaben von Zink hergestellt. Lösungen wurden hergestellt, die 240 nmol/ml enthielten, basierend auf der Extinktion bei 276 nm. Der Zinkgehalt von Lösungen betrug 8-10 ug/ml, der aus den kristallinen Derivaten stammte. Die geschätzten Potenzen einiger Insulinverbindungen sind in Tabelle III unten dargestellt. Tabelle III Potenz relativ zu Insulin, % Vertrauensgrenze Human-Insulin
Die in der vorstehenden Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in jeder ihrer Kombinationen, Gegenstand für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein.

Claims

1. Verbindungen der allgemeinen Formel I (A-Kette) (B-Kette)

wobei die Buchstaben A und B, gefolgt von Zahlen in Klammern, die Peptidfragmente der A- bzw. B-Ketten bezeichnen, angegeben durch die Zahlen in Klammern, E¹, E², E³ und E&sup4; identisch oder verschieden sind, wobei jedes Glutaminsäure oder einen neutralen Aminosäurerest darstellt, der durch Nucleotidsequenzen kodiert werden kann, X einen L-Threonin-, L-Arginin- oder L-Lysin-Rest darstellt, Y und Z identisch oder verschieden sind und jedes einen Aminosäurerest darstellt, in dem jede Seitenkettenaminogruppe acyliert sein kann und in dem jede Seitenkettenhydroxygruppe alkyliert sein kann, m und n identisch oder verschieden sind und jedes Null oder Eins darstellt und R Hydroxy oder einen Amino- oder Esterrest darstellt, der die C-terminale carboxylgruppe der B-Kette blockiert, und W einen Aminosäurerest, ausgenommen Asparagin, darstellt, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der sechs Aminosäurereste E¹, E², E³, E&sup4;, W und X von den in den entsprechenden Positionen in Human-Insulin vorliegenden Aminosäureresten verschieden ist und daß wenigstens einer der acht Aminosäurereste E¹, E², E³, E&sup4;, W, X, Y und Z und die Gruppe R so ausgewählt sind, daß die Verbindung von Formel I wenigstens eine Ladung mehr als Human-Insulin bei einem pH-Wert von 7 besitzt.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X ein Lysin- oder Arginin-Rest ist.

3. Verbindungen nach einem der vorangehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß E² und E³ jeweils ein Glutamin-Rest ist.

4. Verbindungen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Y und/oder Z ein basischer Aminosäurerest ist, in dem die Seitenkettenaminogruppe fakultativ acyliert ist (m = 1).

5. Verbindungen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß n Null ist und Y ein basischer Aminosäurerest ist (m = 1).

6. Verbindungen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Y und Z beide basische Aminosäurereste sind (m = 1, n = 1).

7. Verbindungen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Gruppe der allgemeinen Formel -NR¹R² wobei R¹ und R² identisch oder verschieden sind und jedes Wasserstoff und Niederalkyl darstellt und R vorzugsweise NH&sub2; ist.

8. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß R Niederalkoxy, vorzugsweise tertiäres Butyloxy ist.

9. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß R ein Rest eines Lactams ist, der vorzugsweise weniger als 8 Atome im Lactamring enthält.

10. Verbindungen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß W Gly, Ser, Thr, Ala, His, Asp oder hSer ist.

11. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Human-Insulin, Human-Insulin, Human-Insulin,

12. Injizierbare Lösungen mit verlängerter Insulinwirkung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung der allgemeinen Formel I enthalten (A-Kette) (B-Kette)

wobei die Buchstaben A und B, gefolgt von Zahlen in Klammern, die Peptidfragmente der A- bzw. B-Ketten bezeichnen, angegeben durch die Zahlen in Klammern, E¹, E², E³ und E&sup4; identisch oder verschieden sind, wobei jedes Glutaminsäure oder einen neutralen Aminosäurerest darstellt, der durch Nucleotidsequenzen kodiert werden kann, X einen L-Threonin-, L-Arginin- oder L-Lysin-Rest darstellt. y und Z identisch oder verschieden sind und jedes einen Aminosäurerest darstellt, in dem jede Seitenkettenaminogruppe acyliert sein kann und in dem jede Seitenkettenhydroxygruppe alkyliert sein kann, in und n identisch oder verschieden sind und jedes Null oder Eins darstellt und R Hydroxy oder einen Amido- oder Esterrest darstellt, der die C-terminale Carboxylgruppe der B-Kette blockiert, und W einen Aminosäurerest, ausgenommen Asparagin, darstellt, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der sechs Aminosäurereste E¹, E², E³, E&sup4;, W und X von den in den entsprechenden Positionen in Human-Insulin vorliegenden Aminosäureresten verschieden ist und daß wenigstens einer der acht Aminosäurereste E¹, E², E³, E&sup4;, W, X, Y und Z und die Gruppe R so ausgewählt sind, daß die Verbindung von Formel I wenigstens eine Ladung mehr als Human-Insulin bei einem pH-Wert von 7 besitzt.

13. Zubereitung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie Zink-Ionen enthält, vorzugsweise von etwa 2 ug bis etwa 2 mg Zink pro ml, am bevorzugtesten von etwa 5 ug bis 200 ug Zink pro ml.

14. Zinklösung zur Verwendung bei der Herstellung einer Lösung mit verlängerter Wirkung gemäß Anspruch 12, indem sie mit einer Lösung vermischt wird, die eine Verbindung von Formel I, angegeben in Anspruch 11, enthält, wobei diese Zinklösung vorzugsweise zwischen etwa 10 ug und 20 mg Zink pro ml enthält.

15. Verfahren zur Herstellung einer Lösung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung einer Verbindung von Formel I, angegeben in Anspruch 12, die fakultativ Zink enthält, mit einer Zinklösung vermischt wird, die fakultativ eine Verbindung von Formel I, angegeben in Anspruch 12, enthält, was eine Mischung mit einer Zinkkonzentration von bis zu 2 mg/ml ergibt, und vorzugsweise der Gehalt an Zink in jeder der zwei Lösungen geringer ist als etwa 4 mg/ml.

16. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, angegeben in Anspruch 12, gekennzeichnet durch Transpeptidierung eines Insulinvorläufers der allgemeinen Formel II:

wobei A und B Fragmente der A- und B-Ketten bezeichnen, angegeben durch Zahlen in Klammern, Q eine Peptidkette mit q Aminosäuren ist, q eine ganze Zahl von 0 bis 33 ist, T Lys oder Arg ist und r Null oder Eins ist und E¹, E², E³, E&sup4;, W und X jeweils sind, wie in Anspruch 12 definiert, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III:

H-Ym-Zn-R,

in der Y, Z, R, m und n jeweils sind, wie oben definiert, und wobei Seitenkettenaminogruppen und -hydroxygruppen in Y und Z fakultativ mit Amino- und Hydroxy-Schutzgruppen blockiert sind, unter Verwendung von Trypsin oder einem trypsinähnlichen Enzym als einem Katalysator.