DE3785615T2

DE3785615T2 - Hemmungsstoffe der serin-protease.

Info

Publication number: DE3785615T2
Application number: DE8787870078T
Authority: DE
Inventors: George Irvin Glover; Charles Allan Mcwherter; Charles Steven Schasteen
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1986-06-11
Filing date: 1987-06-10
Publication date: 1993-08-05
Anticipated expiration: 2007-06-11
Also published as: CA1308864C; EP0252057A2; JPS6322027A; EP0252057A3; US4829052A; DE3785615D1; EP0252057B1; JP2520131B2; ES2053588T3

Description

In ihrem weitesten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Enzyminhibitoren. Insbesondere bezieht sie sich auf neue Polypeptide, die inhibierende Wirksamkeit gegen Serinproteasen zeigen.
Die mechanistische Klasse von proteolytischen Enzymen, die als Serinproteasen bekannt sind, ist in der Natur weitverbreitet und wurde in Tieren, Mikroben und Insekten identifiziert. Die Zuordnung von Mitgliedern zu dieser Klasse erfolgte ursprünglich auf Basis ihrer enzymatischen Mechanismen. Danach wurde gezeigt, daß Mitglieder dieser Klasse eine große Menge von Sequenz- und Strukturhomologie aufweisen. Serinproteasen sind durch eine katalytische Dreiergruppe bestehend aus Asparaginsäure, Histidin und Serin an der aktiven Stelle repräsentiert. Serinproteasen können leicht identifiziert werden, weil die aktive Stelle Serin durch Diisopropylfluorphosphat irreversibel und kovalent modifiziert werden kann.
Serinproteaseinhibitoren wurden in Mikroben und in den Geweben und Flüssigkeiten von Pflanzen, Tieren, Insekten und anderen Organismen gefunden. Die natürlich vorkommenden Serinproteaseinhibitoren sind gewöhnlich, jedoch nicht immer, Polypeptide und Proteine, die in erster Linie auf Basis des Disulfidbindungsmusters und der Sequenzhomologie der reaktiven Stelle in Familien eingeteilt wurden. Die reaktive Stelle wird als der Teil der primären Sequenz, der mit der Protease direkt in Wechselwirkung tritt, definiert. Untersuchungen haben gezeigt, daß die meisten Inhibitoren durch einen gemeinsamen Mechanismus inhibieren, in dem der Inhibitor tatsächlich ein schlechtes Substrat ist, das fest gebunden ist und die katalytische Hydrolyse einer speziellen Bindung innerhalb der reaktiven Stelle nur sehr selten erfährt. Wenn aber der pH von Neutralität drastisch verändert wird, erfolgt Hydrolyse der Peptidbindung der reaktiven Stelle.
Außer ihrer üblichen physiologischen Funktion waren Serinproteasen in einer Reihe von pathologischen Zuständen in Menschen impliziert, einschließlich Lungenemphysem, verschiedenen Gerinnungsstörungen und Entzündungsprozessen. Eine Illustration der Bedeutung der katalytischen Wirksamkeit von Serinproteasen wird durch die Rolle humaner neutrophiler Elastase und eines ihrer natürlichen Inhibitoren, α-1-Proteinaseinhibitor (a-P1), in der Pathogenese von Emphysem vorgesehen. In den Lungen gesunder Personen liegt ein Gleichgewicht zwischen den Mengen von Elastase und ihrer Inhibitoren vor. Die Elastase wirkt bei der Wiederherstellung und dem Umsatz von Bindegeweben (Elastin) und der α-1-Proteinaseinhibitor ist in der Regulierung und Clearance von Elastase involviert. Der Ausdruck "Elastin" bezieht sich auf ein heterogenes, hochvernetztes und hochunlösliches Polypeptid, das die Hauptkomponente von elastischem Bindegewebe im Körper ist. Die Unterbrechung des Elastase/α-1-Proteinaseinhibitor- Gleichgewichtes führt zu erhöhtem Elastinabbau und daher zur Zerstörung von elastischem Gewebe. Neues Elastin kann synthetisiert werden, doch wird das geeignete Netzwerk von elastischen Fasern, das während Lungenentwicklung niedergelegt wird, nicht erreicht. Eine längere Unausgewogenheit führt zu einer irreversiblen Dilatation von Lungenluftwegen und zur Schädigung der Atmungsgewebe der Lunge, ein als Lungenemphysem bekannter Zustand.
Diese Unausgewogenheit kann auf eine Reihe von Wegen auftreten. Ein Beispiel ist der Fall von Familienemphysem, das zuerst in Skandinavien identifiziert wurde. Es hat sich gezeigt, daß Personen, bei denen gefunden wurde, daß sie einen homozygoten genetischen Mangel an aktiven Formen von Serum-α-1-Proteinaseinhibitor haben, wahrscheinlicher emphysematöse Symptome entwickeln, insbesondere wenn sie anderen Risikofaktoren, wie Zigarettenrauchen, ausgesetzt sind. Als weiteres Beispiel wurde gezeigt, daß Oxidantien vom Kondensat von Zigarettenrauch die Elastasebindungsaffinität von α-1-Proteinaseinhibitor durch Oxidieren eines Methioninrestes innerhalb der reaktiven Stelle drastisch vermindern. Weiterhin wurde auch gezeigt, daß das Serum von Rauchern im Vergleich mit Nichtrauchern dramatisch höhere Spiegel von oxidiertem α-1-Proteinaseinhibitor aufweist. Es wurde gefolgert, daß das Gleichgewicht durch die Inaktivierung des Inhibitors unterbrochen wurde. Ein letztes Beispiel involviert sowohl erhöhte Werte von Elastase als auch gleichzeitig niedrigere Werte von funktionellem α-1-Proteinaseinhibitor. Die Entzündungsreaktion auf teilchenförmiges Fremdmaterial von Luftverschmutzung oder Zigarettenrauch führt zu erhöhten Spiegeln polymorphonuklearer Leukozyten in der Lunge. Diese Zellen unterbrechen das Protease/Proteaseinhibitor-Gleichgewicht durch Ausscheidung von proteolytischen Enzymen, z.B. Elastase. Sie scheiden auch Oxidantien einschließlich Myeloperoxidase aus, die α-1-Proteinaseinhibitor oxidativ zu inaktivieren scheinen. So führen durch die Entfernung eines Kontrollmechanismus oder durch längere Induktion erhöhter Elastasespiegel verursachte Unausgewogenheiten schließlich zu einer unerwünschten pathologischen Situation, einem Schaden des Bindegewebes und einer herabgesetzten Lungenfunktion.
α-1-Proteinaseinhibitor (Antitrypsin, AT) ist ein einkettiges Glykoprotein mit einem MG von 51 000 mit 394 Aminosäuren mit keinen Disulfidbrücken und 3 Oligosaccharidseitenketten, der im menschlichen Serum bei 130 mg/100 ml oder 23,6 µM vorhanden ist. Er diffundiert leicht in Gewebezwischenräume und bildet einen 1:1 Komplex mit einer Zielprotease, hauptsächlich neutrophiler Elastase. Der Enzym/Inhibitorkomplex wird dann rasch aus dem Kreislauf entfernt und durch die Leber und die Milz katabolisiert. Menschliches AT wurde wegen seiner Fähigkeit, pankreatisches Trypsin zu inaktivieren, ursprünglich Antitrypsin genannt.
Es gibt viele praktische Probleme bei der Verwendung natürlich vorkommender Säugerserinproteaseinhibitoren oder verwandter Materialien als therapeutische Mittel. Die relativ großen natürlich vorkommenden Säugerserinproteaseinhibitoren werfen ein Problem auf, da große Polypeptide schwieriger produziert und Patienten verabreicht werden können als kleinere Polypeptide. Diesen natürlich vorkommenden Inhibitoren fehlen stabilisierende Disulfidbrücken und sie sind wärmelabil. Es hat sich auch gezeigt, daß die Oligosaccharidseitenketten eine Wirkung auf die Lebenszeit der Inhibitoren in vivo haben. So ist die Produktion dieser Inhibitoren mit der geeigneten Oligosaccharidkomponente eine weitere ernste Schwierigkeit bei ihrer Verwendung als therapeutische Mittel.
Die oben angegebene, Elastase involvierende Beschreibung liefert aber nur ein Beispiel einer Situation, wo die Kontrolle von Serinproteaseaktivität nützlich und erwünscht ist. Der Umfang dieser Erfindung schließt die Inhibierung von menschlicher Elastase ein, ist aber in keiner Weise hierauf beschränkt.
Es ist daher das Ziel der vorliegenden Erfindung in ihrem weitesten Aspekt, neue Serinproteaseinhibitoren vorzusehen.
Demgemäß sollte klar sein, daß diese Erfindung auf die Kontrolle der katalytischen Aktivität von Serinproteasen in jeder geeigneten Situation anwendbar ist, einschließlich, aber nicht unbedingt darauf beschränkt, Medizin, Biologie, Landwirtschaft und mikrobieller Fermentation.
Diese und andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen für die Fachleute aus der folgenden Beschreibung und repräsentativen Beispielen hervor.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Präferenzen menschlicher Leukozytenelastase für Aminosäuren in der Stellung unmittelbar aminoterminal zur Spaltstelle. Diese Stellung wird P1-Stellung genannt und wird detaillierter in der Beschreibung besprochen.
Fig. 2 zeigt eine Titrationskurve für Elastaseinhibierung durch Inhibitorpeptid 8.
Fig. 3 illustriert die vom ¹²&sup5;I-Fibronectintest auf Inhibitorpeptid 8 erhaltenen Daten.
Fig. 4 illustriert die vom ³H-Elastintest auf Inhibitorpeptid 8 erhaltenen Daten.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung sieht synthetische Polypeptide, die inhibierende Wirksamkeit gegenüber Zielserinproteasen zeigen, und ein Verfahren zur Herstellung derselben vor. Zielserinproteasen sind jene, die eine starke Präferenz für der Spaltstelle in der aminoterminalen Richtung von Peptidsubstraten benachbarte Aminosäurereste zeigen. Beispiele solcher Serinproteasen sind Elastase und Kathepsin G. Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung synthetische Serinproteaseinhibitoren mit der folgenden Aminosäuresequenz
Arg-Val-Cys-Pro-X-Ile-Leu-Met-Lys-Cys-Lys-Lys-Asp-Ser-Asp- Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-Cys-Gly,
die inhibierende Wirksamkeit gegenüber Elastase zeigt, worin X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Isoleucin, Norvalin, Valin, Norleucin, Methionin, Leucin, Alanin, Glycin und Phenylalanin, und homologe Variationen hievon vor. Mit "synthetisch" ist gemeint, daß die Polypeptide keine natürlich vorkommenden Verbindungen sind.
Die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung besitzen bestimmte Qualitäten, die sie recht praktisch machen. Die kurze Sequenz dieser Polypeptide (29 bis 32 Aminosäurereste) erleichtert ihre Herstellung, insbesondere durch die Verfahren chemischer Synthese. Die große Zahl von Halbcystinresten in bezug auf die Gesamtzahl von Resten zeigt einen hohen Grad von Vernetzung durch Disulfidbindungsbildung. Obwohl die besondere Paarung von Halbcystinresten derzeit nicht bekannt ist, können die Polypeptidinhibitoren der vorliegenden Erfindung leicht zu ihrer biologisch aktiven Form gefaltet werden, wie im nachstehenden beschrieben. Es ist wahrscheinlich, daß diese Polypeptide starr und kompakt gefaltet sind, ein Merkmal, das Polypeptiden und Proteinen im allgemeinen Stabilität verleiht.
Alle in der folgenden Beschreibung und in den Ansprüchen dargestellten Polypeptidstrukturen sind im herkömmlichen Format gezeigt, worin die Aminogruppe am N-Terminus links und die Carboxylgruppe am C-Terminus rechts aufscheint. Wenn nichts anderes angegeben, sind alle Aminosäuren L-Aminosäuren. Die Nomenklatur für die natürlich vorkommenden Aminosäuren, die in Proteinen zu finden sind und die die Polypeptidinhibitoren der vorliegenden Erfindung umfassen, ist wie folgt: Alanin (Ala; A), Asparagin (Asn; N), Asparaginsäure (Asp; D), Arginin (Arg; R), Cystein oder Halbcystin (Cys; C), Glutaminsäure (Glu; E), Glutamin (Gln; Q), Glycin (Gly; G), Histidin (His; H), Isoleucin (Ile; I), Leucin (Leu; L), Lysin (Lys; K), Methionin (Met; M), Phenylalanin (Phe; F), Prolin (Pro; P), Serin (Ser; S), Threonin (Thr; T), Tryptophan (Trep; W), Tyrosin (Tyr; Y) und Valin (Val; V).
Alle chemischen, biologischen, medizinischen und technischen Wörter, Phrasen, Symbole und Nomenklatur sind für Fachleute auf dem Gebiet lebender Wissenschaften üblich und diese Wörter, Phrasen, Symbole und Nomenklatur haben übliche Anwendung sowohl in Lehrbüchern als auch der ursprünglichen wissenschaftlichen Literatur gefunden. Definitionen können an Hand von Lehrbüchern über den geeigneten Gegenstand oder in den Empfehlungen der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, "Biochemical Nomenclature and Related Documents", Biochemical Society, PO Box 32, Commerce Way, Colchester, Essex CO2 8HP England, gefunden werden.
Beispiele von Polypeptidinhibitoren der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle I angeführt. In Tabelle I wird die Schreibweise von Schecter und Berger (Biochem.Biophys.Res.Commun., 27, 157 [1967]) zum Bezeichnen der relativen Stellungen der Reste in bezug auf die Peptidbindung der reaktiven Stelle verwendet. In dieser Schreibweise bezieht sich P1, P2, P3 usw. auf die Reihe von Resten, die von der Bindung der reaktiven Stelle in Richtung des Aminoterminus wegführt, jeweils ein Rest. Eine ähnliche Definition gilt für P1', P2', P3' usw., außer daß die Richtung zum Carboxylterminus hingeht.
Die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind mit der in Tabelle II gezeigten Familie von Trypsininhibitoren von Kürbispflanzen verwandt. Die Kürbisfamilie von Trypsininhibitoren ist eine vor kurzem entdeckte Gruppe von Inhibitoren, die in den Samen von Cucurbitacea-Pflanzen zu finden sind (Wieczorek et al., Biochem.Biophys.Res.Comm., 126, 646-652, 1985). Bisher wurden sieben einzelne Mitglieder durch Aminosäuresequenzierung charakterisiert und Äquilibriumassoziationskonstanten mit Rindertrypsin wurden für sechs dieser Mitglieder bestimmt, siehe Tabelle II.
Die amino- und carboxyterminalen Extensionen geben einen Hinweis, daß die natürlich vorkommenden Trypsininhibitoren von Kürbis durch proteolytische Behandlung von Vorläufern mit höherem Molgewicht produziert werden. Diese Erscheinung wurde im Hinblick auf andere Serinproteaseinhibitoren von Pflanzenquellen beobachtet. Dies ist von Bedeutung, weil sich viele Proteine und Polypeptide in ihren Vorläuferformen leichter zu ihren biologisch aktiven Formen falten und danach behandelt werden, um das kleinere Peptid oder Protein zu ergeben (Steiner et al., Proc. Natl.Acad.Sci., USA, 60, 622-629, 1968). Festphasensynthese von Trypsininhibitor CMTI III von Kürbissamen wurde von G. Kupryszewski et al. (Int.J.Peptide Protein Res. 27, 1986, 245- 250) beschrieben.
Analog mit der Kürbisfamilie von Trypsininhibitoren kann die reaktive Stelle so identifiziert werden, daß sie Reste P5 bis P5' inklusive umfaßt. Es sollte klar sein, daß diese Zuordnung nicht präzise ist, aber ihre präzise Beschreibung ist für den Zweck der vorliegenden Erfindung nicht wichtig. Es ist eher erforderlich, daß einige der Reste innerhalb der bezeichneten reaktiven Stelle eine Rolle bei der Bestimmung der Affinität und Selektivität der inhibierenden Wirksamkeit dieser Polypeptide spielen. Wahrscheinlich würde dies durch die detaillierten molekularen Wechselwirkungen zwischen den reaktiven Stellenresten des Inhibitors und den aktiven Stellenresten der Zielserinprotease erfolgen. Tabelle I Inhibitorpeptid Reaktive Stelle Rahmen ¹ für Homologievergleich insertierter Spalt Fortsetzung der Tabelle I Inhibitorpeptid Reaktive Stelle Rahmen ¹ für Homologievergleich insertierter Spalt Fortsetzung der Tabelle I Inhibitorpeptid Reaktive Stelle Rahmen ¹ für Homologievergleich insertierter Spalt ² Nle bedeutet Norleucin ³ Hyp bedeutet Hydroxyprolin Tabelle II TRYPSININHIBITOREN AUS KÜRBISSAMEN Reaktive Stelle Rahmen Aminosäuresequenz der Kürbisfamilie von Inhibitoren. Ka ist die Assoziationsäquilibriumkonstante mit Trypsin (Wieczorek et al., Biochem.Biophys.Res.Comm, 126, 646-652 (1985)). NR = nicht berichtet ¹ bedeutet für Homologievergleich insertierten Spalt
Die Polypeptidinhibitoren können, um inhibierende Wirksamkeit gegenüber einer Zielserinprotease zu zeigen, durch Insertieren eines geeigneten Aminosäurerestes in die P1-Stellung hergestellt werden. Beispielsweise schließen geeignete P1-Aminosäuren zum Herstellen eines Elastaseinhibitors Isoleucin, Leucin, Norleucin (Nle), Valin, Norvalin (Nva), Methionin, Phenylalanin und Alanin ein, sind aber nicht unbedingt hierauf beschränkt.
Die Analyse der veröffentlichten oder experimentell bestimmten Präferenzen der Zielserinprotease für die Aminosäureart in der P1-Stellung von Substraten und Inhibitoren richtet die Selektion einer P1-Substitution auf die Herstellung eines Inhibitors dieser Zielprotease. Die relativen Präferenzen der Zielserinprotease für verschiedene Aminosäuren in der P1- Stellung kann unter Anwendung der folgenden Methode leicht bestimmt werden.
Eine Zahl kleiner Peptidderivate der Form X-Y-aa-Z wird hergestellt, worin X und Y Aminosäuren sind, die in jedem der Derivate gleich sind, und aa die P1-Aminosäure ist, die variiert wird. Die Gruppe Z stellt eine chromogene Abgangsgruppe dar, die vom Enzym abgespalten wird. Gewöhnlich wird der Aminoterminus der Polypeptide geschützt, um Endeffekte zu verhindern. Die kinetischen Michaelis-Menten-Parameter werden dann für jedes Mitglied der Reihe unter Anwendung von Standardtechniken bestimmt. Die Bindungspräferenz des Enzyms für das P1-Substrat ist von größtem Interesse. Unter Bedingungen, bei welchen das Gleichgewicht von Substratbindung an das Enzym in bezug auf Produktdissoziation (Umsatz) rasch ist, ist die Umkehr von Km, der wohlbekannten Michaelis-Konstante, für die Substrat-Enzym- Assoziationskonstante indikativ. So kann man durch Prüfen von 1/Km für eie Reihe von Peptidderivaten, die sich nur in der P1-Aminosäure unterscheiden, leicht die P1-Aminosäuresubstratbindungspräferenzen eines speziellen Enzyms bestimmen. Als Beispiel illustriert Fig. 1 die veröffentlichten Daten in bezug auf P1 -Substratpräferenzen für menschliche Leukozytenelastase (Harper et al., Biochemistry, 23, 2995-3002, 1984). Eine Reihe von Tripeptidthiobenzylestersubstraten der Form Boc-L-Ala-L-Ala- aa-SBzl wurde für diese Untersuchung verwendet. Die Prüfung der Fig. 1 zeigt eine starke Präferenz für die geraden und verzweigten aliphatischen Seitenketten. Aromatische und schwefel- und sauerstoffhaltige Seitenketten sind durch dieses Kriterium schlechte Binder. Dieser Versuch kann auch irreversible Inhibitoren verwenden, in welchen Z eine aktivierende Gruppe, wie Chloralkyl, anstelle einer chromogenen Abgangsgruppe ist.
Selbstverständlich wissen Fachleute, daß andere Reste als P1 ebenfalls zu der Bindungswechselwirkung zwischen Enzym und Inhibitor beitragen. So kann die Wahl eines P1, der den geometrischen Anforderungen für die reaktive Stellengeometrie entspricht, nicht völlig ausreichend sein, wenn andere reaktive Stellenreste eine signifikante Funktion für eine besondere Zielserinprotease haben.
Die Sequenz außerhalb der reaktiven Stelle ist notwendig, um die geeignete Dreifachfaltung, die für inhibierende Wirksamkeit erforderlich ist, zu erzielen und aufzurechtzuerhalten. Der geeignete Abstand von Halbcystinresten bleibt gut erhalten. So wie mit vielen anderen Familien homologer Proteine folgt, daß die Disulfidpaarungen ebenfalls voraussichtlich erhalten bleiben, und erwartet werden kann, daß sie eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der aktiven dreidimensionalen Struktur spielen. Diese Region kann dann geeignet als "molekulares Gerüst" oder "Rahmen" bezeichnet werden.
Die Atomstrukturen von Serinproteaseinhibitoren, die bisher bestimmt wurden, zeigen einen großen Teil von Ähnlichkeit in der Region der reaktiven Stelle. Ähnlich zeigten Röntgenkristallstrukturen von Serinproteasen ausgedehnte Strukturähnlichkeit in der aktiven Stelle. Es ist vernünftig zu erwarten, daß Reste innerhalb der reaktiven Stelle von Proteaseinhibitoren der vorliegenden Erfindung bestimmten geometrischen Anforderungen entsprechen müssen, um inhibierende Wirksamkeit zu zeigen. Es folgt, daß jegliche Sequenzvariationen, die in der reaktiven Stelle vorgenommen werden, die erforderliche reaktive Stellengeometrie konformationell ermöglichen müssen. Substitutionen, die diese Anforderung nicht ermöglichen, versagen beim Inhibieren.
Es ist zu erwarten, daß Substitutionen toleriert werden können, wenn sie die Erzielung und Stabilität der Dreifachfaltung nicht beeinträchtigen. Andere natürliche (sowohl die im Protein vorkommenden und nicht natürlich vorkommenden) oder synthetische Aminosäuren können in diese Polypeptide substituiert werden, wenn ihre Seitenketten die funktionelle Identität vorsehen, die zum Aufrechterhalten von Peptidstruktur und -funktion benötigt wird. Beispielsweise ist Ornithin eine basische Aminosäure, die Ly, Arg oder His ersetzen kann. β-2-Thienylalanin ist eine synthetische Aminosäure, die ein Phenylalaninanalogon ist. Selbstverständlich könnten geeignete Stereoisomere der Aminosäuren substituiert werden, vorausgesetzt die biologische Aktivität wird nicht nachteilig berührt. Bestimmte Deletionen können ebenfalls möglich sein, obwohl diese auf Grund der kleinen Größe dieser Polypeptide unwahrscheinlich sein mögen. Es kann auch möglich sein, die Faltung durch Anfügen mehrerer Disulfidbindungen oder Anfügen von Gruppen, die Salzbrücken oder Wasserstoffbindungsdonator/akzeptorpaare bilden können, weiter zu stabilisieren. Die bestehenden Brücken können eliminiert werden, wenn sie durch Anfügen neuer Disulfidbrücken, Salzbrücken, Wasserstoffbindungspaaren oder einer geeigneten Kombination kompensiert werden.
Für Fachleute ist es klar, daß die Peptidinhibitoren der vorliegenden Erfindung chemisch modifiziert werden können. Beispielsweise könnten der Aminoterminus und/oder Lysinreste acyliert werden. Andererseits könnten die Carboxylgruppen verestert oder amidiert werden. Extensionen an den Amino- oder Carboxytermini, entweder separat oder gleichzeitig, sind möglich. Solche Extensionen können andere erwünschte Eigenschaften enthalten, wie ein weiteres Inhibitormolekül oder vielleicht ein Molekülerkennungssegment zum Zielen auf ein besonderes Gewebe. Ein Beispiel eines Molekülerkennungssegments wäre ein Polypeptidhormon, das als Ligand für einen Rezeptor dient. Ein weiteres Beispiel wäre ein Antikörper.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden zwei Peptidsequenzen als homologe Variationen voneinander angesehen, wenn die beiden Sequenzen zumindest 75 % Gleichheit in Aminosäureidentität und/oder -ähnlichkeit zeigen. Dieser Vergleich kann unter Anwendung eines von mehreren verfügbaren Rechenverfahren gemacht werden. Ein Beispiel eines geeigneten Rechenverfahrens ist jenes von Lipman und Pearson (Science, 227, 1435- 1441 [1985]). Dieses Rechenverfahren ist in Form des Computerprogramms FASTP (W.R. Pearson, Department of Biochemistry, University of Virginia, Charlottesville, VA. 22908) verfügbar. Fachleute wissen, daß Substitutionen, Deletionen und Insertionen von Aminosäuren häufig in Proteinen und Polypeptiden ohne ungünstige Wirkungen auf Struktur und Funktion beobachtet werden. Tatsächlich zeigen die in Tabelle I angegebenen Polypeptidinhibitoren zumindest 75 % Sequenzidentität Beispielsweise werden die Polypeptide 2 bis 7, 43 und 44 als homologe Variationen von Polypeptid 1 angesehen; die Polypeptide 9 bis 14 werden als homologe Variationen von Polypeptid 8 angesehen; die Polypeptide 16 bis 21 werden als homologe Variationen von Polypeptid 15 angesehen; die Polypeptide 23 bis 28 werden als homologe Variationen von Polypeptid 22 angesehen; die Polypeptide 30 bis 35 werden als homologe Variationen von Polypeptid 29 angesehen; die Polypeptide 37 bis 42 werden als homologe Variationen von Polypeptid 36 angesehen und die Polypeptide 52 bis 57 werden als homologe Variationen von Polypeptid 51 angesehen.
Die Fachleute wissen auch, daß Homologie nur eine Indikation von Struktur und Funktion ist. Das heißt, nicht jede Kombination von Insertionen, Deletionen und Substitutionen, die zu einem Homologiewert von mehr als 75 % Sequenzidentität führt, resultiert notwendigerweise in einem biologisch aktiven Polypeptid. Beispielsweise bleiben die Stellungen der Halbcystine typischerweise in Proteaseinhibitoren hoch erhalten, wobei nur leichte Verschiebungen in den Stellungen festgestellt werden. Daher sollten die oben beschriebenen Homologiekriterien der Qualifikation entsprechen, daß das Peptid einen wesentlichen Grad seiner inhibierenden Wirksamkeit beibehält.
Die Polypeptide der Tabelle II sind recht homolog. Alle weisen einen Prolinrest bei P2 auf. Die wohlbekannte Neigung von Prolin, in einer Kettenumkehr aufzutreten, kann seine strikte Aufrechterhaltung erklären. Obwohl Prolin bei P2 erforderlich sein kann, sollte klar sein, daß auch andere Reste eine relativ hohe Frequenz des Vorkommens an Kettenumkehrungen haben, insbesondere Glycin, gefolgt von Asparaginsäure, Asparagin und Serin.
Veröffentlichte Ergebnisse mit kleinen Peptidsubstraten haben gezeigt, daß Alanin und Leucin ebenfalls in der P2-Stellung funktionieren können. Das Halbcystin in Stellung P3 bleibt strikt erhalten. Ein Halbcystin in Stellung P3 kann ein Erfordernis sein, um die geeignete Disulfidpaarung und Gesamtkonformation aufrechtzuerhalten. Die Stellung P4 ist von einem der nicht-polaren Reste Valin und Methionin in der Kürbisfamilie von Inhibitoren besetzt. Andere polare und nicht-polare Substitutionen bei P4 können möglich sein. Soweit die Substitutionen die Erzielung der notwendigen Gesamtfaltung und die reaktive Stellengeometrie nicht beeinträchtigen, hängen die Wirkungen der Substitutionen von der Zielserinprotease ab. Die Stellung P5 ist von Arginin oder Methionin in der Kürbisfamilie von Inhibitoren besetzt. Es gilt das gleiche Kommentar, wie es hinsichtlich der P4-Stellung gemacht wurde.
Das Muster für P1' bis P5', d.h. drei aufeinanderfolgende nicht-polare Reste, gefolgt von geladenem Rest, gefolgt von Halbcystin, bleibt in den bekannten Mitgliedern der Kürbisfamilie von Inhibitoren strikt erhalten. Man kann erwarten, daß Sequenzvarianten in den Stellungen P1' bis P5' die Affinität und Selektivität eines Peptids in Abhängigkeit von der Substitution und der Zielserinprotease mehr oder weniger beeinflussen. Beispielsweise werden sowohl positiv (Lysin) als auch negativ (Glutaminsäure) geladene Reste in Stellung P4' mit wenig Unterschied in der Äquilibriumassoziationskonstante festgestellt. Andererseits ist P5' Cys in allen Polypeptiden und kann ein Erfordernis für geeignete Disulfidpaarung sein.
Mitglieder der Kürbisfamilie von Inhibitoren weisen innerhalb der Rahmenregion der Sequenz wenig Änderungen auf. Es sollte klar sein, daß Substitutionen zu finden sind. Dies stimmt mit der Zuordnung dieses Teiles der Sequenz als Rahmen, die niedrige Frequenz und erhaltende Natur der Substitution vorausgesetzt, völlig überein.
Die Sequenzen dieser Trypsininhibitoren bleiben hoch erhalten. Der Homologiegrad zwischen diesen Inhibitoren und ihren im wesentlichen äquivalenten Bindungskonstanten für Trypsin unterstützt direkt die oben beschriebenen Homologiekriterien in bezug auf die Polypeptidinhibitoren der vorliegenden Erfindung.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind in einer Vielzahl von Situationen verwendbar, wie als therapeutische Mittel, Kontrolle von Serinproteaseaktivität in Fermentationsbrühen und möglicherweise Schädlingsbekämpfung.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind als Mittel bei der Behandlung oder, wenn geeignet angezeigt, der Verhütung von pathologischen Situationen, assoziiert mit unerwünschter Proteaseaktivität, verwendbar. Geeignete Verwendungen bestehen sowohl in der Human- als auch Veterinärmedizin. Die Polypeptide können als freie Polypeptide oder pharmazeutisch annehmbare Salze hievon verabreicht werden. Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbares Salz" bezieht sich auf jene Säureaditionssalze oder Metallkomplexe der Polypeptide, die die therapeutischen Eigenschaften (z.B. Wirksamkeit, Toxizität usw.) der Polypeptide nicht signifikant oder nachteilig berühren. Die Polypeptide sollten als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden, die in den meisten Fällen das Polypeptid und/oder pharmazeutische Salze hievon mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt. Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbarer Träger" bezieht sich auf jene festen und flüssigen Träger, die die therapeutischen Eigenschaften der Polypeptide nicht signifikant oder nachteilig berühren. Die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können Menschen entweder intravenös, subkutan, intramuskulär, intranasal oder sogar oral verabreicht werden. Die notwendige Dosierung variiert mit dem zu behandelnden besonderen Zustand, der Verabreichungsmethode und der Clearancerate des Polypeptids aus dem Körper. In den meisten Fällen sollten Dosierungen zwischen 0,001 und 30 mg/kg wirksam sein. Ein Dosisbereich zwischen 0,1 und 10 mg/kg wird bevorzugt.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind auch zum Regulieren der Spiegel von Proteaseaktivität in Fermentationsbrühen verwendbar. Sie sind zum Schützen von durch Fermentation von genetisch manipulierten Mikroben gebildeten Proteinen vor Abbau geeignet. Dies kann durch Zusatz von exogenen Polypeptiden oder durch Coklonieren und Expression des für diese Polypeptide codierenden Gens mit jenen des Gens für das zu schützende Protein durchgeführt werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch zur Bekämpfung von Haushalts- und Landwirtschaftsschädlingen durch Beendigung ihrer digestiven Funktion verwendbar sein. Die Polypeptide sollten so formuliert werden, daß sie entsprechend der Umgebung an der Anwendungsstelle geeignete Wirksamkeit erzielen. Die Polypeptide können mit anderen Schädlingsbekämpfungsmitteln verwendet werden.
Die Peptidinhibitoren können durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden. Dies schließt rekombinante DNA-Techniken und chemische Synthese einschließlich der weitverbreitet verwendeten Festphasenpeptidsynthesemethode von Merrifeld (J.Am.Chem.Soc., 85, 2149 (1963); "Solid Phase Peptide Synthesis", Stewart und Young, 2. Aufl., Pierce Chemical Co., Rockford, IL) ein. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung enthalten Cystein, so daß 1 ml Anisol und 150 mg Mercaptopyridin pro g Peptidharz in die Standardfluorwasserstoff-Spaltungsreaktion inkludiert werden sollten. Das gespaltene Peptid wird aus etwa 15 %iger Essigsäure lyophilisiert.
Das rohe Peptid wird dann auf folgende Weise oxidativ gefaltet. Oxidationspuffer (0,1 M Tris-HCl, pH 8,75, enthaltend 1 mM EDTA und eine Mischung von reduzierten (0,5 bis 1,0 mM) bzw. oxidierten (5 bis 10 mM) Glutathionen in einem Molverhältnis von 1 bis 10) wird dem rohen Peptid zugesetzt, um eine Konzentration von 4 mg/ml Peptid zu ergeben. Jedes unlösliche Material wird durch Zentrifugieren bei 8600 x g während 10 min sedimentiert. Der Überstand wird dekantiert und die oxidative Faltungsreaktion läuft 2 bis 8 Stunden bei Umgebungstemperatur ab. Die Reaktionsmischung kann bis zum Reinigungsschritt bei 4ºC gelagert werden.
Das oxidierte rohe Peptid kann auf inhibierende Wirksamkeit gegen eine oder mehrere Serinproteasen beispielsweise unter Verwendung der im nachstehenden beschriebenen Untersuchungen analysiert werden. Es ist vernünftig, eine Kontrolle unter Verwendung nur des Oxidationspuffers durchzuführen. Das oxidierte rohe Peptid kann durch Umkehrphasen-HPLC auf einer C18-Silikagelsäule unter Anwendung eines Wasser/Acetonitrilzusammensetzungsgradienten von 20 bis 40 % Acetonitril, in dem beide Lösungsmittel 0,1 % Trifluoressigsäure enthalten, und einer Fließrate von 2 ml/min analysiert werden. Der Säulenabfluß wird durch Extinktion bei 226 nm beobachtet. Das Einspritzen von 200 bis 300 ul oxidiertem rohen Peptid ermöglicht das Sammeln von Peaks für Identifizierung des aktiven Bestandteiles unter Anwendung eines geeigneten Inhibierungstests. Er ermöglicht auch die Feststellung der relativen Reinheit, Elutionszeit und daher des Prozentsatzes von Acetonitril am Gradientenmischer, wenn das Peptid von der Säule eluiert. Die Elutionszeit des aktiven Bestandteiles ist zum Verfolgen der Reinigung (siehe unten) unter Anwendung eines HPLC-Tests im analytischen Maßstab der chromatographischen Fraktionen wesentlich. Der Prozentsatz von Acetonitril ist zum Festlegen der ungefähren Bedingungen (Lösungsmittelzusammensetzung), die zum Erzielen einer Reinigung des oxidierten rohen Peptids benötigt werden, nützlich.
Die oxidierten rohen Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auf folgende Weise gereinigt werden. Das oxidierte rohe Peptid wird durch ein 0,45 um-Filter filtriert, um jegliche trübe Suspension, die manchmal zu beobachten ist, zu entfernen. Die filtrierte Lösung wird bei einer Fließrate von 6 ml/min auf eine mit C18 Silikagel (10 um) gefüllte 40 x 350 mm Michel-Miller- Glassäule gepumpt. Die Säule war mit Lösungsmittel, erhalten durch Mischen von Aceton und glasdestilliertem Wasser, beide enthaltend 0,1 % (V/V) Trifluoressigsäure, auf eine Endzusammensetzung von 5 % Acetonitril äquilibriert. Die Säule wird mit den 5 % Acetonitril 30 bis 60 min gewaschen, um jegliches ungebundene Material zu eluieren; für diesen und alle folgenden Vorgänge wird eine Fließrate von 6 ml/min verwendet. Ein Gradient wird von 5 % Acetonitril auf die Endzusammensetzung in 30 min geführt. Die Säule wird dann bei der Endzusammensetzung isokratisch eluiert, bis der aktive Bestandteil aus der Säule ausgetreten ist. Der Säulenabfluß wird durch Extinktion bei 226 nm beobachtet und Fraktionen werden unter Verwendung eines Fraktionsammlers gesammelt. Die Fraktionen werden unter Anwendung der geeigneten Tests (siehe unten) auf inhibierende Wirksamkeit untersucht. Die aktiven Fraktionen werden unter Anwendung von Umkehrphasen-HPLC im analytischen Maßstab, wie oben beschrieben, untersucht. Die Fraktionen werden unter Anwendung dieser Information zusammengegeben, um mehr als 95 % homogenes Polypeptid zu ergeben, wie durch HPLC bestimmt. Die zusammengegebenen Fraktionen werden lyophylisiert. Die Polypeptide werden so als Salz von Trifluoressigäsure erhalten.
Für den ersten Versuch zur Reinigung wurde festgestellt, daß eine geeignete Endzusammensetzung eine solche ist, die 10 % weniger Acetonitril aufweist als der Prozentsatz, bei dem das Peptid von der Umkehrphasen-HPLC im analytischen Maßstab eluierte. Eine Verbesserung kann dann durch kleinere Einstellungen von 1 bis einige Prozent Acetonitril nach Prüfung des ersten Elutionsprofils gemacht werden.
Die inhibierende Wirksamkeit der Polypeptide der vorliegenden Erfindung kann unter Anwendung von in vitro-Tests leicht untersucht werden. In diesen Arten von spektrophotometrischen Tests wird die Aktivität der Serinprotease gegenüber einem geeigneten p-Nitroanilidsubstrat in An- und Abwesenheit des Peptidinhibitors gemessen. Die enzymkatalysierte Hydrolyse des Peptid-p-nitroanilidsubstrats produziert p-Nitroanilin, was zu einer Erhöhung der Extinktion führt, die im Bereich von 405 bis 410 nm beobachtet wird. Die Rate der Zunahme der Extinktion ist ein Maß der enzymatischen Aktivität und die Abnahme dieser Rate in bezug auf eine geeignete Kontrolle wird zum Feststellen von Inhibierung verwendet. Das allgemeine Testverfahren und Einzelheiten der in den Beispielen verwendeten Tests sind im Anhang nach den Beispielen angegeben. Es ist auch möglich, die Polypeptide in einem funktionell orientierten Test zu testen, der in vivo Bedingungen nachahmt. Ein solcher Inhibierungstest auf Elastase ist im Anhang ebenfalls beschrieben.

BEISPIELE 1 BIS 15

Beispiele von Polypeptiden der Tabelle I wurden durch Festphasensynthese hergestellt und, wie oben beschrieben, gereinigt, mit Ausnahme der Polypeptide 29, 36, 43, 47, 48 und 50, die als oxidiertes (gefaltetes) rohes Peptid getestet wurden.
Ein Peptid mit der Sequenz des natürlich vorkommenden Trypsininhibitors, gezeigt in der ersten Reihe von Tabelle II, diente in diesem Beispiel als Vergleichskontrolle. Die im nachstehenden angegebenen Polypeptide wurden unter Anwendung der im folgenden Anhang beschriebenen Tests auf Aktivität gegenüber Trypsin, Elastase, Kathepsin G und Chymotrypsin untersucht. Die Testergebnisse sind in nachstehender Tabelle III angegeben. Tabelle III Inhibierende Wirksamkeit Peptid Trypsin Elastase Kathepsin G Chymotrypsin Kontrolle ++ Repräsentiert mehr als 50 % Inhibierung + Repräsentiert 10 bis 50 % Inhibierung - Repräsentiert weniger als 10 % Inhibierung
Peptidinhibitoren wurden bei einem Verhältnis Inhibitor/Protease von etwa 10/1 bis 50/1 getestet. Peptide, die mehr als 50 % Inhibierung bei diesem Molverhältnis zeigen, sollten im wesentlichen vollständige Inhibierung bei Verhältnissen Inhibitor/Protease von etwa 100/1 zeigen. Weniger wirksame Inhibitoren sollten wesentliche Inhibierung bei höheren Inhibitor/Protease- Verhältnissen zeigen. Bevorzugte Elastaseinhibitoren sind die Peptide 1, 8 und 51. Peptid 8 wird als Elastaseinhibitor besonders bevorzugt. Bezugnehmend auf Fig. 2 zeigt Peptid 8 im wesentlichen stöchiometrische Inhibierung von menschlicher Elastase.
Bezugnehmend auf Fig. 1 ist es klar, daß Elastase eine starke Präferenz für Isoleucin (Ile) und Valin (Val) hat. Die Testdaten zeigen, daß das Ersetzen von Arg in Stellung P1 durch Ile oder Val einen starken Elastaseinhibitor produziert. Die Aktivität der Peptide 43 bis 48 zeigt, daß erhaltende Substitutionen entfernt von der Stellung P1 vorgenommen werden können und dennoch die biologische Aktivität aufrechterhalten.
Polypeptid 15 wurde synthetisiert, wobei Phenylalanin bei P1 substituiert wurde. Es ist bekannt, daß Chymotrypsin und Kathepsin G eine Präferenz für Phenylalanin in Stellung P1 zeigen. Die Inhibierung von Chymotrypsin und Kathepsin G wurde festgestellt. Polypeptid 15 inhibierte ebenfalls menschliche Elastase und Trypsin. Peptid 22, das wie Peptid 15 eine voluminöse nicht-polare Aminosäure (Met) in Stellung P1 aufweist, inhibiert menschliches Kathepsin G, Chymotrypsin, menschliche Elastase und Trypsin ebenfalls. Zum Vergleich weist der natürlich vorkommende α-1-Proteinaseinhibitor ebenfalls ein Methionin in Stellung P1 auf und inhibiert ebenfalls alle diese Enzyme.
Die Aktivität der Peptide 45, 46, 47, 48, 29, 36 und 49 zeigt, daß Peptide mit hydrophoben Seitenketten in Stellung P1 Inhibitoren von menschlicher Elastase bleiben. Isoleucin in Stellung P1' kann durch Alanin ersetzt werden, obwohl gewisse Unterschiede in der Stärke resultieren können. Die Tatsache, daß die Peptide 49 und 50 nur marginale Aktivität zeigen, läßt vermuten, daß der Cysteinrest in Stellung P3 wichtig und praktisch unveränderlich ist. Prolin in Stellung P2 kann durch Hydroxyprolin (Hyp) und Glycin substituiert werden, was zeigt, daß Aminosäuren, die eine Kettenumkehrkonformation annehmen können, Prolin in der Stellung P2 ersetzen können.
Die Tatsache, daß Peptid 51, dem eine P1-Seitenkette fehlt, ein menschlicher Elastaseinhibitor ist, läßt vermuten, daß die Seitenkette allein nicht für die Inhibierung verantwortlich ist. Peptid 51 ist ein weniger wirksamer Inhibitor von Elastase als die Peptide 1 oder 8. Daher folgt daraus, daß die P1-Seitenkette die Inhibierung, die durch den Rest der reaktiven Stelle verliehen wird, erhöhen (Peptid 8) oder vermindern (Peptid 51) kann (Trypsininhibitorkontrolle).

BEISPIELE 16 BIS 17

Um die Verwendbarkeit der Inhibitoren der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren, wurde Peptid 8 in weiteren funktionellen Biotests unter Verwendung von natürlicheren und wirksameren Substraten getestet. Peptid 8 wurde auch unter Verwendung von Polymorphonuklearleukozyten (PMN) als Quelle proteolytischer Aktivität getestet.
Fig. 3 illustriert Inhibierungsdaten, die unter Verwendung von ¹²&sup5;I-Fibronectin als Substrat bei einer Enzymkonzentration von 4 nM (oder einer äquivalenten Menge von von PMN stammender menschlicher Elastaseaktivität (HLE-Äquivalent)) erhalten wurden. Diese Datenwerte repräsentieren den Durchschnitt mehrerer (n = 3 bis 9) Replikate im Vergleich mit der Kontrolle, die keinen Inhibitor enthielt.
Peptid 8 zeigte nahezu das gleiche Inhibierungsprofil gegen gereinigte menschliche Elastase (HE)- und von PMN stammende HE- Aktivität. Der α-1-Proteinaseinhibitor war gegen gereinigte HE weitaus wirksamer als Peptid 8. Jedoch fiel bei Verwendung von stimulierten PMN die Wirksamkeit des α-1-Proteinaseinhibitors auf einen Grad ähnlich jenem von Peptid 8.
Die Inhibierung von Elastolyse durch Peptid 8 wurde unter Anwendung des ³H-Elastintests und von gereinigter HE untersucht. Die in Fig. 4 gezeigten Ergebnisse sind ähnlich Fig. 3, was zeigt, daß Peptid 8 für diese beiden Bindegewebesubstrate gleich wirksam ist.

ANHANG

Verallgemeinertes Protokoll von spektrophotometrischen Tests

1) Pipettiere 100 ul Enzymlösung in eine Einmal-Polystyrolküvette (1 cm optische Weglänge).
2) Setze (1900-X) ul Puffer zu der Küvette zu, wobei X das Volumen der Testlösung in ul ist, das im nächsten Schritt zugesetzt wird.
3) Setze X ul Testlösung zu der Küvette zu, wobei x 0 ul für die Kontrolle bis zu einem Maximum von etwa 500 ul beträgt. Inkubiere die Lösung während eines Zeitraumes von 1 bis 5 Minuten bei Umgebungstemperatur
4) Setze 100 ul Substratlösung zu der Küvette zu. Mische den Inhalt durch Bedecken der Küvette mit einem Stück Paraffinfolie und wiederholtes Umdrehen während eines Zeitraumes von 5 bis 15 Sekunden.
5) Zeichne die Änderung der Extinktion während etwa 5 Minuten bei 405 oder 410 nm, in Abhängigkeit vom Test, mit einem mit einer geeigneten Aufzeichnungsvorrichtung ausgestatteten Spektrometer auf.
6) Die Inhibierung wird durch die Verminderung der festgestellten anfänglichen Rate der Änderung der Extinktion in bezug auf eine Kontrolle, die keine Testlösung enthält, bestimmt. Die perzentuelle Inhibierung wird aus der Formel
% Inhibierung = 100 X [(ΔA/min) Test/(ΔA/min Kontrolle}
wobei (ΔA/min) die anfängliche Rate der Extinktionsänderung ist, berechnet.
7) Für genauere quantitative Bestimmungen können Temperaturregulierung der Küvettenhalter und der Reagenslösungen eingesetzt werden.
8) Die Testlösung kann rohes oxidiertes Peptid, hergestellt wie oben beschrieben, Fraktionen von einer chromatographischen Trennung oder gereinigte Polypeptide sein.

Trypsintest

A) Pufferlösung - Triäthanolaminpuffer bestehend aus 200 mM Triäthanolamin, 20 mM CaCl&sub2;, pH 7,8.
B) Substratlösung - Löse 50 mg N-Benzoyl-L-arginin-p- nitroanilid in 50 ml Wasser. Beschalle 5 bis 10 Minuten zum vollständigen Lösen des festen Materials.
C) Enzymlösung - Löse 1 mg Rindertrypsin in 10 ml 0,001 n HCl, während des Tests auf Eis gelagert.
D) Testlösung - Siehe allgemeines Protokoll, Nr. 8.

Verfahren:

Verwende die obigen Lösung im oben beschriebenen all gemeinen Protokoll.

Kathepsin G-Test

A) Pufferlösung - Tris-NaCl-Puffer bestehend aus 0,1 M Tris- HCl, pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,03 % Natriumazid.
B) Substratlösung - Löse 50 mg N-Succinyl-L-alanyl-L-alanyl- L-prolyl-L-phenylalanin-p-nitroanilid in 1 ml 1-Methyl-2- pyrrolidinon und verdünne mit Tris-NaCl-Puffer auf 50 ml.
C) Enzymlösung - Menschliches Sputum-Kathepsin G (Produkt Nr. SG-45, EPC, Inc., Pacific, MO). Löse 1 mg Protein pro 1 ml Tris-NaCl-Puffer. Lagere auf Eis oder bei 4ºC.
D) Testlösung - Siehe allgemeines Protokoll, Nr. 8.

Verfahren:

Verwende die obigen Lösung im oben beschriebenen allgemeinen Protokoll.
1) Dieser Test kann durch Errsetzen der Enzymlösung des Chymotrypsintests für Chymotrypsin verwendet werden.

Chymotrypsintests

A) Pufferlösung - Triäthanolaminpuffer - siehe Trypsintest.
B) Substratlösung - Löse 25 mg 3-Carbomethoxypropionyl-L- arginyl-L-prolyl-L-tyrosin-p-nitroanilid (Produkt Nr. S-2586, KabiVitrum AB, Stockholm, Schweden) in 23,6 ml Wasser.
C) Enzymlösung - Löse 1 mg Rindertrypsin in 4 ml 0,001 n HCl. Stelle die Endverdünnung durch Vereinigen von 0,1 ml der Vorratschymotrypsinlösung und 10 ml 0,001 n HCl her. Lagere auf Eis oder bei 4ºC.

Verfahren:

Verwende die obigen Lösungen im allgemeinen Protokoll.
2) Siehe Bemerkung 1 des Kathepsin G-Tests.
3) 0,1 M Tris-HCl, pH 7,8, 20 mM CaCl&sub2;, 0,05 % Triton X-100 können den Triäthanolaminpuffer ersetzen.

Elastasetests

Methode 1:

A) Pufferlösung - Tris-NaCl-Puffer bestehend aus 0,1 M Tris- HCl, pH 7,5, bei 25ºC enthaltend 0,5 M NaCl und 0,01 % (G/V) NaN&sub3;.
B) Substratlösung - Löse 45,5 mg N-Succinyl-L-alanyl-L- alanyl-L-alanin-p-nitroanilid in 1 ml 1-Methyl-2-pyrrolidinon. Setze 32 ml Tris-NaCl-Puffer zu.
C) Enzymlösung - Menschliche Sputumelastase, Produkt Nr. SE- 563 EPC, Inc., Pacific, MO., USA, Charge 85701. Löse 1 mg in 1 ml Tris-NaCl-Puffer. Lagere auf Eis oder bei 4ºC.
D) Testlösung - Siehe allgemeines Protokoll, Nr. 8.

Verfahren:

Verwende die obigen Lösungen im oben beschriebenen allgemeinen Protokoll.

Methode 2:

1) Pufferlösung - Tris-NaCl-Puffer- Siehe Methode 1.
2) Substratlösung - Löse 50 mg 3-Carbomethoxypropionyl-L- alanyl-L-alanyl-L-propyl-L-valin-p-nitroanilid in 1 ml 1-Methyl- 2-pyrrolidinon. Setze 32 ml Tris-NaCl-Puffer zu.
3) Enzymlösung - Menschliche Sputumelastase, Produkt Nr. SE- 563 EPC, Inc., Pacific, MO., USA, Charge 85071. Stelle eine Probe bei einer Konzentration von 0,01 mg pro ml Tris-NaCl-Puffer her. Lagere auf Eis.
4) Testlösung - Siehe allgemeines Protokoll, Nr. 8.

Verfahren:

Verwende die obigen Lösungen im allgemeinen Protokoll.
1) Schweinepankreaselastase kann menschliche Elastase ersetzen, wenn auf einen Inhibitor der ersteren getestet werden soll.
2) Die Aktivität eines Elastasepräparats kann als
Aktivität = (AΔ (410 nm)/min) x 340,0/(Volumen von zugesetzter Elastase)x (Elastasekonz.)
berechnet werden.
3) Der Tris-NaCl-Puffer kann auch pH 8,0 mit 0,03 % Natriumazid sein. Die Ergebnisse sollten bei einem einzigen pH verglichen werden.

Funktioneller Test auf Elastaseinhibierung

Elastasediffusions-Plattentest

Die elastolytische Aktivität wird durch die radiale Solubilisierung von in einem dünnen Gießagarfilm suspendierten fluoresceinimprägnierten Elastinteilchen gemessen. Die Fläche der Klärungszone ist proportional der in eine in das Agar geschnittene Vertiefung zugesetzten Elastasemenge. Peptide können auf die Fähigkeit zum Inhibieren der Klärung einer Zone getestet werden.

Materialien und Reagentien:

1) Alphasinelastase-Diffusionsplatte, Produkt Nr. A-622, EPC, Inc., Pacific, MO, Charge Nr. 86128.
2) Menschliche Sputumelastase, EPC, Inc., Pacific, MO, Produkt Nr. SE-563. Stelle sie bei einer Konzentration von etwa 300 Einheiten/ml (bestimmt unter Anwendung von Methode 1 des spektrophotometrischen Tests auf Elastase) in Tris-NaCl-Puffer her (Methode 1).
3) Testlösung - Peptide bei einer Konzentration von etwa 1 ug/ul.

Verfahren:

1) Setze 10 ul der Elastaselösung zu 1,5 ml Eppendorf- Röhrchen (1 Röhrchen für eine Kontrolle und 1 Röhrchen für jede Testlösung) zu.
2) Setze (20-X) ul Tris-NaCl-Puffer zu, wobei X das Volumen der zugesetzten Testprobe in ul ist.
3) Setze X ul Testlösung zu, wobei X 0 bis 20 ist. Inkubiere während 1 bis 5 Minuten bei Umgebungstemperatur.
4) Teste 10 ul der erhaltenen Lösung unter Anwendung von Methode 1, ausgenommen daß nur 10 ul Enzymlösung im ersten Schritt verwendet werden.
5) Pipettiere 10 ul jeder Probe in eine Vertiefung.
6) Inkubiere 12 Stunden bei 37ºC.
7) Die Fläche der Klärungszonen wird zweckmäßig mit einem Antibiotikumzonenleser abgelesen. Die Fläche der Vertiefung (Kontrolle) wird von jedem Wert subtrahiert.

Bemerkungen zum Elastasediffusions-Plattentest

1) Es muß geachtet werden, Dehydratisierung des Agars während der Inkubation zu vermeiden. Die Platte wird zusammen mit einigen ml Wasser in einen Kunststoffsack gegeben und der Sack verschlossen.
2) Siehe Bemerkung 1 für Methode 1.
3) Die Inhibierung wird gemäß der Formel
% Inhibiering = 100[1 - (korrigierte Fläche) Test/(korrigierte Fläche) Kontrolle]
bestimmt.

¹²&sup5;I-Fibronectintest

Dieser Test ist dazu bestimmt, den Abbau von Bindegewebe zu modellieren. Der Test wird im wesentlichen durchgeführt, wie von Campbell et al. (J.Clin.Invest., 1982, 70: 845-52) beschrieben. Kurz gesagt wird gereinigtes menschliches Plasmafibronectin (fn) mit ¹²&sup5;I unter Anwendung von Enzymkügelchen und herkömmlicher Verfahren radiomarkiert. Das entsalzte ¹²&sup5;I-fn wird mit fn verdünnt, um ca. 15000 cpm/ug zu ergeben. Dieses Material wird mit pH 9,6 Barbitalpuffer weiter verdünnt und 200 ul (30 ug fn, 50000 cpm) werden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen pipettiert. Die Platten werden etwa 24 Stunden bei 37ºC getrocknet und ungebundenes fn wird mit 2 Wäschen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) entfernt. Die Platten werden bei 4ºC gelagert und sind mindestens 2 Wochen stabil.
Für einen Test wird jede beschichtete Vertiefung mit einem Gesamtvolumen von 200 ul gefüllt. Alle Messungen werden bei optimalen pH- und Pufferbedingungen durchgeführt. Nach Zugabe von proteolytischer Aktivität mit oder ohne Inhibitor wird die Platte 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Der Inhalt der Vertiefungen wird zentrifugiert und eine aliquote Menge von 100 ul wird auf ¹²&sup5;I-Gammastrahlung gezählt. Einige Tests verwendeten Elastaseaktivität, die von frisch hergestellten Neutrophilen (PMN) stammte. In diesem Fall ist ein Aktivierungsmittel zum Stimulieren der PMN in der Vertiefung vorhanden und die PMN werden zuletzt zugesetzt. Eine Standardkurve, die die Linearität der Antwort auf die Menge der zugesetzten gereinigten menschlichen Elastase (HE) zeigt, wird gleichzeitig mit jedem Test erhalten.

³H-Elastintest

Ein weiterer, noch weniger empfindlicher Test verwendet radiomarkiertes Elastin als festes Substrat, um den Abbau von Bindegewebe zu imitieren.
Die Radiomarkierung von Rinderhalsligamentelastin wird mit tritiiertem Natriumborhydrid durchgeführt, wie von Stone et al. (Anal.Biochem., 1977, 80: 572-577) beschrieben. Elastinbeschichtete Mikrotiterplatten werden hergestellt, im wesentlichen wie oben für die Fibronectinplatten beschrieben. Der Test wird ähnlich durchgeführt, ausgenommen, daß der Überstand einem Szintillationscocktail zum Zählen zugesetzt wird. Die Linearität der Antworten auf gereinigte HE wird ebenfalls getestet.

Claims

1. Synthetischer Serinproteaseinhibitor mit der folgenden Aminosäuresequenz

Arg-Val-Cys-Pro-X-Ile-Leu-Met-Lys-Cys-Lys-Lys-Asp-Ser-Asp- Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-Cys-Gly,

der inhibierende Wirksamkeit gegenüber Elastase zeigt, worin X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Isoleucin, Norvalin, Valin, Norleucin, Methionin, Leucin, Alanin, Glycin und Phenylalanin.

2. Serinproteaseinhibitor nach Anspruch 1, in dem X Valin ist.

3. Serinproteaseinhibitor nach Anspruch 1, in dem X Isoleucin ist.

4. Serinproteaseinhibitor nach Anspruch 1, der inhibierende Wirksamkeit gegenüber Elastase und Kathepsin G zeigt und in dem X Phenylalanin ist.

5. Serinproteaseinhibitor nach Anspruch 1, der inhibierende Wirksamkeit gegenüber Elastase und Kathepsin G zeigt und in dem X Methionin ist.

6. Serinproteaseinhibitor mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 75 %iger Wahrscheinlichkeit von Aminosäureidentität und/oder -ähnlichkeit mit der in Anspruch 1 definierten Aminosäuresequenz und die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden 1-48 und 51-57 der Tabelle 1.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung zum Inhibieren einer Zielserinprotease umfassend einen synthetischen Serinproteaseinhibitor nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hievon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der X Valin ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der X Isoleucin ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der X Phenylalanin ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der X Methionin ist.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung zum Inhibieren einer Zielserinprotease umfassend einen synthetischen Serinproteaseinhibitor nach Anspruch 6 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hievon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

13. Analogieverfahren zur Herstellung eines synthetischen Serinproteaseinhibitors nach Anspruch 1 oder 6 durch chemische Synthese.

14. Analogieverfahren nach Anspruch 13, in dem der Inhibitor durch das Festphasenpeptidsyntheseverfahren von Merrifeld hergestellt wird.

15. Analogieverfahren zur Herstellung eines synthetischen Serinproteaseinhibitors nach Anspruch 1 oder 6 durch rekombinante DNA-Techniken.

16. Analogieverfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, in dem X der in Anspruch 1 definierten Aminosäuresequenz Valin ist.

17. Analogieverfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, in dem X der in Anspruch 1 definierten Aminosäuresequenz Isoleucin ist.

18. Analogieverfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, in dem X der in Anspruch 1 definierten Aminosäuresequenz Phenylalanin ist und das Polypeptid inhibierende Wirksamkeit gegenüber Elastase und Kathepsin G zeigt.

19. Analogieverfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, in dem X der in Anspruch 1 definierten Aminosäuresequenz Methionin

TEXTE FEHLT