DE3787350T2

DE3787350T2 - Insektresistente Tomatenpflanzen.

Info

Publication number: DE3787350T2
Application number: DE87870161T
Authority: DE
Inventors: David Allen Fischhoff; Stephen Gary Rogers
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1986-11-20
Filing date: 1987-11-19
Publication date: 1994-04-21
Anticipated expiration: 2007-11-20
Also published as: EP0269601A3; EP0269601A2; EP0269601B2; ES2003838A4; ATE94209T1; IL84536A0; JPS63160577A; EP0269601B1; ES2003838T3; DE3787350D1; ZA878674B

Description

Bacillus thuringiensis ist ein sporenbildendes Bodenbakterium, das für seine Fähigkeit, ein für eine große Vielfalt von Schmetterlingslarven toxisches parasporales kristallines Protein zu erzeugen, bekannt ist. Die Kristalle, die etwa 20 bis 30% des Trockengewichts von sporenbildenden Kulturen ausmachen, bestehen in erster Linie aus einem einzigen Protein mit hohem Molekulargewicht (-134 Kilodalton (KD)), welches nur während der Sporenbildung erzeugt wird. Das kristalline Protein wird im Bakterium als Protoxin erzeugt, das im Darm sensitiver Larven aktiviert wird, um ein toxisches Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 67 KD zu erzeugen.
Zu Insekten, die für die Wirkung des Proteintoxins von Bacillus thuringiensis-Bakterien bei Schmetterlingen sensitiv sind, gehören (nicht ausschließlich) der Tomatenspringwurm (Keiferia lycopersicella), die Tabakschwärmerraupe (Manduca sexta), die Tomatenschwärmerraupe (Maduca quinquemaculata), die Zuckerrübeneule (Spodoptera exigua), die Kohlspannerlarve (Trichoplusia ni) und die Tomatenschwärmerraupe (Heliothis zea und Heliothis virescens). Larven dieser Insekten sind dafür bekannt, daß sie von Tomatenpflanzen leben.
Handelsübliche Insektizidpräparate, die durch Bacillus thuringiensis erzeugte Sporen und kristalline Proteine enthalten, sind unter solchen Namen, wie DIPEL® und THURICIDE® erhältlich. Zu bemerkenswerten Einschränkungen beim Einsatz handelsüblicher Präparate des kristallinen Proteintoxis von B. thuringiensis gehören u. a. die erforderlichen wiederholten Anwendungen der Insektizidpräparate. Ein anderer Nachteil besteht darin, daß das kristalline Protein nur während des Sporenbildungsstadiums des Lebenszyklus von B. thuringiensis erzeugt wird. Eine derartige Wachstumsphasenbeschränkung kann insbesondere in einem industriellen Prozeß zu Unannehmlichkeiten und einem übermäßigen Zeitaufwand während der Herstellung führen. Bei Beendigung der Sporenbildung geben die selbstauflösenden Zellen sowohl Sporen als auch Kristalle in das Kulturmedium ab. Aus Umweltschutzgründen ist es wünschenswert, daß handelsübliche Insektizidpräparate im wesentlichen frei von Sporen sind. Leider ist aufgrund der Ähnlichkeit von Sporen und kristallinem Proteintoxin hinsichtlich Größe und Dichte eine Trennung der Kristalle von den Sporen kompliziert und mühsam und somit kostspielig. Weiters kann es durch Belastungen aufgrund von Wachstumsphasenbeschränkungen oder anderen Faktoren dazu kommen, daß Präparate von B. thuringiensis ihre Fähigkeit, Kristalle zu produzieren, verlieren; solche kristallose Stämme haben keine insektizide Aktivität.
Die Isolierung von DNA aus B. thuringiensis, welche für das kristalline Proteintoxin kodiert, und die Insertion dieser DNA in Expressionsvektoren zur Transformation von Bakterienspezies und Pflanzenspezies ist bekannt.
Die EP-A-0 193 259 offenbart ein chimäres Pflanzengen, umfassend:
(i) einen in Pflanzen wirksamen Promotor, nämlich den MAS (PTR2)-Promotor;
(ii) eine Sequenz, welche für das B.t. Toxin kodiert; und
(iii) eine 3'-Sequenz, die nicht translatiert wird und ein funktionelles Poly(A)-Signal enthält.
Die EP-A-0 142 924 offenbart ein analoges Gen unter der Steuerung des "1,6"-Bereichs der T-DNA (d. h. des MAS-Promotors) oder des CaMV 35S-Promotors.
Weiters beschreiben die EP-A-0 193 259 und EP-A-0 142 924 Verfahren zur Herstellung genetisch transformierter Nachtschattengewächse mit einer Toxizität gegenüber Schmetterlingslarven, transformierte Pflanzenzellen und differenzierte Pflanzen.
S. McCornick et al., Plant Cell Reports, 5, 81-84, (1986) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung genetisch transformierter Tomatenpflanzen über ein Blattscheiben Transformations/Regenerationssystem. Die geoffenbarten Resultate erbrachten einen Nachweis sowohl für Einzelkopie als auch für Mehrfachkopie-Insertionen der T-DNA, wiesen den Erbgang des T- DNA-Inserts in den erwarteten Mendel-Verhältnissen nach, und zeigten, daß mehrere heterologe Promotoren in Tomatenpflanzen wirken.
Der Stand der Technik lehrt jedoch nicht auf spezielle und befähigende Weise, wie eine solche DNA in das Genom einer Tomatenpflanze insertiert werden kann, damit das Toxin eine insektizide Aktivität gegen sensitive Schmetterlingslarven aufweist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht die Kodiersequenz für ein kristallines Proteintoxin von Bacillus thuringiensis, Subspezies kurstaki HD-1.
Fig. 2 veranschaulicht die Herstellung von Plasmid pMON9733.
Fig. 3 veranschaulicht die Herstellung von Plasmid pMAP17.
Fig. 4 veranschaulicht die Herstellung von Plasmid pMON294.
Fig. 5 veranschaulicht die Herstellung von Plasmid pMON8053.
Fig. 6 veranschaulicht die Herstellung von Plasmid pMON9712.
Fig. 7 veranschaulicht die Herstellung von Plasmid pMON9741.
Fig. 8 veranschaulicht die Herstellung von Plasmid pMON9756.
Fig. 9 veranschaulicht den Aufbau von Plasmid pMON316.

Darlegung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zum Transformieren von Tomatenpflanzen, so daß sie gegenüber sensitiven Schmetterlingslarven toxisch sind. Genauergesagt betrifft die vorliegende Erfindung transgene Tomatenpflanzen, die das Toxinprotein von Bacillus thuringiensis in einem insektiziden Ausmaß exprimieren.
Gemäß einem Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung chimäre Gene, die in Tomatenpflanzen wirken und transgene Tomatenpflanzen erzeugen, welche eine Toxizität gegenüber sensitiven Schmetterlingslarven aufweisen. Die Expression eines Pflanzengens, das als doppelsträngige DNA-Form existiert, beinhaltet die Transkription von Messenger-RNA (mRNA) von einem Strang der DNA durch RNA-Polymerase und die Prozessierung des mRNA-Primärtranskripts im Kern. Diese Prozessierung schließt einen nicht translatierten 3'-Bereich ein, der Polyadenylatnukleotide an das 3'-Ende der mRNA anfügt.
Die Transkription von DNA in mRNA wird durch einen DNA- Bereich geregelt, der üblicherweise als "Promotor" bezeichnet wird. Der Promotorbereich enthält eine Sequenz von Nukleotiden, die der RNA-Polymerase anzeigt, sich mit der DNA zu vereinigen und die Erzeugung eines mRNA-Transkripts unter Verwendung des nach dem Promotor befindlichen DNA-Stranges als Matrize zur Herstellung eines korrespondierenden RNA-Stranges einzuleiten.
In der Literatur wurde eine Reihe von Promotoren beschrieben, die in Pflanzenzellen aktiv sind. Diese sind u. a. Nopalinsynthase- (NOS), Octopinsynthase- (OCS) und Mannopinsynthase- (MAS) Promotoren (die sich auf tumorinduzierenden Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens befinden), die Karfiolmosaikvirus (CaMV) 19S- und 35 S-Promotoren und der lichtinduzierbare Promotor aus der kleinen Untereinheit der Ribulosebis-phosphat-carboxylase (ssRuBISCO, ein sehr häufig vorkommendes Pflanzenpolypeptid). Diese Promotortypen wurden zur Schaffung verschiedener Arten von DNA-Konstrukten verwendet, die in Pflanzen exprimiert wurden; siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO 84/02913 (Rogers et al., Monsanto).
Promotoren, die bekannter- oder erwiesenermaßen die Erzeugung eines mRNA-Transkripts in Pflanzenzellen bewirken, können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die gewählten Promotoren sollten eine ausreichende Expression bewirken können, mit dem Ergebnis, eine wirksame Menge von Toxinprotein zu erzeugen, um die Pflanze toxisch für Schmetterlinglarven zu machen. Der Fachmann wird erkennen, daß die zur Induzierung der gewünschten Toxizität notwendige Menge an Toxinprotein je nach der speziellen Schmetterlingslarve, vor der geschützt werden soll, variieren kann. Dementsprechend werden zwar die CaMV35S- und MAS-Promotoren bevorzugt, doch können diese Promotoren selbstverständlich nicht für alle Ausführungsformen der Erfindung optimale Promotoren sein.
Die durch das chimäre Gen erzeugte mRNA enthält auch eine nicht translatierte 5'-Leadersequenz. Diese Sequenz kann von dem speziell gewählten Promotor stammen, wie dem CaMV35S- oder MAS- Promotor. Der nicht translatierte 5'-Bereich kann auch von anderen geeigneten Eukaryotengenen oder einer synthetischen Gensequenz erhalten werden. Der Fachmann wird erkennen, daß die vorausgesetzte Funktionalität der nicht translatierten 5'- Leadersequenz die verbesserte Bindung des mRNA-Transkripts an die Ribosomen der Pflanzenzelle zwecks Verbesserung der Translation der mRNA bei der Erzeugung des kodierten Polypeptids ist.
Das chimäre Gen enthält auch eine strukturelle Kodiersequenz, die für das toxische Protein von Bacillus thuringiensis kodiert. Es ist bekannt, daß B. thuringiensis-Bakterien vom Schmetterlingstyp typischerweise drei Toxingene enthalten, die auf Basis von jedem Gen zugeordneten spezifischen HindIII- Restriktionsfragmenten klassifiziert wurden, siehe Kronstad et al. (1983). Diese Gene werden üblicherweise als 4,5-, 5,3- und 6,6-Gene bezeichnet, basierend auf der Größe der daraus erhaltenen HindIII-Fragmente. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung folgt selbstverständlich, daß die Kodiersequenz für ein als Insektizid aktives Toxin von jedem der drei Gene stammen kann. Somit wird für Zwecke der vorliegenden Erfindung unter "Toxinprotein" das Toxin voller Länge, wie es natürlich von Bacillus thuringiensis erzeugt wird, verstanden.
Der Fachmann wird erkennen, daß Promotoren, die in einer speziellen Ausführungsform nützlich sind, gezwungenermaßen von der Stabilität des mRNA-Transkripts abhängen.
Zur deutlichen und kurzen Erläuterung beschreiben die folgenden Beispiele chimäre Genkonstrukte, bei denen strukturelle Kodiersequenzen verwendet werden, die von einem Toxingen vom "5,3-Typ" aus einem B. thuringiensis-Isolat, Subspezies kurstaki HD-1, stammen. Der Fachmann wird erkennen, daß andere Subspezies von Bacillus thuringiensis eine Toxizität gegenüber den vorgenannten Schmetterlingsinsekten aufweisen. Diese anderen Subspezies sind u. a. B.t. kurstaki HD-1 Dipel (PCT-Veröffentlichung WO 86/01536), B.t. sotto, B.t. berliner, B.t. thuringiensis, B.t. tolworthi, B.t. dendrolimus, B.t. alesti, B.t. galleriae, B.t. aizawai und B.t. subtoxicus. Selbstverständlich kann man eine Kodiersequenz, die für ein Toxinprotein aus einer der oben zitierten B.t.-Subspezies oder andere kodiert, ohne übermäßige Experimente synthetisieren oder isolieren und Tomatenpflanzen transformieren, so daß sie toxisch für sensitive Schmetterlingslarven sind, wie hierin beschrieben. Demgemäß werden solche Abänderungen und Abweichungen als in den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallend betrachtet. Weiters sei bemerkt, daß der Expressionsgrad je nach der speziell verwendeten Toxinkodiersequenz variieren dann und daß der Toxizitätsbereich gegenüber Schmetterlingslarven je nach der Quelle der Toxinkodiersequenz (d. h. verschiedene B.t.- Subspezies) variieren kann.
Die Isolierung von DNA-Sequenzen, die für das Toxinprotein von B. thuringiensis kodieren, ist gut bekannt. Die Kodiersequenzen aus den oben zitierten B.t.-Subspezies sind untereinander ziemlich homolog, insbesondere im N-terminalen Bereich der Kodiersequenz. Diese Homologie ist bei der Isolierung von Toxinprotein-Kodiersequenzen nützlich, da sich eine DNA-Sonde, die bei der Isolierung von B.t.-Subspezies kurstaki HD-1 nützlich ist, wie nachstehend beschrieben, auch für die Isolierung von Toxinkodiersequenzen aus anderen Subspezies eignen würde. Die Aminosäuresequenz des aus Bacillus thuringiensis, Subspezies kurstaki HD-1, isolierten kristallinen Proteintoxingens wurde zum Teil nach der Methode von Hunkapiller et al. (1983) bestimmt. Diese Sequenzen wurden unter Verwendung der DNA-Sequenz des NH&sub2;-terminalen Teils des kristallinen Proteingens, wie von Wong et al. (1983) beschrieben, verifiziert. Synthetische Oligonukleotidsequenzen, die auf einer aus dem kristallinen Protein Polypeptid bestimmten Aminosäuresequenz basieren, wurden nach der Vorgangsweise von Beaucage et al. (1981) hergestellt. Die hergestellten Oligonukleotidsonden sind in der nachstehenden Tabelle I aufgezeigt. Tabelle I SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDSONDEN Größe Sondensequenz B.t.-Proteinbereich 1200 bp-Bereich 27-31-Aminosäurebereich * numeriert vom NH&sub2;-terminalen Ende weg
Plasmid-DNA aus B. thuringiensis, Subspezies kurstaki HD-1, wurde aus 1 bis 2 Litern Kultur gemäß dem Verfahren von Kronstad et al. (1983) gereinigt. Sämtliche Plasmidpräparationen wurden zumindest einmal über einen CsCl/Ethidiumbromid-Gradienten gereinigt. Plasmide mit einer Größe von 30 Megadalton und höher wurden vorzugsweise isoliert.
Der Verdau mit den Restriktionsenzymen EcoRI, PstI, HindIII, BamHl und SmaI wurde unter den vom Zulieferer (Boehringer Mannheim) empfohlenen Bedingungen ausgeführt. Escherichia coli Stamm JM 101 (Messing et al. 1981) und Stamm SR-200 wurden als Rezipienten für den Transformationsschritt verwendet. Kompetente Zellen wurden nach standardverfahren (Dagert et al. 1979) hergestellt. Mit Plasmid pUC8 transformierte Kolonien wurde auf L-Agar mit 100 ug/ml Ampicillin und 40 ul 4%igem 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D- galactopyranosid (X-gal) aufgebracht.
Plasmid-DNA wurde nach dem Verfahren von Southern (1975) auf Nitrocellulose transferiert. Eine Vorhybridisierung erfolgte durch Inkubieren des Nitrocellulosepapiers mit der gebundenen transferierten DNA in einer Prähybridisierungsflüssigkeit, 10 X Denhardts (0,2% BSA, 0,2% Ficoll, 0,2% Polyvinylpyrrolidon) und 6 X SSC (0,9 M NaCl, 0,09 M Natriumcitrat) 2 bis 4 Stunden lang bei 37ºC. Die Hybridisierung erfolgte durch Inkubieren des Nitrocellulosepapiers 8 bis 10 Stunden lang mit 10 bis 11 ml Prähybridisierungsflüssigkeit und der markierten Sonde. Nach mehreren Waschungen mit 6 X SSC bei steigenden Temperaturen (30 bis 45ºC) wurde mit dem Papier ein Röntgenstrahlenfilm belichtet.
BamHI-verdautes pBR328 (100 ng), das mit alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) behandelt worden war, wurde mit 500 ng B. thuringiensis Plasmid-DNA, verdaut mit BamHI, versetzt und ligiert. CaCl&sub2;-präparierte kompetente E. coli SR 200 wurden transformiert und durch Ampicillin-Resistenz selektiert und auf Tetracyclin-Empfindlichkeit untersucht. Eine Analyse mittels Miniplasmid-Herstellungsverfahren (Maniatis et al. 1982) identifizierte zwei Klone mit dem richtigen 16 KB- Insert. Eine Hybridisierungsanalyse nach Southern mit radiomarkierten Sonden aus Tabelle I zeigte, daß das DNA- Fragment, das die zur synthetischen Sonde hybridisierende Sequenz enthielt, subkloniert war. Die beiden Plasmide, die mit pMAP1 und pMAP2 bezeichnet wurden, unterschieden sich nur hinsichtlich der Ausrichtung des DNA-Fragmente innerhalb des Vektors. Diese Plasmidstrukturen erzeugten Material, das bei Western-Blot-Analyseverfahren (Geshoni et al. 1979) mit B.t. kristallinem Proteintoxin-Antikörper kreuzreagierte. Es wurde eine Restriktionskarte des insertierten B.t.-Fragments erstellt, und vier EcoRI (E)-Stellen und drei HindIII (H)-Stellen wurden zwischen den BamHI (B)-Stellen lokalisiert. Dies läßt sich schematisch folgendermaßen darstellen:
E. coli-Stamm SR200, enthaltend pMAP2, ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA (im folgenden "ATCC") hinterlegt und hat die ATCC- Zugriffsnummer 39800.
Ein 8,1 Kb BamHI-PstI-Fragment wurde nach dem BamHI-PstI- Verdau von pMAP2 durch Elektroelution aus einem präparativen Agarosegel auf DEAE-Papier, das gemäß den Anweisungen der Hersteller Schleicher & Schuell (siehe Quellennachweis) verwendet wurde, isoliert. Plasmid pUC8 wurde zum Subklonieren des das B.t.-Gen tragenden BamHI-PstI-Fragments von pMAP2 verwendet. Auf eine Ligation von mit BamHI und PstI verdautem pUC8 mit dem gereinigten 8,1 Kb BamHI-PstI-Fragment folgte eine Transformation von kompetentem E. coli JM101. Die Transformanten wurden auf Basis von Ampicillinresistenz und einer fehlenden β-Galactosidase-Aktivität selektiert. Ein Klon wurde isoliert und enthielt nachgewiesenermaßen das gewünschte Plasmid. Dieses Konstrukt wurde mit pMAP3 bezeichnet. E. coli Stamm JM101, der pMAP3 enthält, ist beim ATCC hinterlegt und hat die ATCC- Zugriffsnummer 39801.
Eine Reduktion des B. thuringiensis DNA-Inserts von pMAP3 von 8,1 kb auf 4,6 Kb wurde durch Deletion eines SmaI-HpaI- Fragments erzielt. Durch CsCl-Gradienten-Zentrifugation gereinigte Plasmid pMAP3-DNA wurde mit SmaI- und HpaI- Restriktionsenzymen verdaut und religiert. Das resultierende DNA-Fragment wurde zum Transformieren der kompetenten E. coli JM101-Zellen verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden mittels Agarose-Elektrophorese von Miniplasmid- Präparationen untersucht. Es wurde ein Klon identifiziert, der ein Plasmid mit dem erwarteten DNA-Restriktionsenzym- Verdauungsmuster enthielt. Dieses Konstrukt wurde mit pMAP4 bezeichnet.
Schließlich enthält das chimäre Gen einen 3'-Bereich, der nicht translatiert wird und für ein Polyadenylierungssignal kodiert, das in Pflanzen wirkt, um die Hinzufügung von Polyadenylatnukleotiden am 3'-Ende der mRNA zu bewirken. Beispiele für geeignete 3'-Bereiche sind die nicht translatierten transkribierten 3'-Bereiche, die das polyadenylierte Signal des Nopalinsynthase (NOS)-Gens vom Agrobacterium-Tumor-induzierenden (Ti) Plasmid oder das Conglycinin (7S)-Speicherproteingen enthalten. Ein Beispiel für einen bevorzugten 3'-Bereich, der nicht translatiert ist, ist jener vom NOS-Gen, wie er in den folgenden Beispielen beschrieben ist.
Das erfindungsgemäße chimäre Gen wird durch irgendein geeignetes Verfahren in das Genom einer Tomatenpflanze eingefügt. Geeignete Pflanzentransformationsvektoren sind u. a. jene, die von einem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens stammen, sowie jene, die in z. B. Herrera-Estrella 1983, Bevan 1983, Klee 1985 und EP-Veröffentlichung 120516, Schilperoort et al., beschrieben sind. Neben Pflanzentransformationsvektoren, die von Ti- oder Wurzel-induzierenden (Ri) Plasmiden von A. tumefaciens stammen, können alternative Verfahren zum Einfügen der erfindungsgemäßen chimären Gene in Tomatenzellen verwendet werden. Bei solchen Verfahren können beispielsweise Liposome, Elektroporierung und Chemikalien eine Rolle spielen, die die Aufnahme von freier DNA steigern. Transformierte Zellen werden dann kultiviert und zu ganzen Tomatenpflanzen regeneriert.
Die folgenden Beispiele dienen zum besseren Verständnis der erfindungsgemäßen Praxis und sollen in keiner Weise den Rahmen der beanspruchten Erfindung einschränken. Der Fachmann wird sehr wohl erkennen, daß verschiedene Äquivalente, Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne vom Gedanken und Umfang derselben abzugehen, und selbstverständlich sind derartige äquivalente Ausführungsformen mitumfaßt.

BEISPIEL 1

Das insektizide Toxingen aus Bacillus thuringiensis, Subspezies kurstaki HD-1, wurde von Watrud et al. (1985) vorbeschrieben. Das Toxingen ist auf einem 4,6 kb Fragment von B.t. DNA in Plasmid pMAP4 enthalten. Die DNA-Sequenz von 3734 Nukleotiden von pMAP4, einschließlich der gesamten Toxinprotein- Kodiersequenz, wurde mittels der Kettenabbruchsmethode von Sanger et al. (1977) bestimmt. Die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz für das Toxinprotein sind in Fig. 1 gezeigt. Nukleotidkoordinaten, auf die nachstehend bezug genommen wird, basieren auf der Numerierung aus Fig. 1.
Diese Sequenz enthält 171 Nukleotide oberhalb des translatorischen Startkodons und reicht bis zu einer KpnI-Stelle 188 Nukleotide nach dem translatorischen Endkodon. Das erste Nukleotid der Proteinkodiersequenz ist mit Position +1 markiert. DNA-Sequenzen vom Nukleotid -75 zum Nukleotid 220 und vom Nukleotid 3245 zu 3650 wurden auch durch die chemische Methode nach Maxam und Gilbert (1977) bestimmt. Die DNA-Sequenz von -171 bis -160 ist von der bekannten Sequenz des Plasmidvektors pUC7 (Vieira, 1982), die DNA-Sequenz von -159 bis -153 ist von einem chemisch synthetisierten PstI-Linker (New England Biolabs); die drei Nukleotide von -152 bis -150 stammen von der bekannten Spaltungsstelle für das Restriktionsenzym HpaI. Die Sequenz vom Nukleotid -149 zu -76 wurde aus bekannten 5'-flankierenden Sequenzen anderer B.t.-Toxingene (Schnepf et al. 1985, Thorne et al., 1986, Adang et al. 1985 und Shibano et al., 1985) eingeführt.

BEISPIELE 2-3

Chimäre B.t.-Toxingene zur Pflanzentransformation mit CaMV35S-Promotor

Toxin in gesamter Länge

Um ein chimäres Gen, das für das Toxinprotein von B.t. kodiert, herzustellen, wird eine NcoI-Stelle am Startkodon der Translation (ATG) der für das B.t.-Toxin kodierenden DNA eingeführt, so daß das ATG-Kodon in der NcoI-Erkennungsstelle (CCATGG) enthalten ist. Eine DNA-Sequenz-Analyse des Bereichs des Toxingens rund um das Startkodon ergab die Sequenz
5'-GAGATGGAGGTAACTTATGGATAACAATCCGA-3 MetAspAsnAsnPro
Zur Einführung der gewünschten NcoI-Stelle war es notwendig, die Sequenz rund um das ATG von TTATGG auf CCATGG abzuändern. Unter Bezugnahme auf Fig. 2 wurde ein 340 bp DraI-EcoRI-Fragment, das den Bereich des Translationsstarts enthält, aus pMAP4 zwischen den SmaI- und EcoRI-Stellen des filamentösen Bakteriophagenvektors M23mp8 subkloniert. Dieses Plasmid wurde mit pMON9732 bezeichnet. Einzelsträngige Phagen-DNA aus diesem Konstrukt enthält den nicht kodierenden Strang der Toxingensequenz.
Eine stellenspezifische Mutagenese wurde an der einzelsträngigen DNA aus diesem Konstrukt mittels der Methode von Zoller und Smith (1983) unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids der Sequenz:
5'-GAGATGGAGGTAACCCATGGATAACAATCC-3'
als Primer vorgenommen. Im Anschluß an die Mutagenese wurde ein Klon, der die gewünschte Veränderung enthielt, durch Verdau mit NcoI identifiziert, und die Anwesenheit der NcoI-Stelle wurde mittels DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Dieser Klon wurde mit pMON9733 bezeichnet.
Es wurde ein intaktes Toxingen konstruiert, das die NcoI- Stelle aus der oben beschriebenen stellenspezifischen Mutagenese enthielt. Unter Bezugnahme auf Fig. 3 wurde pMAP3 mit BamHI und ClaI verdaut, und ein Fragment, das den pUC8-Vektor und das Toxingen von der ClaI-Stelle in Stellung 1283 zur PstI-Stelle nach dem Ende des Gens enthielt, wurde isoliert. Ein 185 bp- Fragment, das sich von der BamHI-Stelle im mp8-Multilinker zur ClaI-Stelle in Stellung 106 erstreckt, wurde aus pMON9733 isoliert. Diese beiden Fragmente wurden ligiert, um pMAP16 zu bilden. pMAP16 enthält die NcoI-Stelle am ATG, hat jedoch nicht das Segment des Toxingens zwischen den ClaI-Stellen bei 106 und 1283. Dieses ClaI-Fragment wurde aus pMAP4 isoliert und mit ClaI-verdautem pMAP16 ligiert. Ein Plasmid, das dieses insertierte ClaI-Fragment in der passenden Orientierung zum Rekonstruieren eines funktionellen Toxingens enthielt, wurde identifiziert und mit pMAP17 bezeichnet. Dieses Plasmid enthaltende E. coli erzeugte ein Protein von etwa 134.000 Dalton, das mit Antikörpern, welche gegen gereinigtes kristallines Toxinprotein aus Bacillus thuringiensis, Subspezies kurstaki HD-1, präpariert waren, in Niveaus reagierte, die mit jenen vergleichbar waren, die durch pMAP4 enthaltende E. coli erzeugt wurden. pMAP17 enthaltende E. coli waren für die Schmetterlingslarve Manduca sexta toxisch.
Zur einfacheren Konstruktion von chimären Toxingenen in Pflanzentransformationsvektoren wurden BamHI- und BglII-Stellen direkt oberhalb der NcoI-Stelle im Toxingen eingeführt. Unter Bezugnahme auf Fig. 4 wurde ein Plasmid pMON146 als Quelle für einen synthetischen Linker verwendet, der die Restriktionsstellen für BamHI, BglII,XbaI und NcoI wie folgt enthält:
5' GGATCCAGATCTGTTGTAAGGAGTCTAGACCATGGATC-3' BamHI BglII XbaI NcoI
pMON146 wurde mit PstI partiell verdaut und dann mit NcoI vollständig verdaut, und es wurde ein 3,5 kb NcoI-PstI-Fragment isoliert. Das 4,5 kb NcoI-PstI-Fragment, welches das ganze Toxingen enthielt, wurde aus pMAP17 isoliert, und dieses Fragment wurde mit dem 3,5 kb pMON146-Fragment ligiert. Ein Plasmid, das diese beiden Fragmente enthielt, wurde pMON294 genannt. In pMON294 gibt es eine BamHI- und eine BglII-Stelle direkt oberhalb des Startkodons für das Toxinprotein und eine BamHI-Stelle direkt unterhalb der PstI-Stelle.
Unter Bezugnahme auf Fig. 9 ist Plasmid pMON316, ein Derivat von pMON200 (Fraley et al. 1985; Rogers et al. 1985), ein Zwischenvektor vom kointegrierenden Typ, der den CaMV35S- Promotor und das 3'-Polyadenylierungssignal des NOS-Gens enthält. pMON316 hat jeweils eine einzige Schnittstelle für die Restriktionsendonukleasen BglII, ClaI, KpnI, XhoI und EcoRI, die sich zwischen dem 5'-Leader- und dem 3'-NOS- Polyadenylierungssignal befinden. Die Schnittstellen ermöglichen die Insertion von Kodiersequenzen, die ihre eigenen translatorischen Startsignale unmittelbar neben der CaMV35S- Leitsequenz tragen. Plasmid pMON316 behält sämtliche Eigenschaften von pMON200, einschließlich der Spectinomycin- Resistenz für die Selektion in E. coli und A. tumefaciens sowie ein chimäres Kanamycingen (NOS/NPTII/NOS) zur Selektion von transformiertem Pflanzengewebe und das Nopalinsynthasegen zum leichten Zählen der Transformanten und des Erbganges der Folgegenerationen, bei.
Unter Bezugnahme auf Fig. 5 wurde ein Plasmid zur Expression des B.t.-Toxingens in Pflanzen durch Ligation des 4,5 kb BamHI-Fragments, welches das Toxingen aus pMON294 enthielt, in pMON316 das mit BglII verdaut worden war, konstruiert. Ein Plasmid, welches das Toxingen so ausgerichtet enthielt, daß der Translationsanfang neben dem CaMV35S-Promotor war, wurde durch Verdau mit EcoRI identifiziert und mit pMON8053 bezeichnet. Es wurde ein weiteres chimäres Pflanzengen hergestellt, das das Konstrukt in voller Länge enthielt, in dem die strukturelle Kodiersequenz für das B.t-Toxin an der DraI-Stelle in Position 3479 verkürzt war. Diese Stelle liegt 10 Nukleotide jenseits des translatorischen Stoppkodons für die Kodiersequenz für das B.t.- Toxin voller Länge. Somit enthält dieses Konstrukt die Kodiersequenz in voller Länge, aber sehr wenig von der 3'- Flankiersequenz vom B.t., Subspezies kurstaki-Gen. Dieses Konstrukt wird mit pMON9712 bezeichnet.
Unter Bezugnahme auf Fig. 6 wurde das Plasmid pMON 9712 durch Verdau von pMON294 mit der Endonuklease DraI hergestellt. Ein Paar komplementärer Oligonukleotide mit der Sequenz:
5'-TAGTAGGTAGCTAGCCA-3'
3'-ATCATCCATCGATCGGTCTAG-5'
wurde synthetisiert. Diese Oligonukleotide kodieren, einmal aneinander angelagert, für translatorische Stoppkodons in allen drei Leserahmen. Das angelagerte Oligonukleotidpaar hört an einem Ende gleich auf und bildet einen Einzelstrangbereich mit vier Nukleotiden und der Fähigkeit zur Ligation an BglII- verdaute DNA am anderen Ende. Die Oligonukleotide wurden aneinander angelagert und an pMON294-DNA ligiert, welche mit DraI verdaut worden war. Die ligierte DNA wurde mit BglII verdaut, und ein BglII-Fragment von annähernd 3,5 kb, das die gewünschte B.t.-Toxin-Kodiersequenz enthielt, wurde isoliert. Dieses Fragment erstreckt sich von der BglII-Stelle direkt oberhalb des translatorischen Startkodons zu der durch das Oligonukleotidpaar geschaffenen BglII-Stelle. Dieses BglII- Fragment wurde an mit pMON316 verdautes BglII ligiert. Durch Verdau mit EcoRI wurde ein Klon (pMON9712) identifiziert, bei dem sich der Translationsanfang für das Toxingen neben dem 355 Promotor befand.

BEISPIEL 4

CHIMÄRES B.t.-TOXINGEN FÜR PFLANZENTRANSFORMATION UNTER VERWENDUNG DES MAS-PROMOTORS

Es wurde ein chimäres B.t-Toxingen konstruiert, bei welchem der Mannopinsynthase (MAS)-Promotor von Plasmid pTiA6, einem Plasmid aus Agrobacterium tumefaciens vom Octopintyp, in Kombination mit dem im zuvor beschriebenen Konstrukt pMON9712 enthaltenen B.t-Toxingen verwendet wurde.
Der MAS-Promotor wurde aus pTiA6 als 1,5 kb EcoRI-ClaI- Fragment isoliert. Dieses DNA-Fragment erstreckt sich von der ClaI-Stelle am Nukleotid 20.138 zur EcoRI-Stelle bei 21.631 in der Sequenz von Barker et al. (1983). Unter Bezugnahme auf Fig. 7 wurde das EcoRi-ClaI-Fragment mit dem binären Vektor pMON505 (Horsch et al. 1986), welcher zuvor mit EcoRI und ClaI verdaut worden war, ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit pMON706 bezeichnet. Ein das NOS 3'-Ende enthaltendes Fragment wurde unterhalb vom MAS-Promotor eingesetzt, um einen MAS-NOS 3'- Expressionskassettenvektor zu erhalten. Das NOS 3'-Fragment wurde aus pMON530 als 300 bp BglII-BamHI-Fragment herausgeschnitten und in BglII-verdautes pMON706 insertiert. Das resultierende Plasmid wurde mit pMON707 bezeichnet.
Plasmid pMON530 wurde durch Schneiden von pMON200 mit NdeI zur Entfernung eines 900 bp NdeI-Fragments zwecks Bildung von pMON503 konstruiert. Plasmid pMON503 wurde mit HindIII und SmaI geschnitten und mit Plasmid pTJS75 (Schmidhauser und Helinski, 1985), welches ebenfalls mit HindIII und SmaI geschnitten worden war, gemischt. Ein Plasmid, das das 3,8 kb HindIII-SmaI-Fragment von pTJS75, gebunden an das 8 kb HindIII-SmaI-Fragment von pMON503, enthielt, wurde isoliert und mit pMON505 bezeichnet. Als nächstes wurde die CaMV35S-NOS3'-Kassette durch Spaltung von pMON316 mit StuI und HindII und Isolierung des 2,5 kb StuI- HindIII-Fragments, das den NOS-NPTII'-NOS-Marker und die CaMV35S-NOS3'-Kassette enthielt, auf pMON505 übertragen. Diese wurde zu mit StuI und HindIII geschnittener pMON505-DNA hinzugefügt. Im Anschluß an die Ligation und Transformation wurde ein die CaMV35S-NOS3'-Kassette in pMON505 tragendes Plasmid isoliert und mit pMON530 bezeichnet.
Da manche binären Vektoren stark reduzierte Transformationsfrequenzen in Tomatenpflanzen im Vergleich zu Kointegrationsvektoren, McCormick et al. (1986), haben, wurde die MAS-NOS3'-Kassette von pMON707 in den Kointegrationsvektor pMON200, Fraley et al. (1985), übertragen. Das Plasmid pMON200 wurde mit StuI und HindIII verdaut, und ein 7,7 kb Fragment wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese isoliert. Das Plasmid pMON707 wurde auf ähnliche Weise mit StuI und HindIII verdaut, und ein 3,5 kb StuI-HindIII-Fragment, das die MAS-NOS3'-Kassette enthielt, wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese und Gewinnung auf DEAE-Membranen mit anschließender Elution mit 1M NaCl isoliert. Diese zwei DNA-Fragmente wurden ligiert, und das resultierende Plasmid wurde mit pMON9741 bezeichnet. Dieses Plasmid enthält die MAS-NOS3'-Kassette im pMON200- kointegrierenden Hintergrund. Ein vom MAS-Promotor gesteuertes chimäres B.t.-Toxingen wurde hergestellt. Unter Bezugnahme auf Fig. 8 wurde das B.t.-Toxingen-Insert als BglII-Fragment aus pMON9712 herausgeschnitten. Dieses Fragment wurde mit BglII- verdautem pMON9741 ligiert. Das 5'-Ende des B.t.-Toxingens befand sich neben dem MAS-Promotor durch Verdau mit EcoRI. Dieses Plasmid wurde mit pMON9756 bezeichnet und enthielt die B.t.-Toxinkodiersequenz aus pMON9712.
Das Plasmid pMON9756 kann zum Transformieren von Tomatenzellen, wie oben beschrieben, verwendet werden. Daraus regenerierte Tomatenpflanzen weisen eine nützliche Toxizität gegenüber sensitiven Schmetterlingslarven auf.

BEISPIEL 5

EXPRESSION VON CHIMÄREN B.t.-GENEN IN TOMATENPFLANZEN

Einführung von Zwischenvektoren in Agrobacterium Zwischenvektoren, die Toxingene in voller Länge enthielten (pMON294, pMON8053 und pMON9712), wurden in Agrobacterium tumefaciens Stamm GV311SE, welches das von Fraley et al. (1985) beschriebene entwaffnete Ti-Plasmid pTiB6SE enthielt, eingebracht. Agrobacterium tumefaciens-Stämme, die Kointegrate zwischen pTiB6SE und diese Zwischenvektoren enthielten, wurden selektiert, wie beschrieben.

Transformation und Regeneration von Tomatenpflanzen

Die Transformation und Regeneration von transformierten Tomatenpflanzen unter Verwendung der oben beschriebenen Agrobacterium tumefaciens-Stämme wurde ausgeführt, wie von McCormick et al. (1986) beschrieben.

Insektenfütterungsversuche mit transformierten Tomatenpflanzen

Die Toxizität von transformierten Tomatenpflanzen, die chimäre B.t.-Toxingene enthielten, wurde durch Fütterungsversuche bei Testinsekten bestimmt. Bei einigen Versuchen wurden Blätter von den Pflanzen entfernt und entweder einzeln oder in Gruppen von bis zu fünf Blättern in sterile 82 mm Petrischalen, die feuchtes, steriles Filterpapier enthielten, gegeben. Fünf bis zehn Insektenlarven wurden auf die Blätter appliziert und durften drei bis sieben Tage lang fressen, worauf die Larven hinsichtlich Mortalität und relativer Größe bewertet wurden. Alternativ wurden Larven auf Blätter von ganzen Tomatenpflanzen gesetzt, welche in vier Zoll-Töpfen wuchsen, die in Plastikschachteln eingeschlossen waren. Reife Tomatenfrüchte wurden auf ihre Toxizität untersucht, indem Insektenlarven direkt auf die intakte Frucht gesetzt wurden. Sämtliche Versuche wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Manduca sexta-Larven, die in den Fütterungsversuchen verwendet wurden, wurden als Eier von der Carolina Biological Supply Co. erhalten, bei Raumtemperatur ausgebrütet und unmittelbar nach dem Ausbrüten auf Blätter oder Pflanzen aufgebracht.

pMON9712 in der Tomate

Eine unter Verwendung des Pflanzentransformationsvektors pMON9712 transformierte Tomatenpflanze wurde wie oben beschrieben isoliert. Elf F1-Nachkommen aus einer Selbstkreuzung dieser Pflanze wurde gewonnen und in zwei getrennten Tests auf ihre Toxizität gegenüber frisch geschlüpften Manduca sexta-Larven getestet. Die Insektenfütterungsversuche wurden an ganzen Pflanzen, wie zuvor beschrieben, durchgeführt.
Neun der elf getesteten Nachkommen zeigten Nopalinsynthase, was auf die Anwesenheit der transformierenden DNA hinwies. Weniger als die Hälfte der Larven überlebten auf acht der neun nopalinpositiven Pflanzen. Weniger als 20% der Larven überlebten auf zwei der neun nopalinpositiven Pflanzen. Die Überlebensrate für Larven auf nicht transformierten Pflanzen betrug etwa 90%. Diese Resultate weisen auf einen bedeutenden Toxizitätsgrad in mit pMON9712 transformierten Tomatenpflanzen gegenüber nicht transformierten Pflanzen hin.

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung genetisch transformierter Tomatenpflanzen, die eine Toxizität gegenüber Schmetterlingslarven aufweisen, welches Verfahren umfaßt:

(a) die Insertion eines chimären Gens in das Genom einer Tomatenzelle, welches chimäre Gen folgendes aufweist:

(i) einen Promotor, der in Pflanzen wirkt, um die Produktion eines mRNA-Transkripts zu bewirken;

(ii) eine Kodiersequenz, die die Erzeugung von mRNA bewirkt, welche für ein Toxinprotein von Bacillus thuringiensis kodiert, das durch die DNA-Sequenz 1-3471 der Fig. 1 kodiert ist, und

(iii) einen 3'-Bereich, welcher nicht translatiert wird und in der Tomatenpflanze die Hinzufügung von Polyadenylatnukleotiden am 3'-Ende der mRNA bewirkt;

(b) die Selektion transformierter Tomatenzellen; und

(c) die Regeneration genetisch transformierter Tomatenpflanzen aus den transformierten Tomatenzellen, welche Tomatenpflanzen eine Toxizität gegenüber Schmetterlingslarven aufweisen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CaMV35S- und MAS- Promotoren.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der Promotor CaMV35S-Promotor ist.

4. Transformierte Tomatenzelle, die eine Toxizität gegenüber Schmetterlingslarven aufweist und ein chimäres Gen enthält, welches nacheinander aufweist:

einen Promotor' der in Pflanzen wirkt, um die Produktion eines mRNA-Transkripts zu bewirken;

eine Kodiersequenz, die die Erzeugung von mRNA bewirkt, welche für ein Toxinprotein von Bacillus thuringiensis kodiert, das durch die DNA-Sequenz 1-3471 der Fig. 1 kodiert ist, und

einen 3'-Bereich, welcher nicht translatiert wird und in der Tomatenpflanze die Hinzufügung von Polyadenylatnukleotiden am 3'-Ende der mRNA bewirkt.

5. Transformierte Tomatenzelle nach Anspruch 4, bei welcher der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CaMV35S- und MAS-Promotoren.

6. Zelle nach Anspruch 4, bei welcher der Promotor CaMV35S- Promotor ist.

7. Differenzierte Tomatenpflanze, die eine Toxizität gegenüber Schmetterlingslarven aufweist und transformierte Tomatenzellen nach Anspruch 4 umfaßt.

8. Differenzierte Tomatenpflanze nach Anspruch 7, bei welcher der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CaMV35S- und MAS-Promotoren.

9. Differenzierte Tomatenpflanze nach Anspruch 8, bei welcher der Promotor CaMV35S-Promotor ist.

10. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem das Proteintoxin von Bacillus thuringiensis, Subspezies kurstaki stammt und die transformierte Pflanze eine Toxizität gegenüber Schmetterlingen der Gattung Manduca und Heliothis und Spodoptera exigua aufweist.

11. Zelle nach Anspruch 6, bei welcher das Proteintoxin von Bacillus thuringiensis, Subspezies kurstaki stammt und die transformierte Pflanze eine Toxizität gegenüber Schmetterlingen der Gattung Manduca und Heliothis und Spodoptera exigua aufweist.

12. Differenzierte Tomatenpflanze nach Anspruch 8, bei welcher der Promotor CaMV35S-Promotor ist, das Proteintoxin von Bacillus thuringiensis, Subspezies kurstaki stammt und die transformierte Pflanze eine Toxizität gegenüber Schmetterlingen der Gattung Manduca und Heliothis und Spodoptera exigua aufweist.